degradaÇÃo de hormÔnios em Águas de abastecimento … · do para meu crescimento profissional....

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA DE SÃO CARLOS

DEGRADAÇÃO DE HORMÔNIOS EM

ÁGUAS DE ABASTECIMENTO PÚBLICO POR

FOTOCATÁLISE HETEROGÊNEA SOLAR

Rodrigo Nogueira Padovan (Doutorando)

Prof. Dr. Eduardo Bessa Azevedo (Orientador)

1

RODRIGO NOGUEIRA PADOVAN

DEGRADAÇÃO DE HORMÔNIOS EM ÁGUAS DE ABASTECIMENTO

PÚBLICO PORFOTOCATÁLISE HETEROGÊNEA SOLAR

Tese apresentada ao Instituto de

Química de São Carlos da Univer-

sidade de São Paulo para obtenção

do Título de Doutor em Ciências

Área de Concentração:

Química Analítica e Inorgânica

Orientador:

Prof. Dr. Eduardo Bessa Azevedo

São Carlos

2015

2

Dedico a Deus e a minha família.

3

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Eduardo Bessa Azevedo, por ter me recebido em seu grupo de pesquisa e

ter confiado no meu trabalho, me orientando ao longo desses anos e, sem dúvida, contribuin-

do para meu crescimento profissional.

Ao meu pai, Jair, minha mãe, Lilliam, meu irmão, Leandro, que sempre estiveram ao

meu lado incondicionalmente me apoiando, me fazendo seguir em frente e acreditando sem-

pre nos meus ideais. São minha base e estrutura.

A Maraíssa, que com sua alegria e sorriso irradiante tornou o caminho agradável e en-

riquecedor, sendo a companheira perfeita. Te amo!

Aos amigos do LDTamb e CROMA, que me ofereceram não só conhecimento cienti-

fico, mas também amizade e companheirismo, dos quais eu jamais me esquecerei.

Ao Lucas pelo tempo dedicado e a sua amizade.

Ao Professor Álvaro José dos Santos Neto que, sempre com entusiasmo, colaborou

com o desenvolvimento do trabalho, discutindo dados e aperfeiçoando ideias. Ao Professor

Fernando Mauro Lanças por me acolher em seu grupo.

Ao Professor Igor Renato Bertoni Olivares pelas contribuições no início deste traba-

lho.

Ao Professor Andrei Leitão e à Patrícia Bergo pela colaboração nos testes de estroge-

nicidade.

A Vânia, Elaine e Guilherme que se fizeram sempre presentes, me auxiliando e contri-

buindo para o desenvolvimento do trabalho.

À Professora Eny Maria Vieira, pela amizade, carinho e suporte.

Aos funcionários das oficinas mecânica e eletrônica, pelo suporte técnico prestado,

sempre dispostos a solucionarem nossos problemas.

Aos amigos Adriel, André Barbie, André Goiano, Antônio, Augusto, Bruno, Carol

Port, Felipe, Flávia, Lucas, Marcio, Meire, Ricardo Baiano, Sergio, Priscilla e Ulisses que,

por apenas um período ou por todo o doutorado, dividiram momentos de preocupação, des-

contração e alegria comigo, proporcionando sempre dias melhores. Obrigado pela amizade e

por discutir ciência comigo.

4

Aos tios e primos que com ternura e carinho estiveram sempre comigo.

As minhas avós Zulmira e Iracema e avôs Durival e Antônio pelo carinho e preocupa-

ção.

Agradeço também àqueles que não citei acima, mas que de alguma forma contribuí-

ram para minha formação profissional e/ou pessoal.

E finalmente a Deus, por ter proporcionado que meu caminho se cruzasse com o de

todas essas pessoas, e tantas outras dispostas a me ajudar. Obrigado por sempre me orientar.

5

RESUMO

Vários compostos utilizados ou produzidos pelo homem quando lançados no meio ambiente,

ou mesmo em estações de tratamento de esgoto, não são facilmente degradados ou removidos.

Desse modo, acabam voltando às estações de tratamento de água, que em sua maioria utilizam

métodos que não são capazes de remover tais compostos, podendo até aumentar o efeito bio-

lógico destes. A detecção destes compostos é um desafio para a Química Analítica, já que

ocorrem em baixas concentrações. Degradou-se uma mistura de quatro hormônios três

naturais, 17β-estradiol (E2), estrona (E1) e estriol (E3), e um sintético, 17α-etinilestradiol

(EE2) em água de abastecimento público pela fotocatálise heterogênea solar, utilizando-se

o fotocatalisador dióxido de titânio suportado em um reator de placa plana operado com reci-

clo. Foi também desenvolvido e validado um método analítico totalmente automatizado que

possibilitou detectar e quantificar baixas concentrações dos quatro hormônios. Foram obtidos

limites de quantificação de 10 µg L-1, com a extração de 125 µL de amostra, com coeficiente

de variação (< 20%) e exatidão (todos entre 80 a 120%) dentro dos limites aceitáveis para este

tipo de análise. Foi possível verificar que a eficiência de degradação atingiu mais de 90% em

menos de 4 horas para todos os hormônios. Mesmo com esse nível de degradação não foi

possível a remoção da atividade estrogênica. Só houve uma redução significativa após 9 h de

degradação. Possivelmente, a atividade estrogênica foi mantida pela concentração restante

dos hormônios e/ou pela formação de produtos de degradação que também apresentavam ati-

vidade biológica. Alguns desses compostos foram propostos, sendo alguns conhecidos na

literatura. No entanto, com as análises realizadas, não foi possível se ter certeza de que os

compostos gerados no tratamento são realmente os sugeridos.

Palavras-chave: Fotocatálise heterogênea; SPE online; Degradação solar; hormônios.

6

ABSTRACT

Several compounds used or produced by man, when released into the environment, or even in

sewage treatment plants, are not easily degraded or removed. Thus, these compounds eventu-

ally return to water treatment plants, which mostly use methods incapable of removing them,

and may even enhance their biological effect. The detection of these compounds is a chal-

lenge to Analytical Chemistry, as they occur at low concentrations. A mixture of four hor-

mones were degraded three of them of natural origin, 17β-estradiol (E2), estrone (E1), and

estriol (E3) and a synthetic one, 17α-ethinyl estradiol (EE2) in public water supply by solar

heterogeneous photocatalysis, using supported titanium dioxide as the photocatalyst in a flat-

plate reactor in recycling mode. A fully automated analytical method was developed and val-

idated making it possible to detect and quantify low concentrations of the four hormones.

Quantification limits of 10 µg L-1 were achieved with the extraction of a 125 µL-sample, with

coefficients of variation (< 20%) and accuracy (all between 80 and 120%) were acceptable

limits for this type of analysis. It was possible to observe that the degradation performance

reached more than 90% in less than 4 hours for all hormones. Even with this level of degra-

dation it was not possible to remove the estrogenic activity. There was only a significant re-

duction after 9 h of degradation. Possibly, the estrogenic activity was maintained by the re-

maining concentration of the hormones and/or by degradation by-products which still present

biological activity. Some of these compounds were proposed, some of which have been al-

ready published in the literature. However, with the performed analyses, it was not possible

to ascertain that the generated compounds during treatment are actually the ones here suggest-

ed.

Keywords: heterogeneous photocatalysis; SPE online; solar degradation; hormones.

7

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Esquema simplificado de um tratamento de água para abastecimento público ...... 18

Figura 2 Bandgap de condutores, semicondutores e não-condutores. ................................. 20

Figura 3 Esquema simplificado de um cromatógrafo líquido. .............................................. 24

Figura 4 Cromatograma de uma solução contendo os solutos hipotéticos A, B e C. ............ 25

Figura 5 Separação cromatográfica. ...................................................................................... 27

Figura 6 Pico cromatográfico com os detalhes para os cálculos do fator de assimetria. ...... 28

Figura 7 Esquema simplificado de um LC com o detector Espectrofotômetro de Ultravioleta

e Visível. ................................................................................................................................... 31

Figura 8 Esquema simplificado de um LC acoplado com um Detector de Arranjo de Diodo.

.................................................................................................................................................. 32

Figura 9 ESI, APCI e APPI e sua aplicação em relação à polaridade e massa molecular dos

analitos. ..................................................................................................................................... 33

Figura 10 Esquema simplificado de um LC-MS com Ionização por "Electrospray" (ESI). . 34

Figura 11 – Esquema simplificado de um LC-MS como Ionização Química a Pressão

Atmosférica (APCI) .................................................................................................................. 35

Figura 12 – Feixe de íons inserido no analisador quadrupolar demonstrando a transmissão

dos íons estabilizados (M1) e a desestabilização dos íons não desejados no momento (M2 e

M3).................................... ........................................................................................................ 36

Figura 13 – Esquema de um cromatógrafo líquido acoplado com o detector do tipo

Quadrupolo. .............................................................................................................................. 36

Figura 14 – Esquema simplificado de um cromatógrafo líquido acoplado com um analisador

TOF. .......................................................................................................................................... 38

Figura 15 Cartucho de SPE. .................................................................................................. 39

Figura 16 Representação esquemática da técnica columnswitching aplicada em LC: (A)

Posição (1–2) de carregamento da amostra e (B) posição (6–1) de eluição da amostra. ......... 41

Figura 17 Bioanálise utilizando-se leveduras modificadas. .................................................. 42

Figura 18 – Exemplo de um gráfico em forma de cubo para o planejamento experimental 23.

.................................................................................................................................................. 46

Figura 19 – Monômero do polímero da fase extratora Strata X. .............................................. 47

8

Figura 20 – Coluna utilizada para o empacotamento com Strata X: a) conexão com volume

morto zero (ZDV, “Zero Dead Volume”); b) tela para retenção das partículas; c) tubo de aço

inox; e d) anilha de estrangulamento. ...................................................................................... 47

Figura 21 – Esquema do sistema utilizado para o empacotamento da coluna. ........................ 48

Figura 22 – Pré-coluna ligada ao reservatório contendo a suspensão para o empacotamento. 48

Figura 23 – Esquema do sistema cromatográfico utilizado para a extração on-line com a

cromatografia líquida capilar. ................................................................................................... 49

Figura 24 – Composição da fase móvel para a eluição dos compostos da pré-coluna e para a

corrida cromatográfica. ............................................................................................................. 50

Figura 25 – Imagem do reator solar de placa plana do LDTAmb: a) Placa vítrea por onde

escorre a água a ser tratada; b) Reservatório com água a ser tratada; c) agitador magnético;

d) bomba de reciclo; e) sistema de retorno de água para a bomba; (f) válvula para o controle

da vazão; g) reservatório para reposição de água; h) válvula solenoide para a reposição de

água destilada; i) sistema para a automação da reposição de água destilada; j) sensor de nível

da água a ser tratada.................................................................................................................. 53

Figura 26 – Esquema utilizado para avaliar os compostos que não ficavam retidos na coluna.

.................................................................................................................................................. 56

Figura 27 – Logaritmo do fator de retenção dos compostos Sulfacetamida, E1 (estrona) e E3

(estriol) por porcentagem de acetronitrila na fase de carregamento ( E1 E3 Sulfaceta-

mida). ........................................................................................................................................ 57

Figura 28 – Carregamento do estriol em diferentes proporções de acetronitrila na fase móvel.

.................................................................................................................................................. 58

Figura 29 – Carregamento da estrona em diferentes proporções de acetronitrila na fase móvel.

.................................................................................................................................................. 59


.................................................................................................................................................. 59

Figura 31 – Cromatograma de uma solução de 100 µg L–1 dos quatro hormônios, Estrona

(E1), 17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol (EE2) e Estriol (E3) sob as condições

cromatográficas expostas no tópico 4.3. ................................................................................... 61

Figura 32 – Resíduo (valor observado menos o predito) das diversas análises nas diferentes

concentrações, em µg L–1, dos compostos estriol (E1), 17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol

(EE2) e estrona (E3). ................................................................................................................ 62

Figura 33 – Curvas de calibração (em triplicata) usando o modelo linear ponderado com peso

x–1: E1 (estriol), E2 (17β-estradiol), EE2 (17α-etinilestradiol) e E3 (estriol). ........................ 64

9

Figura 34 – Dispersão dos resíduos (ponderados e não ponderados) nas diversas

concentrações ( E1 E2 EE2 E3). ................................................................................ 65

Figura 35 – Exatidão das análises dos hormônios em três níveis de concentração (15, 130 e

230 µg L–1). .............................................................................................................................. 68

Figura 36 – Exatidão inter-colunas ( E1 E2 EE2 E3). ............................................... 69

Figura 37 – Sorção dos hormônios no reator ( E1 E2 EE2 E3). ................................ 70

Figura 38 – Adsorção dos quatro hormônios na titânia em pH 4 ( E1 E2 EE2 E3). . 71

Figura 39 – Adsorção dos quatro hormônios na titânia em pH 8 ( E1 E2 EE2 E3). 72

Figura 40 – Degradação por fotólise dos hormônios ( E1 E2 EE2 E3). .................. 73

Figura 41 – Degradação da fotocatalítica dos quatro hormônios ( E1 E2 EE2 E3). . 73

Figura 42 – Gráficos de Pareto com os efeitos de cada variável e sua interação Estrona (E1),

17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol (EE2), Estriol (E3). ..................................................... 76

Figura 43 – Superfície de resposta do planejamento exploratório da Estrona (E1), 17β-

Estradiol (E2); 17α-Etinilestradiol (EE2); Estriol (E3). Variáveis (fatores) codificadas. ....... 77

Figura 44 – Otimização da vazão da água tratada. ................................................................... 78

Figura 45 – Degradação dos hormônios em relação a energia incidente no reator: condições

otimizadas. ................................................................................................................................ 79

Figura 46 – Desenho esquemático do sistema HPLC para a infusão em T de amônia para o

aumento da ionização dos compostos. ...................................................................................... 81

Figura 47 – Comparação entre três análises dos hormônios E1 e E2: ()sem modificador,

() 0,5% e () 1% de hidróxido de amônio (em volume). ................................................... 81

Figura 48 Sistema utilizada para a identificação de subprodutos utilizando-se SPE online. 82

Figura 49 – Cromatograma do íon extraído de massa/carga 303,1586 Da, nos tempos 0, 60,

90, 120, 150, 180 e 210 min. .................................................................................................... 83

Figura 50 – Formação do produto de massa 303,1558 Da ao longo da degradação. ............... 83

Figura 51 – Produtos de degradação com massa 303,1602 Da propostos por: (a) Mai et al.

(2008) e (b) Maboula et al. (2015), respectivamente. .............................................................. 84

Figura 52 – Molécula proposta formada na degradação da estrona. ........................................ 84

Figura 53 – Cromatograma extraído da massa 335,1447 Da nos diferentes tempos de

degradação. ............................................................................................................................... 85


Figura 55 – Molécula proposta por Ohko et al. (2002) para um produto de degradação do

estradiol (335,1500 Da, após a perda de um átomo de hidrogênio). ........................................ 86

10

Figura 56 – Molécula proposta para a massa 335,1447 Da. ..................................................... 86

Figura 57 – Cromatograma do íon extraído da massa 335.1458 Da. ....................................... 87


Figura 59 – Cromatograma do íon extraído massa/carga 319,1544 Da do estriol nos diversos

tempos de degradação. .............................................................................................................. 88


Figura 61 – Compostos propostos como produtos de degradação do E2: (a) Irmak, Erbatur e

Akgerman (2005) e (b) Maboula et al. (2015), ambos com massa/carga 319,1551 Da (M-1). 89

Figura 62 – Produtos propostos na degradação do estriol. ....................................................... 89

Figura 63 – Composto proposto por Pereira et al. (2011) na degradação do estradiol. ........... 90

Figura 64 Curva de proliferação celular (em sextuplicata). .................................................. 91

Figura 65 Absorbância causada pelo crescimento das células no sexto dia de cultivo (em

sextuplicata). ............................................................................................................................. 91

Figura 66 Curva de proliferação celular para a amostra de 9 h de irradiação (em

sextuplicata).. ............................................................................................................................ 93

Figura 67 Absorbância causada pelo crescimento das células no sexto dia de cultivo para uma

degradação de 9 h (em sextuplicata).. ....................................................................................... 93

11

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Interferentes endócrinos encontrados nos EUA em 2001. .................................... 16

Tabela 2 Principais tipos de Processos Oxidativos Avançados. .......................................... 19

Tabela 3 Classificação das colunas de cromatografia líquida de acordo com o diâmetro

interno das colunas e o intervalo de vazão da fase móvel. ....................................................... 29

Tabela 4 – Exemplo de um planejamento fatorial 23................................................................ 45

Tabela 5 – Descrição dos hormônios utilizados neste estudo. ................................................. 54

Tabela 6 – Parâmetros cromatográficos dos Estrona (E1), 17β-estradiol (E2), 17α-

etinilestradiol (EE2) e Estriol (E3) nas condições expostas no tópico 4.3. .............................. 61

Tabela 7 – Teste F para os 4 hormônios: estriol (E1), 17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol

(EE2) e estrona (E3). O F(4;4;0,99) foi de 15,98. ......................................................................... 62

Tabela 8 – Soma dos resíduos (SR) e os parâmetros da reta ajustada (y = bx + a) para os

diversos ponderamentos. .......................................................................................................... 63

Tabela 9 – Valores dos resíduos e dos parâmetros do modelo ponderado x–1.......................... 64

Tabela 10 – Média aritimética e desvio-padrão relativo (DPR) de cada pondo da curva

analítica. .................................................................................................................................... 66

Tabela 11 – Média aritmética e desvio-padrão relativo em três pontos da curva feitos em três

dias diferentes. .......................................................................................................................... 66

Tabela 12 – Recuperação relativa (efeito da matriz). ............................................................... 67

Tabela 13 – Fatores e níveis avaliados no planejamento. ........................................................ 74

Tabela 14 – Planejamento fatorial exploratório realizado (variáveis codificadas), energia

incidente e os resultados obtidos. ............................................................................................. 75

Tabela 15 – Resultados do planejamento fatorial tendo como resposta a degradação pela

energia irradiada na amostra na região do UV-A. .................................................................... 75

Tabela 16 Tabela ANOVA para os experimentos realizados em três tempos de degradação

(1, 2 e 3 horas). ......................................................................................................................... 92

Tabela 17 Teste de Dunnet (α = 0,05) para a diferença entre as observações. ..................... 92

Tabela 18 ANOVA para a amostra degradada por 9 h. ......................................................... 94

Tabela 19 Teste de Dunnet (α = 0,05) para a diferença entre as observações. ..................... 94

12

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Abs Absorbância

ACN Acetonitrila

CS Column Switching

DAD Detector de Arranjo de Diodos

E1 Estrona

E2 17β-Estradiol

E3 Estriol

EE2 17α-Etinilestradiol

fa Fator de assimetria

IE Interferentes endócrinos

K Razão entre a concentração de um analito sorvida na fase estacionária e a concen-

tração dele na fase móvel

k Fator de Retenção

LC Cromatografia Líquida

MS Espectrômetro de Massas

POA Processos Oxidatiovs Avançados

SNIS Sistema Nacional de Informações sobre Saneamento

SPE Extração em Fase Sólida

tM Tempo Morto

TOF Tempo de Voo

tr Tempo de Retenção

tr' Tempo de Retenção Ajustado

ts Tempo inicial

UV/Vis Detector de Comprimento de onda Único nas Regiões do Ultravioleta e Visível

13

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA .............................................................................. 15

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................... 16

2.1 Interferentes Endócrinos (IE) .......................................................................................... 16

2.2 Sistemas de Tratamento de Água .................................................................................... 17

2.3 Processos Oxidativos Avançados ................................................................................... 18

2.4 Fotocatálise Solar ............................................................................................................ 21

2.5 Cromatografia ................................................................................................................. 23

2.6 Cromatografia Líquida (LC) ........................................................................................... 23

2.7 Teoria Cromatográfica .................................................................................................... 24

2.8 Tipos de Cromatografia Líquida ..................................................................................... 29

2.9 Detectores para Cromatografia Líquida .......................................................................... 30

2.9.1 Espectrofotometria UV/Vis ..................................................................................... 30

2.9.2 Espectrometria de Massas ....................................................................................... 32

2.10 Análise de Compostos em Baixas Concentrações ........................................................ 38

2.10.1 Column Switching ................................................................................................. 40

2.11 Teste de Atividade Biológica ........................................................................................ 41

3. OBJETIVO ....................................................................................................................... 44

3.1 Objetivos Específicos ................................................................................................ 44

4. MATERIAis E MÉTODOS ............................................................................................. 45

4.1 Planejamento Fatorial ................................................................................................ 45

4.2 Empacotamento da coluna para SPE on-line ............................................................. 46

4.3 Cromatografia ............................................................................................................ 48

4.4 LC-MS ....................................................................................................................... 50

4.5 Curva de Calibração ................................................................................................... 51

4.6 Reator Fotocatalítico ....................................................................................................... 52

4.7 Radiação Solar ........................................................................................................... 54

4.8 Hormônios ................................................................................................................. 54

4.9 Determinação da Atividade Estrogênica (MCF-7) .................................................... 55

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................................... 56

5.1 Avaliação do Método ...................................................................................................... 56

5.2.1 Limites de Detecção e Quantificação ...................................................................... 60

14

5.2.2 Linearidade .............................................................................................................. 61

5.2.3 Precisão (Desvio-Padrão Relativo) .......................................................................... 65

5.2.4 Efeito Matriz ............................................................................................................ 67

5.2.5 Exatidão ................................................................................................................... 67

5.2.6 Precisão Inter-Colunas ............................................................................................. 69

5.2 Fotocatálise Solar ............................................................................................................ 70

5.2.1 Testes Iniciais .......................................................................................................... 70

5.2.2 Otimização do Reator .............................................................................................. 74

5.2.3 Degradação por Energia Incidente .......................................................................... 79

5.2.4 Identificação de Produtos de Degradação ............................................................... 80

5.3 Atividade Estrogênica (MCF-7) ..................................................................................... 90

6. CONCLUSÃO .................................................................................................................. 95

7. SUGESTÕES PARATRABALHOS FUTUROS ............................................................. 97

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 98

15

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

Atualmente, é muito preocupante a disposição do esgoto no Brasil, já que em 2010,

segundo o Diagnóstico dos Serviços de Água e Esgotos do Sistema Nacional de Informações

sobre Saneamento – SNIS, cerca de 50% dos municípios possuíam rede de coleta de esgoto, e

desses, apenas 38% tratavam o esgoto canalizado (SNSA, 2011). Trata-se de uma porcenta-

gem bem aquém da desejada, que se torna ainda mais grave pelo fato de que alguns compos-

tos não são degradados durante o tratamento de esgoto convencional, sendo posteriormente

devolvidos ao meio ambiente.

Como na maioria das cidades o sistema de coleta de água potável é feito em rios e la-

gos, esses compostos podem retornar, em baixas concentrações, às torneiras das residências

(HALLING-SØRENSEN et al., 1998).

A variedade de compostos antropogênicos encontrados no meio ambiente é cada vez

maior, sendo a maioria compostos provenientes do crescimento populacional humano desor-

denado. Os efeitos destes compostos ainda não são totalmente conhecidos, porém diversas

pesquisas vêm correlacionando a presença destes ao aumento de incidência de doenças.

Alguns compostos vêm ganhando cada vez mais atenção, sendo classificados como

poluentes emergentes, compreendendo um grande espectro de moléculas, tais como: fárma-

cos, produtos de higiene pessoal, plastificantes, retardantes de chama, surfactantes, pesticidas

etc. (MURRAY; THOMAS; BODOUR, 2010).

Dentro desse contexto, os fármacos vêm ganhando bastante atenção da comunidade

cientifica devido aos efeitos deletérios que podem causar tanto à saúde animal quanto à hu-

mana. Os interferentes endócrinos, classe de fármacos capaz de interferir na no sistema endó-

crino de organismos, são rotineiramente utilizados pela população. No entanto, quando inge-

ridos de forma indevida, são responsáveis por algumas anomalias no processo fisiológico e

distúrbios reprodutivos, além de possíveis efeitos sinérgicos (KOLPIN et al., 2002).

Dessa forma, é imprescindível o desenvolvimento de técnicas tanto para a determina-

ção desses compostos no meio ambiente quanto para o seu tratamento.

16

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Interferentes Endócrinos (IE)

Interferentes endócrinos pertencem a uma classe de compostos que mimetizam hor-

mônios naturais do organismo, podendo causar doenças (SUMPTER, 1998). Eles podem ser

responsáveis por problemas no sistema reprodutivo em machos e fêmeas, pelo aumento da

frequência de certos tipos de câncer e por atrasos no desenvolvimento de crianças (EPA,

2011).

A lista de interferentes endócrinos presentes em sistemas aquáticos é bem extensa e

eles podem ter diferentes fontes, tais como: produtos de higiene pessoal, plásticos, hormônios

naturais excretados, fármacos utilizados para controle de natalidade etc.

Os hormônios que têm a maior contribuição para a atividade estrogênica em esgotos

são os hormônios: (a) naturais: estriol (E3), 17β-estradiol (E2) e estrona (E1); e (b) sintéti-

co: 17α-etinilestradiol (EE2) (AURIOL et al., 2006).

Como exemplo, o trabalho de Kolplin et al. (2002) relatou a presença destes compos-

tos nos rios dos Estados Unidos da América. A Tabela 1 apresenta os resultados obtidos pe-

los autores em 2001.

Tabela 1 Interferentes endócrinos encontrados nos EUA em 2001.

IE Amostras Maior Concentração

Encontrada (µg L–1) Média (µg L–1)

Estriol (E3) 70 0,051 0,019

17α-etinilestradiol (EE2) 70 0.831 0,073

17β-estradiol (E2) 85 0,2 0,16

Estrona (E1) 70 0,112 0,027

Fonte: Adaptado de KOLPIN, D. W.; FURLONG, E. T.; MEYER, M. T.; THURMAN, E. M.; ZAUGG, S. D.;

BARBER, L. B.; BUXTON, H. T. Pharmaceuticals, hormones and other organic wastewater contami-

nants in U.S. streams, 1999–2000: A national reconnaissance. Environmental Science & Technology,

v. 36, n. 6, p. 1204–1211, 2002.

17

Apesar de os interferentes endócrinos ocorrerem em baixas concentrações no meio

ambiente, um estudo realizado por Purdon et al. (1994) demonstrou que apenas 1 ng L–1 de

17β-estradiol (E2) ou 0,1 ng L–1 de 17α-etinilestradiol (EE2) são capazes de produzir efeito

biológico em peixes, como por exemplo a mudança de sexo dos mesmos, o que é um indicati-

vo de sua atividade mesmo em baixas concentrações.

Dentro desse contexto, se faz necessário que o sistema de tratamento de água seja efi-

ciente na remoção destes compostos.

2.2 Sistemas de Tratamento de Água

O sistema de tratamento de água para abastecimento público mais utilizado nas cida-

des brasileiras é o que conta com a captação de um reservatório de água (represa, lago ou rio),

como o demonstrado na Figura 1, simplificadamente. Após a captação, a água recebe a adi-

ção de compostos que facilitam a remoção de partículas, geralmente os mais utilizados são o

sulfato de alumínio ou cloreto de ferro (III), esta adição é feita sob agitação. Assim, as partí-

culas de sujeira ficam eletricamente desestabilizadas e mais fáceis de agregar (Coagulação).

A correção do pH se faz necessário, utilizando-se para isso óxido de cálcio. Pode-se fazer

também uma pré-desinfecção, adicionando-se cloro nesta etapa (SABESP, 2015).

Com os flocos formados, a água passa por uma região de baixa agitação para que os

mesmos possam decantar (decantação), assim, facilita-se a remoção das partículas sólidas da

água. A filtração da água é feita no próximo compartimento, possibilitando a remoção de al-

gumas substancias solúveis. Por último, é realizada a desinfecção da água, com a utilização

de agentes oxidantes, geralmente cloro, sendo em alguns casos também utilizada a fluoração

da água, para melhorar a saúde bucal da população (SABESP, 2015).

Apesar de muito eficiente na remoção de sólidos, esse sistema é pouco efetivo para a

remoção de compostos em baixas concentrações, mesmo com a utilização de carvão ativado

ou antracito como adsorvente, não garantindo a remoção de todos os contaminantes, como é o

caso dos interferentes endócrinos.

18

Figura 1 Esquema simplificado de um tratamento de água para abastecimento público

Fonte: OLIVEIRA, F. R.; SILVEIRA, A. A.; GOMES, T. L.; SILVA, S. A.; GALVÃO, D. M. O sistema de

captação, tratamento e distribuição de águas em Barretos. Revista Eletrônica de Ciências, n. 28, 2004.

Diante disso, novos estudos se fazem necessários para o desenvolvimento de tecnolo-

gias de tratamento que visem à remoção ou degradação de tais compostos, sendo os Processos

Oxidativos Avançados (POA) uma alternativa possível para essa finalidade.

2.3 Processos Oxidativos Avançados

Os Processos Oxidativos Avançados (POAs) são métodos de tratamento que utilizam a

geração de agentes oxidantes para a possível mineralização dos poluentes. O principal agente

oxidante gerado por esse processo é o radical hidroxila (OH) (TEIXEIRA; JARDIM, 2004).

Existem vários métodos de obtenção desse radical, sendo alguns deles apresentados na

Tabela 2, na qual se encontram agrupados os POAs pela presença ou não de duas ou mais

fases (homogêneo ou heterogêneo) e pela presença ou não de irradiação (HUANG; DONG;

TANG, 1993).

19

Tabela 2 Principais tipos de Processos Oxidativos Avançados.

Sistemas Sem Irradiação Com Irradiação

Homogêneos • O3/H2O2

• O3/OH–

• H2O2/Fe2+ (Fenton)

• O3/UV

• H2O2/UV

• Feixe de elétrons

• H2O2/US

• UV/US

Heterogêneos • Eletro-Fenton • TiO2/O2/UV

• TiO2/H2O2/UV

Fonte: Adaptado de TEIXEIRA, C. P. A. B.; JARDIM, W. F. Caderno Temático: Processos Oxidativos Avan-

çados. v. 3 Disponível em: <http://lqa.iqm.unicamp.br/cadernos/caderno3.pdf> Acesso em 04 abril 2013.

2004.

No presente trabalho, foi utilizada a fotocatálise heterogênea. O primeiro relato da sua

utilização para a degradação de compostos orgânicos foi feito por Carey, Lawrence e Tosine

(1976), que degradaram a bifenila e clorobifenilas, utilizando-se o dióxido de titânio como

fotocatalisador.

Vários semi-condutores podem agir como fotocatalisadores: TiO2, ZnO, CeO2, CdS,

ZnS etc. (GOGATE; PANDIT, 2003). O semi-condutor pode ser utilizado para reações de

foto-oxirredução devido à sua estrutura eletrônica, caracterizada por uma banda de valência

ocupada, uma banda de condução vazia e uma diferença de potencial (bandgap) em um nível

intermediário, como demonstrado na Figura 2 (HOFFMANN et al., 1995).

O dióxido de titânio é o semicondutor mais utilizado devido a suas características ine-

rentes, como por exemplo, baixo custo, baixa toxicidade, foto-estável e por ter uma larga fai-

xa de pH dentro da qual pode atuar. O bandgap do TiO2 correspondente a um comprimento

de onda na região do UV próximo (388 nm) (RODRIGUES et al., 2008).

20

Figura 2 Bandgap de condutores, semicondutores e não-condutores.

Fonte: Adaptado de MOHANTY, S; RAO, N. N.; KHARE, P.; KAUL, S. N. A coupled photocatalytic-

biological process for degradation of 1-amino-8-naphthol-3,6-disulfonic acid (H-acid). Water Research,

v. 39, n. 20, p. 5064-5070, 2005.

Quando fótons com energia maior ou igual ao bandgap atingem o semicondutor, elé-

trons da banda de valência são promovidos para a banda de condução. A partir desse fenô-

meno, é gerado um par elétron(eBC–)-lacuna(hBV

+) (Equação 1) que pode sofrer uma recombi-

nação interna ou externa gerando calor, ou pode reagir com moléculas adsorvidas na superfí-

cie do catalisador, produzindo reações de oxirredução (LEGRINI et al., 1993), conforme as

Equações 210. As Equações 23 referem-se às reações produzidas pela lacuna da banda de

valência (reações de oxidação) e as Equações 410 referem-se às reações causadas pelo elé-

tron da banda de condução (reações de redução).

TiO2 hv h+

BV + e−BC (1)

h+BV

H2O(ads) + h+BV→•OH + H+ (2)

OH−(sup) + h+

BV → •OH (3)

e−BC

O2 + e−BC → O2

•− (4)

O2•− + H+ → HO2

• (5)

HO2• + HO2

• → H2O2 + O2 (6)

O2•−

+ HO2• → HO2

− + O2 (7)

HO2− + H+ →H2O2 (8)

H2O2 + e−BC → •OH + OH− (9)

H2O2 + O2• → •OH + OH− + O2 (10)

21

Existem, predominantemente, duas maneiras de se usar o dióxido de titânio na foto-

catálise: suportado ou em suspensão. A suspensão tem como vantagem a alta área superfici-

al, já que toda a superfície do fotocatalisador fica à disposição para as reações. No entanto, a

separação catalisador/efluente torna-se trabalhosa e dosagens muito altas de fotocatalisador

tornam o meio opaco à radiação incidente. Tais problemas não ocorrem quando se utiliza o

catalisador suportado, visto que não se necessita da etapa de separação, porém existe uma

perda considerável de área superficial (MAHMOODI et al., 2006).

O TiO2 apresenta três alotrópos comumente encontrados: anatásio, brookita e rutilo.

Poucos estudos são apresentados com a brookita, pois é difícil obtê-la na forma pura (LI;

ISHIGAKI; SUN, 2007). Apesar de a fase anatásio (utilizada pura) apresentar melhores taxas

de degradação fotocatalítica quando comparada às do rutilo (LUTTRELL et al. 2014), o foto-

catalisador de TiO2 mais utilizado é uma mistura 70:30 de anatásio:rutilo (P25, Evonik), sen-

do defendido por alguns autores a presença de um efeito sinérgico entre as fases (HURUM et

al., 2003) e por outros que esse efeito não existe (OHTANI et al. 2010), sendo a diferença

causada pela forma de obtenção dos alótropos puros.

Apesar de existirem vários estudos em escala laboratorial sobre a utilização dos POAs

no tratamento de efluentes, estes processos ainda encontram resistência em sua aplicação,

principalmente pelo alto custo, quando comparados com processos já comumente utilizados.

Uma alternativa para a diminuição desses custos é a utilização de radiação solar para a ativa-

ção do fotocatalisador.

2.4 Fotocatálise Solar

A energia solar pode ser uma fonte alternativa para as degradações fotocatalíticas. De

toda a radiação que chega ao solo, apenas uma pequena porção (3 a 4%) pode ser aproveitada

para a promoção do elétron da banda de valência para a banda de condução do dióxido de

titânio, já que é necessária uma energia maior que 3,27 eV (energia equivalente ao bandgap

do TiO2). Tal energia ocorre em comprimentos de onda menores que 388 nm, situados na

região do UV-A (NOGUEIRA; JARDIM, 1996).

22

Apesar de se poder utilizar apenas uma pequena fração da radiação que chega à super-

fície terrestre para a fotocatálise, várias pesquisas para a degradação de compostos não biode-

gradáveis em reatores solares são realizadas, obtendo-se bons resultados.

García-Ripoll et al. (2007) obtiveram 100% de degradação de uma solução a 50 mg L–1 do

inseticida Ultracide (methidathion) em 2 h de fotocatálise solar. Vilela et al. (2012) utiliza-

ram a radiação solar para degradar fotocataliticamente10 µg L–1 de [D-Leu]-Microcistina-LR,

e obtiveram 90% de remoção em 2 h, utilizando o TiO2 (P25) suportado em uma placa de

vidro jateado.

Silva, Otero e Esteves (2012) fizeram um estudo detalhado da produção científica so-

bre tratamentos para a degradação ou remoção de hormônios. Nesse levantamento, é possível

observar-se a utilização da fotocatálise com dióxido de titânio em diversos trabalhos, porém

somente dois utilizaram a radiação solar para a fotólise destes compostos e apenas um utilizou

a fotocatálise tendo o Sol como fonte de energia.

Os dois trabalhos avaliaram a fotodegradação solar da estrona e do 17β-estradiol, na

presença de diversos possíveis interferentes. A estrona apresentou um tempo de meia-vida de

52,50 min em águas naturais (100 µW cm2) (CHOWDHURY; CHARPENTIER; RAY,

2010). Já o 17β-estradiol, sob condições variadas, apresentou tempos de meia-vida variando

de 10 a 25 h, dependendo da intensidade da energia irradiada e das características da água,

tais como: concentração de NO3–, HCO3

– e Fe+3, pH, ácidos húmicos e turbidez. O NO3– e o

Fe3+ foram responsáveis pelo aumento da fotodegradação e o HCO3– pela sua diminuição, por

esse agir como sequestrante do radical hidroxila (CHOWDHURY; CHARPENTIER; RAY,

2011).

O único trabalho que estudou a luz solar na ativação de fotocatalisadores para a degra-

dação de hormônios foi feito por Han et al. (2012), no qual o objetivo principal foi comparar

os catalisadores TiO2 e ZnO na degradação da estrona. Foi utilizado um reator com os catali-

sadores em suspensão, obtendo-se uma degradação maior que 99% em menos de 15 min, com

uma irradiação de 4 W cm–2 e 0,05 g L–1 de ambos os fotocatalisadores.

Além dos trabalhos descritos na revisão de Silva, Otero e Esteves (2012), Mboula et

al. (2015) avaliaram nanoestruturas de titânio e partículas de dióxido de titânio (P25) irradia-

23

do com um simulador solar para a degradação do 17β-estradiol (E2). As partículas comerci-

ais de dióxido de titânio obtiveram melhor desempenho, com mais 90% de degradação em

90 min, enquanto as nanoestruturas de titânio atingiram apenas 30% de degradação no mesmo

tempo, sendo o volume tratado de 1 L e a concentração de cada catalisador de 20 mg L-1. Este

reator trabalhou em batelada, ou seja, a amostra foi mantida sob radiação por toda a degrada-

ção.

Um fator crítico para a realização de trabalhos de degradação é a parte analítica do

processo, pois os interferentes endócrinos ocorrem em baixas concentrações (g ou ng por

litro) e há a presença de outros compostos que podem interferir na detecção dos mesmos e que

podem influenciar na degradação. Isso é um desafio, sendo necessário o desenvolvimento de

metodologias aptas para este tipo de análise ou a aquisição de equipamentos de alto custo.

2.5 Cromatografia

A cromatografia é uma técnica analítica eficaz na separação de compostos para a sua

possível detecção. O processo de separação é baseado na diferença de interação (força e tipo)

dos compostos entre a fase móvel e a fase estacionária.

Existem vários tipos de cromatografia, dependendo da fase móvel e/ou da fase estaci-

onária. A escolha de qual deve ser utilizada é função dos analitos a serem avaliados. No caso

de fármacos, a cromatografia líquida de fase reversa é a mais utilizada, pois a maioria desses

compostos possuem polaridade intermediária e alto ponto de ebulição.

2.6 Cromatografia Líquida (LC)

A cromatografia líquida (LC) é caracterizada por utilizar como fase móvel um líquido

e uma fase estacionária na maioria das vezes sólida. O equipamento de cromatografia líquida

é constituído basicamente de bombas utilizadas para empurrar a fase móvel por todo o siste-

ma. A coluna cromatográfica (local no qual a fase estacionária permanece retida) fica inseri-

24

da em um forno, onde ocorre a separação dos compostos de interesse que, após devidamente

isolados, atingem o sistema de detecção, como demonstrado na Figura 3.

Figura 3 Esquema simplificado de um cromatógrafo líquido.

O esquema apresentado na Figura 3 conta com duas bombas, permitindo assim fazer a

modificação da fase móvel durante a separação cromatográfica, possibilitando assim uma

maior capacidade de separação durante as análises. Após a separação dos compostos, esses

são conduzidos para o detector, que gera um gráfico denominado cromatograma, construído

ao se plotar o sinal analítico na ordenada o tempo na abscissa.

2.7 Teoria Cromatográfica

A separação dos compostos depende do equilíbrio que cada composto estabelece entre

a fase móvel e a fase estacionária. A razão entre a concentração de um analito hipotético A

sorvida na fase estacionária [AEstacinária] e a concentração dele na fase móvel [AMovel] é deno-

minada K, ou razão de distribuição (Equação 11).

𝐾 =

[A𝐸𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛á𝑟𝑖𝑎]

[A𝑀ó𝑣𝑒𝑙]

(11)

Quanto maior o valor de K maior é a afinidade do composto com a fase estacionária,

consequentemente, mais tempo o analito permanecerá na coluna cromatográfica, fato que

acarretará em um tempo maior para o mesmo ser eluído da coluna.

25

Em uma situação hipotética para a separação cromatográfica de três compostos (A, B,

C), o cromatograma da Figura 4 seria o resultado da análise, sendo cada composto o respon-

sável por um pico. É possível deduzir que o composto C é o que possui maior interação com

a fase estacionária, consequentemente, ele possui o maior valor de K.

Figura 4 Cromatograma de uma solução contendo os solutos hipotéticos A, B e C.

Fonte: Adaptado de BRAITHWAITE, A.; SMITH, J. F. Chromatographic Methods. Dordrecht:

Kluwer Accademic Publishers 1995.

Também é possível observar outros parâmetros importantes em um cromatograma.

A partir do momento em que a válvula do injetor é colocada na posição de injeção, o detector

começa adquirir dados (ts).

O tempo morto (tM), definido como o tempo necessário para que uma molécula percor-

ra todo o equipamento sem interagir com a fase estacionaria, é caracterizado no cromatogra-

ma com uma perturbação na linha de base, provocada pelo solvente da amostra. Caso esse

26

não seja facilmente visualizado, um analito que sabidamente tem pouca interação com a fase

estacionária pode ser utilizado, como exemplo, a uracila é utilizada para colunas do tipo C18.

Com o tM é possível calcular-se o tempo de retenção ajustado de cada composto (t’R).

Esse cálculo é importante para que seja possível a comparação do tempo de retenção de um

composto quando analisado em sistemas cromatográficos diferentes, nos quais os volumes

dosa sistemas podem ambém ser diferentes. O tempo de retenção ajustado é calculado pela

diferença entre o tempo morto (tM) e o tempo de retenção (t’R), conforme apresentado na

Equação 12.

𝑡𝑅′ = 𝑡𝑅 − 𝑡𝑀 (12)

Com os tempos de retenção de um composto e o tempo morto da análise é possível

encontrar o Fator de Retenção (k), que é um valor mais prático que o K para se descrever a

retenção de cada composto (Equação 13).

k =

tR − tM

tM

(13)

Como a vazão durante a análise é conhecida, pode-se também obter o volume necessá-

rio de fase móvel para a eluição completa dos compostos (VR), possibilitando, assim, calcular-

se o volume ocupado pela fase móvel dentro do sistema (Vm).

Outro importante parâmetro disponível em um cromatograma é a altura do pico (h),

que é definido como o sinal analítico mais intenso provocado pelo analito. Esse parâmetro é

importante para se definir o limite de detecção (valor padronizado em que se tem a certeza de

que o composto está presente) e de quantificação (valor padronizado no qual se pode obter a

concentração dentro de um determinado nível de confiança). Geralmente, a padronização do

limite de detecção (LD) e do limite inferior de quantificação (LIQ) é feita pela razão da altura

do pico pelo ruído da linha de base, na região adjacente aos picos ou do mesmo tempo de re-

tenção de uma injeção contendo apenas a matriz, três vezes e dez vezes respectivamente, sen-

do que para o limite de quantificação é necessário os níveis precisão e exatidão se encontrem

em níveis aceitáveis (ANVISA, 2003).

27

A área do pico é uma dimensão que pode ser é correlacionada à concentração do anali-

to na amostra.

A largura da base pode ser utilizada para o cálculo do número de pratos teóricos (N)

para um determinado composto. Essa medida caracteriza o quão eficaz é o método cromato-

gráfico para a separação dos compostos. A Equação 14 define como N pode ser calculado

utilizando-se a largura da base (Wb); já a Equação 15 apresenta o cálculo utilizando-se a lar-

gura da base a meia altura (Wh).

N = 16 ∗ (tR

Wb)2 (14)

N = 5,54 ∗ (tR

Wh)2 (15)

Uma boa separação cromatográfica é avaliada pela resolução entre os picos cromato-

gráficos. Uma boa resolução (Equação 16) propicia a acurácia nas análises quantitativas, já

que a área do pico pode ser facilmente calculada. O valor ideal para a resolução entre dois

picos é de 1,2 a 1,5 (BRAITHWAITE; SMITH, 1995).

Figura 5 Separação cromatográfica.

Fonte: Adaptado de BRAITHWAITE, A.; SMITH, J. F. Chromatographic Methods. Dordrecht: Kluwer

Academic Publishers 1995.

28

𝑅𝑠 = ∆𝑡

(𝑊𝑏𝐵 + 𝑊𝑏𝐴) (16)

Outro cálculo que está diretamente relacionado com a eficiência cromatográfica é o

fator de assimetria (fa), o qual verifica o quão simétrico está o pico cromatográfico (SILVA et

al., 2010), avaliando-se a presença de cauda ou de deformações no começo do pico (fronting).

Os picos considerados com distribuição normal possuem valores para fa compreendidos entre

0,8 e 1,2. A Figura 6 e a Equação 17 demonstram como é feito os cálculos do fator de assi-

metria.

Figura 6 Pico cromatográfico com os detalhes para os cálculos do fator de assimetria.

𝑓𝑎 =𝑏 − 𝑐

𝑐 − 𝑎 (17)

Sendo “c” o ponto central do pico, “a” o limite do pico a esquerda e “b” o limite do

pico a direita ambos a 10% da altura máxima do mesmo, como demonstrado na Figura 6.

29

2.8 Tipos de Cromatografia Líquida

A cromatografia líquida pode ser diferenciada pela faixa de vazão empregada e pelo

diâmetro de suas colunas. A diminuição das colunas cromatográficas empacotadas, sem di-

minuição na capacidade de separação dos cromatógrafos, só foi possível com o desenvolvi-

mento de partículas da fase estacionária cada vez menores e com a melhoria das bombas cro-

matográficas, já que quanto menores são as partículas, maior a pressão necessária para bom-

bear a fase móvel (LANÇAS, 2009a).

A Tabela 3 apresenta a classificação das colunas quanto ao diâmetro interno e à vazão

típica aplicável. Quanto menor é a coluna, menor é o volume de fase móvel utilizada na cor-

rida cromatográfica.

Tabela 3 Classificação das colunas de cromatografia líquida de acordo com o diâmetro interno das colunas e

o intervalo de vazão da fase móvel.

Denominação da coluna Diâmetro interno Vazão típica

Preparativas > 10 mm > 20 mL min–1

Semipreparativas 4,6 – 10 mm 5 – 20 mL min–1

Convencional/padrão 4,0 – 4,6 mm 1 – 5 mL min–1

Narrowbore 2,0 – 4,0 mm 0,2 – 2 mL min–1

Microbore 1,0 – 2,0 mm 50 – 1000 μL min–1

Capilar 100 μm – 1 mm 0,5 – 200 μL min–1

Nanobore 25 – 100 μm 25 – 4000 nL min–1

Tubulares abertas < 25 μm < 25 nL min–1

Fonte: LANÇAS, F. M. Cromatografia líquida moderna: HPLC/CLAE. Campinas: Átomo, 2009.p. 138.

Basicamente, o cromatógrafo é constituído por 4 módulos: bombas, injetor, forno

(coluna) e detector. O sinal analítico referente aos compostos de interesse após estes passa-

rem pelo sistema de separação é gerado pelo detector que é discutido mais profundamente no

item 2.10.

30

2.9 Detectores para Cromatografia Líquida

Vários detectores podem ser acoplados à cromatografia líquida. Para isso, o detector

deve ser sensível aos analitos de interesse e não ao solvente utilizado. Os detectores mais

utilizados são o espectrofotômetro de Ultravioleta/Visível e o Espectrômetro de Massas.

2.9.1 Espectrofotometria UV/Vis

Os principais atrativos da utilização desta técnica acoplada com cromatografia liquida

são: o baixo custo do detector, a grande variedade de compostos que podem ser avaliados e a

não destruição da amostra, possibilitando o acoplamento com outros detectores.

Dentre as desvantagens, pode-se citar a baixa seletividade da técnica, já que vários

compostos podem absorver em um mesmo comprimento de onda, incluindo compostos que

não são de interesse na análise. Além disso, a técnica é pouco sensível, quando comparada à

espectrometria de massas, por exemplo.

A Figura 7 demonstra um esquema simplificado de um LC que possui como detector

um Espectrofotômetro de Ultravioleta e Visível (LC-UV/Vis). Para que o detector consiga

fazer análises nos comprimentos de onda da região do ultravioleta (200-400 nm) e do visível

(400-700 nm) é necessária à presença de duas lâmpadas: uma lâmpada de deutério, para as

análises na região do ultravioleta, e uma lâmpada de tungstênio, para a região do visível.

A seleção da lâmpada a ser utilizada na análise é feita pelo espelho que direciona o feixe de

luz para a cela do detector.

Após a seleção da lâmpada a ser utilizada na análise, o feixe de luz passa por um mo-

nocromador, onde é possível se obter o comprimento de onda desejado para que esse atinja os

analitos que passam pela cela de detecção. Os primeiros espectrofotômetros contavam com

um prisma para a decomposição da luz, porém, esse foi substituído por uma rede de difração.

31

O monocromador também possui uma fenda por onde passa o comprimento de onda

desejado. Quanto menor é a fenda, mais exato é o comprimento de onda da luz a ser irradiado

na amostra.

Figura 7 Esquema simplificado de um LC com o detector Espectrofotômetro de Ultravioleta e Visível.

A cela do detector UV/Vis tem a mesma função de uma cubeta de um espectrofotôme-

tro de bancada, possibilitando a passagem da radiação pela amostra. A cela pode ter diversos

caminhos óticos e volumes. Um tamanho maior permite o aumento da sensibilidade do detec-

tor pois, segundo a Lei de Lambert-Beer (Equação 16), para uma mesma amostra, se o cami-

nho ótico (l) for maior, maior será a sua absorbância (Abs), já que sua concentração (C) é a

mesma, assim como sua absortividade molar (α). A diminuição do volume da cela permite o

acoplamento deste detector com a cromatografia, que utiliza pequenas vazões de trabalho,

como no caso da cromatografia capilar.

𝐴𝑏𝑠 = 𝐶 ∗ 𝛼 ∗ 𝑙 (16)

A diferença de intensidade da radiação que passa pela cela de detecção na presença de

analitos que a absorvam é percebida pelo componente eletrônico (fotodiodo) inserido no ca-

minho da luz após a cela de detecção.

32

Outro detector que utiliza os mesmos princípios do detector UV/Vis, mas que possui a

capacidade de avaliar vários comprimentos de onda ao mesmo tempo, é denominado de De-

tector de Arranjo de Diodo (DAD). A configuração de ambos são parecidas, porém no DAD

não existe monocromador, apenas uma rede de difração após a cela do detector, que permite a

decomposição da luz nos seus diferentes comprimentos de onda, permitindo a análise simul-

tânea da energia incidida pelo arranjo de diodos, como demonstrado na Figura 8.

Figura 8 Esquema simplificado de um LC acoplado com um Detector de Arranjo de Diodo.

Outro detector muito utilizado em LC é o espectrômetro de massas (MS), que será dis-

cutido no item 2.9.2.

2.9.2 Espectrometria de Massas

A espectrometria de massas, como forma de detecção, é bastante eficiente quando

acoplada à cromatografia líquida, pois possui alta seletividade, proporciona baixos limites de

detecção e permite analisar uma grande variedade de compostos. Para isso, é necessário ape-

nas que o composto de interesse adquira pelo menos uma carga (negativa ou positiva) para

que possa ser analisado.

33

As principais partes de um espectrômetro de massas são a fonte de ionização, o anali-

sador e o detector.

A inovação tecnológica mais importante que permitiu o fácil acoplamento da croma-

tografia líquida com a espectrometria de massas foi a fonte de ionização, já que a cromatogra-

fia líquida, em sua maioria, trabalha com altas pressões, e os espectrômetros de massas traba-

lham em pressões baixas.

2.9.2.1 Fonte de Ionização

As fontes de ionização mais utilizadas são as denominadas API (do inglês Atmosphe-

ric Pressure Ionization), em que se destacam: ESI (Ionização por “Electrospray”), APCI (Io-

nização Química à Pressão Atmosférica) e APPI (Fotoionização à Pressão Atmosférica).

A escolha da fonte é realizada dependendo da propriedade química de cada composto,

como por exemplo a polaridade e a massa molecular como demonstrado na Figura 9.

Figura 9 ESI, APCI e APPI e sua aplicação em relação à polaridade e massa molecular dos analitos.

Fonte: SYAGE, J. A.; SHORT, L. C.; CAI, S. S. Atmospheric pressure photoionization The second source

for LC-MS? Lc Gc North America, v. 26, n. 3, p. 286–287, 2008.

34

Geralmente, com o mesmo espectrômetro de massas, tem-se a opção de se utilizar

duas fontes diferentes de ionização (APCI e ESI), sendo um item opcional no momento da

compra do equipamento. A fonte de ionização por “electrospray é a fonte mais utilizada para

análises de compostos emergentes. Pode-se observar na Figura 10, que demonstra o esquema

simplificado para uma fonte do tipo ESI, que a saída do cromatógrafo líquido é ligada na

entrada do espectrômetro. Assim, toda fase móvel oriunda do cromatógrafo passa por um

capilar (eletrodo) que possui um alto potencial elétrico (normalmente de 3 a 4 kV) em relação

a seu contra-eletrodo (DASS, 2007). Com isso, ocorre a dessolvatação do meio (remoção da

fase móvel) e a condução dos analitos já com carga para a entrada da antecâmara de

ionização. Nos espectrômetros modernos, a condução dos íons é feita por um hexapolo

(podendo ser um quadrupolo ou octapolo) para aumentar os ions direcionados ao analisador.

Figura 10 Esquema simplificado de um LC-MS com Ionização por "Electrospray" (ESI).

Fonte: Adaptado de DASS, C. Fundamentals of Contemporary Mass Spectrometry. John Wiley & Sons,

2007. p. 512.

A ESI é uma fonte sensível à concentração, por isso é uma técnica muito utilizada para

cromatográfos com baixa vazão, como por exemplo os cromatógrafos líquidos capilares. No

entanto, antes da utilização dessa forma de ioização, deve-se considerar o diâmetro do capilar

de entrada da fonte de ionização utilizada, já que diâmetros muito grandes podem acarretar no

alargamento da banda cromatografica.

Os sitema APCI é bem parecido com o sitema ESI, porém a dessolvatação é realizada

apenas utilizando-se temperaturas elevadas e a ionização é feita com a aplicação de um

potencial eletrico, por meio de uma agulha corona (Figura 11). A APCI é sensível fluxo

mássico e não à concentração do analito (EDMONDSON; RUSSEL, 1998), fato que limita

35

sua utilização com cromatografia com vazões reduzidas, como é o caso da cromatografia

capilar.

Figura 11 – Esquema simplificado de um LC-MS como Ionização Química a Pressão Atmosférica (APCI)

Fonte: Adaptado de DASS, C. Fundamentals of Contemporary Mass Spectrometry. New York: John Wiley

& Sons, 2007. p. 512

2.9.2.2 Analisadores

O analisador é uma das partes mais importantes do espectrômetro de massas, tanto que

o nome do equipamento, na maioria das vezes, é relacionado ao analisador presente.

O analisador é o responsável pela seleção dos íons para a detecção, sendo também

chamado por alguns autores de filtro de íons (DAWSON, 1976), já que tem a função de con-

duzir íons de massa/carga (m/z) específica para o próximo estágio do espectrômetro.

A escolha do analisador depende de alguns fatores, como, por exemplo, o tipo de apli-

cação desejada, o intervalo de massas de interesse, o poder de resolução, a exatidão da massa,

a taxa de transmissão dos íons, a sensibilidade, a quantificação, a velocidade de varredura,

bem como a facilidade de acoplamento como o sistema de separação.

36

O analisador mais comum utiliza quatro hastes simetricamente arranjadas, às quais é

aplicado um potencial elétrico alternado por radiofrequência (RF) sobreposto a um potencial

de corrente contínua (DC). Com a interação dos potenciais aplicados, um campo elétrico é

criado, estabilizando os íons axialmente introduzidos no centro das quatro hastes, de acordo

com sua razão massa carga (m/z). Dependendo da intensidade e frequência das voltagens

aplicadas, diferentes relações m/z podem ser filtradas através do analisador (SANTOS-NETO,

2008), como demonstrado na Figura 12. Esse analisador é denominado quadrupolo.

Figura 12 – Feixe de íons inserido no analisador quadrupolar demonstrando a transmissão dos íons estabilizados

(M1) e a desestabilização dos íons não desejados no momento (M2 e M3).

Fonte: Adaptado de HERBERT, C.; JOHNSTONE, R. A. W. Mass spectrometry basics. Boca Raton: CRC,

2003. 474 p.

O acoplamento do espectrômetro de massas com a cromatografia líquida é demonstrado simplificada-

mente na Figura 13.

Figura 13 – Esquema de um cromatógrafo líquido acoplado com o detector do tipo Quadrupolo.


& Sons, 2007. p. 512

37

Os analisadores do tipo quadrupolo podem ser acoplados em série, sendo denominados

por triploquadrupolo (QqQ), visto que são constituídos por 3 quadrupolos, o segundo sendo

utilizado apenas para a fragmentação de um composto em novos íons.

Apesar dos analisadores do tipo triplo-quadrupolo conseguirem detectar baixas

concentrações (na faixa de nanograma por litro), não têm uma boa resolução de massas, ou

seja, não conseguem diferenciar massas próximas (que diferem entre si nas casas decimais).

Uma opção para se obter a massa precisa com até 4 casas após a virgula é a utilização

de um espectrômetro de alta resolução, como é o caso do analizador Time of Flight (ToF -

Tempo de Voo) (NÚÑEZ; MOYANO; GALCERAN, 2004).

O analisador por tempo de vôo baseia a separação de massas no tempo que uma massa

necessita para percorrer todo o analisador. Quanto maior o tempo, maior sua relação m/z, ou

seja, a velocidade de um íon é inversamente proporcional à raiz quadrada da sua relação

massa/carga (Dass, 2007).

Após ionizadas na fonte de ionização, as moléculas são aceleradas com o auxilio de

um campo elétrico (região de aceleração), entrando em um tubo longo, direcionadas pelos

pratos defletores.

A Figura 14 apresenta um esquema simplificado de um cromatógrafo liquido acoplado

a um espectrômetro de massas com o analisador do tipo ToF.

Um grande avanço nos analisadores ToF é a utilização de um refletor, conhecido

também como espelho de íons (ou espelho eletrônico), visto que tem a finalidade de

redirecionar os íons, contribuindo para a melhora da resolução, possibilitanto trajetos maiores

em um espaço físico menor (LANÇAS, 2009b). Um dos problemas deste analisador, apesar

de ter uma alta resolução, é sua sensibilidade bem inferior ao triplo quadrupolo.

38

Figura 14 – Esquema simplificado de um cromatógrafo líquido acoplado com um analisador TOF.


& Sons, 2007. p. 512

2.10 Análise de Compostos em Baixas Concentrações

A detecção de compostos em baixas concentrações é um constante desafio para a quí-

mica analítica, visto que, muitas vezes, são necessários equipamentos de alto custo. Uma

alternativa a esse problema é o desenvolvimento de metodologias de concentração e clean-up

que consigam elevados fatores de concentração do analito e elevada seletividade, eliminando,

pelo menos em parte, os interferentes da amostra (preparo de amostra).

Esta etapa é uma das mais importantes no desenvolvimento de um método analítico,

consumindo até 80% do tempo total de análise, dependendo da complexidade da matriz

(KATAOKA, 2003).

As primeiras técnicas de extração utilizadas foram as extrações líquido-líquido, que se

baseiam no coeficiente de partição de cada analito entre dois solventes. Esse método ainda é

bastante utilizado em análises de rotina, porém apresenta como desvantagens: elevados vo-

lumes de solvente orgânicos, baixos fatores de concentração, baixas especificidades, difícil

39

automação e custo elevado (devido às etapas de amostragem e descarte dos resíduos forma-

dos).

Na década de 70, foi desenvolvida a técnica de extração em fase sólida (SPE – Solid

Phase Extraction), a qual é baseada nos mecanismos de separação da cromatografia líquida

clássica, empregando-se uma pequena coluna aberta (Figura 15), usualmente denominada

cartucho de extração, que contém a fase sólida utilizada para a extração dos analitos

(LANÇAS, 2004).

Figura 15 Cartucho de SPE.

Existem vários tipos de fases extratoras que operam com diferentes mecanismos de

extração, por exemplo: adsorção, partição, troca iônica, exclusão por tamanho etc. Dentre as

fases mais comumente utilizadas estão a C18, amino, sílica gel, fenil e ciano. A escolha do

tipo de fase extratora a ser utilizada depende tanto das propriedades dos compostos-alvo quan-

to da matriz onde esses estão inseridos.

Outros tipos de fases, inseridas comercialmente em 1988, foram as denominadas fases

poliméricas, que possuem como vantagens maior capacidade de retenção dos analitos de inte-

resse e maior seletividade, podendo ser usadas em uma ampla faixa de pH e com a maioria

dos solventes, o que facilita sua limpeza e reaproveitamento para outras análises.

Além da variedade de fases extratoras, a SPE é uma técnica que pode ser automatiza-

da. Uma forma de se automatizar a SPE é colocá-la de forma online com o cromatografo, ou

seja, fazer com que a SPE seja parte do processo cromatográfico. Isso é possível com a utili-

40

zação de uma válvula que permita a alteração do caminho do solvente dentro de uma corrida

cromatográfica, processo denominado de Column Switching (CS).

2.10.1 Column Switching

Para que um cromatógrafo trabalhe nessa configuração, é necessário que tenha, além

das peças convencionais, uma bomba para o carregamento da amostra para a coluna de extra-

ção (pré-coluna) e uma válvula de comutação com pelo menos seis portas.

A Figura 16 demonstra esquematicamente um sistema de SPE online com collumn

switching. Inicialmente, a válvula é mantida em uma posição tal que permita à bomba trans-

ferir a amostra do injetor para a coluna de extração (carregamento da amostra), enquanto a

bomba utilizada para a separação cromatografia é mantida condicionando a coluna (Figura

16a). Em seguida, a válvula é comutada (Figura 16b) fazendo com que o solvente utilizado

para o condicionamento da coluna passe pela coluna de extração e elua os compostos retidos

na mesma para a coluna cromatográfica, possibilitando a separação; enquanto isso, o solvente

utilizado para o carregamento na primeira etapa é direcionada para o descarte. Após a eluição

completa dos compostos, a válvula é retornada à posição original (Figura 16a) possibilitando

o condicionamento da primeira coluna e a continuidade de separação dos compostos.

Existem pelo menos duas configurações possíveis para a eluição em um sistema de

column switching: na primeira, a eluição é feita no mesmo sentido da vazão empregado na

etapa de carregamento da amostra, sendo denominada eluição forwardflush. Quando a elui-

ção é feita no sentido oposto à vazão de carregamento, a o método é denominado backflush.

A Figura 16 representa um sistema de column swiching operando em modo backflush.

41

Figura 16 Representação esquemática da técnica columnswitching aplicada em LC: (A) Posição (1–2) de

carregamento da amostra e (B) posição (6–1) de eluição da amostra.

Fonte: Adaptado de SEGER, C.; GRIESMACHER, A. Some important aspects of implementing tandem mass

spectrometry in a routine clinical laboratory environment. Biochemia Medica v. 17, n. 1, p. 29–51, 2007.

O sistema de SPE online tem como vantagens a utilização de pequeno volume de sol-

vente, injeção de todos os compostos extraídos (e não uma parte deles, como normalmente

acontece com a SPE convencional), diminuição do tempo de extração e o possível acoplamen-

to com os diversos tipos de cromatografia líquida disponíveis.

Porém, como desvantagens da SPE online, pode-se citar a possibilidade do apareci-

mento do efeito memória, limitação quanto ao uso do solvente de eluição, visto que esse tem

de ser compatível com a fase móvel utilizada na etapa cromatográfica e o fato de que toda

amostra extraída é injetada no sistema, fazendo que para cada injeção, uma nova extração

tenha que ser realizada.

2.11 Teste de Atividade Biológica

Várias bioanálises in vitro foram desenvolvidas para se determinar a atividade biológi-

ca de interferentes endócrinos em análises ambientais. Streck (2009), por exemplo, aplicou o

teste que utiliza leveduras transgênicas luminescentes para avaliação da qualidade dos rios da

região de Campinas. As leveduras utilizadas possuíam um receptor para compostos estróge-

nos; com isso, quando esses organismos entravam em contato com compostos que interferi-

42

am no sistema endócrinos, eles passavam a bioluminescer, conforme exemplificado na Figura

17 (BERGAMASCO et al., 2011).

Figura 17 Bioanálise utilizando-se leveduras modificadas.

Fonte: Adaptado de FUNDAÇÃO DE AMPARO A PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO. Tecnologia.

Levedura luminescente. São Paulo, 2012. Disponível em: <http://revistapesquisa.fapesp.br/2012/03/27/

levedura-luminescente/>. Acesso em: 10 jan. 2015.

Outra opção para a avaliação da atividade estrogênica de águas contaminadas por in-

terferentes endócrinos no meio ambiente é a utilização de células de câncer de mama, pois

possuem uma grande quantidade de receptores endócrinos. Este tipo de célula foi isolado pela

primeira vez do tecido da mama de uma senhora caucasiana em 1970, sendo denominada por

MCF-7, um o acrônimo do instituto Michigan Cancer Foundation. A presença de estrógenos

em solução estimula o crescimento da MCF-7, sendo ele proporcional à concentração do es-

trógeno presente. Esta técnica é bastante sensível e permite a avaliação de estrógenos em

concentrações muito baixas.

As células de MCF-7 foram utilizadas com sucesso para a avaliação da estrogenicida-

de de uma micotoxina (zearalenona) e seus derivados (-zearalenol, -zearalenol, -zearala-

nol e -zearalanol), sendo constatada a estrogenicidade das mesmas. Essa avaliação foi im-

portante, pois estabeleceu um teste padronizado, tornando possível a sua comparação com

outros testes que utilizam outros organismos, como por exemplo, o que utiliza leveduras mo-

dificadas com receptores estrógenos, obtendo-se resultados semelhantes (MINERVINI et al.,

2005).

43

Celulas de MCF-7 também foram utilizadas para avaliar a estrogenicidade de duas bi-

fenilas policloradas (PCB): a PCB3 e PCB5. O teste eficaz para a observação da estrogenici-

dades desses compostos em baixíssimas concentrações: 7,8 e 8,3 pg mL1, respectivamente

(DU; CHU; XU, 2000).

44

3. OBJETIVO

Este estudo teve por objetivo desenvolver um sistema cromatográfico para a detecção

de hormônios em baixas concentrações, bem como avaliar e otimizar um sistema de degrada-

ção solar para quatro hormônios, sendo três naturais — 17β-estradiol (E2), estrona (E1) e es-

triol (E3) — e um sintético, utilizado como anticoncepcional, o 17α-etinilestradiol (EE2).

Também teve como objetivo tentar identificar subprodutos da degradação e avaliar a atividade

biológica residual após o tratamento.

3.1 Objetivos Específicos

Desenvolver e validar um sistema analítico que permitisse o acompanhamento da de-

gradação destes compostos em pequenas concentrações. O sistema escolhido foi um

capilar on-line de extração em fase sólida, acoplado a um Cromatógrafo Capilar de Al-

ta Eficiência (UHPLC).

Otimizar as condições de trabalho do reator fotocatalítico em relação à vazão e ao pH.

Avaliar a degradação pela quantidade de energia solar incidida no sistema.

Avaliar o efeito biológico residual após a degradação solar.

Acompanhar a formação de subprodutos da degradação dos quatro hormônios por es-

pectrometria de massas.

45

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Planejamento Fatorial

Os planejamentos fatoriais são muito simples de serem executados e depois amplifica-

dos para formar um planejamento mais sofisticado, caso seja necessário. Para que o planeja-

mento fatorial funcione, é necessário um grande conhecimento teórico do experimento para

que se possa escolher os fatores e níveis a serem utilizados.

O planejamento fatorial mais simples é o que utiliza apenas 2 níveis. Sendo assim,

pode-se simplificar a equação do número de experimentos, conforme a Equação 15.

Número de Experimentos = 2f (15)

Para que os níveis tenham a mesma importância, é necessário que sejam codificados,

como é demonstrado na Tabela 4, onde o maior nível é designado pelo sinal (+) e o nível co-

mo menor valor por (–), em um planejamento com 2 níveis e 3 fatores. Se houver a necessi-

dade de ser usar mais níveis, pode-se utilizar a Equação 16 para calculá-los, na qual xi corres-

ponde ao valor da variável codificada, Xi é o valor (máximo ou mínimo) adotado para a vari-

ável, Xi0 é o valo médio entre dos dois níveis estudados e ΔXi/2 é a metade da amplitude da

variação, que corresponde à diferença entre o valor superior e o valor inferior.

2

0

i

ii

iX

XXx

(16)

Tabela 4 – Exemplo de um planejamento fatorial 23.

Experimentos Fatores

1 2 3

1 – – –

2 + – –

3 – + –

4 + + –

5 – – +

6 + – +

7 – + +

8 + + +

46

Para que o planejamento seja feito minimizando-se os erros sistemáticos, é importante

que os experimentos sejam realizados de forma aleatória.

Tendo sido efetuado os experimentos do planejamento, este pode ser representado gra-

ficamente em terceira dimensão, nos casos dos planejamentos 23. A Figura 13 demonstra o

modelo do gráfico que permite a fácil visualização da tendência das respostas em relação às

variáveis, sendo possível escolher o próximo procedimento experimental a ser tomado, po-

dendo-se observar a importância de cada variável e se estas são significativas ao processo. Os

números de 1 a 8 encontrados no vértice do cubo (Figura 18), geralmente são substituídos

pela resposta obtida no planejamento experimental.

Figura 18 – Exemplo de um gráfico em forma de cubo para o planejamento experimental 23.

4.2 Empacotamento da coluna para SPE on-line

A coluna capilar de extração em fase sólida foi feita utilizando-se um tubo de aço inox

de 6 cm de comprimento e 500 µm de diâmetro interno, duas telas para retenção de partículas,

com poros de 2 µm, duas uniões e duas anilhas.

A coluna foi empacotada com a fase extratora comercial StrataX, fase polimérica da

empresa Phenomenex, que possui partículas de 33 µm de diâmetro e uma área superficial es-

pecífica de 800 m2 g–1. Seu monômero é mostrado na Figura 19 e mais informações podem

ser encontradas em Phenomenex (2013).

47

Figura 19 – Monômero do polímero da fase extratora Strata X.

A Figura 20 apresenta um corte lateral da coluna desenvolvida com seus principais

componentes. Após a confecção da parte estrutural da coluna, esta foi empacotada com o

material polimérico.

Figura 20 – Coluna utilizada para o empacotamento com Strata X: a) conexão com volume morto zero (ZDV,

“Zero Dead Volume”); b) tela para retenção das partículas; c) tubo de aço inox; e d) anilha de es-

trangulamento.

Fonte: Adaptado de VALCO INSTRUMENTS Co. Inc. (VICI). ValcoFittings. Overview. Disponível em:

<http://www.vici.com/vfit/vfit.php>. Acesso em: 22 março 2013.

Para o empacotamento, foi adicionado 10 mg de Strata X em uma solução hidrometa-

nólica 95:5 (em volume), necessária para manter as partículas em suspensão por tempos maio-

res.

A pré-coluna foi fechada com a conexão em apenas uma das extremidades; a outra

extremidade foi conectada à um tubo de aço inox oco (coluna de HPLC vazia), onde a suspen-

são foi posteriormente adicionada. O lado conectado à bomba cromatográfica continha uma

conexão com filtro, com a finalidade de se evitar que as partículas voltassem à coluna. Após

a adição da suspensão, o sistema foi instalado na saída de uma bomba de HPLC convencional,

tendo como fase móvel metanol (Figura 21). A Figura 22 é a foto tirada do tubo de aço inox

unido com a coluna de SPE para o empacotamento.

48

Figura 21 – Esquema do sistema utilizado para o empacotamento da coluna.

Figura 22 – Pré-coluna ligada ao reservatório contendo a suspensão para o empacotamento.

O sistema foi mantido com uma vazão de 0,5 mL min–1 de metanol por 15 min, para

garantir que toda a coluna fosse empacotada de forma homogênea.

Com o empacotamento concluído, foi instalada a outra conexão lacrando os dois lados

da coluna. Deixou-se a coluna com uma vazão de 60 L min–1 de água por 1 h para o condi-

cionamento.

4.3 Cromatografia

O esquema do sistema cromatográfico é demonstrado na Figura 23, onde se encontram

as dimensões das tubulações utilizadas — capilares de diâmetro interno (d.i.) igual à 50 µm e

comprimento (l.) de 350 mm. Já para a tubulação que não participa do caminho cromatográ-

fico, o diâmetro interno (d.i.) foi de 75 µm, sendo o caminho da bomba ao injetor de 650 mm

e do injetor à válvula de 550 mm de comprimento. O loop de injeção utilizado foi de 125 µL.

BOMBA

HPLCDESCARTE

ÁGUA

CONEXÃO

COM TELA

CONEXÃO

SEM TELA

CONEXÃO

COM TELA

12

1 - Partículas em suspensão

2 - Partículas empacotadas

49

Inicialmente, o sistema era mantido na posição A, na qual a amostra (125 µL) era con-

duzida pela bomba de carregamento (Bomba A, apenas com água) para a coluna de extração,

na qual os analitos ficaram retidos, enquanto a Bomba Cromatográfica (Bomba B) permanecia

condicionando a coluna. Depois de 4 min, a válvula era mudada para a posição B, no qual os

analitos eram conduzidos para a separação cromatográfica pela Bomba B, enquanto o solvente

da bomba A era direcionado para o descarte. Após 12 min da injeção, a válvula voltava para

a posição A, condicionando assim a coluna de extração para uma nova injeção. A coluna

cromatográfica utilizada foi uma C18 com partículas de 3 µm, diâmetro interno de 300 µm e

15 cm de comprimento.

Utilizou-se um cromatógrafo UltiMate 3000 RSLCnano da empresa Thermo Scientific

com detector de UV, localizado no Grupo de Cromatografia (CROMA) do Instituto de Quí-

mica de São Carlos – USP. Este equipamento conta com uma válvula de 6 vias e uma bomba

ternária adicional para fazer o carregamento da amostra. O detector de ultravioleta e visível

(UV-VIS) possui comprimento de onda variável e até quatro canais de aquisição de dados.

Além disso, este módulo possui dimensões bastante reduzidas, o que permite o seu acopla-

mento com a cromatografia capilar, tendo um volume interno total de 45 nL, com um cami-

nho ótico de 10 mm e suportando uma pressão de 200 bar.

Figura 23 – Esquema do sistema cromatográfico utilizado para a extração on-line com a cromatografia líquida

capilar.

50

A Figura 24 apresenta o gradiente de solventes (água/acetonitrila) da bomba principal

usada para a eluição e a corrida cromatográfica. A bomba de carregamento ficou com água

como solvente por todo o tempo da análise.

Figura 24 – Composição da fase móvel para a eluição dos compostos da pré-coluna e para a corrida cromatográ-

fica.

4.4 LC-MS

Para os experimentos de identificação de intermediário foi utilizado um espectrômetro

micrOTOF-Q II da empresa Bruker Daltonics, sendo a separação realizada em uma coluna

Kinetex XB-C18 (100 mm × 2,1 mm; 2,6 μm) da Phenomenex, em um HPLC Shimadzu série

20A Prominence (Bomba B, injetor e forno onde ficava a coluna para a separação mostrados

na Figura 48). Para a fase móvel, utilizou-se água ultrapura (A)/acetonitrila (B) com a seguin-

te programação: 0-3 min, 5% de B; 3-12 min, 5-60% de B; 12-14 min, 60-95% de B; 14-20

min, 95% de B; 20-22 min, 95-5% de B; 22-26 min, 5% de B. A vazão utilizada foi de 0,25

mL min–1 e a temperatura do forno de 40°C.

As condições do espectrômetro de massas utilizado foram: fonte de ionização por

electrospray (voltagem do capilar a 4,5 kV, temperatura de dessolvatação a 200°C, vazão do

gás de secagem a 8 L min–1 e pressão do nebulizador a 4 bar), intervalo de m/z monitorado de

50 a 3000 u, taxa de aquisição de espectros a 2 Hz no modo full MS, ou seja, o analisador

quadrupolo foi utilizado apenas para conduzir os íons para o TOF.

0 2 4 6 8 10 12 14 160

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

AC

N (

%)

Tempo (min)

51

As condições do espectrômetro de massas utilizado no sistema capilar foi fonte de io-

nização por electrospray, com os seguintes parâmetros: voltagem do capilar a 4,5 kV, tempe-

ratura de dessolvatação a 180°C, vazão do gás de secagem a 5 L min-1 e pressão do nebuliza-

dor a 0,8 bar, intervalo de m/z monitorado de 50 a 3000 u, taxa de aquisição de espectros a

2 Hz no modo full MS.

4.5 Curva de Calibração

Os dados foram avaliados em relação à sua dispersão. Se os dados têm a mesma vari-

ância em todos os pontos da curva, estes são denominados homocedásticos; caso a variância

seja diferente para as diferentes concentrações, são considerados heterocedásticos.

Uma forma de se estabelecer a homo ou a heterocedasticidade é aplicar o teste F, que

compara a variância do maior ponto da curva com o menor (Fexp) e depois compara com a

estatística F tabelada (Ft). Caso exista a heterocedasticidade, o Fexp será maior que o Ft.

Após o teste F, podem-se testar os vários tipos de regressões lineares possíveis e se de-

terminar qual é o modelo que apresenta a menor soma de resíduos percentual (em módulo).

O primeiro modelo testado é o linear sem ponderação, pelo método dos mínimos qua-

drados. A Equação 17 representa a equação linear aplicável aos dados analíticos, e nas Equa-

ções 18-19 são apresentados os cálculos dos coeficientes angular (b) e linear (a), respectiva-

mente.

𝑦 = 𝑏𝑥 + 𝑎 (17)

𝑏 =

𝑛 ∑ 𝑥𝑖𝑦𝑖 − ∑ 𝑥𝑖 . ∑ 𝑦𝑖

𝑛 ∑ 𝑥𝑖2 − ( ∑ 𝑥𝑖)

2 (18)

𝑎 =

∑ 𝑥𝑖2 . ∑ 𝑦𝑖 − ∑ 𝑥𝑖 . ∑ 𝑥𝑖𝑦𝑖

𝑛. ∑ 𝑥𝑖2 − (∑ 𝑥𝑖)

2 (19)

52

Também pode ser testada a aplicação de diversos pesos à equação linear, que podem

permitir uma melhor exatidão nas concentrações mais baixas. Sugere-se que os seguintes

pesos (w) sejam testados: x–0,5, x–1, x–2, y–0,5, y–1 e y–2 (ALMEIDA; CASTEL-BRANCO;

FALCÃO, 2002).

Ajusta-se, então, a Equação 17 aos dados ponderados. Porém, os coeficientes b e a

são definidos pelas Equações 20-21, respectivamente.

𝑏 =

∑ 𝑤𝑖 . ∑ 𝑤𝑖𝑥𝑖𝑦𝑖 − ∑ 𝑤𝑖𝑥𝑖 . ∑ 𝑤𝑖𝑦𝑖

∑ 𝑤𝑖 . ∑ 𝑤𝑖𝑥𝑖2 − ( ∑ 𝑤𝑖𝑥𝑖)

2 (20)

𝑎 =

∑ 𝑤𝑖𝑥𝑖2 . ∑ 𝑤𝑖𝑦𝑖 − ∑ 𝑤𝑖𝑥𝑖 . ∑ 𝑤𝑖𝑥𝑖𝑦𝑖

∑ 𝑤𝑖 . ∑ 𝑤𝑖𝑥𝑖2 − (∑ 𝑤𝑖𝑥𝑖)

2 (21)

O coeficiente de correlação da reta ponderada é dado pela Equação 22.

𝑟 =

∑ 𝑤𝑖 . ∑ 𝑤𝑖𝑥𝑖𝑦𝑖 − ∑ 𝑤𝑖𝑥𝑖 . ∑ 𝑤𝑖𝑦𝑖

√∑ 𝑤𝑖 . ∑ 𝑤𝑖𝑥𝑖2 − ( ∑ 𝑤𝑖𝑥𝑖)

2 . √∑ 𝑤𝑖 . ∑ 𝑤𝑖𝑦𝑖

2 − (∑ 𝑤𝑖𝑦𝑖)2

(22)

4.6 Reator Fotocatalítico

Para a degradação dos hormônios presentes na amostra foi utilizado o tratamento por

fotocatálise heterogênea irradiado com luz solar (TiO2/UV).

Para a fotocatálise, a titânia foi imobilizada em uma placa vítrea, jateada, plana, sobre

a qual a água escoou exposta ao Sol (Figura 27), seguindo-se o esquema proposto por Kondo

(1990).

53

A placa (24 cm de largura por 44,5 cm de comprimento) foi limpa, primeiramente com

detergente e depois com ácido nítrico a 10% em volume. Em seguida, foi aplicada uma sus-

pensão aquosa de TiO2 a 1% em massa com pH = 3, com o auxílio de um borrifador. A placa

foi seca em uma estufa a 100ºC (VILELA, 2009). Esse processo foi repetido 10 vezes.

O reator funciona em reciclo, ou seja, a água a ser tratada passa pela placa de vidro (a)

várias vezes, dependendo da vazão que é utilizada, voltando ao recipiente (b) onde é feita a

sua homogeneização por um agitador magnético (c). O reciclo é proporcionado por uma

bomba centrífuga (d) e a vazão é controlada por uma válvula (f) e um rotâmetro. Para que

não haja sobrecarga na bomba, existe um by-pass (e).

O sistema também conta com uma bomba (h) para a reposição automática (j e i) de

água (g). Assim, é praticamente eliminado o efeito da perda de água por evaporação, ficando

apenas o efeito produzido pela degradação fotocatalítica.

Figura 25 – Imagem do reator solar de placa plana do LDTAmb: a) Placa vítrea por onde escorre a água a ser

tratada; b) Reservatório com água a ser tratada; c) agitador magnético; d) bomba de reciclo; e) sis-

tema de retorno de água para a bomba; (f) válvula para o controle da vazão; g) reservatório para re-

posição de água; h) válvula solenoide para a reposição de água destilada; i) sistema para a automa-

ção da reposição de água destilada; j) sensor de nível da água a ser tratada.

Fonte: VILELA, W. F. D. Estudo da Degradação da [D-Leu]-Microcistina-LR por Fotocatálise Heterogê-

nea Solar. 2009. Dissertação (Mestrado)– Instituto de Química de São Carlos, USP, São Carlos, 2009.

b i

e

d

j

f

g

h

c

a

54

4.7 Radiação Solar

A energia que chega à superfície é muito variável, seja pela sazonalidade ou pelas

condições climáticas. Por esta razão, é imprescindível que a intensidade solar seja monitorada

durante os experimentos, pois assim é possível fazer-se a comparação entre experimentos e

também com os dados obtidos na literatura. Para isso, foi utilizado um espectrorradiômetro

StellarNet EPP2000C, sendo a radiação medida à mesma altura e angulação da placa vítrea.

4.8 Hormônios

As massas molares (MM), estruturas químicas, solubilidades em água e constantes de

partição octanol/água (log Kow) dos hormônios utilizados são apresentados na Tabela 5. Os

padrões foram fornecidos pela Sigma-Aldrich, com pureza acima de 95%.

Tabela 5 – Descrição dos hormônios utilizados neste estudo.

Nome (Abreviação) Estrutura Química

MM

(g mol–1)

Solubilidade

em água

(mg L–1 a 20ºC)

Log

KOW pKa

Estrona (E1)

270,1698 5,03 4,313 10,771

17β-Estradiol (E2)

272,1776 13,03 3,753 10,711

17α-Etinilestradiol

(EE2)

296,1776 4,83 4,153 10.333

Estriol (E3)

288,1725 13,03 2,673 10,402

Fonte: 1 LEWIS, K. M.; ARCHER, R. D. pKa values of estrone, 17 beta-estradiol and 2-methoxyestrone. Steroids, v. 34,

n. 5, p. 485–99, 1979. 2 MARQUES, R.; VAZ, F. A. S.; POLONINI, H. C.; OLIVEIRA, M. A. I. Optimized separation method for Estriol

17-β-estradiol and Progesterone by Capillary Eletrochromatography with Monolithic Column and its Application to a

Transdermal Emulsion. Journal of The Brazilian Chemical Society, v. 26, n. 3, p. 609-618, 2015. 3 CHEMAXON. Properties viewer, Budapest. Disponível em: <http://www.chemicalize.org/>. Acesso em: 10 jan

2015.

55

4.9 Determinação da Atividade Estrogênica (MCF-7)

As células aderentes MCF-7 foram cultivadas em meio Eagle modificado (Dubelco’s

Modified Eagle Medium, DMEM) suplementado com 3,5 g L–1 de glicose, 10% de soro de

feto bovino (FBS), 1% de penicilina (100 U.I. L–1) e estreptomicina (0,1 mg L–1). Atingida a

confluência de 80% (ou seja, 80% da superfície do frasco ocupada com células), as células

foram lavadas com tripsina e PBS (tampão fosfato), sendo em seguida incubadas com tripsina

durante 10 min e centrifugadas a 2.000 rpm por 5 min.

As células MCF-7 foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 24 h.

Após esse período, o meio foi substituído por DMEM sem vermelho-fenol, suplementado

com 3,5 g L–1 de glicose, 10% de soro de feto bovino tratado com dextran-carvão ativo (fetal

bovine serum – charcoal stripped, FBS-CS), solução com 1 % de penicilina (100 U.I. L–1) e

estreptomicina (0,1 mg L–1). A esse meio adicionou-se o controle positivo (E2, 10–8 mol L–1)

ou os analitos a serem avaliados. O controle negativo foi o meio contendo apenas o solvente

utilizado no preparo das soluções testadas e do controle positivo.

Em um primeiro experimento, foram testadas amostras das misturas dos hormônios

coletadas no início e após 1, 2 e 3 h de exposição ao Sol. Como a concentração de cada hor-

mônio era mais alta que a do controle positivo, foi necessário fazer uma diluição de 91 vezes

para o teste de estrogenicidade, para o qual a concentração de 17β-estradiol na mistura inicial

foi utilizada como referência (10–8 mol L–1).

As amostras diluídas foram esterilizadas por filtração em membrana de PVDF

0,22 µm e adicionadas ao meio de cultura. As células foram incubadas por um período de 1 a

6 dias a 37oC, com atmosfera a 5% de CO2, sendo feita a troca do meio a cada 48 h. A ativi-

dade estrogênica foi medida por meio de ensaio colorimétrico de MTT-formazan, no qual as

células vivas metabolizam o brometo de tetrazólio (sal amarelo) levando à formação de cris-

tais de formazan (violeta) que são solubilizados. As determinações das absorbâncias foram

feitas a 570 nm.

56

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Avaliação do Método

Antes dos estudos de degradação, foi necessário validar o método de análise dos com-

postos em água de abastecimento.

Por se tratar de um método on-line de análise, foi necessário observar quão bem reti-

dos os compostos ficavam na coluna de Strata X produzida no laboratório. Para isso, ao sis-

tema original, demonstrado na Figura 23, foi adicionado um detector de DAD após a coluna

de SPE (Figura 26). Com isso, foi observado o sinal analítico dos compostos que atravessa-

vam a coluna. O DAD foi utilizado neste teste, pois este possuía uma cela de detecção maior

que o fotômetro de UV utilizado para o sistema capilar, podendo assim ser utilizado com va-

zões maiores. A vazão utilizada para este teste foi de 60 µL min–1, vazão utilizada para o car-

regamento nas demais etapas. Para esse teste, a válvula foi mantida sempre na posição A por

toda a análise, até que os analitos passassem através da coluna, sendo detectada no DAD.

Figura 26 – Esquema utilizado para avaliar os compostos que não ficavam retidos na coluna.

57

Com o sistema montado várias porcentagens de solvente orgânico foram testadas para

o carregamento de dois compostos: estriol e estrona. Esses compostos foram escolhidos por

serem o primeiro e o último a serem eluídos da coluna cromatográfica, respectivamente, já

que a coluna cromatográfica tem características semelhantes às da coluna extratora.

Para a designação do tempo morto foi utilizado um padrão de uracila, pois sabe-se

que este composto tem pouca (ou nenhuma) afinidade com fases reversas. Também foi utili-

zado um composto que possui baixa afinidade com a fase extratora, a sulfacetamida, para

comparação (CARVALHO, 2013).

A Figura 27 demonstra o log de k (fator de retenção) de cada composto (E1 e E3) na

coluna de extração, e também a referência de baixa retenção (sulfacetamida).

Figura 27 – Logaritmo do fator de retenção dos compostos Sulfacetamida, E1 (estrona) e E3 (estriol) por porcen-

tagem de acetronitrila na fase de carregamento ( E1 E3 Sulfacetamida).

É possível se observar que ambos os hormônios ficaram bem retidos na fase extratora,

atingindo um tempo de retenção aproximadamente 100 vezes maior que o tempo morto (tem-

po de retenção da uracila) em 5% de acetonitrila (ACN) para o estriol e 20% para a estrona, a

sulfacetamida apresentou valores bem menores de fator de retenção com 0% de ACN.

Esta avaliação é importante para se determinar qual é a porcentagem mínima de sol-

vente orgânico necessária para carrear toda a amostra pela coluna. Assim, não há perda de

analitos, realiza-se uma boa limpeza da coluna (“clean-up”) entre amostras e o método pode

ser utilizado para várias amostras.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

Log K

ACN (%)

58

Outra observação importante a ser feita é que não foi possível avaliar em valores menores

que 5% de solvente orgânico para o estriol e 20% para a estrona, pois com o aumento do fator

de retenção os picos se tornaram alargados demais.

É possível se observar o alargamento da banda do estriol (Figura 30), da estrona (Figu-

ra 31) e da sulfacetamida (Figura 28) no seu carregamento.

Figura 28 – Carregamento do estriol em diferentes proporções de acetronitrila na fase móvel.

O mesmo aconteceu com as diferentes proporções de ACN testadas no carregamento

da estrona (Figura 29), porém, para este composto a proporção que produziu a banda mais

baixa avaliada foi a de 20%, a partir desta proporção não foi possível perceber alteração na

linha de base do detector.

59


A maior afinidade da estrona pela fase extratora é novamente evidenciada quando se

compara, por exemplo, a porcentagem de acetronitrila de 30% no carregamento dos compos-

tos. Nessa proporção, as moléculas de estriol demoram cerca de 2 min para percorrer toda a

coluna de extração e serem detectadas no DAD, enquanto as de estrona demoram mais de 4

min e as de sulfacetamida demoram menos de 1 min (Figura 30).


Como não foi possível avaliar a porcentagem de moléculas perdidas utilizando-se co-

mo fase móvel 0% de ACN (já que o alargamento do pico não permitiu tal avaliação), foi no-

vamente montado o sistema da Figura 23 e avaliou-se apenas o estriol, por este ter a menor

afinidade com a coluna extratora dentre os quatro hormônios.

60

O sistema da Figura 23 foi mantido por diferentes tempos na posição de carregamento

(posição “A” da válvula). Posteriormente, a válvula foi comutada para posição B e os com-

postos foram eluídos da coluna, passando pelo detector UV-Vis. Foi observado que tempo

mínimo para o carregamento total da amostra foi inferior a 1 min e que o estriol permanecia

aderido a ela mesmo após 60 min de lavagem da coluna de extração com água. Esse resultado

foi um indício de que não se estava trabalhando no limite de saturação da coluna, sendo pos-

sível o aumento do volume de injeção da amostra e também um maior “clean up” da mesma,

caso necessário.

O aumento do volume de injeção apenas não foi realizado, por limitações de hardware

do equipamento, mais precisamente o tamanho do loop de injeção, porém é algo que poderia

ser modificado.

Tendo sido determinado que os compostos foram de fato retidos, avaliou-se o perfil

cromatográfico dos picos, o limite de determinação, o limite de quantificação, a linearidade, a

exatidão, a seletividade e as precisões intra-dia, inter-dias e inter-colunas (com uma segunda

coluna empacotada com a mesma metodologia).

5.2.1 Limites de Detecção e Quantificação

Os limites de detecção dos 4 hormônios foram estipulados como um sinal analítico

com a altura do pico cromatográfico pelo menos três vezes maior que o ruído das proximida-

des do pico. Foi obtido um limite de detecção de 3 µg L–1.

O limite de quantificação foi o primeiro ponto da curva de calibração, sendo para to-

dos os hormônios a concentração de 10 µg L–1. A Figura 31 apresenta um cromatograma ob-

tido com os quatro hormônios na concentração de 100 µg L–1.

61

Figura 31 – Cromatograma de uma solução de 100 µg L–1 dos quatro hormônios, Estrona (E1), 17β-estradiol

(E2), 17α-etinilestradiol (EE2) e Estriol (E3) sob as condições cromatográficas expostas no tópico

4.3.

A Tabela 6 expões as principais avaliações realizadas no cromatograma, em todas os

parâmetros apresentados estão dentro dos limites que caracterizam o pico como aceitável. Os

hormônios E1 e E3, não apresentaram valores de resolução, pois esta é calculada baseada no

pico que vem em sequência, e estes não apresentaram picos próximos a eles.

Tabela 6 – Parâmetros cromatográficos dos Estrona (E1), 17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol (EE2) e

Estriol (E3) nas condições expostas no tópico 4.3.

Hormônio Largura do pico

a meia altura

Fator de

Assimetria Resolução

Número de

Pratos Teóricos

E1 0,123 1,2 42.454

E2 0,108 1,1 2,28 49.856

EE2 0,117 1,0 2,49 43.096

E3 0,077 1,1 42.454

5.2.2 Linearidade

A linearidade foi avaliada construindo-se uma curva de calibração com 7 concentra-

ções diferentes, sendo o ponto de menor concentração (10 µg L–1), o de concentração média

(150 µg L–1) e o mais concentrado (250 µg L–1) feitos em quintuplicata e os demais pontos

(25, 50, 100 e 200 µg L–1) em triplicata.

62

Embora os coeficientes de determinação (R2) das curvas (retas) de calibração obtidos

tenham sido altos (> 0,99), a Figura 32 mostra que existe um aumento de amplitude dos resí-

duos com o aumento da concentração. Isso pode ser um indício de que o modelo de regressão

linear simples não se adequa bem ao valor mais baixo da curva.

Figura 32 – Resíduo (valor observado menos o predito) das diversas análises nas diferentes concentrações, em

µg L–1, dos compostos estriol (E1), 17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol (EE2) e estrona (E3).

Outro indício de que os dados são heterocedásticos é que todos os valores experimen-

tais do teste F (Fexp) são maiores que os valores do teste F tabelados (Ft), conforme a Tabela 7,

o que demonstra que a variância do ponto mais baixo é significativamente diferente da do

ponto mais alto (ALMEIDA; CASTEL-BRANCO; FALCÃO, 2002).

Tabela 7 – Teste F para os 4 hormônios: estriol (E1), 17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol (EE2) e estrona

(E3). O F(4;4;0,99) foi de 15,98.

Hormônios Fexp Fexp/Ft Soma dos

Resíduos (%)

E1 256,9 16,1 18,91

E2 50,19 16,0 48,14

EE2 119,8 7,50 51,72

E3 97,69 8,90 106,27

0 50 100 150 200 250-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

Concentração (µg L-1)

Re

síd

uo

E1

0 50 100 150 200 250-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6


Re

síd

uo

E2

0 50 100 150 200 250-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

Resíd

uo


EE2

0 50 100 150 200 250-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

Concentração (µg L-1

)

Re

síd

uo

E3

63

Foram então avaliados os diversos ponderamentos sugeridos por Almeida, Castel-

Branco e Falcão (2002) para o ajuste linear, a fim de se diminuir a soma dos resíduos gerados.

Os quatro hormônios seguiram o mesmo padrão e em todos os casos a ponderação que

utilizou o peso x–0,5 obteve a menor soma dos resíduos, mas não os maiores coeficientes de

determinação (R2). Por isso, foi escolhida a ponderação x–1 que, além de ainda apresentar

baixos valores de resíduos, forneceu valores de R2 acima de 0,99. A Tabela 8 apresenta os

resultados dos seis diferentes ponderamentos para os quatro compostos.

Tabela 8 – Soma dos resíduos (SR) e os parâmetros da reta ajustada (y = bx + a) para os diversos ponderamentos.

Hormônios Pesos SR (%) b a R2

E1

1 18,9 0,0230 – 0,0292 0,996

x–0,5 – 0,110 0,0226 – 0,0231 0,987

x–1 – 4,37 0,0230 – 0,0373 0,994

x–2 – 12,8 0,0230 – 0,0398 0,994

y–0,5 – 29,7 0,0230 – 0,0435 0,994

y–1 – 27,9 0,0229 – 0,0408 0,994

y–2 – 52,3 0,0221 – 0,0215 0,983

E2

1 48,1 0,0215 0,0186 0,996

x–0,5 –0,000200 0,0217 – 0,00304 0,993

x–1 0,0161 0,0216 – 0,00182 0,998

x–2 11,1 0,0216 0,00352 0,998

y–0,5 6,52 0,0216 0,00250 0,998

y–1 –9,62 0,0216 0,00399 0,998

y–2 18,1 0,0217 – 0,00778 0,995

EE2

1 51,7 0,0243 0,0158 0,998

x–0,5 – 0,00135 0,0246 – 0,0113 0,998

x–1 0,136 0,0245 – 0,00858 0,999

x–2 13,3 0,0245 – 0,00166 0,999

y–0,5 11,1 0,244 0,00218 0,999

y–1 – 3,62 0,0245 0,00934 0,999

y–2 7,13 0,0246 0,0125 0,999

E3

1 106 0,0187 – 0,0547 0,998

x–0,5 – 2,93 0,0189 – 0,0790 0,991

x–1 – 7,51 0,0190 – 0,0821 0,997

x–2 20,1 0,0189 – 0,0755 0,998

y–0,5 0,456 0,0189 – 0,0789 0,998

y–1 – 24,8 0,0189 – 0,0840 0,997

y–2 – 49,4 0,0184 – 0,0749 0,985

A Tabela 9 resume os valores de a e b (da equação y = bx + a) para os quatro hormô-

nios e a soma dos resíduos (SR) provenientes do ajuste escolhido neste estudo. A Figura 33

apresenta as curvas de calibração (em triplicata) dos hormônios com a equação após a utiliza-

ção da regressão linear com peso x–1.

64

Tabela 9 – Valores dos resíduos e dos parâmetros do modelo ponderado x–1.

Hormônios SR (%) b a R2

E1 – 4,37 0,0230 – 0,0373 0,994

E2 0,0161 0,0216 – 0,00182 0,998

EE2 0,136 0,0245 – 0,00858 0,999

E3 – 7,51 0,0190 – 0,0821 0,997

Figura 33 – Curvas de calibração (em triplicata) usando o modelo linear ponderado com peso x–1: E1 (estriol),

E2 (17β-estradiol), EE2 (17α-etinilestradiol) e E3 (estriol).

É possível se observar uma melhor dispersão dos resíduos referentes aos pontos expe-

rimentais obtidos com o modelo ponderado (x–1) em comparação com o modelo sem peso

(Figura 34). Também é possível observar que que a diferença maior entre os modelos está

nos pontos inferiores, tendo pouca importância para os pontos de maior concentração, o que

realça a sua importância quando o objetivo é analisar baixas concentrações.

0 50 100 150 200 2500

1

2

3

4

5

6

Concentração (g L-1)

E1

Áre

a

0 50 100 150 200 2500

1

2

3

4

5


Áre

a

E2

0 50 100 150 200 2500

1

2

3

4

5

6


Áre

a

EE2

0 50 100 150 200 2500

1

2

3

4

5


Áre

a

E3

65

Figura 34 – Dispersão dos resíduos (ponderados e não ponderados) nas diversas concentrações

( E1 E2 EE2 E3).

5.2.3 Precisão (Desvio-Padrão Relativo)

A precisão intra-dia das análises foi avaliada e é apresentada na Tabela 10. Nela é

possível observar a precisão na determinação em cada nível de concentração dos 4 hormônios

analisados.

0 50 100 150 200 250-30

-20

-10

0

10

20

30

Resíd

uo (

%)


0 50 100 150 200 250-30

-20

-10

0

10

20

30


Re

síd

uo

(%

)

0 50 100 150 200 250-30

-20

-10

0

10

20

30


Re

síd

uo

(%

)

0 50 100 150 200 250-30

-20

-10

0

10

20

30


Re

síd

uo

(%

)

66

Tabela 10 – Média aritimética e desvio-padrão relativo (DPR) de cada pondo da curva analítica.

Concentração

(µg L–1) N

E1 E2 EE2 E3

Área

Média

DPR

(%)

Área

Média

DPR

(%)

Área

Média

DPR

(%)

Área

Média

DPR

(%)

10 5 0,210 7,71 0,215 14,0 0,235 6,54 0,115 7,70

25 5 0,484 11,1 0,529 11,0 0,594 3,58 0,313 5,28

50 3 0,973 13,0 1,07 4,42 1,22 5,76 0,921 4,62

100 3 2,49 3,19 2,20 2,16 2,50 0,758 1,89 3,01

150 5 3,48 5,61 3,38 5,28 3,73 2,80 2,84 3,77

200 3 4,48 4,85 4,30 1,40 4,90 0,843 3,66 1,95

250 5 5,68 4,56 5,34 3,98 6,04 2,79 4,58 1,91

É possível se observar que, em todas as concentrações, o desvio-padrão relativo foi

bem menor que 20%, valor exigido pela ANVISA (2003).

Como se trata de um método que será utilizado em dias diferentes, é importante saber-

se qual é a sua variação em dias distintos, por isso foi avaliado a precisão inter-dias, apresen-

tada na Tabela 11. Esta avaliação foi feita em três dias diferentes, em três concentrações

(baixa, média e alta concentração da curva) e em quintuplicata.

Tabela 11 – Média aritmética e desvio-padrão relativo em três pontos da curva feitos em três dias diferentes.

Hormônio Concentração

(g L–1)

Média

(área)

DPR

(%)

E1

10 0,214 7,6

150 3,521 8,1

250 5,724 9,2

E2

10 0,173 15,9

150 3,192 10,0

250 5,175 10,4

EE2

10 0,235 11,7

150 3,739 4,5

250 6,097 4,7

E3

10 0,122 17,6

150 2,727 6,3

250 4,472 6,0

67

Novamente, é possível se observar um desvio-padrão relativo menor que 20%, inclu-

sive nas concentrações mais baixas.

5.2.4 Efeito Matriz

Apesar da água de abastecimento público ser uma matriz relativamente limpa, quando

comparada ao esgoto, é importante verificar qual o seu efeito na análise. Foram então reali-

zadas medidas em 3 níveis de concentração em quintuplicata em água deionizada e compara-

das com as médias da precisão inter-dias.

É possível visualizar-se na Tabela 12 que existe uma variação de 5 a 20%, aproxima-

damente, do sinal analítico. No entanto, esta variação é pequena, não superando o desvio-

padrão relativo das amostras realizadas em dias diferentes.

Tabela 12 – Recuperação relativa (efeito da matriz).

Recuperação Relativa (efeito matriz)

Concentração

(g L–1) E3 E2 EE2 E1

10 80,9 91,6 84,3 81,7

150 89,8 94,3 96,1 91,2

250 88,5 95,2 95,5 94,4

5.2.5 Exatidão

Para se determinar a exatidão do método foram utilizadas concentrações de hormônios

em três níveis diferentes: 15, 130 e 230 µg L–1(em triplicata).

A Figura 35 apresenta a concentração utilizada dos hormônios e os respectivos valores

calculados com a curva ponderada (x–1). No mesmo gráfico é também mostrada a exatidão da

análise, sendo esta diferenciada no gráfico pela cor vermelha e definida pela Equação 23, sen-

68

do CC a concentração calculada pela curva ponderada e CA a concentração dos hormônios

adicionada à matriz livre de hormônios.

𝐸𝑥𝑎𝑡𝑖𝑑ã𝑜 = 𝐶𝐶

𝐶𝐴× 100 (23)

Figura 35 – Exatidão das análises dos hormônios em três níveis de concentração (15, 130 e 230 µg L–1).

Na maioria dos pontos a diferença entre a concentração analisada e concentração real

foi menor que 10%, tendo apenas alguns valores próximos a 20% no ponto de concentração

mais baixa (15 µg L-1), do composto estriol (E3). Tal fato está de acordo com o estipulado

pela ANVISA (2003) para testes analíticos e bioanalíticos.

0 50 100 150 200 2500

50

100

150

200

E1

Concentração adicionada (mg L-1

)

Concentr

ação C

alc

ula

da (

mg L

-1)

0 50 100 150 200 25080

90

100

110

120

Exatidão

0 50 100 150 200 2500

50

100

150

200

E2


)

Concentr

ação C

alc

ula

da (

mg L

-1)

0 50 100 150 200 25080

90

100

110

120

Exatidão (

%)

0 50 100 150 200 2500

40

80

120

160

200

240EE2


)

Concentr

ação C

alc

ula

da (

mg L

-1)

0 50 100 150 200 25080

90

100

110

120

Exatidão (

%)

0 50 100 150 200 250

0

50

100

150

200

E3


)

Concentr

ação C

alc

ula

da (

mg L

-1)

0 50 100 150 200 25080

90

100

110

120

Exatidão (

%)

69

5.2.6 Precisão Inter-Colunas

Todas as análises apresentadas foram realizadas com a mesma pré-coluna (mais de

300 injeções realizadas). No entanto, após essa quantidade de injeções, foi percebida uma

drástica queda dos sinais cromatográficos. Decidiu-se então substituir a fase extratora por

outra nova.

Após a troca, foi feita uma avaliação da exatidão do novo empacotamento da coluna.

Foram comparados os valores obtidos pela curva ponderada em três concentrações (10, 150 e

250 µg L–1). A Figura 36 apresenta os três níveis avaliados e a correlação entre a concentra-

ção adicionada e as respectivas exatidões.

Figura 36 – Exatidão inter-colunas ( E1 E2 EE2 E3).

Observa-se que em nenhuma dos pontos o erro é superior que 20%, mesmo no ponto

mais baixo, mantendo assim a exatidão da coluna anterior, podendo-se assim afirmar que as

colunas re-empacotadas são reprodutíveis.

Tendo sido então realizada a avaliação do método analítico, passou-se a avaliar a de-

gradação no reator fotocatalítico.

0 50 100 150 200 25080

85

90

95

100

105

110

115

120

Exatidão N

ova C

olu

na (

%)

Concentração (g L-1

)

70

5.2 Fotocatálise Solar

Antes da otimização do reator fotocatalítico foram feitos alguns testes iniciais para se

verificar se a fotocatálise poderia, de fato, ser utilizada para a degradação dos hormônios e a

influência de outros fatores na remoção dos compostos de solução.

5.2.1 Testes Iniciais

O primeiro teste realizado avaliou a possibilidade da sorção dos hormônios no reator

fotocatalítico, já que este possui vários tipos de superfícies (placa, reservatório de amostra,

mangueiras, bomba, barra de agitação etc.). Os testes de adsorção foram feitos no escuro.

Neste teste foi utilizado uma placa vítrea sem o TiO2.

Como é possível observar-se na Figura 37, no pior dos casos (E1 ou E2) houve uma

diminuição de aproximadamente 20% na concentração dos hormônios, depois de 20 horas de

contato com o reator, sendo a concentração inicial de 250 µg L–1. Tal diminuição é insignifi-

cativa para o processo.

Figura 37 – Sorção dos hormônios no reator ( E1 E2 EE2 E3).

0 4 8 12 16 200,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

C/C

0

Tempo (h)

71

O segundo teste realizado foi o de adsorção dos hormônios na titânia. Este óxido

apresenta um pH(I) = 6,25 (ZHU et al., 2005), ou seja, neste pH a carga elétrica líquida das

partículas do óxido é zero (IUPAC, 2014). Como, dependendo do pH, a titânia pode ter carga

superficial positiva (pH < 6,25) ou negativa (pH > 6,25), ambos foram avaliados. Os testes de

adsorção foram feitos no escuro.

Para avaliação da adsorção dos compostos na titânia positivamente carregada, foi utili-

zado o pH 4, que corresponde a um meio aproximadamente 100 vezes mais ácido do que um

que esteja no pH(I). A vazão utilizada foi de 100 mL min–1.

Na Figura 38 é possível observar-se que em 4 horas de reciclo, não houve adsorção

considerável no TiO2, sendo a remoção máxima de 10% nas 4 horas (estrona).

Figura 38 – Adsorção dos quatro hormônios na titânia em pH 4 ( E1 E2 EE2 E3).

Já na Figura 39, que apresenta a adsorção em pH 8 — aproximadamente 100 vezes

mais básico do que o pH(I) —, houve uma adsorção um pouco maior. No entanto, ainda sim

foi baixa, chegando em 20% em 4 horas de contato, para o estriol.

Nenhum dos compostos apresentam grupos ionizáveis nesta faixa de pH avaliada, por

isto esse resultado era esperado. No entanto, tal experimento é importante para a confirmação

de que não existiria nenhum outro fator atuando na remoção dos compostos nos diferentes pH,

como por exemplo a mudança da carga predominante na superfície da partícula de dióxido de

titânio, ou do próprio grupo silanol na superfície do vidro que poderiam facilitar ou prejudicar

adsorção.

0 30 60 90 120 150 180 210 2400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

C/C

0

Tempo (min)

72

Figura 39 – Adsorção dos quatro hormônios na titânia em pH 8 ( E1 E2 EE2 E3).

Também foi avaliada a fotólise solar dos hormônios, onde novamente o reator foi

montado com a placa de vidro sem titânia.

Observa-se na Figura 40 que a fotólise também foi pouco representativa, atingindo-se

uma degradação máxima de 20% do estriol após 5 horas, sendo este efeito, menor para os

outros hormônios. A pequena remoção dos compostos está de acordo com a literatura.

Por exemplo, Fonseca, Lima e Valdemar (2011) conseguiram degradações significati-

vas dos 4 hormônios depois de 2 dias de exposição, obtendo-se aproximadamente 100% de

degradação somente em 110 dias.

Já os trabalhos apresentados por Chowdhury, Charpentier e Ray (2010, 2011) relata-

ram a degradação apenas do 17β-estradiol e da estrona, respectivamente, tendo sido determi-

nados tempos de meia-vida de 10 h para o primeiro e 56 h para o segundo. Os dois trabalhos

também apresentaram a influência de outros compostos na degradação solar, como por exem-

plo nitratos, hidrogenocarbonatos, cloretos e outros.

0 30 60 90 120 150 180 210 2400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

C/C

0

Tempo (min)

73

Figura 40 – Degradação por fotólise dos hormônios ( E1 E2 EE2 E3).

Em seguida, foi então realizada a degradação fotocatalítica. Foi estipulada uma vazão

de 100 mL min–1 e pH 4, condições similares às aplicadas para a fotólise, ambas as condições.

Foi possível constatar uma degradação bem mais acentuada destes compostos com a

fotocatálise heterogênea solar, como é se observa na Figura 41, obtendo-se mais de 90% de

degradação em 3 horas para todos os compostos.

Figura 41 – Degradação da fotocatalítica dos quatro hormônios ( E1 E2 EE2 E3).

0 30 60 90 120 150 180 210 2400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

C/C

0

Tempo (min)

0 30 60 90 120 150 180 210 2400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

C/C

0

Tempo (min)

LOQ

74

O único trabalho encontrado para fins de comparação foi realizado por Han et al.

(2012), que degradaram 200 mL de uma solução contendo estrona (600 µg L–1), em 10 min,

utilizando um reator com 0,05 g L–1 de titânia em suspensão irradiada pelo Sol.

Após a verificação, a partir dos testes preliminares, de que a fotocatálise solar poderia

ser utilizada para a degradação dos hormônios, foi dado início à otimização das condições de

operação do reator fotocatalítico.

5.2.2 Otimização do Reator

As condições de trabalho do reator fotocatalítico foram avaliadas por um planejamento

fatorial, com dois fatores (pH e vazão) em dos níveis (22). A Tabela 13 apresenta os níveis

avaliados para cada um dos fatores. O tempo de degradação foi escolhido pelos testes preli-

minares como 150 min.

Tabela 13 – Fatores e níveis avaliados no planejamento.

Fatores Níveis

–1 +1

pH 4,5 8

Vazão (mL min–1) 150 300

Os experimentos foram realizados em duplicata e em ordem aleatória. O planejamen-

to e os resultados obtidos (em porcentagem de degradação para cada composto) são apresen-

tados na Tabela 14.

Além da quantificação, que foi feita por cromatografia líquida, foi também medida

a radiação solar de cada experimento de 15 em 15 minutos, obtendo-se a energia incidente na

placa de vidro. Como a região de excitação do fotocatalisador fica na região do UV-A, a

quantificação de energia foi feita nessa região. Os resultados também são apresentados na

Tabela 14.

75

Tabela 14 – Planejamento fatorial exploratório realizado (variáveis codificadas), energia incidente e os resulta-

dos obtidos.

Experimento pH Vazão

(mL min–1)

Energia Incidente

(J cm–2)

Degradação (%)

E3 EE2 E2 E1

1 –1 –1 4,58 63,2 70,8 65,6 57,0

2 +1 +1 2,77 62,1 59,4 60,0 64,2

3 +1 –1 2,74 43,6 41,9 35,9 26,4

4 –1 +1 2,49 66,5 63,7 63,8 60,3

1 –1 –1 5,20 73,3 65,4 71,2 58,6

2 +1 +1 2,78 60,6 57,6 53,9 50,2

3 +1 –1 4,16 55,5 53,5 57,2 55,2

4 –1 +1 3,06 69,0 64,9 68,2 70,3

Como as energias incidentes foram bem diferentes para cada experimento, estas foram

utilizadas para normalizar os resultados de degradação, obtendo-se um valor de degradação

dividido pela energia incidente. Os resultados encontram-se na Tabela 15. A partir dos resul-

tados de degradação por energia, foi possível calcular os efeitos e a significância estatística

das variáveis.

Tabela 15 – Resultados do planejamento fatorial tendo como resposta a degradação pela energia irradiada na

amostra na região do UV-A.

Experimento pH Vazão

(mL min–1)

Degradação Normalizada (% J–1 cm2)

E3 EE2 E2 E1

1 –1 –1 13,8 15,5 14,3 12,4

2 +1 +1 20,3 21,4 21,6 23,1

3 +1 –1 15,9 15,2 13,1 9,6

4 –1 +1 26,7 25,6 25,6 24,2

1 –1 –1 14,1 12,6 13,7 11,3

2 +1 +1 21,7 20,7 19,3 18,0

3 +1 –1 13,3 12,9 13,7 13,2

4 –1 +1 22,5 21,2 22,3 23,0

76

A Figura 42 apresenta os gráficos de Pareto para os quatro hormônios. Em todos é

possível verificar-se que a vazão foi a única variável (dentre as testadas) significativa do pro-

cesso (com 95% de confiança). O valor do efeito foi positivo, o que indica a possibilidade de

aumento da degradação por energia irradiada com o aumento da vazão de água.

Figura 42 – Gráficos de Pareto com os efeitos de cada variável e sua interação Estrona (E1), 17β-estradiol (E2),

17α-etinilestradiol (EE2), Estriol (E3).

O fato do pH não ser significativo para nenhum dos hormônios testado pode ser justi-

ficado pelo valor dos seus respectivos pKa, todos acima de 10 (LEWIS; ARCHER, 1979).

Essa faixa de pH não foi atingida nos experimentos, pois ela não é habitual para água de abas-

tecimento. Este resultado também foi obtido por Malygina, Preis e Kallas (2005) que obser-

varam melhoras significativas na degradação do E2 em pH acima de 11, usando-se uma sus-

pensão de titânia irradiada com uma lâmpada que emitia luz centrada no comprimento de onda

de 360 nm, com uma intensidade de 1,1 mW cm–2.

E1

p = 0,05

1x2

(1)pH

(2)Vazão

-0,802

-1,06

6,44

E2

p = 0,05

1x2

(1)pH

(2)Vazão

-1,38

-1,95

8,16

EE2

p = 0,05

(1)pH

1x2

(2)Vazão

-0,804

-0,824

5,66

E3

p = 0,05

(1)pH

1x2

(2)Vazão

-1,15

-1,66

6,70

77

Já a tendência do aumento da degradação com o aumento da vazão, pode ser explicada

pelo número de passes que a água faz pela superfície do reator, já que quanto maior a vazão,

maior será o número de passes.

A tendência de melhoria do processo com o aumento da vazão pode também ser ob-

servada nas superfícies de resposta de cada um dos hormônios, representadas na Figura 43.

Os quatro hormônios têm a mesma tendência: aumento da degradação com o aumento da

vazão e praticamente nenhum efeito da variação do pH (na faixa estudada).

Figura 43 – Superfície de resposta do planejamento exploratório da estrona (E1), 17β-estradiol (E2); 17α-

etinilestradiol (EE2); estriol (E3). Variáveis (fatores) codificadas.

Como somente a vazão se mostrou significativa, deu-se continuidade a otimização

deste fator para o tratamento fotocatalítico. A Figura 44 demonstra a variação da resposta

(porcentagem de degradação/energia) em razão da vazão da água tratada. É possível obser-

var-se uma diferença significativa entre as vazões de 150 e 200 mL min-1, mantendo-se cons-

tante até 250 mL min-1, para todos os compostos.

> 24

< 23

< 21

< 19

< 17

< 15

< 13

< 11

-1,2

-0,8

-0,4

0,0

0,4

0,8

1,2

pH

-1 ,2-0 ,8

-0,40 ,0

0 ,40 ,8

1 ,2

Vazão

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

Degra

dação/E

nerg

ia

E1

> 24

< 23

< 21

< 19

< 17

< 15

< 13

-1,2

-0,8

-0,4

0,0

0,4

0,8

1,2

pH

-1,2-0,8

-0,40,0

0 ,40,8

1 ,2

Vazão

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Degra

dação/E

nerg

ia

E2

> 24

< 24

< 22

< 20

< 18

< 16

< 14

-1,2

-0,8

-0,4

0,0

0,4

0,8

1,2

pH-1,2

-0 ,8-0 ,4

0 ,00,4

0 ,81 ,2

Vazão

12

14

16

18

20

22

24

26

28D

egra

dação/E

nerg

ia

EE2

> 26

< 25

< 23

< 21

< 19

< 17

< 15

< 13

-1,2

-0,8

-0,4

0,0

0,4

0,8

1,2

pH

-1,2-0,8

-0,40,0

0,40 ,8

1,2

Vazão

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Degra

dação/E

nerg

ia

E3

78

Figura 44 – Otimização da vazão da água tratada.

Uma medida mais fina do ajuste de vazão não é possível devido a limitações de escala

do rotâmetro e também por uma pequena variação da vazão ao longo do processo, de 10 a

20 mL min-1 do começo ao fim do tratamento. Como a variação da vazão foi sempre para

menos, ou seja, se começássemos com 250 mL min–1, a vazão mínima poderia chegar até

230 mL min–1 no final do processo, foi escolhida a vazão de 250 mL min–1 como ótima para o

tratamento, pois mesmo que houvesse uma diminuição na vazão ainda estar-se-ia na região

ótima de trabalho.

Com a vazão de trabalho escolhida, foi feita então a avaliação da degradação dos hor-

mônios em função da energia incidente. Essa avaliação é importante, pois permite o aumento

de escala do tratamento, já que a energia incidente difere muito, dependendo da: latitude,

altitude, estação do ano, horário do dia e condições climáticas durante o tratamento d’água.

0 100 200 300 400 500

10

15

20

25

0 100 200 300 400 500

10

15

20

25

0 100 200 300 400 500

10

15

20

25

0 100 200 300 400 500

10

15

20

25EE2

De

gra

da

çã

o/E

ne

rgia

De

gra

da

çã

o/E

ne

rgia

E2

Vazão (mL min-1)Vazão (mL min

-1)

De

gra

da

çã

o/E

ne

rgia

E1

Vazão (mL min-1)Vazão (mL min

-1)

De

gra

da

çã

o/E

ne

rgia

E3

79

5.2.3 Degradação por Energia Incidente

Por se tratar de uma degradação solar, é praticamente impossível a comparação direta

entre experimentos, já que o desempenho da degradação em cada experimento depende das

condições climáticas em que foram obtidos. Sendo assim, as degradações foram calculadas

em função da energia incidida.

É possível observar-se na Figura 45 que os hormônios têm comportamento semelhante

sendo degradados com maior rapidez no começo da degradação e após 4 J cm-2 esta degrada-

ção passa a ser mais lenta, provavelmente pela diminuição dos compostos em solução, conse-

quentemente, diminuindo a probabilidade do radical hidroxila encontrar a molécula para a

degradação. Por isso, é importante avaliações em concentrações ainda mais baixas, algo que

não foi possível neste trabalho por limitações do sistema de análise.

Figura 45 – Degradação dos hormônios em relação a energia incidente no reator: condições otimizadas.

0 1 2 3 4 5 60,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 1 2 3 4 5 60,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 1 2 3 4 5 60,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 1 2 3 4 5 60,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 E2

C/C

0

Energia (J cm-2)

EE2

C/C

0

Energia (J cm-2)

E3

C/C

0

Energia (J cm-2)

E1

C/C

0

Energia (J cm-2)

80

5.2.4 Identificação de Produtos de Degradação

A identificação de produtos de degradação vem ganhando destaque na comunidade ci-

entífica, já que estes podem apresentar ainda problemas para o ambiente e para a saúde, po-

dendo ser até mais prejudiciais que o composto inicial. Existem trabalhos cujo único tema é a

identificação deste tipo de compostos (FERREIRA, 2014; KOULOUMBOS et al., 2003).

A ferramenta mais utilizada para a identificação de produtos de degradação é a croma-

tografia acoplada com a espectrometria de massas de alta resolução, já que, na maioria das

vezes, não existem padrões destes compostos.

Os compostos escolhidos para o trabalho são de difícil ionização. Utilizando-se ape-

nas as condições cromatográficas exposta no item 4.4, os picos dos compostos antes da de-

gradação apresentaram altura muito baixa no modo negativo e não se observaram picos no

modo positivo. Este fato, então, inviabilizou a utilização do método convencional para a

identificação dos produtos de degradação.

Os quatro compostos iniciais avaliados possuem uma hidroxila ligada ao anel aromáti-

co, grupo funcional passível de ionização em pH elevado. No entanto, a utilização de pH ele-

vado em cromatografia tem limitações quando se leva em consideração as sílicas quimica-

mente ligadas às cadeias carbônicas longas, como é o caso da coluna utilizada. Para contornar

esse problema, foi utilizada uma união em T para a adição de hidróxido de amônio após a

coluna cromatográfica, garantindo-se, assim, uma maior ionização dos compostos de interes-

se. A adição foi realizada por uma bomba Shimadzu LC-20AD (Bomba C, Figura 46), com

uma vazão de 0,1 mL min–1 (ACN, 1% NH4OH). O sistema cromatográfico foi o mesmo uti-

lizado anteriormente, assim como as condições do espectro de massas.

81

Figura 46 – Desenho esquemático do sistema HPLC para a infusão em T de amônia para o aumento da ionização

dos compostos.

Apesar de bastante eficiente para o aumento da intensidade do sinal analítico (Figura

47), não foi observado nenhum produto nos diversos tempos de degradação dos compostos,

separadamente.

Figura 47 – Comparação entre três análises dos hormônios E1 e E2: ()sem modificador, () 0,5% e () 1%

de hidróxido de amônio (em volume).

Foi então avaliada a extração online com a fase extratora Strata-X no sistema capilar, a

mesma utilizada no desenvolvimento do trabalho para a avaliação do reator, na tentativa de se

concentrar os produtos da oxidação. Desta vez, foi utilizado o detector de massas (Q-TOF).

A mesma união em T foi utilizada para o aumento da ionização dos compostos. O sistema é o

mesmo descrito no item 4.3 com a adição do espectrômetro de massas. Seu esquema é apre-

sentado na Figura 48.

82

Figura 48 Sistema utilizada para a identificação de subprodutos utilizando-se SPE online.

A vazão utilizada foi de 5 µL min1 na Bomba B, bomba binária responsável pela se-

paração cromatográfica, com o mesmo gradiente utilizado na análise com o sistema semi-

micro (item 4.4). A Bomba C, bomba para a adição de uma solução de hidróxido de amônio

em acetonitrila (0,1% em volume) em T após a coluna, funcionou com uma vazão de 5 µL

min-1, no modo isocrático. Já a bomba A, funcionou no modo isocrático (60 L min1) com

100% água. Apesar de não ser o ideal de vazão de trabalho deste tipo de detector, este possui

o capilar da fonte com volume compatível com vazões capilares.

Foi possível então identificar-se alguns produtos de oxidação, que foram comparados

com a literatura.

Apesar de todas as modificações realizadas no sistema cromatográfico, não foi possí-

vel a identificação de produtos de degradação partindo-se das concentrações utilizadas na

etapa de avaliação do processo fotocatalítico (250 µg L-1 de cada composto). Por isso, foi

utilizada a concentração de cada hormônio próximo a sua solubilidade: 4 mg estrona L-1,

10 mg 17β-estradiol L-1, 4 mg 17α-etinilestradiol L-1 e 10 mg estriol L-1.

83

5.2.4.1 Estrona (E1)

Alguns compostos chamaram a atenção, por não aparecerem no tempo inicial de de-

gradação, como é o caso do de massa/carga 303,1558 Da, detectado a partir de 90 min de de-

gradação. No cromatograma da Figura 49, é possível se observar que o composto é formado

até o tempo 210 min.

Figura 49 – Cromatograma do íon extraído de massa/carga 303,1586 Da, nos tempos 0, 60, 90, 120, 150, 180 e

210 min.

A Figura 50 apresenta a formação do composto ao longo do tempo, em termos da área

do respectivo pico cromatográfico.

Figura 50 – Formação do produto de massa 303,1558 Da ao longo da degradação.

0 30 60 90 120 150 180 210

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

Tempo (min)

Áre

a

84

Não foi encontrado nenhum trabalho que tenha observado esta massa após a degrada-

ção da estrona, porém existem trabalhos com outros compostos semelhantes que apresentaram

massas próximas (Figura 51). Em ambos os trabalhos o composto de partida para a degrada-

ção foi o estradiol (E2) e a degradação foi feita por fotocatálise heterogênea com dióxido de

titânio irradiado com uma lâmpada de baixa pressão de mercúrio de 8 W (MAI et al., 2008) e

com um simulador solar (MABOULA et al., 2015).

Apesar de haver uma diferença de apenas 15 ppm, já que a massa de ambos os com-

postos após a perda de um hidrogênio é de 303,1602 Da, é difícil propor uma reação que pos-

sa justificar a redução do grupo cetona à um grupo álcool no anel carbônico de cinco carbo-

nos. Uma hipótese mais viável é a formação de outra molécula com mesma massa molecular

(Figura 52), já que esta possui as características da molécula intacta da estrona.

Figura 51 – Produtos de degradação com massa 303,1602 Da propostos por: (a) Mai et al. (2008) e (b) Maboula

et al. (2015), respectivamente.

a) b)

Figura 52 – Molécula proposta formada na degradação da estrona.

CH3

O

OH

OOH

CH3OH

OH

OH

OH

CH3O

OH

OH

OH

85

Outro composto detectado com a degradação da estrona foi o de massa 335,1447 Da.

O seu cromatograma de íon extraído é apresentado na Figura 53. É possível observar-se que

esta massa aparece em todos os tempos de degradação menos no tempo inicial. A área do

pico respectivo aumenta de 30 até 120 min e então começa a diminuir, tendo sua menor área

em 210 min (Figura 54).

Figura 53 – Cromatograma extraído da massa 335,1447 Da nos diferentes tempos de degradação.


Uma massa muito próxima a esta foi encontrada por Ohko et al. (2002), porém esta

também é proveniente da degradação do estradiol e a molécula apresentada pelo autor tam-

bém apresenta uma hidroxila no anel de cinco carbonos (Figura 53).

0 30 60 90 120 150 180 210

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Áre

a

Tempo (min)

86

Figura 55 – Molécula proposta por Ohko et al. (2002) para um produto de degradação do estradiol (335,1500 Da,

após a perda de um átomo de hidrogênio).

Mais uma vez, propõe-se uma molécula com a mesma massa molecular (335,1500 Da)

e com a mesma estrutura base da molécula da estrona (Figura 55). O erro da massa foi de

16 ppm.

Figura 56 – Molécula proposta para a massa 335,1447 Da.

5.2.4.2 17β-Estradiol (E2)

O composto encontrado para o 17β-Estradiol (E2) apresentou uma massa/carga próxi-

ma à encontrada na avaliação da estrona (E1) e também do trabalho publicado por Ohko et al.

(2002), 335,1455 Da. Este aparece em todos os tempos de degradação, menos no tempo ini-

cial, como demonstrado na Figura 57, com um erro de -14 ppm como relação à molécula pro-

posta por Ohko et al. (2002). A Figura 58 apresenta a formação do composto ao longo do

tempo, em termos da área do respectivo pico cromatográfico.

CH3OH

O

O

OH

OH

O

CH3O

O

O

OH

OH

OH

87

Figura 57 – Cromatograma do íon extraído da massa 335.1458 Da.


5.2.4.3 17α-Etinilestradiol (EE2)

Não foram identificados produtos de degradação.

0 30 60 90 120 150 180

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

Áre

a

Tempo (min)

88

5.2.4.4 Estriol (E3)

Não foi encontrado nenhum trabalho na literatura que tenha avaliado os produtos de

degradação para o estriol. Neste trabalho foi encontrada a massa 319,1544 Da, que surge de-

pois de 30 min de degradação e aumenta com o tempo de degradação (Figura 59). A Figura

60 apresenta a formação do composto ao longo do tempo, em termos da área do respectivo

pico cromatográfico.

Figura 59 – Cromatograma do íon extraído massa/carga 319,1544 Da do estriol nos diversos tempos de degrada-

ção.


0 30 60 90 120 150 180

0

200000

400000

600000

800000

1000000

Áre

a

Tempo (min)

89

Irmak, Erbatur e Akgerman (2005) observaram a formação de um composto de massa

muito próxima à encontrada neste trabalho para a degradação do estriol. No entanto, o traba-

lho citado degradou o composto E2 com o ozônio. A mesma massa também foi encontrada

por Maboula et al. (2015) na degradação fotocatalítica do E2, com o dióxido de titânio, porém

outro composto foi sugerido pelos autores. Os compostos sugeridos por esses autores são

apresentados na Figura 61.

Figura 61 – Compostos propostos como produtos de degradação do E2: (a) Irmak, Erbatur e Akgerman (2005) e

(b) Maboula et al. (2015), ambos com massa/carga 319,1551 Da (M-1).

a) b)

Apesar do erro de massa entre as moléculas sugeridas pelos autores e a encontrada

neste trabalho ser muito pequeno (-2,2 ppm), a probabilidade de que estes compostos tenham

sido formados é muito baixa, já que a hidroxila do anel de 5 membros teria de ser removida, o

que é difícil de acontecer em um processo oxidativo. Composto mais viáveis são isômeros

dos compostos apresentados na literatura (Figura 62).

Figura 62 – Produtos propostos na degradação do estriol.

a) b)

CH3

O

OOH

OH

CH3

OH

OH

OH OH

CH3OH

OH

O

OOH

CH3OH

OH

OH

OH

OH

90

O composto da Figura 62a foi proposto levando-se em consideração o trabalho de

Pereira et al. (2011), que obtiveram um composto de degradação semelhante, reagindo o 17β-

Estradiol (E2) com ozônio (Figura 63).

Figura 63 – Composto proposto por Pereira et al. (2011) na degradação do estradiol.

5.2.4.5 Conclusão da Identificação dos Produtos de Degradação

Apesar da melhora significativa do sinal dos hormônios e da possibilidade de se iden-

tificar alguns produtos de degradação, não é possível ter certeza dos compostos apresentados,

já que mesmo com a concentração obtida com a SPE online, não se obtiveram altos sinais,

não permitindo a realização de análises em tandem (MS-MS).

Para que isso seja possível é necessário um maior fator de concentração dos compos-

tos, uma vez que não é possível aumentar a concentração dos hormônios avaliados (por já

estarem próximos aos seus limites de solubilidade).

5.3 Atividade Estrogênica (MCF-7)

Para o teste de atividade estrogênica, foi realizado um experimento com 3 horas de du-

ração, sendo avaliadas quatro amostras: a amostra inicial e depois de uma, duas e três horas

de degradação fotocatalítica, sendo a concentração inicial de carda hormônio de 250 µg L1.

Os experimentos foram realizados em sextuplicatas.

CH3OH

O

O

OH

91

A curva de proliferação celular obtida para esse experimento sugeriu que 3 h não foi

um tempo suficiente para degradar hormônios avaliados a ponto de remover a atividade estro-

gênica deles e de seus produtos de degradação, pois as amostras apresentaram atividade estro-

gênica semelhante àquela obtida para o controle positivo nos seis dias de cultivo das células

(Figura 61).

Figura 64 Curva de proliferação celular (em sextuplicata).

Embora tenha sido feito o acompanhamento do crescimento em todos os dias, o teste

de estrogenicidade foi realizado no sexto e último dia (Figura 62), visto que esse foi o tempo

necessário para se atingir a estabilização do crescimento celular estimulado pelo controle po-

sitivo.

Figura 65 Absorbância causada pelo crescimento das células no sexto dia de cultivo (em sextuplicata).

P rim e iro e x p e rim e n to

(c o n c e tra ç ã o d e E 2 c o m o re fe rê n c ia )

d ia s

Ab

so

rb

ân

cia

0 1 2 3 4 5 6 7

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

c o n tro le n e g a tiv o

c o n tro le p o s it iv o (E 2 )

0 h

1 h

2 h

3 h

P rim e iro e x p e rim e n to - 6

o d ia

ab

so

rb

ân

cia

co

ntr

ole

neg

at i

vo

co

ntr

ole

po

sit

ivo

(E

2)

0h

1h

2h

3h

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

****

* p < 0 ,0 5

* * p < 0 ,0 1

* ** p < 0 ,0 0 1

* ** * p < 0 ,0 0 0 1

92

Uma análise de variância (ANOVA) com comparações múltiplas foi realizada para o

conjunto de dados (Tabela 17).

Tabela 16 Tabela ANOVA para os experimentos realizados em três tempos de degradação (1, 2 e 3 horas).

G.L. SS MS Teste F p

Grupos 5 1,278 0,2555 36,69 < 0,0001

resíduos 36 0,2508 0,006965

Total 41 1,528

R2 0.8359

G.L.: grau de liberdade; SS: soma dos quadrados; MS: média dos quadrados.

O teste de Dunnet (Tabela 18) foi aplicado utilizando-se o controle positivo como re-

ferência. Os resultados obtidos sugerem que não há diferença entre a estrogenicidade apre-

sentada pelo E2 usado como controle positivo e as amostras submetidas ao teste de degrada-

ção.

Tabela 17 Teste de Dunnet (α = 0,05) para a diferença entre as observações.

Diferença

entre os grupos

Diferença

entre

as médias

Limite

Inferior

(IC)

Limite

Superior

(IC)

p Significativo?

CP* (E2) vs. CN** 0,4837 0,3663 0,6011 < 0,0001 Sim

CP* (E2) vs. 0h -0,01371 -0,1311 0,1036 0,9980 Não

CP (E2) vs. 1h 0,09200 -0,02541 0,2094 0,1673 Não

CP (E2) vs. 2h 0,04100 -0,07641 0,1584 0,8244 Não

CP (E2) vs. 3h 0,006000 -0,1114 0,1234 0,9998 Não

*Controle Positivo; **Controle Negativo

Em seguida, uma nova degradação foi feita por um período de 9 h. O procedimento

experimental utilizado foi o mesmo descrito anteriormente.

93

Analisando-se a curva de proliferação celular obtida para esse experimento, é possível

observar que a amostra coletada no tempo inicial do experimento (0 h) estimulou o cresci-

mento de forma semelhante àquela apresentada pelo controle positivo. Em contrapartida, a

amostra da mistura que foi exposta ao tratamento de degradação durante 9 horas (Figura 63),

apresentou menor atividade estrogênica que o hormônio de referência, sugerindo que a perda

de atividade seja devida à degradação parcial dos hormônios.

Figura 66 Curva de proliferação celular para a amostra de 9 h de irradiação (em sextuplicata).

A perda parcial da atividade estrogênica fica mais evidente quando se observa o gráfi-

co da atividade detectada no sexto dia do experimento (Figura 64).

Figura 67 Absorbância causada pelo crescimento das células no sexto dia de cultivo para uma degradação de 9 h

(em sextuplicata).

S e g u n d o e x p e rim e n to

(c o n c e n tr a ç ã o d e E 2 c o m o r e fe r ê n c ia )

d ia s

ab

so

rb

ân

cia

0 1 2 3 4 5 6 7

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

c o n tro le n e g a tiv o

c o n tro le p o s it iv o (E 2 )

0 h

9 h

S e g u n d o e x p e rim e n to

(c o n c e tra ç ã o d e E 2 c o m o re fe rê n c ia )

ab

so

rb

ân

cia

co

ntr

ole

neg

at i

vo

co

ntr

ole

po

sit

ivo

(E

2)

0h

9h

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

***

****

* p < 0 ,0 5

* * p < 0 ,0 1

* ** p < 0 ,0 0 1

* ** * p < 0 ,0 0 0 1

94

A análise de variância para esse experimento mostrou que não há diferença estatisti-

camente significativa entre a mistura de hormônios no tempo inicial (0 h) e o controle positi-

vo. No entanto, o resultado obtido para a amostra após 9 h de degradação é estatisticamente

diferente do controle positivo (Tabela 19).

Tabela 18 ANOVA para a amostra degradada por 9 h.

G.L. SS MS Teste F p

Grupos 3 0,3015 0,1005 28,88 < 0,0001

resíduos 28 0,09742 0,003479

Total 31 0,3998

R2 0.7558

G.L.: grau de liberdade; SS: soma dos quadrados; MS: média dos quadrados.

A diferença entre o controle e amostra com 9 h de tratamento é significativa, como

demonstrado na Tabela 20.

Tabela 19 Teste de Dunnet (α = 0,05) para a diferença entre as observações.

Diferença

entre os grupos

Diferença

entre

as médias

Limite

Inferior

(IC)

Limite

Superior

(IC)

p Significativo?

CP (E2) vs. CN 0,2566 0,1809 0,1809 < 0,0001 Sim

CP(E2) vs. 0h 0,0485 -0,03607 -0,03607 0,3634 Não

CP (E2) vs. 9h 0,1328 0,05713 0,05713 0,0005 Sim

*Controle Positivo; **Controle Negativo

Embora na análise cromatográfica seja possível se observar o desaparecimento das

bandas cromatográficas dos hormônios avaliados, a atividade estrogênica observada para a

amostra após 9 h de degradação sugere que os hormônios estudados, mesmo em concentra-

ções abaixo do limite de quantificação da técnica empregada (3 g L1), e/ou seus produtos de

degradação ainda apresentam atividade biológica.

95

6. CONCLUSÕES

A sistema cromatográfico desenvolvido apresentou excelentes resultados, sendo com-

parável tanto a técnicas convencionais, como por exemplo a de Verbinnen, Nunes e Vieira

(2010), que conseguiram um limite de quantificação menor, de 1,25 µg L–1 para o estriol (E3),

e de 3,75 µg L–1 para estrona (E1), 17α-etinilestradiol (EE2) e 17β-estradiol (E2) em detector

UV, porém utilizou 1 litro de amostra e a corrida cromatográfica foi de 16 min, sem contar o

tempo da extração.

O método também pode ser comparado com técnicas miniaturizadas, como por exem-

plo, o apresentado por Almeida e Nogueira (2006), que utilizou a técnica de SBSE para a ex-

tração de diversos interferentes endócrinos, tendo sido obtido um limite de quantificação de

3 µg L–1 para o EE2, E2 e E1, porém ele sutilizaram30 mL de amostra e a extração consumiu

2 h.

Apesar de o volume não ser propriamente um problema com relação à disponibilidade

de amostras ambientais, a necessidade de um volume grande de amostra pode gerar problemas

para a estocagem e manuseio, necessitando de lugares amplos.

Além disso, o desenvolvimento e avaliação de sistemas de tratamento de águas e esgo-

tos em escalas laboratoriais na maioria das vezes utilizam reatores de baixa capacidade (de 0,1

a 10 litros) o que demanda coletas de pequenas alíquotas para o acompanhamento do proces-

so.

Ambos os casos podem se beneficiar das vantagens do método, que também é um sis-

tema simples de se operar e é totalmente automatizado.

A fotocatálise heterogênea solar (TiO2) parece como uma alternativa promissora para

a degradação dos hormônios testados. Com os estudos feitos até agora, é possível afirmar-se

que a fotocatálise possibilita a degradação de forma muito mais efetiva que a fotólise e que

não existe a perda significativa dos compostos por outras fontes.

96

Também é possível afirmar-se que a alteração do pH, na faixa em que geralmente a

água é distribuída à população, não produz alteração significativa na degradação dos hormô-

nios e que a utilização de uma vazão de 250 µL é o ideal para o trabalho deste reator.

A degradação solar catalisada pelo dióxido de titânio é bastante eficaz na remoção dos

compostos, removendo 90% dos hormônios em 4 horas de degradação (5,5 J cm2), apesar da

boa remoção dos compostos, não foi possível remover todo o efeito biológico destes para o

organismo teste avaliado, sendo possível apenas uma remoção parcial em nove horas de de-

gradação. Esse pode ser justificado pela sinergia dos compostos na produção de efeito bioló-

gico e/ou pela formação de subprodutos de degradação que podem ter atividade biológica.

Apesar de os intermediários terem sido observado nos cromatograma após a extração

on-line, não foi possível a identificação estrutural pois estes estavam em baixa concentração,

não sendo possível aplicar o modo MS/MS do equipamento.

97

7. SUGESTÕES PARATRABALHOS FUTUROS

Para que se trabalhe em menores concentrações é importante aumentar o fator de

concentração do método analítico proposto, ou seja aumentar o volume injetado

para a extração on-line, permitindo uma verificação em concentrações menores;

O aumento do volume de injeção também pode ser um fator importante para iden-

tificação exata dos compostos formados, além de possibilitar uma avaliação de

degradação por unidade de energia em uma região que ocorre naturalmente;

Avaliar a cinética de degradação em concentrações inferiores;

Avaliar outros organismos testes;

Avaliar outros tipos de reatores;

98

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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degradaÇÃo de hormÔnios em Águas de abastecimento … · do para meu crescimento profissional....

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