(cuvier, 1818), expostos ao petrÓleo e a hipoxia....

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZOcircNIA - INPA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM

LUCIANO RICARDO BRAGA PINHEIRO

Dissertaccedilatildeo apresentada ao programa

Integrado de Poacutes-graduaccedilatildeo em

Biologia Tropical e Recursos Naturais

do convecircnio INPAUFAM como

requisito para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de

mestre em CIEcircNCIAS BIOLOacuteGICAS

aacuterea de concentraccedilatildeo em Geneacutetica

Conservaccedilatildeo e Biologia Evolutiva

Manaus _ AM

2007

EXPRESSAtildeO GEcircNICA DIFERENCIAL EM TAMBAQUIS Colossoma macropomum

(Cuvier 1818) EXPOSTOS AO PETROacuteLEO E A HIPOXIA




Orientadora Vera Maria Fonseca de Almeida-Val Dr ordf

Co-orientador Seacutergio Ricardo Nosawa Dr

Fonte financiadora Projeto Piatam III (FINEPPetrobras) FAPEAM PRONEX

(CNPq-FAPEAM)







aacuterea de concentraccedilatildeo em geneacutetica

conservaccedilatildeo e Biologia Evolutiva

Bolsista FAPEAM

Manaus - AM

2007



ii

Dedico este trabalho a Analucia Braga

esta que eacute ao mesmo tempo matildee pai e

amiga a pessoa que priorizou a minha

felicidade em detrimento da dela aquela

que faz do meu sucesso suas maiores

conquistas Amo-te muito

iii

Agradecimentos

Agrave Profa Dra Vera Maria Fonseca de Almeida-Val minha orientadora

pela oportunidade confianccedila e amizade Esta que por vezes deixou

de lado a condiccedilatildeo imparcial da academia e me abraccedilou como uma

substituta da minha matildee

Ao Dr Seacutergio Ricardo Nozawa meu co-orientador sua esposa e

colega Mocircnica Nozawa pela paciecircncia e co-orientaccedilatildeo Por terem

sentado agrave bancada comigo e resolvido questotildees que claramente

haviam chegado ao meu limite intelectual

Ao Dr Adalberto Luiacutes Val pelo apoio infra-estrutura e fomento para o

meu projeto de dissertaccedilatildeo sem o qual natildeo seria possiacutevel sua

conclusatildeo

Agrave Dra Gislena Carvalho pela atenccedilatildeo e boa vontade em me atender e

esclarecer minhas inuacutemeras duacutevidas aleacutem da colaboraccedilatildeo na

qualificaccedilatildeo

Agrave minha grande amiga Herciacutelia que nas horas de dificuldade sempre

me estendeu a matildeo Agradeccedilo por ouvir com toda paciecircncia minhas

reclamaccedilotildees ateacute aquelas injustificadas

Ao meu eterno amigo e professor Alexandre Luna Cacircndido aquele

que me fez entrar em contato com a Biologia Molecular e nunca

deixou de acreditar nos seus alunos

iv

Aos companheiros de trabalho e amigos do GCBEV e LEEM

Pessoas maravilhosas muitos dos quais foram meus parceiros de

riso e choro Em especial a Maria de Faacutetima que muito me ajudou no

final dos experimentos me dando apoio quando precisei

Ao Centro Universitaacuterio Nilton Lins Manaus por fornecer o espaccedilo

laboratorial de forma incondicional complementando meus trabalhos

do INPA

Agrave minha famiacutelia que graccedilas a Deus deposita em mim uma confianccedila

inabalaacutevel

Ao Francisco de Assis dos Santos parceiro de conversa e um

grande divisor de aacuteguas na minha vida acadecircmica Antes de

conhececirc-lo nem ao menos sabia o significado do termo mestrado

Agrave minha matildee Pessoa que me orgulha com sua caracteriacutestica

batalhadora e por ser humana e maravilhosamente compreensiva

A Deus eterno pai e senhor

v

Ficha catalograacutefica

Pinheiro Luciano Ricardo Braga

Expressatildeo gecircnica diferencial em TambaquisColossoma macropomum (Cuvier

1818) expostos ao petroacuteleo e a hipoxia

xi - 66p

Dissertaccedilatildeo (mestrado) ndash Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA)

Universidade Federal do Amazonas (UFAM) 2007

1 Expressatildeo gecircnica 2 Petroacuteleo 3 DD RT-PCR 4 Amazocircnia 5Peixes

ldquo permitida a coacutepia total ou parcial deste documento desde que citada a fonte ndash o autorrdquo

vi

RESUMO

A exploraccedilatildeo de petroacuteleo na Bacia Amazocircnica jaacute eacute uma realidade As condiccedilotildees

de pH sedimentos precipitados vegetaccedilatildeo oxigenaccedilatildeo e vazatildeo neste ambiente satildeo

tatildeo peculiares que eacute difiacutecil avaliar com precisatildeo quais os reais impactos de um

vazamento de oacuteleo em aacuteguas interiores na Amazocircnia Neste trabalho o Tambaqui

peixe endecircmico da Bacia Amazocircnica foi avaliado como alternativa de biomarcador de

contaminaccedilatildeo por petroacuteleo Por meio da teacutecnica de DD RT-PCR investigamos o

padratildeo de expressatildeo gecircnica em juvenis de Tambaquis expostos a concentraccedilotildees

subletais e o dobro da concentraccedilatildeo letal de oacuteleo cru nos intervalos de tempo de 3 6

e 12 horas sendo este uacuteltimo tempo o periacuteodo proposto para recuperaccedilatildeo sob

condiccedilotildees de normoacutexia e hipoacutexia Apoacutes os experimentos os animais foram

sacrificados e o fiacutegado imediatamente congelado em nitrogecircnio liacutequido para posterior

extraccedilatildeo do RNA A siacutentese da fita complementar de cDNA foi feita por 3 iniciadores

poli-T ancorados com nucleotiacutedeos terminais CG ou A A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo se

deu combinando os iniciadores poliT com outros 5 iniciadores heteroacutelogos de 13

nucleotiacutedeos O produto amplificado foi revelado em gel de agarose 25 e corado

com brometo de etiacutedium sendo as bandas diferencialmente expressas eluiacutedas e

clonadas com Ecoli com Vetor P-gen easy sistem para posterior sequumlenciamento e

comparaccedilatildeo com bancos puacuteblicos de ESTacutes Foram identificados 4 genes (i) RAG2

(recombination-activating genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR

(glutathione reductase) e (iv) CFTR Os trecircs uacuteltimos estatildeo amplamente reportados

como agentes do processo de desintoxicaccedilatildeo enquanto que o primeiro eacute um

regulador na formaccedilatildeo de ceacutelulas do sistema imune RAG2 e ERK tambeacutem estatildeo

envolvidos em mecanismos de apoptose celular (morte programada da ceacutelula) GR no

processo antioxidante em condiccedilotildees de estresse ambiental e CFTR como regulador

de Caacutelcio em bracircnquias de peixes O meacutetodo de DD RT-PCR mostrou-se eficiente no

processo de identificar vias bioquiacutemicas que habilitem organismos da Bacia

Amazocircnica como biomarcadores de poluiccedilatildeo ambiental causada por petroacuteleo

1

ABSTRACT

Petroleum industry is a reality in the Amazon region Specific sediment and pH

along with water level changes which induce specific patterns of oxygenation and

floating vegetation make such a complex environment that becomes difficult to predict

all impacts of an oil spill in the Amazon basin The present work investigates the

effects of petroleum exposure on Tambaqui an endemic Amazon fish species

Differential Display RT-PCR was applied to reveal differential expressed genes

between juveniles exposed and non-exposed to petroleum sub-letal concentrations

twice letal concentration at three and six hours Recovery was measured after 6 hours

under both conditions hypoxia and normoxia After the experiments fish were killed

and liver was immediately excised and frozen in liquid nitrogen RNA was then

extracted cDNA was obtained after hybridization with poli-T primers anchored with

terminal nucleotides C G or A Amplifying reaction was performed combining poli-T

primers with five heterologous primers with 13 nucleotides Amplified product was

visualized after electrophoresis in 25 agarose gel and stained with ethidium

bromide The differentially expressed bands were eluted and cloned with Ecoli ndash

Vector P-gen easy system and sequenced The sequences were compared with

ESTrsquos public banks Four genes were identified (i) RAG2 (recombination-activating

genes) (2) ERK (mitogen-activated protein kinase) (iii) GR (glutathione reductase) e

(iv) CFTR The last three are well reported as detoxifying agents while the first

regulates cell formation for immune system RAG2 and ERK are also involved in cell

apoptosis GR is involved in the antioxidant process after environmental stress

exposure CFTR regulates Calcium uptake at fish branchial level Thus DD RT-PCR is

an efficient method to identify the main biochemical pathways involved in the

responses of fish to petroleum exposure

2

IacuteNDICE

11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo 4 12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica 5 13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos 6 14 - O tambaqui como um modelo biomarcador 10 15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular 12 16 - Objetivos 14

161 - Objetivo Geral 14 162 - Objetivos Especiacuteficos 1 4

17 - Justificativa 15 2 MATERIAIS E MEacuteTODOS 17

21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui 17 22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo 18

221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo 18 222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido 18 231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol 19 232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA) 19

Sequumlecircncias 20

233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios 20 235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas 21 236 ndash Clonagem dos produtos amplificados 22 237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas 23

3 ndash RESULTADOS 23

31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose 23 333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial 34 4 ndash CONCLUSAtildeO 57

5 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 58

3

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 ndash A caracterizaccedilatildeo do petroacuteleo

Petroacuteleo eacute o nome comum dado a uma mistura de compostos orgacircnicos fruto de

decomposiccedilatildeo incompleta da biomassa relacionada a eventos de intemperismo ao

longo da histoacuteria geoloacutegica do planeta (Val e Almeida-Val 1999) Os componentes do

petroacuteleo podem ser subdivididos em dois grupos a) Alcanos e b) Hidrocarbonetos

aromaacuteticos Os Alcanos estatildeo subdivididos em n-alcanos com configuraccedilatildeo estrutural

linear e saturados e alcanos isoprenoacuteides derivados dos alcenos de cadeias

ramificadas com cinco aacutetomos de carbono Nos dois casos satildeo comumente de

natureza biogecircnica secretados pelo fitoplacircncton marinho algas bentocircnicas bacteacuterias

e vegetais superiores Entre os dois grupos apenas os n-alcanos satildeo constituintes do

petroacuteleo Quanto aos hidrocarbonetos aromaacuteticos destacam-se os compostos

Policiacuteclicos (PAHs) moleacuteculas que apresentam em suas estruturas pelo menos dois

aneacuteis aromaacuteticos Existe uma iacutentima relaccedilatildeo entre sua presenccedila no ambiente e

atividades associadas ao petroacuteleo e seus derivados Os PAHs podem ser

subdivididos de acordo com sua natureza em petrogecircnicos constituintes direto do

oacuteleo cru e caracterizados por ciclos aromaacuteticos curtos ou pirogecircnicos derivados da

combustatildeo parcial de compostos orgacircnicos presentes no proacuteprio petroacuteleo ou na

biomassa vegetal de aacutereas florestais Os principais PHAs de origem petrogecircnica satildeo

naftaleno fenantreno e antraceno Apresentam heteroaacutetomos de oxigecircnio ou enxofre

aleacutem de homoacutelogos alquilados Os pirogecircnicos apresentam trecircs ou mais ciclos

aromaacuteticos e baixo grau de alquilaccedilatildeo (Lourenccedilo 2003) Muitos dos compostos do

petroacuteleo tecircm potenciais efeitos carcinogecircnicos ou genotoacutexicos para a biota que podem

4

ser agravados dependendo dos metaboacutelitos gerados por eventual absorccedilatildeo (Matsuo

2004)

12 - As implicaccedilotildees do desenvolvimento da induacutestria petroliacutefera na Bacia Amazocircnica

A inserccedilatildeo da regiatildeo Norte no dinacircmico cenaacuterio econocircmico vem ganhando forccedila

sobretudo na segunda metade do seacuteculo XX Os indicadores de composiccedilatildeo da

populaccedilatildeo que estatildeo intimamente ligados ao sucesso das atividades e investimentos

do setor industrial satildeo visivelmente mais expressivos na Amazocircnia que a meacutedia

nacional durante a deacutecada de 80 e 90 Nesse periacuteodo a taxa de crescimento

populacional na Amazocircnia foi de 36 enquanto que o resto do Brasil cresceu 19

Ainda nesta linha no iniacutecio da deacutecada de oitenta os municiacutepios da Amazocircnia Legal

com populaccedilatildeo urbana superior a 50 mil habitantes estavam praticamente resumidos

agraves capitais Em 1991 jaacute totalizavam 25 e 5 anos mais tarde este montante

ultrapassava 30 municiacutepios Entretanto os serviccedilos de infra-estrutura e saneamento

baacutesico aleacutem daqueles que compotildeem o iacutendice de desenvolvimento humano (IDH)

como sauacutede educaccedilatildeo e poder de compra natildeo acompanharam a crescente demanda

da populaccedilatildeo A consequumlecircncia imediata foi o aparecimento de um excedente

marginalizado que potencializou os impactos no ambiente amazocircnico (Monteiro e

Sawyer 2001) Em geral a demanda por energia cresce conforme o aumento do

consumo Atualmente mais que 50 da energia requerida no mundo satildeo

dependentes das atividades de prospecccedilatildeo de petroacuteleo (Solomon 1980) Esta

pressatildeo pelo consumo do petroacuteleo acarreta necessidade de investimentos para

aumento de produccedilatildeo aleacutem de gerar um passivo ambiental derivado de acidentes com

derramamentos de oacuteleo lavagens de tanques de estocagem escape por combustatildeo

5

incompleta dos automotivos e despejos de solventes de usos domeacutesticos ou

industriais (Meniconi amp Garbado 2002) O estado do Amazonas vem se destacando

no cenaacuterio da induacutestria petroliacutefera com uma crescente produccedilatildeo de oacuteleo considerado

de excelente qualidade

A exploraccedilatildeo do petroacuteleo na Amazocircnia eacute anterior agrave Petrobraacutes Em 1934 foram

realizadas 17 perfuraccedilotildees nas proximidades de grandes rios ainda sob a

responsabilidade do Departamento Nacional da Produccedilatildeo Mineral e posteriormente

mais 7 a cargo do Conselho Nacional do Petroacuteleo No entanto as condiccedilotildees de

exploraccedilatildeo e o entendimento da dinacircmica das bacias sedimentares eram precaacuterios e

soacute apoacutes 1953 com a criaccedilatildeo da Petrobraacutes eacute que a tecnologia de perfuraccedilatildeo baseada

em informaccedilotildees gravimeacutetricas e de geologia de superfiacutecie comeccedilou a produzir frutos

(Carvalho 2002) A intensificaccedilatildeo de exploraccedilatildeo no estado do Amazonas se daacute a

partir de 1986 apoacutes descoberta das reservas de gaacutes natural e petroacuteleo situadas na

proviacutencia de Urucu distante 600 km da cidade de Manaus (Duarte 2005) O petroacuteleo

eacute extraiacutedo em terra firme e bombeado para a margem do rio Tefeacute O capital gerado

pelas atividades da Petrobraacutes na regiatildeo tem forte repercussatildeo soacutecio-econocircmica Aleacutem

de ser a atividade com maior potencial arrecadador de ICMS do Amazonas os

royalties pagos ao estado e municiacutepios amazonenses chegaram ao montante de R$

1901400000 no ano de 2001 apenas ao municiacutepio de Coari (Sakamoto 2002)

13 - As bacias hidrograacuteficas na regiatildeo amazocircnica e suas fragilidades a impactos por xenobioacuteticos

Entende-se por bacia hidrograacutefica o rio principal seus formadores afluentes

lagos lagoas marginais reservatoacuterios e demais coleccedilotildees de aacutegua (IBAMA 2003) A

6

regiatildeo Hidrograacutefica do Amazonas possui uma vazatildeo meacutedia de 134119 m3s

correspondendo a 73 da vazatildeo de todo territoacuterio brasileiro Deteacutem a maior

diversidade de peixes do mundo totalizando entre 2500 e 3000 espeacutecies (ANA

2002) A dinacircmica deste bioma comeccedila a passar por um raacutepido processo de

transformaccedilatildeo a partir do crescimento exponencial do movimento migratoacuterio ainda na

primeira metade do seacuteculo XX aumentando assim as pressotildees antroacutepicas na regiatildeo

O desmatamento colabora com a lixiviaccedilatildeo e assoreamento das bacias por

sedimentos que satildeo carreados a partir das aacutereas desnudas Aleacutem disso o processo

erosivo tambeacutem incrementa a exportaccedilatildeo de mercuacuterio metal comum na constituiccedilatildeo

dos solos da Amazocircnia (Farella et al 2001) A mineraccedilatildeo outra importante fonte de

renda dos amazocircnidas potencializa a deposiccedilatildeo de mercuacuterio e outros metais como

alumiacutenio nas calhas dos grandes rios e contribuem para sua turbidez sobretudo em

ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas A consequumlecircncia eacute a maximizaccedilatildeo destes

compostos na cadeia troacutefica (Mol amp Ouboter 2004) A variedade de xenobioacuteticos

capazes de ser artificialmente inseridos na bacia amazocircnica por accedilatildeo antroacutepica eacute

significativa Outros exemplos satildeo os Organoclorados (OCPs) derivados de

defensivos quiacutemicos nas praacuteticas agriacutecolas Fenoacuteis (PCBs) e Hidrocarbonetos

Poliaromaacuteticos (PAHs) Todos satildeo poluentes orgacircnicos passiacuteveis de formar

complexos que se acumulam nos organismos aquaacuteticos (Verweij et al 2004) Quanto

aos PAHs em florestas tropicais podem estar relacionados a queimadas para

expansatildeo das fronteiras agriacutecolas (Abas et al 1995) ou ainda a derivados da accedilatildeo

petrogecircnica A concentraccedilatildeo de xenobioacuteticos no ambiente pode diminuir a

heterogeneidade de haacutebitats condiccedilatildeo de extrema importacircncia para o complexo

bioma amazocircnico A homogeneizaccedilatildeo do ambiente pode se dar por modificaccedilotildees nos

paracircmetros fiacutesico-quiacutemicos importantes para sobrevivecircncia da biota como pH

7

oxigecircnio dissolvido na aacutegua turbidez temperatura aleacutem de interferecircncia nas relaccedilotildees

ecoloacutegicas Os organismos aquaacuteticos satildeo especialmente sensiacuteveis a estas variaccedilotildees

respondendo com modificaccedilotildees significativas do seu padratildeo de distribuiccedilatildeo e

diversidade (Petry et al 2003) Aleacutem da mineraccedilatildeo e do desmatamento o

desenvolvimento do capital industrial na Amazocircnia contribuiu para o excedente de

resiacuteduos derivados de petroacuteleo Ainda natildeo estatildeo bem compreendidos os impactos em

longo prazo do passivo gerado por vazamentos de embarcaccedilotildees lavagem de

tanques solventes orgacircnicos despejados por esgotos domeacutesticos bem como a

geraccedilatildeo de produtos provenientes da proacutepria atividade de exploraccedilatildeo e refino do

petroacuteleo Existe um largo espectro de componentes orgacircnicos e inorgacircnicos derivados

do oacuteleo aacutegua de formaccedilatildeo e aditivos que satildeo adicionados ao ambiente Os

compostos fenoacutelicos de cadeias longas satildeo exemplos de substacircncias lipossoluacuteveis

que podem permanecer por mais tempo no ambiente e em peixes influenciar o

balanccedilo hormonal devido a interaccedilotildees com receptores de estrogecircnio ou ainda

funcionar como pro - oxidantes em doses elevadas (Larkin et al2002 Hasselberg et

al2004) Os hidrocarbonetos policiacuteclicos e heterociacuteclicos originados do petroacuteleo e

seus derivados satildeo comumente reportados como agentes causadores de severos

danos celulares por serem capazes de oxidar moleacuteculas orgacircnicas complexas como

os aacutecidos nucleacuteicos (Xue amp Warshawsky 2005) O potencial mutagecircnico do oacuteleo cru

em organismos aquaacuteticos jaacute foi amplamente descrito (Baumann 1998 Aas et al

2000 Shailaja amp DacuteSilva 2003 Hyotylainen amp Oikari 2004) O tipo de paisagem

certamente interfere no dano causado ao ambiente Derrames de oacuteleo em plataformas

continentais teratildeo efeitos diferentes de outros na mesma proporccedilatildeo em aacuteguas

interiores Page et al (2005) estudando os impactos causados pelo derramamento de

35500 toneladas de oacuteleo cru no Alaska estimaram uma reduccedilatildeo de 25 ao ano da

8

concentraccedilatildeo de PAHacutes na biota residente Uma raacutepida resiliecircncia do ambiente

tambeacutem foi relatada para acidentes no Brasil como o ocorrido na Baia de Guanabara

no estado do Rio de Janeiro (Meniconi amp Garbado 2002) Na Amazocircnia em virtude

da dinacircmica de sua paisagem a dissipaccedilatildeo do oacuteleo na hipoacutetese de acidentes com

maiores magnitudes eacute dependente de paracircmetros como niacutevel da aacutegua quantidade de

sedimentos em suspensatildeo temperatura pH entre outros Estes paracircmetros

apresentam valores divergentes quando satildeo comparados os ecossistemas de aacuteguas

interiores e os representados por aacuteguas continentais A capacidade de recuperaccedilatildeo

em casos de derrame de oacuteleo certamente natildeo seria a mesma nos dois ambientes Os

rios de aacuteguas brancas satildeo caracterizados por uma grande quantidade de sedimentos

e satildeo rotas obrigatoacuterias das embarcaccedilotildees transportadoras de petroacuteleo para a refinaria

de Manaus (REMAN) As partiacuteculas de oacuteleo derramadas nessas aacuteguas formariam

coloacuteides com consequumlente aumento da densidade e maior eficiecircncia de deposiccedilatildeo no

substrato aleacutem da diluiccedilatildeo aumentada dos constituintes toacutexicos do petroacuteleo Se o

derramamento ocorrer em eacutepoca de cheia natildeo haveraacute dificuldades do oacuteleo chegar a

ambientes lecircnticos como as vaacuterzeas e igapoacutes reconhecidamente importantes

berccedilaacuterios e refuacutegios para uma ampla variedade de espeacutecies aquaacuteticas As aacutervores e

arbustos funcionariam como substratos que dificultariam qualquer estrateacutegia de

mitigaccedilatildeo dos efeitos dos compostos orgacircnicos no ambiente No caso dos rios de

aacutegua preta como o rio Negro os baixos valores de pH satildeo limitantes para

colonizaccedilatildeo de bacteacuterias decompositoras dos compostos petrogecircnicos aumentando

assim o tempo de permanecircncia destas substacircncias no ambiente (Duncan 1998) O

homem pode optar pelo uso de dispersantes em resposta ao derramamento de oacuteleo

Dispersantes satildeo substacircncias capazes de diminuir a tensatildeo superficial da aacutegua

formando micelas com o oacuteleo e provocando assim sua deposiccedilatildeo no substrato o que

9

aumenta a superfiacutecie de contato e facilita sua degradaccedilatildeo (Duarte 2005) Entretanto

o uso de dispersantes natildeo eacute uma alternativa consensual A exposiccedilatildeo dos organismos

aquaacuteticos a estes compostos pode induzir efeitos sineacutergicos com o oacuteleo e aumentar a

toxicidade no ambiente (George-Ares amp Clarck 2000) A viscosidade do oacuteleo tambeacutem

interfere no potencial toacutexico quando associada a dispersantes (Pollino amp Holdway

2002) Os PAHacutes apesar de serem extremamente volaacuteteis satildeo potencialmente mais

toacutexicos aos organismos aquaacuteticos quando na presenccedila de dispersantes quiacutemicos

como o Corexit 9500 (Ramachandran et al 2004) A quase totalidade dos estudos faz

inferecircncias aos ambientes continentais As implicaccedilotildees que pequenas e contiacutenuas

liberaccedilotildees de oacuteleo ou ateacute mesmo acidentes de maiores proporccedilotildees podem ocasionar

no ambiente amazocircnico ainda satildeo difiacuteceis de serem mensuradas Portanto estudos

sobre a influecircncia do petroacuteleo em ambientes de aacuteguas interiores e sobre os

organismos que ali vivem satildeo cada vez mais necessaacuterios para que se somem ao

conhecimento jaacute existente e possam contribuir com um cenaacuterio que auxiliaraacute na

mitigaccedilatildeo de impactos ambientais

14 - O tambaqui como um modelo biomarcador

Pertencente agrave Subfamiacutelia Serrasalminae (Teleostei Characiformes Characidae)

o Tambaqui Colossoma macropomun (Cuvier 1818) eacute um peixe de elevado

potencial econocircmico na regiatildeo amazocircnica com manejo relativamente faacutecil para

piscicultura Esta espeacutecie eacute endecircmica da bacia amazocircnica sendo comumente

distribuiacuteda nos rios principais da Bacia (Araujo-Lima amp Goulding 1998) Eacute

essencialmente filtrador na fase juvenil e frugiacutevoro quando adulto Pode atingir 1 m de

comprimento e pesar aproximadamente 30 kg em condiccedilotildees ideais O Tambaqui eacute um

peixe de carne magra com teor de gordura menor que 15 sendo que 04 satildeo de

10

gordura saturada Sua ampla aceitaccedilatildeo como fonte alimentar para a populaccedilatildeo

amazocircnida tem levado agrave sua sobrepesca No final da deacutecada de 70 este peixe

correspondia a 45 do peso total desembarcado no mercado municipal de Manaus

(Graef 1996) hoje o percentual natildeo ultrapassa 20 Atualmente a espeacutecie jaacute consta

na lista oficial de espeacutecies protegidas durante o defeso (IBAMA 2003) No estado de

Rondocircnia a pesca do Tambaqui esteve suspensa ateacute maio de 2006 agrave exceccedilatildeo dos

rios Guaporeacute e Mamoreacute com fins de recuperar os estoques naturais da espeacutecie

(MMA 2005) Associado a este fator o desmatamento para produccedilatildeo de pastagens

tem diminuiacutedo as aacutereas propiacutecias para reproduccedilatildeo e alimentaccedilatildeo da espeacutecie

(Marshall 1995) Estima-se que 10 milhotildees de hectares foram ou estatildeo sendo

devastados para produccedilatildeo de pastagens (Santos 2000) O Tambaqui eacute um peixe de

comportamento migratoacuterio deslocando-se anualmente para os rios de aacuteguas brancas

durante o periacuteodo das chuvas em busca do ambiente de vaacuterzea ideal para

reproduccedilatildeo devido agrave sua grande produtividade e disponibilidade de micro-haacutebitats que

se tornam aacutereas de refuacutegio (Lima amp Arauacutejo-Lima 2004) Apesar do seu potencial

reprodutivo podendo um peixe de 60 cm produzir cerca de 500 mil ovos a taxa de

mortalidade eacute elevada nos estaacutegios iniciais do seu ciclo de vida Por sua importacircncia

econocircmica pela atenccedilatildeo dada aos esforccedilos de conservaccedilatildeo destas espeacutecies

altamente explotadas e por seu potencial para o desenvolvimento da aquumlicultura o

Tambaqui tornou-se o peixe siacutembolo da Amazocircnia (Arauacutejo Lima amp Goulding 1998)

O Tambaqui assim como muitos outros peixes que se ajustaram para maximizar

as trocas gasosas nos ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo da bacia amazocircnica

apresenta modificaccedilotildees anatocircmicas e fisioloacutegicas importantes quando em condiccedilotildees

de hipoxia O tambaqui tem a capacidade de expandir o laacutebio inferior na tentativa de

captar a superfiacutecie da aacutegua comumente mais rica em oxigecircnio (Val amp AlmeidandashVal

11

1999 Porto 2005) Se a baixa oxigenaccedilatildeo da aacutegua for provocada por interferecircncia de

contaminaccedilatildeo por petroacuteleo o comportamento do Tambaqui de emergir iraacute provocar

um maior contato do indiviacuteduo com os componentes toacutexicos Duncan (1998) observou

que respostas induzidas pelo oacuteleo cru como mobilizaccedilatildeo do glicogecircnio eacute mais

significante em Tambaqui que ateacute mesmo em outras espeacutecies de respiraccedilatildeo aeacuterea

facultativa como Hoplosternum litoralle Na Amazocircnia o gecircnero Colossoma se

diferenciou precocemente entre os demais gecircneros da subfamiacutelia Serrasalminae (Ortiacute

et al 1996) As respostas fisioloacutegicas diferenciadas e um padratildeo gecircnico relativamente

homogecircneo aleacutem de sua ampla distribuiccedilatildeo ao longo de toda bacia amazocircnica

candidatam o Tambaqui como importante ferramenta para o biomonitoramento de

ambientes impactados por diferentes xenobioacuteticos Quanto ao petroacuteleo investigaccedilotildees

preacutevias jaacute diagnosticaram distuacuterbios no equiliacutebrio iocircnico efeitos citotoacutexicos e

genotoacutexicos em indiviacuteduos submetidos ao oacuteleo cru seus derivados ou substacircncias

inorgacircnicas provenientes da aacutegua de formaccedilatildeo (Duncan 1998 Oliveira 2003

Matsuo 2004 Duarte 2005) O desenvolvimento de marcadores moleculares que

possam diagnosticar concentraccedilotildees criacuteticas de compostos petrogecircnicos atraveacutes da

identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no padratildeo de bandeamento eacute uma alternativa sensiacutevel e

com potencial investigativo das estrateacutegias de desintoxicaccedilatildeo utilizadas pelos

organismos aquaacuteticos

15 - O potencial do DD RT- PCR (differential display reverse transcriptase ndash Polymerase Chain Reaction) como marcador molecular

A grande maioria dos organismos eucariotos possui aproximadamente

100000 genes diferentes No entanto apenas 15 deste valor satildeo expressos quando

focamos uma ceacutelula isoladamente (Liang amp Pardee1992) Os mecanismos de

12

regulaccedilatildeo da expressatildeo destes genes eacute que determinam a direccedilatildeo dos processos

vitais A biologia molecular tem haacute algumas deacutecadas dedicado uma especial atenccedilatildeo

aos estudos dos produtos transcritos como alternativa de elucidar mecanismos de

regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica em eucariotos (Liang amp Pardee 1995) Northern

blotting eacute um exemplo de teacutecnica amplamente difundida para a determinaccedilatildeo da

abundacircncia relativa de genes transcritos seus tamanhos e potenciais variaccedilotildees

(Larkin et al 2003) No entanto esta teacutecnica eacute eficiente apenas para um nuacutemero

limitado de genes natildeo sendo aplicada a todo transcriptoma Metodologias mais

recentes como Differential Display (DD RT-PCR) possuem a vantagem de cobrir todo

mRNA transcrito por meio de combinaccedilotildees de oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda

poliadenilada (Poli-A) e oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios capazes de se ligar a siacutetios

especiacuteficos no mRNA resultando em sequumlecircncias de alta resoluccedilatildeo do cDNA

amplificado Os fragmentos-alvos ideais satildeo representados por poucas centenas de

bases devem ser suficientemente longos para serem separados em fragmentos

uacutenicos de mRNA e ao mesmo tempo curtos o bastante para serem separados de

outros por tamanho Desenvolvida inicialmente por Liang e Pardee (1992) esta

teacutecnica possibilita criar relaccedilotildees entre os padrotildees bioquiacutemicos e fenocircmenos de

interferecircncia das condiccedilotildees convencionadas como normais para organismos tecidos

ou ceacutelulas O meacutetodo permite abordagens exploratoacuterias do efeito de diferentes

substacircncias ou condiccedilotildees de estresse em um ilimitado nuacutemero de espeacutecies Carginale

et al (2002) identificaram grupos de genes ativados numa espeacutecie de peixe da

Antaacutertida (Chionodraco hamatus) quando submetidos ao Cadmio um potencial

contaminante ambiental Xenobioacuteticos satildeo relatados como agentes causadores de

variaccedilotildees fisioloacutegicas em diversos animais Na Bacia Amazocircnica compostos

orgacircnicos como os derivados do petroacuteleo jaacute foram descritos como indutores de

13

mudanccedilas nos mecanismos fisioloacutegicos e de regulaccedilatildeo iocircnica (Brauner et al 1999

Duarte 2005) aleacutem de interferir nas estrateacutegias oxidativas dos compostos energeacuteticos

de reserva como o glicogecircnio (Duncan 1998) O meacutetodo de Differential Display pode

ser uma alternativa viaacutevel para esclarecer a correlaccedilatildeo entre a concentraccedilatildeo eou tipo

de moleacutecula residual com as estrateacutegias metaboacutelicas relacionadas agrave desintoxicaccedilatildeo

das populaccedilotildees expostas ao agente indutor

16 - Objetivos

161 - Objetivo Geral

O presente projeto tem como objetivo geral avaliar a eficiecircncia dos produtos

transcritos diferencialmente em mRNA (DD RT-PCR) como marcadores de exposiccedilatildeo

do Tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier 1818) ao petroacuteleo contribuindo para

a geraccedilatildeo de informaccedilotildees que possam ser descritas como estrateacutegias de

monitoramento ambiental ou que possam gerar propostas mitigadoras em casos de

acidentes ou aumento criacutetico da concentraccedilatildeo de petroacuteleo no dinacircmico ecossistema

da bacia amazocircnica

162 - Objetivos Especiacuteficos

a) Avaliar o potencial do Tambaqui como bioindicador da exposiccedilatildeo ao petroacuteleo nos

diferentes ambientes da bacia amazocircnica

b) Identificar ou corroborar mecanismos bioquiacutemicos envolvidos com a desintoxicaccedilatildeo

de peixes no ambiente amazocircnico

c) Relacionar o comportamento de respiraccedilatildeo na superfiacutecie aquaacutetica inerente a vaacuterias

espeacutecies de peixes da Amazocircnia com o potencial aumento da toxidade do petroacuteleo

14

d) Comparar a intensidade das respostas bioquiacutemicas de Tambaquis submetidos a

diferentes concentraccedilotildees de oacuteleo cru

17 - Justificativa

O uso de Differential Display como ferramenta para monitoramento da

contaminaccedilatildeo por xenobioacuteticos em ambientes aquaacuteticos tem sido relativamente

insipiente muito embora resultados preliminares envolvendo caacutedmio (Larkin et al

2003) e derivados do petroacuteleo (Peterson amp Bain 2004) atestem a sensibilidade do

meacutetodo em detectar modificaccedilotildees no padratildeo de expressatildeo gecircnica quando os

indiviacuteduos satildeo submetidos ao agente indutor de estresse Na Bacia Amazocircnica onde

a exploraccedilatildeo de petroacuteleo eacute uma realidade haacute algumas deacutecadas as consequumlecircncias de

acidentes capazes de provocar descargas de grandes quantidades de oacuteleo cru no

ambiente ainda natildeo podem ser totalmente mensuradas Os impactos que pequenos

vazamentos derivados da lavagem dos tanques das embarcaccedilotildees petroleiras

liberaccedilatildeo in natura de dejetos domeacutesticos aleacutem do oacuteleo dispensado pelos barcos

pesqueiros tambeacutem natildeo estatildeo totalmente compreendidos O Tambaqui tem sido

utilizado como eficiente biomarcador para paracircmetros histoloacutegicos fisioloacutegicos e

comportamentais quando submetido ao petroacuteleo (Matsuo 2004) e outros poluentes

(Porto 2005) No entanto poucas alternativas de respostas bioloacutegicas em niacutevel

molecular foram descritas O complexo do citocromo P450 (CYP 1A)

estrategicamente importante para o mecanismo de regulaccedilatildeo oxidativa nos

organismos superiores (Conney 1992 Aas et al 2000 Matsuo 2004) eacute ateacute o

momento o indicador com maior corroboraccedilatildeo para avaliaccedilotildees de condiccedilotildees de

estresse provocadas por petroacuteleo ou seus derivados A ativaccedilatildeo da CYP 1A eacute

15

dependente do AhR (Aryl hydrocarbon receptor) um receptor de membrana capaz de

se ligar aos PAHs e promover apoacutes alcanccedilar o nuacutecleo celular a ativaccedilatildeo de regiatildeo

promotora de expressatildeo da CYP 1 A (Hanh 1998) No entanto Shailaja e D`Silva

(2003) alertam para possiacuteveis resultados controversos quanto agrave competecircncia da CYP

1A como biomarcador em peixes expostos a xenobioacuteticos por assumir estrateacutegias

divergentes de induccedilatildeo conforme a espeacutecie sexo e estaacutegio reprodutivo o que ocorre

possivelmente em funccedilatildeo de variaccedilotildees na estrutura molecular do AhR Matsuo et al

(2006) alerta que na Bacia Amazocircnica a expressatildeo da CYP 1A pode ser

potencializada em rios ricos em aacutecidos huacutemicos e fluacutevicos pois os mesmos podem

conter PAHs de origem natildeo petrogecircnica Estes resultados indicam que nos ambientes

amazocircnicos o uso deste complexo como bioindicador de contaminaccedilatildeo pode gerar

resultados discutiacuteveis Deve-se ainda ressaltar que os danos provocados pelo

petroacuteleo natildeo estatildeo limitados aos seus efeitos oxidativos Distuacuterbios imunoloacutegicos

iocircnicos (Matsuo 2004) e reprodutivos (Larkin et al 2002) tambeacutem satildeo consequumlecircncias

da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo e outros xenobioacuteticos Neste contexto a padronizaccedilatildeo

de um protocolo para DD RT-PCR eacute uma ferramenta potencial na identificaccedilatildeo de

rotas bioquiacutemicas alternativas ou na contribuiccedilatildeo com novas informaccedilotildees para rotas

metaboacutelicas jaacute caracterizadas e envolvidas nos mecanismos de desintoxicaccedilatildeo e

adaptaccedilatildeo das espeacutecies expostas ao agente estressor Poucos satildeo os estudos

envolvendo DD RT-PCR em organismos aquaacuteticos submetidos a contaminantes

ambientais Para peixes tropicais a falta de dados eacute um problema ainda maior Na

bacia amazocircnica onde muitas espeacutecies de peixes de interesses ecoloacutegicos e

econocircmicos como o Tambaqui e o Matrinxatilde (Brycon amazonicus) desenvolveram

adaptaccedilotildees agrave condiccedilatildeo de hipoacutexia chegando ateacute a superfiacutecie da aacutegua para maximizar

as trocas gasosas o efeito do petroacuteleo pode ser potencializado no que tange agrave

16

toxicidade Numa situaccedilatildeo de exposiccedilatildeo aguda ao petroacuteleo estas espeacutecies

certamente estaratildeo mais predispostas a absorver compostos orgacircnicos altamente

toacutexicos como os PAHacutes O Tambaqui aleacutem de apresentar respiraccedilatildeo na superfiacutecie

aquaacutetica eacute uma espeacutecie presente em diferentes tipos de rios da bacia amazocircnica

podendo servir como alternativa de biomonitoramento em diversos ambientes com

diferentes proporccedilotildees de impacto Para o desenvolvimento de uma metodologia de

Differential Display que seja reveladora da contaminaccedilatildeo por petroacuteleo na bacia

amazocircnica o Tambaqui eacute a espeacutecie ideal e com melhores caracteriacutesticas para ser

utilizada como modelo investigativo

2 MATERIAIS E MEacuteTODOS

21 - Obtenccedilatildeo e manutenccedilatildeo dos juvenis de Tambaqui

Os animais provenientes de fazendas de piscicultura com meacutedia de peso da ordem

de 90 + 20 g foram transportados ao Laboratoacuterio de Ecofisiologia e Evoluccedilatildeo

Molecular (LEEM) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazocircnia (INPA) onde

foram mantidos em tanques de 1000 L sob aeraccedilatildeo constante e alimentados duas

vezes ao dia com raccedilatildeo comercial ad libitum A aclimataccedilatildeo laboratorial foi realizada

com base na aacutegua controle proveniente de poccedilos artesianos do INPA que foi sifonada

em 13 do volume dos tanques a cada dois dias ateacute o iniacutecio do experimento As 24h

que antecedem as baterias experimentais foram caracterizadas por suspensatildeo da

alimentaccedilatildeo

17

22 - Induccedilatildeo de estresse pelo petroacuteleo

221 - Procedimento experimental de exposiccedilatildeo

A fase experimental se deu por exposiccedilatildeo de grupos de 6 peixes (n=6) agraves

concentraccedilotildees de 2 (vv) e 10 (vv) de oacuteleo cru em cacircmaras individuais de 2L sob

aeraccedilatildeo constante Para cada tratamento diferentes indiviacuteduos foram mantidos por 3h

e 6h de exposiccedilatildeo e em seguida 24h de recuperaccedilatildeo O grupo controle foi composto

por peixes acondicionados apenas em aacutegua sob as mesmas condiccedilotildees de

temperatura e oxigenaccedilatildeo Para evitar pseudo-reacuteplica dois indiviacuteduos do controle

foram amostrados nos intervalos de 3 6 e 24 h Para avaliar os efeitos do aumento

da superfiacutecie de contato entre o Tambaqui e o oacuteleo cru condiccedilatildeo possiacutevel em

ambientes de baixa oxigenaccedilatildeo onde o peixe procura a fraccedilatildeo superficial mais rica

em oxigecircnio a qual tambeacutem conteacutem mais hidrocarbonetos mono e poliaromaacuteticos no

caso de acidentes por conter tanto a fraccedilatildeo insoluacutevel como a fraccedilatildeo soluacutevel em aacutegua

do petroacuteleo (do inglecircs Water-soluble fraction (WSF) Val amp Almeida-Val1999) todo

procedimento experimental foi repetido em condiccedilotildees de hipoacutexia

222 - Coleta e conservaccedilatildeo de tecido

Apoacutes o tempo de exposiccedilatildeo os peixes foram anestesiados com 025gL de

Benzocaiacutena para extraccedilatildeo do fiacutegado e um pequeno pedaccedilo de muacutesculo branco As

amostras de tecidos foram coletadas em tubos epperdorf imediatamente congeladas

em nitrogecircnio liacutequido e estocadas em freezer -80ordmC ateacute o momento da anaacutelise

18

23 - Expressatildeo gecircnica diferencial por DD RT-PCR

231 - Extraccedilatildeo das amostras de RNA total por Trizol

Um homogenado contendo aproximadamente 50 mg de cada amostra de tecido

hepaacutetico e muscular em 1 mL de Trizol foi transferido para tubos epperdorf de 2 mL e

centrifugado a 12000 x g por 5 minutos O sobrenadante foi transferido para

microtubos de 2 mL foi adicionado 300 microL de clorofoacutermio e colocado em um vortex

por 15s e em seguida centrifugado a 4000 x g por 15 min a 4o C Este procedimento

garante a separaccedilatildeo do material geneacutetico e proteacuteico em diferentes fases Uma

contendo DNA (abaixo) uma intermediaacuteria contendo lipiacutedeos e proteiacutenas e outra

contendo RNA (acima) Apoacutes a centrifugaccedilatildeo as amostras foram precipitadas em 500

microL de Isopropanol e centrifugadas a 12000 x g por mais 10 min a 4o C O

sobrenadante foi descartado apoacutes nova centrifugaccedilatildeo e o pellet lavado com 500 microL de

etanol absoluto resfriado a -20o C e novamente centrifugado a 9000 x g por 5 min

Para redissolver o RNA o etanol foi descartado e completamente separado por

incubaccedilatildeo a 55o C por 5 min com 50 microL de H2O + DEPC (Diethyl pyrocarbonate-

inibidor de RNase) A quantificaccedilatildeo do RNA total extraiacutedo foi feita por meio de leitura

da densidade oacuteptica (OD) em espectrofotocircmetro Shimatzu 2000 UVVIS usando A260

(x 40 x diluiccedilatildeo) conforme descrito por Denslow et al (2004)

232 - Siacutentese da fita complementar (cDNA)

Para polimerizaccedilatildeo da fita complementar de DNA (cDNA) foram utilizados 2 microL do

RNA total extraiacutedo na concentraccedilatildeo de 200 ngmicroL As reaccedilotildees de transcriccedilatildeo reversa

19

foram processadas em triplicatas a 4o C uma para cada 2 micro L oligo-dTM (tabela 1) na

concentraccedilatildeo de 02 microM onde M pode ser Adenina (A) Citosina (C) ou Guanina (G) O

RNA juntamente com o oligo-dTM foi incubado a 65o C durante 5 min e logo apoacutes

resfriado em gelo por 2 min A seguir 15 microL do mix contendo 4microL de soluccedilatildeo tampatildeo

(250 mM Tris-HCl pH 83 375 mM KCl 15 mM MgCl2) 2 microL de DTT 2 microL de dNTP 1

microlL de DNase e 6 microL de H2O RNase free aleacutem de 1 microL de M-MLV RT (Moloney

Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) foram adicionados perfazendo um

volume final de 20 microL As amostras controle foram caracterizadas por reaccedilotildees

contendo o mix e os oligonucleotiacutedeos sem a adiccedilatildeo do RNA total A fita

complementar foi sintetizada de acordo com os seguintes paracircmetros de temperatura

25o C por 10 min 42o C por 60 min e 70o C por 15 min (Adaptado de Medhurst et al

2000)

Oligonucleotiacutedeos acircncoras SequumlecircnciasH-T11A 5`_-AAGCTTTTTTTTTTA-3`H-T11C 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTC-3`H-T11G 5`_-AAGCTTTTTTTTTTTG-3`

Tabela 1 Oligonucleotiacutedeos e sequumlecircncias que foram utilizadas para siacutentese da fita complementar

(cDNA)

233 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios

Para amplificaccedilatildeo das amostras foram utilizados 2 microL do transcrito reverso obtido

apoacutes reaccedilatildeo com oligonucleotiacutedeos ancorados agrave cauda Poli(A) 2 microL de soluccedilatildeo

tampatildeo 10x (100 mM Tris-HCL pH 83 500 mM KCl) 875 microL de dH2O 12 microL MgCl2

16 microL de dNTP (25 microM) 02 microL de Taq polimerase Foi utilizada uma combinaccedilatildeo de

2 microL de cada oligonucleotiacutedeo arbitraacuterio (Tabela 2) com 2 microL do oligonucleotiacutedeo

20

ancora apropriado O volume final foi de 20 microL por amostra (Adaptado de Liang e

Pardee 1997) A reaccedilatildeo de PCR foi otimizada em 4 ciclos iniciais de 92o C por 15s

46oC por 30s 72oC por 2min E mais 25 ciclos de 92o C por 15s 60o C por 30s72o C

por 2min (Adaptado de Medhurst et al 2000)

Oligonucleotiacutedeos sequumlecircncias

Mob 1 5`_ GTTGCGATCC_ 3`

Mob 5 5 _AAGCTTGATTGCC_ 3

TK 5 _AAGCTTAGTAGGC_ 3

osteopontin 5 _AAGCTTAGAGGCA_ 3

Pai 2 5_AAGCTTGCACCAT_ 3

Tabela 2 ndash Oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios para amplificaccedilatildeo do transcrito reverso 234 ndashEletroforese em Gel de Agarose

Apoacutes amplificaccedilatildeo um mix contendo 2microL de tampatildeo de carreamento incubado a 80oC

30 min e 35 microl da amostra foi submetido agrave corrida eletroforeacutetica em gel desnaturante

de agarose a 25 (mv) previamente submetido agrave preacute-corrida por 30 min As bandas

amplificadas foram separadas durante 35 h a 60W por 1700V O gel obtido foi

envolvido por papel filme e aquecido a 80o C por 1h para secagem e em seguida

revelado

235 - Excisatildeo e reamplificaccedilatildeo das bandas candidatas

Apoacutes a revelaccedilatildeo o gel foi alinhado e as bandas de interesse foram delimitadas com

agulha esteacuteril para excisatildeo (~2 mm) e posteriormente rehidratadas por 20 minutos

em microtubos de 500 microL contendo 2 microL de H2O esteacuteril ateacute um volume final de 5 microL

Para reamplificaccedilatildeo das amostras uma nova reaccedilatildeo de PCR foi realizada com 4 microL

21

dos mesmos oligonucleotiacutedeos arbitraacuterios e ancoras anteriormente utilizados em cada

uma das amostras e 35 microL do mix (17 microL de H2O esteacuteril 4 microL de soluccedilatildeo tampatildeo 10x

12 microL de MgCl2 08 microL de Taq Polimerase) A reamplificaccedilatildeo eacute um procedimento

recomendado para garantir uma quantidade satisfatoacuteria do produto gerado A reaccedilatildeo

de PCR seguiraacute os seguintes paracircmetros 95o C por 5 min 30 ciclos de 94o C por 15s

60o C por 30s 72o C por 2min finalizando com 72o C por min com temperatura de

manutenccedilatildeo de 7o C A corrida eletroforeacutetica foi feita em gel de agarose 15 (mv)

com 15 microL do produto amplificado e 2 microL de tampatildeo de carreamento

236 ndash Clonagem dos produtos amplificados

Os fragmentos-alvo reamplificados foram clonados pelo vetor de clonagem p-GEM-T

easy vector (Promega) segundo o protocolo do fabricante e logo apoacutes foram

transferidos 50 ng do fragmento ligado para tubos contendo 200 microL Escherichia coli

competentes (DH5-alfa) atraveacutes de choque teacutermico agrave 42oC por 45s e imediata

transferecircncia ao gelo por 2 min A esta soluccedilatildeo foi transferidos 800 microL de meio LB

liacutequido e colocados a 37ordm C por 1 hora O microtubo contendo as ceacutelulas

transformadas foram centrifugados a 2000 x g por 4 minutos e o pellet foi transferido

para uma placa de Petri contendo LB soacutelido contendo 20 microL de IPTG (isopropyl

thiogalactoside) e 20 microL X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)

ambos da promega e conforme a indicaccedilatildeo da conscentraccedilao indicada pelo fabricante

sob agitaccedilatildeo de 150rpm agrave 37oC por pelo menos 10 horas O controle positivo foi feito

por cultivo de ceacutelulas submetidas a choque teacutermico contendo o vetor pUC18 e o

controle negativo natildeo continha DNA Para seleccedilatildeo das ceacutelulas transformadas foi

utilizado o meio LB soacutelido com 50microgmL de ampicilina As colocircnias que natildeo formaram

um precipitado com coloraccedilatildeo azul (portanto brancas) foram selecionadas e isoladas

22

em subculturas de meio LB com 50microgmL de ampicilina por 37ordm C por 10 horas ou

feito um estoque com glicerol e estocados em freezer -80o C

237 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo das bandas com expressatildeo diferencial confirmadas

Os DNAs plasmidiais foram extraiacutedos de 2 mL de meio LB liacutequido contendo o vetor de

interesse utilizando o Kit Wizard Plamidial extraction da Promega conforme

instruccedilotildees do fabricante

A anaacutelise de sequumlenciamento das bandas foi feita em um sequumlenciador automaacutetico

MEGA Bace

A anaacutelisepor bioinformaacutetica foi feita utilizando os softwares phredphrapconsed (linux)

para avaliar a qualidade das sequumlecircncias (phredgt15) e realizar o agrupamento das

sequumlecircncias Os contigs foram visualizados pelo softaware consed e os arquivos em

formatos FASTA fora transferidos para softaware BLAST 2 GO para anaacutelise por

BLAST n e X Paralelamente foi utilizado o mesmo software para anaacutelise da ontologia

por GO (gene ontology) bem como suas funccedilotildees e suas possiacuteveis rotas metaboacutelicas

(KEGG) incorporadas no pipeline do BLAST2GO

3 ndash RESULTADOS

31 - Amplificaccedilatildeo das amostras com oligonucleotiacutedeos aleatoacuterios e Eletroforese em Gel de Agarose

Neste trabalho foi avaliado o efeito do petroacuteleo nas concentraccedilotildees a) subletal

(12CL50) e b) o dobro da letal (2CL50) em intervalos de tempo de 3h 6h e

recuperaccedilatildeo de mais 6h totalizando 12h de experimento sob aeraccedilatildeo constante A

mesma matriz foi repetida em condiccedilatildeo de hipoacutexia onde os niacuteveis de oxigecircnio

dissolvido foram monitorados e mantidos no intervalo de 05 e 10 mg de O2 por litro

23

Para efeito de identificaccedilatildeo nos geacuteis de agarose das combinaccedilotildees entre os diferentes

tratamentos foi utilizada a nomenclatura conforme descrita na Tabela 3

COacuteDIGO DO

TRATAMENTO

IDENTIFICACcedilAtildeO DOS TRATAMENTOS

T0 Tempo zero de exposiccedilatildeoA Indiviacuteduos expostos a 2 x CL50 de oacuteleo cruB Indiviacuteduos expostos a frac12 x CL50 de oacuteleo cruC Condiccedilatildeo controle (sem exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru)D Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 3 horasE Tempo de exposiccedilatildeo equivalente a 6 horasF Intervalo de 12h apoacutes iniacutecio do experimento caracterizando 6h

de recuperaccedilatildeo para os indiviacuteduos expostos ao oacuteleo cruG Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de normoacutexiaH Indiviacuteduos em condiccedilatildeo de hipoacutexia

Tabela 3 Identificaccedilatildeo das condiccedilotildees experimentais Exceccedilatildeo feita ao tempo zero cada canaleta no

gel de agarose corresponde a uma combinaccedilatildeo de 3 ou 4 tratamentos

24

312 ndash Padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando o oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1

T0 ADG CDH CDG CEH CEG AFH CAFH CAFG

BDH BEH BFH ADG AEG BEG AFG BFG branco

Figs1 A e B padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 1 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA As bandas reprensatadas pelas setas 1 e 2 aparecem de forma mais intensa nos tratamentos com hipoacutexia (representados com uma letra H) Ambas continuam sendo expressas mesmo depois de um tempo de recuperaccedilatildeo equivalente ao dobro do tempo de exposiccedilatildeo A banda 3 estaacute parece ter uma associaccedilatildeo entre o maior tempo de exposiccedilatildeo ao oacuteleo cru e hipoacutexia jaacute que aparece nos tratamentos com hipoacutexia Neste gel a amplificaccedilatildeo da condiccedilatildeo AEH natildeo consta

25

500 pb

1A

1B

1

2

3

3312 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5

T0 CDH CDG ADH BDH BDG CEH CEG BEH AEH BEG

BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG

Figs 02 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda indicada no gel 2A aparece prefencialmente nas condiccedilotildees com tratamento seja com ou sem hipoacutexia

26

500 pb

2A

2B

T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH BEH

BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco

Figs 03 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Natildeo foi possiacutevel estabelecer uma correlaccedilatildeo entre bandas e tratamentos para estes geacuteis

27

500pb

3A

3B

T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG BEH


Figs 04 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Mob 5 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtC Nesta combinaccedilatildeo o padratildeo de banda indicado pela seta 1 estaacute nitidamente relacionado a uma condiccedilatildeo de normoacutexia independente do tratamento Na seta 2 existe uma tendecircncia a expressatildeo mais pronunciada nos tratamentos independente da concentraccedilatildeo e oxigecircnio dissolvido As duas condiccedilotildees permanecem na recuperaccedilatildeo

28

500 pb

4A

4B

12

3313 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin


AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco

Figura 05 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo osteopontin combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Nesta situaccedilatildeo existe um padratildeo de banda preferencialmente expressa na situaccedilatildeo mais extrema correspondente a 2xCL50 (A) duraccedilatildeo de 6h de induccedilatildeo (E) e condiccedilatildeo de hipoacutexia (H) Nas situaccedilotildees de recuperaccedilatildeo a mesma banda natildeo se manteacutem

29

500pb

500 pb

5A

5B

3314 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2


AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG

Fig 06 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA A seta indica uma banda que responde a condiccedilatildeo de estresse por oacuteleo cru indiferente da concentraccedilatildeo ou a condiccedilatildeo de hipoacutexia Ela permanece no momento de recuperaccedilatildeo indicando um periacuteodo de residecircncia de expressatildeo posterior ao estiacutemulo direto pelo agente estressor

30

500 pb

6A

6B

T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG AEH

AEH BEH AEG BEG CAFH CAFG AFH BFH AFG BFG branco

Figs 07 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo Pai 2 combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG A banda expressa nesta combinaccedilatildeo eacute exclusiva dos tratamentos independentemente da condiccedilatildeo de oxigecircnio dissolvido no entanto ela soacute permanece no periacuteodo de recuperaccedilatildeo nos tratamentos com 2xCL50

31

500 pb

7A

7B

3315 ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK

T0 CDH CDG ADH BDH ADG BDG CEH CEG

CEG BEH AEG BEG CAFH CAFG BFH BFH AFG BFG

Figs 08 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtA Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose

32

500 pb

8A

8B



Figs 09 A e B ndash padratildeo de amplificaccedilatildeo utilizando oligonucleotiacutedeo heteroacutelogo TK combinado com oligonucleotiacutedeo acircncora dtG Para os primers TK natildeo foi possiacutevel estabelecer um padratildeo de repetibilidade Possivelmente seja necessaacuterio otimizar o protocolo para este oligonucleotiacutedio uma vez que natildeo se estabeleceu um padratildeo de integridade das bandas apoacutes a corrida em eletroforese em gel de Agarose

33

500 pb

9A

9B

333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial Apoacutes a clonagem no vetor pGEM-T easy vector (Promega) e sequenciamento os

arquivos (ESD) foram transferidos para o pipeline de bioinformaacutetica conforme a

Figura abaixo

Figura 10 - Pipeline de bioinformaacutetica utilizado para anotar o sequenciamento dos fragmentos

diferencialmente expressos (1) os arquivos obtidos diretamente do sequenciador satildeo aplicados numa

sequumlecircncia de softwares de qualidade agrupamento e geraccedilatildeo de contigs (2) e em seguida os contigs

satildeo enviados para o programa BLAST2GO para busca de homologia e similaridade (3) Os resultados

satildeo automaticamente submetidos para anaacutelise por GO (gene ontology) por processo bioloacutegico (BP)

funccedilatildeo molecular (MF) e componente celular (CC) (4) Caso haja homologia ou similaridade com algum

processo metaboacutelico jaacute descrito o software envia como resultado a via (rota) metaboacutelica descrita para

determinada enzimas eou proteiacutena (5) Em seguida todos os resultados obtidos em (3) (4) e (5) satildeo

armazenados em (6) um banco de dados desenvolvido no Centro Universitaacuterio Nilton Lins que

compara todos os dados obtidos com aproximadamente 1 milhatildeo e 500 mil ESTs de peixes existentes

em outros bancos de dados da web

EST (NCBI)1500000

AnotaccedilatildeoMYSQL

(banco de dados da NL)

Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx

Mapa metaboacutelico

Files esd do sequenciador

PhredPhrapCAP3

Search Keywords GO gi etc

1

2

3

5

4

6

34

De 7 (sete) fragmentos clonados e sequumlenciados apenas 4 (quatro) apresentaram um

resultado na comparaccedilatildeo de sequumlecircncias em bancos de dados (BLAST) conforme

mostrado na tabela abaixoIdentidade de amplificaccedilatildeo

Oligo

dTX

13mers

Relaccedilatildeo com o banco de

EST(Blast X)

Homologia Paracircmetros de expressatildeo

Oxigecircnio

dissolvido

Concentraccedilatildeo

de petroacuteleo

Tempo de

exposiccedilatildeodTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC MOB5 GR 71 x - -

dTG OSTEO CFTR 75 x x x

dTG OSTEO ERK 67 x - -dTG OSTEO RAG2 100 - - -Tabela 03- Fragmentos de DDRT-PCR obtidos nas diferentes condiccedilotildees Os paracircmetros de expressatildeo

indicados com um (X) indica influecircncia no tratamento enquando (-) indica que a condiccedilatildeo em questatildeo

natildeo interferiu

De acordo com o padratildeo representado na tabela 3 percebe-se que nos 13merrsquos

MOB1 e Pai2 a correlaccedilatildeo foi positiva para o paracircmetro de expressatildeo equivalente a

oacuteleo cru em qualquer que seja a concentraccedilatildeo tambeacutem natildeo importando o tempo de

exposiccedilatildeo e o niacutevel de oxigecircnio dissolvido Estes iniciadores foram extremamente

coerentes com os tratamentos com petroacuteleo no entanto a comparaccedilatildeo com o banco

de dados natildeo resultou em sequumlecircncias conhecidas Seraacute necessaacuterio continuar os

esforccedilos para esclarecer quem satildeo estes produtos transcritos Para combinaccedilatildeo

Osteo + dTG foram identificadas 3 diferentes ESTrsquos A primeira eacute a CFTR ( do inglecircs

Cystis Fibrosis Transmembrane conductance regulator) no experimento ela eacute positiva

para todos os paracircmetros de expressatildeo ou seja expressa apenas em condiccedilatildeo de

maacuteximo estresse com 6 h de exposiccedilatildeo na maior concentraccedilatildeo e em condiccedilatildeo de

hipoacutexia A segunda eacute a ERK (mitogen-activated protein kinase) uma quinase que aqui

estaacute relacionada apenas com a condiccedilatildeo de hipoacutexia independente das concentraccedilotildees

de oacuteleo ou tempo A terceira eacute a RAG2 (recombination-activating genes) uma EST

tambeacutem conciliada com a condiccedilatildeo de hipoacutexia seja tratamento ou grupo controle Para

35

o Mob5 a homologia foi verificada com uma GR (Glutationa Redutase) responsaacutevel

por mecanismos de defesa de estresse oxidativo e em alguns casos com

mecanismos de desintoxicaccedilatildeo Aqui ela aparece coincidindo com tratamentos ou

controles em hipoacutexia A seguir eacute apresentado um resumo dos resultados por buscas

de similaridade dos primeiros quatros fragmentos obtidos

1) RAG2 O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de homologia Tamanho do fragmento

alinhado

e-value

gb|AAY790901| [Colossoma macrop 438 9e-122

gb|AAY790751| 20 [Brycon sp 430 3e-119gb|AAY791341| Mylesinus schomb 429 7e-119

gb|AAY790641| Mylesinus sp 426 4e-118

gb|AAY791411| Piaractus bra 425 1e-117

gb|AAY791291| Mylossoma duriv e 424 1e-117

gb|AAY791481| Pygocentrus natt 422 9e-117

gb|AAY791131| Hemiodus gracili 421 2e-116

gb|AAY791171| Hydrolycus pecto 419 6e-116

gb|AAY791521| Serrasalmus sp 417 2e-115

gb|AAY791251| Leporinus striat 414 1e-114

gb|AAY791391| Parodon sp AMNH 412 7e-114

gb|AAY790811| Characidium purp 412 9e-114

Tabela 4 Valores de Blast X para RAG2

BLASTX

gb|AAY790901| recombination activating gene 2 [Colossoma macropomum]

Length Score bits Expect 410 438 1127 9e-122

Identities = 209209 (100) Positives = 209209 (100) Gaps = 0209 (0) Frame = +2 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181

ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR

36

118 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 177

182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361

PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT


362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541

YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV


542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628

SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE


gb|AAY790751| recombination activating gene 2 [Brycon sp DC-2004]

Length Score bits Expect430 430 1105 3e-119 Identities = 204209 (97) Positives = 207209 (99) Gaps = 0209 (0)


ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR

116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175


PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT

176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235


Y+TLDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV

236 YVTLDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295


SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE

296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324

gb|AAY791341| recombination activating gene 2 [Mylesinus schomburgkii]





37





Y+ LDDVGI MEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV

235 YVALDDVGIRMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 294




gb|AAY790641| recombination activating gene 2 [Mylesinus sp DC-2004]

Length Score bits Expect408 426 1096 4e-118

Identities = 202209 (96) Positives = 206209 (98) Gaps = 0209 (0) 2 ENWNTVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 181 ENWN+VVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 116 ENWNSVVDCPPQVYLIDLEFGCCSAHTLPELTDGQSFHVALAREDCVYFLGGHILSTDCR 175

182 PARLFRLRVELLLGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 361 PARLFRLRVELL+GSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 176 PARLFRLRVELLIGSPVLSCDMFNDGLSITSAIATPVGPAHEYIILGGYQSDSQKRMQCT 235

362 YITLDDVGIHMEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 541 Y+ LDDVGI +EPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 236 YVALDDVGIRVEPREPPQWSSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 295

542 SFQQEEDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 628 SFQQE DAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 296 SFQQEGDAEDPTQTCSQESTDFEDSAPLE 324

gb|AAY791471| recombination activating gene 2 [Piaractus mesopotamicus]

Length Score bits Expect 410 425 1092 1e-117 Identities = 202209 (96) Positives = 204209 (97) Gaps = 0209 (0)




38





Y+ LDDVGI MEPREPPQW SEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV

238 YVALDDVGIRMEPREPPQWGSEISQSRTWFGGSLEKGSALIAIPSEGNPAPPDAYYFYQV 297


SFQQE DAEDPTQ CSQESTDFEDSAPLE

298 SFQQEGDAEDPTQMCSQESTDFEDSAPLE 326

39

Gene Ontology (GO) processo bioloacutegico

Conforme mostrado na figura e no graacutefico abaixo a anotaccedilatildeo gecircnica mostrando a

funccedilatildeo do gene RAG2 em processo bioloacutegico na recombinaccedilatildeo do complexo VDJ eacute

complexa

40

V(D)J recombinationGO 0033151

Somatic Diversification of immune receptors via germline recombination within a single locus GO 0002562

Somatic cell DNA recombinationGO 00016444

DNA recombinationGO 0006310

Somatic diversification of immune receptors

GO 0002200

DNA metabolic processGO 0006259

Immune system development GO 0002520

Nucleo base nucleoside nucleotide and nucleic acid metabolic process

GO0006739

Biopolymer Metabolic processes GO

00043283

System developmentGO 0048731

Immune System process

GO 0002376

Cellular metabolic process

GO 0044237

Primary metabolic Process

GO 0044238

Macromolecule metabolic process

GO 0043170

Anatomical Structure DevelopmentGO 0048856

Multicellular organismal development GO 0007275

Cellular ProcessGO 0009987

Metabolic ProcessGO 0008152

Developmental ProcessGO 0032502

Multicellular organismal process

GO 0032501

Biological ProcessGO 0008150

allall

Mapa Metaboacutelico natildeo haacute disponiacutevel

2) ERK O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados

Blastx

dbj|BAD238431| extracellular signal regulated protein kinase 2 [Cyprinus carpio]


Identities = 6695 (69) Positives = 6895 (71)

65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244 P SGAE+VR F P EGAYGMV SAYKRD K+ISPFEHQTYCQ16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYTNLSYIGEGAYGMVCSAYKRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75

245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349 RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110

gb|AAY578051| extracellular signal-regulated kinase 2 [Danio rerio]

Length Score bits Expect(2) 369 120 302 9e-32


65 PDSGAEIVRASGFRRRPALHQPLVHREGAYGMVFSAYKRDPSACGDKEISPFEHQTYCQ 244

P SGAE+VR F P EGAYGMV SAY RD K+ISPFEHQTYCQ

16 PGSGAEMVRGQAFDVGPRYSNLSYIGEGAYGMVCSAYDRDNKVRVAIKKISPFEHQTYCQ 75

245 RTLREINFLLRFKHELIIGINDIIRTPTIDQMKDV 349

RTLREI LLRFKHE IIGINDIIRTPTIDQMKDV

76 RTLREIKILLRFKHENIIGINDIIRTPTIDQMKDV 110

41

Gene ontology processo bioloacutegico Envolvido na fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas

42

Mapa metaboacutelico natildeo identificado

3) GR Glutationa redutase O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os

seguintes resultados

BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value

ref|NP_0010183901| Danio rerio 118 1e-25

emb|CAG083131| Tetraodon

nigroviridis

101 2e-20

gb|EAW634421| Homo sapiens 994 6e-20

ref|NP_0006282| Homo sapiens 994 6e-20

Tabela 5 Valores de Blast X para GR

ref|NP_0010183901| hypothetical protein LOC553575 [Danio rerio]

Length Score Bits Expect 425 118 296 1e-25

Identities = 6370 (90) Positives = 6470 (91) Gaps = 070 (0)

23 MTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNT 202

M SGSVSRF+ LV GGGSG LA ARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPK VMWNT

1 MASGSVSRFDFLVVGGGSGGLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKKVMWNT 60

203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62

emb|CAG083131| unnamed protein product [Tetraodon nigroviridis]

Length Score bits Expect 473 101 251 2e-20 Identities = 5170 (72) Positives = 6070 (85) Gaps = 070 (0) 26 TSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVMWNTS 205

+S + +RF+ LV GGGSG LA ARRA+ELGA+ AVIESH+LGGTCVNVGCVPK VMWN +

6 SSTTTTRFDFLVIGGGSGGLAGARRASELGASAAVIESHKLGGTCVNVGCVPKKVMWNAA 65

43

206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75

gb|EAW634421| glutathione reductase isoform CRA_a [Homo sapiens]


14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193 G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM 54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113

194 WNTSTHAEYLHDHA 235 WNT+ H+E++HDHA 114 WNTAVHSEFMHDHA 127

ref|XP_5196962| PREDICTED glutathione reductase isoform 2 [Pan troglodytes]



14 GRSMTSGSVSRFEILVFGGGSGPLAGARRAAELGATTAVIESHRLGGTCVNVGCVPKLVM 193

G +G+V+ ++ LV GGGSG LA ARRAAELGA AV+ESH+LGGTCVNVGCVPK VM

54 GPPPAAGAVASYDYLVIGGGSGGLASARRAAELGARAAVVESHKLGGTCVNVGCVPKKVM 113

194 WNTSTHAEYLHDHA 235

WNT+ H+E++HDHA

114 WNTAVHSEFMHDHA 127

Gene ontology GO 0006749 ndash processo bioloacutegico

44

45


46

4) CFTR O fragmento foi submetido ao pipeline e foram obtidos os seguintes resultados

BlastX

ref|NP_0010253251| ATP-binding cassette sub-family C (CFTRMRP)

Length Score bits Expect 1558 179 454 5e-44 Identities = 8893 (94) Positives = 8993 (95) Gaps = 093 (0) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180

RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+++AMRALTN

203 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNPLIIGAHKRPIELKKIGKLPIAMRALTN 262

181 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWISMYRAFG 279

YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIW SMYRAFG

263 YLRLKDSYEEQRQNTEDPEKSPSIWKSMYRAFG 295

dbj|BAE794771| sulfonylurea receptor subunit 2 [Danio rerio]Length Score bits Expect1409 179 454 5e-44


1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180

RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MNPLIIGAHKRP EL KIGKLP+AMRALTN





ref|XP_6012023| PREDICTED similar to ATP-binding cassette sub-family C member


Identities = 6994 (73) Positives = 8394 (88) Gaps = 194 (1) 1 RVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWSMNPLIIGAHKRPNELKIGKLPMAMRALTN 180

+VKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYW MN LII AHK+P ++L IGKLP+AMRA+TN

10 KVKPPEDLQDLGVRFLQPFVNLLSKATYWWMNTLIISAHKKPIDLKAIGKLPIAMRAVTN 69

47

181 YLRLKDSYEEQRQN-TEDPEKSPSIWISMYRAFG 279

Y+ LKD+YEEQ++ +DP ++PSIW++MYRAFG

70 YVCLKDAYEEQKKKVADDPNRTPSIWLAMYRAFG 103

Gene Ontology funccedilatildeo molecular

48

Gene ontology processo bioloacutegico

49

50

4 DISCUSSAtildeO

Modelos matemaacuteticos propostos por Yang amp Liang (2004) sugerem que em trabalhos

baseados na teacutecnica de DD RT-PCR a cobertura gecircnica pode atingir 96 de todo

transcrito quando utilizados conjuntos de 160 iniciadores arbitraacuterios com 13 bases

(13mers) onde 7 dessas sequumlecircncias satildeo sempre conservadas Diversos 13mers jaacute se

mostraram eficientes na identificaccedilatildeo de genes diferencialmente expressos podendo

ser adquiridos na forma de mix Alguns 13mers satildeo descritos como eficientes para

investigaccedilatildeo de processo de modulaccedilatildeo proteacuteica fosforilaccedilatildeo alcalina e accedilatildeo de

quinases (De Vries et al 2000 Zangh et al 2000) Todos estes processos satildeo

comuns em eventos de estresse oxidativo como os sofridos pela accedilatildeo do petroacuteleo

(Duncan 1998 Matsuo 2004)

A quase totalidade dos trabalhos publicados com DD RT-PCR utiliza geacuteis de SDS ndash

PAGE marcados com P ou S radioativos No entanto apesar de garantir maior

sensibilidade esta teacutecnica tem a desvantagem de ser laboriosa e requerer matildeo-de-

obra treinada e espaccedilo fiacutesico protegido de escape radioativo Liang amp Pardee (1997)

relatam tentativas de sucesso com outros corantes como Nitrato de prata ou Brometo

de etidium muito embora reconheccedilam a possiacutevel perda de resoluccedilatildeo da

documentaccedilatildeo do produto amplificado Aqui utilizamos Brometo de etidium em gel de

agarose a 25 Todos os 13mers utilizados (Tabela 2) possuem de acordo com a

proporccedilatildeo purinapirimidina uma temperatura de anelamento oacutetima proacutexima a 370 C

no entanto as estrateacutegias de PCR devem ser otimizadas para maximizar a impressatildeo

em gel do padratildeo de bandeamento Os 13mers utilizados quando avaliados quanto a

sua proporccedilatildeo GC x AT apresentam temperatura de extringecircncia oacutetima em torno de

37 0C Empiricamente uma estrateacutegia de ldquoPCR touchdownrdquo onde ciclos curtos a

temperaturas mais elevadas que gradativamente tornam-se menores ateacute atingir o

ponto de anelamento oacutetimo parece ter uma eficiecircncia melhor que uma amplificaccedilatildeo

contiacutenua a 370C Oligonucleotiacutedeos heteroacutelogos apresentam uma elevada

variabilidade no seu padratildeo de bandeamento (Ferreira amp Grattapaglia 1998) Altas

temperaturas restringem os alvos por aumentar a especificidade com os siacutetios de

ligaccedilotildees facilitando a seleccedilatildeo dos mesmos nos proacuteximos ciclos e assim diminuindo

a possibilidade de resultados natildeo repetitivos

51

Normalmente mais da metade dos genes isolados em geacuteis de ddPCR natildeo pode ser

identificada porque natildeo constitui sequumlecircncias encontradas no Gene Bank ou natildeo

apresentam funccedilatildeo conhecida (Picard amp Schulte 2004 Liang amp Pardee 1997) No

presente trabalho bandas relacionadas com a exposiccedilatildeo ao petroacuteleo natildeo

apresentaram identidade com sequumlecircncias depositadas no banco de ESTrsquos Este

resultado eacute tiacutepico de levantamentos de sequumlecircncias expressas numa grande variedade

de organismos (Oduru et al 2003 Lo et al 2003) Outra limitaccedilatildeo da metodologia de

ddPCR eacute a variaccedilatildeo que ocorre entre diferentes indiviacuteduos ou seja diferentes

animais natildeo respondem de maneira homogecircnea ao mesmo protocolo experimental

Por isso eacute tatildeo importante que se faccedilam as confirmaccedilotildees de expressatildeo gecircnica em

tempo real (real time RT-PCR) (Picard amp Schulte 2004) No presente trabalho foram

analisados seis indiviacuteduos em cada situaccedilatildeo e houve pequena variaccedilatildeo No entanto

natildeo foi possiacutevel validar as expressotildees dos genes identificados com a teacutecnica de RT-

PCR em tempo real em funccedilatildeo das restriccedilotildees de equipamento e de prazos Esta eacute

uma das perspectivas de continuidade de nossas investigaccedilotildees sobre os genes

expressos nesta espeacutecie apoacutes exposiccedilatildeo ao petroacuteleo e hipoxia

Muitos dos trabalhos realizados com a teacutecnica de Differential display (dd PCR) tecircm

sido realizados com a aplicaccedilatildeo de primers arbitraacuterios juntamente com primers de

genes reconhecidamente responsivos agraves situaccedilotildees testadas Aqui nenhum gene em

especiacutefico foi estudado uma vez que nossa investigaccedilatildeo teve como meta descobrir

novos genes marcadores para peixes expostos ao petroacuteleo Apesar de ainda natildeo

termos identificado as sequumlecircncias de todos os genes expressos em nossos

experimentos a sequumlecircncia de alguns dos genes demonstrou similaridade com genes

importantes para o metabolismo celular frente agrave exposiccedilatildeo ao petroacuteleo

A espeacutecie Colossoma macropomum eacute uma das espeacutecies mais ruacutesticas dos peixes da

Amazocircnia em particular da famiacutelia Characidae Eacute uma espeacutecie tolerante a pHs

aacutecidos a extremos de temperatura bem como a oscilaccedilotildees no teor de oxigecircnio da

aacutegua Tem adaptaccedilotildees a situaccedilotildees hipoacutexicas no ambiente apresentando o habito de

procurar a superfiacutecie da coluna drsquoaacutegua camada mais rica em oxigecircnio Tal adaptaccedilatildeo

eacute uma desvantagem num possiacutevel contato com o oacuteleo derramado em acidentes

52

A anotaccedilatildeo e categorizaccedilatildeo de sequumlecircncias de tambaquis expostos a petroacuteleo

identificadas nas bibliotecas de cDNArsquos expressos diferencialmente por DD RT-PCR

elucidaram homoacutelogos de ESTacutes jaacute depositadas em bancos de sequumlecircncias Dos sete

clones sequumlenciados quatro satildeo relatadas como indicadores de estresse a

contaminantes ambientais sobretudo metais pesados e uma estaacute associada a

mecanismos de reparo e rearranjo do sistema imune

Os RAGacutes (recombination activating genes) satildeo importantes moduladores do

desenvolvimento de linfoacutecitos B e T (Galaktionov 2004) Contudo a exposiccedilatildeo a

tratamentos pode perturbar o mecanismo de expressatildeo desses genes e desencadear

processos oncoacuteticos especialmente por translocaccedilatildeo de regiotildees reguladoras dos

receptores de antiacutegenos Superexpressatildeo de RAG-2 tem sido associada a respostas

por tratamentos e desenvolvimento de quadros canceriacutegenos do sistema imune em

humanos (Haines et al 2006 Wang et al 2007) RAG-2 assim como seu gene

homoacutelogo RAG-1 satildeo ativados em fibroblastos imaturos Funcionam de forma

independente sendo o RAG-2 mais conservado e diretamente relacionado com o

mecanismo de induccedilatildeo de V(D)J recombination O produto transcrito destes genes

satildeo geralmente incomuns estando sua importacircncia bem focada no mecanismo de

rearranjo do DNA (Oettinger et al 1990 Jankovic 2004) O gene RAG-2 possui um

homoacutelogo em camundongo O gene rag-2 expressa uma proteiacutena que catalisa a

formaccedilatildeo do complexo VDJ importante para o sistema imunoloacutegico A ausecircncia da

expressatildeo deste gene pode ser explicada por Takeda et al (2001) que demonstrou

que camundongos mutantes para o gene rag-2 podem sofrer de linfopenia celular dos

linfoacutecitos B eT aleacutem do bloqueio na maturaccedilatildeo de ceacutelulas B e T em fases precoces

provocando um profundo deacuteficit funcional do sistema imunoloacutegico Assim podemos

explicar porque este fragmento expressa somente nos peixes controle A ausecircncia de

oxigecircnio faz que com este gene seja reprimido e o promotor fique ldquocegordquo para a

expressatildeo normal do gene rag-2 A falta da conversatildeo transcricional de rag-2 por

hipoacutexia para a proteiacutena RAG-2 responsaacutevel pela maturaccedilatildeo dos linfoacutecitos B e T

conferem aos tambaquis expostos a hipoacutexia (qualquer tempo e tratamento) uma

situaccedilatildeo de deficiecircncia do sistema imunoloacutegico o que pode lhe causar severos danos

com relaccedilatildeo ao processamento metaboacutelico devido a hepatomegalia

53

Erk (mitogen-activated protein kinase) satildeo enzimas que fazem parte de um complexo

mecanismo em cascata responsaacutevel por ativar respostas de transcriccedilatildeo e divisatildeo

celular Satildeo ativadoras de uma seacuterie de quinases em ceacutelulas do sistema imunoloacutegico

e tecido epitelial de diferentes oacutergatildeos (Leal et al 2006) Funcionam basicamente em

mecanismo de feedback junto com as Ragacutes sendo dependentes de GTP e de

eventos de defosforilaccedilatildeo de glicoproteiacutenas de membrana Sua ativaccedilatildeo inibe o

processo de apoptose celular podendo levar a processos de induccedilatildeo tumoral

metaacutestica Rag e Erk funcionam por feedback negativo entre si As proteiacutenas

transcritas a partir deste gene satildeo altamente conservadas (Leal et al 2006) no caso

de uma confirmaccedilatildeo destas bandas como modelo biomarcador de contaminaccedilatildeo

ambiental esta caracteriacutestica eacute importante uma vez que se pode universalizaacute-la para

outros organismos O padratildeo de expressatildeo do gene Erk jaacute foi associado com

respostas agrave contaminaccedilatildeo por chumbo No entanto para o modelo de experimento

montado neste trabalho natildeo foi identificada nenhuma correlaccedilatildeo entre o gene Erk e as

concentraccedilotildees de petroacuteleo ficando sua expressatildeo restrita aos tratamentos com

hipoacutexia independente de serem indiviacuteduos controle ou introduzidos ao oacuteleo Gracey

et al (2001) explicaram a expressatildeo do gene Erk apoacutes um estresse severo por

hipoxia pela induccedilatildeo da ativaccedilatildeo de MAP kinase-1 que controla a expressatildeo de Erk

Para glutathione reductase (GR) o aumento no niacutevel de expressatildeo sugere que seu

mecanismo de accedilatildeo estaacute intimamente relacionado agrave estrateacutegia de regulaccedilatildeo

oxidativa (revisado por Anderson 1998) Alguns xenobioacuteticos inibem a assimililaccedilatildeo

de CO2 no processo respiratoacuterio ou fotossinteacutetico de plantas Plantas transformadas

expostas a herbicidas apresentam expressatildeo variaacutevel da enzima superoacutexido

dismutase (SOD) reconhecidamente uma indicadora de estresse oxidativo No

entanto a expressatildeo gecircnica de GR nos cloroplastos mostra-se mais conservada

quando comparada com organismos natildeo transformados (Foyer et al 1995) Eacute

importante observar que o aumento da expressatildeo natildeo estaacute necessariamente

associado ao aumento da proteiacutena no organismo No caso da exposiccedilatildeo de peixes a

hipoacutexia e ao petroacuteleo o aumento na atividade de enzimas do processo antioxidante

da ceacutelula eacute relacionado com o periacuteodo de recuperaccedilatildeo celular (quando o oxigecircnio

volta a estar presente em altas quantidades) e processos de eliminaccedilatildeo dos radicais

livres A GR eacute ativada como mecanismo de defesa na formaccedilatildeo dos radicais livres

principalmente os peroacutexidos de elevado poder oxidante que satildeo formados em

54

condiccedilatildeo de estresse (revisado por Anderson 1998) Jaacute foi observado que os

produtos secundaacuterios formados atraveacutes da accedilatildeo das enzimas moduladas pelo gene

GR possuem uma afinidade por metais O aumento de iacuteons metaacutelicos no meio pode

ter sua porta de entrada atraveacutes do sistema oxidativo A SOD GST e GR satildeo

exemplos de alternativas de biomonitoramento do ambiente em casos de

contaminaccedilatildeo por metais pesados (Hansen et al 2007) e defensivos quiacutemicos

cuacutepricos (Kavitha amp Rao 2007) Na presenccedila destes xenobioacuteticos ocorre a inibiccedilatildeo

de uma enzima neurotransmissora a colinesterase O mecanismo de feedback

negativo entre a colinesterase e as enzimas do sistema oxidativo eacute a explicaccedilatildeo para

a superexpressatildeo de GR (Leggatt et al 2007A) A accedilatildeo da GR eacute especiacutefica de cada

tecido sendo mais facilmente quantificada nas bracircnquias Eacute interessante o sequumlestro

deste gene expresso diferencialmente no fiacutegado muito embora natildeo tenha existido

nenhuma correlaccedilatildeo entre GR e os tratamentos com petroacuteleo estando expresso

apenas nas condiccedilotildees de pouca oxigenaccedilatildeo Na verdade este natildeo eacute um marcador

claacutessico para outros contaminantes diferentes dos metais A identificaccedilatildeo da GR

associada a hipoacutexia e temperatura mostra uma coerecircncia com a literatura (Leggatt et

al2007B) Possivelmente uma estrateacutegia de quantificaccedilatildeo por Real-Time PCR seraacute

uacutetil para identificar a sensibilidade do fiacutegado para expressatildeo da GR Este seria um

passo importante tomando como verdade a maior facilidade de se trabalhar com

fiacutegado para quantificaccedilatildeo de proteiacutenas de interesse

O gene CFTR faz parte de uma famiacutelia de transportadores ABC do tipo C (ABCC)

CFTRrsquos satildeo responsaacuteveis pela traduccedilatildeo de proteiacutenas reguladoras de canais de

cloreto A expressatildeo diferenciada deste gene em Tambaquis eacute um fato diferenciado A

literatura aponta para uma super-expressatildeo de CFTR em condiccedilotildees extremas de

salinidade (Cutler amp Cramb 2001) e no caso de peixes estaacute associada a espeacutecies

eurialinas (Deane amp Woo 2004 Marshall et al 2002) Peixes de aacuteguas interiores natildeo

satildeo descritos como capazes de usar de maneira igualmente eficiente aos marinhos

estas proteiacutenas de membrana para manter seu equiliacutebrio iocircnico A princiacutepio poderia

parecer um contra-senso um peixe como Tambaqui ser dotado de capacidade para

usar tal estrateacutegia em situaccedilatildeo de estresse no entanto trata-se de uma espeacutecie

migratoacuteria da Bacia Amazocircnica onde as diferenccedilas fiacutesico-quiacutemicas entre as aacuteguas de

seus rios satildeo consideraacuteveis Natildeo satildeo poucos os exemplos de adaptaccedilotildees fisioloacutegicas

das espeacutecies amazocircnicas que contribuiacuteram para sobrevivecircncia nestes ambientes com

55

baixa oxigenaccedilatildeo e grandes divergecircncias de temperatura e pH Estas adaptaccedilotildees

satildeo especialmente importantes para espeacutecies migratoacuterias como o Tambaqui muito

embora ateacute o momento natildeo tenha sido descrita nenhuma estrateacutegia de compensaccedilatildeo

osmoacutetica desta espeacutecie por ativaccedilatildeo de CFTR Neste trabalho este gene soacute

expressou em condiccedilatildeo maacutexima de estresse com 6h de exposiccedilatildeo em hipoacutexia e o

dobro da concentraccedilatildeo letal do oacuteleo cru Percebe-se ainda que a condiccedilatildeo permanece

nos indiviacuteduos submetidos a recuperaccedilatildeo Este dado estaacute de acordo com Scott amp

Schult (2005) que caracterizam as proteiacutenas das CFTRrsquos como de permanecircncia

prolongada mesmo apoacutes finda a condiccedilatildeo de estresse Esta caracteriacutestica

possivelmente qualifique este transcrito como um biomarcador ambiental importante

Uma confirmaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo por PCR em tempo real podem nos dar novos

dados a respeito do potencial deste gene para estrateacutegias de monitoramento Outra

caracteriacutestica que o qualifica eacute que diferentemente dos transcritos de ATPase (das

bombas de Soacutedio e Potaacutessio) estas proteiacutenas parecem natildeo ter relaccedilatildeo com niacuteveis de

hormocircnios mineralo-corticoacuteides que poderiam mascarar o diagnoacutestico uma vez que

alguns xenobioacuteticos mimetizam hormocircnios (Scott et al 2005 Singer et al 2007)

Parece que ateacute entatildeo os trabalhos apontam para uma relaccedilatildeo exclusiva das CFTRrsquos

com a salinidade Natildeo foram encontrados relatos de expressatildeo diferenciada deste

gene em respostas a contaminantes ambientais O fato da expressatildeo estar neste

trabalho associada com uma condiccedilatildeo de hipoacutexia encontra precedente uma vez que

eacute sabido que peixes eurialinos apresentam em seu tecido branquial uma grande

quantidade de mitococircndrias associadas a super-expressatildeo das CFTR (Marshall et al

2002)

4 ndash CONCLUSAtildeO

A estrateacutegia de DD RT-PCR demonstrou ser oportuna para obtenccedilatildeo de genes

induzidos em resposta ao petroacuteleo e hipoacutexia Parece natildeo haver efeito sineacutergico entre

as duas condiccedilotildees A avaliaccedilatildeo via induccedilatildeo demonstra que mecanismos fisioloacutegicos

de peixes caracteriacutesticos da bacia amazocircnica funcionam como biomarcadores de

contaminaccedilatildeo por petroacuteleo gerando alternativas aos modelos atuais baseados em

organismos exoacuteticos ao territoacuterio brasileiro O tempo de exposiccedilatildeo e a concentraccedilatildeo

satildeo fatores criacuteticos na expressatildeo de genes sensiacuteveis aos estresses por xenobioacuteticos e

hipoacutexia

56

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69

Manaus _ AM


Bolsista FAPEAM

Manaus - AM






16 - Objetivos



17 - Justificativa








Sequumlecircncias


234 ndashEletroforese em Gel de Agarose




3 ndash RESULTADOS


333 - Sequumlenciamento e comparaccedilatildeo dos fragmentos obtidos por expressatildeo diferencial







Co-orientador Seacutergio Ricardo Nosawa Dr

Fonte financiadora Projeto Piatam III (FINEPPetrobras) FAPEAM PRONEX

(CNPq-FAPEAM)







aacuterea de concentraccedilatildeo em geneacutetica

conservaccedilatildeo e Biologia Evolutiva

Bolsista FAPEAM

Manaus - AM

2007



ii







iii

Agradecimentos











conclusatildeo










iv







do INPA


inabalaacutevel







v





xi - 66p





vi

RESUMO




























1

ABSTRACT

























2

IacuteNDICE











3
























4


2004)






















5























6


























7


























8


























9

























10


























11
























12


























13







16 - Objetivos
















14



17 - Justificativa





















15


























16





















17





















18






















19












2000)



(cDNA)







20

















revelado






21

























22








MEGA Bace








3 ndash RESULTADOS







23



COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






24





25

500 pb

1A

1B

1

2

3





26

500 pb

2A

2B




27

500pb

3A

3B




28

500 pb

4A

4B

12





29

500pb

500 pb

5A

5B





30

500 pb

6A

6B




31

500 pb

7A

7B





32

500 pb

8A

8B




33

500 pb

9A

9B



Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

3

5

4

6

34




Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















35







Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





36






























37





















38










39




complexa

40






GO 0002200




GO0006739


00043283



GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


42




BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value



nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





43

206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



44

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BlastX





















47





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49

50

4 DISCUSSAtildeO































51































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hipoacutexia

56













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Science 267814





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Manaus _ AM


Bolsista FAPEAM

Manaus - AM






16 - Objetivos



17 - Justificativa








Sequumlecircncias






3 ndash RESULTADOS











iii

Agradecimentos











conclusatildeo










iv







do INPA


inabalaacutevel







v





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vi

RESUMO




























1

ABSTRACT

























2

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3
























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COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






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500 pb

1A

1B

1

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7A

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9B



Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

3

5

4

6

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Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

- - x -





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35







Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





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complexa

40






GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value



nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





43

206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



44

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BlastX





















47





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50

4 DISCUSSAtildeO































51































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54


































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2002)









hipoacutexia

56













1ndash14







57



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226



4917

58

















59





















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2241ndash2249



105












61




















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Paulo SP 101p


Science 267814





63




















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(147) 4-22








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16 - Objetivos



17 - Justificativa








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EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

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BP MF and CC

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1

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Oligo

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encontrada

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Acesso

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alinhado

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GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value



nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





43

206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



44

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BlastX





















47





48


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4 DISCUSSAtildeO































51































52
































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54


































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2002)









hipoacutexia

56













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Paulo SP 101p


Science 267814





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COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






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1A

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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

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PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

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natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

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complexa

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GO0006739


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GO 0032501


allall



Blastx















41


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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value



nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





43

206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



44

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4 DISCUSSAtildeO































51































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2002)









hipoacutexia

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TRATAMENTO






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1A

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9A

9B



Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

3

5

4

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Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





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complexa

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GO 0002200




GO0006739


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GO 0044238


GO 0043170







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allall



Blastx















41


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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value



nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





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66 VHAEYLHDHS 75












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hipoacutexia

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EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

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natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

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BLASTX





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complexa

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GO 0002200




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Espeacutecie de

homologia

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HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

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13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

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encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

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Acesso

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BLASTX





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GO 0002200




GO0006739


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GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value



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101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

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HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












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500pb

500 pb

5A

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7A

7B





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500 pb

8A

8B




33

500 pb

9A

9B



Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



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1

2

3

5

4

6

34




Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















35







Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





36






























37





















38










39




complexa

40






GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


42




BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value



nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

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62





43

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WNT+ H+E++HDHA



44

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46


BlastX





















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49

50

4 DISCUSSAtildeO































51































52
































53


































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2002)









hipoacutexia

56













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Science 267814





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Bolsista FAPEAM

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Sequumlecircncias






3 ndash RESULTADOS




























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5























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16 - Objetivos
















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(cDNA)







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MEGA Bace








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COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






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500 pb

1A

1B

1

2

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6A

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7B





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8A

8B




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9A

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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

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BP MF and CC

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1

2

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Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

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encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















35







Acesso

GeneBank


alinhado

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BLASTX





36






























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complexa

40






GO 0002200




GO0006739


00043283



GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


42




BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value



nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





43

206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



44

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BlastX





















47





48


49

50

4 DISCUSSAtildeO































51































52
































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54


































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2002)









hipoacutexia

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1ndash14







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4917

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Paulo SP 101p


Science 267814





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Manaus _ AM


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17 - Justificativa








Sequumlecircncias






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COacuteDIGO DO

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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

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PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

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Tempo de


encontrada

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encontrada

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Acesso

GeneBank


alinhado

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BLASTX





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complexa

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GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


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GO 0032501


allall



Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

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fragmento

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nigroviridis

101 2e-20










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WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















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4 DISCUSSAtildeO































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TRATAMENTO






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9A

9B



Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

3

5

4

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Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

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dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





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complexa

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GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

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nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

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HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















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4 DISCUSSAtildeO































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2002)









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Paulo SP 101p


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EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

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natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





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complexa

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GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value



nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

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206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















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4 DISCUSSAtildeO































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2002)









hipoacutexia

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Paulo SP 101p


Science 267814





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EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

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1

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Oligo

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GeneBank

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EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

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13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


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Tempo de


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GeneBank


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GO 0002200




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GO 0044238


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Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

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fragmento

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29

500pb

500 pb

5A

5B





30

500 pb

6A

6B




31

500 pb

7A

7B





32

500 pb

8A

8B




33

500 pb

9A

9B



Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

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BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

3

5

4

6

34




Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















35







Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





36






























37





















38










39




complexa

40






GO 0002200




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GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


42




BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

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nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





43

206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



44

45


46


BlastX





















47





48


49

50

4 DISCUSSAtildeO































51































52
































53


































54


































55























2002)









hipoacutexia

56













1ndash14







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4917

58

















59





















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2241ndash2249



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Paulo SP 101p


Science 267814





63




















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(147) 4-22








65



















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66



















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291







68









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Manaus _ AM


Bolsista FAPEAM

Manaus - AM






16 - Objetivos



17 - Justificativa








Sequumlecircncias






3 ndash RESULTADOS






























11
























12


























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16 - Objetivos
















14



17 - Justificativa





















15


























16





















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19












2000)



(cDNA)







20

















revelado






21

























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MEGA Bace








3 ndash RESULTADOS







23



COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






24





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500 pb

1A

1B

1

2

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5A

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6A

6B




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7A

7B





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8A

8B




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9A

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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

3

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34




Oligo

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13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

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Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

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encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















35







Acesso

GeneBank


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BLASTX





36






























37





















38










39




complexa

40






GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







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allall



Blastx















41


42




BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

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nigroviridis

101 2e-20










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STHAEYLHDH

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62





43

206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



44

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BlastX





















47





48


49

50

4 DISCUSSAtildeO































51































52
































53


































54


































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2002)









hipoacutexia

56













1ndash14







57



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226



4917

58

















59





















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2241ndash2249



105












61




















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Paulo SP 101p


Science 267814





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(147) 4-22








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-189

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Manaus - AM






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17 - Justificativa








Sequumlecircncias






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COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






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7A

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8A

8B




33

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9A

9B



Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

3

5

4

6

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Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

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dTC MOB1 Natildeo

encontrada

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encontrada

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natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

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BLASTX





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complexa

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GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







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allall



Blastx















41


42




BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

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nigroviridis

101 2e-20










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STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

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HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



44

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BlastX





















47





48


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50

4 DISCUSSAtildeO































51































52
































53


































54


































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2002)









hipoacutexia

56













1ndash14







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4917

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Paulo SP 101p


Science 267814





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COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






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8A

8B




33

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9A

9B



Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

3

5

4

6

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Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

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natildeo interferiu
















35







Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





36






























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complexa

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GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







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allall



Blastx















41


42




BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

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fragmento

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nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

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HAEYLHDH+

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WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















47





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4 DISCUSSAtildeO































51































52
































53


































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2002)









hipoacutexia

56













1ndash14







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Paulo SP 101p


Science 267814





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COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






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5A

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7A

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8B




33

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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

3

5

4

6

34




Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

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dTC PAI2 Natildeo

encontrada

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natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





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complexa

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GO 0002200




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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


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GO 0032501


allall



Blastx















41


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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

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nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





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206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

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WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















47





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50

4 DISCUSSAtildeO































51































52
































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54


































55























2002)









hipoacutexia

56













1ndash14







57



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4917

58

















59





















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2241ndash2249



105












61




















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Paulo SP 101p


Science 267814





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(147) 4-22








65



















-189

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835ndash841

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Manaus _ AM


Bolsista FAPEAM

Manaus - AM






16 - Objetivos



17 - Justificativa








Sequumlecircncias






3 ndash RESULTADOS







17 - Justificativa





















15


























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2000)



(cDNA)







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revelado






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COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

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13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

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dTC MOB1 Natildeo

encontrada

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natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

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BLASTX





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complexa

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GO 0002200




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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


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Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

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fragmento

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101 2e-20










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STHAEYLHDH

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206 THAEYLHDHA 235

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WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















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51































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2002)









hipoacutexia

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Paulo SP 101p


Science 267814





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COacuteDIGO DO

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8A

8B




33

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9A

9B



Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

3

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6

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Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

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dTC MOB1 Natildeo

encontrada

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encontrada

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natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

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BLASTX





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complexa

40






GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

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nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

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66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















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50

4 DISCUSSAtildeO































51































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53


































54


































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2002)









hipoacutexia

56













1ndash14







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Paulo SP 101p


Science 267814





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16 - Objetivos



17 - Justificativa








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EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

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1

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Oligo

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13mers


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encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















35







Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





36






























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38










39




complexa

40






GO 0002200




GO0006739


00043283



GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


42




BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value



nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





43

206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



44

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BlastX





















47





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49

50

4 DISCUSSAtildeO































51































52
































53


































54


































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Science 267814





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Manaus _ AM


Bolsista FAPEAM

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17 - Justificativa








Sequumlecircncias






3 ndash RESULTADOS

























18






















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2000)



(cDNA)







20

















revelado






21

























22








MEGA Bace








3 ndash RESULTADOS







23



COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






24





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500 pb

1A

1B

1

2

3





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2A

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8A

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500 pb

9A

9B



Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

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BP MF and CC

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tBLASTx



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1

2

3

5

4

6

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Oligo

dTX

13mers


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Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















35







Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





36






























37





















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complexa

40






GO 0002200




GO0006739


00043283



GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


42




BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value



nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





43

206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



44

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BlastX





















47





48


49

50

4 DISCUSSAtildeO































51































52
































53


































54


































55























2002)









hipoacutexia

56













1ndash14







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226



4917

58

















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Paulo SP 101p


Science 267814





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(147) 4-22








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Manaus - AM






16 - Objetivos



17 - Justificativa








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2000)



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COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






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1A

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2A

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7A

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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

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1

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natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

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BLASTX





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complexa

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GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

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nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





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HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















47





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50

4 DISCUSSAtildeO































51































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2002)









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17 - Justificativa








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COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

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13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


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- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

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encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





36






























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complexa

40






GO 0002200




GO0006739


00043283



GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

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nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





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206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



44

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BlastX





















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50

4 DISCUSSAtildeO































51































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hipoacutexia

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Paulo SP 101p


Science 267814





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17 - Justificativa








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COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

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natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





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complexa

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GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

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nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

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206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















47





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4 DISCUSSAtildeO































51































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2002)









hipoacutexia

56













1ndash14







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Paulo SP 101p


Science 267814





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16 - Objetivos



17 - Justificativa








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COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

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13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

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GO 0002200




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GeneBank

Espeacutecie de

homologia

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fragmento

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101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

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17 - Justificativa








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COacuteDIGO DO

TRATAMENTO






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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

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13mers


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GO 0002200




GO0006739


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GO 0044238


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Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

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101 2e-20










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4 DISCUSSAtildeO































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9A

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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

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4

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Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

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Acesso

GeneBank


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GO0006739


00043283



GO 0002376


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GO 0044238


GO 0043170







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Acesso

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Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

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66 VHAEYLHDHS 75












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51































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Science 267814





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Sequumlecircncias






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25

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8A

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9A

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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



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1

2

3

5

4

6

34




Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















35







Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





36






























37





















38










39




complexa

40






GO 0002200




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GO 0044238


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allall



Blastx















41


42




BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

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nigroviridis

101 2e-20










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43

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44

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51































52
































53


































54


































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2002)









hipoacutexia

56













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Science 267814





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16 - Objetivos



17 - Justificativa








Sequumlecircncias






3 ndash RESULTADOS









26

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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

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BP MF and CC

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tBLASTx



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1

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encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

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encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















35







Acesso

GeneBank


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BLASTX





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39




complexa

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GO 0002376


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GO 0044238


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Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

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fragmento

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nigroviridis

101 2e-20










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BlastX





















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2002)









hipoacutexia

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4917

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Paulo SP 101p


Science 267814





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Bolsista FAPEAM

Manaus - AM






16 - Objetivos



17 - Justificativa








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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

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PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

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Tempo de


encontrada

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dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

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encontrada

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natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

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BLASTX





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complexa

40






GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


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GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

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fragmento

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101 2e-20










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2002)









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16 - Objetivos



17 - Justificativa








Sequumlecircncias






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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

3

5

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Oligo

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EST(Blast X)


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de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

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encontrada

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encontrada

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Acesso

GeneBank


alinhado

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GO 0002200




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allall



Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

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fragmento

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nigroviridis

101 2e-20










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STHAEYLHDH

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4 DISCUSSAtildeO































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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

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dissolvido


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Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

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- - x -





natildeo interferiu
















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Acesso

GeneBank


alinhado

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BLASTX





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complexa

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Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

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WNT+ H+E++HDHA



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4 DISCUSSAtildeO































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2002)









hipoacutexia

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4917

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Paulo SP 101p


Science 267814





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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

3

5

4

6

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Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

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encontrada

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natildeo interferiu
















35







Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





36






























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complexa

40






GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


42




BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

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nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





43

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HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















47





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4 DISCUSSAtildeO































51































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2002)









hipoacutexia

56













1ndash14







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2241ndash2249



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Paulo SP 101p


Science 267814





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16 - Objetivos



17 - Justificativa








Sequumlecircncias






3 ndash RESULTADOS








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Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

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Oligo

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encontrada

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Acesso

GeneBank


alinhado

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BLASTX





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GO 0002200




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GO 0002376


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Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

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fragmento

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101 2e-20










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EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

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1

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complexa

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GO 0002200




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GO 0002376


GO 0044237


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GeneBank

Espeacutecie de

homologia

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fragmento

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WNT+ H+E++HDHA



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54


































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Sequumlecircncias






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EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

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BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

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1

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Oligo

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EST(Blast X)


Oxigecircnio

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encontrada

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GeneBank


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GO 0002200




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GeneBank

Espeacutecie de

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fragmento

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69

Manaus _ AM


Bolsista FAPEAM

Manaus - AM






16 - Objetivos



17 - Justificativa








Sequumlecircncias






3 ndash RESULTADOS







Figura abaixo












EST (NCBI)1500000



Sim Natildeo

Blast2GOGO

BP MF and CC

Blast2GOBLASTn x

tBLASTx



PhredPhrapCAP3


1

2

3

5

4

6

34




Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















35







Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





36






























37





















38










39




complexa

40






GO 0002200




GO0006739


00043283



GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


42




BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value



nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





43

206 THAEYLHDHA 235

HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



44

45


46


BlastX





















47





48


49

50

4 DISCUSSAtildeO































51































52
































53


































54


































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2002)









hipoacutexia

56













1ndash14







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4917

58

















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60


2241ndash2249



105












61




















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Paulo SP 101p


Science 267814





63




















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(147) 4-22








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Sequumlecircncias






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Oligo

dTX

13mers


EST(Blast X)


Oxigecircnio

dissolvido


de petroacuteleo

Tempo de


encontrada

- - x -

dTC MOB1 Natildeo

encontrada

- - x -

dTC PAI2 Natildeo

encontrada

- - x -





natildeo interferiu
















35







Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





36






























37





















38










39




complexa

40






GO 0002200




GO0006739


00043283



GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















41


42




BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

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nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

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61 STHAEYLHDH 70

62





43

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66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















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4 DISCUSSAtildeO































51































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Science 267814





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Sequumlecircncias






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Acesso

GeneBank


alinhado

e-value














BLASTX





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complexa

40






GO 0002200




GO0006739


00043283



GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

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nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

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61 STHAEYLHDH 70

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BlastX





















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4 DISCUSSAtildeO































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Paulo SP 101p


Science 267814





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complexa

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GO 0002200




GO0006739


00043283



GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

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nigroviridis

101 2e-20










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STHAEYLHDH

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GO 0002200




GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







GO 0032501


allall



Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

e-value



nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

61 STHAEYLHDH 70

62





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HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















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4 DISCUSSAtildeO































51































52
































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2002)









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Sequumlecircncias






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GO0006739


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GO 0002376


GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







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Blastx















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BlastX

Acesso

GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

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nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

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HAEYLHDH+

66 VHAEYLHDHS 75












WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















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4 DISCUSSAtildeO































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GO0006739


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GO 0044237


GO 0044238


GO 0043170







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Blastx















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BlastX

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GeneBank

Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

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nigroviridis

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WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















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4 DISCUSSAtildeO































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Science 267814





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homologia

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fragmento

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Sequumlecircncias






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BlastX

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homologia

Tamanho do

fragmento

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nigroviridis

101 2e-20










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Espeacutecie de

homologia

Tamanho do

fragmento

alinhado

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nigroviridis

101 2e-20










203 STHAEYLHDH 232

STHAEYLHDH

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HAEYLHDH+

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WNT+ H+E++HDHA



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BlastX





















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WNT+ H+E++HDHA



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835ndash841

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Manaus _ AM


Bolsista FAPEAM

Manaus - AM






16 - Objetivos



17 - Justificativa








Sequumlecircncias






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hipoacutexia

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(cuvier, 1818), expostos ao petrÓleo e a hipoxia....

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