Cultura Celular a Curto PrazoBIO1940 - Citogenética Básica

Dr. Cláudio C. SilvaPUC-Goiás / BIO

Cultura Celular Amostra Heparinizada

Fitohemaglutinina

Meio RPMI

Glutamina

Soro Fetal Bovino

Antibióticos

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

Preparação das Lâminas

Colchicina

Hipotônica

Fixador

Limpeza da lâminas

Gotejamento da amostra

Coloração com Giemsa 4%

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

Análise Microscópica

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

Coleta das Amostras

Protocolo de Cultura Celular

Sangue periférico Heparinizado................... 1,0mL

Meio RPMI....................................................4,5mL

Glutamina.......................................................0,1mL

Soro Fetal Bovino..........................................1,0mL

Fitohemaglutinina..........................................0,1mL

Antibióticos................................................... 0,1mL

• Incubar na estufa 37oC durante 47h;

• Acrescentar 10g/mL (100L) colchicina em cada

cultura;

• Incubar por mais 1h (47h+1h=48h de cultura)

• Ao completar 48h de cultura fazer a colheita;

• Transferir a amostra para um cubo cônico de centrífuga;

• Centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e desprezar o sobrenadante;

• Acrescentar por gotejamento e agitação 10mL de solução hipotônica previamente

aquecida de KCl a 0,075M;

• Colocar na estufa a 37oC por 15 minutos, centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e

desprezar o sobrenadante;

• Acrescentar por gotejamento e agitação 10mL de fixador de Carnoy´s gelado;

• Aguardar 10 minutos, centrifugar a 1.500rpm por 10 minutos e desprezar o

sobrenadante;

• Repetir os dois últimos passos por mais duas vezes;

• Gotejar em uma lâmina limpa e desengordurada ± 3 gotas da amostra sob banho maria a

60oC e aguardar 1 minuto;

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

Coloração e Análise das

lâminas

• Mergulhar as lâminas em

Giemsa à 4% durante 10

minutos;

• Enxaguar em água corrente;

• Secar e proceder a análise

microscópica da amostra;

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

Observar em pequeno aumento para localizar as metáfases e depois em 1000X para a análise microscópica dos cromossomos;

Microscópio Lâmina Coordenadas Número de cromossomos Observações

Análise Microscópica

Estudo Cromossômico – Teste do MN em linfócitos T in vitro (Fenech & Morley, 1985)

Recomendações da SBG / 2004

Contagem: 15-20 células

Análise: 4-5 células

Cariótipo: 2 células