análise citogenética comparativa entre glossophaga ... · 2.3 citogenética de chiroptera . 24 ....

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA

Análise Citogenética Comparativa entre

Glossophaga soricina, Platyrrhinus lineatus e

Sturnira lilium (Phyllostomidae, Chiroptera).

Merilane da Silva Calixto

Recife, PE Fevereiro, 2008

Merilane da Silva Calixto

Análise Citogenética Comparativa entre

Glossophaga soricina, Platyrrhinus lineatus e

Sturnira lilium (Phyllostomidae, Chiroptera).

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco,

como parte dos requisitos necessários para

a obtenção do grau de Mestre em Genética.

Orientadora: Prof. Dra. Maria José de Souza Lopes, Depto. de Genética, Centro

de Ciências Biológicas, UFPE.

Co-Orientadora: Prof. Dra. Neide Santos,

Depto. de Genética, Centro de Ciências

Biológicas, UFPE.

Recife, PE Fevereiro, 2008

ii

Calixto, Merilane da Silva Análise citogénetica comparativa entre Glossophaga soricina, Platyrrhinus

lineatus e Sturnira lilium (Phyllostomidae, Chiroptera). / Merilane da Silva Calixto. – Recife: A Autora, 2008. 101 fls. .: il. Dissertação (Mestrado em Genética) – UFPE. CCB 1. Genetica 2. Chiroptera 3. Morcegos I.Título 599.4 CDU (2ª. Ed.) UFPE 599.4 CDD (22ª. Ed.) CCB – 2008 – 39

Aos meus pais, às minhas

irmãs e a Wellington com

muito amor dedico.

iv

v

“As coisas são semelhantes: isto faz a

Ciência possível;as coisas são diferentes:

isto faz a Ciência necessária.”

(Levins e Levontin, 1985).

AGRADECIMENTOS

Em primeiríssimo lugar a Deus, que me deu toda força necessária para eu

concretizar mais esse objetivo, mostrando mais uma vez pra mim que quando se

quer tudo é possível, basta acreditar e fazer por onde.

Em especial à minha mãe Marinalva, por todo amor, carinho, suporte,

incentivo, apoio e confiança depositada em mim durante mais essa etapa da

minha vida, que foram essenciais para eu persistir quando as coisas tornavam-se

difíceis.

Ao meu pai Everaldo e às minhas queridas irmãs Meriene e Merilene,

pelo amor, carinho, compreensão, ajuda, força, incentivo e por sempre

acreditarem em mim.

Ao meu noivo Wellington pelo carinho, amizade, cumplicidade,

disponibilidade, paciência, compreensão pelas minhas ausências e estresses, por

ter me apoiado em todos os momentos em que precisei, principalmente pelo amor

e incentivo constante e por me fazer sentir capaz de realizar meus sonhos

sempre.

À minha orientadora Profª Maria José, pela dedicação, disponibilidade,

ensinamentos, orientação e confiança durante o desenvolvimento deste trabalho.

À minha co-orientadora Profª Neide Santos, pelo carinho, amizade,

solidariedade, estímulo, confiança, ajuda e principalmente por ter me iniciado na

citogenética na graduação, contribuindo na minha formação profissional.

A todos os amigos da minha turma de Mestrado pela excelente

convivência durante o cumprimento dos créditos.

Aos professores da Pós-graduação em genética por todos os

ensinamentos que contribuíram para minha formação profissional.

A todos do Laboratório de Genética e Citogenética Animal: Adriana, Angélica, Bárbara, Carolina, Cibele, Cybelle, Danielle, Diogo, Evillis, Graciela, Guilherme, Helen, Iane, Ituza, Jefferson, Jéssica, João Henrique, Luzia, Marcela, Myrella, Nara, Pollyanna, Sárah, Sérgio, Thatiana, Tyago e Vilma. À Carol, Cibele, Esteban, Jefferson, Luzia, Thaís e Tyago pela excelente

convivência e ajuda nas coletas.

vi

Á minha grande amiga Marcela Pinto pela amizade, carinho,

solidariedade, companheirismo, força, paciência, estímulo e ajuda em todos os

momentos que precisei nessa etapa da minha vida.

Ao meu amigo Jefferson Geovane por toda ajuda, paciência, apoio,

estímulo, carinho e amizade durante o último ano do Curso.

À minha grande amiga Jéssica Miranda pela amizade, força, paciência,

apoio, incentivo e maravilhosa convivência tanto no laboratório como nos

momentos de lazer neste último ano do curso.

Aos Drs. Alfredo Ricardo Langguth Bonino e Katharine Raquel Pereira dos Santos da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) pela identificação

taxonômica das espécies utilizadas nesse trabalho.

À Cirlene Maria da Silva e à Francisca Tavares Lira pelo suporte técnico,

excelente amizade e convivência durante a execução do projeto.

Ao Prof. Dr. Marcelo Guerra por ter disponibilizado o sistema de captura

de imagens do Laboratório de Citogenética Vegetal e a Diogo Cabral de Mello pela ajuda com a captura das imagens de fluorescência do trabalho.

À minha prima-amiga Vanessa Calixto e à minha amiga Márcia Tatyana,

pela amizade, apoio, por ter acreditado em mim e me incentivado dando forças

nos momentos difíceis que passei nesse período.

Aos meus amigos: Fábio, Fernando, Juliano, Lidiane, Paulo, Rose, Ricardo, Sandro, Sheyla e Silvana pela maravilhosa convivência nos meus

poucos momentos de lazer nestes dois anos.

Aos meus eternos amigos de faculdade Adriana Megume, Eliane Coimbra, Helena Rocha, Marina de Freitas, Patrícia Santos e Pedro Paulo que sempre me apoiaram e me incentivaram mesmo com a distância entre nós.

Aos meus grandes e eternos amigos conquistados na época de colégio:

Adrienne Carla, Apolônio Neto, Cláudia Fernanda, Fabíola Gomes, Flaviana Silva, Gustavo Queiroz, Jutaír Fernandes, Milane Karine, Paulo Henrique, Suzani França e Vivian Clécia que mesmo distante me apoiarem e incentivarem

a lutar sempre pelos meus objetivos, me dando força para jamais desistir.

A todos os meus familiares pela ajuda e apoio constantes.

Enfim, agradeço a todos que ajudaram direta ou indiretamente para a conclusão

deste trabalho.

vii

viii

SUMÁRIO Página

Lista de Tabelas 9

Lista de Figuras 10

Lista de Abreviaturas 11

Resumo 12

1. Introdução 13

2. Revisão Bibliográfica 15

2.1. Ordem Chiroptera 15

2.1.1 Aspectos Gerais 15 2.1.2 Distribuição e Classificação 17 2.2 Família Phyllostomidae: Taxonomia e Distribuição 19 2.3 Citogenética de Chiroptera 24 2.3.1 Aspectos Gerais 24

2.3.2 Aspectos Citogenéticos e Evolutivos da Família Phyllostomidae: Ênfase para as subfamílias Glossophaginae e Stenodermatinae

26

2.4 Marcadores Cromossômicos na Análise Citogenética de morcegos 33

2.4.1 Heterocromatina constitutiva (HC) e Fluorocromos base- específicos 40

2.4.2 Regiões organizadoras de nucléolo (RONs) 47

3. Referências Bibliográficas 53

4. Manuscrito de Artigo Científico Heterogeneidade da heterocromatina constitutiva e das seqüências intergênicas associadas às RONs em três espécies de morcegos (Phyllostomidae,Chiroptera).

68

5. Conclusões 90

6. Abstract 92

7. Anexo 93

7.1. Instruções para Autores 94

7.2 Fotos das espécies estudadas 101

LLIISSTTAA DDEE TTAABBEELLAASS

Tabela Página

Revisão Bibliográfica

Tabela 1: Número de gêneros e espécies de Microchiroptera

no Brasil

19

Tabela 2: Classificação das subfamílias, tribos e gêneros de

Phyllostomidae proposta por Baker et al. (2003)

23

Tabela 3: Dados cromossômicos de espécies das subfamílias

Glossophaginae e Stenodermatinae 30

Tabela 4: Síntese de dados citogenéticos em espécies de

Phyllostomidae

36

Manuscrito de artigo científico

Tabela 1: Espécies de morcegos, localidade de coleta, coordenadas

Geográficas e número de indivíduos analisados 73

Tabela 2: Padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva em

alguns representantes da subfamília Stenodermatinae

(Phyllostomidae).

89

Tabela 3: Padrão de qualificação da eucromatina, heterocromatina

e das seqüências intergênicas das RONs com o CMA3 e DAPI em

representantes de Phyllostomidae.

89

9

LLIISSTTAA DDEE FFIIGGUURRAASS

Figura Página

Manuscrito Figura 1: Coloração convencional em Platyrrhinus lineatus (a),

Sturnira lilium (b) e Glossophaga soricina (c). No inserto

cromossomo X e Y de macho. Barra: 5 μm.

85

Figura 2: Padrão de heterocromatina constitutiva através do

bandeamento C em Platyrrhinus lineatus (a) e Sturnira lilium (b).

Em b notar a coloração diferencial do braço longo do

cromossomo X. Barra: 5 μm.

86

Figura 3: Idiograma mostrando o padrão de heterocromatina e

RONS em Platyrrhinus lineatus (a), Sturnira lilium (b) e

Glossophaga soricina (c). Em b notar a coloração diferencial do

braço longo do cromossomo X.

87

Figura 4: Coloração seqüencial AgNO3/CMA3/DA/DAPI em

metáfase de Platyrrhinus lineatus (a-c), Sturnira lilium (d-f) e

Glossophaga soricina (g-i). As setas indicam as RONs. Em (e)

destaque para o padrão de CMA3+ do cromossomo X. Em (f)

Cabeças de seta indicam a marcação DAPI + nos pares 5, 6 e 7.

Barra: 5 μm.

88

Anexo Figura 1: Fotos das espécies Platyrrhinus lineatus (a), Sturnira

lilium (b) e Glossophaga soricina (c). Fonte:

www.flickr.com/photos/morcegao/).

101

10

http://www.flickr.com/photos/morcegao/

11

LLIISSTTAA DDEE AABBRREEVVIIAATTUURRAASS

AgNO3 Nitrato de Prata AT Adenina – Timina CBG Bandeamento C com Giemsa CB-CMA3 Bandeamento C com CMA3 CB-DAPI Bandeamento C com DAPI CMA3 Cromomicina A3 DA Distamicina A DAPI 4,6-diamidino-2-fenilindol DNA

Desoxiribonucleic Acid Ácido Desoxirribonucléico

DNAr DNA ribosomal

FISH Fluorescent in Situ Hybridization Hibridização in Situ Fluorescente

GC Guanina – Citosina GTG Bandeamento G com Giemsa HC Heterocromatina Constitutiva NF Número Fundamental RNAr RNA ribosomal RON Região Organizadora de Nucléolo ITS Espaçadores transcritos internos ETS Espaçadores transcritos externos

Calixto, MS Análise citogenética comparativa entre...

Resumo Cromossomos mitóticos de Glossophaga soricina (2n=32,XY; NF=60),

Platyrrhinus lineatus e Sturnira lilium (2n=30,XY; NF=56) foram analisados

através da coloração convencional, bandeamento C, impregnação com nitrato de

prata (AgNO3) e fluorocromos base-específicos. Dados da análise convencional

obtidos para as três espécies estão de acordo com aqueles descritos na

literatura, exceto pela morfologia do cromossomo Y de P. lineatus, indicando

variação cromossômica geográfica para a espécie. Os blocos de HC na região

distal do braço curto dos pares 5, 6, 7 e cromossomo X, observados pelo

bandeamento C, em P. lineatus e S. lilium, além da coloração diferencial do

braço longo do cromossomo X de Sturnira lilium correspondem a um padrão

compartilhado por alguns representantes de Stenodermatinae. A fraca marcação

CMA3+

nas regiões heterocromáticas pericentroméricas e distais de alguns

cromossomos indica uma predominante associação de heterocromatina com

seqüências ricas em pares de bases GC. Contudo, os padrões diferenciais obtidos

com o emprego de fluorocromos base-específicos confirmaram a

heterogeneidade da HC quanto à sua composição (rica em AT e/ou GC) e

comprovaram características diferenciais das seqüências intergênicas

associadas às RONs (CMA3 positiva, negativa ou sem especificidade) em

representantes de Phyllostomidae.

Palavras-chave: Phyllostomidae, bandeamento C, AgNO3, CMA3, DAPI

12


1. Introdução

Os morcegos constituem uma das mais extraordinárias ordens de

mamíferos por possuírem a capacidade de vôo verdadeiro e uma avançada

ecolocalização, que lhes permite ocupar abrigos menos expostos à predação e à

competição, bem como explorar uma ampla variedade de nichos ecológicos,

aproveitando de forma mais eficiente os recursos naturais. Estes organismos

apresentam ampla distribuição geográfica, com uma ampla variedade de hábitos

alimentares, constituindo um grupo bem sucedido, com uma grande diversidade

de espécies (Airas, 2003; Baker et al., 2003; Jones, 2005).

Do ponto de vista citogenético, os representantes da família

Phyllostomidae são os mais estudados dentro da ordem Chiroptera. Desde seu

surgimento, no início da década de 70, as técnicas de bandeamento têm sido

amplamente utilizadas no estudo cromossômico de morcegos, particularmente o

bandeamento G que permite a identificação precisa de cromossomos e de seus

eventuais rearranjos, o bandeamento C (CBG) e a marcação com nitrato de

prata (AgNO3) que marcam regiões de heterocromatina constitutiva (HC) e

regiões organizadoras de nucléolos (RONs), respectivamente (Baker e Bickham,

1980; Varella-Garcia et al., 1989; Souza e Araújo, 1990).

Dados da literatura mostram que espécies estreitamente relacionadas

freqüentemente apresentam padrões de bandas G bastante conservados.

Contudo, certa diferenciação ocorre quanto aos padrões de bandeamento C e

RONs. Estes marcadores cromossômicos, aliados aos estudos taxonômicos têm

permitido um melhor entendimento sobre os mecanismos evolutivos

responsáveis pelas divergências encontradas nos diferentes grupos da ordem

13


(Varella-Garcia et al., 1989; Souza e Araújo, 1990; Santos e Souza, 1998a, b;

Rodrigues et al., 2000; Neves et al., 2001; Santos et al., 2001; 2002; Leite-Silva

et al., 2003).

Análise citogenética molecular utilizando fluorocromos base-específicos

como o DAPI e o CMA3 específicos para AT e GC, respectivamente, têm

permitido a caracterização de diferentes classes de HC (rica em pares de bases

AT e/ou GC, ou sem especificidade), da eucromatina (bandas G e R) e das

seqüências intergênicas associadas às RONs dentro ou entre cariótipos distintos

em diferentes espécies de mamíferos. O uso desses fluorocromos tem fornecido

informações úteis para o estudo da evolução cromossômica desses organismos.

Contudo, em morcegos apenas alguns representantes das famílias

Vespertilionidae, Phyllostomidae e Molossidae foram estudados com esse

enfoque (Bickham, 1987; Ruedas et al., 1990; Santos e Souza, 1998a,b; Santos

et al., 2001; Leite-Silva et al., 2003).

Neste estudo, foi realizada uma análise comparativa através de

marcadores citogenéticos diferenciais (bandeamento C e marcação com AgNO3)

e moleculares (tríplice coloração CMA3/DA/DAPI) nas espécies Glossophaga

soricina, Platyrrhinus lineatus e Sturnira lilium (Phyllostomidae). O padrão e a

heterogeneidade da HC foram analisados através da técnica de bandeamento C

e do uso de fluorocromos base-específicos (CMA3 e DAPI). A caracterização das

RONs e a variabilidade da composição de pares de bases das seqüências

intergênicas associadas a essas regiões foram estudadas pela marcação com

nitrato de prata e pelos fluorocromos CMA3 e DAPI. No conjunto, esses dados

citogenéticos fornecem subsídios para um melhor entendimento sobre a

evolução cromossômica na família Phyllostomidae.

14


2. Revisão Bibliográfica 2.1 Ordem Chiroptera 2.1.1 Aspectos Gerais

A ordem Chiroptera compreende um grupo de mamíferos voadores, geralmente

coloniais, que apresenta uma grande diversidade de formas decorrentes de várias

adaptações morfológicas e fisiológicas. Possui a maior variedade de hábitos

alimentares dentre os mamíferos, incluindo adaptações para serem insetívoros,

frugívoros, nectarívoros, piscívoros e hematófagos. O hábito alimentar frugívoro é o

mais comum (freqüente entre os Phyllostomidae), seguido do insetívoro (encontrado

em Molossidae e Vespertilionidae) (Airas, 2003; Baker et al., 2003; Bonato et al.,

2004; Reis et al., 2007).

Como o nome da ordem sugere (Cheir, mão; Peteron, asa), os morcegos

modificaram seus membros anteriores pelo alongamento dos ossos da mão e dedos

para sustentar e controlar movimentos de uma “membrana alar” (patágio), que se

estende entre os seus dedos, juntando-se lateral e posteriormente à parte mais baixa

da perna, seguindo até a região entre os membros posteriores (Jones, 2002). A

diferenciação gradual dos braços somada ao desenvolvimento do patágio conferiu

aos morcegos a capacidade do vôo verdadeiro, tornando-os os únicos mamíferos

com essa característica (Morton, 1989; Wilson e Reeder, 1993).

Os morcegos constituem uma das mais extraordinárias ordens de mamíferos,

não apenas por serem os únicos mamíferos que voam, mas também por possuírem

uma avançada ecolocalização. A maioria das espécies possui adaptações para

executar esse fenômeno também conhecido como biosonar, que é um processo ativo

15


usado por espécies que necessitam perceber o ambiente onde a visão é ineficaz

(Jones, 2005).

A ecolocalização envolve emissão de sinais de alta freqüência e captação do

eco gerado por eles em diferentes obstáculos, fazendo com que o animal determine a

sua distância e extensão pela medida do tempo entre a produção e o retorno do som.

Dessa maneira, os morcegos são capazes de ocupar abrigos menos expostos à

predação e à competição, obter estabilidade microclimática, bem como de explorar de

modo mais eficiente os recursos oferecidos pelo meio, devido à diversificação dos

seus hábitos alimentares. De fato, a ecolocalização, juntamente com a capacidade de

vôo dos morcegos, é amplamente responsável pelo sucesso global desses animais,

pela sua riqueza de espécies e habilidade de explorar diversos nichos ecológicos em

complexa relação de interdependência com o meio (Fenton, 1992; Pough et al., 1999;

Jones, 2005; Jones e Teeling, 2006).

Pela sua abundância, diversidade e complexidade biológica, os morcegos são

importantes na regulação dos ecossistemas tropicais, atuando como dispersores de

sementes de diversas espécies vegetais, polinizadores de numerosas espécies de

plantas e reguladores de populações de insetos noturnos, à medida que partilham os

recursos, especialmente os alimentares. Dessa maneira, os morcegos desempenham

um papel muito importante na manutenção dos complexos ecossistemas tropicais

sendo, por vezes, diretamente benéficos ao homem (Nowak, 1991; Marinho-Filho e

Sazima, 1998; Jones et al., 2002; Teeling et al., 2005).

Em contrapartida, esses animais podem ser reservatórios naturais de agentes

infecciosos como o protozoário Trypanossoma cruzi, o fungo Toxoplasmose gondii e

o vírus da raiva. O alto conteúdo orgânico dos solos enriquecidos com os

excrementos dos morcegos favorece a proliferação de fungos patogênicos, como o

16


Histoplasma capsulatum, causador da histoplasmose (Constantine, 1970). Além

disso, o guano dos morcegos acumulados nos telhados de residências foi identificado

como potencial alergênico, indutor de asma e rinite em humanos (El-Ansary et al.,

1987).

Chiroptera constitui a segunda maior ordem dentre os mamíferos, com

aproximadamente 1120 espécies, sendo o segundo maior grupo em diversidade,

perdendo apenas para a ordem Rodentia. Representam aproximadamente um terço

dos mamíferos da fauna do Brasil com 167 espécies e constituem 22% das espécies

de mamíferos do mundo (Taddei, 1996; Marinho-Filho e Sazima, 1998; Simmons,

2005; Wilson e Reeder, 2005; Reis et al., 2007).

As características biológicas especiais desses animais, bem como sua alta

diversidade, juntamente com seu papel na economia, ecologia e saúde pública

tornam esse grupo um interessante objeto de estudos. Diversos trabalhos com

diferentes enfoques, tais como fisiologia, taxonomia, biologia, sistemática e

citogenética vêm sendo realizados com o intuito de contribuir para o melhor

conhecimento desses mamíferos (Taddei, 1988; Emmons e Feer, 1990; Souza e

Araújo, 1990; Santos et al., 2002; Passos et al., 2003).

2.1.2 Distribuição e Classificação

Apesar de apresentarem distribuição mundial, incluindo grandes altitudes e ilhas

remotas, como a Nova Zelândia, a maioria dos morcegos ocorre nos trópicos,

existindo poucas espécies em latitudes maiores que 50 graus. A maior diversidade de

espécies está concentrada na região Neotropical, da qual se destaca a região

amazônica que possui a fauna de morcegos mais rica do mundo (Findley, 1993;

17


Altringham, 1996; Jones, 2002). Infelizmente estes “hotspots” de diversidade

freqüentemente coincidem com regiões de grande pressão e influência humana.

Dessa maneira, mais da metade das espécies de morcegos encontra-se em listas de

conservação, extintas ou em perigo de extinção (Jones, 2002).

Os representantes da ordem Chiroptera estão agrupados em 202 gêneros, 18

famílias e duas subordens: Megachiroptera (megabats= Old World fruit bats) e

Microchiroptera (microbats= echolocating bats). Os morcegos da subordem

Megachiroptera, conhecidos popularmente como raposas-voadoras devido à

similaridade de suas faces com a das raposas, não ocorrem no Brasil, estando

representados por 185 espécies em uma única família, a Pteropodidae, com

ocorrência limitada ao velho mundo, na região tropical da África, Índia, sudeste da

Ásia e Austrália. Devido ao tamanho desses morcegos, a orientação desses animais,

com poucas exceções, é baseada na visão, memória e olfato (Taddei, 1996; Jones,

2002; Peracchi et al., 2006; Reis et al., 2007).

A subordem Microchiroptera está representada por 930 espécies reunidas em

17 famílias, cuja distribuição é mundial, exceto nas regiões polares e algumas ilhas

distantes das áreas de continente. Os morcegos desse grupo, ao contrário dos

Megachiroptera, possuem a habilidade de usar a ecolocalização para orientação e

procura de alimento (Findley, 1993; Jones, 2002; Simmons, 2005; Peracchi et al.,

2006; Reis et al., 2007).

Das 17 famílias de Microchiroptera, nove ocorrem nas Américas, estando todas

representadas no Brasil: Emballonuridae, Furipteridae, Molossidae, Mormoopidae,

Natalidae, Noctilionidae, Phyllostomidae, Thyropteridae, e Vespertilionidae. No Brasil,

são conhecidos 64 gêneros e 167 espécies de Microchiroptera (Tabela 1) (Peracchi

et al., 2006; Reis et al., 2007). Esses morcegos habitam todo o território nacional,

18


ocorrendo na Amazônia, no Cerrado, Mata Atlântica, Pantanal, no árido nordeste e

em áreas urbanas (Reis et al., 2007).

Tabela 1: Número de gêneros e espécies de Microchiroptera no Brasil

Famílias Nº de gêneros Nº de espécies

Emballonuridae 7 15

Furipteridae 1 1

Molossidae 7 26

Mormoopidae 1 4

Natalidae 1 1

Noctilionidae 1 2 Phyllostomidae 40 90

Thyropteridae 1 4

Vespertilionidae 5 24

Referência: Peracchi et al., 2006; Reis et al., 2007.

2.2 Família Phyllostomidae: Taxonomia e Distribuição

Os representantes da família Phyllostomidae, também conhecidos como “leaf-

nosed bats”, são caracterizados pela presença de um apêndice nasal bem

desenvolvido, em forma de folha triangular (folha nasal), exceto nas espécies

hematófagas (Desmodontinae), onde a folha nasal é reduzida (Findley, 1993; Nowak,

1994; Medellín et al., 1997). Phyllostomidae constitui uma família taxonomicamente

diversa, apresentando o maior número de gêneros e espécies entre os Chiroptera

Neotropicais. Inclui 56 gêneros e cerca de 140 espécies, das quais aproximadamente

120 espécies foram descritas no Brasil (Baker et al., 2003; Peracchi et al., 2006; Reis

et al., 2007).

19


De acordo com a nova classificação proposta por Baker et al. (2003), esta família

possui os 56 gêneros agrupados em 11 subfamílias: Carollinae, Desmodontinae,

Glossophaginae, Glyphonycterinae, Lonchophyllinae, Lonchorhininae, Macrotinae,

Micronycterinae, Phyllostominae, Rhinophyllinae e Stenodermatinae (Tabela 2).

Embora Phyllostomidae seja a terceira maior família dentre os Chiroptera, seus

representantes exibem mais variações morfológicas do que qualquer outro grupo de

mamíferos, possuindo adaptações a uma grande variedade de nichos ecológicos

(Baker et al., 2003). Por conta dessa considerável heterogeneidade, há uma

discordância no que diz respeito às suas relações sistemáticas e evolutivas (Baker et

al., 2000; Wetterer et al., 2000; Jones et al., 2002; Pieczarka et al., 2005).

Os filostomídeos caracterizam-se por possuir hábito alimentar bem variável,

incluindo insetos, frutos, pólen, néctar, folhas, artrópodes, pequenos vertebrados e

sangue de vertebrados endotérmicos (aves e mamíferos). Espécies dessa família

utilizam como abrigo cavernas, fendas, rochas, minas, túneis, folhagens, ocos de

árvores e edificações (Câmara, 1991; Jones, 2002).

A subfamília Glossophaginae é representada por morcegos que se alimentam

de néctar, pólen e às vezes de partes florais. Esses animais possuem pequeno porte,

sendo adaptados ao seu tipo de alimentação, apresentando um focinho alongado e

uma língua longa e extensível, com numerosas papilas filiformes na extremidade

distal. Possuem vôo muito manobrável, sendo capazes de pairar próximos à flor para

retirada do néctar (Taddei, 1983). Esta subfamília é constituída por 13 gêneros

(Tabela 2) e 33 espécies, distribuídas nas Américas Central e do Sul, indo desde o

Sul do México ao Sul do Brasil, e representa a segunda maior subfamília dentro de

Phyllostomidae. No Brasil está representada por 8 gêneros e 14 espécies (Reis et al.,

2007). O gênero Glossophaga está representado por cinco espécies (G.

20


commissarisi, G. leachi, G. longirostris, G. morenoi e G. soricina). Dentre essas

apenas três ocorrem no Brasil (G. commissarisi, G. longirostri e G. soricina). A

espécie G. soricina tem como localidade-tipo o Suriname e está distribuída por toa

região neotropical, ocorrendo desde o México até as Guianas, sudeste do Brasil e

norte da Argentina (Simmons, 2005).

Glossophaginae apresenta uma classificação sistemática bastante discutível,

considerando que dados morfológicos, citogenéticos e imunológicos têm indicado

uma possível origem polifilética para o grupo (Nowak, 1994; Hoffmann e Baker, 2001;

Baker et al., 2003; Ribeiro et al., 2003). Entretanto, alguns autores têm fornecido

informações compatíveis com a hipótese de que Glossophaginae seja de origem

monofilética, baseando-se em dados imonológicos e eletroforéticos (Haiduk e Baker,

1982; Gimenez et al., 1996).

Alguns pesquisadores aceitam a hipótese monofilética para a família

Phyllostomidae. Esta monofilia tem sido apoiada por dados morfológicos (Hood e

Smith, 1982; Wetterer et al., 2000) e bioquímicos (Honeycutt et al., 1980; Arnold et

al., 1983). Além disso, a filogenia de espécies de Phyllostomidae tem sido

amplamente discutida com base nas análises de homeologia baseadas nos padrões

de bandeamento cromossômico (Baker e Bickham, 1980; Varella-Garcia et al., 1989;

Souza e Araújo, 1990; Baker, 2003; Ribeiro et al., 2003).

Stenodermatinae representa a maior subfamília em Phyllostomidae,

abrangendo 20 gêneros (Tabela 2) e aproximadamente 67 espécies. Seus

representantes apresentam dieta basicamente frugívora, podendo ser

complementada por néctar de flores em períodos de seca onde as frutas são

escassas. Por esta razão, são considerados como um dos mais importantes

dispersores de sementes, essenciais para a regeneração de florestas e colonização

21


de plantas em novas áreas (Emmons e Feer, 1990; Altringham, 1996; Baker et al.,

2003; Reis et al., 2007).

Os morcegos da subfamília Stenodermatinae têm sua distribuição na América

Central e do Sul e têm sido considerados muito importantes para a biodiversidade

(Wetterer et al., 2000; Jones et al., 2002; Baker, et al., 2003). O gênero Sturnira

compreende 15 espécies (Simmons, 2005; Sánchez-Hernadez et al., 2005), onde

apenas quatro espécies são representadas no Brasil (S. bidens, Sturnira lilium, S.

magna e S. tildae) (Reis et al., 2007). S. lilium ocorre nas pequenas Antilhas e do

México até a região nordeste da Argentina, Uruguai e Paraguai (Simmons, 2005). No

Brasil distribui-se em todo o território (Eisenberg e Redford, 1999). O gênero

Platyrrhinus está constituído por 14 espécies (Velazco, 2005), das quais apenas cinco

espécies ocorrem em território brasileiro (P.brachycephalus, P. helleri, P. infuscus, P.

lineatus e P. recifinus) (Reis et al., 2007). P. lineatus é uma espécie endêmica à

América do Sul e ampla distribuição no continente, com registros para Colômbia,

Peru, Equador, Guiana Francesa, Suriname, Bolívia, Brasil, Uruguai, Argentina e

Paraguai. Brasil (Simmons, 2005). No Brasil, ocorre em todos os biomas, sendo rara

apenas na Amazônia. Nos outros biomas é a espécie mais comumente registrada em

levantamentos faunísticos (Reis et al., 2007).

22


Tabela 2. Classificação das Subfamílias, tribos e gêneros de Phyllostomidae proposta por Baker et al. (2003)

Família Phyllostomidae

Macrotinae Lonchophyllinae Macrotus Lionycteris Micronycterinae Lonchophylla Micronycteris Platalina Lampronycteris Carolliinae Desmodontinae Carollia Diphyllini Glyphonycterinae Diphylla Glyphonycteris Desmodontini Trinycteris Desmodus Rhinophyllinae Diaemus Rhinophylla Lonchorhininae Stenodermatinae Lonchorhina Sturnirini Phyllostominae Sturnira Macrophyllini Stenodermatini Macrophyllum Vampyressina Trachops Chiroderma Phyllostomini Vampyriscus Lophostoma Uroderma Tonatia Vampyressa Mimon Mesophylla Phylloderma Vampyrodes Phyllostomus Platyrrhinus Vampyrini Mesostenodermatini Chrotopterus Enchisthenina Vampyrum Enchisthenes Glossophaginae Ectophyllina Glossophagini Ectophylla Monophyllus Artibeina Glossophaga Artibeus Leptonycteris Dermanura Brachyphyllini Stenodermatina Brachyphylla Ariteus Phyllonycterini Ardops Erophylla Stenoderma Phyllonycteris Centurio Choeronycterini Pygoderma Anourina Sphaeronycteris Anoura Ametrida Choeronycterina Phyllops Hylonycteris Choeroniscus Choeronycteris Musonycteris Lichonycteris Scleronycteris

23


2.3 Citogenética de Chiroptera 2.3.1 Aspectos Gerais

Embora os caracteres morfológicos tenham sido amplamente utilizados em

estudos genéticos, sistemáticos e evolutivos, a análise cariotípica surgiu como uma

complementação destes estudos, após o aperfeiçoamento das técnicas de

preparação e coloração citológicas. Técnicas adequadas de tais preparações ainda

não haviam sido descritas para mamíferos até 1956, quando Ford e Hamerton

descreveram uma técnica a partir da utilização de células de medula óssea com o

emprego de uma solução salina hipotônica que permitia o aumento do volume celular

e um melhor espalhamento cromossômico.

Estudos citogenéticos iniciais em Chiroptera baseavam-se exclusivamente na

análise convencional, permitindo a determinação dos números diplóides, número de

braços autossômicos (número fundamental=NF), morfologia cromossômica e sistema

de determinação sexual em várias espécies (Baker, 1967; Baker e Patton, 1967; Hsu

et al., 1968; Yonenaga et al., 1969). Esse tipo de análise foi possível graças à técnica

de preparação citológica descrita para mamíferos por Ford e Hamerton (1956).

Os primeiros estudos abordando a citogenética evolutiva de morcegos foram

realizados na década de 1960. Baker (1967) analisou 27 espécies representantes de

seis subfamílias e 18 gêneros da família Phyllostomidae e estabeleceu uma relação

filogenética baseada nas variações cariotípicas das espécies. Nesta mesma época,

Baker e Patton (1967) descreveram os cariótipos de 32 espécies, representantes de

nove gêneros de Vespertilionidae, e discutiram as vantagens do uso do cariótipo

como bom indicador filogenético.

24


Hsu et al. (1968) analisando 26 espécies de morcegos da família

Phyllostomidae, descreveram o sistema sexual múltiplo em seis espécies

pertencentes aos gêneros Artibeus, Carollia e Choeroniscus, e discutiram uma

possível origem para este sistema de determinação sexual em morcegos. No final

dos anos 60, Yonenaga et al. (1969) realizaram os primeiros estudos com morcegos

filostomídeos brasileiros, descrevendo o cariótipo de seis espécies.

Nesse mesmo período, vários trabalhos haviam sido publicados descrevendo o

cariótipo de diversas espécies americanas, européias e brasileiras de diferentes

famílias de morcegos e até o início de 1970, tinham sido publicados trabalhos

contendo observações feitas em relação ao mecanismo de determinação sexual,

devido à ocorrência de translocações entre o cromossomo X e autossomos em

algumas espécies de morcegos como as do gênero Artibeus (Beçak et al., 1968,

1969) e Carollia (Patton e Gardner, 1971).

No início da década de 1970, um estudo muito importante baseado na análise

citogenética convencional foi realizado em um grande número de espécies

representantes das famílias Desmodontinae, Emballonuridae, Molossidae, Natalidae,

Phyllostomidae e Vespertilionidae. Neste estudo, Baker (1970) observou uma elevada

variação cariotípica dentro da ordem, com ampla variação no número diplóide, indo

de 2n=16 (Tonatia bidens) a 2n=62 (Rhinolophus cornulus). Casos de variação

cromossômica em morcegos também foram identificados em outros trabalhos (Baker

e Lopez 1970; Baker e Hsu, 1970). Dessa forma, estes estudos iniciais contribuíram

consideravelmente para um primeiro entendimento da evolução cariotípica da ordem.

25


2.3.2 Aspectos Citogenéticos e Evolutivos da Família Phyllostomidae: Ênfase para as Subfamílias Glossophaginae e Stenodermatinae

Estudos realizados na família Phyllostomidae demonstraram uma variabilidade

nos números diplóides (2n), que vão desde 2n=14 em Vampyressa melissa

(Stenodermatinae) até 2n=46 em Macrotus waterhousii (Macrotinae), bem como do

número de braços autossômicos (número fundamental = NF) variando de 20 (Tonatia

bidens) a 68 (Micronycteris megalotis), onde os números mais freqüentes são

2n=30/32 e NF=56/60 (Baker, 1970).

A evolução cromossômica desta família sempre foi um assunto muito discutido.

Baseado nas altas freqüências de cariótipos com 2n=30-32 e NF=56-60 entre as

diferentes espécies de Phyllostomidae, Baker (1973) sugeriu que este poderia ser o

cariótipo primitivo e os demais derivados. Entretanto, posteriormente Patton e Baker

(1978) propuseram que o cariótipo ancestral para a família seria 2n=46 e NF=60,

similar ao observado em M. waterhousii. Portanto, foi proposto que a evolução

cariotípica entre os filostomídeos pode ter levado a uma redução dos números

diplóides através de eventos de fusão cêntrica. Por outro lado, com base em análise

cladística realizada nesta e em famílias relacionadas (Noctilionidae, Mormoopidae e

Vespertilionidae) através dos bandeamentos C e G, Baker e Bickham (1980)

sugeriram que 2n=42/NF=60 seria a condição primitiva para a família Phyllostomidae.

Análises citogenéticas realizadas por Baker e Bickham (1980) em várias

espécies de morcegos, indicaram que a evolução cariotípica de algumas famílias da

ordem Chiroptera (Phyllostomidae, Mormopidae, Mystacinidae e Vespertionidae) não

ocorreu de maneira uniforme. As alterações cromossômicas apresentaram diferenças

tanto na extensão como na velocidade dos eventos evolutivos. Dessa maneira, os

26


morcegos foram classificados em grupos que apresentaram mudanças rápidas e

consideráveis (megaevolução cariotípica), e em grupos que apresentaram uma lenta

taxa de evolução cromossômica (conservacionismo cromossômico). Espécies

estreitamente relacionadas exibiram extensos rearranjos cromossômicos, de forma

que as homeologias não puderam ser determinadas pelo bandeamento G. De acordo

com Varella-Garcia et al. (1989) esta não-uniformidade na evolução cromossômica é

uma característica não apenas de algumas famílias, mas de toda a ordem Chiroptera.

As translocações são fenômenos comuns na evolução cromossômica dos mamíferos,

particularmente as Robertsonianas, que levam à formação de cromossomos meta-

submetacêntricos ou subtelocêntricos a partir da fusão cêntrica de dois elementos

acrocêntricos. A atuação desse tipo de translocação pode ser observada em toda a

ordem Chiroptera, particularmente na família Phyllostomidae, que é intensamente

estudada sob o enfoque citogenético. Quando a fusão ocorre entre dois autossomos

o número diplóide é reduzido e o NF permanece o mesmo. Por outro lado, quando

ocorre entre um autossomo e cromossomos sexuais há redução tanto do número

diplóide quanto do número fundamental. Se o evento envolver apenas o X, ocorre

uma mudança no número diplóide da fêmea em relação ao macho, embora o NF

permaneça o mesmo nos dois sexos (Hsu et al., 1968).

Representantes da subfamília Glossophaginae apresentam números diplóides

que vão de 2n=16 em Choeronicteris mexicana a 2n=36 em Lonchophylla thomasi e

número fundamental variando de NF=24 (Hylonycteris underwoodi) a NF=60

(Glossophaga longirostris), sendo 2n=30/32 e NF=56/60 os cariótipos mais

freqüentes (Tabela 3) (Hsu et al., 1968; Baker, 1979; Baker e Bickham, 1980; Varella-

Garcia et al., 1989; Ribeiro et al., 2003).

27


Com base em dados cromossômicos, dois grupos distintos foram reconhecidos

para Glossophaginae, um grupo conservado que inclui Glossophaga, bem como um

altamente derivado incluindo Anoura. No cariótipo de Glossophaga soricina é possível

reconhecer todos os braços cromossômicos do cariótipo de Macrotus waterhousii

(primitivo), embora alguns desses braços tenham sido encontrados reorganizados em

um único cromossomo (Baker e Bass, 1979). Por outro lado, o cariótipo de Anoura

caudifer, com exceção dos maiores autossomos, sofreu extensos rearranjos

cromossômicos, não sendo possível determinar a presença de homeologias através

do bandeamento G entre seu cariótipo e o de Glossophaga e/ou Macrotus (Varella-

Garcia-et al., 1989).

Casos de variação cariotípica foram encontrados em representantes da

subfamília Glossophaginae. Baker (1967) e Hsu et al. (1968) numa análise

citogenética em Choeroniscus godmani descreveram o cariótipo 2n=19 em todos os

exemplares analisados. Entretanto, posteriormente, Patton e Gardner (1971) ao

analisarem uma fêmea de C. godmani da Costa Rica, observaram número diplóide

2n=20, mostrando a presença de variação intraespecífica.

Os representantes de Stenodermatinae abrangem diferentes números diplóides

de 2n=14 (Vampyressa melissa) a 2n=44 (Uroderma bilobatum) e número

fundamental variando de NF=20 (V. pusilla) a NF=62 (U. magnirostrum) (Tabela 3).

Embora essa subfamília tenha sido caracterizada por uma extensa conservação

cariotípica como é o caso de espécies dos gêneros Artibeus, Sturnira e Platyrrhinus,

cujos cariótipos são altamente conservados, também são encontrados grupos que

englobam espécies portadoras de inúmeros rearranjos cromossômicos, como as dos

gêneros Uroderma e Vampyressa, que apresentam ampla variabilidade inter e

28


intraespecífica (Tabela 3) (Baker e Lopez, 1970; Baker, 1973; Baker et al., 1973;

Gardner, 1977; Baker, 1979; Varella-Garcia et al., 1989; Silva et al., 2005).

O sistema simples de determinação cromossômica do sexo do tipo XX;XY é o

mais comum em mamíferos, sendo também o mais freqüente em morcegos.

Entretanto, a família Phyllostomidae apresenta adicionalmente dois mecanismos

distintos de determinação do sexo, o sistema múltiplo XX;XY1Y2 e o sistema Neo-XY

(considerado como derivado do sistema múltiplo), ambos originados a partir de

eventos de translocação entre autossomos e cromossomos sexuais (X e Y) (Baker,

1979; Tucker, 1986; Varella-Garcia et al., 1989; Souza e Araújo, 1990; Santos e

Souza, 1998b).

O sistema múltiplo tem sido descrito nas subfamílias Carollinae, Glossophaginae

e Stenodermatinae, com esta última apresentando o maior número de espécies com

esse sistema sexual. Por outro lado, o sistema Neo-XY tem sido descrito apenas na

subfamília Stenodermatinae, particularmente nos gêneros Sturnira, Platyrrhinus,

Chiroderma, Uroderma, Vampyressa e em algumas espécies de Artibeus.

Particularmente, amostras de A. cinereus provenientes dos Estados de Pernambuco

e do Pará mostraram sistema sexual Neo-XY diferente de exemplares coletados em

Trinidad, cujo sistema sexual foi XX;XY1Y2 (Baker, 1979; Tucker, 1986; Varella-Garcia

et al., 1989; Souza e Araújo, 1990; Santos e Souza, 1998b).

A hipótese de que o sistema sexual XY1Y2, observado em representantes da

família Phyllostomidae, surgiu por translocação simples de um autossomo

acrocêntrico para o cromossomo X foi proposta por Hsu et al. (1968). Tucker (1986)

propôs que a origem do sistema múltiplo, bem como do tipo Neo-XY, nesta família, foi

decorrente da fixação evolutiva de translocações ancestrais entre autossomos e

cromossomos sexuais. No sistema múltiplo, o cromossomo Y original passou a ser

29


denominado de Y1 e o autossomo homólogo, cujo par foi translocado para o X, foi

chamado de Y2. Por outro lado, após a formação da condição XY1Y2, uma

translocação subseqüente do Y2 para o Y1 deu origem ao sistema Neo-XY (Tucker,

1986; Tucker e Bickham, 1986).

Tabela 3- Dados cromossômicos de espécies das subfamílias Glossophaginae

e Stenodermatinae

Subfamília Glossophaginae

Espécies 2n NF X Y Y2 Referências

Anoura caudifer 30 56 SM A 2,9,17,25,18

A. cultrata 30 54 SM A 17

A. geoffroyi 30 56 SM A 1,4,9,25

Choeroniscus minor 22 36 SM - 27,28

C. intermedius 20 36 SM A 2,19,25

C. mexicana 24-26 - SM - 1,2,4

C.godmani 19/20 32/36 SM ST/A A 1,4,13,17

Brachyphylla cavernarum 32 60 SM A 26

B. nana 32 60 SM A 26

Erophylla cezekorni 32 60 SM A 26

Glossophaga

alticola 32 60 M A

1

G. commissarisi 32 60 M A 1,4

G. longirostris 32 60 M A 17

G. soricina 32 60 M/SM A 1,4,19

Hylonycteris underwoodi 16 24 - - 2

Leptonycteris sanborni 32 60 M A 1,4

L. nivalis 32 60 - - 2

Lichonycteris obscura 24/28 44/50 SM A 17

Monophyllus pletodon 32 60 SM A 17

M. redmani 32 60 SM A 10

Phyllonycteris aphylla 32 60 SM A 25

P. obtusa 32 60 SM A 25

30


Stenodermatinae Espécies 2n NF X Y Y2 Referências

Ametrida centurio 30-31 - ST SM

M/ST 19

Ardops nichollsi 30-31 56 SM ST A 22

Ariteus flavenscens 30-31 56 ST ST A 22

Artibeus aztecus 30-31 56 ST A A 2

A. cinereus 30-31/30 56 ST SM/M M/- 19

A. concolor 30/31 56 ST SM/A M/A 26

A. obscurus 30-31 56 ST A A 31

A. fimbriatus 30-31 56 - - - 29

A. glaucus 30-31 56 ST A A 24

A. hirsutus 30-31 56 ST ST A 17

A. inopinatus 30-31 56 ST ST A 17

A. jamaicensis 30-31/30 56 ST A/- A 1,4,8,9

A. lituratus 30-31 56 SM/ST A/ST A/SM 1,4,5,6,8,9

A. phaeotis 30 56 ST SM 1,4

A. planirostris 30-31 56 ST A A 24

A. toltecus 30-31 56 ST A A 1,4

A. watsoni 30 56 ST SM 17

Centurio senex 28 52 ST SM 1,4,9

Chiroderma salvini 26 48 ST/SM SM 17

C. improvisum 26 48 ST ST 23

C. trinitatum 26 48 ST SM/ST 9,23,24

C. villosum 26 48 ST/SM SM 4,9,18,24

Ectophylla alba 30 56 SM A 17,21

Enchisthenes hartii 30/30-31 56 ST SM -/A 1,4,9

Mesophylla macconnelli 21/21-22 20 A 1,9,12

Phyllops haitiensis 30-31/30 56 ST ST A/- 21,22

Platyrrhinus lineatus 30 56 ST - 26

P. dorsalis 30 56 ST SM 2

P. helleri 30 56 ST SM 1,4,9

P. infuscus 30 56 ST A 24

P. brachycephalus 30 56 ST SM 2

P. nigellus 30 56 ST A 24

P. recifinus 30 56 ST -

P. vittatus 30 56 ST A 2

Pgloderma bilobatum 30-31

56

M

SM

SM

2

31


Espécies 2n NF X Y Y2 Referências

Sphaeonycteris toxophyllum

28 52 ST SM

17

Stenoderma rufum

30-31

56

ST

A

A

14

Sturnira bidens 30 56 ST A 7

S. erythromos 30 56 ST A 7

S. lilium 30 56 ST SM 1,4,8,9

S. ludovici 30 56 ST SM/A 1,4,8

S. magna 30 56 ST A 24

S. mordax 30 56 - - 17

S. nana 30 56 ST A 24

S. thomasi 30 56 - - 17

S. tildae 30 - ST SM 9

Uroderma bilobatum 38 a 44 44/50 ST/SM SM/M 1,4,9,10,12,15,34

U. magnirostrum 35/36 60-62 SM/SM SM/M 10,12,29

Vampyressa melissa 14 24 ST - 24

V. nymphaea 26 48 ST SM/A 2,17,24

V. pusilla 18/23/22-23/23-24 20/22 ST/A SM/ST 2,17,24

V. bidens 26 48 - - 26

V. brocki 24 44 ST - 26

Vampyrodes caracciolli 30 46 ST SM 2,9

M= Metacêntrico; SM= Submetacêntrico; ST= Subtelocêntrico; A= Acrocêntrico

- = dado não disponível ou não descrito na literatura

Referências: (1) Baker, 1967; (2) Yonenaga, 1968; (3) Baker, 1970; (4) Hsu et al., 1968; (5) Yonenaga et al., 1969; (6)

Beçak et al., 1969; (7) Gardner e O’Neill, 1969; (8) Kibliski, 1969; (9) Baker e Hsu, 1970; (10) Baker e Lopez, 1970; (11)

Baker e Bleier, 1971; (12) Hsu e Berniscke, 1971; (13) Patton e Gardner, 1971; (14) Genoways e Baker, 1972; (15)

Baker e McDaniel, 1972; (16) Hsu e Bernischke, 1973; (17) Baker, 1973; (18) Pathak e Stock, 1974; (19) Stock, 1975;

(20) Hsu et al., 1975; (21) Greenbaum et al., 1975; (22) Nagorsen e Peterson, 1975; (23) Baker e Genoways, 1976; (24)

Gardner, 1977; (25) Baker 1979; (26) Varella-Garcia et al., 1989; (27) Ribeiro et al., 2003; (28) Neves et al., 2001; (29)

Baker et al., 2003; (30) Silva et al., 2005; (31) Lemos-Pinto, 2007;

32


2.4 Marcadores Cromossômicos na Análise Citogenética de Morcegos

Com o desenvolvimento de técnicas de bandeamento cromossômico no início da

década de 70, em especial os bandeamentos Q, G e R, os estudos citogenéticos

foram aperfeiçoados e dessa forma, além de determinarem a morfologia

cromossômica e os números diplóide e fundamental, permitiram identificar cada par

de homólogos, demonstrar homeologias de cromossomos inteiros ou de segmentos

cromossômicos entre diferentes espécies, bem como identificar rearranjos

cromossômicos ocorridos ao longo do processo evolutivo (Sumner, 1990).

Dentre as técnicas atualmente empregadas na análise citogenética de

morcegos, pode-se destacar técnicas básicas como o bandeamento G (Seabright,

1971), que promove a diferenciação longitudinal dos cromossomos, permitindo

identificar cada cromossomo e seus eventuais rearranjos, a técnica de bandeamento

C (Sumner, 1972) que permite definir o padrão de localização da heterocromatina

constitutiva (HC), e a marcação com nitrato de prata (Howell e Black, 1980) que

marca as regiões organizadoras de nucléolos (RONs), indicando a localização

cromossômica dos genes para o RNAr transcricionalmente ativados na intérfase

anterior.

Com o avanço da citogenética, a partir do final dos anos 80, os estudos

citogenéticos em Chiroptera foram ainda mais aperfeiçoados. Análise citogenética

molecular utilizando fluorocromos base-específicos na caracterização da composição

da HC bem como das regiões espaçadoras associadas às RONs têm fornecido

informações úteis para o estudo da evolução cromossômica (Santos e Souza,

1998a,b; Santos et al., 2001; Leite-Silva et al., 2003).

33


A partir do desenvolvimento de novos enfoques citogenéticos utilizando-se

sondas específicas para localização de seqüências cromossômicas através da

hibridização in situ fluorescente (FISH) o estudo citogenético molecular vem

sendo amplamente realizado em diversos grupos de organismos. Em morcegos,

o emprego de sondas de DNA ribossomal e/ou telomérico vem sendo realizado

em algumas espécies. A FISH com sondas de DNAr foi realizada em 15

espécies da família Phyllostomidae (Baker et al., 1992; Santos et al., 2001, 2002)

e três de Molossidae (Leite-Silva et al., 2003), auxiliando no estudo da

variabilidade das RONs em diferentes organismos, uma vez que esta técnica

localiza sítios de DNAr independente de sua atividade (Baker et al., 1992;

Pendás et al., 1993).

Por outro lado, FISH com sondas de DNA telomérico tem sido usada em

várias espécies de morcegos, particularmente nas famílias Phyllostomidae

(Meyne et al., 1990, 2002; Faria e Morielle-Versute, 2002; Volleth et al., 2002;

Ribeiro et al., 2003), Molossidae (Meyne et al., 1990; Finato et al., 2000) e

Vespertilionidae (Ono e Yosida, 1997; Ao et al., 2006).

A análise da citogenética molecular comparativa através da pintura

cromossômica (ZOO-FISH), muitas vezes é complementar ao bandeamento

cromossômico, mostrando-se mais confiável no estudo de espécies relacionadas

que se diferenciaram por diferentes rearranjos cromossômicos. É uma acurada

ferramenta para a determinação de homeologias entre diferentes espécies, e tem

ajudado na compreensão da evolução cariotípica em mamíferos (Scherthan et

al., 1994; Yang et al., 1995; Volleth et al., 1999; Pieczarka et al., 2005; Faria e

Morielle-Versute, 2006).

34


A utilização da ZOO-FISH, tem revelado muitos rearranjos cromossômicos

que levaram à organização no genoma de diferentes espécies de mamíferos e

outros vertebrados. Entretanto, em Chiroptera, dados obtidos pela utilização desta

técnica ainda são raros. Apenas algumas espécies pertencentes a cinco famílias

de Microchiroptera (Mollossidae, Phyllostomidae, Vespertilionidae, Hipposideridae

e Rhinolophidae) e a única família de Megachiroptera (Pteropodidae) foram

estudadas pela pintura cromossômica comparativa (Volleth et al., 1999, 2002;

Pieczarka et al., 2005; Ao et al., 2006; Faria e Morielle-Versute, 2006).

Tais marcadores cromossômicos têm sido amplamente utilizados em

representantes da Ordem Chiroptera em todo o mundo, particularmente em

Phyllostomidae que é bastante representada (Tabela 4). Esses marcadores

aliados aos estudos taxonômicos e filogenéticos têm auxiliado no melhor

entendimento dos mecanismos evolutivos responsáveis pelas divergências

encontradas nos diferentes grupos da ordem Chiroptera (Varella-Garcia et al.,

1989; Souza e Araújo, 1990; Rodrigues et al., 2000; Neves et al., 2001; Pieczarka

et al., 2005; Reis et al., 2007).

A elucidação de aspectos relacionados à filogenia de diferentes grupos tornou-

se possível pelo avanço e melhoramento de vários marcadores citogenéticos, uma

vez que estes permitem identificar rearranjos cromossômicos ocorridos. Dessa

forma, o uso de variadas técnicas citogenéticas bem como a determinação das

diferenças citotaxonômicas existentes entre espécies relacionadas tem sido muito

importante na análise cromossômica evolutiva de diferentes grupos de vertebrados,

particularmente morcegos (Varella-Garcia et al., 1989; Souza e Araújo, 1990;

Santos e Souza, 1998a,b; Rodrigues et al., 2000; Neves et al., 2001; Santos et al.,

2001, 2002; Leite-Silva et al., 2003, Pieczarka et al., 2005).

35


Tabela 4 – Síntese de dados citogenéticos em espécies de Phyllostomidae

Espécies estudadas

2N

NF

Estudos

Referências

Subfamília Macrotinae

Macrotus californicus 40 60 GTG, CBG. 13 M. waterhousii

46 60 Conv., GTG,

CBG. 2,13,50

Subfamília Micronycterinae

Micronycteris brachiots 32 60 GTG, CBG. 13,15,50 M.daviesi 28 52 Conv. 15,50 M.hirsuta 28/30 32 Conv., CBG. 9,10,12,14,48

M.megalotis 40/42 68/70 Conv., GTG, CBG, RON e Fluorocromo

12,25,36,49

M.minuta 28 52 Conv., GTG, CBG 9, 12, 14,25,36

M.nicefori 28 52 Conv., GTG, CBG.

2,13,15,50

M.schmidtorum 38 66 Conv. 15,50 M.sylvestris

22 40 Conv. 15,50

Subfamília Desmodontinae

Desmodus rotundus 28 52 Conv., GTG, CBG, RON e Fluorocromos

12,19, 31,43,52

Diaemus youngii 32 60 Conv., GTG, CBG, e RON.

12,16,20,31

Diphylla ecaudata 32 60 Conv., GTG, CBG, RON e Fluorocromos

12,22,43

Subfamília Lonchorhininae

Lonchorhina aurita

32 60 Conv. 3,9,12,14

Subfamília Phyllostominae

Chrotopterus auritus

28 52 Conv., GTG, CBG e RON.

15,25,32,50,51

Macrophyllum macrophyllum 32 56 Conv. 15,50 Mimon bennettii 30 56 Conv. e GTG. 14,15,50 M.crenulatum

32 60 Conv., GTG e

CBG. 3,7,12,22,25,36

M.koepckeae 32 60 Conv. 15 Phylloderma stenops 32 58 Conv., RON e

FISH 3,9,12,14,25,44

Phyllostomus discolor 32 60 Conv.,GTG, CBG,

RON e FISH 2,3,12,29,33, 40,42,44,52

P.elongatus 32 58 Conv., GTG,

CBG, RON e FISH

13,15,46

P.hastatus 32 58 Conv., GTG, CBG, RON e

FISH

3,18,29,31,36,37, 40,44,52

36


Espécies estudadas 2N NF Estudos Referências

P.latifolius 32 58 Conv. 15,25 Tonatia bidens 16 20 Conv., GTG,

CBG, RON e FISH

2,13,15,44,50

T. brasiliense 30 56 Conv. e GTG. 15,50 T. carrikeri 26 46 Conv. 15,50 T. minuta 30 56 Conv., GTG e

CBG. 2,13,15

T. schulzi 28 36 Conv., GTG e CBG.

15,50

T. silvícola 34 60 Conv. 15,50 T. saurophyla 16 20 Conv., C, G e

RON 2,3,12,23,25,36,49

T. venezuelae 30 56 Conv. 15 Trachops cirrhosus 30 56 Conv, RON e

FISH 9,12,25,44

Vampyrum spectrum 30 56 Conv. 3,9,12,15,50 Subfamília Glossophaginae

Anoura caudifer 30 54/ 56 Conv, GTG, CBG e RON.

9,12,24,44,50

A. cultrata 30 54 Conv. 15,50 A. geoffroyi 30 56 Conv. e GTG 3,15,24,50

Brachyphylla cavernarum 32 60 Conv. 50 B. nana 32 60 GTG e CBG. 13,50

Choeroniscus godmani 19/20 32/36 Conv. 2,15,50 C. intermedius 20 36 Conv, GTG, CBG

e RON. 13,15,50

C. minor 20 36 GTG, CBG e RON.

38,39

Chrotopterus auritus 20 36 G, C e RON 25 Choeronycteris mexicana 16 24/26 Conv. e GTG. 2,5,

Erophylla bombifrons 32 60 Conv. 4 E. cezekorni 32 60 GTG e CBG. 15,54

Glossophaga alticola 32 60 Conv. 2 G. commissarisi 32 60 Conv. 2,50

G.leachii - - Conv. 50 G. longirostris 32 60 Conv. 13,17,50

G. soricina 32

60 Conv., GTG, CBG, RON e

FISH

14,18,24,31,38, 39,44,50

Hylonycteris underwoodi - - GTG. 50 Leptonycteris nivalis - - Conv. 50

L. sanborni 32 60 Conv. e GTG. 2,50 Lampronycteris brachyotis 32 60 G, C e RON 36,49

Lichonycteris obscura 24 44 Conv. 12,15,50 Monophyllus harrisoni - - GTG. 50

M. plethodon - - Conv. 50 M. redmani 32 60 Conv., GTG e

CBG. 4,13,50

Phyllonycteris aphylla 32 60 GTG e CBG. 13,50 P. poeyi

- - Conv. 50

Subfamília Lonchophyllinae Lionycteris spurrelli 28 50/52 Conv., GTG, CBG

e RON. 12,15,24,25,38,39,

50 Lonchophylla robusta 28 50 Conv. 15,50

37



L. thomasi 30/32/36 34/38/40/48

Conv., GTG, CBG e RON.

9,12,15,22,24,25, 38,39,50

Subfamília Carolliinae

Carollia benkeithi 22 38 C, G e RON 27,28,35,46,48 C. brevicauda 20/21 36 Conv., GTG e

CBG. 15,35,37,48,50

C. castanea 22 38 Conv., GTG, CBG e RON.

15,50

C. perspicillata 20/21 36 Conv., GTG, CBG, RON,

Fluorocromo e FISH

2,3, 5,12,13,15,17,18, 28,29,31,34,35,41,

48,51,52 C. subrufa 20/21 36 Conv. 2,50

Subfamília Glyphonycterine

G. sylvestris - - - - G. daviese - - - -

Subfamília Rhinophyllinae

Rhinophylla fischerae 34 56 Conv. 5,12,15,50 R. pumilio

26/34/36 48/56/

62/64 Conv. C, G e RON 5,12,13,14,15,25,

27,34,50,51 Subfamília Stenodermatinae

Ametrida centurio 30/31 56 Conv. 2,12,15,50 Artibeus aztecus - - Conv. 50

A. cinereus 30 56 Conv., GTG, CBG, RON e

FISH

2,12,13,15,42,44, 47,48,50,51

A. concolor 31 56 Conv. 14,15,50 A. fimbriatus 30/31 56 Conv. GTG, CBG,

RON e FISH 44

A. fuliginosus - - Conv. 15,50 A. hartii - - GTG e CBG. 50

A. hirsutus - - Conv. 50 A. inopinatus - - Conv. e CBG. 50

A. jamaicensis 30/31 56 Conv, GTG, CBG, RON e FISH

2,3,4,12,13,15, 29,42,44,49,50,51

A. lituratus 30/31 56 Conv., GTG, CBG, Ag-RON,

FISH

2,4,15,31, 42,44,47,49,

50,51,52 A. obscurus 30/31 56 Conv., CBG,

RON e Fluorocromos.

30

A. Phaeotis

30 56 Conv., GTG e CBG.

13,15,50

A. planisrostris 30/31 56/57/58/59

Conv., GTG, CBG, RON e

FISH

15,17,18,22,31,47,50,51

A. toltecus 30/31 56 Conv. 2,50 A. turpis 30/31 56 Conv. 2

A. watsoni 30 56 Conv., GTG e CBG.

13,50

Centurio senex

28 52 Conv., GTG e CBG.

1,2,3,13,15,50

38



Chiroderma doriae 26 48 Conv., GTG, CBG e RON.

31,50,51,52

C. trinitatum 26 48 RON 2,3,11,15,49,50 C. villosum 26 48 Conv. C, G e RON 1,2,3,13,15,26,31,

49,50,51 C. improvisum - - Conv. 50

C. solvini 26 48 Conv. 15,50 Ectophylla alba - - Conv. 50

Enchisthenes hartii 30/31 56 Conv, GTG e CBG.

1,2,13,15,49

Mesophylla macconnelli 21/22 20 Conv. 2,3,10,12,15,25,50 Phyllops halltensis 30 56 GTG e CBG. 13

Platyrrhinus brachycephalus 30 56 Conv. e G 10,15,49,50 P. dorsalis 30 56 Conv. 15,50 P. helleri 30 56 Conv., G e RON 1,2,15,25,26,49,50

P. infuscus 30 56 Conv. 15,22,50 P. lineatus 30 56 Conv., GTG,

CBG, RON e FISH

17,18,31,52,47, 50,51

P. vittatus 30 56 Conv, GTG e CBG.

13,15,50

Pygoderma bilabiatum 30/31 56 Conv. 15,33,50 Sphaeronycteris toxophyllum 28 52 Conv. 9,12,15,50

Stenoderma rufun 30/31 56 Conv. 50 Sturnira bidens 30 56 Conv. 15,21,50 S. erythromos 30 56 Conv., GTG e

CBG. 13,15,50

S. lilium 30 56 Conv., GTG, CBG, Ag-RON e

FISH

2,13, 15,18,26,29,31,44,

47,49,50,51 S. ludovici 30 56 Conv. 2,15,50 S. magna 30 56 Conv. 15,22,49,50 S. mordax - - Conv. 50 S. tildae 30 56 Conv. e G 3,15,49,50 S. nana 30 56 Conv. 15,50

S. thomasi - - Conv. 50 Uroderma bilobatum 38/39/42/

43/44/49 44/45/48/50

Conv.,C, G, e RON

1,2,3,4,6,8,13, 15,25,27,45,49,50

U. magnirostrum 35/36

62 Conv., GTG, CBG e RON.

4,12,15,27,45,50

Vampyressa bidens 26 48 Conv. 15,22,25,50 V. brocki 26 44 Conv. 10,12,15,22,25,50

V. melissa 14 24 Conv. 15,50 V. nymphae

26 48 Conv., GTG e

CBG. 13,15,50

V. pusilla 18/22/23/24

20/22 Conv., G e RON 9,10,12,13,15, 22,49,50

Referencias: (1) Baker, 1967; (2) Baker, 1970; (3) Baker e Hsu, 1970; (4) Baker e Lopez, 1970; (5) Baker e Bleier, 1971; (6) Baker et al., 1972a; (7) Baker et al., 1972b; (8) Baker e Mc Daniel, 1972; (9) Baker, 1973; (10) Baker et al., 1973; (11) Baker e Genoways,1976; (12) Baker, 1979; (13) Baker e Bickham, 1980; (14) Baker et al., 1981; (15) Baker et al., 1982; (16) Cadena e Baker, 1976; (17) Faria et al, 2000; (18) Faria e Morielle-Versute, 2006; (19) Finato et al., 2000; (20) Forman et al, 1968; (21) Gardner e O’Neil, 1969; (22) Gardner, 1977; (23) Genoways e Willians, 1980; (24) Haiduck e Baker, 1982; (25) Honeycutt et al., 1980; (26) Hsu et al, 1968; (27) Hsu e Berniscke, 1973; (28) Hsu et al., 1975; (29) Kiblisky, 1969; (30) Lemos-Pinto (2007); (31) Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988; (32) Morielle-Versutte et al., 1992; (33) Myers, 1981; (34) Noronha et al., 2004; (35) Patton e Gardner, 1971; (36) Patton e Baker, 1978; (37) Pieczarka et al., 2005; (38) Ribeiro et al, 2000; (39) Ribeiro et al., 2003; (40) Rodrigues et al., 2000; (41) Santos e Souza, 1998a; (42) Santos e Souza, 1998b; (43) Santos et al., 2001; (44) Santos et al., 2002; (45) Silva et al., 2005; (46) Solari e Baker, 2006; (47) Souza e Araújo, 1990; (48) Stock, 1975; (49) Tucker e Bickham, 1986; (50) Varella-Garcia e Taddei, 1989; (51) Varella-Garcia et al., 1989; (52) Yonenaga et al, 1969.

39


2.4.1 Heterocromatina Constitutiva (HC) e Fluorocromos base específicos

Nas células eucarióticas o DNA genômico está associado com proteínas

histônicas e não-histônicas para formar a cromatina. A cromatina desses organismos

está organizada em duas classes distintas denominadas eucromatina e

heterocromatina (Sumner, 2003). A primeira representa regiões cromossômicas que

sofrem alterações estruturais (condensação e descondensação) durante o ciclo

celular, enquanto que a heterocromatina é representada pelas regiões que

permanecem condensadas durante todo o ciclo celular (Sumner, 1990; Wallrath,

1998).

O termo heterocromatina foi criado por Emil Heitz (1928) para indicar a parte da

cromatina que é mais compactada, baseando-se na compactação diferencial na

intérfase. As regiões cromossômicas que contêm uma alta densidade de elementos

de DNA repetitivo como os sítios de seqüências satélites e elementos de

transposição são os principais constituintes da heterocromatina (Wallrath, 1998;

Grewal e Jia, 2007).

Existem dois tipos principais de heterocromatina: a constitutiva (HC) e a

facultativa (HF). A riqueza de DNA satélite determina o estado permanente ou

reversível da heterocromatina, assim como a presença de polimorfismos e as

propriedades de coloração. A HC é estável e conserva as propriedades

heterocromáticas durante todos os estágios do ciclo celular e em todos os tecidos

(Wallrath, 1998; Grewal e Jia, 2007). Por ser altamente polimórfica, a HC pode ter

seu tamanho e localização afetada, embora aparentemente não haja nenhum efeito

fenotípico. Por outro lado, a HF é reversível e pode mudar do estado de

heterocromatina para eucromatina, dependendo do tipo de célula e do estágio de

40


desenvolvimento em que esta se encontra, estando freqüentemente associada a

cromossomos sexuais e diferenciação sexual. O DNA da HC é altamente metilado,

com as metilações ocorrendo exclusivamente nas citosinas, enquanto que o DNA da

HF sofre apenas uma discreta metilação (Mattei e Luciani, 2003).

A heterocromatina difere da eucromatina pela composição de pares de bases

de seu DNA, pela presença de grande parte do DNA satélite, que consiste em um

grande número de pequenas seqüências repetidas em tandem, e por apresentar

replicação tardia em relação à eucromatina, exibindo baixa ou nenhuma atividade

transcricional. O bloqueio da transcrição está associado ao estado altamente

condensado deste tipo de cromatina (Mattei e Luciani, 2003; Sumner, 2003).

Existe uma correlação entre DNA satélite e regiões heterocromáticas, embora

nem toda heterocromatina seja composta por DNA altamente repetitivo. A maior parte

dos segmentos de heterocromatina nos cromossomos de eucariotas contém elevadas

concentrações de DNA repetitivo, que podem variar no comprimento da repetição e

na composição de bases, podendo ser ricos em GC ou AT (Sumner, 1990).

O bandeamento C com Giemsa é um dos procedimentos mais utilizados para

evidenciar a HC em diferentes fases mitóticas e meióticas e núcleos interfásicos de

diferentes grupos de eucariotas. Nesta técnica, o pré-tratamento modifica a estrutura

cromossômica pela extração preferencial de proteínas e DNA eucromático,

fornecendo um padrão característico de bandas. Esta preferência pela extração das

regiões eucromáticas deve estar associada à presença das proteínas não-histônicas

na estrutura e formação da HC, formando um complexo que dificulta a retirada de

DNA heterocromático. Embora o bandeamento C seja eficiente para detectar regiões

de HC, esta técnica nem sempre revela todos os tipos de HC, além de poder

41


evidenciar uma HC fraca ou parcialmente corada. Isto pode estar mais relacionado às

características peculiares da cromatina do que à ausência de HC (Sumner, 2003).

A HC tem localização preferencial em determinadas regiões cromossômicas,

particularmente nas centroméricas ou proximais. A heterocromatina forma blocos de

tamanho variáveis, sendo estes específicos para cada grupo de organismos. Além

disso, têm sido descritos blocos de HC distais e, com menor freqüência, em regiões

intersticiais de determinados cromossomos de algumas espécies (Sumner, 2003).

Os morcegos caracterizam-se por ter HC localizada preferencialmente na região

pericentromérica de todos os cromossomos. Contudo, têm sido descrita ocorrência

adicional desse marcador em regiões teloméricas e intersticiais de poucos

cromossomos em algumas espécies (Varella-Garcia et al., 1989; Varella-Garcia e

Taddei, 1989; Souza e Araújo, 1990).

Dentre as espécies de morcegos que apresentam um padrão de distribuição

de HC restrito às regiões pericentroméricas, destacam-se representantes das

famílias: Phyllostomidae - Phyllostomus hastatus, P. discolor, P. elongatus (Varella-

Garcia et al., 1989; Santos e Souza, 1998b; Rodrigues et al., 2000), Chrotopterus

auritus (Morielle-Versute et al., 1992), Anoura caudifer, Chiroderma villosum, C.

doriae (Varella-Garcia et al., 1989), Lonchorhina aurita e Trachops cirrhosus (Barros,

2006); Molossidae - Molossus molossus e M. ater (Leite-Silva et al., 2003) e

Vespertilionidae - Pipistrellus pipistrellus, P. kuhlii, P. nathusii, Glischropus tylopus e

Lasiurus borealis (Volleth et al., 2001).

A presença de HC nas regiões distais e/ou intersticiais tem sido descrita em

algumas espécies como: Carollia perspicillata, Choeroniscus minor, Glossophaga

soricina, Artibeus lituratus, A. planirostris, A. jamaicensis, A. cinereus, Diaemus

youngi, Desmodus rotundus, Diphylla ecaudata, Anoura caudifer, Uroderma

42


magnirostrum, U. bilobatum, Sturnira lillium e Platyrrhinus lineatus (Baker et al., 1982;

Varella-Garcia et al., 1989; Souza e Araújo, 1990; Santos e Souza, 1998a,b; Volleth

et al., 1999; Neves et al., 2001; Santos et al., 2001; Silva et al., 2005). De acordo

com Van Den Bussche et al., (1995) as diferenças na quantidade e localização dos

blocos heterocromáticos desempenham um importante papel de variação

cromossômica na ordem.

A análise de HC tem contribuído na diferenciação de espécies que são

morfologicamente semelhantes, como é o caso de Artibeus obscurus, A. lituratus e A.

jamaicensis que apresentaram HC nas regiões pericentroméricas de todos os

cromossomos, na região distal (braço curto) dos subtelocêntricos 5, 6, 7, 9 e no

cromossomo X. Adicionalmente, em A. jamaicensis foi observada HC intersticial nos

braços longos dos pares 1, 2, 3, e distal nos braços curtos do par 13. Nas três

espécies analisadas foi observada uma coloração diferencial da cromatina do

cromossomo X, quando comparada com a do restante do complemento cariotípico.

Os acrocêntricos Y1 e Y2 mostraram-se quase inteiramente heterocromáticos,

principalmente o Y original do complemento (Souza e Araújo, 1990; Santos e Souza

1998b).

Neves et al. (2001), analisando o cariótipo de Choeroniscus minor

(Glossophaginae), verificaram a presença de heteromorfismo em relação à HC: um

dos homólogos do par 1 tem dois blocos de HC separados por um pequeno

segmento eucromático. Também foi observada a presença de um segmento adicional

no braço curto do par 2, enquanto o par 3 apresentou um pequeno bloco extra na

região pericentromérica do braço longo em um dos homólogos, enquanto o outro

homólogo tem HC localizada na região proximal do braço longo. Considerando esse

padrão, os autores sugeriram a ocorrência de inversões paracêntricas.

43


O padrão de distribuição de HC em duas espécies do gênero Uroderma

(Stenodermatinae) foi analisado por Silva et al. (2005). Uroderma magnirostrum

(2n=36, NF=62) mostrou blocos de HC nas regiões pericentroméricas de todos os

autossomos e adicionalmente, blocos distais nos braços curtos de todos os

cromossomos submetacêntricos. Nesta espécie, foi detectado heteromorfismo para

HC no par 5 (bloco intersticial no braço curto) e no par 6 (bloco proximal no braço

longo). No cromossomo X foram observados blocos de HC centromérico e terminal

no braço curto. O Y submetacêntrico apresentou HC no braço longo. O bandeamento

C em U. bilobatum (2n=42, NF=50) revelou padrão diferencial quando comparado

com U. magnirostrum. Este padrão corresponde à HC em regiões pericentroméricas

de todos os autossomos e na posição distal dos braços curtos dos pares 1 e 2

submetacêntricos. O cromossomo X mostrou blocos centromérico e terminal de HC e

o Y apresentou um bloco no braço longo.

Em alguns representantes da ordem Chiroptera com sistema sexual simples, em

geral, o cromossomo Y apresenta-se quase totalmente heterocromático. Do mesmo

modo, aqueles que têm sistema sexual múltiplo exibem o Y1 (Y original)

heterocromático, diferindo apenas pela presença de blocos característicos do Y2

(homólogo livre do autossomo translocado ao Xp). Por outro lado, as espécies que

apresentam sistema sexual composto do tipo neo-XY, destacam-se pela presença

simultânea de dois padrões distintos de HC nos braços curto e longo do Y. Na

subfamília Stenodermatinae, várias espécies apresentam blocos pericentroméricos

de HC no cromossomo X, adicionalmente o braço longo deste cromossomo mostra

um padrão diferencial de sua cromatina (Souza e Araújo, 1990; Morielle-Versute et

al., 1992; Santos e Souza, 1998 a,b; Rodrigues et al., 2000; Santos et al., 2001).

44


Uma variedade de fluorocromos tem sido utilizada para produzir padrões de

diferenciação cromossômica em animais e plantas. Esses fluorocromos podem ser

agrupados de acordo com sua afinidade pelos pares de bases AT ou GC do DNA. No

primeiro grupo estão incluídos os que são específicos para os pares de bases AT e

no segundo aqueles que têm afinidade pelos pares de bases GC (Schweizer, 1976).

Em alguns casos, esses corantes são associados a outros marcadores que podem ou

não ser fluorescentes (contracorantes) para obtenção de resultados diferenciados

(Sumner, 1990; Verma e Babu, 1995).

O uso de fluorocromos base-específicos como uma forma alternativa no estudo

da HC tem sido importante para determinar sua qualificação e heterogeneidade. O

DAPI e o CMA3 têm sido utilizados na caracterização das regiões heterocromáticas

ricas em AT ou GC, que foram aparentemente homogêneas no bandeamento C. O

uso desses corantes pode ou não estar associado a um pré-tratamento. Quando não

há tratamento prévio, os fluorocromos podem revelar padrões de bandas G e R

(Schmid, 1980; Schweizer, 1980; Sola et al., 1992; Bella e Gonsálvez, 1994). Por

outro lado, a associação dos fluorocromos ao pré-tratamento para o bandeamento C

(CB-CMA3/CB-DAPI) tem revelado diferentes tipos de HC (Bella e Gonsálvez, 1994;

Dio Meo et al., 1998; Santos e Souza, 1998a,b; Santos et al., 2001; Swarça et al.,

2003; Barros, 2006).

O emprego de fluorocromos na análise comparativa de cromossomos tem sido

realizado e tem revelado diferenças de composição na cromatina e na HC de

diferentes organismos. Em peixes, a combinação do CMA3 ou DAPI com o

bandeamento C tem mostrado blocos fluorescentes adicionais aos observados com

CMA3 e DAPI sem tratamento prévio, sugerindo uma modificação na estrutura da

cromatina pelo pré-tratamento, que pode aumentar a instabilidade do CMA3 e DAPI

45


(Artoni et al., 1999; Swarça et al., 2003; Kavalco et al., 2004). Em algumas espécies

de anfíbios, os blocos fluorescentes correspondentes àqueles vistos pelo

bandeamento C tem apresentado diferentes respostas aos fluorocromos, indicando

uma variedade na composição da HC de um mesmo cromossomo (Herrero et al.,

1993; Schimid et al., 2002).

Em morcegos, ainda há poucos trabalhos usando fluorocromos base-

específicos. Apenas três espécies da família Molossidae (Molossus ater, M. molossus

e Mollosops planirostris), sete de Phyllostomidae (Carollia perspicillata, Phyllostomus

discolor, Artibeus liturartus, A. jamaicensis, A. cinereus, Desmodus rotundus e

Dyphylla ecaudata) e três de Vespertilionidae (Lasiurus intermedius, Scotophilus

dignii e S. viridis) foram estudadas com esse enfoque, permitindo uma melhor

qualificação da eucromatina e da HC (Ruedas et al., 1990; Santos e Souza, 1998a,b;

Santos et al., 2001; Leite-Silva et al., 2003).

Na família Phyllostomidae, em geral, a tríplice coloração CMA3/DA/DAPI tem

realçado os padrões de bandas R (ricas em GC) com CMA3, revelando uma coloração

uniforme ao longo dos cromossomos ou um fraco padrão de bandas G (ricas em AT)

com o DAPI (Ruedas et al., 1990; Santos e Souza, 1998a,b; Santos et al., 2001;

Barros, 2006). Por outro lado, em A. lituratus, A. jamaicensis, A. cinereus, P. discolor,

D. rotundus e D. ecaudata, esse tipo de coloração revelou padrões de bandas R

(positivas para o CMA3) em todas as espécies. O DAPI mostrou uma coloração

uniforme, contudo, em P. discolor foi possível detectar pequenos blocos DAPI-

positivos nas regiões pericentroméricas de alguns cromossomos. No cariótipo de C.

perspicillata a tríplice coloração CMA3/DA/DAPI mostrou blocos CMA3-positivos

restritos às regiões pericentroméricas e blocos DAPI-positivos na região intersticial e

distal de alguns cromossomos (Santos e Souza, 1998a,b; Santos et al., 2001).

46


Santos et al. (1998b) analisaram comparativamente a composição da HC em

relação aos pares de bases GC e/ou AT em três espécies do gênero Artibeus e em

Phyllostomus discolor. Lâminas pré-tratadas para o bandeamento C com Giemsa

(CBG) e coradas com o DAPI (CB-DAPI) das três espécies do gênero Artibeus

mostraram um padrão de HC similar ao obtido pelo bandeamento C. A coloração

diferencial, detectada pelas duas técnicas, no braço longo do cromossomo X das três

espécies, sugerem a ocorrência de uma cromatina dispersa com diferentes

propriedades estruturais da cromatina pericentromérica e telomérica do genoma. Por

outro lado, a coloração CB-CMA3 de duas espécies analisadas evidenciou blocos

CMA3-positivos na região telomérica do braço curto de alguns autossomos e no braço

longo do Y1. Além disso, essa coloração mostrou apenas um padrão de bandas R em

P. discolor. Essa resposta diferencial aos fluorocromos base-específicos mostra uma

variabilidade na composição da cromatina em representantes de Phyllostomidae

(Santos et al., 1998a,b; Santos et al., 2001).

2.4.2 Regiões Organizadoras de Nucléolo (RONs)

O nucléolo é um compartimento subnuclear de células eucarióticas no qual

ocorre síntese de RNA ribossomal (RNAr) e biogênese dos ribossomos (Busch e

Smertana, 1970). No nucléolo estão localizados os genes que são transcritos a RNAr.

Durante a divisão celular ocorre o rompimento do nucléolo, que é uma das

características mais marcantes do ciclo celular. Contudo, os sítios cromossômicos

onde se situam os genes para transcrição de DNAr geralmente permanecem visíveis

como uma constrição. A síntese de RNAr é completamente inibida até o final da

divisão celular, onde ocorre o reaparecimento do nucléolo seguido da retomada da

47


síntese. Nenhum outro tipo de gene ativo, exceto os de RNAr, foi descrito fazendo

parte do nucléolo (Hernadez-Verdun et al., 2002; Sumner, 2003; Raska et al., 2004).

As células somáticas de eucariotas superiores contêm de dez a mil genes

ribossomais. Esses genes encontram-se repetidos em tandem, podendo formar

grupos em apenas um ou mais cromossomos, existindo em dois tipos distintos de

cromatina: aquela que permite a transcrição (eucromatina) e a que é

transcripcionalmente inativa (heterocromatina). Os mecanismos que estabelecem e

mantêm o estado ativo ou inativo dos loci de DNAr ainda são pouco entendidos

(Santoro et al., 2002; Raska et al., 2004).

Os sítios cromossômicos onde se situam os genes para transcrição do DNAr são

denominados regiões organizadoras de nucléolos (RONs). O RNAr é sintetizado e

processado em pré-ribossomos existentes no nucléolo, e em seguida torna-se parte

de ribossomos maduros localizados no citoplasma. Em eucariotas superiores, as

seqüências de RNAr encontram-se organizadas em duas classes de genes. Na

primeira, estão os principais genes de RNAr (18S, 5.8S e 28S), que consistem de

várias cópias de um segmento de aproximadamente 40kb que se encontram em

sítios específicos nos cromossomos, denominados RONs. A segunda classe

compreende os genes de RNA 5S que ocorrem, em geral, em apenas um par

cromossômico podendo apresentar vários locus (Sumner, 1990). Cada unidade de

repetição das múltiplas cópias que compõem os genes de RNAr, contém uma

seqüência de transcrição envolvida por seqüências espaçadoras não transcritas,

denominadas espaços intergênicos (Raska et al., 2004).

As RONs são importantes marcadores para o estudo da evolução

cromossômica. O método citogenético mais utilizado na detecção da posição dessas

regiões ativas em cromossomos utiliza o nitrato de prata (AgNO3), que tem uma alta

48


afinidade pelas proteínas nucleolares. Contudo, esta técnica evidencia apenas as

RONs que se encontram transcripcionalmente ativas na intérfase anterior, visto que a

técnica tem como princípio a reação do AgNO3 com as proteínas ácidas

(ribonucleoproteínas) remanescentes da organização nucleolar que se encontram

associadas ao DNAr. Dessa forma, o uso da coloração com AgNO3 tem tido uma

maior importância para o estudo da expressão dos genes ribossomais do que para

sua localização (Sumner, 2003).

RONs de vários grupos de vertebrados também têm sido analisadas através de

fluorocromos GC-específicos (CMA3 e MM) e/ou pela hibridização in situ fluorescente

(FISH) através do uso de sonda de DNA ribossomal, particularmente em mamíferos

(Stitou et al., 2000; Svartman e Vianna-Morgante, 2003), anfíbios (Schmid et al.,

1995; Lourenço et al., 2000) e peixes (Tigano et al., 2004; Gromicho et al., 2005). A

FISH para genes ribossomais tem permitido uma maior compreensão quanto à

variabilidade de genes de DNAr, podendo ser usada na localização destas

seqüências independente de estarem ou não ativas no genoma, visto que a

marcação por esta técnica independe da presença do produto de transcrição (Porter,

1994).

A coloração com AgNO3 em associação com fluorocromos CMA3 e DAPI tem

sido utilizada para qualificar as regiões intergênicas associadas às RONs quanto a

sua composição de pares de bases CG e AT, uma vez que os genes que codificam os

RNAr 18S, 5.8S e 28S estão separados por espaçadores transcritos internos (ITS) e

externos (IGS ou ETS). Os ITSs são geralmente compostos de seqüências repetitivas

ricas em pares de bases GC, o que justifica a detecção das regiões organizadoras de

nucléolos através do emprego de fluorocromos GC-específicos (Torres et al., 1990;

King, 1991).

49


Em representantes da família Phyllostomidae, a coloração seqüencial

AgNO3/CMA3/DAPI tem evidenciado uma composição diferencial nessas regiões. Nas

espécies Artibeus lituratus, A. jamaicensis, Desmodus rotundus e Diphylla ecaudata

essas regiões mostram-se positivas para o CMA3 e neutras para o DAPI, enquanto

que Carollia perspicillata e Phyllostomus discolor mostraram que essas regiões são

CMA3 neutras e DAPI negativas (Santos e Souza, 1998a,b; Santos et al., 2001).

Em Phyllostomidae, ocorre uma grande incidência de espécies com RONs em

apenas um par autossômico indicando que esse padrão pode ser considerado como

uma condição ancestral para a família. Entretanto, a presença de RONs múltiplas tem

sido descrita no gênero Choeroniscus (Baker et al., 1992; Neves et al., 2001) e na

espécie Lonchophylla thomasi (Ribeiro et al., 2003), pertencentes à subfamília

Glossophaginae, bem como em espécies pertencentes à subfamília

Stenodermatinae, como é o caso do gênero Uroderma (Silva et al., 2005),

Chiroderma doriae (Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988) e do gênero Artibeus

(Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988; Souza e Araújo, 1990), que tem como

característica mais freqüente a presença de RONs em três pares autossômicos,

provavelmente originada por fragmentação e amplificação de seqüências de DNAr

(Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988).

As RONs podem estar localizadas nas regiões distais ou intersticias dos

cromossomos, estando geralmente em suas constrições secundárias. Este padrão de

RONs localizadas nas contrições secundárias é comum no cariótipo de vertebrados e

foi descrito como sendo uma condição ancestral para o grupo (Hsu et al., 1975). Em

morcegos, essa relação entre RONs e constrições secundárias têm sido observada

em algumas espécies (Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988; Santos e Souza,

1998ª; Santos et al., 2002).

50


Em Phyllostomidae, é comum a presença de variabilidade no número de RONs

ativas por células em espécies portadoras de RONs múltiplas, nas quais geralmente

as freqüências de marcações por metáfases diferem de forma significativa entre

indivíduos e espécies. Contudo, pouca variabilidade tem sido observada em espécies

que possuem apenas um par de RONs por célula. Essas diferenças relacionadas ao

número e localização das RONs indicam que essas regiões estão freqüentemente

envolvidas em rearranjos cromossômicos, desta forma esses marcadores podem ser

utilizados como ferramenta para avaliação de relações filogenéticas quando estão

envolvidos em algum rearranjo cromossômico (Souza e Araújo, 1990; Santos et al.,

2002).

Em geral, o número e a localização das RONs são característicos de

espécies e populações, embora variações interindividuais dessas regiões tenham

sido observadas em vários organismos, particularmente morcegos. Em

Phyllostomidae, também ocorre variação intraespecífica na atividade dessas regiões,

sugerindo que esses marcadores cariotípicos podem ser úteis na compreensão dos

mecanismos de evolução cromossômica na família. Além disso, a análise de várias

espécies através da técnica Ag-RON tem permitido concluir que esses organismos

apresentam uma grande variabilidade de número de RONs. Em Chiroptera, Myotis

myotis (Vespertilionidae) exibe o maior número de RONs, estando estas localizadas

em 14 pares de autossomos (Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988; Souza e

Araújo, 1990; Santos e Souza, 1998b; Santos et al., 2002).

Comparando-se o número de cromossomos com RONs marcadas e o número

de nucléolos por núcleo marcado por célula, verifica-se a freqüente ocorrência de

associação de RONs ativas na formação de um único nucléolo, fenômeno

denominado fusão nucleolar. Dessa forma, os cromossomos que se encontram

51


envolvidos na organização dos nucléolos durante a intérfase podem permanecer

associados na metáfase, servindo como evidência da associação nucleolar

(Anastossova-Kristeva, 1977).

Embora a presença de RONs em cromossomos sexuais seja considerada

incomum, estudos mostram a presença dessas estruturas em cromossomos sexuais

de alguns mamíferos, em especial em duas espécies de morcegos da subfamília

Carollinae: Carollia perspicillata (cromossomo X) e C. castanea (cromossomos X e

Y), que apresentaram RONs unicamente nesses cromossomos (Hsu et al., 1975;

Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988; Santos e Souza, 1998a).

Santos et al., (2002) analisando treze espécies de filostomídeos pertencentes

aos gêneros Artibeus, Glossophaga, Phyllostomus, Phylloderma, Platyrrhinus,

Tonatia e Trachops, descreveram a localização das RONs utilizando a marcação com

AgNO3 para detectar os sítios que se encontravam ativos, e usaram a FISH com

sonda de DNAr 18S para confirmar a localização dos sítios de genes de RNAr. Nove

das 13 espécies analisadas apresentaram apenas um par cromossômico com RON

ativa, enquanto A. cinereus, A. jamaicensis, A. fimbriatus e A. lituratus apresentaram

múltiplas RONs ativas, variando de dois a três pares. A FISH confirmou o número e a

posição das RONs em todas as espécies, com exceção de A. cinereus, que

apresentou sinais de hibridização em um par cromossômico a mais, indicando a

ocorrência de RONs silenciosas.

52


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66


4. Manuscrito de Artigo Científico

Heterogeneidade da heterocromatina constitutiva e das

seqüências intergênicas associadas às RONs em três espécies

de morcegos (Phyllostomidae, Chiroptera).

Manuscrito a ser encaminhado à revista

Micron: The International Research

and Review Journal for Microscopy

ISSN: 0968-4328

67

http://www.sciencedirect.com/science/journal/09684328



Heterogeneidade da heterocromatina constitutiva e das seqüências intergênicas

associadas às RONs em três espécies de morcegos (Phyllostomidae, Chiroptera).

.

Calixto, M.S., Santos, N. & Souza. M.J.

Departamento de Genética, Centro de Ciências Biológicas/CCB, Universidade

Federal de Pernambuco/UFPE, Av. Professor Moraes Rego, Nº 1235, CEP

50670-901, Recife, Pernambuco, Brasil; (Fone: +55-81-21268520, e-mail:

[email protected]

*Autor para correspondência: Departamento de Genética, Centro de Ciências

Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Av. Prof. Moraes do

Rego Nº 1235, Cidade Universitária, CEP: 50732 -970, Recife, Pernambuco,

Brasil. Fone: +55 81 21268520; e-mail: [email protected]

68


Resumo

Cromossomos mitóticos de Glossophaga soricina (2n=32,XY;NF=60),

Platyrrhinus lineatus e Sturnira lilium (2n=30,XY; NF=56) foram analisados

através da coloração convencional, bandeamento C, marcação com nitrato de

prata (AgNO3) e fluorocromos base-específicos. Dados da análise convencional

obtidos para as três espécies estão de acordo com aqueles descritos na

literatura, exceto pela morfologia do cromossomo Y de P. lineatus, indicando

variação cromossômica geográfica para a espécie. Os blocos de HC na região

distal do braço curto dos pares 5, 6, 7 e cromossomo X, observados pelo

bandeamento C, em P. lineatus e S. lilium, além da coloração diferencial

observada na cromatina presente no braço longo do X de Sturnira lilium

correspondem a um padrão compartilhado por alguns representantes de

Stenodermatinae. As respostas diferenciais obtidas com os fluorocromos base-

específicos CMA3 e DAPI confirmaram a heterogeneidade da HC e das

seqüências intergênicas associadas às RONs quanto à sua composição de

pares de bases. Contudo, a fraca marcação CMA3+

nas regiões heterocromáticas

pericentroméricas e distais de alguns cromossomos indica uma predominante

associação de heterocromatina com seqüências ricas em pares de bases GC.

Esses resultados sugerem a necessidade de uma ampliação no número de

espécies estudadas com esse enfoque, visando um melhor entendimento da

expansão diferencial das seqüências repetitivas (ricas em AT ou GC) dentro da

família Phyllostomidae.

Palavras-chave: Phyllostomidae, bandeamento C, AgNO3, CMA3, DAPI

69


Introdução

Sturnira lilium e Platyrrhinus lineatus pertencem à subfamília

Stenodermatinae considerada detentora da maior biodiversidade de gêneros e

espécies, quando comparada com as demais subfamílias da ordem Chiroptera

(Wetterer et al., 2000; Jones et al., 2002; Baker et al., 2003). Stenodermatinae é

a maior subfamília de Phyllostomidae, estando representada por 17 gêneros e 67

espécies (Reis et al., 2007) com distribuição na América Central e do Sul, indo

do centro do México ao Sul do Uruguai (Wetterer et al., 2000; Jones et al., 2002;

Baker, et al., 2003). Seus representantes são importantes dispersores de

sementes, sendo essenciais para a regeneração de florestas e colonização de

novas áreas de plantas (Alttringham, 1996).

Glossophaginae compreende a segunda maior subfamília dos

filostomídeos, estando representada por 13 gêneros e 33 espécies, distribuídas

nas Américas Central e do Sul, indo desde o Sul do México ao Sul do Brasil.

(Ribeiro et al., 2003). Esta subfamília apresenta uma classificação sistemática

bastante discutível, considerando que dados morfológicos, imunológicos e

citogenéticos têm indicado uma possível origem polifilética para o grupo (Baker

et al., 2003; Ribeiro et al., 2003).

Em morcegos, os dados cariotípicos revelados pelos bandeamentos G

bem como pela marcação com nitrato de prata têm indicado uma evolução

cromossômica conservativa (Baker e Bickham, 1980; Souza e Araújo, 1990;

Neves et al., 2001; Leite-Silva et al., 2003; Ribeiro et al., 2003). Entretanto,

desde que o bandeamento C foi descrito por Sumner (1972) como um método

eficiente para identificação cromossômica da heterocromatina constitutiva (HC),

70


seu emprego na análise da HC em Phyllostomidae tem revelado variabilidade

quanto à localização deste marcador entre as espécies, ainda que a localização

preferencial da HC seja nas regiões pericentroméricas dos cromossomos

(Santos e Souza, 1998a,b; Neves et al., 2001; Santos et al., 2001).

Em morcegos, as RONs são importantes marcadores para o estudo da

evolução cromossômica. O método de análise cromossômica mais utilizado na

detecção dos sítios ativos utiliza a marcação com AgNO3 (Morielle-Versute e

Varella-Garcia, 1988; Varella-Garcia e Taddei, 1989; Souza e Araújo, 1990;

Baker et al., 1992; Santos e Souza, 1998a,b). Os genes que codificam os RNAr

18S, 5.8S e 28S estão separados por regiões espaçadoras, geralmente

compostas de seqüências repetitivas ricas em pares de bases GC, que podem

ser detectadas através do emprego de fluorocromos GC-específicos (Torres et

al., 1990; King, 1991). Em representantes da família Phyllostomidae, a

coloração seqüencial AgNO3/CMA3/DA/DAPI tem evidenciado uma composição

de pares de bases diferencial nessas regiões (Santos e Souza, 1998a,b; Santos

et al., 2001).

O emprego de fluorocromos base-específicos na análise cromossômica

tem revelado padrões diferenciais na cromatina (eucromatina e heterocromatina)

e nas seqüências intergênicas associadas às RONs de diferentes organismos,

particularmente peixes (Kavalco et al., 2004), aves (Mayr et al., 1990), roedores

(Burgos et al., 1990), anfíbios (Schimid et al., 2002) e primatas (Pieczarka et al.,

2000; 2001). Em morcegos, apenas poucas espécies tiveram a heterocramatina

e as seqüências intergênicas presentes nas RONs analisadas com esses

corantes fluorescentes, os quais têm evidenciado uma composição de pares de

71


bases diferencial nessas regiões (Bickham, 1987; Ruedas et al. 1990; Santos e

Souza,1998a,b; Santos et al., 2001; Santos et al., 2002; Leite-Silva et al., 2003)

Neste trabalho, os cariótipos de P. lineatus, S. lilium e G. soricina

provenientes da região Nordeste do Brasil, foram analisados pelo bandeamento

C, coloração com AgNO3, CMA3/DA/DAPI e coloração seqüencial

AgNO3/CMA3/DA/DAPI. Os dados obtidos reforçam a heterogeneidade da HC

quanto à sua composição (rica em AT e/ou GC) e ratificam as características

particulares das seqüências intergênicas associadas às RONs (em geral, CMA3

positiva) na família Phyllostomidae. No conjunto, esses resultados fornecem

subsídios para um melhor entendimento sobre a evolução cromossômica desta

família.

Material e Métodos

As análises cromossômicas foram realizadas a partir de preparações

diretas de medula óssea em 18 indivíduos de Platyrrhinus lineatus (3 fêmeas e

15 machos), nove de Sturnira lilium (2 fêmeas e 7 machos) e 13 de Glossophaga

soricina (4 fêmeas e 9 machos). Os exemplares analisados foram capturados em

municípios dos Estados de Pernambuco e Bahia, no Nordeste do Brasil (Tabela

1).

O bandeamento C (CBG) e a marcação com AgNO3 foram realizados de

acordo com Sumner (1972) e Howell e Black (1980), respectivamente, com

pequenas modificações em relação ao tempo de exposição da lâmina em cada

reagente. A tríplice coloração CMA3/DA/DAPI foi realizada de acordo com

Schweizer (1980), com algumas modificações (Santos e Souza, 1998a). Para a

coloração seqüencial AgNO3/CMA3/DA/DAPI as lâminas foram coradas com

72


AgNO3 de acordo com Howell e Black (1980), e depois de fotografadas foram

descoradas segundo Guerra (1991) e coradas com CMA3/DA/DAPI (Schweizer,

1980).

Tabela 1 – Espécies de morcegos, localidades de coleta, coordenadas

geográficas e número de indivíduos analisados.

Espécies Localidades Coordenadas Nº de indivíduos

Platyrrhinus lineatus

Aldeia -PE Andaraí -BA Caruaru -PE Igarassu -PE Ipojuca-PE Recife-PE Rio de Contas -BA Saloá-PE

8º 1’ 18”; 34º 58’ 52” 12º 45’ 26”; 41º 10’ 53” 8º 17’ 0”; 35º 58’ 34” 7º48’45’’S; 34º56’15’’ 8º26’15’’S; 35º03’45’’ 8º 3’ 14”; 34º 52’ 52” 13º 34’ 44”; 41º 48’ 41” 8º 58’ 33”; 36º 41’ 15”

2 3 1 2 2 2 3 3

Sturnira lilium Aldeia-PE Igarassu-PE Ipojuca-PE Saloá-PE

8º 1’ 18”; 34º 58’ 52” 7º48’45’’S; 34º56’15’’ 8º 23’ 56”; 35º 3’ 50” 8º 58’ 33”; 36º 41’ 15”

4 1 2 2

Glossophaga soricina

Aldeia-PE Caruaru-PE Ipojuca-PE Rio de Contas -BA Saloá-PE Saltinho-PE Toritama-PE

8º 1’ 18”; 34º 58’ 52” 8º 17’ 0”; 35º 58’ 34” 8º26’15’’S; 35º03’45’’ 13º 34’ 44”; 41º 48’ 41” 8º 58’ 33”; 36º 41’ 15” 5º 43’ 35”; 35º 6’ 17” 8º 0’ 24”; 36º 3’ 24”

1 1 2 1 3 3 2

73


Resultados

Coloração convencional

Sturnira lilium e Platyrrhinus lineatus apresentaram número diplóide 2n=30,XY e

número fundamental (NF) igual a 56, com cromossomos meta-submetacêntricos

(1-4, 8,10-14) e subtelocêntricos (5,6,7,9 e X). O cromossomo Y é um pequeno

subtelocêntrico em P. lineatus (Fig. 1a) e metacêntrico em S. lilium (Fig. 1b). O

número diplóide de Glossophaga soricina foi 2n=32,XY e NF=60 com a

morfologia cromossômica constituída por meta-submetacêntricos (1-10, 14 e X),

subtelocêntricos (11-13) e acrocêntricos (15 e Y), sendo o Y um pequeno

acrocêntrico (Fig.1c).

Bandeamento C e marcação com nitrato de prata

O bandeamento C revelou HC pericentromérica em todos os cromossomos das

três espécies (Fig. 2 a-b e 3a-c). Adicionalmente, blocos intersticiais de HC

foram visualizados nos pares 1, 2, 3, 5, 6, 7 e 8 em P. lineatus, na região distal

dos braços curtos dos subtelocêntricos (5, 6, 7, 9 e X) em P. lineatus (Fig. 2a e

3a) e S. lilium (Fig. 2b e 3b) e na região distal do braço longo do Y de G. soricina

(Fig. 3c). Em S. lilium o braço longo do X apresentou uma coloração diferencial

e o cromossomo Y foi quase totalmente marcado (Fig. 2b e 3b) e P. lineatus

apresentou bloco adicional de HC na região distal do braço longo do Y (Fig. 2a e

3b). As Ag-RONs foram localizadas na região distal do braço curto do

cromossomo 7 em P. lineatus (Fig. 4a) e S. lilium (Fig. 4d) e na constrição

secundária do braço longo do par 15 em G. soricina (Fig. 4g).

74


Fluorocromos base específicos (CMA3 e DAPI)

A tríplice coloração CMA3/DA/DAPI revelou um padrão de bandas R com o

CMA3 em P. lineatus (Fig. 4b), S. lilium (Fig. 4e) e G. soricina (Fig. 4h), além de

uma fraca marcação na região pericentromérica de alguns cromossomos.

Adicionalmente, foi observado um bloco CMA3 positivo na região

pericentromérica do cromossomo X de S. lilium (Fig. 4e). O uso do DAPI revelou

uma coloração uniforme nos cromossomos de P. lineatus (Fig. 4c) e G. soricina

(Fig. 4i), enquanto que em S. lilium (Fig. 4f) exibiu um fraco padrão de bandas G

e uma marcação na região centromérica nos pares 5, 6 e 7. A coloração

seqüencial AgNO3/CMA3/DA/DAPI evidenciou uma correspondência entre as

regiões CMA3 positivas com os sítios marcados pelo AgNO3 em P. lineatus (Fig.

4a-c), S. lilium (Fig. 4d-f) e G. soricina (Fig. 4g-i). Contudo, em S. lilium o CMA3

apresentou um fraco sinal fluorescente (Fig. 4e). Nas três espécies esses sítios

apresentaram-se DAPI negativos (Fig. 4c,f,i).

Discussão Os dados cariotípicos obtidos, referentes aos números diplóide e

fundamental, morfologia cromossômica e sistema sexual de G. soricina e S.

lilium, estão de acordo com aqueles previamente descritos na literatura (Varella-

Garcia e Taddei, 1989; Souza e Araújo, 1990; Volleth et al., 1999; Santos et al.,

2002). Contudo, em P. lineatus foi observada uma divergência quanto à

morfologia do cromossomo Y em relação à descrita por Tucker (1986) para o

gênero Vampyrops (= Platyrrhinus) que descreveu o mecanismo sexual de

espécies dos gêneros Vampyrops (= Platyrrhinus), Chiroderma, Sturnira,

Uroderma e Vampyressa como do tipo Neo-XY. Este sistema composto teria

75


sido derivado de fusão entre os cromossomos Y1 e Y2 (sistema múltiplo)

resultando na formação de um Y metacêntrico. Nos exemplares de P. lineatus

aqui analisados, entretanto, este cromossomo corresponde a um pequeno

subtelocêntrico diferente daquele descrito por Tucker (1986) como metacêntrico

em exemplares coletados na Costa Rica, Peru e Trinidad. A morfologia

subtelocêntrica para o cromossomo Y é uma condição incomum entre os

morcegos filostomídeos, sendo observada em apenas alguns representantes

(Baker e Hsu, 1970; Baker, 1973; Nargosen e Peterson, 1975; Baker e

Genoways, 1976). Dessa forma, nossos resultados indicam uma variação

cromossômica geográfica para P. lineatus.

O padrão pericentromérico de distribuição de HC revelado pelo

bandeamento C nas espécies aqui analisadas coincide com o observado na

maioria dos representantes da família Phyllostomidae (Varella-Garcia et al.,

1989; Souza e Araújo, 1990; Santos et al., 1998a, b; Santos et al., 2001). Além

disso, os blocos adicionais de HC na região telomérica do braço curto dos pares

5, 6, 7 e cromossomo X em P. lineatus e S. lilium correspondem a um padrão

compartilhado por alguns representantes de Stenodermatinae (Tabela 1)

(Varella-Garcia et al. 1989; Souza e Araújo, 1990; Santos e Souza, 1998b).

Adicionalmente, a coloração diferencial presente no braço longo do cromossomo

X de S. lilium representa uma característica de alguns representantes de

Stenodermatinae, particularmente do gênero Artibeus (Souza e Araújo, 1990;

Santos e Souza, 1998b; Santos et al., 2001), indicando a ocorrência de uma

cromatina dispersa, com propriedades estruturais diferentes da cromatina da

região pericentromérica e telomérica do genoma dessas espécies.

76


Embora P. lineatus e S. lilium apresentem semelhanças quanto ao padrão

pericentromérico e distal de HC, diferenças foram observadas em relação à

presença de blocos intersticiais em P. lineatus e a coloração diferencial do braço

longo do cromossomo X de S. lilium (Figura 2a, b e Tabela 2).

A localização das RONs observadas pela marcação com AgNO3 no par 7

em P. lineatus e S. lilium e no par 15 em G. soricina coincide com dados da

literatura (Morielle-Versute e Varella-Garcia, 1988; Souza e Araújo, 1990),

representando uma condição ancestral para a família Phyllostomidae. Em

morcegos, o padrão de RONs ativas tem sido evidenciado pelo AgNO3, devido a

sua afinidade pelos remanescentes nucleolares presentes nesses sítios (Volleth

1987; Morielle-Versute e Varella-Garcia 1988; Souza e Araújo 1990), e também

pelo CMA3, pela associação aos pares de bases GC comumente presentes nas

regiões intergênicas das RONs (Santos e Souza 1998a,b; Santos et al., 2001;

Leite-Silva et al., 2003).

Os fluorocromos base-específicos têm revelado padrões diferenciais tanto

na eucromatina como na heterocromatina de diferentes organismos,

particularmente vertebrados (Pieczarka et al., 2001; Santos et al., 2001; Schmid

et al., 2002; Leite-Silva et al., 2003; Kavalco et al., 2004). Em morcegos, a

tríplice coloração CMA3/DA/DAPI geralmente induz um padrão de bandeamento

da eucromatina e tem revelado uma composição diferencial da hererocromatina

(Tabela 3) (Bickham, 1987; Ruedas et al., 1990; Santos e Souza 1998a, b; Santos

et al., 2001; Leite-Silva et al., 2003). O padrão de bandas R com o CMA3

observado em G. soricina, P. lineatus e S. lilium, a coloração uniforme dos

cromossomos observada com o DAPI em P. lineatus e G. soricina e o fraco

padrão de bandas G em S. lilium, também tem sido observado em outros

77


representantes da família Phyllostomidae (Santos e Souza, 1998a, b; Santos et

al., 2001).

O uso da tríplice coloração CMA3DA/DAPI permitiu identificar a ocorrência

de um grande bloco CMA3 positivo na região pericentromérica do cromossomo X

em S. lilium, indicando uma heterocromatina diferencial, que pode ser

considerada como um marcador cariotípico para essa espécie. Além disso, a

coloração uniforme com o DAPI nos cromossomos de P. lineatus e G. soricina e os

blocos positivos para o DAPI na região centromérica de alguns cromossomos de

S. lilium, também observada em outras espécies (Santos e Souza, 1998a,b;

Santos et al., 2001), confirmam a ampla heterogeneidade na composição da

heterocromatina em Phyllostomidae.

Em Carollia perspicillata, a coloração CMA3/DA/DAPI mostrou tanto bandas

da eucromatina (bandas G e R) como três tipos de heterocromatina constitutiva:

CMA3-positiva, DAPI-positiva e CMA3 e DAPI neutra (Tabela 3). Em Phyllostomus

discolor foram evidenciados blocos DAPI positivos nas regiões pericentroméricas

de alguns cromossomos (Santos e Souza, 1998a,b). Por outro lado, Artibeus

lituratus, A. jamacensis, A. cinereus, Desmodus rotundus e Diphyla ecaudata

(Santos e Souza, 1998b; Santos et al., 2001) não apresentaram nenhuma riqueza

de pares de bases AT e GC através dessa coloração (Tabela 3), indicando que o

uso desses fluorocromos permite uma qualificação da composição da cromatina

no genoma de morcegos.

A correspondência entre as regiões CMA3 positivas com os sítios

marcados pelo nitrato de prata visualizada pela coloração AgNO3/CMA3/DA/DAPI

nas três espécies indica a riqueza de pares de bases GC nesses sítios e também

tem sido encontrada em outras espécies de Phyllostomidae (Tabela 3) (Santos e

78


Souza 1998b; Santos et al. 2001). Contudo, em S. lilium foi observado um sinal

fluorescente menos intenso desses sítios marcados com o CMA3, sugerindo uma

variabilidade desses sítios em relação à repetição das seqüências de pares de

bases GC quando comparado com P. lineatus e G. soricina. Essa composição

diferencial também foi observada em Carollia perspicillata e Phyllostomus

discolor que apresentaram as seqüências intergênicas associadas às RONs

neutras para o CMA3 e negativa para o DAPI (Tabela 2)(Santos e Souza,

1998a,b). Dessa forma, nossos dados confirmam a existência de uma

variabilidade na composição desses sítios em Phyllostomidae.

A afinidade das seqüências intergênicas associadas às RONs pelos

fluorocromos específicos para GC, também tem sido constatada em outros

organismos, como peixes (Gromicho et al., 2005, Silva et al., 2006), anfíbios

(Lourenço et al., 2000) e mamíferos (Svartmam e Vianna-Morgante, 2003). Tal

comportamento observado nessas regiões em diferentes organismos,

particularmente vertebrados, indica uma maior riqueza de pares de bases GC

nos sítios de DNAr, embora ocorra casos em que esses sítios são ricos em AT

ou sem nenhuma riqueza específica (Amemyia e Gold, 1986; Santos e Souza,

1998b).

As respostas diferenciais aos fluorocromos base-específicos CMA3 e DAPI

obtidas nas espécies analisadas confirmam a heterogeneidade da HC quanto à

sua composição nesses representantes de Phyllostomidae, e comprovam as

características particulares das seqüências intergênicas associadas às RONs

que geralmente apresentam-se CMA3 positiva em filostomídeos podendo ser,

com menor freqüência, negativa ou sem especificidade. Contudo, mais espécies

precisam ser estudadas com esse enfoque, numa tentativa de estabelecimento

79


de que tipo de seqüência repetitiva (rica em AT ou GC) apresenta expansão

diferencial nesses organismos.

Agradecimentos

As autoras agradecem aos Drs. Alfredo Ricardo Langguth Bonino e a Katharine

Raquel Pereira dos Santos da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) pela

fundamental contribuição na identificação taxonômica das espécies utilizadas

nesse trabalho; à Cirlene Maria da Silva e Francisca Tavares Lira pelo suporte

técnico e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico) pelo apoio financeiro ao projeto.

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84


Figura 1 – Coloração convencional em Platyrrhinus lineatus (a), Sturnira lilium (b) e

Glossophaga soricina (c). No inserto cromossomo X e Y de macho. Barra: 5 μm.

85


a

Figura 2 – Padrão de heterocromatina constitutiva através do bandeamento C

em Platyrrhinus lineatus (a) e Sturnira lilium (b). Em b notar a coloração

diferencial do braço longo do cromossomo X. Barra: 5 μm.

86


Heterocromatina constitutiva Cromatina dispersa RONs

Figura 3 - Idiograma mostrando o padrão de heterocromatina e RONS em

Platyrrhinus lineatus (a), Sturnira lilium (b) e Glossophaga soricina (c). Em b notar

a coloração diferencial do braço longo do cromossomo X.

87


88

Figura 4 - Coloração seqüencial AgNO3/CMA3/DA/DAPI em metáfase de

Platyrrhinus lineatus (a-c), Sturnira lilium (d-f) e Glossophaga soricina (g-i). As

setas indicam as RONs. Em (e) destaque para o padrão de CMA3+ do

cromossomo X. Em (f) Cabeças de seta indicam a marcação DAPI + nos pares 5,

6 e 7. Barra: 5 μm.


Tabela 2: Padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva em alguns representantes da subfamília Stenodermatinae (Phyllostomidae).

Padrão de bandeamento C Espécies Pericentromérico Distal Intersticial Referências

Platyrrhinus lineatus + 5,6,7, X, Y 1,2,3,5,6,7,8 3 Sturnira lilium + 5,6,7, X - 3 Glossophaga soricina + Y - 3 Artibeus lituratus + 5,6,7 6 1,2 A. fimbriatus + 5,6,7 - 1,2 A. jamaicensis + 5, 6, 7, 9 e

13 1, 2 e 6 1,2

A. obscurus + 5, 6, 7 e 9 1, 2, 5 e 6 1 Referências: (1) Lemos-Pinto (2007); (2) Santos e Souza (1998b); (3) Presente trabalho

Tabela 3: Padrão de qualificação da eucromatina, heterocromatina e das seqüências intergênicas das RONs com o CMA3 e DAPI em representantes de Phyllostomidae.

CMA3 DAPI

Espécies Eucromatina HC Seqüências intergênicas

Referências

Platyrrhinus lineatus R CMA3+ CMA3+/DAPI- 6

Sturnira lilium R e G CMA3+ e DAPI+ CMA3+/DAPI- 6

Glossophaga soricina R CMA3+ CMA3+/DAPI- 6

Artibeus obscurus R CMA3+ CMA3+ 2

A. lituratus R CMA30/DAPI0 CMA3+/DAPI0 4

A. jamaicensis R CMA30/DAPI0 CMA3+/DAPI0 4

A. fimbriatus R CMA3+ CMA3+ 2

Desmodus rotundus R e G CMA30/DAPI0 CMA3+/DAPI0 5

Diphylla ecaudata R e G CMA30/DAPI0 CMA3+/DAPI0 5

Lonchorhina aurita R CMA3+ CMA3+ 1 Trachops cirrhosus R CMA3+ CMA30 1

Carollia perspicillata R e G CMA3+/DAPI+,

CMA30/DAPI0

CMA30/DAPI- 3

Phyllostomus discolor R CMA3/DAPI+ CMA30/DAPI- 4

R=Banda R; G=Banda G; CMA3 =Banda R; DAPI = Banda G; HC=heterocromatina

constitutiva; + =positiva; - =negativa; 0=neutra

Referências: (1) Barros (2006); (2) Lemos-Pinto (2007); (3) Santos e Souza (1998a);

(4) Santos e Souza (1998b); (5) Santos et al. (2001); (6) Presente trabalho.

89


5. Conclusões

1. Os números diplóides (2n=30,XY e 2n=32,XY) e os números fundamentais

(NF=56-60) encontrados nas três espécies são considerados a condição

primitiva para a família Phyllostomidae;

2. A morfologia subtelocêntrica do Y de Platyrrhinus lineatus indica a ocorrência de

uma variação cromossômica geográfica para essa espécie, uma vez que dados

da literatura descrevera um Y metacêntrico;

3. Os blocos adicionais de HC na região distal do braço curto dos pares 5, 6, 7 e

cromossomo X observado em P. lineatus e S. lilium correspondem a um padrão

compartilhado por alguns representantes de Stenodermatinae;

4. A coloração diferencial observada na cromatina presente no braço longo do X de

Sturnira lilium, quando submetida ao bandeamento C, tem sido observada em

alguns representantes da subfamília Stenodermatinae. Além disso, o

comportamento quase totalmente heterocromático do Y dessa espécie é um

padrão freqüente em Phyllostomidae;

5. A ocorrência de um único par de RONs em autossomos observada nas espécies

analisadas é considerada uma condição ancestral para os filostomídeos;

6. Nas três espécies analisadas as regiões heterocromáticas pericentroméricas e as

regiões distais de alguns cromossomos apresentaram uma fraca marcação com o

CMA3, indicando uma predominante associação de heterocromatina com

seqüências ricas em pares de bases GC;

7. As respostas diferenciais obtidas com os fluorocromos base-específicos CMA3 e

DAPI confirmaram a heterogeneidade da HC e das seqüências intergênicas

associadas às RONs quanto à sua composição de pares de bases. Esses

resultados sugerem a necessidade de uma ampliação no número de espécies

estudadas com esse enfoque, visando um melhor entendimento da expansão

90


diferencial das seqüências repetitivas (ricas em AT ou GC) dentro da família

Phyllostomidae.

91


6. Abstract

Mitotic chromosomes of Glossophaga soricina (2n=32,XY; NF=60), Platyrrhinus

lineatus and Sturnira lilium (2n=30,XY; NF=56) were analyzed through the

conventional staining, C-banding, silver nitrate impregnation (AgNO3) and base-

specific fluorochromes. Data of the conventional analysis obtained from the three

species are in agreement with those described in the literature, except for the

morphology of the Y chromosome of P. lineatus, indicating geographical

chromosomal variation for the species. The blocks of CH in the distal region of

the short arm of 5, 6, 7 and X chromosomes, observed by the C-banding, in P.

lineatus and S. lilium, besides the differential staining in the long arm of the X

chromosome of Sturnira lilium correspond a pattern shared by some

representatives of Stenodermatinae. The weak marking CMA3+ in the

pericentromeric and distal heterochromatic regions of some chromosomes

indicate a predominant association of heterochromatin with GC-rich sequences.

However, the differential patterns obtained with the base-specific fluorochromes

confirmed the heterogeneity of CH to its composition (AT- and/or GC-rich) and

proved differential characteristics of the intergenic sequences associated to NORs

(positive CMA3, negative or without specificity) in representatives of Phyllostomidae.

Key-word: Phyllostomidae, C-banding, AgNO3, CMA3, DAPI

92


7. ANEXOS

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7.1 INSTRUÇÕES PARA AUTORES

Revista Micron: The International Research and Review

Journal for Microscopy

ISSN: 0968-4328

94




Micron: The International Research and Review Journal for Microscopy Submission of Papers

Submission of a paper implies that it has not been published previously, that it is

not under consideration for publication elsewhere, and that if accepted it will not

be published elsewhere in the same form, in English or in any other language,

without the written consent of the publisher.

Authors are encouraged to submit their papers using the online submission tool

at http://ees.elsevier.com/jmic

Alternatively, for hardcopy submissions:

For Physical Science Research papers and communications, three copies of

the entire paper should be sent directly to either of the following:

Professor D.J.H. Cockayne, University of Oxford, Department of Materials, Parks

Road, Oxford OX1 3PH, UK. Tel: 44 (0) 1865 273682; Fax: 44 (0) 1865 273789;

e-mail: [email protected]

Professor R.F. Egerton, Physics Department, University of Alberta, Edmonton,

Canada T6G 2J1. Tel.: 1 780 492 5095; Fax: 1 780 492 0714; e-mail: [email protected] For Physical Science Review papers, three copies of the entire paper should

be submitted to Professor Egerton at the above address.

For Biological Research papers and Short communications, three copies of

the entire paper should be sent directly to:

Dr J.R. Harris, Institute of Zoology, University of Mainz, D-55099 Mainz,

Germany. Tel: 49 6131 392 3158; Fax: 49 6131 392 4652; e-mail: [email protected]

For Biological Review papers, three copies of the entire paper should be

submitted to Dr Harris at the above address.

Manuscript Preparation

General: Manuscripts must be typewritten, double-spaced with wide margins on

one side of white paper. Good quality printouts with a font size of 12 or 10 pt are

required. The corresponding author should be identified (include a Fax number

and E-mail address). Full postal addresses must be given for all co-authors.

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mailto:[email protected]




Authors should consult a recent issue of the journal for style if possible. An

electronic copy of the paper should accompany the final version. The Editors

reserve the right to adjust style to certain standards of uniformity. Authors should

retain a copy of their manuscript since we cannot accept responsibility for

damage or loss of papers. Original manuscripts are discarded one month after

publication unless the Publisher is asked to return original material after use.

Abstracts: This must be a concise statement of the purpose of the paper and of

the major results obtained. Abstracts must be self-explanatory and should not

consist of more than 500 words.

Text: Follow this order when typing research manuscripts: Title, Authors,

Affiliations, Abstract, Keywords (about 10), Introduction, ?Materials and Methods,

Discussion, Acknowledgements, Appendix, References, Figure Captions and

then Tables. For short communications sub-headings (introduction, etc.) should

not be used. For reviews, include a contents list, and appropriate sub-headings

(two grades of heading only) after the introduction, i.e

I.?Introduction

A. . . .

B. . . .

II.?. . .

A. . . .

B. . . . etc.

Do not import the Figures or Tables into your text. The Title should be short but

must accurately reflect the content of the paper. The corresponding author should

be identified with an asterisk and footnote. Authors are requested not to use

footnotes in the main body of the paper but to include any scientific matter or

sources of special materials in the text and any which take the form of an

acknowledgement in the appropriate section. All acknowledgements should be

confined in the section set aside at the end of the text for this purpose. Papers

should carry the appropriate sub-headings

Units: Authors are required to use SI units throughout. Please ensure that any

Greek or unusual symbols are clearly identified in the margin.

References: All publications cited in the text should be presented in a list of

references following the text of the manuscript. In the text refer to the author's

96


name (without initials) and year of publication (e.g. "Since Peterson (1993) has

shown that . . ." or "This is in the agreement with results obtained later (Kramer,

1994)"). For three or more authors use the first author followed by "et al.", in the

text. The list of references should be arranged alphabetically by authors' names.

The manuscript should be carefully checked to ensure that the spelling of

authors' names and dates are exactly the same in the text as in the reference list.

References should be given in the following form:

Adams, A., Nelson, W.J., Smith, S.J., 1996. Quantitative analysis of cadherin-

catenin-actin reorganization during development of cell-cell adhesion. Journal of

Cell Biology 135, 1899--1911.

Mostov, K.E., Cardone, M.H., 1995. Regulation of protein traffic in polarized

epithelial cells. Bioessays 17 (1), 129--138.

Strunk Jr., W., White E.B., 1979. The Elements of Style, 3rd ed. Macmillan, New

York.

Gurman, A.S., Kniskern, D.P., 1981. Family therapy outcome research: knowns

and unknowns. In: Gurman, A.S., Kniskern, D.P. (Eds.), Hand book of Family

Therapy. Brunner/Maazel, New York, pp. 742--775.

Shida, H., Shida, M., Ohga, R., 1986. A new method for quantitative high

resolving power analysis of immunoelectron microscopy using post-embedding

labeling procedure. In: T. Imura, S. Maruse, T. Suzuki, III (Eds.), Proceedings

XIth International Congress on Electron Microscopy, Kyoto.

Illustrations: For online submissions, electronic graphics are mandatory. Online

instructions can be found at: http://ees.elsevier.com/jmic and artwork instructions

are at: http://www.elsevier.com/locate/authorartwork

If you are not submitting online, all illustrations should be provided in camera-

ready form, suitable for reproduction (which may include reduction) without

retouching. Photographs, charts and diagrams are all to be referred to as

"Figure(s)" and should be numbered consecutively in the order to which they are

referred. They should accompany the manuscript, but should not be included

within the text. All illustrations should be clearly marked on the back with the

figure number and the author's name. All figures are to have a caption. Captions

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http://ees.elsevier.com/jmic

http://www.elsevier.com/locate/authorartwork


should be supplied on a separate sheet.

Line drawings: Good quality printouts on white paper produced in black ink are

required. All lettering, graph lines and points on graphs should be sufficiently

large and bold to permit reproduction when the diagram has been reduced to a

size suitable for inclusion in the journal. Dye-line prints or photocopies are not

suitable for reproduction. Do not use any type of shading on computer-generated

illustrations.

Photographs: Original photographs must be supplied as they are to be

reproduced (e.g. black and white or colour). Authors should indicate clearly their

preferred size for micrographs and diagrams. All sets of photographs should be

fully labelled with Letraset symbols and contain scale bars. Please note that

photocopies of photographs are not acceptable.

Colour: No charges will be made for colour illustrations for those papers in which

colour is essential to convey the full information content of the image. The pages

will be decided at the Editors' discretion.

Tables

Tables should be numbered consecutively and referred to by Arabic numerals.

These should be given a suitable caption and each table typed on a separate

sheet. Footnotes are acceptable to tables and should be typed below the table

and should be referred to by superscript lowercase letters. No vertical rules

should be used. Tables should not duplicate results presented elsewhere in the

manuscript, (e.g. in graphs).

Electronic submission

Authors should submit an electronic copy of their paper with the final version of the manuscript. The electronic copy should match the hardcopy exactly. Always keep a backup copy of the electronic file for reference and

safety.

Proofs

Proofs will be sent to the author (first named author if no corresponding author is

identified of multi-authored papers) and should be returned within 48 hours of

receipt. Corrections should be restricted to typesetting errors; any others may be

charged to the author. Any queries should be answered in full. Please note that

authors are urged to check their proofs carefully before return, since the inclusion

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of late corrections cannot be guaranteed. Proofs are to be returned to the Log-in

Department, Elsevier, Stover Court, Bampfylde Street, Exeter, Devon EX1 2AH,

UK.

Reprints

The corresponding author will be provided with a PDF of the article in its

published form. Authors wishing to order additional paid reprints should indicate

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Copyright All authors must sign the "Transfer of Copyright" agreement before the article can

be published. This transfer agreement enables Elsevier to protect the copyrighted

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holder permission to reproduce any material for which copyright already exists.

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Contact details for questions arising after acceptance of an article, especially

those relating to proofs, are provided when an article is accepted for publication.

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7.2 FOTOS DAS ESPÉCIES ESTUDADAS

100


101

a

b

c

a

Figura 1 – Fotos das espécies Platyrrhinus lineatus (a), Sturnira lilium (b) e

Glossophaga soricina (c). Fonte: ). www.flickr.com/photos/morcegao/

http://www.flickr.com/photos/morcegao/

análise citogenética comparativa entre glossophaga ... · 2.3 citogenética de chiroptera . 24 ....

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