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Cultivo in vitro, em tanques e no mar de Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta, Solieriaceae) em Santa CatarinaTRANSCRIPT
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Universidade Federal de Santa Catarina
Centro de Ciências Agrárias
Departamento de Aqüicultura
Cultivo in vitro, em tanques e no mar de Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta, Solieriaceae) em Santa
Catarina
Gabriel Soares Mattar de Faria
Florianópolis / SC
2008
2
Universidade Federal de Santa Catarina
Centro de Ciências Agrárias
Departamento de Aqüicultura
Cultivo in vitro, em tanques e no mar de Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta, Solieriaceae) em Santa
Catarina
Relatório de Estágio de Conclusão do
Curso de Engenharia de Aqüicultura
Gabriel Soares Mattar de Faria
Orientador: Profa. Dra. Zenilda L. Bouzon
Supervisor: Dra. Leila Hayashi
Laboratório de Algas Marinhas, CCB, UFSC
Florianópolis / SC
2008
3
Agradecimentos
BAKOF E PIBIC CNPQ
4
Sumário
1. Resumo ........................................................................................................................................... 5
2. Introdução ....................................................................................................................................... 7
3. Objetivos ....................................................................................................................................... 10
4. Material e Métodos ........................................................................................................................ 11
4.1 Infra-Estrutura da Câmara de Cultivo .......................................................................................... 11
4.2 Cultivo em laboratório ................................................................................................................. 11
4.3 Efeitos de Diferentes Concentrações de Sulfato ......................................................................... 12
4.4 Crescimento em Água Proveniente da Praia do Sambaqui ........................................................ 13
4.5 Efeitos de Diferentes Fontes de Nutrientes Comerciais .............................................................. 14
4.5.1 Uréia agrícola ........................................................................................................................... 14
4.5.2 Adubo NPK 15:15:20 ................................................................................................................ 14
5. Cultivo em Tanques ...................................................................................................................... 15
7. Cultivo Experimental no Mar ......................................................................................................... 16
8. Análises Estatísticas ..................................................................................................................... 17
9. Resultados e Discussão ................................................................................................................ 18
9.1 Cultivo em Laboratório ................................................................................................................ 18
9.1.1 Efeito de Diferentes Concentrações de Sulfato ........................................................................ 18
9.1.2 Crescimento em Água Proveniente da Praia do Sambaqui ..................................................... 20
9.2 Análise dos Efeitos de Diferentes Fontes de Nutrientes Comerciais ........................................... 23
9.2.1 Uréia Agrícola .......................................................................................................................... 23
9.2.2 Adubo NPK 15:15:20 ................................................................................................................ 25
10. Cultivo em Tanques .................................................................................................................... 26
11. Cultivo Experimental no Mar ....................................................................................................... 26
12. Considerações Finais .................................................................................................................. 28
13. Referências ................................................................................................................................. 29
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1. Resumo
O presente relatório refere-se às atividades desenvolvidas entre julho de 2007 a maio de 2008,
início da vigência da Bolsa de Iniciação Científica (PIBIC/UFSC), vinculada ao Projeto “Cultivo
Experimental de Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta, Solieriaceae) no litoral de Santa Catarina”,
realizado pela UFSC (CCB/ BEG), em parceria com a EPAGRI, USP e Instituto de Pesca de São Paulo.
Como a autorização para o início do cultivo experimental no mar foi concedida apenas em
dezembro de 2007, a instalação do módulo de cultivo foi realizada somente em fevereiro do presente
ano. Enquanto isto, experimentos em laboratório foram desenvolvidos para analisar o desempenho da
espécie em condições controladas. Estudos relacionados à sobrevivência das algas em água do mar
coletada na Praia do Sambaqui, consideradas ligeiramente eutrofizadas pelo cultivo de moluscos e
onde o módulo de cultivo foi instalado, foram realizados. Plantas incubadas nessa água por 14 dias
apresentaram baixas taxas de crescimento e sinais de “ice-ice”, doença degenerativa do talo, típica da
espécie. Entretanto, uma vez colocada novamente nas condições gerais de cultivo, essas recuperaram
as taxas de crescimento normais e o aspecto saudável. Diferentes concentrações de sulfato em meios
de cultura foram testadas para verificar a sobrevivência da espécie, uma vez que as carragenanas são
colóides altamente sulfatados. Plantas cultivadas com ausência de sulfato não sobreviveram e as que
foram cultivadas com acréscimo de sulfato apresentaram taxas de crescimento similares ao do
controle. Experimentos com diferentes fontes de nutrientes comerciais estão sendo realizados
inicialmente em laboratório para encontrar alternativas mais viáveis à solução von Stosch utilizada
tradicionalmente no cultivo in vitro da espécie. Os primeiros resultados indicam que a Uréia comercial
não é eficiente para a manutenção das plantas. Entretanto, o NPK tem mostrado resultados otimistas,
considerando que o objetivo principal não é o crescimento das plantas, mas a manutenção de
propágulos saudáveis nos cultivos em tanques. Este tipo de cultivo está sendo desenvolvido como uma
medida preventiva, uma vez que a espécie é proveniente de regiões tropicais e Santa Catarina possui
baixas temperaturas no inverno, sendo uma alternativa, caso seja necessário retirar as plantas do mar
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até que as condições ambientais se tornem novamente favoráveis. O módulo de cultivo ainda
apresenta problemas de adequação às condições da região. Diferentes alternativas de cultivo estão
sendo testadas de forma a solucionar estes problemas. Até o momento, a dispersão da espécie nos
costões e praias adjacentes não foi observada. A segunda etapa do projeto envolverá o
acompanhamento do ciclo anual do cultivo no mar (plantio, colheita e processamento) e a análise de
carragenana.
Palavras-Chave
Kappaphycus alvarezii, macroalgas marinhas, maricultura.
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2. Introdução
Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex P. C. Silva (Rhodophyta, Solieriaceae) é atualmente a
principal fonte de carragenana kappa, colóide utilizado amplamente pelas indústrias alimentícia,
farmacêutica e de cosméticos como agente espessante e estabilizante. A espécie, juntamente com
Eucheuma denticulatum (N.L. Burman) F.S. Collins & Hervey, responde por aproximadamente 88% da
matéria-prima mundial processada para produção de carragenana (McHugh 2003). A maricultura
dessas espécies no sul das Filipinas modificou em apenas 10 anos a fisionomia mundial da indústria de
carragenana, iniciada em escala comercial na década de 1940 e a partir de então, linhagens derivadas
desses cultivos foram introduzidas em mais de 20 países, com propósitos de maricultura (Areces 1995,
Paula & Pereira 1998, Paula et al. 1998, Paula 2001). Atualmente, a produção mundial de
carragenófitas provenientes dos cultivos das Filipinas, Indonésia e Tanzânia atingem a cifra anual de
150.000 toneladas, sendo 80% proveniente de K. alvarezii e 20% de E. denticulatum. A indústria de
carragenana possui mercado estimado de US$ 240 milhões (McHugh 2003).
Os principais fatores limitantes para a produção das algas são: a luz, os nutrientes, o
hidrodinamismo e as inter-relações bióticas. A maricultura de algas é feita geralmente em um sistema
extensivo, sem adição de nutrientes e tratamento com produtos químicos. A taxa de crescimento e a
produção têm sido amplamente utilizadas como os primeiros passos para avaliar o desempenho das
algas para fins de maricultura, considerando que as taxas de crescimento são intrínsecas a uma dada
espécie em resposta aos fatores ambientais. Do mesmo modo, a morfologia, as dimensões, a
resistência e a longevidade do talo, entre outras características fisiológicas e reprodutivas, têm sido
consideradas particularmente importantes em relação à seleção de técnicas e de locais de cultivo
(Paula 2001).
Os cultivos comerciais de Kappaphycus alvarezii são realizados em larga escala empregando
o sistema conhecido como "tie-tie", onde porções do talo são amarradas em cabos de cultivo e esses
são mantidos fixos ao fundo ou em sistemas flutuantes, como balsas ou "long-lines". A propagação de
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K. alvarezii é um processo de caráter contínuo baseado na sua multiplicação vegetativa através de
ciclos sucessivos de cultivo por 40 a 60 dias. Variações desse sistema têm sido testadas ainda sem
sucesso comercial, visando minimizar a mão-de-obra exigida (Areces 1995).
No Brasil, a espécie foi introduzida experimentalmente em 1995, no Instituto de Pesca da
Secretaria de Agricultura e Abastecimento (Ubatuba, São Paulo), com o objetivo de desenvolver
estudos básicos (marinomia) como suporte para a implantação de cultivos comerciais no litoral
brasileiro, sendo aprovado pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis (IBAMA) (Paula 2001).
Os resultados obtidos durante mais de 10 anos de experimentos evidenciam características
favoráveis das linhagens para o cultivo comercial no Brasil. Destacam-se: a adaptação da espécie na
região, com altas taxas de crescimento (entre 4,5% e 8,0% dia-1), bom teor de carragenanas durante
todo o ciclo anual (entre 20% e 40% de carragenana semi-refinada e entre 12% e 28% de carragenana
refinada) e a regularidade das variações sazonais desses dois parâmetros, que pode ser utilizada para
a previsão e o controle da produção. A sazonalidade do crescimento foi relacionada principalmente à
temperatura, e a herbivoria foi o principal fator limitante da espécie na região. Não foram observados
indícios de riscos ambientais (Hayashi 2001, Paula & Pereira 1998, 2003, Paula et al. 1999, Hayashi et
al. 2007a). Desde a sua introdução, diversos estudos foram realizados: a) cultivo in vitro e taxas
fotossintéticas (Erbert 2001, Paula et al. 2001), b) introdução no mar e maricultura (Paula 2001, Paula
& Pereira 1998, Paula et al. 2002, Paula & Pereira 2003, Hayashi 2007, Hayashi et al. 2007b), c) cultivo
integrado com camarões, moluscos e peixes (Lombardi et al. 2001a, 2001b, Hayashi 2007, Hayashi et
al. 2008b), d) teor e propriedades de carragenanas (Hayashi 2001, 2007, Hayashi et al. 2007a, Hayashi
et al. 2007b), e) cultura de tecidos e seleção de linhagens (Paula et al. 1999, Hayashi et al. 2008a), f)
aspectos reprodutivos e biológicos (Contador 2001, Bulboa & Paula 2005).
As altas taxas de crescimento e o comportamento previsível da produção de Kappaphycus
alvarezii observados no cultivo experimental realizado na região de Ubatuba, SP, sugerem a
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possibilidade de cultivo da espécie em grande parte do litoral brasileiro. O Estado de Santa Catarina foi
escolhido como um local promissor para desenvolver este projeto pela disponibilidade de espaços para
implantação de fazendas marinhas e por ser o Estado onde existe maior desenvolvimento da
maricultura e estrutura social voltada para produção de organismos marinhos, com uma infra-estrutura
de pesquisa e extensão (Universidade Federal de Santa Catarina/UFSC, Empresa de Pesquisa
Agropecuária e de Extensão Rural/ EPAGRI) que não encontra paralelo no país.
Uma vez que a autorização demorou a ser liberada, foram realizados alguns experimentos de
cultivo em laboratório para analisar o desempenho da espécie em condições controladas. Estudos
sobre a sobrevivência das algas em água do mar coletada na Praia do Sambaqui, consideradas
ligeiramente eutrofizadas pelo cultivo de moluscos, onde o módulo de cultivo foi instalado, foram
realizados. Além disso, diferentes concentrações de sulfato em meios de cultura foram testadas para
verificar a sobrevivência da espécie, uma vez que as carragenanas são colóides altamente sulfatados.
Foi iniciado o cultivo em tanques como uma medida preventiva, uma vez que a espécie é
proveniente de regiões tropicais e Santa Catarina possui baixas temperaturas no inverno. Esse tipo de
cultivo é uma alternativa, caso seja necessário retirar as plantas do mar até que as condições
ambientais se tornem novamente favoráveis. Por ser realizado em uma escala maior que o cultivo in
vitro, ocorre um alto consumo de nutrientes para manter as plantas saudáveis, o que torna essa fase
intermediária dispendiosa. Experimentos com diferentes fontes de nutrientes comerciais estão sendo
realizados inicialmente em laboratório para encontrar alternativas mais viáveis à solução von Stosch
utilizada tradicionalmente no cultivo in vitro da espécie. Uma vez encontrada a fonte mais adequada,
essa será testada nos tanques.
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3. Objetivos
Esse trabalho teve como objetivos:
� Montar uma infra-estrutura no Laboratório de Algas Marinhas (LAMAR), do Departamento de
Biologia Celular, Embriologia e Genética, do Centro de Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Santa Catarina, que suporte toda a biomassa produzida através das linhagens
trazidas do Laboratório de Algas Marinhas “Edison de Paula” da Universidade de São Paulo
� Produzir biomassa suficiente para os cultivos no mar
� Avaliar o crescimento das linhagens cultivadas em diferentes concentrações de sulfato
� Avaliar o crescimento das linhagens cultivadas em água do mar proveniente da Praia do
Sambaqui
� Avaliar o crescimento das linhagens cultivadas sob efeito de diferentes nutrientes comerciais
� Criar uma fase intermediária de cultivo em tanques
� Instalação do módulo de cultivo no mar
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4. Material e Métodos
4.1 Infra-Estrutura da Câmara de Cultivo
Uma das finalidades dos cultivos in vitro foi aumentar a biomassa das linhagens provenientes
de São Paulo até que a autorização para instalação do cultivo fosse concedida. Sendo assim, toda a
infra-estrutura da câmara de cultivo foi otimizada e adaptada para se criar as melhores condições de
crescimento da espécie. Para tanto, a irradiância foi aumentada com a instalação de mais lâmpadas, o
sistema de aeração foi aprimorado com a instalação de filtros intermediários para evitar a passagem de
óleo proveniente do compressor de ar, e as válvulas de aeração foram substituídas e adicionadas nas
prateleiras. Com a instalação de novas lâmpadas, houve um superaquecimento das prateleiras,
problema resolvido com isolamento térmico através de placas de isopor. Foi colocado ainda um ar
condicionado com controle termostático de temperatura, para garantir uma temperatura constante de
25°C no interior da câmara. Mangueiras de silicone foram instaladas para garantir a passagem da
aeração por todas as prateleiras.
Foi colocado ainda mais um conjunto de 4 prateleiras, para aumentar a capacidade da câmara
de cultivo, disponibilizando assim mais espaço para novos experimentos.
4.2 Cultivo em laboratório
Ramos de 5 linhagens diferentes (tetrasporófitos marrom, MR, verde, VD, vermelho, VM, e
gametófito feminino, FM, e linhagem “Edison de Paula”, EP) de Kappaphycus alvarezii foram
transferidas dos cultivos unialgáceos e livres de contaminantes realizados no Laboratório de Algas
Marinhas “Edison José de Paula” do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para o
Laboratório de Algas Marinhas (LAMAR) do Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética
(BEG/CCB) da Universidade Federal de Santa Catarina. Esses ramos estão sendo cultivados em água
do mar esterilizada (34 ± 1 ups) enriquecida com solução von Stosch 50% (VS 50, segundo McLachlan
1973), em fotoperíodo de 12 h, temperatura de 25°C (±1°C), fluxo fotônico de 100 (±10) µmol fótons.
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m-2. s-1 e aeração constante. Os cultivos são realizados para produção de mudas de 10 a 20 g de
biomassa úmida e, uma vez atingida a biomassa, as mudas são mantidas em tanques até serem
transferidas para o cultivo no mar, localizado na Praia do Sambaqui (Florianópolis, Santa Catarina).
4.3 Efeitos de Diferentes Concentrações de Sulfato
Estudos prévios foram realizados para escolher o meio de cultura mais adequado para os
experimentos. Ramos da linhagem VD com biomassa inicial de 0,5 g foram cultivados em 200 mL dos
seguintes meios de cultura: água do mar sem sulfato enriquecida com solução VS 50 sem sulfato, água
do mar esterilizada e enriquecida com solução VS 50 e água do mar artificial (Pueschel & West 2007)
enriquecida com solução VS 50, segundo as condições gerais de cultivo em laboratório descritas acima
(item 4.1). O sulfato foi removido da água do mar segundo metodologia modificada descrita por
Grasshoff et al. (1983). Para cada tratamento, foram feitas 4 repetições e os cultivos foram mantidos
por 15 dias.
Após os experimentos prévios, ramos das linhagens MR e VD foram cultivados em meios de
cultura com diferentes concentrações de sulfato. Ápices com biomassa fresca total de 0,5 g foram
cultivados em 200 mL de meio de cultura, perfazendo um total de quatro repetições para cada
linhagem, por um período de 28 dias. Foram testados: água do mar esterilizada sem sulfato
enriquecida com solução VS 50 sem sulfato e água do mar esterilizada enriquecida com solução VS 50
e 80 mM de sulfato de sódio. Como controle, foi utilizada água do mar esterilizada enriquecida com
solução VS 50. Semanalmente, os meios de cultura foram renovados, as algas foram pesadas e as
TCs foram calculadas. No final do experimento, foi observado aumento da salinidade (38 ups) nos
meios de cultura com acréscimo de sulfato de sódio. Sendo assim, o experimento foi repetido,
controlando a salinidade desse tratamento
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4.4 Crescimento em Água Proveniente da Praia do Sambaqui
Ramos das linhagens de MR, VD, VM e FM foram cultivados nas condições gerais de cultivo
em laboratório descritas acima (item 4.1) em água do mar coletada na Praia do Sambaqui. Plantas com
biomassa fresca total aproximada de 15 g foram cultivadas em 3 L de água por 14 dias, perfazendo um
total de três repetições para cada linhagem. Como controle, foi utilizado água do mar sem algas. No
final do experimento, as algas foram pesadas e as TCs foram calculadas.
Após o período experimental, aproximadamente 5 g de biomassa de cada linhagem foi isolada
e cultivada em água do mar esterilizada com regime alternado de nutrientes: uma semana com o
acréscimo de solução de VS 50 e outra semana sem. Para cada linhagem, foram feitas 3 repetições.
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4.5 Efeitos de Diferentes Fontes de Nutrientes Comerciais
As concentrações estabelecidas para os fertilizantes comerciais foram baseadas na
concentração de nitrogênio utilizada na solução von Stosch.
4.5.1 Uréia agrícola
Ramos com biomassa inicial de 0,5 g da linhagem marrom foram cultivados com água do mar
esterilizada enriquecida com diferentes concentrações de Uréia Agrícola (com 45% de nitrogênio –
Ultraverde): a) 50% (4 mg L-1) b) 100% (8 mg L-1) e c) 200% (16 mg L-1). Como controle, foi utilizado
água do mar esterilizada enriquecida com solução VS 50. Dois regimes nutricionais foram testados:
pulso de nutrientes de 3 dias e acréscimo de nutrientes em semanas alternadas (uma semana de
cultivo com nutrientes e outra semana apenas com água do mar esterilizada). Para cada tratamento,
foram feitas 3 repetições. Os experimentos foram realizados por um período de 35 dias.
Semanalmente, os meios de cultura foram renovados, as algas foram pesadas e as TCs foram
calculadas.
4.5.2 Adubo NPK 15:15:20
Experimentos prévios foram realizados para analisar o desempenho da espécie quando
cultivada com esse fertilizante. Ramos da linhagem VD com biomassa inicial de 1g foram cultivados em
500 mL de água do mar esterilizada enriquecida com solução NPK (Sempre Verde). Foi utilizada uma
solução padrão de NPK na concentração de 5,83g L-1; entretanto, a quantidade utilizada não diluiu
completamente em água destilada, sendo necessário filtrar os resíduos. A solução final foi
acrescentada na água do mar esterilizada utilizada nos cultivos, na mesma proporção da solução VS
50 (4 mL L-1). O experimento teve duração de 35 dias, e foram feitas 3 repetições. Os meios de cultura
foram renovados semanalmente, momento em que as algas foram pesadas e as TCs foram calculadas.
Atualmente, estão sendo realizados experimentos com diferentes concentrações e regimes
nutricionais, como descrito no experimento da Uréia (dados não apresentados).
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5. Cultivo em Tanques
Foram instalados 4 tanques circulares de polietileno de 500 L (BAKOF TEC), interligados entre
si através de canos de PVC. Foram colocadas telas plásticas circulares com malha de 1,0 cm a uma
distância de 30 cm do fundo do tanque de forma a permitir que as algas permaneçam no meio da
coluna de água. A circulação da água é feita entre os tanques com bomba submersa de 23 watts e
capacidade de vazão de 1200 L h-1. A temperatura da água nos tanques é mantida com termostato em
aproximadamente 25 ± 1 ºC, salinidade em 35 ups e aeração constante. Os tanques são mantidos
dentro de uma casa de vegetação e protegidos da chuva. O sistema de cultivo é fechado, sem adição
de nutrientes e com renovação de água após períodos superiores a 30 dias (Figura 1).
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Havendo a necessidade de corrigir a salinidade, água de torneira com anticloro instantâneo
fabricado pela Empresa Mania de Peixes Ornamentais Ltda. é adicionada nos tanques para manter a
salinidade em 35 ups.
7. Cultivo Experimental no Mar
Os cultivos estão sendo realizados na Praia do Sambaqui, localizada na Baía Norte da Ilha de
Santa Catarina, em uma área experimental de cultivo de moluscos do Departamento de Aqüicultura da
UFSC.
O módulo de cultivo é composto por 13 quadras de 4 x 3 m, compostas por canos de PVC e
cabos multifilamento. Em cada quadra estão presos oito cabos monofilamento de cultivo. Em cada
cabo, 17 mudas de biomassa média de 20 g foram amarradas com espaçamento entre elas de 20 cm.
Abaixo da estrutura foi colocada uma rede de nylon com o objetivo de proteger as algas contra
eventuais herbívoros e evitar a dispersão e perda no ambiente (Figura 2).
Figura 1 Estrutura do cultivo em tanques de Kappaphycus alvarezii
17
Em cada extremidade da balsa foram colocadas poitas de 800 kg, confeccionadas de concreto
e ferro, além de bóias de sinalização.
Estão sendo testados diferentes tipos de amarrações das plantas e dos cabos de cultivo.
8. Análises Estatísticas
As TCs das diferentes linhagens foram analisadas segundo Análise de Variância (ANOVA) uni
ou multifatorial, e teste a posteriori de Duncan (multifatorial) ou Tukey (unifatorial) ou Unequal N (n
diferentes). TCs dos cultivos em tanques foram correlacionadas com temperatura e salinidade segundo
correlação de Spearman R. Todas as análises foram realizadas no Programa Statisitica (versão 6.0) ,
considerando p< 0,05.
Figura 2 Módulo de cultivo de Kappaphycus alvarezii instalado na Praia do Sambaqui. A. Visão geral B. Visão de uma quadra.
A B
18
9. Resultados e Discussão 9.1 Cultivo em Laboratório 9.1.1 Efeito de Diferentes Concentrações de Sulfato
Experimentos prévios demonstraram que algas cultivadas em água do mar sem sulfato
enriquecida com solução VS 50 sem sulfato não conseguiram sobreviver após 7 dias de cultivo, e as
TCs média em água do mar artificial enriquecida com VS 50 (0,23 - 1,24% dia-1) foram
significativamente menores do que as do controle (água do mar esterilizada enriquecida com VS 50 –
7,91 - 10,37 % dia-1). Plantas do controle apresentaram ainda TCs significativamente maiores em 14
dias de cultivo que em 7 dias (Figura 3).
Figura 3 – Taxas de crescimento (TC % dia-1) da linhagem verde cultivada por 14 dias em água do mar esterilizada enriquecida com solução von Stosch 50% (controle), água do mar artificial enriquecida com solução von Stosch 50% (artificial) e água do mar sem sulfato enriquecida com solução von Stosch 50% sem sulfato (sem SO4). Valores apresentados em médias (n=4); as barras verticais representam o intervalo de confiança e as letras as diferenças significativas entre o período de cultivo (minúsculas) e entre tratamento e controle (maiúscula), segundo teste a posteriori de Newman-Keuls.
0
2
4
6
8
10
12
7 14
período de cultivo (dias)
TC
(%
dia
-1)
Controle
Artificial
Sem SO4a A
b A
Sem SO4
BB
Após os experimentos prévios, ramos das linhagens MR e VD foram cultivados em meios de
cultura com diferentes concentrações de sulfato. Ramos de ambas as linhagens não sobreviveram
quando cultivados em água do mar sem sulfato enriquecida com solução VS 50 sem sulfato (Figura 4).
Não foram observadas diferenças significativas entre as TCs de plantas cultivadas no tratamento
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controle (água do mar enriquecida com solução VS 50) e com acréscimo de sulfato em ambas
linhagens, após 28 dias de cultivo. O sulfato não é considerado um fator limitante para o crescimento
das algas em condições normais devido a sua abundância no mar, e pouca atenção tem sido dada a
sua influência nos cultivos de algas marinhas. Essa abundância provavelmente explique as TCs
similares entre controle e tratamento com 80 mM de sulfato de sódio, quantidade 3 vezes maior que a
normalmente encontrada na água do mar (25 mM) (DeBoer 1981). Entretanto, a ausência de sulfato no
meio de cultura foi limitante na sobrevivência da espécie.
Nos primeiros 7 dias de cultivo a linhagem VD do controle apresentou TC média (8,71 ± 2 %
dia-1) significativamente maior do que a linhagem MR do controle (5,90 ± 1,43 % dia-1) ; no período
restante, não foram observadas diferenças significativas entre as linhagens (Figura 5).
A alta salinidade não interferiu nas taxas de crescimento uma vez que os mesmos resultados
foram obtidos após repetir o experimento, regulando a salinidade para 33 ups.
A carragenana é um dos principais componentes da parede celular de K. alvarezii e sua
funcionalidade é diretamente relacionada ao seu grau de sulfatação (Goulard & Diouris 2005). Apesar
da adição de sulfato não ter interferido na TC da espécie, existe a possibilidade de alteração na
Figura 4 Ramos de linhagens de Kappaphycus alvarezii cultivados em água do mar sem sulfato enriquecida com solução VS 50 sem sulfato. A. Linhagem marrom e B. Linhagem verde. Escala = 1 cm
A B
20
qualidade da carragenana e na estrutura da parede celular. Por esse motivo, após o encerramento dos
experimentos, amostras foram separadas para posterior análise de Microscopia Óptica e Eletrônica, e
qualidade de gel.
Figura 5 – Taxas de crescimento (TC % dia-1) das linhagens marrom (MR) e verde (VD) cultivadas por 28 dias em água do mar esterilizada enriquecida com solução von Stosch 50% (controle) e água do mar esterilizada enriquecida com solução von Stosch 50% acrescida de 80 mM de sulfato de sódio (Sulfato). Valores apresentados em médias (n=4); as barras verticais representam o intervalo de confiança e as letras as diferenças significativas entre as linhagens, segundo teste a posteriori de Newman-Keuls.
0
2
4
6
8
10
12
7 14 21 28
período de cultivo (dias)
TC
(%
dia
-1)
Controle MR
Sulfato MR
Controle VD
Sulfato VD
a
b
'
9.1.2 Crescimento em Água Proveniente da Praia do Sambaqui
As TCs média das linhagens incubadas em água do mar proveniente da Praia do Sambaqui
foram mais baixas (1,20 - 2,64 % dia-1) que as observadas normalmente em cultivo in vitro (Paula et al.
2001; Bulboa & Paula 2005). As TCs foram significativamente menores em 14 dias de cultivo somente
para as linhagens MR e VD. Não foram observadas diferenças significativas entre as linhagens (Figura
6). Após o período de incubação, foi observado despigmentação das plantas de todas as linhagens e
sinais de “ice-ice”, doença degenerativa do talo associada ao estresse (Figura 7). Provavelmente, essa
diminuição das TCs e despigmentação seja devido a limitação de nutrientes, uma vez que a água do
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mar onde as algas foram incubadas não foi renovada durante todo o período experimental. De acordo
com DeBoer (1981), a diminuição do conteúdo de pigmentos fotossintetizantes é uma das respostas
das algas a deficiência de nutrientes. Esta deficiência pode ter sido provocada ainda por competição
com outros microorganismos, uma vez que a água utilizada na incubação não foi filtrada nem
esterilizada.
Figura 6 - Taxas de crescimento das linhagens tetrasporofíticas marrom (MR), verde (VD) e vermelha (VM) e gametófito feminino (FM), incubadas por 14 dias em água do mar coletada da Praia do Sambaqui. Valores apresentados em média (n=3); as barras verticais apresentam os intervalos de confiança, e as letras as diferenças significativas entre os períodos de incubação de acordo com o teste a posteriori de Newman-Keuls.
0
1
2
3
4
7 14
período de incubação (dias)
TC
(%
dia
-1)
MR
VD
VM
FM
aA
b
B
Figura 7 Linhagens de Kappaphycus alvarezii incubadas por 14 dias em água do mar proveniente da Praia do Sambaqui. A. Linhagem marrom, B. Linhagem verde, C. Linhagem vermelha e D. Linhagem feminina. Escala = 1 cm.
A B C D
22
Após o período de incubação, as plantas foram cultivadas em água do mar esterilizada
enriquecida com solução VS 50, por 28 dias. Após 1 semana de aclimatação, todas as linhagens
recuperaram as TCs médias normalmente descritas para a espécie cultivadas in vitro (Paula et al.
2001; Bulboa & Paula 2005), com TCs máximas em 21 dias. Entretanto, em 28 dias de cultivo, as TCs
diminuíram significativamente para todas as linhagens, indicando provável limitação de espaço dentro
do frasco onde foram cultivadas (Figura 8. Segundo Paula et al. (2001), as maiores TCs são
observadas quando a biomassa de alga total é inferior a 10 g L-1 de meio de cultura.
Figura 8 - Taxas de crescimento das linhagens tetrasporofíticas marrom (MR), verde (VD) e vermelha (VM) e gametófito feminino (FM), cultivadas por 28 dias em água do mar esterilizada enriquecida com solução von Stosch 50%, após incubação por 14 dias em água do mar coletada da Praia do Sambaqui. Valores apresentados em média (n=3); as barras verticais apresentam os intervalos de confiança, e as letras as diferenças significativas entre os períodos de incubação de acordo com o teste a posteriori de Newman-Keuls.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
7 14 21 28
período de cultivo (dias)
TC
(%
dia
-1)
MR
VD
VM
FM
a
bc
bd
ac
A
B
a
b
A
B
Não foram observadas diferenças significativas entre as linhagens durante todo o período
experimental (Figura 6 e 9).
23
Figura 9 - Taxas de crescimento das linhagens tetrasporofíticas marrom (MR), verde (VD) e vermelha (VM) e gametófitos feminino (FM), cultivadas por 28 dias em água do mar esterilizada enriquecida com solução von Stosch 50%, após incubação por 14 dias em água do mar coletada da Praia do Sambaqui. Valores apresentados em média (n=3) e as barras verticais apresentam os intervalos de confiança.
0
1
2
3
4
5
MR VD VM FM
linhagem
TC
(%
dia
-1)
9.2 Análise dos Efeitos de Diferentes Fontes de Nutrientes Comerciais 9.2.1 Uréia Agrícola
Tanto no regime de pulso de nutrientes por 3 dias quanto no regime de semanas alternadas, as
TCs foram significativamente maiores na primeira semana para todos os tratamentos (Tabela 1).
Plantas cultivadas em uréia a 100% e 200% em regime de semanas alternadas apresentaram
diferenças significativas em relação ao controle em 7 e 35 dias de cultivo. Para plantas cultivadas em
regime de pulso, não foram observadas diferenças significativas em relação ao controle. Após 35 dias
de cultivo, praticamente todas as plantas dos tratamentos com uréia morreram. Entretanto, maior
incidência de “ice-ice” foi observada durante todo o período experimental em plantas cultivadas no
regime de semanas alternadas. Provavelmente, as plantas cultivadas nesse regime ficaram mais
susceptíveis ao desbalanço nutricional de fósforo/nitrogênio, uma vez que a uréia utilizada nos
tratamentos era composta apenas por 45% de nitrogênio, sem nenhum outro elemento mineral. Plantas
cultivadas em pulso de 3 dias, possuíam maior tempo hábil para recuperarem o balanço, embora
parcialmente, uma vez que possuíam apenas os nutrientes disponíveis naturalmente na água do mar.
Foi observado que a utilização de uréia como única fonte de nutrientes é prejudicial ao
24
desenvolvimento da espécie, sendo necessário o acréscimo de outros elementos minerais. De fato,
Navarro-Ângulo & Robledo (1999), em estudos sobre efeitos de fontes de nitrogênio, proporção N:P e
concentração de pulso de nitrogênio no crescimento de Gracilaria cornea, relatam maiores taxas de
crescimento quando a relação de N:P era de 10:1 do que 10:0 em solução Provasoli (PES). Segundo
estes autores, plantas cultivadas com meio de cultura PES com relação N:P 10:0 conseguiram
sobreviver, porém apresentaram coloração pálida a partir de duas semanas de cultivo. No presente
experimento, como apenas uréia foi fornecida, sem outra solução de nutrientes, as plantas não
sobreviveram.
Tabela 1 – Taxas de crescimento da linhagem marrom cultivada por 35 dias em regime de pulso de nutrientes por 3 dias (P) ou em semanas alternadas (A), em diferentes concentrações de uréia comercial: a) 50% (U50P e U50A), b) 100% (U100P e U100A) e c) 200% (U200P e U200A). Como controle, foi utilizado água do mar esterilizada enriquecida com solução von Stosch 50% (CP e CA). Valores apresentados em médias (n=3) ± intervalo de confiança. Os asteriscos indicam as diferenças significativas entre os períodos de cultivo e as letras, as diferenças entre controles e tratamentos, segundo teste a posteriori de Newman-Keuls.
Período de cultivo (dias) Tratamento 7 14 21 28 35
CP 3,34% ∗ ± 0,31
0,68% ± 0,30
1,25% ± 0,98
1,17% ± 1,77
1,03% ± 0,57
CA 7,15% ∗a
± 1,03 2,98% ± 1,16
2,79% ± 1,01
2,93% ± 0,20
3,31% a
± 0,45
U50P 3,73% ∗ ± 0,64
0,76% ± 0,26
0,00% ± 0,00
1,49% ± 1,27
0,00% ± 0,00
U50A 3,50% ∗ ± 0,27
1,17% ± 0,11
0,00% ± 0,00
0,37% ± 0,09
0,00% b
± 0,00
U100P 3,28% ∗ ± 0,74
0,59% ± 0,06
0,21% ± 0,19
0,53% ± 0,51
0,10% ± 0,17
U100A 3,70% ∗b
± 0,64 0,59% ± 0,53
0,15% ± 0,26
0,22% ± 0,38
0,00% b
± 0,00
U200P 3,19% ∗ ± 0,40
1,03% ± 0,32
0,21% ± 0,36
0,18% ± 0,31
0,00% ± 0,00
U200A 4,74% ∗b
± 0,68 0,44% ± 0,29
0,17% ± 0,29
0,38% ± 0,65
0,12% b ± 0,21
25
9.2.2 Adubo NPK 15:15:20
Experimentos prévios indicam que ramos da linhagem VD cultivados em NPK na concentração
de 50% apresentaram TC média entre 0,82 – 2,41% dia-1. As TCs em 7 e 14 dias foram
significativamente maiores que no período restante (Figura 10). Em todo o período experimental,
nenhuma planta apresentou sinais de “ice-ice” e ao término do experimento, foi observada alteração na
tonalidade das plantas de verde escuro para verde amarronzado. Essa mudança de tonalidade está de
acordo com o observado por Navarro-Ângulo & Robledo (1999) em Gracilaria cornea cultivada em meio
de cultura com relação N:P 10:10, similar ao utilizado no presente experimento.
As TCs observadas estão dentro do esperado para o propósito inicial de manter as plantas
saudáveis com fertilizantes comerciais de baixo custo. Experimentos testando concentrações mais
altas de NPK e diferentes regimes de nutrientes (contínuo ou em pulso) estão em andamento.
Figura 10 – Taxas de crescimento da linhagem verde cultivada por 35 dias em água do mar esterilizada enriquecida com solução NPK 50% (5,83g L-1). Valores apresentados em médias (n=3). As barras verticais representam o intervalo de confiança e as letras, as diferenças significativas de acordo com teste a posteriori de Newman-Keuls.
0
1
2
3
7 14 21 28 35
período de cultivo (dias)
TC
(%
dia
-1)
a ca
b
bb d
26
10. Cultivo em Tanques
Desde o início do cultivo nos tanques, algumas alterações tiveram que ser realizadas de forma
a aprimorar o sistema de cultivo. Foi instalado um filtro de partículas sólidas de forma a melhorar a
qualidade da água. As algas apresentaram uma coloração pálida com as pontas despigmentadas após
um período de 30 dias de cultivo sem renovação de água. Possivelmente, esse aspecto possa estar
relacionado à baixa disponibilidade de nutrientes e a alta incidência de luz. Segundo Werlinger & Alveal
(1995) se a incidência de luz ultrapassa os limites máximos, ocorre a despigmentação e debilitação dos
talos das algas, e redução nas TCs. A irradiância excessiva causa foto-oxidação dos pigmentos e
posterior destruição dos cloroplastos e proteínas internas da planta.
Como uma tentativa melhorar o desempenho da espécie nesse sistema, foi colocada tela
sombrite (25% de passagem de luz) em cima dos tanques para diminuir a incidência de radiação solar
e solução VS 50 foi adicionada diretamente nos tanques. Entretanto, como a água do mar utilizada não
é esterilizada, houve uma proliferação excessiva de outros microorganismos, como colônias de
cianobactérias, ocasionando alta turbidez da água e prejudicando a incidência de luz. Sendo assim,
pulsos de nutrientes em recipientes plásticos de 50 L foram realizados com água do mar enriquecida
com solução VS 50 por 7 dias em aeração constante. Após esse período, as linhagens foram
transferidas novamente para os tanques.
Atualmente, o regime de pulsos de nutrientes associado a menor incidência de luz tem
apresentado resultados satisfatórios. As plantas estão se mantendo saudáveis por períodos superiores
a 30 dias sem renovação de água. Materiais precipitados no fundo dos tanques são sifonados quando
observados em excesso.
11. Cultivo Experimental no Mar
Embora existam procedimentos padrões para o cultivo de K. alvarezii, deve-se considerar que
a maioria dos protocolos de cultivo, como espaçamento dos propágulos no cabo de cultivo, período de
27
crescimento, tamanho do propágulo, profundidade e distância entre cabos de cultivo são específicos de
cada região e época do ano. Assim, diversos experimentos devem ser realizados para se determinar as
metodologias mais adequadas que garantam uma alta produtividade ao longo do ano (Ask & Azanza
2002). A região da Praia do Sambaqui possui características bem diferentes da Baía de Itaguá, em
Ubatuba, São Paulo. Essas características incluem maior força de água e maior influência às variações
de correntes. Esses fatores contribuíram para a dificuldade em estabelecer o cultivo na região, uma vez
que amarrações das plantas iguais às utilizadas em Ubatuba não foram eficientes em Florianópolis.
Foram testados diversos tipos de amarrações, com diferentes materiais, porém todos
provocaram a ruptura das plantas devido à força da água (Figura 11).
Atualmente, a amarração que parece estar funcionando para manter as algas nos cabos de
cultivo de monofilamento é realizada através de cabos multifilamento. Esse cabo, por ser mais macio,
evita a ruptura da alga, mesmo quando a força da água é intensa, o que não foi observado quando se
utilizava fitilhos de plástico (tradicional “tie-tie”). Por outro lado, amarrações com ganchos feitos com
cabo monofilamento, como os utilizados em Ubatuba, mantinham as plantas muito expostas à
superfície, causando “ice-ice”. Esse tipo de amarração é bem eficiente para plantas do tamanho de
propágulos comerciais, entre 150 a 200g. No presente estudo, as plantas foram transferidas para o mar
em tamanhos que variavam de 10 a 20 g.
Figura 11 Principais amarrações testadas no cultivo experimental de Kappaphycus alvarezii realizado na Praia do Sambaqui.
28
Incrustações também foram freqüentes, e na rede colocada abaixo do módulo de cultivo, foi
observada uma grande quantidade de Hypnea musciformis. Até o momento, não foi notada a ação de
herbívoros e a dispersão da espécie nos costões e praias adjacentes não foi observada.
Devido a todos os problemas expostos, não foi possível iniciar os experimentos de crescimento
no mar, que está previsto para iniciar após o período de inverno, mais crítico para os cultivos.
12. Considerações Finais
O cultivo estabelecido na Praia do Sambaqui ainda apresenta problemas de adequação do
módulo de cultivo às condições da região. Por esse motivo, experimentos de crescimento e
produtividade das diferentes linhagens ainda não foram realizados. Além disso, com a proximidade do
inverno, época crítica para o crescimento das algas em Santa Catarina devido às baixas temperaturas,
considera-se prudente observar o desempenho da espécie nessas condições para então iniciar tais
experimentos, previstos para agosto do presente ano.
Em relação ao cultivo em tanques, a proposta inicial de estabelecer condições de cultivo que
mantivesse as plantas saudáveis foi cumprida. O propósito de se manter as plantas e não crescê-las se
deve principalmente a inviabilidade financeira de manter grande biomassa estocada por períodos de
condições desfavoráveis no mar. Entretanto, alguns ajustes ainda devem ser realizados, principalmente
em relação à utilização de fertilizantes comerciais de baixo custo e freqüência de pulso de nutrientes.
Os resultados parciais dos experimentos de cultivo em tanques e de incubação com água
proveniente na Praia do Sambaqui serão apresentados no VIII Congresso de Ficologia da América
Latina e do Caribe, que será realizado nos dias 21 a 29 de agosto, em Lima, Peru.
29
13. Referências
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