criopreservação de embriões embrioes...celular, prejudiciais á funcionalidade das células....

Criopreservação de embriões

Vicente J.F. Freitas Biotecnologia da Reprodução Animal Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução www.uece.br/lfcr

Aula ministrada por: M.Sc. Ribrio Ivan T. P. Batista

1.  PRINCÍPIO DA CRIOPRESERVAÇÃO

1.  Danos causados pela criopreservação

2.  Proteção contra danos

2.  TÉCNICAS DE CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES

3.  FATORES QUE AFETAM O SUCESSO DA TÉCNICA

4.  CONSIDERAÇÕES FINAIS

Redução ou mesmo parada de todos os fenômenos biológicos

(movimentos moleculares, reações químicas e atividades

enzimáticas), as temperaturas inferiores a - 150 °C.

Conceito

– Embrião de camundongo (Whittingham et al., 1972)

– Embrião de bovino (Wilmut e Rowson, 1973)

– Embrião de ovino (Willadsen et al., 1976)

– Embrião de caprino (Bilton e Moore, 1976)

Histórico

1.  Otimização das biotecnologias reprodutivas.

2.  Conservação de material genético – extinção/produção.

a.  Preservação de raças em vias de extinção.

3.  Prevenção de perdas de animais vivos durante o

transporte.

4.  Adequação a época de parições.

Vantagens

O p r o t o c o l o e m p r e g a d o n a

criopreservação de uma célula deve ser

suficientemente lento para prevenir a

cristal ização da água intracelular e

suficientemente rápido para prevenir a

expos ição das cé lu las a e levadas

concentrações de eletrólitos antes da

congelação.

Princípio da criopreservação

Lesões nas membranas

Danos

Desnaturação proteíca

Danos

Desnaturação do citoesqueleto

Danos

Ø  Crioprotetores

ü  Proteção celular

ü  Reduzem a formação de cristais de gelo

ü  Reduzem do ponto crioscópico da água

ü  Maior estabilidade a membrana celular

Proteção

¨  Crioprotetores

¨  Substituem e/ou removem a água intracelular

¨  Intracelulares (penetrantes)

¨  Et i lenogl icol , d imet i l sufóx ido, gl icerol ,

propanodiol, butanodiol e metanol

¨  Extracelulares (não penetrantes)

¨  Lactose, glicose, sacarose, polivinilpirrolidona,

manitol, trealose e albumina sérica bovina

(BSA)

Proteção

¨  Crioprotetores

¨  Moléculas protetoras do citoesqueleto

¨  Citocalasina B

Proteção

�  Toxicidade de Crioprotetores

¨  Concentração

¨  Entre 1 e 2 M

¨  Tempo de exposição 10 a 20 min.

¨  Nível de toxicidade

¨  Etilenoglicol

¨  Glicerol

¨  Propilenoglicol

Proteção

¨  Métodos de criopreservação

¨  Congelamento lento

¨  Convencional

¨  One-Step

¨  Vitrificação

¨  OPS

¨  Em grade de microscopia eletrônica de transmissão

¨  Cryollop

¨  Micropipetas de vidro – GMP

¨  Em superfície sólida de vitrificação – SSV

¨  Microgotas

¨  Hemi-palhetas (“Hemi Straw”)

Métodos

São utilizados taxas de resfriamento que permitem a

troca de água intracelular por crioprotetor, sem

grandes efeitos osmóticos ou mudanças na forma

celular, prejudiciais á funcionalidade das células.

Congelação lenta

1.  Lavar embriões em PBS com 0,4% de BSA

2.  Equilíbrio com 1,5 M de etileno glicol em PBS com 0,4% de BSA

por pelo menos 5’;

Etapas de congelação lenta com etilenoglicol

Congelação lenta

3.  Envase durante o equilíbrio (mínimo de três colunas, separadas por

bolhas de ar; embrião na coluna do meio)

4.  Levar palhetas ao congelador de embriões (já estabilizado entre -5

e -7ºC);

5.  Deixar por 5 minutos a -5/-7ºC;


Congelação lenta


Congelação lenta

6.  Realizar o seeding;

7.  Confirmar formação do gelo nas palhetas;

8.  Deixar mais 5 min. a -5/-7ºC;


Congelação lenta

8.  Deixar mais 5 min. a -5/-7ºC;

9.  Iniciar curva de congelação (-0,3 a -0,6ºC/min);

10. Após atingir 32ºC, mergulhar palheta em N2 liquido (não tocar

palheta com as mãos).


Congelação lenta

1.  Descongelação: 5” no ar e 30” em banho-Maria a 35-37ºC

2.  Palheta é montada diretamente no inovulador ;

3.  Recomendado não levar mais do que 20’ entre a

descongelação e a inovulação;

4.  Não existe avaliação prévia do embrião.

Etapas de descongelação lenta com etilenoglicol

Congelação lenta

Ø  Estado líquido estado vítreo (amorfo)

Ø  Crioprotetores com alto grau de viscosidade

Ø  Crioprotetores: etilenoglicol e DMSO

Ø  Alta velocidade na congelação (imersão direta

no N2)

Vitrificação

Vitrificação por OPS (Vajta, 1998).

Ø Palheta de 0,25 ml esticada (diâmetro interno pequeno)

Ø Crioprotetores:

Ø Meios

Ø Solução I (VS1):

Ø TCM Hepes + SFB (20%)

Ø Etilenoglicol (7,5%) e DMSO (7,5%)

Ø Solução II (VS2):

Ø TCM Hepes + SFB (20%)

Ø Etilenoglicol (16,5%) e DMSO (16,5%) + sacarose (0,5 M)

Vitrificação

VS1: 7,5% EG + 7,5% DMSO - 1 min

VS2: 16,5% EG + 16,5% DMSO - 20 seg

Vitrificação

Vitrificação

ü  Reaquecimento:

ü  Meios:

ü  SM (sacarose 0,5 M): PBS+5%SFB

ü  Poço 1: 800 μl HM, 400 μl SM

ü  Poço 2: 800 μl HM, 400 μl SM – 5 min

ü  Poço 3: 800 μl HM, 200 μl SM – 5 min

ü  Poço 4: 800 μl HM

P-1 P-2

P-3 P-4

Vitrificação

Ø  Vitrificação X Congelamento lento

Ø  Inconvenientes:

Ø  Estresse osmótico

Ø  Toxicidade químico de crioprotetor

Ø  Vantagens:

Ø  Não precisa de um congelador programável

Ø  Técnica muito rápida

Vitrificação

q  Qualidade do embrião

Fatores influenciando o sucesso da técnica

q  Estádio de desenvolvimento embrionário


q  Raça – Bos taurus x Bos indicus

q  Espécies zebuínas – menor taxa de sobrevivência

embrionária


q  Origem do embrião


Tabela 1. Taxa de fertilidade ao parto e sobrevivência embrionária após

inovulação de embriões vitrificados obtidos pela produção in vivo ou in vitro

(COGNIÉ e BARIL, 2002).

Parâmetro observado

Ovinos In vivo In vitro

Caprinos In vivo In vitro

Número de receptoras 33 34 27 20

Parto (%) 70a 15ª 52 45

Sobrevivência embrionária (%) 49b 9b 37 30

Letras diferentes na mesma coluna: P < 0,001


Ø  Ambas as técnicas (congelação lenta e vitrificação)

podem ser utilizadas para criopreservação de embriões.

Ø  A eficiência das duas técnicas podem variar de acordo

com diversos fatores.

Considerações Finais

criopreservação de embriões embrioes...celular, prejudiciais á funcionalidade das células....

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