CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EQÜINO: DESENVOLVIMENTO DE EQUIPAMENTOS PARA CONGELAMENTO EM ACELERAÇÃO E

PARA DESCONGELAMENTO ULTRA-RÁPIDO (98ºC/4seg)

GUILHERME VALENTE DE SOUZA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

SETEMBRO – 2006

CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EQÜINO: DESENVOLVIMENTO DE EQUIPAMENTOS PARA CONGELAMENTO EM ACELERAÇÃO E

PARA DESCONGELAMENTO ULTRA-RÁPIDO (98ºC/4seg)

GUILHERME VALENTE DE SOUZA

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal.

Orientador: Prof. José Frederico Straggiotti Silva

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

SETEMBRO – 2006

CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN EQÜINO: DESENVOLVIMENTO DE EQUIPAMENTOS PARA CONGELAMENTO EM ACELERAÇÃO E

PARA DESCONGELAMENTO ULTRA-RÁPIDO (98ºC/4seg)

GUILHERME VALENTE DE SOUZA

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal.

Aprovada em 27 de setembro de 2006. Comissão Examinadora: _______________________________________________________ Prof. José Antonio Silva Ribas (DS. Produção Animal) - UFF _______________________________________________________ Prof. José Tarcisio Lima Thiébaut (DS. Produção Animal) - UENF _______________________________________________________ Profa. Isabel Cândia Nunes da Cunha (DS. Reprodução Animal) - UENF _______________________________________________________ Prof. José Frederico Straggiotti Silva (DS. Reprodução Animal) – UENF

(Orientador)

ORAÇÃO DO CAVALO

DONO MEU:

Dá-me, freqüentemente, de comer e beber, e, quando tenhas terminado de

trabalhar-me, dá-me uma cama na qual eu possa descansar comodamente.

Examina todos os dias os meus pés e limpa meu pêlo. Quando eu recusar a

forragem, examina meus dentes e minha boca, porque bem pode ser que eu tenha

uma travagem que me impeça de comer.

Fala-me; tua voz é sempre mais eficaz e mais conveniente para mim que o

chicote, que as rédeas e que as esporas. Acaricia-me freqüentemente para que eu

possa compreender-te, querer-te e servir-te da melhor maneira e de acordo com os

teus desejos. Não corte o meu rabo muito curto, privando-me do melhor meio que

tenho para espantar as moscas e insetos.

Não me batas violentamente e nem dês golpes violentos nas rédeas, pois, se

não obedeço, como queres, é porque ou não te compreendo ou porque estou mal

encilhado, com o freio mal colocado, com alguma coisa nos meus pés ou no meu

ombro que me causam dor. Se eu me assustar, não deves bater-me sem saberes a

causa disso, pois bem pode ser o defeito de minha vista ou um proverbial aviso para

ti.

Não me obrigues a andar muito depressa em subidas, descidas, estradas

empedradas ou escorregadias. Não permaneças montado sem necessidade, pois

prefiro marchar, a ficar parado com uma sobrecarga sobre o dorso. Quando cair,

tenha paciência comigo e ajuda-me a levantar, pois, faço quanto posso para não cair

e não causar-te desgosto algum. Se tropeçar, não deves pôr a culpa para cima de

mim, aumentando minha dor e a impressão de perigo com tuas chicotadas; isso só

servirá para aumentar meu medo e minha má vontade. Procura defender-me da

tortura do freio, não no trabalho, mas quando esteja em descanso, e cobre-me com

a manta ou com uma capa apropriada.

Enfim meu dono, quando a velhice me tornar inútil, não esqueça o serviço que

te prestei, obrigando-me a morrer de dor e privações sob o jogo de um dono cruel ou

nos varais de uma carroça, se não puderes manter-me, ou mandar-me para o

campo, mata-me com tuas próprias mãos, sem me fazer sofrer. Eis tudo o que eu te

peço, em nome daquele que quis nascer numa baia, minha morada e não num

palácio, tua casa.

Autor desconhecido

Aos meus pais, pela educação desde meu primeiro dia de vida até hoje e,

também, pelo mais puro amor, carinho, dedicação e companheirismo nas horas mais

difíceis dessa dura caminhada.

Aos meus irmãos, William e Marden, pela força em todos os momentos de

nosso dia-a-dia.

À minha noiva, Lívia, pela sua imensa dedicação, compreensão, amor e

carinho em todos os momentos e a seus familiares, pela atenção e carinho.

Ao meu avô e ao meu tio-avô, Walcy e Hervan, respectivamente, por

passarem as suas experiências de vida de forma simples, mas de tão bela grandeza

para minha formação como pessoa e, a todos meus familiares tanto os “presentes”

em vida quanto os “ausentes”.

DEDICO

AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me dado forças para finalizar este trabalho e por sempre estar

presente para que eu superasse os obstáculos encontrados nessa minha árdua

caminhada.

À Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) e ao Centro de

Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA) pelo oferecimento deste curso.

Ao CNPq pela concessão de bolsa de estudo, pois sem ela seria impossível

permanecer nesta cidade.

Ao orientador e professor José Frederico Straggiotti Silva, principalmente pela

amizade e confiança, pela orientação neste trabalho de forma integral e incansável,

por me fazer um pesquisador capaz de vencer obstáculos dando estímulos,

sugestões e apresentando algumas dificuldades para desenvolver a capacidade de

pensar.

Ao meu amigo Bruno Fagundes, pela sua amizade fraterna, desde o início de

nossa difícil caminhada pela graduação, mestrado e doutorado, mostrando-se

presente em todos os momentos, sem medir esforços para ajudar.

Ao Cláudio Wermelinger, por sua amizade e ajuda para a realização deste

trabalho de pesquisa.

Aos nobres amigos José Renato e Marcus Barreto, pela amizade fraterna e

companheirismo, mostrando sempre prontos nas horas difíceis como também no

compartilhamento do conhecimento.

Ao Vinícius, “caro Watson”, meu co-orientado de Iniciação Científica, por sua

intensa e incansável ajuda e pela sua amizade.

Aos técnicos do LMGA, Thiago e Vânia, pelos auxílios nos trabalhos

desenvolvidos, pela organização e manutenção de equipamentos do laboratório.

Àqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste

trabalho.

BIOGRAFIA

GUILHERME VALENTE DE SOUZA, filho de Telmo Marden de Souza e Anna

Maria Valente de Souza, nasceu em 21 de junho de 1977, na cidade de Rio Bonito –

RJ.

Em março de 1996, iniciou o curso de Medicina Veterinária na Universidade

Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes – RJ, onde se

formou em março de 2001.

Em março de 2001, deu início ao Curso de Pós-graduação em Produção

Animal, ao nível de Mestrado, na área de Reprodução Animal, da Universidade

Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes – RJ,

submetendo-se à defesa de tese, para conclusão do curso, em março de 2003.

Em março de 2003, deu início ao Curso de Pós-graduação em Produção

Animal, ao nível de Doutorado, na área de Reprodução Animal, da Universidade

Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes – RJ,

submetendo-se à defesa de tese, para conclusão do curso, em setembro de 2006.

RESUMO

Souza, Guilherme Valente; DSc; Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy Ribeiro; setembro/2006; Criopreservação de sêmen eqüino: desenvolvimento de equipamentos para congelamento em aceleração e para descongelamento ultra-rápido (98ºC/4seg); Professor orientador: José Frederico Straggiotti Silva. Professora conselheira: Isabel Cândia Nunes da Cunha.

O sêmen criopreservado de mamífero é reconhecidamente caracterizado por ter uma fertilidade menor em comparação com o sêmen fresco. A redução da fertilidade transparece tanto em uma menor viabilidade pós-descongelamento como nas disfunções sub-letais da porção da sub-população sobrevivente. Torna-se necessário, então, uma otimização da criopreservação do sêmen eqüino e conseqüente padronização desta metodologia, pois facilitaria o armazenamento e a propagação da genética de cavalos de grande valor através da reprodução assistida. Pretendeu-se, neste trabalho, desenvolver um novo protocolo de congelamento e de descongelamento de sêmen eqüino utilizando um sistema automatizado eletroeletrônico para o congelamento e outro para o descongelamento. No congelamento foram utilizadas 4 curvas de resfriamento, obtidas à 1cm, 4cm e 8cm acima do nível do nitrogênio líquido e, a outra através da máquina de congelamento, sendo a taxa de resfriamento para o congelamento à 1cm do nitrogênio foi de -87ºC/min de 5 à -120ºC e -8,65ºC/min de -120 à -196ºC, taxa de resfriamento para o congelamento à 4cm do nitrogênio foi de -46,8ºC/min de 5 à -120ºC e -9,86ºC/min de -120 à -196ºC, taxa de resfriamento para o congelamento à 8cm do nitrogênio foi de -15,26ºC/min de 5 à -120ºC e -31,71ºC/min de -120 à -196ºC e taxa de resfriamento para o congelamento na máquina foi de -12,20ºC/min de 5 à -120ºC e -85ºC/min de -120 à -196ºC. No descongelamento utilizou-se duas metodologias, a convencional (37±1ºC/1minuto) e na máquina de descongelamento ultra-rápido (98±1ºC/4 seg e depois 37±1ºC até completar 1 minuto). Foi verificado que a interação máquina de congelamento com a máquina de descongelamento ultra-rápido foi a melhor interação, visto que a proporção da integridade de acrossoma foi maior entre as médias populacionais por intervalo de confiança, com 95% de probabilidade.

Propõe-se como novo protocolo de criopreservação de sêmen eqüino a interação das duas máquinas.

Palavras-chave: Eqüino, espermatozóides, congelamento, descongelamento,

máquina de descongelamento ultra-rápido e máquina de congelamento.

ABSTRACT

The mammalian criopreservated semen is characterized by having a lower fertility

rate when compared to fresh semen. The reduction of the fertility is presented in a

lower post-thawing semen viability and also in a sub-lethal damage of the

cryosurvival sob-population. Then, the optimization of the stallion semen

cryopreservation and standardization of this procedure is a must, since it enables the

storage and propagation of high genetic stallions through the attended reproduction.

The aim of this work was to develop a new freezing and thawing stallion semen

protocols using an electronic programmable system for freezing and another one for

thawing. To freeze, four cooling rates have been used, and have been obtained at

1cm (-87ºC/min from 5 to -120ºC and -8,65ºC/min from -120 to -196ºC), 4cm

(46,8ºC/min from 5 to -120ºC and -9,86ºC/min from -120 to -196ºC) and 8cm (-

15,26ºC/min from 5 to -120ºC and -31,71ºC/min from -120 to -196ºC) above the liquid

nitrogen vapour and the other one through the freezing machine (-12,20ºC/min from

5 to -120ºC and -85ºC/min from -120 to -196ºC).

Two methods have been used at the thawing process, the standard one

(37±1ºC/1min) and the ultra-fast thawing machine (98±1ºC/4sec and after 37±1ºC

until one full minute). This study demonstrates that the interaction of both machines

(the freezing and the thawing ones) was better than all the other interactions, since

the acrossome integrity proportion was higher among population standards per

confidence interval, with 95% of probability. The interaction between these two

machines is proposed as a new protocol of stallion semen cryopreservation.

Key-words: Equine, spermatozoa, freezing, tthawing, ultra-fast thawing

machine and freezing machine.

SUMÁRIO

RESUMO viii ABSTRACT x 1 INTRODUÇÃO 01 2 REVISÃO DE LITERATURA 06 2.1 Sêmen 06 2.1.1 Células espermáticas 06 2.1.2 Membrana Plasmática do espermatozóide 07 2.1.3 Plasma seminal 09 2.2 Efeitos da temperatura 10 2.2.1 Taxa de resfriamento 10 2.2.2 Formação e dissolução dos cristais de gelo 12 2.3 Processos da Criopreservação 14 2.3.1 Congelamento 14 2.3.2 Descongelamento 21 2.3.3 Pressão osmótica 24 3 MATERIAL E METODOS 28 3.1 Animais 28 3.2 Sêmen 28 3.3 Soluções 29 3.3.1 Diluentes 29 3.3.1.1 Diluente de centrifugação 29 3.3.1.2 Diluente de congelamento 29 3.3.2 Formol-citrato 29 3.3.3 Diacetato carboxifluoresceína e iodeto de propídio – CFDA 29 3.3.4 Fitc-PNA e iodeto de propídio - Fitc-PNA 30 3.4 Concentração das amostras 30 3.4.1 Sêmen nativo 30 3.4.2 Células em diluente de centrifugação 30 3.4.3 Células em diluente de congelamento 30 3.5 Congelamento 31 3.6 Temperatura e tempo de descongelamento 31 3.7 Motilidade espermática 32

3.8 Integridade de membranas – CFDA 32 3.9 Integridade de acrossoma - Fitc-PNA 33 3.10 Máquina de descongelamento 34 3.11 Máquina de congelamento em aceleração 36 3.12 Estatística 38 4 RESULTADOS 39 4.1 Motilidade 39 4.2 Integridade de membrana 43 4.3 Integridade de acrossoma 45 4.4 Curvas de congelamento 48 4.4.1 Curva de resfriamento 20±1ºC à 5±1ºC 48 4.4.2 Curva de congelamento à 1cm do nitrogênio de 5±1ºC à -196ºC 48 4.4.3 Curva de congelamento à 4cm do nitrogênio de 5±1ºC à -196ºC 49 4.4.4 Curva de congelamento à 8cm do nitrogênio de 5±1ºC à -196ºC 49 4.4.5 Curva de congelamento na máquina de 5±1ºC à -196ºC 50 4.5 Curvas de descongelamento 50 4.5.1 Curvas de descongelamento convencional 50 4.5.2 Curvas de descongelamento na máquina ultra-rápida 51 5 DISCUSSÃO 52 6 CONCLUSÃO 61 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 62 8 ANEXOS 70

1

1. INTRODUÇÃO

A inseminação artificial foi a biotecnologia mais importante aplicada aos

animais e, com seu desenvolvimento, houve o melhoramento nos métodos de

manejo dos machos e coleta, avaliação, preservação de sêmen e inseminação, não

deixando de salientar avanços ocorridos nas metodologias de detecção do cio e no

controle do ciclo estral nas fêmeas.

O desenvolvimento da inseminação artificial foi um marco histórico de

incansáveis pesquisadores dedicados na busca do conhecimento para substituir a

ficção em fatos e, conseqüentemente, a aplicação desta ferramenta biotecnológica.

Existe uma história não documentada que os árabes obtinham sêmen de

esponjas introduzidas na vagina de éguas cobertas de grupos rivais e usavam estas

para inseminar suas próprias éguas.

Os primeiros a visualizarem os espermatozóides foram LEEWENHOEK e seu

assistente, HAMM, no ano de 1678, denominando-os de “animacules” (FOOTE,

2002).

A primeira inseminação artificial com sucesso foi feita por Spallanzani, no ano

de 1784, feita em cão, obtendo como resultado 3 filhotes após 62 dias da

inseminação (FOOTE, 2002).

As pesquisas sobre inseminação artificial em eqüinos iniciaram-se na Rússia

em 1899 (IVANOFF, 1922, citado por FOOTE, 2002) estimuladas pela necessidade

de cavalos para uso das forças militares. ISHIKAWA iniciou estudos similares no

Japão em 1912 (NISHIKAWA, 1962, citado por FOOTE, 2002); já nos Estados

2

Unidos os estudos sobre coleta, processamento e inseminação em eqüinos foram

iniciados por MCKENZIE e colaboradores em 1939 e BERLINER em 1942.

As primeiras coletas de sêmen foram realizadas colocando um saco de coleta

de borracha na vagina de éguas em cio. Em 1930 e 1940, outros modelos de vagina

artificiais foram desenvolvidos e vêm sendo modificados. A primeira versão de

modelo de vagina artificial para eqüino foi desenvolvida por NISHIKAWA (DAVEIS

MOREL, 1999).

Antes da II Guerra Mundial a principal fonte de garanhões provinha dos

plantéis de cavalos militares (MAULE, 1962, citado por FOOTE, 2002), e, no pós-

guerra, muitos desses plantéis foram eliminados porque a população de cavalos

decresceu. A regulamentação de algumas associações de criadores de cavalos ao

restringir o uso da inseminação artificial desestimulou as pesquisas nesta área e a

sua aplicação. Entretanto a China foi a que mais utilizou a inseminação artificial em

eqüino neste período.

No decorrer da história da criopreservação, POLGE et al. (1949) tiveram

sucesso no congelamento de sêmen de ave ao incluir no diluente o glicerol. Muitos

pesquisadores realizaram experimentos, no ano de 1940, para congelar sêmen de

touro utilizando etileno glicerol e conservando-o a –10ºC, porém, não tiveram

sucesso. Também foram utilizados açúcares como crioprotetor, mas sem sucesso

(FOOTE, 2002).

O diluente utilizado por POLGE foi originalmente citrato-gema mais glicerol

(SALISBURY et al., 1941). ALQUIMIST e colaboradores (O’DELL e ALQUIMIST,

1957) desenvolveram o meio para criopreservação de sêmen de touros utilizando

leite integral mais glicerol. O diluente tampão tris-gema mais glicerol também

promoveu excelente proteção aos espermatozóides congelados e não-congelados

(FOOTE, 1998).

Outra grande mudança ocorreu nos anos de 1950 com a troca da substância

criogênica utilizada para o armazenamento do sêmen congelado. O dióxido de

carbono sólido à –79ºC foi substituído pelo nitrogênio líquido à –196ºC. Alguns

pesquisadores demonstraram que a sobrevida dos espermatozóides à –196ºC era

infinita, enquanto que à –79ºC ocorriam mudanças biológicas nas células

espermáticas. Também o armazenamento com o dióxido de carbono sólido não era

conveniente, pois necessitava de recargas mais freqüentes (FOOTE, 2002).

3

O armazenamento do sêmen congelado em dióxido de carbono sólido (gelo

seco) ou nitrogênio líquido foi um problema ao se utilizar ampolas de vidro que,

freqüentemente, quebravam durante o congelamento e descongelamento (FOOTE,

2002).

CASSOU (1964) modificou o sistema desenvolvido por SORENSEN (1940),

através da utilização de um método de selar as palhetas de plástico e um dispositivo

para a deposição do sêmen no útero (PICKETE e BERNDTSON, 1974). Foram

utilizadas inicialmente palhetas com capacidade de 0,5 mL para envasar o sêmen a

ser congelado, porém, mais recentemente, as palhetas de 0,25 mL têm sido mais

utilizadas devido estas requererem menor espaço para armazenamento (FOOTE,

2002).

No início da utilização do nitrogênio líquido para armazenamento, foram

encontrados problemas na conservação por um tempo mais prolongado do mesmo,

pois o isolamento dos botijões era ineficiente e também havia necessidade de

recarga freqüente para se manter a temperatura de –196ºC. Alguns anos mais tarde,

J. Rockfeller Prentice financiou o desenvolvimento de botijões que ofereciam melhor

isolamento térmico e, com isso, houve um crescimento na indústria de

criopreservação (FOOTE, 2002).

Com os avanços na criopreservação de sêmen de touros, observou-se um

crescente interesse pela criopreservação de sêmen eqüino. Vários métodos foram

desenvolvidos para o congelamento de sêmen eqüino, porém a inseminação artificial

nesta espécie vem sendo, ainda hoje, realizada utilizando sêmen resfriado diluído e

inseminado num período máximo de 48 horas após coleta.

O sêmen congelado é menos fértil do que o sêmen fresco (SHANNON e

VISHWANATH, 1995). Muitos aditivos na preparação dos diluentes para o

congelamento de células espermáticas não obtiveram resultados satisfatórios na

melhoria da fertilidade do sêmen congelado (FOOTE, 1999). Entretanto, alguns

pesquisadores afirmam que a adição de peptídeo melhora a fertilidade do sêmen

congelado e descongelado (AMANN et al., 1999). FAGUNDES (2003) observou que

a adição de proteínas concentradas, com massa molecular superior a 10 kDa, do

plasma seminal no diluente melhoraria as características espermáticas no

congelamento e descongelamento, enquanto que a troca do plasma seminal de

garanhões bons congeladores pelo plasma seminal de maus congeladores resultou

na melhora da motilidade pós-descongelamento (VIANNA, 2001).

4

O sêmen criopreservado de mamífero é reconhecidamente caracterizado por

ter uma fertilidade menor em comparação com o sêmen fresco. A redução da

fertilidade transparece tanto em uma menor viabilidade pós-descongelamento como

nas disfunções sub-letais da porção da sub-população sobrevivente. As razões da

perda da fertilidade são várias, dentre elas podemos destacar os fatores que afetam

a porção das células sobreviventes, como: susceptibilidade ao choque-térmico, taxa

de resfriamento, composição do diluente e estresse osmótico, e os fatores que

influenciam no estado funcional, que são: estabilidade de membrana, danos

oxidativos, integridade dos receptores de membrana e estrutura nuclear.

A criopreservação prolonga a viabilidade do espermatozóide para a

fertilização, entretanto, o potencial fertilizante de sêmen descongelado é

comprometido pelas alterações estruturais e fisiológicas das células espermáticas.

Estas alterações estão presentes na população móvel, diminuindo a viabilidade

espermática, a capacidade de interação com o trato da fêmea e a capacidade

fertilizante. A etiologia dessas alterações pode ser representada por uma

combinação de fatores como a fragilidade hereditária das células espermáticas em

resistir aos processos de criopreservação e diluição do sêmen.

Quando se trata do uso de sêmen congelado eqüino, verifica-se que esse

mostra-se, ainda, pouco eficiente e difundido devido a algumas associações de

produtores de cavalos não permitir em a utilização desta biotécnica, além do uso

desta biotécnica estar associada a baixa fertilidade e aos resultados inconsistentes.

Existem no mercado várias máquinas para congelamento de sêmen que

visam uma padronização da técnica do congelamento e, assim, permitir uma precisa

taxa de resfriamento das amostras. Quanto ao descongelamento não foi observado

nenhuma máquina no mercado, somente foram verificados dois trabalhos, bovinos e

caninos, sendo esta desenvolvida por mim e meu professor orientador, em nosso

laboratório cuja utilização melhorou as características de motilidade e integridade de

membrana.

Atualmente, persistem os problemas de resultados inconsistentes quando se

utiliza sêmen congelado de eqüino e, conseqüentemente, ainda não foi possível

padronizar a metodologia de congelamento do sêmen desta espécie.

Então, torna-se necessário, ainda hoje, uma otimização da criopreservação

do sêmen eqüino e conseqüente padronização desta metodologia, pois facilitaria o

5

armazenamento e a propagação da genética de cavalos de grande valor através da

reprodução assistida.

Pretende-se, neste trabalho de pesquisa, propor um novo protocolo de

congelamento e descongelamento de sêmen eqüino utilizando um sistema

automatizado eletroeletrônico para o congelamento e outro para o descongelamento.

6

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Sêmen

2.1.1 Células espermáticas

Os espermatozóides são células haplóides carentes de citoplasma e outras

organelas, exceto o núcleo, acrossoma e uma série de mitocôndrias num arranjo

helicoidal localizado na região anterior do flagelo (EDDY, E.M. e O’BRIEN, D.A.

citado por MEDEIROS et al., 2002).

As células espermáticas de eqüino, como a de todas as espécies de

mamíferos, são altamente especializadas e são constituídas por cabeça, peça

intermediária, principal e terminal, que tem como único objetivo a fertilização do

óvulo (HAFEZ,1995; SAMPER, 2000).

Portanto, na tentativa de manter os espermatozóides estruturalmente íntegros

para que possam exercer sua função na fisiologia reprodutiva, deve-se proporcionar

a eles, durante seu processamento, um ambiente o mais favorável possível, já que

nos mamíferos, os espermatozóides ejaculados ou inseminados, pós-

processamento, necessitam de ambiente favorável no trato genital da fêmea

espécie-específica por um determinado tempo, o que é necessário para preparar o

espermatozóide para a fertilização do óvulo. Este tempo é controlado por hormônios

da fêmea para evitar a inviabilidade do gameta. O deslocamento do espermatozóide

nos sistemas genital tanto no masculino quanto no feminino induz mudanças

7

bioquímicas sucessivas necessárias para o espermatozóide desenvolver a sua

capacidade de fertilizar o óvulo (AUSTIN, C. R., 1951 e CHANG, M. C., 1951 citados

por MEDEIROS et al., 2002).

2.1.2 Membrana Plasmática do espermatozóide

O conhecimento da membrana plasmática nos espermatozóides é o ponto

inicial para o êxito nos processos de manipulação do sêmen, principalmente nas

espécies como a eqüina e a suína, as quais possuem baixa resistência à

manipulação extra-corpórea. Toda manipulação do sêmen fresco ou congelado

produz alterações nas células espermáticas (VALLE e SILVA FILHO, 2002).

A membrana plasmática é o componente mais externo da célula espermática

e está envolvendo toda a superfície do espermatozóide exceto após a reação

acrossômica, envelhecimento e morte (AMANN e GRAHAM, 1992).

SAMPER (2000) descreve que as células espermáticas são recobertas pela

membrana plasmática, e esta é constituída de uma bicamada fosfolipídica

incorporada por colesterol, complexos carboidratados e proteínas. O colesterol,

provavelmente, serve como substância estabilizadora de membrana. A bicamada

lipídica é composta por fosfolipídeos com sua cadeia de ácido graxo hidrofóbico

direcionado internamente e sua cadeia hidrofílica com cabeça polar orientada

externamente (AMANN e GRAHAM, 1992; STRYER, 1988) (figura 1).

Algumas das proteínas estão entremeadas dentro da camada lipídica

variando o seu tamanho, outras estão localizadas no exterior da camada lipídica ou

estão associadas ao glicocálice.

As proteínas presentes na membrana plasmáticas são classificadas como

proteína integral (trans-membrana), essenciais na estrutura da membrana, e

periféricas, associadas a membrana, mas facilmente removidas. Certas proteínas

trans-membrana têm sido relatadas por se localizarem na bicamada lipídica como

canais de íons, poros, receptores e componentes transdutores de sinal, valendo

ressaltar que foram encontradas proteínas entre a bicamada. As proteínas que

compõem a membrana espermática representam cerca de 50% do peso molecular

total da membrana (AMANN e GRAHAM, 1992; SAMPER, 2000).

Muitas das proteínas da superfície externa da membrana plasmática contêm

cadeias de carboidratos na parte lateral, as quais tendem ter carga negativa e atrair

8

outras proteínas do meio extracelular ao redor do espermatozóide (AMANN e

GRAHAM, 1992).

Figura 1: Representação da membrana plasmática, mostrando seus componentes, como proteínas trans-membrana e periféricas, colesterol e carboidratos ligados às proteínas (AMANN e GRAHAM, 1992).

Nos espermatozóides de mamíferos a composição e a distribuição dos

fosfolipídios diferem dentro de certos domínios e regiões da membrana plasmática.

Normalmente, os fosfolipídios diferentes são aleatoriamente arranjados na

membrana e são livres para se movimentar lateralmente no folheto da bicamada,

isto se dá porque a membrana está fluida a temperatura corporal. A relação

colesterol/fosfolipídio bem como a natureza dos fosfolipídios determinam a fluidez da

membrana, portanto, quanto maior for a presença de colesterol menor será a fluidez

(AMANN e GRAHAM, 1992).

O colesterol auxilia no arranjo aleatório dos fosfolipídios da membrana. Uma

adequada quantidade de colesterol e uma distribuição aleatória das proteínas trans-

membranas exercem uma configuração sobre fosfolipídios, fazendo com que a

bicamada normal seja mantida. Em certas condições, os lipídeos podem mudar para

uma forma cristalina (fase de transição), ocorrendo a agregação protéica que leva a

uma desestabilização da membrana, o que pode causar danos irreversíveis, sendo o

resfriamento um fator que induz a essa mudança (AMANN e GRAHAM, 1992).

9

2.1.3 Plasma seminal

A fonte dos constituintes do plasma seminal varia com as espécies, assim

como o número e tamanho dos órgãos acessórios (HAFEZ, 1995). O plasma

seminal do eqüino é constituído por uma coleção de fluidos proveniente do

epidídimo, ampola, próstata, vesícula seminal e glândula bulbouretral, onde os

espermatozóides são suspensos na hora da ejaculação (SAMPER, 2000).

No que tange ao assunto plasma seminal existem muitas contradições em

relação ao utilizá-lo ou não para resfriamento e congelamento das células

espermáticas.

Segundo NISHIKAWA (1975), a remoção do plasma seminal antes do

congelamento ajuda a manter a motilidade dos espermatozóides após o

descongelamento. Uma das razões do plasma seminal ser prejudicial seria a alta

concentração de cloreto de sódio. Alguns pesquisadores relatam que a remoção do

plasma seminal do sêmen eqüino antes do resfriamento e armazenamento a 5ºC é

benéfico (DRAWSON et al., 1999; JASKO et al., 1991; PRUITT et al., 1993 citado

por CROCKETT et al. 2001 e VIDAMENT et al., 2001). Outros pesquisadores como

FAGUNDES (2003), observou que a adição de proteínas concentradas do plasma

seminal, com massa molecular superior a 10 kDa, no diluente, melhoraria

características espermáticas no congelamento e descongelamento, enquanto que a

troca do plasma seminal de garanhões bons congeladores pelo plasma seminal de

maus congeladores resultou na melhora da motilidade pós-descongelamento

(VIANNA, 2001). NUNES et al. (1982) observaram efeito positivo da presença do

plasma seminal na sobrevivência dos espermatozóides submetidos ao

congelamento. Alguns componentes foram descritos como deletérios aos

espermatozóides, sendo identificados na secreção da glândula bulbouretral, de

caprinos, um componente apresentando este efeito nos espermatozóides diluídos

em meio contendo gema de ovo (RITAR e SALAMON, 1982 citado por AZEREDO et

al., 2001) ou leite (CORTEEL, 1974 citado por AZEREDO et al., 2001). Este

componente foi identificado como uma glicoproteina de 60kDa (PELLICER et al.,

1997). AL-SOMAI et al. (1994) relataram que os componentes protéicos de baixa

massa molecular causam danos aos espermatozóides e a remoção desses

componentes do plasma seminal é benéfica à sobrevivência dos espermatozóides.

10

2.2 Efeitos da temperatura

2.2.1 Taxa de resfriamento

WOELDERS et al. (2005) relataram que as células podem apresentar danos

pela diminuição da temperatura por si só (danos do resfriamento), pelo resfriamento

brusco (danos do choque térmico) ou por ambos. Os danos do resfriamento podem

ser reduzidos pela inclusão de gema de ovo no diluente quando abaixo de 15ºC e o

choque térmico pelo lento e gradual resfriamento (aproximadamente -1ºC/min.) de

15 a 5ºC.

A determinação da taxa de resfriamento ideal para os espermatozóides

eqüino é um dos assuntos mais importantes para a conservação da motilidade e da

fertilidade. Este é um assunto complexo que envolve a individualidade do garanhão,

constituição da membrana do espermatozóide, natureza do diluente e temperatura

final de armazenamento (SILVA FILHO, J. M., 1994 citado por SNOECK e HENRY,

2002a).

WATSON (1995) relatou que os espermatozóides sofrem o primeiro estresse

térmico no resfriamento do sêmen entre 19º a 5ºC, pois nesta faixa de temperatura a

membrana plasmática passa por uma fase de transição, do estado líquido cristalino

para o gel, podendo ocorrer perda de movimentos progressivos, alterações na

membrana plasmática e acrossomal.

LOOMIS (1992) relatou que o êxito do resfriamento do sêmen eqüino

depende da diluição adequada, taxas relativamente lentas de resfriamento e

manutenção em temperaturas específicas. Esses fatores associados irão reduzir o

metabolismo espermático e minimizar as lesões de membrana, evitando a indução

prematura da capacitação e/ou reação acrossômica.

MOORE et al. (2006) relataram que a taxa de resfriamento a qual as células

são submetidas é que vai determinar a extensão da desidratação. Observaram,

também, que não houve diferença na motilidade e viabilidade espermática quando

os espermatozóides eram submetidos a taxas de resfriamento de -5 a -45ºC/min,

sendo esses dados similares ao encontrado por DEVIREDDY et al. (2002) que

determinaram que os espermatozóides de garanhões sobrevivem a taxas de

resfriamento de -20 a -1000C/min. Esses resultados vêm confirmar que existe uma

11

ampla taxa de resfriamento que é considerada como ótima para o congelamento de

sêmen eqüino.

MOORE et al. (2006) observaram uma diferença na viabilidade espermática,

sendo que a taxa de resfriamento de -100C/min apresentou maior viabilidade que a

de -500C/min.

KAYSER et al. (1992) concluíram que o sêmen eqüino pode ser resfriado

rapidamente de 37º e 20ºC, mas entre 20º e 5ºC deve ser resfriado de forma a se

obter uma curva em que a temperatura seja reduzida 0,1ºC/min.

VIDAMENT et al. (2000), utilizando sêmen eqüino, verificaram que a taxa

moderada de resfriamento (0,55ºC/min de 37 a 4ºC) obteve maior motilidade

comparado com a taxa lenta (0,13ºC/min).

Há tempos se conhece que o resfriamento muito rápido de sêmen de

ungulados entre 30º e 0ºC induz a um estresse letal em algumas células,

proporcionado pela taxa de resfriamento, intervalo e variação de temperatura

(WATSON, 1981 citado por WATSON, 2000). Tratando do processo de

congelamento do sêmen eqüino, AMANN e PICKETT (1987) afirmam que diversos

problemas não observados à temperatura ambiente (em torno de 22°C) são

introduzidos com a queda da temperatura. São umas séries de alterações não

completamente entendidas e parcialmente irreversíveis ocorridas durante o

resfriamento de 20° a 1°C. Este fenômeno é conhecido como choque-térmico ou

estresse-térmico (AMANN E PICKETT, 1987; WATSON, 1981 citado por WATSON,

2000). O fenômeno é identificado por um grande número de espermatozóides com

movimento circular, perda da motilidade, queda na produção de energia, aumento na

permeabilidade da membrana e perda de íons e moléculas intracelulares.

A extensão dos danos é dependente da taxa de resfriamento. Ao contrário, o

reaquecimento é raramente prejudicial, ou menos danoso à célula espermática

(WATSON, 2000). Isto vem a confrontar com o descrito por HOLT e NORTH (1994)

que observaram não haver danos de integridade de membrana das células

espermáticas de ovino através dos processos de resfriamento e congelamento na

ausência de crioprotetores, onde esses danos não foram observados imediatamente

após o descongelamento, mas durante o reaquecimento após o descongelamento

na faixa de temperatura entre 2 a 300C.

No resfriamento quando a temperatura da fase de transição de um lipídeo é

alcançada este lipídeo muda de fase, somente esse lipídeo, e se agrega em

12

microdomínios de gel lipídico em uma membrana ainda líquida, fazendo com que

formem “buracos” permeáveis a íons entre os microdomínios e o restante da

membrana (figura 2) e, assim, podendo ocasionar ruptura ou a fusão da membrana

(AMANN e GRAHAM, 1992).

Figura 2: Representação esquemática do polimorfismo dos lipídeos na membrana plasmática. A) Configuração planar da membrana dos fosfolipídeos com sua cadeia de ácido graxo hidrofóbico direcionado internamente e sua cadeia hidrofílica com cabeça polar orientada externamente. B) Forma hexagonal-II, onde a cadeia hidrofílica com cabeça polar está voltado para o centro e a cadeia de ácido graxo hidrofóbico estão orientadas externamente (AMANN e GRAHAM, 1992).

DEVIREDDY et al. (2002) verificaram que a taxa de resfriamento considerada

ótima era aproximadamente 290C/min, isto na ausência de crioprotetor; já na

presença observaram que a taxa de 600C/min era a melhor.

2.2.2 Formação e dissolução dos cristais de gelo

As lesões induzidas pela formação dos cristais de gelo são, principalmente,

associados às mudanças da pressão osmótica na fração não congelada (WATSON

e DUNCAN,1988). Quando a solução é resfriada abaixo do ponto de congelamento,

cristais de gelo são formados e a água de fora das células se cristaliza (figura 3). Os

solutos são dissolvidos na porção da água líquida restante, fazendo com que a

pressão osmótica da solução aumente. A relação em que a água cristaliza depende

da temperatura, ou seja, quanto mais baixa a temperatura, menor será a fração não

congelada e, assim, maior será a pressão osmótica da solução (WATSON, 2000).

13

Figura 3: Movimentação da água do interior do espermatozóide para dentro dos canais de água descongelada, com a resultante redução do volume e um aumento da concentração de soluto na célula. Conforme o esquema, a maior parte da água extracelular já esta sob forma de gelo (MAZUR, 1984).

As células espermáticas são geralmente congeladas numa taxa relativamente

rápida num intervalo que varia de -15 a -60ºC/min., que foi empiricamente

determinado como apresentando as melhores taxas de sobrevivência. Obviamente

se fosse conhecida a permeabilidade da célula à água e sua energia de ativação,

seria possível predizer a taxa de resfriamento máxima compatível com o equilíbrio

osmótico e então determinar ótimos protocolos de criopreservação. Tais

observações foram consideradas importantes para outros tipos celulares (MAZUR,

1984).

Alguns pesquisadores mediram a permeabilidade da água das membranas de

espermatozóide de diferentes espécies. Com exceção do coelho (CURRY et al.,

1995a), a maioria das espécies apresentou uma permeabilidade superior em

comparação com a permeabilidade de outros tipos celulares (GILMORE et al., 1996;

NOILES et al., 1997). A modulação dos canais de glicose das membranas de

espermatozóide afeta a permeabilidade da água (CURRY et al., 1995b).

A proporção de células que sobrevivem aos protocolos de criopreservação é

determinada pela sensibilidade ao estresse osmótico durante a adição e remoção do

crioprotetor e durante o resfriamento e reaquecimento (WATSON, 2000).

14

2.3 Processos da criopreservação

Os processos da criopreservação estão fundamentados nas características

físicas celulares a fim de manter a viabilidade e limitar os danos de membrana que

podem ocorrer durante a exposição das células espermáticas a condições não

fisiológicas como a temperatura sub-zero, formação dos cristais de gelo e altas

concentrações do soluto (LUVONI, 2006).

Desde 1990, HARMMERSTEDT et al. e WATSON, após suas revisões sobre

os processos da criopreservação do sêmen, enfatizaram que o progresso na

melhoria da viabilidade espermática não seria atingido simplesmente pela

modificação dos diluentes de criopreservação. Relatam que o mais fundamental

entendimento dos processos biofísico e bioquímico que acompanham o

congelamento e descongelamento do sêmen é o pré-requisito essencial para

desenvolver, com sucesso, protocolos de criopreservação (HOLT e NORTH, 1994).

MAZUR et al. (1972, citado por DEVIREDDY et al., 2002) discorreram sobre a

taxa de resfriamento dizendo que a taxa que otimiza as respostas de qualquer

sistema celular pode ser definida como a mais rápida taxa de resfriamento de um

dado meio que impede os danos pela formação dos cristais de gelo intracelular.

2.3.1 Congelamento

O grande prejuízo que o congelamento acarreta à célula é a ruptura da

membrana, principalmente devido às alterações térmicas, mecânicas, químicas e ao

estresse osmótico. Estes danos são atribuídos à desidratação celular e formação

intracelular de cristais de gelo (PARKS E GRAHAM, 1992).

Segundo DAVIES MOREL (1999), a taxa de resfriamento ou taxa de

congelamento do sêmen depende do método de processamento e de

armazenamento.

JASKO (1994) estabeleceu em seu experimento que o sêmen eqüino deve

ser submetido previamente a uma curva de resfriamento com duração de duas a três

horas, envasado e colocado no vapor de nitrogênio líquido para se dar início ao

congelamento.

O grande problema da criopreservação não está na habilidade do

espermatozóide em manter-se viável à temperatura de –196ºC, mas sim nos danos

15

que a célula sofre durante o resfriamento e descongelamento, numa temperatura

intermediária de –15ºC e –60ºC (AMANN e PICKETT, 1987; PARKS e GRAHAM,

1992). Sabe-se que o resfriamento rápido na faixa entre 20°C e 5ºC leva o sêmen

eqüino ao choque térmico, onde nessa faixa crítica de temperatura o sêmen deve

ser resfriado lentamente (MCKINNON, 1996 citado por SNOECK e HENRY, 2002b)

(figura 4).

O resfriamento moderadamente rápido (-25ºC a -40ºC/min) provoca

desidratação celular, formando cristais de gelo intracelular. Se o congelamento é

lento, causa danos à célula devido à alta concentração de soluto intracelular durante

o processo. Quando o espermatozóide é resfriado muito rápido (-60ºC/min) pode

ocorrer o fenômeno da recristalização após o descongelamento, com a formação de

grandes cristais de gelo que provocam danos físicos às células (GRAHAM, 1996).

Figura 4: Representação esquemática de prováveis mudanças em espermatozóides de eqüino, e no diluente ao seu redor durante o congelamento e descongelamento. Efeito da velocidade de resfriamento e reaquecimento (setas verticais grandes e pequenas) e formação de cristais de gelo ou micro-cristais (estrelas grandes e pequenas) são mostrados na representação esquemática. Após o resfriamento inicial e formação de micro-cristais de gelo no meio extracelular a uma temperatura de cerca de -5°C, a velocidade de resfriamento afeta tanto a movimentação de água como a quantidade de formação intracelular de gelo. Danos podem ocorrer como resultado de velocidades inapropriadas de resfriamento e reaquecimento. Na velocidade de resfriamento ótima (seta do meio), a água move-se para fora do espermatozóide, murchando-o lentamente como conseqüência da desidratação. Durante o reaquecimento, a movimentação intensa de água e glicerol pode provocar danos pelo inchamento da célula. Se a velocidade de reaquecimento é sub-ótima pode ocorrer a recristalização de micro-cristais de gelo, danificando também a célula. No reaquecimento ótimo, a entrada de água rehidratando os espermatozóides equilibra a concentração de solutos e os micro-cristais internos

16

descongelam sem formarem grandes cristais de gelo, isto é, recristalização (MAZUR, 1984).

MOORE et al. (2006) observaram uma diferença na viabilidade espermática,

entre as taxas de resfriamento -10ºC/min e -50ºC/min, sendo que à -10ºC/min

apresentou maior viabilidade. Observaram, também, que não houve diferença na

motilidade e viabilidade espermática quando os espermatozóides eram submetidos a

taxas de resfriamento de -5 a -45ºC/min, sendo esses dados similares ao encontrado

por DEVIREDDY et al. (2002) que determinaram que os espermatozóides de

garanhões sobrevivem a taxas de resfriamento de -20 a -100ºC/min.

JANUSKAUSKAS et al. (1999) observaram, para sêmen de bovino, não haver

diferença estatística entre a taxa de resfriamento lenta com a rápida, ressaltando

que a taxa de resfriamento lenta não é mais benéfica do que a rápida quando

analisado os parâmetros de viabilidade espermática após o descongelamento e

fertilidade após a inseminação artificial.

WATSON (1995) relata que o resfriamento e a criopreservação

desestabilizam as membranas espermáticas e conseqüentemente induzem reação

acrossômica prematura, diminuindo a vida útil do espermatozóide no trato

reprodutivo feminino e a fertilidade na inseminação artificial.

Alguns pesquisadores observaram que a taxa de resfriamento lenta, de -

0,5ºC/min de 5 à -20ºC, seguida de rápida taxa de resfriamento, -3ºC/min de -20 à -

196ºC, foi o que apresentou menor incidência de dano de acrossoma (CHAO e

CHANG, 1962; ADVENA, 1990; HEITLAND et al.,1996, citado por DAVIS MOREL,

1999).

Resumindo os eventos osmóticos que ocorrem durante o congelamento,

pode-se salientar que no congelamento a fase de transição da água induz a

diminuição no potencial de água extracelular, já que a água passa através da

membrana plasmática. Isto induziria a uma mudança do fluxo da água e da

desidratação celular. Os danos do resfriamento lento têm sido atribuídos ao aumento

na concentração interna e externa do soluto (cloreto de sódio; DAW et al., 1973

citado por WOELDERS et al., 2005), ao pequeno tamanho da porção não

congelada, ao estresse mecânico causado pela diminuição do volume celular

(MAZUR et al., 1983 citado por WOELDERS et al., 2005) e a desestabilização das

membranas e proteínas pelo baixo potencial de água (CARPENTER et al., 1988

citado por WOELDERS et al., 2005). A alta taxa de resfriamento a desidratação

intracelular (pelo efluxo da água) não pode acompanhar os passos da desidratação

17

extracelular (pela fase de transição da água). Como conseqüência, as altas taxas de

resfriamento resultam em maior nível de super-resfriamento intracelular, maior

diferença na pressão osmótica trans-membrana e concentração de soluto e maior

taxa de efluxo de água através da membrana. Os danos do resfriamento rápido

parecem estar relacionados, particularmente, a formação de gelo intracelular

(MAZUR et al., 1963; MAZUR et al., 1972; MAZUR et al., 1977; citado por

WOELDERS et al., 2005). Outros pesquisadores têm atribuído o dano de membrana

a alta diferença na pressão osmótica trans-membrana resultando numa alta taxa de

fluxo de água trans-membrana. Alternativamente, danos do resfriamento rápido

poderiam resultar do fato de que as células são expostas a grandes mudanças

repentinas de tamanho, forma e ultra-estrutura devido ao rápido efluxo de água e

encolhimento das células (WOELDERS et al., 1997 citado por WOELDERS et al.,

2005).

PAPA et al. (2003), observaram que não houve diferença estatística quando

amostras de sêmen de eqüinos foram congeladas em diferentes alturas do nível de

nitrogênio líquido (1, 3, 6 e 9cm) e, NÖTHLING e SHUTTLEWORTH (2005),

também, não observaram diferença no congelamento à 3,5cm e 8cm do nível do

nitrogênio líquido, tendo uma leve tendência de maior motilidade para o

congelamento à 8cm e menor dano de integridade de acrossoma.

Em atual época, existe comercialmente uma vasta quantidade de máquinas

para congelamento de sêmen. A princípio estas poderiam ajudar na manipulação de

amostras com grande volume, principalmente pela sua padronização de

congelamento e permitir o preciso resfriamento das amostras para a taxa desejada.

As principais máquinas de congelamento de sêmen encontradas no mercado são:

CryoLogic Freeze Control CL3000, Planer Products Kryo Save Compact KS1.7,

Sanyo 152ºC (MDF-1155 ATN), Planer Kryo 10 Series III (desenvolvida por Watson)

e TK3000 (TK Tecnologia em Congelação Ltda).

O que se faz hoje em dia, comercialmente, de forma menos onerosa, é o

congelamento na caixa de isopor colocando as palhetas à 4cm sobre o nível de

nitrogênio por 10 minutos e, depois estas são imersas no nitrogênio para congelar,

valendo salientar que a taxa de resfriamento de 20 à 5ºC é de 0,5ºC/min.

Durante o congelamento podemos observar nas curvas de resfriamento que

existe um pico, ou seja, um aumento na temperatura devido ao aquecimento

provocado pela liberação de energia durante a fusão dos cristais de gelo e,

18

conseqüentemente, aumentando a temperatura da amostra submetida ao

congelamento (HOLT, 2000; THURSTON et al., 2003; CHAVEIRO et al., 2006).

Muitos pesquisadores chamam este aumento na curva de resfriamento de platô de

congelamento, sendo este considerado o ponto mais prejudicial na viabilidade

espermática durante o processamento.

HOLT (2000) relata que este “platô” pode permanecer por 2 a 3 minutos antes

do resfriamento recomeçar, já CHAVEIRO et al. (2006) observaram um “platô” com

duração média de 30 segundos.

SIEME et al. (2001) ressaltam que para prevenir a ocorrência do “platô” no

congelamento do sêmen deve-se induzir o “seeding” nas amostras a serem

congeladas. Também observaram que ao reduzir o platô havia uma melhora na

viabilidade espermática do sêmen de garanhões.

THURSTON et al. (2003) verificaram que ao fazer o “seeding” nas amostras

de sêmen de suínos, a dissipação do calor foi menor, minimizando, assim, a

flutuação da temperatura dentro da amostra na formação de gelo e melhorando a

motilidade do sêmen descongelado quando comparado com as outras taxas de

resfriamento.

WOELDERS et al. (2005) relataram que o super-resfriamento causa uma

mudança brusca da temperatura e da osmolaridade, causando danos no

congelamento. Isto pode ser evitado através do “seeding”, usando um volume e

geometria da amostra que permite rápida propagação do frio através desta.

Relatam, também, que a curva após a formação dos cristais de gelo é de extrema

importância no congelamento.

HAMMADEH et al. (2001a) observaram que a utilização da máquina de

congelamento (Planer Kryo 10 Series III) para sêmen humano apresentava menor

dano as células espermáticas quando comparado com o congelamento convencional

(20cm acima do nível do nitrogênio líquido).

THURSTON et al. (2003) realizaram um experimento, com sêmen de suíno,

testando três máquinas de congelamentos (CryoLogic Freeze Control CL3000,

Planer Products Kryo Save Compact KS1.7 e Planer Kryo 10 Series III, desenvolvida

por Watson) onde observaram reduzida viabilidade espermática na curva de

resfriamento à -6ºC/min (14,2±2,8% - CryoLogic Freeze Control CL3000) quando

comparada à -40ºC/min (KS1.7 e Planer Kryo 10 Series III, 18,4±3,2% e 25,7±3,7%,

respectivamente).

19

ÁLAMO et al. (2005) testaram a viabilidade de um ultra-freezer (Sanyo®) para

congelamento e armazenamento de sêmen de cães como alternativa do uso do

nitrogênio líquido e, observaram que este poderia ser utilizado, pois as

características eram semelhantes com as observadas no congelamento com

nitrogênio líquido. A taxa de resfriamento foi lenta (-5ºC/min) de 5 a -10ºC, rápida (-

30ºC/min) de -10 a -100ºC e depois -100ºC a -130ºC a taxa foi de -10ºC/min.

ARRUDA et al. (2005) observaram que não houve diferença significativa

quando comparou o congelamento de sêmen de bovino à 3cm do nível do nitrogênio

líquido (-19ºC/min) com o congelamento no aparelho programável (-15,5ºC/min).

ROTA et al. (2005) verificaram que a taxa de resfriamento lento (0,5ºC/min de

5 a -10ºC, 8ºC/min de -10 a -60ºC e imersão no nitrogênio líquido), utilizando um

sistema de congelamento programável, foi melhor quanto a motilidade e integridade

de membrana quando comparado com a taxa de resfriamento convencional, ou seja,

à 4cm do nível de nitrogênio (taxa de resfriamento rápido).

DOUGLAS-HAMILTON et al. (1984, citado por FÜRST et al., 2003)

comparando as taxas de resfriamento rápida (maiores que -1ºC/min), média (entre -

1ºC/min e -0,33ºC/min) e lenta (menores que -0,33ºC/min) concluíram que as taxas

de resfriamento lenta e rápida causam maiores danos à célula espermática que a

taxa média.

SIEME et al. (2001) utilizaram um sistema multi-gradiente direcional,

denominado IMT (ARAV, 1999 citado por SIEME et al. 2001), para congelamento de

sêmen de garanhões, onde a taxa de resfriamento e formação dos cristais de gelo

eram precisamente controlados. Estes pesquisadores observaram que através deste

sistema de congelamento era possível evitar o aumento da temperatura no momento

em que começava a formação dos cristais de gelo.

HAMMADEH et al. (2001b) verificaram que a utilização de um sistema de

congelamento computadorizado com diminuição gradual da temperatura mostrou-se

ser melhor que o congelamento convencional, principalmente para amostras de

sêmen de doadores considerados subnormais (inférteis), sendo recomendado este

tipo de congelamento para espermatozóides de humanos, especialmente para

aqueles que apresentam baixa qualidade seminal com o objetivo de evitar danos nas

células espermáticas.

DAVIS MOREL (1999) em sua revisão relata que existe uma curva apropriada

para congelamento de sêmen eqüino utilizando um sistema programado de

20

temperatura, onde se inicia a uma taxa de -10ºC/min de 4 à -10ºC, -20ºC/min até -

100ºC, -60ºC/min até -140 e, por fim, as palhetas são mergulhadas no nitrogênio.

MAZUR et al. (1972, citado por HAMMADEH et al., 2001a; LI, 2005;

CHAVEIRO et al., 2006) postularam que a formação dos cristais de gelo e o efeito

solução apresentavam um efeito na inativação celular e que uma ótima taxa de

resfriamento poderia minimizar estes efeitos. A curva da porcentagem de

sobrevivência celular versus a taxa de resfriamento apresenta-se em forma de “U”

invertido (figura 5), onde no ponto máximo o efeito do dano, tanto pela baixa taxa de

resfriamento como a formação de cristais de gelo, é mínimo, sendo esta taxa de

resfriamento considerada ótima.

Figura 5: Porcentagem de sobrevivência celular versus a taxa de resfriamento

21

2.3.2 Descongelamento

Segundo FÜRST et al. (2003) o descongelamento é um dos pontos mais

importantes no manuseio do sêmen congelado, pois diferentes fatores físico-

químicos desconhecidos podem atuar influenciando na sobrevida dos

espermatozóides.

Durante o descongelamento, as células espermáticas congeladas podem

sofrer danos físicos devido à recristalização (figura 4), processo este ocorrido

quando cristais microscópicos de gelo formam outros cristais maiores

(WATSON,1995).

Segundo AMANN e PICKETT (1987) alguns fatores influenciam no

descongelamento como: tipo de envase, quanto à condutividade do calor e

espessura da parede e à temperatura da água do banho-maria.

O descongelamento pode ser feito de diversas maneiras o que dependerá do

tipo de envase e do processo de congelamento propriamente dito (COCHRAN et al.,

1984). Segundo GRAHAM (1996) aqueles processos que utilizam curva de

resfriamento rápido exigem descongelamento rápido e outros realizados com curva

lenta de resfriamento deve-se utilizar descongelamento lento.

HOLT (2000) relata que alguns estudos com descongelamento utilizando

altas temperaturas (60 a 70ºC) têm sido realizados, tendo os melhores resultados

quando as amostras são descongeladas a uma rápida taxa de reaquecimento. Isso

tem sido atribuído a possibilidade de pequenos cristais de gelo intracelular formados

durante o congelamento poderem crescer durante um lento processo de

reaquecimento, logo o descongelamento rápido pode prevenir a recristalização do

gelo intracelular presente nos espermatozóides (MAZUR, 1977, citado por

SALAMON e MAXWELL, 1995).

O congelamento/descongelamento resulta em alta percentagem de

espermatozóides com alteração similar a reação acrossômica ou com danos de

membrana e reduzida viabilidade, o que pode ser explicado pela baixa taxa de

fertilidade de éguas inseminadas com sêmen criopreservado e, também, pela

variação existente entre garanhões e ejaculados (BEDFORD et al., 1998 citado por

SNOECK e HENRY, 2002b).

O descongelamento do sêmen é dependente do tipo de armazenamento

utilizado, assim como da taxa de resfriamento. Sêmen armazenado em palhetas de

22

0,5mL são geralmente descongeladas a 37ºC por um mínimo de 30 segundos.

Entretanto, alguns laboratórios recomendam descongelar palhetas de 0,5mL a

75ºC/7segundos. Sêmen congelado em palhetas de 2,5mL, 4mL ou 5mL são

geralmente descongeladas a 50ºC/45segundos (SAMPER, 2000).

Vários autores relataram que quando os espermatozóides são submetidos a

altas temperaturas de descongelamento a motilidade e a viabilidade espermática

são superiores quando comparadas a temperatura convencional (± 37ºC/30

segundos) de descongelamento (JASKO, 1994; BARRETO, 2002).

WOELDERS e MALVA (1998 citado por BARRETO, 2002) estudando a

interação entre taxa de resfriamento, taxa de descongelamento e concentração de

glicerol demonstraram que a combinação de maiores taxas de resfriamento com

descongelamento lento, acompanhado da maior concentração de glicerol (0.8 M),

propiciou maiores danos aos espermatozóides bovinos. Ao passo que o

descongelamento rápido (2400°C/min) propiciou os melhores resultados para todas

as taxas de resfriamento e concentração de glicerol. A taxa de resfriamento teve

muito pouco efeito sobre a motilidade e viabilidade espermática.

ROBINS et al. (1976, citado por SALAMON e MAXWELL, 1995) observaram

que os espermatozóides submetidos à uma rápida taxa de descongelamento são

expostos por um menor período de tempo ao soluto concentrado e ao crioprotetor.

Estudos prévios determinaram que o descongelamento de sêmen bovino a

37°C por 10 - 15 segundos, seguido de sua transferência para banho-maria com

temperatura de 21ºC, ou então 5°C para completar o descongelamento e

permanecer durante parte de seu processamento (± 2 min) nesta temperatura e a

incubação final a 37°C, diminuiu a ocorrência de choque osmótico, resultando na

manutenção da integridade e funcionalidade da membrana espermática (CORREA

et al., 1996 e 1997, citado por BARRETO, 2002).

COCHRAN et al. (1984) verificaram que houve maior motilidade progressiva

nas amostras descongeladas à 75ºC por 7 segundos, imediatamente submetendo ao

banho de 37ºC, por no mínimo de 5 segundos, do que à 37ºC por 30 segundos.

DELL`AQUA et al. (2001, citado por VIDAMENT et al., 2001) observaram uma leve

tendência na melhor qualidade do sêmen descongelado à 60ºC quando

descongelado à 38ºC. Esses resultados vêm a discordar com os verificados por

BORG et al. (1997), nos quais não observaram uma melhora real sobre a motilidade

e integridade de acrossoma.

23

SALAMON e MAXWELL (1995) descrevem, em seu artigo, que a maioria dos

pesquisadores descongelam sêmen de ovinos de 38 a 42ºC. ANDERSEN e

AAMADAL (1972, citado por SALAMON e MAXWELL, 1995) observaram que o

descongelamento à 75ºC foi superior à 35ºC. Descongelamento a altas temperaturas

(60ºC) tem sido preferido por outros pesquisadores (FISER et al.,1987; FISER e

FAIRFULL, 1989, citado por SALAMON e MAXWELL, 1995), porém existem

publicações que não observaram diferença, na motilidade e integridade de

acrossoma, entre descongelamento de 36 a 40ºC ou de 50 a 70ºC (PONTBRIAND et

al., 1989, citado por SALAMON e MAXWELL, 1995). BRUGOV (1977, citado por

SALAMON e MAXWELL, 1995) observou que o descongelamento ultra-rápido, em

banho com glicerol a 190ºC/3 a 4 segundos, melhorou significativamente a

motilidade do sêmen, de bovino e ovino, em comparação ao descongelamento à

38ºC.

Foi observado, também, que o descongelamento feito de forma ultra-rápido

era capaz de melhorar a motilidade e a viabilidade espermática em bovinos

(BARRETO, 2002) e caninos (SANTOS et al., 2006). Resultados preliminares, em

nosso laboratório, revelaram que o mesmo ocorreu para eqüinos e ovinos.

NÖTHLING e SHUTTLEWORTH (2005) não observaram diferença no

descongelamento com temperatura de 70ºC/5segundos comparado com 37ºC/2min

quando as amostras foram congeladas à 3,5cm e 8cm do nível do nitrogênio líquido.

24

2.3.3 Pressão osmótica

É de fundamental importância entender os limites da tolerância osmótica do

espermatozóide durante os processos de congelamento e descongelamento. A

resistência a anisosmolaridade (condição em que as células espermáticas se

encontram em soluções de osmolaridade diferente delas, ou seja, soluções hipo ou

hiperosmóticas) é essencial para prevenir a lise e a morte das células. A capacidade

do espermatozóide de responder com o ajuste do seu volume é determinada por

vários fatores, incluindo a composição fosfolipídica da membrana, permeabilidade à

água, temperatura da fase de transição dos lipídeos, atividade ATPase Na+/K+,

canais de íons e componentes do citoesqueleto (POMMER et al., 2002).

O sêmen de eqüino e de suíno podem apresentar diferenças significantes na

capacidade de resistir ao ciclo do congelamento/descongelamento, isso nos leva a

entender que existem diferenças nas características da membrana espermática e na

composição bioquímica entre as espécies (HOLT, 2000).

No estudo realizado por POMMER et al. (2002), onde observaram a variação

das condições osmóticas, eles demonstraram que os espermatozóides de eqüino

são capazes de adaptar, de forma significante e reversível, o seu volume celular

médio. Foi determinado o volume médio dos espermatozóides, em condições

isosmóticas é de 24,4 ± 0,6µm3 (volume médio ± média do desvio padrão) à uma

temperatura de 22ºC. Esse volume foi máximo à 75mOsm/Kg, osmolaridade mínima

testada em seu experimento, onde as células alcançaram um aumento do volume de

1,6 vezes (60%) em relação aos espermatozóides que foram mantidos em

condições de isosmolaridade e uma diminuição no volume de 0,81 vezes quando

submetido à 900 mOsm/Kg (tabela 1 e figura 6).

25

Tabela 1: Volume médio das células, motilidade, viabilidade, potencial mitocondrial da membrana (MMP) quando submetidas às diferentes condições osmóticas. Valendo ressaltar que esses valores foram obtidos após as células serem incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente sob condição isosmolar e anisosmolar (POMMER et al. 2002).

Osmolaridade

(mOsm/Kg)

Volume da

célula

Motilidade

(%)

Viabilidade

(%)

Alto MMP

(%)

75 1,6 13,03 43,13 45,36

150 1,28 56,67 60,64 69,91

300 1,00 100,00 100,00 100,00

450 0,89 70,30 99,69 86,70

600 0,85 15,15 99,47 94,45

900 0,81 0,61 99,96 85,13

NOILES et al. (1992 citado por POMMER et al. 2002) relataram que os

espermatozóides de eqüinos são capazes de aumentar seu volume 6,1 vezes em

relação àqueles em condições isosmóticas, tendo como parâmetro uma variação da

osmolaridade de 3 a 215 mOsm/Kg. Ainda ressaltam que os espermatozóides de

eqüinos possuem uma alta resposta osmoregulatória. A tendência entre os dois

estudos foi similar, mas houve uma grande diferença no aumento do volume das

células enquanto os espermatozóides eram submetidos a condições de

hiposmolaridade (1,6 versus 6,1 vezes em relação aqueles submetidos a condições

isosmóticas). POMMER et al. (2002) relatam que existem duas explicações para

essa discrepância de resultados; primeiro, podemos destacar a variação osmótica

testada no estudo de NOILES et al. (1992 citado por POMMER et al. 2002) que foi

mais baixa (3mOsm/Kg versus 75mOsm/Kg) e, segundo, o método utilizado para

estimar o volume das células espermáticas na condição de anisosmolaridade.

POMMER et al. (2002) demonstraram em seus estudos que os

espermatozóides de eqüinos são altamente susceptíveis ao estresse osmótico visto

que a motilidade diminui em condição anisosmolar e que os espermatozóides da

maioria dos tratamentos demonstraram um retorno inferior da motilidade seguido do

curto período do estresse osmótico (tabela 1), quando comparado ao grupo controle.

Citam, também, que tanto a motilidade quanto a viabilidade espermática diminuem

significativamente em meio hiposmótico, demonstrando comportamento similar ao

dos espermatozóides de suíno (HOLT, 2000).

26

Figura 6: Os valores foram obtidos após as células serem incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente sob condição isosmolar e anisosmolar. A letra (a) mostra a diferença significativa (p<0,05) entre o tratamento controle (300mOsm/Kg) dentro de cada grupos (POMMER et al. 2002).

Ficou claro, observando os resultados de POMMER et al. (2002), que o

processo de aumento do volume dos espermatozóides de eqüinos é mais prejudicial

do que o processo de encolhimento e que os mecanismos que afetam a motilidade

parece ser diferente nessas duas situações, ou seja, os espermatozóides

submetidos a condições hiperosmóticas mostram-se com as membranas intactas e

capazes de preservar suas mitocôndrias, como demonstrado pelo alto potencial

mitocondrial da membrana (tabela 1); já quando os espermatozóides foram

submetidos a soluções hiposmóticas o potencial mitocondrial da membrana e a

viabilidade diminuíram marcadamente.

Para exemplificar, podemos destacar o volume das células nas diferentes

condições osmóticas, onde o volume das células à 450mOsm/Kg foi reduzido 89%

do volume inicial e reteve 70% da motilidade inicial; já à 150mOsm/Kg o volume

aumentou 28% em relação ao grupo controle e a motilidade diminuiu 57% da

motilidade inicial. Além disso, quando as células retornam às condições de

isosmolaridade, os espermatozóides que foram submetidos a 900mOsm/Kg

mostraram diminuição do potencial mitocondrial da membrana e da viabilidade

quando as células aumentaram seu volume. Isto sugere que a capacidade do

espermatozóide de manter o balanço eletrolítico e o potencial da membrana seja

27

impedida quando os espermatozóides incham. Logo, o processo de

descongelamento pode ser mais prejudicial ao espermatozóide do que o processo

de congelamento (POMMER et al., 2002).

Esses dados são confrontantes com os de WATSON (2000), pois ele relata

que os efeitos do reaquecimento sob as células espermáticas são raramente

prejudiciais ou menos danosos à célula espermática.

28

3. MATERIAL E METODOS

3.1 Animais

O sêmen foi obtido de 5 garanhões, com idade compreendidas entre 5 e 10

anos, em perfeito estado sanitário, de um haras do município de Campos dos

Goytacazes/RJ .

3.2 Sêmen

As coletas foram efetuadas por meio de vagina artificial modelo “Hannover”,

utilizando-se como parceira para o salto uma égua adequadamente contida.

Imediatamente após a coleta, o sêmen foi mantido a ± 37ºC em banho-maria e,

assim, efetuado os exames de concentração, motilidade e subseqüentes

tratamentos.

Antes das coletas para o congelamento dos ejaculados, os garanhões foram

esgotados. Para cada garanhão foram coletados 3 ejaculados, sendo cada um deles

repartido igualmente para o procedimento de congelamento. Cada ejaculado foi

congelado em palhetas de 0,5mL, utilizando-se de 4 velocidades de resfriamento,

sendo que o resfriamento de ± 250C até ± 50C foi a mesma para todos tratamentos.

29

3.3 Soluções

3.3.1 Diluentes

3.3.1.1 Diluente de centrifugação

O diluente utilizado para centrifugação foi Souza&Silva 1998 (SOUZA e

SILVA, 1998), diluente a base de leite em pó desnatado, modificado por SOUZA et.

al. (2001) (anexo I). Este foi utilizado com o objetivo de diluir a amostra para

determinação da sua motilidade através do analisador de motilidade.

3.3.1.2 Diluente de congelamento

O diluente utilizado para o congelamento das células espermáticas foi o

diluente comercial Botu-Crio® com 5% de crioprotetor, sendo 3% de glicerol e 2% de

dimetilformamida.

3.3.2 Formol-citrato

A solução (anexo II) foi utilizada para fazer a diluição do sêmen nativo na

proporção de 1:200 e, assim, determinar a concentração espermática da amostra

com o auxílio da câmara de Newbauer.

3.3.3 Diacetato carboxifluoresceína e iodeto de propídio - CFDA

A solução (anexo III) foi utilizada para avaliar a integridade de membrana

plasmática espermática, sendo composta pelas sondas diacetato

carboxifluoresceína (Sigma®) e iodeto de propídio (Sigma®). Para ser utilizada, foi

feita uma solução estoque (anexo III) para cada sonda e esta foi aliquotada em

tubos de 0,5mL. O iodeto de propídio foi aliquotado em 5µL e o diacetato

carboxifluoresceína 10µL. A solução de trabalho foi sempre preparada momento

antes da avaliação microscópica e mantida em recipientes protegidos da luz.

30

3.3.4 Fitc-PNA e iodeto de propídio - Fitc-PNA

A solução (anexo IV) foi utilizada para avaliação da integridade acrossomal,

sendo composta pelas sondas Fitc-PNA (FITC labeled; L 7381, Sigma®) e iodeto de

propídio (Sigma®). Para ser utilizada, foi feita uma solução estoque (anexo 4) para

cada sonda e esta foi aliquotada em tubos de 0,5mL. O iodeto de propídio foi

aliquotado em 5µL e Fitc-PNA 10µL. A solução de trabalho foi sempre preparada

momento antes da avaliação microscópica e mantida em recipientes protegidos da

luz.

3.4 Concentração das amostras

3.4.1 Sêmen nativo

As concentrações das amostras foram determinadas com o auxílio da câmara

de Newbauer. Para a contagem na câmara foi utilizada a solução formol-citrato para

diluir o sêmen na proporção de 1:200, isto é, 50µL de sêmen em 9950µL de formol

citrato, após a diluição e passados 2 minutos foi realizada a contagem. Para a

determinação pelo uso do analisador de motilidade, o sêmen foi diluído em

Souza&Silva (1998) numa proporção 1:3±1, dependendo do aspecto da amostra, a

fim de obter uma concentração em torno do 50x106 espermatozóides/mililitros, para

obter-se uma leitura com maior acurácia no analisador de motilidade.

3.4.2 Células em diluente de centrifugação

Após a determinação da concentração espermática do sêmen nativo, este foi

diluído numa concentração de 50x106 espermatozóides/mililitros, tendo a diluição

por finalidade diminuir os danos causados pela centrifugação.

3.4.3 Células em diluente de congelamento

As células espermáticas foram ressuspensas no diluente de congelamento

numa concentração de 100x106espermatozóides/mililitros com a finalidade de se

31

obter, nas amostras congeladas, uma quantidade em torno 50x106 espermatozóides

nas palhetas.

3.5 Congelamento

Nos congelamentos foram utilizadas palhetas de 0,5mL, sendo realizadas 3

velocidades de congelamento denominadas de velocidade de congelamento rápida

(ao se posicionar as palhetas a 1cm do nitrogênio líquido), padrão (ao se posicionar

a 4cm do nitrogênio líquido) e lenta (ao se posicionar a 8cm do nitrogênio líquido),

sendo que todos os grupos permaneceram nesta posição por 10 minutos e logo

após imersos no nitrogênio (figura 7). Um outro grupo foi testado numa taxa de

resfriamento em aceleração, ou seja, os envases encontravam-se presos numa

raque e, o nitrogênio líquido, contido numa caixa de isopor, era deslocado em

movimento constante em direção aos envases até serem submersos no nitrogênio

líquido. Nos congelamentos citados acima, foi introduzida uma sonda do

Termômetro digital (IOP Therm 42) nas palhetas e a cada 10 segundos foi realizada

a leitura da temperatura, que foi gravada na memória e posteriormente anotada em

uma ficha para posterior avaliação e determinação da velocidade em cada ponto.

Figura 7: Esquema da estrutura flutuante de poliestireno com diferentes alturas para congelamento de palhetas de 0,5mL em nitrogênio líquido.

3.6 Temperatura e tempo de descongelamento

Foram utilizadas 2 velocidades de descongelamento sendo: velocidade de

descongelamento convencional 37±1°C/1 minuto e velocidade experimental ±

98±1°C/ 4 segundos e depois 37±1°C até completar 1 minuto. Para a realização do

descongelamento na velocidade experimental foi utilizada uma máquina de

descongelamento intitulada máquina de descongelamento ultra-rápido. Após o

32

descongelamento foram analisados os parâmetros de motilidade e integridade de

acrossoma e de membrana (Fitc-PNA e CFDA).

3.7 Motilidade espermática

A motilidade espermática foi determinada através de análise computadorizada

pelo programa Hamilton Thorne Research (Versão 10.8 HTM-CEROS), como no

“setup” descrito no anexo V, sendo a motilidade classificada em: motilidade total

(MotTot) e motilidade progressiva (MotProg).

Imediatamente após o descongelamento, tanto o convencional quanto o

experimental, as palhetas foram secas manualmente com lenços de papel e abertas

com o auxílio de uma tesoura, tendo seu conteúdo vertido em tubos Eppendorf de

1mL pré-aquecidos em banho-maria a 37±1°C.

Para cada velocidade de descongelamento foram utilizadas 2 doses de

sêmen de cada velocidade de congelamento a fim de comparar o melhor

desempenho/relação dos diferentes descongelamentos com a velocidade de

congelamento.

Cinco microlitros de sêmen descongelado foram depositados entre lâmina e

lamínula (2X-CEL da Hamilton Thorne Research com 20 µm de profundidade) pré-

aquecida que foi colocada em uma mesa térmica. Quatro campos foram

selecionados, sendo a motilidade descrita, em porcentagem, como motilidade total e

progressiva.

3.8 Integridade de membranas - CFDA

Para a análise da integridade da membrana espermática foi utilizada a

metodologia descrita por HARRISON e VICKERS (1990) com algumas modificações

de acordo com BRINSKO (2003), SIEME (2004) e AURICH (1996).

Para a avaliação, adicionou-se 10µL da amostra a 40µL da solução de

trabalho. As amostras foram incubadas por, no mínimo, 15 minutos, cujos tubos de

1,5mL estavam envoltos por papel alumínio para proteger a amostra da luz. Em

seguida, uma alíquota de 5µL da suspensão foi depositada entre lâmina e lamínula e

avaliada em microscópio de epifluorescência com aumento de 1000X utilizando-se

óleo de imersão (ZEISS, JENALUMAR, Alemanha). Para a visualização da

33

fluorescência foram utilizados os filtros de fluoreceína (azul) e rodamina (verde) para

a observação dos corantes diacetato carboxifluoresceína e iodeto de propídio,

respectivamente. Para cada tratamento foram contadas 200 células (divididas em

duas contagens de 100 células em uma mesma lâmina) sendo anotadas todas as

células que emitiam qualquer fluorescência a cada campo.

As células foram classificadas como: Íntegros – Células coradas pela CFDA,

visualização da emissão da fluorescência verde - espermatozóides com membrana

plasmática íntegra; Lesados – Células coradas pelo IP, visualização da emissão da

fluorescência vermelha - espermatozóides com membrana plasmática e acrossomal

lesadas; Semilesados – Células coradas na região do acrossomo pelo CFDA e

núcleo corado pelo IP, visualização da emissão da fluorescência verde do

acrossomo e vermelho do núcleo - espermatozóides com membrana plasmática

lesada e acrossomal íntegra.

3.9 Integridade de acrossoma - Fitc-PNA

Para avaliação da integridade acrossomal utilizou-se a coloração fluorescente

com as sondas Iodeto de Propídio e Fitc-PNA, de acordo com a técnica descrita por

KIRK (2001, modificada por LANDIM-ALVARENGA, citado por CUNHA 2002). Para

a avaliação misturou-se 10µL da amostra a 40µL da solução de trabalho. A

avaliação foi realizada com uma alíquota de 5µL da suspensão depositada entre

lâmina e lamínula e avaliada em microscópio de epifluorescência com aumento de

1000X no microscópio de contraste de fase utilizando-se óleo de imersão (ZEISS,

JANAMED2, Alemanha). Para a visualização da fluorescência foram utilizados os

filtros de fluoreceína (azul) e rodamina (verde) para a observação dos corantes Fitc-

PNA e iodeto de propídio, respectivamente. Primeiramente, foi realizada a contagem

das células espermáticas em campo claro e, imediatamente após, o mesmo campo

foi visualizado sob epifluorescência. Foram anotadas todas as células que emitiam

qualquer fluorescência a cada campo, a contagem só era finalizada quando a

contagem de células em campo claro alcançava 200 células.

A classificação das células foi realizada da seguinte forma (CUNHA, 2002):

reação acrossomal verdadeira – visualização apenas da emissão da fluorescência

verde (Fitc-PNA); falsa reação do acrossomo – visualização da emissão da

fluorescência verde na região acrossomal (Fitc-PNA) e vermelha (PI);

34

espermatozóides lesados – visualização apenas da emissão da fluorescência

vermelha (PI); espermatozóides intactos - células não coradas.

3.10 Máquina de descongelamento

A máquina consiste fundamentalmente de dois recipientes de vidro, com

capacidade de um litro cada. Tais recipientes apresentam, em sua volta e

separadamente resistências elétricas onde a temperatura da água é regulada

através de um termostato acoplado a cada recipiente. Um dispositivo eletrônico se

encarrega de manter o nível constante de água dentro de cada recipiente, que se

encontra conectado a uma fonte de água, conforme a figura 8. Bombas d’água

movidas a eletricidade são utilizadas para injetar a água aquecida até o dispositivo

de descongelamento, que consiste em uma peça de vidro na forma de ? ,

apresentando duas entradas (água aquecida dos recipientes) e uma entrada para o

sonda do termômetro digital, pelo qual se introduziu a sonda, com o objetivo de aferir

a temperatura da água no momento em que esta passa pelo dispositivo, e uma

única saída de água.

Cada entrada de água do dispositivo de descongelamento foi conectada a um

dos dois recipientes responsáveis pelo armazenamento da água aquecida. Deste

modo, a temperatura de descongelamento pôde ser alterada de acordo com a

bomba que foi acionada.

O aparelho de descongelamento ultra-rápido funciona com um simples

acionamento do botão iniciar, desde que todos os parâmetros necessários tenham

sido previamente realizados, ou seja, acoplamento do aparelho com a fonte d’água,

energia elétrica, ajuste das temperaturas e ajuste do “timer”.

35

Controlador deTemperatura

Term

ômet

roD

igita

l

Con

trola

dor

Ele

trôn

icod

oT

IME

RC

ontr

olad

orE

letrô

nico

doN

ível

ador

Tran

sfor

mad

or

1 1

2

33

4

56789

11

10

Figura 8: Máquina de descongelamento ultra-rápido. Na figura podemos observar vários segmentos que são numerados e classificados como: 1 – recipientes de vidro envoltos de resistência elétrica com capacidade de 1L; 2 – bomba de entrada de água para os recipientes de vidro; 3 - Bombas d’água para injetar a água aquecida até o dispositivo de descongelamento; 4 - dispositivo de descongelamento; 5 – entrada da energia mais transformador; 6 – controlador eletrônico nivelado; 7 - controlador eletrônico “TIMER”; 8 – controlador de temperatura; 9 – Termômetro digital; 10 – Entrada da água; 11 – saída da água do dispositivo de descongelamento.

36

3.11 Máquina de congelamento em aceleração

A máquina de congelamento (figura 9) se constitui em duas partes, sendo

uma eletroeletrônica e outra hidráulica. O funcionamento desta máquina só iniciou

quando todos os pré-requisitos foram concluídos: as amostras estavam presas na

raque (figura 10), o recipiente contendo o nitrogênio líquido estava preenchido até

seu limite máximo (12cm), respeitando o período de equilíbrio de temperatura de 20

minutos e o reservatório de água, também, preenchido.

O sistema eletrônico foi responsável pela manutenção do reservatório de

água, sempre com uma quantidade suficiente para seu funcionamento. Este volume

foi controlado por um sistema nivelador e por uma bomba de entrada de água,

assim, quando tal volume atingiu o nível mínimo, capaz de manter o resto do

sistema em funcionamento, o sistema nivelador foi acionado para que a bomba de

entrada de água fosse ativada. Por conseguinte, o sistema o desligamento da

entrada de água quando o volume atingiu seu limite máximo.

Depois de realizado os requisitos mínimos necessários para o início do

congelamento iniciou-se, então, o processo. Automaticamente o sistema eletrônico

acionou uma bomba que lança a água no interior do botijão e fez com que o

recipiente contendo nitrogênio líquido desloca-se para cima resfriando as amostras

até submetê-las ao congelamento, ou seja, submergindo as amostras no nitrogênio

líquido.

Ao final do congelamento, o sistema eletroeletrônico desligou-se

automaticamente, isto é, quando o nível máximo de água no botijão foi atingido e, ao

mesmo tempo, as amostras já submersas no nitrogênio líquido, o sistema nivelador

desligou toda parte elétrica, o que não permitiu a entrada de água no reservatório,

nem no botijão.

A velocidade em que ocorreu o resfriamento e posterior congelamento das

amostras foi controlada por uma fonte regulável digital acoplada no sistema

eletroeletrônico, onde se podia aumentar ou reduzir a voltagem, isto é, aumentar ou

reduzir a velocidade da entrada da água no botijão.

37

Figura 9: Esquema da máquina de congelamento: a) corte mediano do botijão mostrando as guias (1) que irão conduzir o recipiente contendo o nitrogênio líquido em sua trajetória para cima e a entrada e saída da água do botijão (2); b) corte mediano do botijão mostrando a raque (3) e o recipiente do nitrogênio líquido (4); c) vista superior do botijão mostrando a parte do sistema eletroeletrônico e hidráulico – reservatório de água (externo ao botijão), a raque (retângulo menor ao centro) e o recipiente do nitrogênio líquido (retângulo maior).

Figura 10: Esquema da estrutura fixa de pvc para congelamento de palhetas de 0,5mL.

38

3.12 Estatística Os dados foram analisados considerando o método de amostragem simples

ao acaso e a proporção de espermatozóides foi obtida quanto à motilidade,

integridade de membrana e de acrossoma para cada condição de congelamento e

descongelamento. Foi utilizado o nível de significância de 5% de probabilidade e as

amostras foram dimensionadas considerando um desvio de 10% (5% de cada lado)

em torno da proporção da amostra.

Com a obtenção dos intervalos de confiança, para proporção populacional

(95% de probabilidade), em cada característica estudada, foi feita uma análise

considerando os intervalos superpostos ou não. Os intervalos servem, no caso, para

definir proporções estatisticamente iguais ou não.

Os dados, nas tabelas nos anexos VI, VII e VIII, foram apresentados em

proporção, sendo estes valores variando de 0 a 1. Para se obter os valores em

porcentagem deve-se multiplicá-los por 100 e, assim, estes valores estarão variando

de 0 a 100.

39

4. RESULTADOS

4.1 Motilidade

Após a realização dos descongelamentos e feita as análises estatísticas,

observou-se que houve diferença entre os diversos descongelamentos, tanto para a

motilidade total (figura 11), quanto para a progressiva (figura 12), demonstrando que

a máquina de descongelamento ultra-rápido foi significativamente melhor que o

convencional (anexo VI - tabela 2).

b

a

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

Maq Conv

Figura 11: Comparação da motilidade total pós-descongelamento do sêmen eqüino, utilizando a metodologia de descongelamento ultra-rápida (Maq) e a convencional (Conv). Os valores apresentados são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança. Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

40

ba

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

Maq Conv

Figura 12: Comparação da motilidade progressiva pós-descongelamento do sêmen eqüino, utilizando a metodologia de descongelamento ultra-rápida (Maq) e a convencional (Conv). Os valores apresentados são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança. Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

Quando comparamos os diferentes tratamentos de congelamento, sem levar

em conta o modo de descongelamento, podemos observar que tanto para a

motilidade total (figura 13) quanto para a progressiva (figura 14) o congelamento à

8cm do nitrogênio líquido foi significativamente maior quanto os demais tratamentos

à 1cm, 4cm e máquina de congelamento (MC) (anexo VI - tabela 3).

b

a

b

c

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

1cm 4cm 8cm MC

Figura 13: Comparação da motilidade total

bab

c

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

1cm 4cm 8cm MC

Figura 14: Comparação da motilidade progressiva

41

Ao se observar que houve diferença entre os tratamentos de congelamento,

buscamos, então, verificar qual foi a melhor associação entre as metodologias de

congelamento com as de descongelamento. Assim, observamos que para a

motilidade total (figura 15) a melhor interação, ou seja, média, foi o congelamento à

8cm com o descongelamento ultra-rápido, não diferindo significativamente da

interação máquina de congelamento com o descongelamento ultra-rápido. Já para a

motilidade progressiva (figura 16), também a melhor interação foi o congelamento à

8cm com o descongelamento ultra-rápido, não diferindo significativamente da

interação congelamento à 4cm com o descongelamento ultra-rápido (anexo VI -

tabela 4).

de

abba

dc

fe

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

Maq Conv Maq Conv Maq Conv Maq Conv

1cm 1cm 4cm 4cm 8cm 8cm MC MC

Figura 15: Comparação da motilidade total

bcbcbca

cab

dd

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

Maq Conv Maq Conv Maq Conv Maq Conv

1cm 1cm 4cm 4cm 8cm 8cm MC MC

Figura 16: Comparação da motilidade progressiva

Com o propósito de observar melhor o comportamento dos ejaculados dos

garanhões, fizemos um estudo da variabilidade individual dos garanhões tendo

como parâmetros os diferentes congelamentos com as metodologias de

descongelamento convencional (figura 17 – motilidade total, figura 18 – motilidade

42

progressiva e anexo VI - tabela 5) e ultra-rápida (figura 19 – motilidade total, figura

20 – motilidade progressiva e anexo VI - tabela 6).

gh

b

defg

mlm

ij

m

jl

cdecdeffgh

jlhi

efghdefgfgh

bc

a

bbcd

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1 1 1 1 3 3 3 3 4 4 4 4 6 6 6 6 7 7 7 7

1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC

Figura 17: Comparação da motilidade total

b

aa

cdefgdefgefg

bccddef

aabababaaaab

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1 1 1 1 3 3 3 3 4 4 4 4 6 6 6 6 7 7 7 7

1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC

Figura 18: Comparação da motilidade progressiva

aaa

effg

de

fgg

cbc

effg

decd

efefg

aaba

c

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1 1 1 1 3 3 3 3 4 4 4 4 6 6 6 6 7 7 7 7

1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC

Figura 19: Comparação da motilidade total

43

d

aa

d

hfg

ghh

abc

deef

gh

d

abbcdd

abaa

cd

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1 1 1 1 3 3 3 3 4 4 4 4 6 6 6 6 7 7 7 7

1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC

Figura 20: Comparação da motilidade progressiva

4.2 Integridade de membrana

Logo após o descongelamento, as amostras de sêmen foram submetidas ao

teste de integridade de membrana através da coloração CFDA (como descrita no

item 3.8). Quando as análises foram feitas somente observando as duas

metodologias de descongelamento, sem levar em conta o congelamento, não houve

diferença estatística para as células classificadas como íntegras (figura 21) e

lesadas, mas para as células semi-lesadas as médias foram significativamente

diferentes (anexo VII - tabela 7).

aa

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

Maq Conv

Figura 21: Comparação da integridade membrana

Quando comparamos os diferentes tratamentos de congelamento, sem levar

em conta a metodologia de descongelamento, verificou-se que as médias foram

significativamente diferentes, sendo o congelamento à 4cm que apresentou maior

porcentagem de células com membrana íntegra que os demais tratamentos à 1cm,

8cm e máquina de congelamento (figura 22 e anexo VII - tabela 8).

44

b

c

a

d

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

1cm 4cm 8cm MC

Figura 22: Comparação da integridade membrana

Como observado para a motilidade, também houve diferença entre os

tratamentos de congelamento para a integridade de membrana. Assim,

direcionamos nosso foco para verificar qual foi a melhor associação entre as

metodologias de congelamento com as de descongelamento.

A melhor interação foi o congelamento à 4cm com o descongelamento ultra-

rápido (figura 23 e anexo VII - tabela 9), sendo observado a maior média de células

com membranas íntegras.

bc

de

ba

gf

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

Maq Conv Maq Conv Maq Conv Maq Conv

1cm 1cm 4cm 4cm 8cm 8cm MC MC

Figura 23: Comparação da integridade membrana

Assim como realizado para a motilidade, voltamos a observar a variabilidade

individual dos garanhões, tendo como parâmetros os diferentes congelamentos com

as metodologias de descongelamento convencional (figura 24 e anexo VII - tabela

10) e ultra-rápida (figura 25 e anexo VII - tabela 11).

45

high

bc

l

effgh

cd

jl

ab

de

abc

jl

a

efde

j

ab

efg

a

ij

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1 1 1 1 3 3 3 3 4 4 4 4 6 6 6 6 7 7 7 7

1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC

Figura 24: Comparação da integridade membrana

e e

ab

i

ghghi

a

hi

bc

ef

ab

i

dee

cd

ghi

ab

g

a

fg

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1 1 1 1 3 3 3 3 4 4 4 4 6 6 6 6 7 7 7 7

1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC

Figura 25: Comparação da integridade membrana

4.3 Integridade de acrossoma

As mesmas amostras de sêmen que foram submetidas ao teste de

integridade de membrana também foram utilizadas no teste de integridade de

acrossoma através da coloração Fict-PNA (como descrita no item 3.9).

Semelhante ao que foi feito com a motilidade e integridade de membrana,

também foi realizado para a integridade de acrossoma, ou seja, primeiramente as

análises foram feitas somente observando as duas metodologias de

descongelamento, sem levar em conta o congelamento. Dessa forma podemos

observar que houve diferença estatística para as células classificadas como

espermatozóides intactos e com reação acrossomal verdadeira (figura 26 e anexo

VIII - tabela 12).

46

ba

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

Maq Conv

Figura 26: Comparação da integridade acrossoma

Quando comparamos os diferentes tratamentos de congelamento, sem levar

em conta a metodologia de descongelamento, verificamos que as médias foram

significativamente diferentes, sendo o congelamento na máquina que apresentou

maior porcentagem de células intactas que os demais tratamentos à 1cm, 4cm e

8cm (figura 27 e anexo VIII - tabela 13)

a

c

b

d

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

1cm 4cm 8cm MC

Figura 27: Comparação da integridade acrossoma

Semelhante ao observado para a motilidade e integridade de membrana,

também houve diferença entre os tratamentos de congelamento para a integridade

de acrossoma. Passamos para a outra fase, que foi a de verificar qual a melhor

associação entre as metodologias de congelamento com as de descongelamento.

A melhor interação observada foi o congelamento na máquina com o

descongelamento ultra-rápido (figura 28 e anexo VIII - tabela 14) tendo superposição

com o congelamento à 4cm com o descongelamento ultra-rápido.

47

ba

de

cab

gf

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

Maq Conv Maq Conv Maq Conv Maq Conv

1cm 1cm 4cm 4cm 8cm 8cm MC MC

Figura 28: Comparação da integridade acrossoma

Como executado nos outros parâmetros como a motilidade e integridade de

membrana, observamos, também, a variabilidade entre garanhões tendo como

parâmetros os diferentes congelamentos com a metodologia de descongelamento

convencional (figura 29 e anexo VIII - tabela 15) e ultra-rápida (figura 30 e anexo VIII

- tabela 16).

jlij

ab

mn

fg

high

m

ab

efgde

n

a

gh

ijlm

cddef

bc

j

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1 1 1 1 3 3 3 3 4 4 4 4 6 6 6 6 7 7 7 7

1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC

Figura 29: Comparação da integridade acrossoma

cdc

b

f

cd

ef

b

de

a

c

b

ef

a

c

b

ef

a

cd

a

ef

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1 1 1 1 3 3 3 3 4 4 4 4 6 6 6 6 7 7 7 7

1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC 1cm 4cm 8cm MC

Figura 30: Comparação da integridade acrossoma

48

4.4 Curvas de congelamento

4.4.1 Curva de resfriamento 20±1ºC à 5±1ºC

Para realizar o congelamento das amostras, estas foram refrigeradas em uma

geladeira da MiniTub, com a temperatura regulada para 5±1ºC, a fim de reduzir a

temperatura ambiente das amostras para 5±1ºC. Após várias mensurações, se

chegou a uma curva de resfriamento (figura 31). Essa curva foi utilizada para todos

os tratamentos de congelamento, sendo a taxa de resfriamento de 3ºC/min.

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Tempo (minutos)

Tem

per

atu

ra (

ºC)

Figura 31: Curva de resfriamento das amostras

4.4.2 Curva de congelamento à 1cm do nitrogênio de 5±1ºC à -196ºC

Na curva de congelamento à 1cm do nitrogênio (figura 32), foi observado uma

acentuada diminuição na temperatura, ou seja, uma curva com taxa de

congelamento muito elevada (87ºC/min de 5 à -120ºC).

-250

-200

-150

-100

-50

0

50

20 22 24 26 28 30

Tempo (minutos)

Tem

per

atu

ra (

ºC)

Figura 32: Curva de congelamento à 1cm do nitrogênio.

49

4.4.3 Curva de congelamento à 4cm do nitrogênio de 5±1ºC à -196ºC

Na curva de congelamento à 4cm do nitrogênio (figura 33), foi observado uma

diminuição na temperatura mais moderada, ou seja, uma curva com taxa de

congelamento de 46,8ºC/min (5 à -120ºC).

-250

-200

-150

-100

-50

0

50

20 22 24 26 28 30

Tempo (minutos)

Tem

per

atu

ra (

ºC)

Figura 33: Curva de congelamento à 4cm do nitrogênio

4.4.4 Curva de congelamento à 8cm do nitrogênio de 5±1ºC à -196ºC

Na curva de congelamento à 8cm do nitrogênio (figura 34), foi observado uma

diminuição na temperatura mais lenta, apresentando uma curva com taxa de

congelamento de 15,26ºC/min (5 à -120ºC) e, uma taxa de 31,71ºC/min (-120 à -

196ºC).

-250

-200

-150

-100

-50

0

50

20 22 24 26 28 30

Tempo (minutos)

Tem

per

atu

ra (

ºC)

Figura 34: Curva de congelamento à 8cm do nitrogênio

50

4.4.5 Curva de congelamento da máquina de 5±1ºC à -196ºC

Na curva de congelamento da máquina (figura 35), foi observado uma

diminuição na temperatura mais lenta, apresentando uma curva com taxa de

congelamento de 12,20ºC/min (5 à -120ºC) e, uma taxa de 31,71ºC/min (-120 à -

196ºC).

-250

-200

-150

-100

-50

0

5020 22 24 26 28 30

Tempo (minutos)

Tem

aper

atu

ra (

ºC)

Figura 35: Curva de congelamento da máquina

4.5 Curvas de descongelamento

4.5.1 Curva do descongelamento convencional

Para realizar o descongelamento convencional das amostras, foi feito o uso

de um banho-maria regulado para 37±1ºC com circulação de água. Após realizados

os descongelamentos por essa metodologia, observou-se uma curva de

descongelamento (figura 36) de 858,92ºC/min (-196 à 5ºC) e 91,76ºC/min (5 à

36ºC).

51

-250

-200

-150

-100

-50

0

50

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57

Tempo (segundos)

Tem

per

atu

ra (

ºC)

Figura 36: Curva do descongelamento convencional

4.5.2 Curva do descongelamento na máquina ultra-rápida

Para realizar o descongelamento das amostras, foi feito o uso de uma

máquina de descongelamento ultra-rápdo e de um banho-maria regulado para

37±1ºC com circulação de água, para que as palhetas ficassem neste até completar

1 minuto. Após realizados os descongelamentos por essa metodologia, observou-se

uma curva de descongelamento (figura 37) de 1620ºC/min (-196 à 5ºC) e

70,90ºC/min (5 à 36ºC).

-250

-200

-150

-100

-50

0

50

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57

Tempo (segundos)

Tem

per

atu

ra (

ºC)

Figura 37: Curva do descongelamento na máquina ultra-rápida

52

5. DISCUSSÃO

O resfriamento das amostras foi feito usando uma geladeira da MiniTub, com

a temperatura regulada para 5±1ºC. Após várias mensurações, se chegou a uma

curva padrão de resfriamento para todos os tratamentos de congelamento com taxa

de resfriamento de -3ºC/min. Outros autores utilizam a taxa de resfriamento de -

0,1ºC/min (KAYSER et al., 1992) e -0,55ºC/min (WOELDERS et al., 2005;

VIDAMENT et al., 2000). A taxa de resfriamento para o congelamento à 1cm do

nitrogênio foi de -87ºC/min de 5 à -120ºC e -8,65ºC/min de -120 à -196ºC,

semelhante a utilizada por PAPA et al. (2003), à 4cm do nitrogênio foi de -

46,8ºC/min de 5 à -120ºC e -9,86ºC/min de -120 à -196ºC, como utilizado por ROTA

et al. (2005), à 8cm do nitrogênio foi de -15,26ºC/min de 5 à -120ºC e -31,71ºC/min

de -120 à -196ºC, semelhante a utilizada por NÖTHLING e SHUTTLEWORTH

(2005) e taxa de resfriamento para o congelamento na máquina foi de -12,20ºC/min

de 5 à -120ºC e -85ºC/min de -120 à -196ºC. Esta taxa é diferenciada das demais,

visto que o constante deslocamento do nível de nitrogênio em direção as palhetas

aumenta de forma constante a taxa de resfriamento em relação ao tempo,

caracterizando um congelamento em aceleração. É importante salientar que esta

metodologia não foi verificada na literatura, sendo, então, inédita.

Com relação a motilidade espermática podemos inferir que os resultados

encontrados neste trabalho vêm a corroborar com os obtidos por BARRETO (2002)

e SANTOS (2006), em que a utilização da máquina de descongelamento ultra-rápido

foi superior à metodologia convencional, sendo tanto a motilidade total como a

53

progressiva com seus valores estimados de médias populacionais por intervalo de

confiança não foram superpostos, com 95% de probabilidade, ou seja, são

estatisticamente diferentes. Os resultados de BRUGOV (1977, citado por SALAMON

e MAXWELL, 1995) vêm a corroborar com nossos resultados, pois este pesquisador

observou que o descongelamento ultra-rápido, em banho com glicerol a 190ºC/3 a 4

segundos, melhorou significativamente a motilidade do sêmen de bovino e de ovino,

em comparação ao descongelamento à 38ºC. Os resultados de ANDERSEN e

AAMADAL (1972, citado por SALAMON e MAXWELL, 1995), também, vêm a

corroborar com nossos resultados, onde observaram que o descongelamento à 75ºC

foi superior à 35ºC. Os resultados de COCHRAN et al. (1984), os quais verificaram

que houve maior motilidade progressiva nas amostras descongeladas à 75ºC por 7

segundos, imediatamente submetendo ao banho de 37ºC, por no mínimo de 5

segundos, do que à 37ºC por 30 segundos, também, vêm a corroborar com nossos

resultados. Existem publicações que vêm a confrontar com nossos resultados, pois

não observaram diferença na motilidade entre descongelamento de 36 a 40ºC ou de

50 a 70ºC (PONTBRIAND et al., 1989, citado por SALAMON e MAXWELL, 1995).

Quando foram observados os diferentes tratamentos de congelamento, sem

levar em conta o modo de descongelamento, podemos verificar que tanto para a

motilidade total quanto para a progressiva o congelamento à 8cm do nitrogênio

líquido foi significativamente maior quanto aos demais tratamentos à 1cm, 4cm e

máquina de congelamento, considerando 95% de probabilidade. Os congelamentos

à 4cm e máquina de congelamento tiveram seus valores superpostos, demonstrando

que as médias populacionais por intervalo de confiança são iguais, com 95% de

probabilidade. Estes resultados confrontam com os encontrados por PAPA et al.

(2003), no qual não observaram diferença estatística quando amostras de sêmen de

eqüinos foram congeladas em diferentes alturas do nível de nitrogênio líquido (1, 3,

6 e 9cm) e, NÖTHLING e SHUTTLEWORTH (2005) que, também, não observaram

diferença no congelamento à 3,5cm e 8cm do nível do nitrogênio líquido, somente

vindo a corroborar com a observação de uma leve tendência de maior motilidade

para o congelamento à 8cm.

Assim, ao se observar que houve diferença entre os tratamentos de

congelamento, buscou-se, então, verificar qual foi a melhor associação entre as

metodologias de congelamento com as de descongelamento. Observou-se que para

a motilidade total a melhor interação, ou seja, maior média estimada, foi o

54

congelamento à 8cm com o descongelamento ultra-rápido, não diferindo

significativamente da interação máquina de congelamento com o descongelamento

ultra-rápido, com 95% de probabilidade. Já para a motilidade progressiva, também a

melhor interação foi o congelamento à 8cm com o descongelamento ultra-rápido,

não diferindo significativamente da interação congelamento à 4cm com o

descongelamento ultra-rápido. Estes achados vêm a corroborar com os resultados

de ROTA et al. (2005), HAMMADEH et al. (2001a), HAMMADEH et al. (2001b) e

THURSTON et al. (2003), onde a utilização de um sistema programável realizando

uma taxa de resfriamento lento apresentou uma melhor motilidade. Nossos

resultados confrontam com os resultados de ARRUDA et al. (2005), que não

observaram diferença entre o congelamento à 3cm comparado com aparelho de

congelamento; ÁLAMO et al. (2005), que testaram a viabilidade de um ultra-freezer

para congelamento e armazenamento de sêmen de cães e observaram que este

poderia ser utilizado devido às suas características serem semelhantes as

observadas no congelamento com nitrogênio líquido; e MOORE et al. (2006), que

observaram não haver diferença na motilidade e viabilidade espermática quando os

espermatozóides foram submetidos a taxas de resfriamento de 5 a 45ºC/min, sendo

esses dados similares ao encontrado por DEVIREDDY et al. (2002) que

determinaram que os espermatozóides de garanhões sobrevivem a taxas de

resfriamento de 20 a 100ºC/min.

A pior interação foi o congelamento à 1cm com o descongelamento

convencional, tanto para a motilidade total como a progressiva, sendo que a média

populacional por intervalo de confiança para a motilidade total não superpôs com as

médias de outras interações. Quando se procedeu com o congelamento rápido, à

1cm, e descongelamento ultra-rápido, esse procedimento não resultou em melhores

resultados de viabilidade espermática quando comparado com o congelamento

lento, à 8cm, com descongelamento ultra-rápido. NÖTHLING e SHUTTLEWORTH

(2005) observaram que a melhor interação foi o congelamento à 8cm com o

descongelamento à 70ºC, logo, esses resultados vêm a corroborar com os

encontrados em nossa pesquisa. Dessa forma, nossos resultados discordam, de

certa forma, com a teoria de GRAHAM (1996), onde aqueles processos que utilizam

curva de resfriamento rápido exige descongelamento rápido e outros realizados com

curva lenta de resfriamento deve-se utilizar descongelamento lento. Ao levar em

conta essa teoria, era de se esperar uma melhor interação entre o congelamento à

55

1cm com o descongelamento ultra-rápido e o congelamento à 8cm com o

descongelamento à 37ºC, o que não aconteceu.

A fim de observar melhor o comportamento dos ejaculados dos garanhões e

verificar quais garanhões que tiveram as melhores e piores interações, foi feito,

então, um estudo da variabilidade dos garanhões tendo como parâmetros os

diferentes congelamentos com as metodologias de descongelamento convencional e

ultra-rápida. Assim, podemos destacar para o descongelamento convencional que o

garanhão 1 apresentou melhor motilidade total e progressiva quando o ejaculado foi

submetido ao congelamento à 8cm e que o garanhão 6, com o ejaculado congelado

à 4cm, foi a pior interação. Já para o descongelamento ultra-rápido o melhor foi o

garanhão 7 com o ejaculado submetido à 8cm e, o pior foi o garanhão 6 com o

ejaculado congelado à 4cm. Estes resultados mostram que a variação da motilidade,

para alguns garanhões, como exemplo o garanhão 1, manteve-se constante dentro

de cada tratamento, ou seja, apresentou sempre a motilidade mais elevada. Já para

outros garanhões, como o garanhão 7, o tratamento influenciou profundamente na

motilidade, ou seja, o congelamento deste garanhão à 1cm foi o que apresentou a

menor motilidade total, já à 8cm apresentou a maior motilidade total dentre os

garanhões. Isto, provavelmente, é devido a diferentes composições bioquímicas das

células espermáticas e do plasma seminal dos diversos garanhões que respondem

de forma diferenciada às diferentes taxas de resfriamento/descongelamento,

fazendo com que exista melhor congelabilidade para alguns garanhões de forma

específica (garanhão 7) para uma determinada taxa de resfriamento e outros de

forma geral (garanhão 1). Alguns garanhões são resistentes a uma ampla variação

da taxa de resfriamento, como observado por MOORE et al. (2006), que não houve

diferença na motilidade e viabilidade espermática quando os espermatozóides eram

submetidos a taxas de resfriamento de 5 a 45ºC/min e DEVIREDDY et al. (2002) que

determinaram que os espermatozóides de garanhões sobrevivem a taxas de

resfriamento de 20 a 100ºC/min.

Para o teste de integridade de membrana após o descongelamento, as

amostras de sêmen foram submetidas à coloração CFDA (como descrita no item

3.8). Quando as análises foram feitas somente observando as duas metodologias de

descongelamento, sem levar em conta o congelamento, houve superposição entre

as médias populacionais para as células classificadas como íntegras e lesadas, mas

para as células semi-lesadas as médias não foram superpostas, sendo o

56

descongelamento na máquina ultra-rápida com a maior média populacional para as

células íntegras. BARRETO (2002) e SANTOS et al. (2006), também, observaram

que o descongelamento ultra-rápido apresentou menor dano a membrana. Logo,

podemos fazer o uso desta máquina a fim de obter melhores resultados, pois ao se

pensar numa população, a variação de um pequeno valor na proporção da média

populacional pode gerar uma diferença muito grande em termos de quantidade de

células viáveis, o que pode vir a interferir na taxa de fertilidade.

Quando comparamos os diferentes tratamentos de congelamento, sem levar

em conta a metodologia de descongelamento, verificou-se que as médias foram

significativamente diferentes, não havendo superposição entre as médias

populacionais por intervalo de confiança, sendo o congelamento à 4cm que

apresentou maior porcentagem de células com membrana íntegra que os demais

tratamentos, seguido do congelamento na máquina. Estes resultados, também, vêm

a confrontar com os encontrados por PAPA et al. (2003) e ARRUDA et al. (2005),

em que não observaram diferença estatística quando amostras de sêmen de

eqüinos foram congeladas em diferentes alturas do nível de nitrogênio líquido (1, 3,

6 e 9cm) e entre 3,5cm e aparelho programável, respectivamente; e vêm a

corroborar com os resultados de ROTA et al. (2005) que observaram melhor

integridade de membrana ao se congelar num sistema de congelamento

programável, taxa de resfriamento lento, comparado ao congelamento à 4cm do

nível de nitrogênio.

Como foi observado, para a motilidade também não houve superposição entre

os tratamentos de congelamento para a integridade de membrana, quando somente

observamos as células íntegras. Assim, direcionamos nosso foco para verificar qual

foi a melhor associação entre as metodologias de congelamento com as de

descongelamento. A melhor interação foi o congelamento à 4cm com o

descongelamento ultra-rápido, sendo observado a maior média populacional para

células com membranas íntegras. Esses resultados vêm a confrontar, de certa

forma, com a teoria de GRAHAM (1996), onde aqueles processos que utilizam curva

de resfriamento rápido exige descongelamento rápido e outros realizados com curva

lenta de resfriamento deve-se utilizar descongelamento lento. Vale ressaltar que a

interação congelamento na máquina com descongelamento ultra-rápido foi a terceira

melhor interação, somente apresentado resultado inferior a interação congelamento

à 4cm com descongelamento convencional e congelamento na máquina com

57

descongelamento convencional, sendo que estas últimas apresentaram médias

populacionais superpostas, ou seja, são iguais. Esses resultados vêm a corroborar

com relatos de COCHRAN et al. (1984), que o descongelamento pode ser feito de

diversas maneiras, o que dependerá é o tipo de envase e do processo de

congelamento propriamente dito.

Assim como realizado para a motilidade, observamos que houve uma

variabilidade entre garanhões, sendo utilizados os parâmetros dos diferentes

congelamentos com as metodologias de descongelamento convencional e ultra-

rápida. Assim, podemos destacar para o descongelamento convencional que o

garanhão 3 apresentou melhor integridade de membrana quando o ejaculado foi

submetido ao congelamento na máquina e que o garanhão 7, com o ejaculado

congelado à 1cm, foi a pior interação. Já para o descongelamento ultra-rápido o

melhor foi o garanhão 1 com o ejaculado submetido à 4cm e na máquina de

congelamento e o pior foi o garanhão 7 com o ejaculado congelado à 1cm. Isto,

como também foi relatado para a motilidade espermática, provavelmente, é devido a

diferentes composições bioquímicas das células espermáticas e do plasma seminal

dos diversos garanhões, fazendo com que exista melhor congelabilidade para

alguns garanhões. A determinação da ideal taxa de resfriamento e descongelamento

para os espermatozóides eqüino é um dos assuntos mais importantes para a

conservação da motilidade e da viabilidade espermática. Como relatado por SILVA

FILHO (1994, citado por SNOECK e HENRY, 2002a) este é um assunto complexo

que envolve a individualidade do garanhão, a constituição da membrana do

espermatozóide, a natureza do diluente e a temperatura final de armazenamento.

As mesmas amostras de sêmen que foram submetidas ao teste de

integridade de membrana também foram utilizadas no teste de integridade de

acrossoma através da coloração Fict-PNA (como descrita no item 3.9). Foi repetido

o mesmo procedimento para a motilidade e integridade de membrana, sendo

primeiramente as análises feitas somente observando as duas metodologias de

descongelamento, sem levar em conta o congelamento.

Dessa forma, podemos observar que não houve superposição entre médias

populacionais por intervalo de confiança para as células classificadas em

espermatozóides intactos, com reação acrossomal verdadeira e com falsa reação de

acrossoma, sendo mais importante observar as células intactas, pois as células

intactas que serão responsáveis pela fecundação, valendo ressaltar que a

58

metodologia de descongelamento ultra-rápido teve sua média populacional maior

que a convencional, com 95% de probabilidade. Os resultados de BORG et al.

(1997) vêm a confrontar com nossos resultados, pois eles não observaram uma

melhora real sobre a integridade de acrossoma quando descongelando o sêmen foi

feito a 60 e 38ºC, como também os resultados de PONTBRIAND et al. (1989, citado

por SALAMON e MAXWELL, 1995), que não observaram diferença na integridade

de acrossoma, entre descongelamento de 36 a 40ºC ou de 50 a 70ºC.

Já quando comparamos os diferentes tratamentos de congelamento, sem

levar em conta a metodologia de descongelamento, verificamos que as médias

populacionais da metodologia de congelamento na máquina apresentou maior

proporção (95% de probabilidade) de células intactas que os demais tratamentos à

1cm, 4cm e 8cm. Esses resultados vêm a corroborar, em parte, com os de

NÖTHLING e SHUTTLEWORTH (2005) que observaram uma leve tendência de

menor dano de integridade acrossoma para o congelamento com taxa mais lenta de

resfriamento, no caso de seu experimento, à 8cm.

Assim, ao verificarmos as diferenças entre os tratamentos, passamos para a

outra fase, que foi a de verificar qual foi a melhor interação entre as metodologias de

congelamento com as de descongelamento para a característica células intactas. A

melhor interação observada foi o congelamento na máquina com o

descongelamento ultra-rápido tendo superposição com o congelamento à 4cm com

o descongelamento ultra-rápido, valendo ressaltar que foram observadas as médias

populacionais por intervalo de confiança, com 95% de probabilidade. Os resultados

de NÖTHLING e SHUTTLEWORTH (2005), que observaram a melhor interação do

congelamento à 8cm com o descongelamento à 70ºC, vêm corroborar com os

encontrados em nossa pesquisa, ou seja, os melhores resultados foram observados

quando se utilizou uma taxa de resfriamento lento com uma taxa de reaquecimento

rápido.

Como executado nos outros parâmetros, observamos, também, a

variabilidade entre garanhões, tendo como parâmetros os diferentes congelamentos

com as metodologias de descongelamento convencional e ultra-rápida.

Assim, podemos destacar para o descongelamento convencional que o

garanhão 3 apresentou melhor integridade de acrossoma quando o ejaculado foi

submetido ao congelamento na máquina e que o garanhão 4, com o ejaculado

congelado à 1cm, foi a pior interação. Já para o descongelamento ultra-rápido o

59

melhor foi o garanhão 1 com o ejaculado submetido ao congelamento na máquina e

o pior foi o garanhão 7, com o ejaculado congelado à 1cm. Isto, como também foi

dito para a motilidade espermática e integridade de membrana, provavelmente, é

devido a diferentes composições bioquímicas das células espermáticas e do plasma

seminal dos diversos garanhões, fazendo com que exista melhor congelabilidade

para alguns garanhões. Como relatado por SILVA FILHO (1994, citado por SNOECK

e HENRY, 2002a) este é um assunto complexo que envolve a individualidade do

garanhão, a constituição da membrana do espermatozóide, a natureza do diluente e

a temperatura final de armazenamento. Os resultados de BORG et al. (1997) vêm a

corroborar com nossos resultados, pois eles, também, observaram a individualidade

do garanhão frente aos processos de congelamento e descongelamento.

Fazendo uma síntese do experimento, podemos destacar que a taxa de

resfriamento lento (máquina de congelamento) foi capaz de propiciar um melhor

congelamento, pois as células espermáticas tiveram mais tempo para interagir com

o diluente, diminuindo, então, a lesão de acrossoma. Isto está de acordo com relato

de LOOMIS (1992), quando destacou que o êxito do resfriamento do sêmen eqüino

depende da diluição adequada, taxas relativamente lentas de resfriamento e

manutenção em temperaturas específicas, onde esses fatores associados irão

reduzir o metabolismo espermático e minimizar as lesões de membrana, evitando a

indução prematura da capacitação e/ou reação acrossômica.

A curva de resfriamento, provavelmente, transcreveu uma taxa de

resfriamento considerada ótima, como descrita por MAZUR et al. (1972, citado por

HAMMADEH et al., 2001a; LI, 2005; CHAVEIRO et al., 2006) onde postularam que a

formação dos cristais de gelo e o efeito solução apresentavam um efeito na

inativação celular e que uma ótima taxa de resfriamento poderia minimizar estes

efeitos. A curva da porcentagem de sobrevivência celular versus a taxa de

resfriamento apresentava-se em forma de “U” invertido, onde no ponto máximo o

efeito do dano, tanto pela baixa taxa de resfriamento como a formação de cristais de

gelo, é mínimo, sendo esta taxa de resfriamento considerada ótima.

Essa taxa de resfriamento, na máquina de congelamento, aproxima-se da

curva de congelamento de sêmen eqüino relatada por DAVIS MOREL (1999) como

uma curva apropriada de congelamento utilizando um sistema programado de

temperatura, onde se inicia a uma taxa de 10ºC/min de 4 à -10ºC, -20ºC/min até -

100ºC, -60ºC/min até -140 e, por fim, as palhetas são mergulhadas no nitrogênio. Na

60

curva de congelamento da máquina observamos uma taxa de congelamento de

12,20ºC/min (5 à -120ºC) e, uma taxa de 31,71ºC/min (-120 à -196ºC).

No descongelamento convencional observou-se uma curva de

descongelamento de 858,92ºC/min (-196 à 5ºC) e 91,76ºC/min (5 à 36ºC) e no

descongelamento utilizando a máquina de descongelamento ultra-rápido observou-

se uma curva de descongelamento de 1620ºC/min (-196 à 5ºC) e 70,90ºC/min (5 à

36ºC). Foram marcantes os resultados utilizando a máquina de descongelamento

ultra-rápido, melhorando não só a motilidade, mas, também, reduziu os danos de

integridade de membrana e acrossoma, valendo ressaltar que foi muito importante o

descongelamento com taxa de descongelamento muito alta (1620ºC/min) até a

temperatura de 5ºC e a partir daí uma taxa mais lenta (70,90ºC/min), pois com essa

taxa de descongelamento os espermatozóides ficaram menos expostos, por um

menor período de tempo, ao soluto e ao crioprotetor, vindo corroborar com ROBINS

et al. (1976, citado por SALAMON e MAXWELL, 1995) quando observaram que os

espermatozóides submetidos à uma rápida taxa de descongelamento são expostos

por um menor período de tempo ao soluto concentrado e ao crioprotetor,

melhorando, assim, os resultados de motilidade e viabilidade espermática. Logo,

podemos chegar a uma conclusão que esta metodologia pode ser utilizada para o

descongelamento de sêmen eqüino e, também, para outras espécies como bovinos

e caninos, BARRETO (2002) e SANTOS el al. (2006), respectivamente.

BORG et al. (1997) observaram a grande dificuldade de se descongelar a alta

temperatura (à 75ºC), pois para isso seria necessário um equipamento especial para

evitar que as amostras permanecessem nesta temperatura por mais de um segundo,

o que levaria os processos de congelamento e descongelamento a resultados

inferiores quanto a motilidade e viabilidade espermática.

61

6. CONCLUSÃO

A metodologia de descongelamento ultra-rápido pode ser utilizada para o

descongelamento do sêmen de eqüino.

Com o uso das máquinas, tanto a de congelamento, quanto a de

descongelamento, torna-se mais fácil a manipulação, de forma mais padronizada, do

sêmen, obtendo, assim, melhores resultados.

Verificou-se a variação da individualidade de alguns garanhões com relação a

congelabilidade do sêmen e para outros garanhões existiu a manutenção de uma

melhor congelabilidade para os diferentes tratamentos.

Propõe-se como novo protocolo de criopreservação de sêmen eqüino a

interação das duas máquinas.

Tornam-se necessários estudos mais aprofundados relativos à comparação

da taxa de resfriamento à 8cm do nitrogênio com a máquina de congelamento, visto

que os melhores resultados encontraram-se nessas taxas de resfriamento.

62

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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69

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70

8. ANEXOS

ANEXO I – Diluente de centrifugação

Leite em pó desnatado 100g

Penicilina G procaína 1925000UI

Penicilina G potássica 640000 UI

Estreptomicina 1,25g

Água destilada (q.s.p.) 1000mL

ANEXO II – Preparação do formol-citrato??

citrato de sódio 2,94 g??

adicionar 100 mL de água

Agitar bem, logo após retirar 4mL do volume final e substituir por 4 ml de

formol

71

ANEXO III – Técnica fluorescente para avaliação da integridade de membranas

Soluções estoque:

1- Solução estoque de fluoresceína:

6-carboxifluoresceína diacetato 4,6mg

DMSO 10mL

2- Solução estoque de iodeto de propídio:

iodeto de propídio 10mg

solução fisiológica (q.s.p.) 20mL

3- Solução estoque de formaldeído:

Solução 1:80 de formalina 40%, em solução fisiológica.

4- Citrato de Sódio 3%:

Citrato de Sódio 2,94g

Água destilada (q.s.p.) 100mL

Solução de trabalho

Solução estoque 1 10µL

Solução estoque 2 5µL

Solução estoque 3 10µL

Citrato de Sódio 3% 0,48mL

72

ANEXO IV – Técnica fluorescente para avaliação da integridade acrossomal

Soluções estoque:

1- Solução Estoque de Fitc-PNA:

FITC labelled (L 7381, SIGMA) 1mg

PBS 1mL

2- Solução estoque de iodeto de propídio:

iodeto de propídio 10mg

solução fisiológica (q.s.p.) 20mL

3- Solução estoque de formaldeído:

Solução 1:80 de formalina 40%, em solução fisiológica.

4- Citrato de Sódio 3%:

Citrato de Sódio 2,94g

Água destilada (q.s.p.) 100mL

Solução de trabalho

Solução estoque 1 10µL

Solução estoque 2 5µL

Solução estoque 3 10µL

Citrato de Sódio 3% 0,48mL

73

ANEXO V – Parâmetros utilizados para as análises de motilidade de células

espermáticas de garanhões pelo programa Ceros versão 10.8 da Hamilton Thorne

Research (HTR) (Analysis Setup).

Frames Acquired 30

Frame Rate 60 Hz

Minimum Contrast 80

Minimum Cell Size 3 Pixels

Minimum Static Contrast 30

Straightness (STR) Threshold 70.0%

Low VAP Cutoff 5,0 µm/s

Medium VAP Cutoff 25,0 µm/s

Low VSL Cutoff 11,0 µm/s

Head Size, Non-Motile 6 Pixels

Head Intensity, Non-Motile 160

Static Head Size 0,32 a 2,50

Static Head Intensity 0,10 a 1,12

Static Elongation 12 a 90

Slow Cells Motile No

Magnification 1,95

Video Source Camera

Video Frequency 60

Bright Field No

Brightness for LED 2300

Brightness for Ident. 3000

Temperature Set 0,0ºC

Cell Type User

Cell Depth Setup 20,0 µm

Field Selection Mode SELECT

Ident Active NO

Ident Mode A

Integrating Time 1 Frame

74

ANEXO VI – Resultados da motilidade

Tabela 2: Comparação da motilidade total (MotTot) e progressiva (MotProg) pós-descongelamento do sêmen eqüino, utilizando a metodologia de descongelamento ultra-rápida (Maq) e a convencional (Conv). Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança. Descong MotTot MotProg

Maq 0,3296±0,0059a 0,1568±0,0046a

Conv 0,2861±0,0057b 0,1429±0,0044b

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

Tabela 3: Comparação da motilidade total (MotTot) e progressiva (MotProg) pós-descongelamento do sêmen eqüino tendo como parâmetro analisado os tratamentos de congelamento à 1cm, 4cm, 8cm e máquina de congelamento (Maqcong) sem levar em conta a metodologia de descongelamento. Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança.

Cong MotTot MotProg

1cm 0,2483±0,0077c 0,1176±0,0057c

4cm 0,3055±0,0082b 0,1553±0,0064b

8cm 0,3621±0,0086a 0,1718±0,0067a

Maqcong 0,3156±0,0083b 0,1546±0,0064b

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

Tabela 4: Comparação da motilidade total (MotTot) e progressiva (MotProg) pós-descongelamento do sêmen eqüino tendo como parâmetro analisado os tratamentos de congelamento à 1cm, 4cm, 8cm e máquina de congelamento (Maqcong) levando em conta as metodologias de descongelamento (convencional – Conv; máquina de descongelamento ultra-rápido – Maq). Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança.

Trat Descong MotTot MotProg 1cm Maq 0,2653±0,0111e 0,1200±0,0082d

1cm Conv 0,2313±0,0106f 0,1153±0,0080d

4cm Maq 0,3226±0,0118c 0,1670±0,0094ab

4cm Conv 0,2883±0,0114d 0,1436±0,0088c

8cm Maq 0,3763±0,0122a 0,1840±0,0098a

8cm Conv 0,3480±0,0120b 0,1596±0,0092bc

Maqcong Maq 0,3543±0,0121ab 0,1563±0,0091bc

Maqcong Conv 0,2770±0,0113de 0,1530±0,0091bc

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

75

Tabela 5: Comparação da motilidade total (MotTot) e progressiva (MotProg) pós-descongelamento do sêmen eqüino, pela metodologia convencional, tendo como parâmetro analisado os tratamentos de congelamento à 1cm, 4cm, 8cm e máquina de congelamento (Maqcong) e a variação entre garanhões. Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança.

Cong Garanhão MotTot MotProg

1cm 1 0,3566±0,0271bcd 0,1883±0,0221ab

1cm 3 0,2816±0,0254fgh 0,1916±0,0222ab

1cm 4 0,1933±0,0223jl 0,0700±0,0144def

1cm 6 0,1833±0,0219jl 0,0516±0,0125efg

1cm 7 0,1416±0,0197m 0,0750±0,0149cde

4cm 1 0,4083±0,0278b 0,2083±0,0229a

4cm 3 0,3066±0,0261defg 0,1933±0,0223ab

4cm 4 0,2783±0,0253fgh 0,0800±0,0153cd

4cm 6 0,1350±0,0193m 0,0366±0,0106g

4cm 7 0,3133±0,0262defg 0,2000±0,0226a

8cm 1 0,4883±0,0282a 0,2233±0,0235a

8cm 3 0,2916±0,0257efgh 0,1933±0,0223ab

8cm 4 0,3266±0,0265cdef 0,1016±0,0171c

8cm 6 0,2116±0,0231ij 0,0566±0,0130def

8cm 7 0,4216±0,0279b 0,2233±0,0235a

Maqcong 1 0,3700±0,0273bc 0,2150±0,0232a

Maqcong 3 0,2466±0,0244hi 0,1983±0,0225a

Maqcong 4 0,3433±0,0268cde 0,1533±0,0203b

Maqcong 6 0,1583±0,0206lm 0,0466±0,0119fg

Maqcong 7 0,2666±0,0250gh 0,1516±0,0203b

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada

coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

76

Tabela 6: Comparação da motilidade total (MotTot) e progressiva (MotProg) pós-descongelamento do sêmen eqüino, pela metodologia ultra-rápida, tendo como parâmetro analisado os tratamentos de congelamento à 1cm, 4cm, 8cm e máquina de congelamento (Maqcong) e a variação entre garanhões. Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança.

Cong Garanhão MotTot MotProg

1cm 1 0,3650±0,0272c 0,1633±0,0209cd

1cm 3 0,2566±0,0247efg 0,1600±0,0207d

1cm 4 0,2366±0,0240fg 0,0716±0,0146gh

1cm 6 0,2100±0,0230g 0,0550±0,0129h

1cm 7 0,2583±0,0247ef 0,1500±0,0202d

4cm 1 0,4350±0,0280a 0,2450±0,0243a

4cm 3 0,2616±0,0248ef 0,1750±0,0215bcd

4cm 4 0,2633±0,0249ef 0,1116±0,0178ef

4cm 6 0,2200±0,0234fg 0,0700±0,0144gh

4cm 7 0,4333±0,0280a 0,2333±0,0239a

8cm 1 0,4233±0,0279ab 0,2316±0,0238a

8cm 3 0,3300±0,0266cd 0,2150±0,0232ab

8cm 4 0,3750±0,0274bc 0,1383±0,0195de

8cm 6 0,2866±0,0255de 0,1000±0,0169fg

8cm 7 0,4666±0,0282a 0,2350±0,0240a

Maqcong 1 0,4533±0,0281a 0,2133±0,0231ab

Maqcong 3 0,2866±0,0255de 0,1550±0,0204d

Maqcong 4 0,3633±0,0272c 0,2050±0,0228abc

Maqcong 6 0,2250±0,0236fg 0,0516±0,0125h

Maqcong 7 0,4433±0,0281a 0,1566±0,0205d

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada

coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

77

ANEXO VII – Resultados da integridade de membrana

Tabela 7: Comparação da integridade de membrana pós-descongelamento do sêmen eqüino, utilizando a metodologia ultra-rápida (Maq) com a convencional (Conv), sendo as células classificadas como: íntegra (CFDAVr); lesada (CFDAVm) e semi-lesada (CFDAVv). Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança. Descong CFDAVm CFDAVr CFDAVv

Maq 0,5931±0,0062 0,2919±0,0057 0,1150±0,0040a

Conv 0,6047±0,0061 0,2874±0,0057 0,1053±0,0038b

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade. Tabela 8: Comparação da integridade de membrana pós-descongelamento do sêmen eqüino tendo como parâmetro analisado os tratamentos de congelamento à 1cm, 4cm, 8cm e máquina de congelamento (Maqcong) sem levar em conta a metodologia de descongelamento, sendo as células classificadas como: íntegra N(CFDAVr); lesada (CFDAVm) e semi-lesada (CFDAVv). Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança.

Cong CFDAVm CFDAVr CFDAVv

1cm 0,7366±0,0078a 0,1583±0,0065d 0,1050±0,0054b

4cm 0,5016±0,0089c 0,4001±0,0087a 0,0980±0,0053bc

8cm 0,6515±0,0085b 0,2590±0,0078c 0,0895±0,0051c

Maqcong 0,5060±0,0089c 0,3411±0,0084b 0,1483±0,0063a

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

78

Tabela 9: Comparação da integridade de membrana pós-descongelamento do sêmen eqüino tendo como parâmetro analisado os tratamentos de congelamento à 1cm, 4cm, 8cm e máquina de congelamento (Maqcong), levando em conta as metodologias de descongelamento (convencional – Conv; máquina de descongelamento ultra-rápido – Maq), sendo as células classificadas como: íntegra (CFDAVr); lesada (CFDAVm) e semi-lesada (CFDAVv). Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança.

Trat Descong CFDAVm CFDAVr CFDAVv

1cm Maq 0,6970±0,0116b 0,1773±0,0096f 0,1256±0,0083b

1cm Conv 0,7763±0,0105a 0,1393±0,0087g 0,0843±0,0070de

4cm Maq 0,4763±0,0126e 0,4200±0,0124a 0,1033±0,0077c

4cm Conv 0,5270±0,0126d 0,3803±0,0122b 0,0926±0,0073cd

8cm Maq 0,6530±0,0120c 0,2456±0,0108e 0,1013±0,0076c

8cm Conv 0,6500±0,0120c 0,2723±0,0112d 0,0776±0,0067e

Maqcong Maq 0,5463±0,0125d 0,3246±0,0118c 0,1300±0,0085b

Maqcong Conv 0,4656±0,0126e 0,3576±0,0121b 0,1666±0,0094a

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

79

Tabela 10: Comparação da integridade de membrana pós-descongelamento do sêmen eqüino, pela metodologia convencional, tendo como parâmetro analisado os tratamentos de congelamento à 1cm, 4cm, 8cm e máquina de congelamento (Maqcong) e a variação entre garanhões, sendo as células classificadas como: íntegra (CFDAVr); lesada (CFDAVm) e semi-lesada (CFDAVv). Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança.

Cong Garanhão CFDAVm CFDAVr CFDAVv

1cm 1 0,7566±0,0242b 0,1633±0,0209ij 0,0800±0,0153efghi

1cm 3 0,7466±0,0246b 0,1566±0,0205j 0,0966±0,0167defgh

1cm 4 0,7833±0,0233ab 0,1400±0,0196jl 0,0766±0,0150fghi

1cm 6 0,7683±0,0238b 0,1266±0,0188jl 0,1050±0,0173defg

1cm 7 0,8266±0,0214a 0,1100±0,0177l 0,0633±0,0137ij

4cm 1 0,4550±0,0281ij 0,4533±0,0281a 0,0916±0,0163defghi

4cm 3 0,6416±0,0271cde 0,3150±0,0262de 0,0433±0,0115j

4cm 4 0,4850±0,0282ij 0,4033±0,0277abc 0,1116±0,0178de

4cm 6 0,4966±0,0283i 0,3516±0,0270cd 0,1516±0,0203c

4cm 7 0,5566±0,0281gh 0,3783±0,0274bc 0,0650±0,0139ij

8cm 1 0,6233±0,0274def 0,2733±0,0252efg 0,1033±0,0172defg

8cm 3 0,6466±0,0270cde 0,2883±0,0256ef 0,0650±0,0139ij

8cm 4 0,6166±0,0275ef 0,3150±0,0262de 0,0683±0,0142hij

8cm 6 0,6766±0,0264cd 0,2466±0,0244fgh 0,0766±0,0150fghi

8cm 7 0,6866±0,0262c 0,2383±0,0241gh 0,0750±0,0149ghi

Maqcong 1 0,4683±0,0282ij 0,4233±0,0279ab 0,1083±0,0175def

Maqcong 3 0,3333±0,0266h 0,4583±0,0282a 0,1250±0,0187cd

Maqcong 4 0,5066±0,0282hi 0,4333±0,0280ab 0,0933±0,0164defghi

Maqcong 6 0,4333±0,0280j 0,2666±0,0250ef 0,3000±0,0259a

Maqcong 7 0,5866±0,0278fg 0,2066±0,0229hi 0,2066±0,0229b

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

80

Tabela 11: Comparação da integridade de membrana pós-descongelamento do sêmen eqüino, pela metodologia ultra-rápida, tendo como parâmetro analisado os tratamentos de congelamento à 1cm, 4cm, 8cm e máquina de congelamento (Maqcong) e a variação entre garanhões, sendo as células classificadas como: íntegra (CFDAVr); lesada (CFDAVm) e semi-lesada (CFDAVv). Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança.

Cong Garanhão CFDAVm CFDAVr CFDAVv

1cm 1 0,6683±0,0266abc 0,2216±0,0235fg 0,1100±0,0177ab

1cm 3 0,6850±0,0262abc 0,1816±0,0218ghi 0,1333±0,0192a

1cm 4 0,7150±0,0255ab 0,1633±0,0209i 0,1216±0,0185ab

1cm 6 0,6983±0,0259abc 0,1700±0,0212hi 0,1316±0,0191a

1cm 7 0,7183±0,0254a 0,1500±0,0202i 0,1316±0,0191a

4cm 1 0,4133±0,0278l 0,4666±0,0282a 0,1200±0,0183ab

4cm 3 0,5383±0,0282gh 0,3516±0,0270cd 0,1100±0,0177ab

4cm 4 0,4700±0,0282j 0,4183±0,0279ab 0,1116±0,0178ab

4cm 6 0,4333±0,0280jl 0,4500±0,0281a 0,1166±0,0181ab

4cm 7 0,5266±0,0282hi 0,4133±0,0278ab 0,0583±0,0132d

8cm 1 0,6633±0,0267bcd 0,2150±0,0232g 0,1216±0,0182ab

8cm 3 0,6033±0,0276ef 0,2883±0,0256e 0,1083±0,0175ab

8cm 4 0,6650±0,0267bc 0,2633±0,0249ef 0,0716±0,0146cd

8cm 6 0,7233±0,0253a 0,1866±0,0220ghi 0,0900±0,0161bc

8cm 7 0,6100±0,0276def 0,2750±0,0252e 0,1150±0,0180ab

Maqcong 1 0,4616±0,0282jl 0,4200±0,0279ab 0,1183±0,0185ab

Maqcong 3 0,5450±0,0281gh 0,3116±0,0262de 0,1450±0,0199a

Maqcong 4 0,4800±0,0282ij 0,3816±0,0274bc 0,1383±0,0195a

Maqcong 6 0,6566±0,0268cde 0,2116±0,0231gh 0,1350±0,0193a

Maqcong 7 0,5883±0,0278fg 0,2983±0,0258e 0,1133±0,0179ab

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

81

ANEXO VII – Resultados da integridade de acrossoma

Tabela 12: Comparação da integridade de acrossoma pós-descongelamento do sêmen eqüino utilizando a metodologia ultra-rápida (Maq) com a convencional (Conv), sendo as células classificadas como: lesadas (PNAVm); reação acrossomal verdadeira (PNAVr); falsa reação de acrossoma (PNAVv); intactas (PNAnc). Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança.

Descong PNAVm PNAVr PNAVv PNAnc

Maq 0,4429±0,0062 0,0271±0,0020a 0,2440±0,0054b 0,2836±0,0057a

Conv 0,4504±0,0062 0,0224±0,0018b 0,2630±0,0055a 0,2620±0,0055b

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade. Tabela 13: Comparação da integridade de acrossoma pós-descongelamento do sêmen eqüino tendo como parâmetro analisado os tratamentos de congelamento à 1cm, 4cm, 8cm e máquina de congelamento (Maqcong) sem levar em conta a metodologia de descongelamento, sendo as células classificadas como: lesadas (PNAVm); reação acrossomal verdadeira (PNAVr); falsa reação de acrossoma (PNAVv); intactas (PNAnc). Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança.

Cong PNAVm PNAVr PNAVv PNAnc

1cm 0,5020±0,0089a 0,0008±0,0005d 0,3590±0,0085a 0,1381±0,0061d

4cm 0,3916±0,0087b 0,0281±0,0029b 0,2260±0,0074b 0,3456±0,0085b

8cm 0,5181±0,0089a 0,0088±0,0016c 0,2285±0,0075b 0,2445±0,0076c

Maqcong 0,3748±0,0086b 0,0613±0,0042a 0,2005±0,0071c 0,3631±0,0086a

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

82

Tabela 14: Comparação da integridade de acrossoma pós-descongelamento do sêmen eqüino tendo como parâmetro analisado os tratamentos de congelamento à 1cm, 4cm, 8cm e máquina de congelamento (Maqcong) levando em conta as metodologias de descongelamento (convencional – Conv; máquina de descongelamento ultra-rápido – Maq), sendo as células classificadas como: lesadas (PNAVm); reação acrossomal verdadeira (PNAVr); falsa reação de acrossoma (PNAVv); intactas (PNAnc). Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança.

Cong Descong PNAVm PNAVr PNAVv PNAnc

1cm Maq 0,5060±0,0126a 0,0003±0,0004e 0,3356±0,0119b 0,1580±0,0092f

1cm Conv 0,4980±0,0126a 0,0013±0,0009e 0,3823±0,0122a 0,1183±0,0081g

4cm Maq 0,3873±0,0123b 0,0163±0,0032c 0,2190±0,0104d 0,3686±0,0122ab

4cm Conv 0,3960±0,0123b 0,0400±0,0049b 0,2330±0,0106cd 0,3226±0,0118c

8cm Maq 0,5210±0,0126a 0,0083±0,0023d 0,2406±0,0108c 0,2300±0,0106e

8cm Conv 0,5153±0,0126a 0,0093±0,0024d 0,2163±0,0104d 0,2590±0,0110d

Maqcong Maq 0,3573±0,0121c 0,0836±0,0070a 0,1806±0,0097e 0,3780±0,0122a

Maqcong Conv 0,3923±0,0123b 0,0390±0,0048b 0,2203±0,0104cd 0,3483±0,0120b

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

83

Tabela 15: Comparação da integridade de acrossoma pós-descongelamento do sêmen eqüino, pela metodologia convencional, tendo como parâmetro analisado os tratamentos de congelamento à 1cm, 4cm, 8cm e máquina de congelamento (Maqcong) e a variação entre garanhões, sendo as células classificadas como: lesadas (PNAVm); reação acrossomal verdadeira (PNAVr); falsa reação de acrossoma (PNAVv); intactas (PNAnc). Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança.

Cong Garanhão PNAVm PNAVr PNAVv PNAnc

1cm 1 0,4183±0,0279ef 0,0033±0,0032fg 0,4150±0,0278bc 0,1633±0,0209jl

1cm 3 0,6600±0,0268a 0h 0,2050±0,0228ghi 0,1350±0,0193lm

1cm 4 0,4700±0,0282de 0,0033±0,0032fg 0,4466±0,0281b 0,0800±0,0153n

1cm 6 0,5666±0,0280bc 0h 0,3200±0,0264d 0,1133±0,0179m

1cm 7 0,3750±0,0274fg 0h 0,5250±0,0282a 0,1000±0,0169mn

4cm 1 0,3250±0,0265gh 0,0100±0,0056def 0,2633±0,0249ef 0,3950±0,0276bc

4cm 3 0,6233±0,0274a 0,0016±0,0023gh 0,1933±0,0223hi 0,1766±0,0215ij

4cm 4 0,4216±0,0279ef 0,0250±0,0088c 0,2066±0,0229ghi 0,3366±0,0267de

4cm 6 0,3800±0,0274f 0,0200±0,0079cd 0,3216±0,0264d 0,2683±0,0250gh

4cm 7 0,2300±0,0238i 0,1433±0,0198a 0,1800±0,0217i 0,4366±0,0280ab

8cm 1 0,4566±0,0281e 0,0150±0,0068cde 0,2000±0,0226hi 0,3283±0,0265def

8cm 3 0,6166±0,0275ab 0,0116±0,0060cdef 0,1116±0,0178j 0,2600±0,0248gh

8cm 4 0,4633±0,0282de 0h 0,2350±0,0240fgh 0,3016±0,0259efg

8cm 6 0,5133±0,0282cd 0,0183±0,0075cde 0,2483±0,0244efg 0,2200±0,0234hi

8cm 7 0,5266±0,0282c 0,0016±0,0023gh 0,2866±0,0255de 0,1850±0,0219ij

Maqcong 1 0,4183±0,0279ef 0,0116±0,0060cdef 0,1983±0,0225hi 0,3716±0,0273cd

Maqcong 3 0,3950±0,0276f 0,0066±0,0046efg 0,1283±0,0189j 0,4700±0,0282a

Maqcong 4 0,3000±0,0259h 0,0650±0,0139b 0,1900±0,0222hi 0,4450±0,0281ab

Maqcong 6 0,4250±0,0279ef 0,0950±0,0165b 0,2000±0,0226hi 0,2800±0,0254fg

Maqcong 7 0,4233±0,0279ef 0,0166±0,0072cde 0,3850±0,0275c 0,1750±0,0215jl

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.

84

Tabela 16: Comparação da integridade de acrossoma pós-descongelamento do sêmen eqüino, pela metodologia ultra-rápida, tendo como parâmetro analisado os tratamentos de congelamento à 1cm, 4cm, 8cm e máquina de congelamento (Maqcong) e a variação entre garanhões, sendo as células classificadas como: lesadas (PNAVm); reação acrossomal verdadeira (PNAVr); falsa reação de acrossoma (PNAVv); intactas (PNAnc). Os valores apresentados na tabela são estimativas de médias populacionais por intervalo de confiança.

Cong Garanhão PNAVm PNAVr PNAVv PNAnc

1cm 1 0,3933±0,0276fg 0g 0,4516±0,0281a 0,1550±0,0204ef

1cm 3 0,6583±0,0268a 0g 0,1883±0,0221hi 0,1533±0,0203ef

1cm 4 0,4833±0,0282cd 0,0016±0,0023fg 0,3583±0,0271bc 0,1566±0,0205ef

1cm 6 0,4983±0,0283cd 0g 0,3083±0,0261cd 0,1933±0,0223de

1cm 7 0,4966±0,0283cd 0g 0,3716±0,0273b 0,1316±0,0191f

4cm 1 0,2683±0,0250i 0,0100±0,0056de 0,2483±0,0244ef 0,4666±0,0282a

4cm 3 0,4783±0,0282cde 0,0066±0,0046ef 0,1650±0,0210hij 0,3416±0,0268b

4cm 4 0,4250±0,0279ef 0,0016±0,0023fg 0,1966±0,0224gh 0,3700±0,0273b

4cm 6 0,4050±0,0277fg 0g 0,2500±0,0245ef 0,3333±0,0266b

4cm 7 0,3600±0,0271gh 0,0633±0,0137bc 0,2350±0,0240fg 0,3316±0,0266b

8cm 1 0,4633±0,0282de 0,0200±0,0079d 0,2850±0,0255de 0,2316±0,0238cd

8cm 3 0,5650±0,0280b 0,0050±0,0039ef 0,1750±0,0215hij 0,2550±0,0246c

8cm 4 0,4933±0,0282cd 0g 0,2483±0,0244ef 0,2583±0,0247c

8cm 6 0,5200±0,0282bc 0,0050±0,0039ef 0,3133±0,0262cd 0,1616±0,0208ef

8cm 7 0,5633±0,0280b 0,0116±0,0060de 0,1816±0,0218hi 0,2433±0,0242c

Maqcong 1 0,2616±0,0248i 0,0916±0,0163ab 0,1483±0,0201ijl 0,4983±0,0283a

Maqcong 3 0,3516±0,0270gh 0,0550±0,0129c 0,1116±0,0178l 0,4816±0,0282a

Maqcong 4 0,3116±0,0262h 0,1050±0,0173a 0,1383±0,0195jl 0,4450±0,0281a

Maqcong 6 0,3966±0,0276fg 0,1250±0,0187a 0,2416±0,0242efg 0,2366±0,0240cd

Maqcong 7 0,4650±0,0282cde 0,0416±0,0113c 0,2633±0,0249def 0,2283±0,0237cd

Obs: Os intervalos de confiança seguidos de pelo menos uma mesma letra, em cada coluna, são estatisticamente superpostos, com 95% de probabilidade.