Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade

de Coimbra

Engenharia Biomédica

Trabalho elaborado por:

Andrêa Gouvêa

Ivânia Pereira

Lara Bolito

Magali Barbosa

Controlo da Replicação de

Plasmídeos

2

Objectivos:

Pretende-se com este trabalho relevar a importância da bioinformática numa área

em expansão crescente, a genética e biotecnologia, executando modelos matemáticos/

informáticos e aplicando-os à área em estudo.

Introdução:

Talvez a propriedade fundamental de todos os organismos vivos seja a sua

capacidade de reprodução. Todos eles têm uma informação genética inerente,

transmitida pelos progenitores e garantida pela replicação, especificando a sua estrutura

e função.

Genética Mendeliana:

Os princípios clássicos da genética foram desenvolvidos por Gregor Mendel, em

1865, com base em resultados experimentais com ervilhas (verdes e amarelas). A

manifestação de características distintas e que variam entre seres (inclusive na mesma

espécie) revela a presença de genes. Ou seja, estes são sequências específicas de pares

de bases no DNA, e o seu conjunto constitui o código genético. Os genes, que em

mamíferos se estima serem entre 50.000 a 100.000, estão fisicamente ligados em

estruturas designadas por cromossomas, existentes no núcleo da célula. A localização

particular num cromossoma em que um determinado gene se encontra chama-se locus

genético. Os cromossomas são, assim, conjuntos de loci genéticos onde se encontram

codificados todos os genes que definem uma espécie.

O mapa genético de um organismo define o seu genótipo e a sua eventual

expressão é o fenótipo. Cada organismo pode ser alterado fisicamente conforme o meio

ambiente; contudo o seu mapeamento genético não é afectado.

Por exemplo, cruzando duas vagens de ervilhas, uma tendo ervilhas amarelas

(Y) e outra verdes (y), levam ao seguinte resultado:

3

Cada cadeia progenitora tem duas cadeias idênticas do gene amarelo (Y) ou

verde (y). As plantas sucessoras são, contudo, híbridos, pois contêm um gene amarelo e

um gene verde. Por observações efectuadas, o gene dominante será, então o amarelo,

uma vez que a primeira geração de sucessores é amarela; o gene verde é recessivo. O

genótipo (composição genética) desta geração é Yy e o seu fenótipo (aparência física) é

amarelo.

Fig 1: Experiência de Mendel - cruzamento de duas vagens de ervilha.

Fig 2: Experiência de Mendel -

cruzamento de duas vagens de

ervilha.

4

Na geração seguinte poderá manifestar-se fisicamente o gene recessivo; porém,

só há 25% de probabilidades deste caso ocorrer.

Células Haplóides e Diplóides:

Um organismo haplóide contém células que apresentam metade do número de

cromossomas do cariótipo característico da sua espécie. Estas são produzidas a partir da

meiose, que tem por finalidade a produção de gâmetas, possuindo N cromossomas.

Por sua vez, os organismos diplóides contêm informação em duplicado. Para

cada característica existem pelo menos 2 genes, estando cada um em cromossomas

homólogos. Diz-se que a quantidade de DNA é 2N, em que N é o número de

cromossomas característicos da espécie em causa.

O estudo de células haplóides é, por isso, mais fácil, daí que seja privilegiado o

seu uso.

Estrutura do DNA

O DNA (ácido desoxirribonucleico) é uma macromolécula constituída por vários

polímeros, sendo a unidade básica o nucleótido, composto por um açúcar

(desoxirribose), um grupo fosfato e uma base azotada – purina (adenina ou guanina) ou

pirimidina – (timina e citosina), que se complementam, uma vez que as purinas se ligam

às pirimidinas.

Fig. 3:constituição celular

5

A desoxirribose vai ligar-se ao grupo fosfato da base azotada, pelos carbonos 5’

e 1’, respectivamente.

A molécula de DNA é formada por duas cadeias polinucleotídicas, enroladas

uma na outra no sentido dos ponteiros do relógio, em forma de dupla hélice. As bases

são orientadas para o interior e ligam –se entre as cadeias por pontes de hidrogénio.

As cadeias são antiparalelas, correndo de 5’ para 3’, em sentidos opostos.

Plasmídeo:

Em termos genéticos e bioquímicos, a E.coli é, provavelmente, o organismo

mais bem estudado de todos os que se conhecem. Para além disso, tem características de

manipulação fácil: cresce rápida e economicamente, daí ser usada como o principal

organismo hospedeiro para produzir grandes quantidades de proteínas, a partir de genes

com origens diversas. O vector de expressão da bactéria é usualmente um plasmídeo.

Um plasmídeo é uma molécula circular dupla de DNA capaz de se replicar

independentemente dos cromossomas, cujo tamanho pode variar entre dezenas a

milhares de kilobases. Eles são introduzidos na bactéria por um processo conhecido

como transformação (em células eucarióticas é conhecido por transfecção).

Fig.4 :Estrutura química de uma cadeia simples de DNA.

Fig. 5 :Esquema representativo da cadeia de DNA.

6

Para estudar plasmídeos em laboratório, a cultura de células deriva de um

simples plasmídeo que facilmente se replica. Todas as células da cultura irão conter o

plasmídeo em questão. Estes contêm uma diversidade de genes para sua própria

manutenção, mas que não estão presentes na bactéria.

A presença de alguns plasmídeos nas células bacterianas torna-se evidente no

fenótipo destas; por exemplo, uma bactéria que contenha um plasmídeo tet-r torna-se

resistente à tetraciclina.

• Replicação dos plasmídeos:

Os plasmídeos ligam-se a enzimas da célula hospedeira na replicação de DNA

para a sua reprodução. Mas a iniciação da replicação é controlada pelos genes dos

plasmídeos. Em consequência, o número de cópias do plasmídeo numa célula varia

conforme o seu tipo, dependendo da regulação na iniciação da replicação.

Os plasmídeos contêm uma série de genes para o estabelecimento de ligações

entre células e para transferir DNA do dador para o receptor. Uma cópia do plasmídeo

pode ser transferida na ligação da célula. A transferência é sempre acompanhada por

uma replicação do plasmídeo.

Todos os plasmídeos contém pelo menos uma sequência de DNA que serve

como uma origem de replicação ou ori (um ponto inicial para a replicação de DNA), e

que permite ao DNA do plasmídeo replicar-se independentemente do DNA

cromossómico, com locais específicos, onde as enzimas de restrição clivam a cadeia.

Algumas moléculas circulares de DNA replicam por um processo que não inclui

os intermediários característicos da replicação eucariótica.

Fig. 6: E.coli

7

Esta replicação chama-se “rolling-circle replication”. Neste processo a

replicação inicia-se com um corte numa ligação específica base-fosfato numa dupla

cadeia circular. Este corte produz duas extremidades quimicamente distintas 3’ e 5’. O

DNA é sintetizado pela adição de dexoxinucleótidos na extremidade 3’, com a mudança

simultânea da extremidade 5’.

À medida que a replicação prossegue, a extremidade 5’ roda para fora como uma

tubo que vai aumentando de comprimento.

Em muitos casos, à medida que este processo se efectua, uma cadeia

complementar é sintetizada, o que resulta num tubo idêntico, duplo de DNA.

Este fenómeno é comum em estádios tardios de replicação da dupla cadeia de

DNA.

O plasmídeo pode ser retirado e manipulado de uma célula e reinserido

permanentemente numa bactéria, sem que haja prejuízo ou dano. Depois da

transferência, ambas as células contêm um plasmídeo que pode servir novamente como

dador. Este processo efectua-se em poucos minutos.

É esta característica que torna os plasmídeos uma das ferramentas mais

importantes da engenharia genética genética.

• Tipos de Plasmídeos:

Existem dois grupos básicos de plasmídeos: os conjuntivos e os não-

conjuntivos. Os plasmídeos conjuntivos contém um gene chamado tra-gene, que pode

iniciar a conjugação, isto é, a troca sexual de plasmídeos com outra bactéria (Fig. 4). Os

plasmídeos não-conjuntivos são incapazes de iniciar a conjugação e, por esse motivo, o

seu movimento para outra bactéria, mas podem ser transferidos com plasmídeos

conjuntivos durante a conjugação.

Fig. 7: Rolling- circle

replication

8

Fig. 8: Conjugação e transferência

Numa única célula podem coexistir vários tipos diferentes de plasmídeos. A E.

coli, por exemplo, tem até sete. Dois plasmídeos podem ser incompatíveis, e a sua

interacção resulta na destruição de um deles. Os plasmídeos podem, portanto, ser

colocados em grupos de incompatibilidade, que dependem da sua capacidade de

coexistir numa única célula.

Uma forma óbvia de classificar os plasmídeos é pela função que desempenham.

Existem cinco classes principais:

• Plasmídeos de Fertilidade (F), que contém apenas transgenes. A sua única

função é a iniciação da conjugação bacteriana.

• Plasmídeos de Resistência (R), que contém genes que os tornam resistentes a

antibióticos ou venenos.

• Col-plasmídeos, que contém plasmídeos que determinam a produção de

colicinas, proteínas que podem matar outras bactérias.

• Plasmídeos degradativos, que permitem a digestão de substâncias pouco

habituais, como o toluole ou o ácido salicílico.

• Plasmídeos de virulência, que transformam a bactéria num agente patogénico.

Os plasmídeos que existem em cópia única em cada bactéria correm o risco de,

depois da divisão celular, desaparecer numa das bactérias filhas. Para se assegurarem de

que a célula tem "interesse" em manter uma cópia do plasmídeo em cada uma das

células filhas, alguns plasmídeos incluem um sistema viciante: produzem tanto um

9

veneno de longa vida como um seu antídoto de vida curta. A célula que mantiver uma

cópia do plasmídeo irá sobreviver, ao passo que a célula que não o possuir morrerá em

breve por falta do antídoto.

• Aplicações dos Plasmídeos:

Os plasmídeos são ferramentas importantes nos laboratórios de genética e

bioquímica, onde são usados rotineiramente para multiplicar (fazer muitas cópias de) ou

expressar genes específicos. Há muitos plasmídeos com esse fim disponíveis no

mercado. Inicialmente, o gene a ser replicado é inserido num plasmídeo. Este deverá

conter, além do gene inserido, um ou mais genes capazes de conferir resistência

antibiótica à bactéria que servir de hospedeiro. Os plasmídeos são então inseridos em

bactérias pela transformação, e estes são depois incubadas em meio rico em

antibiótico(s) específico(s). Então, as bactérias que contiverem uma ou mais cópias do

plasmídeo expressam (fazem proteínas a partir de) o gene que confere resistência aos

antibióticos. Tipicamente, a célula produz uma proteína que irá ser destruída pelos

antibióticos que, de outra forma, matariam a célula. Os antibióticos matam as células

que não receberam plasmídeo, porque não possuem os genes de resistência aos

antibióticos. O resultado é que só as bactérias com a resistência aos antibióticos

sobrevivem, e estas são as mesmas que contém o gene a ser replicado. Desta forma, os

antibióticos actuam como filtros que seleccionam apenas as bactérias modificadas. E

agora estas bactérias podem ser cultivadas em grandes quantidades, recolhidas e

destruídas para isolar o plasmídeo interessante.

O DNA pode ser também de extrema importância para a purificação de DNA.

Por exemplo, o DNA é extraído de uma cadeia patogénica de Pneumococcus (DNA

circular), que está rodeada por uma cápsula de aparência lisa, formando colónias. A

adição de DNA purificado S a uma cultura normal, sem cápsula R resulta na formação

de colónias S. Então, o DNA purificado contém informação genética responsável pela

transformação de bactérias R em S.

10

Outro uso importante dos plasmídeos é a produção de grandes quantidades de

proteínas. Neste caso, cultiva-se as bactérias que contém um plasmídeo que inclui o

gene que codifica a proteína que se pretende produzir. Da mesma forma que uma

bactéria produz proteínas que lhe conferem resistência aos antibióticos, também pode

ser induzida a produzir grandes quantidades de proteínas a partir do gene que nelas foi

introduzido. Esta é uma maneira barata e simples de produzir um gene ou a proteína que

ele codifica - por exemplo, a insulina - ou até mesmo antibióticos.

Pela sua maneabilidade, os plasmídeos são os vectores de excelência para a

clonagem de genes ou fragmentos de DNA específicos, apesar de também serem usados

na construção de bibliotecas de genes. Os plasmídeos usados em clonagem são

derivados de plasmídeos que ocorrem naturalmente e foram modificados, por

engenharia genética, de maneira a incorporarem um certo número de características

desejadas.

Fig. 10: vários processos

de plasmídeos

Fig. 9:Purificação de DNA.

11

Clonagem:

Hoje em dia, a clonagem tem interesses múltiplos no âmbito da engenharia

genética, tais como:

Isolamento de um gene particular, parte de um gene, ou região de um genoma;

Produção de um RNA particular e proteínas moleculares em grandes

quantidades;

Grande eficiência na produção de bioquímicos como enzimas e drogas;

Criação de organismos com características particulares desejáveis, como por

exemplo, plantas e animais mais resistentes ao meio ambiente.

Diagnósticos de doenças genéticas

Correcção de defeitos genéticos

A clonagem de um gene pode ser descrita da seguinte forma: o gene é ligado a

um vector, formando uma molécula de DNA recombinante. Em seguida, esta molécula

é introduzida numa célula hospedeira, onde permanece desligado do genoma da célula

hospedeira. O vector tem capacidade de se replicar por si só, em paralelo com a própria

replicação do DNA do hospedeiro. O vector divide-se simultaneamente com a célula

hospedeira, e é transmitido às células hospedeiras. Diz-se assim que se obteve um clone

de células iguais, que permite amplificar o gene para melhor isolamento.

Nos processos de clonagem de genes ou de fragmentos de DNA, são utilizadas

diversas enzimas celulares, como as enzimas de restrição. Estas podem ser obtidas a

partir de microorganismos e fazem parte fulcral do sistema de defesa à invasão de DNA

estranho. Têm por função cortar esse DNA de uma forma específica, inactivando-o e

não digerindo o DNA endógeno que se encontra modificado em certas sequências.

Nesse corte, obtêm-se 3 tipos de extremidades de DNA, e as enzimas específicas fazem

a identificação de cada extremidade.

As extremidades obtidas por corte podem voltar a unir-se, por emparelhamento

de cadeias simples complementares. A sua ligação por uma enzima ligase reconstitui a

molécula original de DNA. É este processo que constitui a base de formação de

moléculas de DNA recombinantes apara clonagem, uma vez que permite juntar DNA

provenientes de células diferentes, que foram cortados com a mesma enzima ou com

extremidades compatíveis.

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Fig. 11: colónia de bactérias in vitro

O isolamento de um plasmídeo recombinante é um exemplo típico de uma

experiência de clonagem em bactérias.

O plasmídeo contém uma origem de replicação oriB, uma marca de selecção que

codifica resistência a ampicilina – ampR – e um local de clonagem para a enzima EcoRI

(a enzima só corta uma vez no plasmídeo e o corte não influencia nenhum gene vital do

plasmídeo). Esta enzima vai linearizar o plasmídeo isolado.

Seguidamente, há um tratamento do plasmídeo, com fosfatase, por exemplo, que

vai remover os grupos fosfato 5’, para impedir uma reconstituição antecipada da cadeia

circular. Simultaneamente, o DNA a clonar também é clivado com EcoRI. O plasmídeo

e o DNA são, então, misturados na sua forma linear, e na presença da enzima ligase, que

promove as ligações fosfodiestéricas entre os grupos fosfato 5’ e hidroxilo 3’. Esta

recombinação permite uma transformação de bactérias, que reparam as quebras no DNA

recombinante.

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Deduções matemáticas:

Reacções químicas de expansão de volume:

Considerando uma reacção química envolvendo três espécies químicas

diferentes A, B e C:

→→+ µCBA k '' ,

sendo:

k’’- constante de proporcionalidade da reacção de formação de C,

µ - constante de proporcionalidade da reacção de degradação de C;

Tendo em conta que a expansão do volume é dada por

VV α=& , sendo α a taxa de crescimento da população em estudo.

Designando x , y e z como as respectivas massas de A, B e C, tem-se

zxykz µ−= ''& ,

isto é, a variação da massa de C com o tempo depende de k’’ e µ, multiplicados pelas

massas de A e B.

Uma vez que as concentrações são dadas por VzC

VyB

VxA === ,, obtém-se

CVBVAVkVCVC µ−=+ .''&& .

Definindo Vkk ='' , vem CkABCC µα −=+& .

Aumentando o volume, diminui a constante k’’, modificando-se assim as

constantes das reacções, obtendo-se

→→+ +αµCBA k .

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Aproximação de Michaelis – Menton

A degradação de um composto C implica a acção de uma enzima cE , formando-

se um complexo intermédio C, que se decompõe na enzima cE original e num novo

produto X.

XEEC cc +→⇔+ C

Matematicamente:

C.

C,C

C,CC

21

321

321

kCEkC

kkCEkE

kkCEk

c

cc

c

+−=

++−=

−−=

&

&

&

Como a soma das duas primeiras equações referidas anteriormente é nula e a

massa da enzima é conservada durante a reacção, vem que

)0(cc EE =+ C (tendo em conta que a concentração inicial de C é nula).

Das equações acima vem

CKCV

Cc

C

+−=& , definindo

1

32

3

)()0(

kkk

k

EkV

C

CC

+=

=

A este processo dá-se o nome de aproximação de Michaelis – Menton.

Controlo das reacções de replicação:

A replicação dos plasmídeos é controlada por reacções que envolvem produtos

intermédios e controlo por feedback (que pode aumentar ou diminuir as concentrações

iniciais de acordo com as concentrações finais/intermédias)

Reacções de replicação:

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1) os plasmídeos são copiados a uma velocidade 1γ , para um segmento de RNA

M’: ,'1 MPP +→γ

2) M’ passa a forma estável a uma velocidade 2γ :

MM → 2' γ

3)M serve de padrão à síntese da proteína Q, à velocidade δ :

QMM +→δ

4)Esta proteína regula a produção do plasmídeo P, por feedback, à velocidade a:

PPQ a 2→+

Reacções de inibição:

1)Um segmento de P é copiado para uma molécula de controlo C, à

velocidade β :

CPP +→β

2)A molécula C pode interagir com M’ de modo a inactivá-lo à velocidade b:

XMC b→+ '

onde X é um composto genérico inactivo e que apresenta irrelevância para este

estudo.

Reacções de degradação:

1) Seguindo a reacção de Michaelis-Menton aplicada à reacção de plasmídeos

obtém-se:

XEEC CK

cC +→→←+ CC σ

2) De modo semelhante para M, há uma enzima ME que degrada M:

XEEM MK

MMF +→→←+ σM

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Combinando todas as equações e reacções anteriormente expostas, obtém-se

assim as seguintes equações diferenciais para o estudo do problema em questão:

PaQP )( α−=&

CCK

VbMPC

C

C )'(+

++−= αβ&

')(' 21 MbCPM αγγ ++−=&

QaPMQ )( ασ +−=&

MMK

VMM

M

M

+

+−= αγ 2'&

Implementou-se estas deduções num circuito diferencial de simulink, obtendo-

se o seguinte formato em anexo.

Deduziram-se de dados científicos obtidos em investigações paralelas os

seguintes valores:

Para as reacções de replicação, consideram-se as constantes γ1, γ2, δ e a a variar

num intervalo entre 0 e 1, uma vez que são representativas de taxas de variação, assim

como α. Para as reacções de inibição, as respectivas constantes β e b são negativas, com

intervalo de variação entre -1 e 0.

Na continuação da pesquisa efectuada nas áreas específicas de investigação, e

analisando as concentrações padrão usadas in vitro, conclui-se que o estudo da

replicação só faz sentido para as condições de equilíbrio, e os valores a atribuir são:

mLgMmLgQ

mLgMmLgCmLgP

/001.0/02.0

/001.0'/4/3

µµµ

µµ

=====

17

Gráficos obtidos:

De forma semelhante, podem obter-se os gráficos para cada variável de estado,

efectuando o comando plot (tout, simout1) ( por exemplo, para a variável Q) na janela

do workspace do Matlab:

Graf. 2: variação da concentração de P

Gráf.1: situação de equilíbrio

18

Pela fácil análise do gráfico, observamos que a concentração de plasmídeos

mantém-se constante no decorrer da reacção, isto porque não interessa um aumento da

sua concentração, mas sim uma replicação, ou seja, um número final igual ao inicial.

Há um decaimento exponencial da curva representativa de C ao longo da

reacção. Por exemplo, partindo de um valor de equilíbrio de 10, atinge um valor nulo no

final; isto é, não estará presente na cultura no fim da replicação.

Graf. 3: variação da concentração de C

Graf. 4: variação da concentração de M’

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A sua concentração cresce de forma exponencial e atinge rapidamente o equilíbrio.

Porém, pelos dados experimentais obtidos, a sua concentração não chega a ser muito

elevada.

Este gráfico é de variação semelhante ao de C, há uma rápida adaptação ao meio e o seu

decréscimo é rápido, atingindo valores vestigiais (que se podem considerar quase

insignificantes) no fim da reacção.

Graf. 5: variação da concentração de Q

Graf. 6: variação da concentração de Q

20

O gráfico é semelhante ao de M’, o que é lógico, dada a sua complementaridade

a nível de reacção enzimática.

~

Ao analisarmos uma situação de caos, verifica-se que todas as concentrações

atingem um valor nulo. A nível biológico, isto significa que, pura e simplesmente,

deixamos de ter plasmídeos, ou seja, há uma extinção do nosso objecto de estudo.

É assim fácil de deduzir que a situação de desequilíbrio conduz a um caos nas

condições de cultura, com extinção desta.

Daí que esta hipótese não seja alvo de análise, uma vez que não concretiza os

nossos objectivos de trabalho.

Conclusão:

Tal como já foi referido, o caos não nos leva a conclusões válidas de estudo.

Graf. 7: situação de caos

21

Então, ao analisar uma situação de equilíbrio, verificamos experimentalmente

que:

- um factor de crescimento α é muito pequeno, relativamente aos factores das

outras equações;

- Q tem valores muito pequenos;

- para que haja equilíbrio, as variáveis necessitam de ser constantes, daí que as

suas derivadas sejam nulas nestas condições;

- P é constante.

Os gráficos obtidos pela construção do circuito diferencial em simulink levam à

refutação destas premissas.

Analisando as equações diferenciais que foram implementadas em simulink:

PaQP )( α−=&

CCK

VbMPC

C

C )'(+

++−= αβ&

')(' 21 MbCPM αγγ ++−=&

QaPMQ )( ασ +−=&

MMK

VMM

M

M

+

+−= αγ 2'&

Aplicando as conclusões experimentais, anulando as derivadas, e tendo em conta

que Q e α:

δδ aQPMMaQP =⇔=

Substituindo na primeira equação:

δαPM =

Podemos então deduzir que M é muito pequeno, uma vez que é dependente de α.

Retiramos também que:

M

M

KMV

M2

'γ

= , logo M’ também é muito pequeno, com expressão simplificada:

,'' PM αγ= com δγ

γM

M

KV

2

'=

22

Além disso:

''

'' M' 2121 γ

γαγγγγα

abCMbCMP

−=⇔−−= .

Pela segunda equação, chegamos à determinação de P:

')( 1

1 γγ

γβb

VP C +=− .

Assim, a análise de todos os mecanismos envolvidos na replicação de

plasmídeos leva-nos a concluir que há mecanismos de controlo de replicação que

influenciam o crescimento, de modo a anular variação de P com o tempo ( )P& , fazendo

αα =P . Por exemplo, quanto mais lento for o crescimento, maior o inibidor C e menor

será M e M’( uma vez que estes estão estreitamente dependentes um do outro).

Bibliografia:

VIDEIRA, Arnaldo (2001) – “Engenharia Genética - Princípios e aplicações”;

Lidel, lda, ISBN: 972-757-163-8

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HARTL, Danill L. and others (1999) – “Essential Genetics”, 2nd edition; Jones

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COOPER, Geoffrey M. (2000) – “The Cell, a Mollecular approach”; 2nd

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GRIFFITHS, Anthony J. F. and others (2005) – “Introduction to Genetic

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INTERNET (http://pt.wikipedia.org/wiki/Biologia ;www.b-on.pt)