CONTRIBUIÇÃO AO CONHECIMENTO DAS ALTERAÇÕES DO EIXO

HIPOTÁLAMO-HIPÔFISETIREÔIDEO NA HIPOPROTEINEMIA

EXPERIMENTAL EM RATOS WISTAR ALBINOS

(RATTUS NORVEGICUS ALBINUS)

Vânia Cairá Borghi

DISSERTAÇÃO E TESE-IEA 086IEA-DT 086

OUTUBRO/1978

CONSELHO DELIBERATIVO

MEMBROS

Klaus Reinach — PresidenteRoberto DUtra VaiHelcio Modesto da Costafvano Humbert MarchdsiAdmar Cervellini

PARTICIPANTES

Regina Elisabete Azevedo BerettaFlávio Gori

SUPERINTENDENTE

Rômulo Ribeiro Pieroni

DISSERTAÇÃO E TESE - IEA 086 OUTUBRO/1978IEA-DT-086

CONTRIBUIÇÃO AO CONHECIMENTO DAS ALTERAÇÕES DO EIXO

HIPOTALAMOHIFÔFISE TIREOlDEO NA HIPOPROTEINEMIA

EXPERIMENTAL EM RATOS WISTAR ALBINOS

(RATTUS NORVEGICUS ALBINUS)

Vlnia Cairá Borghi

ftm para obtançfo do Título da "Doutor am Ciências -

Area d« FWologit" - Ortontador Prof. Dr. Ary

Domingo* do Amaral. Aprawntada a dafartdWa am 31

da março da 1978, ao Inttttuto da BkocMnclai da

UniMnidada da Sfo Paub.

INSTITUTO DE ENERGIA ATÔMICA

SAO PAULO BRASIL

Sfrie DISSERTAÇÃO E TESE IEA

Not* A r*d*c*o. ortogrifi* * concntoi 1*0 d* rniionitblliriad* (ioi tutor*!.

SUMARIO

Página

INTRODUÇÃO 1

MATERIAL E MÉTODOS 4

1 — Animais , 4

2 - Dietas 6

3 - Prova de OepteçSo do TSH Hipof isério 6

4 — Técnicas de Dosagem 7

4.1 - Proteínas Totais a Frações Proteicas 7

4.2 - Hormônio Tireotrófico 7

4.2.1 - Hormônio PadrSo a para Radioiooaçeb a Prlmairo Anticorpo 7

4.2.2 - Obtençáo do Segundo Anticorpo 8

4.2.2.1 - Prepartçfc da IgG da Coalho 8

4.2.2.2 - Preparação da Soro da Carneiro Antl-lgG da Coalho 9

4.2.3 - Técnica da lodaçab »

4.2.4 - Purificação do Hormônio Marcado 10

4.2.5 - Provas do Rendimento da Marcacfo a da Pureza do Hormônio Marcado 10

4.2.6 - Protocolo do Ensaio 12

4.2.7 - Cálculos 12

6 - Tratamento Estatístico 15

5.1 - Peso dos Ratot 16

5.2 - Concantraçf da Proteínas Totais a FraoSes Proteicas Se>lces 17

6.3 - Concentração da Hormônio Tireotrófico no Soro 17

RESULTADOS 17

1 - Paso dos Ratos 17

1.1 - Paso Inicial 17

1.2 - Evolução do Paio 10

1.3 - Peso Final 23

2 - Concentraçlo de Proteínas Totais a Frações Proteicas SIVICM 23

3 - Concentraçlo do Hormônio Tireotrófico (TSH) no Soro 27

DISCUSSÃO 31

1 - Modelo Experimental 31

2 - Aclimauçlo e Manuseio dos Animais 31

Pagina

3 - Método da Deptoçio do TSH Hipof M r » 32

3.1 - Anestesia dos Animais 32

3.2 - Administração do TRH 33

4 - Peso do» Animais 33

6 - Concentração de Proteínas Totais a FrapSei Protelou Serices 34

6 - Concentração da Hormônio Tireotróf k» (TSH) no Soro 36

6.1 - Método da Dosagtm do TSH 36

6.2 - Depleçfo do TSH Hipof isário : 37

6.3 - Nívei» da TSH na Desnutriçlo 38

CONCLUSÕES , 40

APÊNDICE 41

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 63

CONTRIBUIÇÃO AO CONHECIMENTO DAS ALTERAÇÕES DO EIXO

HIPOTALAMO HIPOFISE TIREOlDEO NA HIPOPROTEINEMIA

EXPERIMENTAL EM RATOS WISTAR ALBINOS

(RATTUS NORVEGICUS ALBINUS)

Vânia Caira Borghi

RESUMO

Este trabalho foi realizado com a finalidade d* verificar a influência da dista carente am proteína* totor* otnlvti» de hormônio tireotrôfico no soro de ratos, em condições batais * em r*<posta è administração d* seu hormônioIberador ITRH).

Eitudaram-se dois grupos de animais, compreendendo 24 rato» em cada grupa, submetidos, respecth>emente, i tdietas normoproteica. contendo 15% de caseíne (grupo controle) * hipoproteica, contendo 3% d* canina (grupocarente crônico proteico).

A experiência foi realizada em ambiente provido de aparelho condlcionador da ar, para control* datemperatura c exposto a iluminação natural. O período experimental exiendeute por 30dias, no qual os animal»receberem dieta e água "ad libitum".

Analisaram-se os pesos iniciais, finais e • evolução do peso dos ratos dos dois gruont

Determinaram-se, no final do período experimental, as concentrações séricas d* proteínas totais, albumin»,globulinai • hormônio tireotròtrco (TSH). A concentracio hormonal foi estimada ames • apôs a adminiitraçlointra-carotfdaa d* 10 microgremas de TRH sintético a cada animal, em horário prmttebetectdo, por radiolmunoensak)empregando-» a técnica do duplo anticorpo.

Ot dados obtidos foram submetidos ao tratamento estatístico, aplicando-se análises apropriadas.

Os animais dos dois grupos estudados, cujos petis médios iniciais eram semelhantes, apresentaram no decorrerdo período axperimental diferentes evoluções d* peso. Os animais controle aumantaram de peso t os cartntM tiveramtaus patos diminuídos (O<0.001).

As concentracfiet téricas da proteínas totais * frações protelcat analisada» foram ilgnlficentr-ment» menores nogrupo car«nte, qtMndo comparadas ás concentrações correspondentes do grypa contrai* (Cr<0,001).

0 nível betai d* TSH tárk» nfc diferiu stgnifkamemente entre ot dois grupos estudados. Após a administraçãoda TRH. o grupo controla aumentou cerca d* 10 v«et teu nível médio basal d* TSH tarlco (O<0,001l, ao mesmotempo em que o grupo carente apresentou um acréscimo da 17 veies (a<0,001); etndo este Incremento maisacentuado nos animal» carentes (Q<0,001).

Nestas condicoe» experimentais, este trabalho vem a confirmar uma Itoerecéo exagerada da hormôniotkaotroflco «m raspocta ao tttímulo da teu hormônio Uoerador, nos animais «."bmetWos 4 carência protelei, emboranfc demonstra theracan nos nível» basalt.

Eites resultados foram ditcutldoi com baia nos relato» da literatura, refervntes i t arterapfle» endocrlnasobjarvadas na oatnutrlcfo clínica e experimental Ponfvelmante, a dlmlnuiçlo d* frenaçto hlpofraírle na «ecreçao daTSH, obttrvadt no grupo carente em resposta ao TRH, ta)t causada pele deficiente eonvarelo txtratlraoMaa da tlroxrna,qu* acarretaria diminuída formaefo hapética de triiodofironlna.

Aprovada para publicaçfo em Jan*in>/1978.

INTRODUÇÃO

A incidência contínua e a persistente taxa de mortalidade encontrada na desnutrição

humana ' são dois aspectos irônicos desta condição, que, embora inteiramente evitáveis, persistem

como características dominantes da nutrição mundial. Apesar da pesquisa e do desenvolvimento

dirigirem-se no sentido de prevenção e cura da má nutrição, o elevado índice de ocorrências, bem como

fatores sociais, culturais, econômicos e tecnológicos contribuem para sua difícil erradicação. Muitas

indagações relativas a eventos metabólicos que a precedem e acompanham permanecem ainda sem

resposta.

As alterações ciínicas e patológicas encontradas em animais desnutridos são substancialmente atmesmas que compõe os quadros de marasmo e "kwashiorkor", dois dos principais tipos de deficiêncianutricional reconhecidos na espécie humana. Justifica-se, assim, a extensão dos estudos para oestabelecimento de modelos acurados em animais experimentais. 0 número substancial de dados obtidosem animais depletados em proteínas fundamenta a aceitação de c3es. ratos, porcos e macacos comoréplicas mais características da condição h u m a n a l12 .36 .42 . 5 0.77. i2ü.145.169.1 72.177.178) A c r e d j t a . $ ,

que a desnutrição, quando instaurada na infância, provavelmente inibe o crescimento do cérebro e o

subseqüente desenvolvimento intelectual . Quanto mais cedo a criança for vitimada pela subali-

mentação, maior será a probabilidade de desenvolver atrasos persistentes no crescimento e na função

cerebral '. Crianças gravemente desnutridas apresentam deficits na capacidade mental e no desenvol-

vimento psicológico que persistem após a reabilitação n-jtricional.

Demonstrou-se que quando ratos são desnutridos durante o período neonatal e depois a.imen-

tados adequadamente, ocorrem efeitos, alguns irreversíveis, no tamanho corpóreo, no ADN cerebral no

número e tamanho das células gordurosas e nas taxas cardíaca e r e s p i r a t ó r i a 1 7 ' 6 8 ' 7 4 ' 7 9 ' 1 7 1 ' 1 7 3 > 1 7 5 ' .

Outros efeitos relacionados com o desenvolvimento neuromotor e com o acúmulo de catecnlaminas no

cérebro ocorrem em ratos gerados e amamentados por mães subnutridas1 1 4 4 '1 4 6 1 . 0 mecanismo pelo

qual a desnutrição produz estes efeitos durante a fase crítica do desenvolvimento neonatal ou mesmo

desde a fase pré-nalal, é pouco conhecido.

Estudos clínicos e experimentais revelam que o jejum, as restrições proteica s calórica e ai

deficiências vitamínicas e minerais alteram a função das glândulas endócrinas. Alterações histológicas são

descritss no pancreas endocrine e na glândula tireóide de caês e ratos procriados e alimentados por mães

malnutridas1661. Em ratos, a restrição dietética materna durante a gestação e lactação produz uma

progêníe de crescimento retardado, com glândulas hipofisárias de menor tamanho e concentrações

reduzidas de hormônio de crescimento hipofisário e sérico 9 > 1 5 4 ' . Concentrações diminuídas da

tiroxina (T 4 ) e tireotiofina (TSH) circulantes, bem como de hormônio liberador da tireotrofina (TRH)

hipotalâmico foram observadas em ratos recém-nascidos, privados caloricamente por amamentação

intermitente11431.

Diversas alterações foram descritas fora do período perinatal. Da experimentação animal, bem

como de estudos necrópsicos humanos derivaram muitos dados sobre as mudanças histológicas da

hipófise e órgíos alvos ocorridas na desnutrição1 3 3 '6 6 -1 0 1 -119.160,161.166,160,179) H w l í t t j r e o i d e (

adrenais, ovários e testículos apresentam alterações estruturais involutivas que podem levar a atrofia da

g lândula ' 1 0 1 ' 1 7 9 ' . A observação dessas involuções permitiu a MULINOS • P O M E R A N T Z 1 1 0 1 ' intro-

duzirem, em 1940, o termo "pseudohípofisectomia" em virtude da semelhança entre o i defeitos da

inanição e hipof isectomiz, e da convicção que muitos desses efeitos fossem decorrentes da má nutriçio

da hipófise, resultando na seereçâo diminuída de seus hormônios.

Estudos necrópsicos de glândulas hipof isarias revelaram uma reserva hormonal diminuída de

gonadotrofinas e hormônio de crescimento (GH) em pacientes caquéticos e de TSH em crianças

malnutr idas ' 1 3 4 ' 1 6 6 ' . Rates submetidos « privação proteica apresentaram diminuiçio no conteúdo

1 AON: Ácido D*K>xlrlbonuc!«lco.

bipofisai id dos hormônios folículo-estimulante (FSH), estimulante das células intersticiais, de TSH e deG H t t .1!,1)

Embora a reserva hipofis.ii 1,1 de certos hormônios esteja mlu/ida r.a desnutrição, não se podeafirnwr que a concentração hormonal no sai»|ue seja inadequada. Exi '•• uma concordância que os níveisde GH circulante estão aumentados na má nutrição proteico calor H a infantil • •provavelmente devido à hipersecreção , na inanição do adulto e aumentados ou normais na anorexianervosa • b^^' Q nível de cor liso', plasmático também encontra-se elevado, verossimilmente emvirtude de um catabolismo deficiente . Em contraste, as çionadotrofinas estão diminuídas. Adultos comdiferentes graus de desnutrição ou com anorexia nervosa apresentaram hnixa excreção urinaria degonadotrofinas e estróqenos . Em crianças nidlnutrid.is foram descritos níveis plasmáticos dehormônio luteinizante (LH1 e FSH ojecrescidos insignificantemente e res|>ostas subnormals rio LH ao seuhormônio libe ador . Na desnutrição do adulto, istudos realizados em mulheri's com anorexianervosa demon traram níveis basais cte LH e estradiol diminuídos, de FSH riecrescirios ou inalterados erespostas deficitárias ao clomifênio e ao hormônio liberador d.is (jonadotrof mas ' ° .Entretanto, alguns desses estudos revelaram jinda respostas de FSH aumentada', e prolongadas ou mesmorespostas de LH prolongadas ã estimulação pelo hormônio liherarior do hormônio lutomi/ante ' .Recentemente, foram descritos níveis basais baixos de prolactina na desnutrição infantil c normais ouelevados em adultos com anorexia nervosa .13,16',16)) Q n l v ) , | [,asal ,|,> insulina plasmáticaimunorreativa encontra-se diminuído na mi nutrição e na privação alimentar e as respostas aiadministrações intravenosas de glicose e glucijonio são subnormals .94.nb)

Estas alterações da função endócrina são recuperáveis, sendo o nível hormonal normalizado comO tratamento da desnutrição, o que contrasta com as permanentes alterações que ocorrem no períodoperinatal.

No que diz respeito ao eixo hipotálamohipófisetireóideo, a maioria djs estudos em desnutriçãoé difícil de ser interpretada e os relatos são controversos quanto ao local da alteração. Diversas alteraçõeshistológicas foram encontradas na tireóide de ratos e camundongos privados do alimentação .Existem, também, evidências histolóaicas de hiDOPlasia tireóidea na desnutrição clínica e experimental,embora glândulas de crianças malnutridas náo tenham revelado alterações histológicas'66 '101 • n 9 >

. Significant» reduções no peso da ti;eóide foram determinadas em ratos submetidos adepleçáo proteica, em crianças malnutridas e em indivíduos caquéticos1304782-134,150,1561Atribuiu-se esta hipoplasia a uma provável diminuição na liberação do TSH hipofisário, sendoque a reduzida hiperplasia observada em ratos desnutridos como resposta à administração de subs-tâncias baciogénicas suportava a referida hipótese182'.

Do ponto de vista funcional, várias evidências encontradas na má nutrição clínica e experi-mental, a saber: diminuições na taxa metabólica basa l 1 9 4 4 9 7 - 1 0 8 ' 1 5 0 1 , na captação de iodo radioativopela tireóide'8-9'1 ̂ « . ^ l O f l ) n o $ n f v e j $ d e j o d o | jga<j0 , p r o t e f n a $ (PB|)(9,14,6O,71.123.164I , d ,

iodo extraível pelo butanol (BEI)'9 '141 , na relação entre as concentrações de radioíodo na tireóide e notoro (T/S)1 3 0 '1 6 0 1 , na taxa de secreção de T 4

( 1 4 7 ) e nos teores de T4 e triiodotironina (T, | natireóide - e T4 no plasma com quantidades de iodoaminoácidos tíreóídeos aumentadas, indicamuma diminuição na função tireóidea. Poderia parecer que na desnutrição uma secreção reduzida de TSHfotM responsável, pelo menos em parte, por essas alterações funcionais da tireóide, visto que a adminis-traçio de TSH estimulava a glândula19'641. Entretanto, o TSH exógeno nío elevou significantementeestes parâmetros em animais submetidos è depleçSo proteica, sugerindo mais um comprometimentotireôideo do que hipoflsaW30-641.

As primeiras investigações acerca dos níveis de TSH, utilizando métodos biológicos, revelaramdimlnuicfo nas concentrações de TSH sérioo e hipofisário, tanto em ratos submetidos a privaçãoalimentar ou proteica' dietética, como em mulheres caquétlcas • crianças com marasmo ou"kwashiorkor"'33-134-161-105 '. Com o recente desenvolvimento de um radloimlnoensalo para a medidada TSH, a imroduçlo desta metodologia veio mostrar que na desnutriofo a tendência deste hormAnio éde estar Inalterado na cireuleçio. Assim, foram descritos níveis basais normais de TSH circulante em

crianças com marasmo, "kwashiorkor", "kwashiorkor"-marasmático, em pacientes com anorexia nervosa,em adultos obesos ou normais submetidos ao jejum, e em adultos com má nutrição proteico-calô-rica(13.28.59.60.62.70.93.99.121.124.161.166) E n t r e t a n t O r o i t 0 e n t r e 2 4 crianças com má nutrição

proteico-calórica estudadas por PIMSTONE e cols.'1 1 3 1 apresentaram TSH séricn basal elevado e,inversamente, baixos níveis deste hormônio foram determinados em crianças marasmáticas e emindivíduos obesos mantidos em je jum' 6 0 - 6 2 - 1 3 1 1 .

0 uso do tripeptídio sintético, hormônio liberador da tireotrofina (TRH) como uma provaestimulante da reserva hipofisária de TSH, tornou possível o estudo da função hipotálamo-hipófise-tireóidea na desnutrição, revelando respostas do TSH ao TRH, na maioria das vezes exageradas ap r o l o n g a d a s ' " - " 3 - 1 2 4 - ' 3 1 - 1 6 1 - 1 6 6 ' .

Estes estudos da dinâmica do TSH na desnutrição humana foram realizados em condiçõesclínicas em que os grupos estudados nem sempre são homogêneos, e os resultados sSo, âs vezes,discutíveis. Portanto, a confirmação desses achados em condições experimentais controladas eradesejável.

Julgou-se então necessário avaliar o nível basal de TSH sérico e sua resposta ao TRH sintéticoem ratos malnutridos.

Este trabalho compara observações realizadas em dois grupos de ratos, carente crônico proteicoe controle, analisando-se os parâmetros seguintes:

- pesos iniciais, finais e evolução dos pesos dos animais,

- concentração de proteínas totais séricas,

- concentração das frações proteicas séricas,

- nível basal do hormônio tireotrófico (TSH) no soro,

- nível sérico do TSH em resposta à administração de seu hormônio liberador (TRH).

MATERIAL E MÉTODOS

1 - Animais

Utilizaram-se 48 ratos Wistar albinos (Rattus norvagicus alblnus) - Myomorpha - ROOENTIA,do sexo feminino, com idade em torno de 70 dias, de peso homogêneo t alados no biotérfo doInstituto de Energia Atômica de SSo Paulo (I.E.A.).

Os animais foram encerrados em gaiolas metabólicas individuais, sendo mantidos durante odecorrer da experiência em sala fechada sujeita è iluminação natural por aproximadamente 12 horasdiárias a provida de aparelho condiclonador da ar que manteve a temperatura média ambienta da24 ,4 í1 ,7°C .

A experiência durou 30 diai, período em que os animais receberam dieta a égua "ad libitum".

Constituíram-se, assim, os dois grupos da estudo do presente experimento:

a) Grupo controle - compreendendo 24 ratos que receberam dieta normoprotalM, contando16% de proteína da casefna (GC);

b) Grupo carente crônico em proteínas - compreendendo 24 ratos qua rihipoproteica, contendo 3% da prottfna da casefna (GCCP).

-am dieta

Determinou-» o peão dos ratos am intervalos de dois a trfts dias. Precedendo a pesagem, oaanimais eram mantidos nas mão* do exparimantedor, durante algum tempo, a fim da aviar o estresse1

decorrente do seu manuseio.

2-Dietas

As dietas utilizadas neste trabalho tiveram as seguintes composições:

Composiçfo Porcentual das Dietas da Casefna

Fornecidas aos Animais

Ingredientes

(g/100 g da dieta)

Casefea

Mistura de tais minerai!

Solwçfo de vitaminas

óleo da fígado da bacalhau

óleo de milho

Maiaana

Dietas

Normoproteica

15

4

2

2

4

73

Hipoprotaica

3

4

2

2

4

85

Mistura de saia minerais - preparada segundo a mistura da PHILLIPS a HART1 1 0 9 1 modificada.Cam gramas da dieta contém as seguintes quantidade» da sais:

NaCI

Fa, (S0 4 ) | .H,0

KlCa,H1(PO4),.4HJO

MnSO4.4HjO

MgS04.7H,O

ZnCI,

CeCO,

CuSO4.6HjO

0,5949 g

0,1332 g

1,6006 g

0,0028 g

0,3374 g

0,0012 g

0,3623 g

0,0009 g

1.0666 g

0,0011 g

SOHJOIO da vitaminas11"' - Cam mllllKroa da SOUMCO eontribufraan com ai seguintesquantidades «m mg/lOO/dlt

1 Do k * * «re»": «fim*» Suerque * Holanda Fern*», A. Mno Oktmttrlo «• L/b*m r*at*vm. 1 eA Ra>Jenelra, fdHor* New Framelra, 1978.

Tiamina HCI 3,57

Riboflavina 3,57

Piridoxina HCI 3,57

Pantotenato de rile» 8.94

Ácido nicótico 3,57

Colina HCI 1.787,28

Ácido fólico 1,79

Inositol 178,73

Vitamina B1 3 0,04

Vitamina Kj 8,94

Água desionizada q.s.p. 100 ml

Observação - Cem gramas de dieta normoproteica e hipoproteica forneceram respectivamente

408.41 e 381,65 Kcal.1

O preparo das dietas obedeceu i seqüência: dissolução da mistura de sais na solução d»vitaminas, adição dos óleos , adição da caseira e maisena; homogeneização da mistura seguida de duaspassagens do pó, correspondente a mistura final, através de peneira de malhas de "nylon".

As dietas foram armazenadas em recipientes • guardadas em câmara fria a quatro grau*centígrados.

Retirou-se, diariamente, das dietas estocadas, a quantidade suficiente para o suprimento dotanimais durante 24 horas.Com a finalidade de evitar o fornecimento de alimentos em temperatura baixa,a dieta foi mamida durante cerca de duas horas, i temperatura ambiente, antes de ser oferecida aosratos.

Após os 30 dias em que os animais receberam as dietas balanceadas, eles permaneceram emjejum durante as duas horas precedentes ao início da prova de deplecio do hormônio tireotrófioo (TSK)hipofisark).

3 - Prova d« Deplecsb do TSH HipofMrio

Os animais dos dois grupos (GC • GCCP) foram submetidos i prova de deplecão do TSHhipofisark) por meio de injeção do hormônio liberador da tireotrofina (TRH).

Utilizou-se o método da depleção pituKiria para o bioensalo dot fr.ores hipotílímicos,padronizado por MOTTA • cols. '1 0 0 ' , modificado por PIVA t STEINER 1 1 1 8 1 a adaptado as condiçõesexperimentai! deste trabalho.

O» animais previamente anestesiados por Injíçío intraparttoneal de Pentobarbltal sodico2 (trêsmg por 100 g de peso corpóreo) tiveram a artéria carótica exposta por melo da uma inclsfo longitudinalna regiJo anterior do pescoço. Por meio da uma cánula (tubo da polietlteno PE 6 0 a I introduzida naartéria retirou se pequena amostra de sangue, adiminlitrando-se i seguir, pala masma via, 10 microgramatda TRH 4 sintético dilu'dos em 0,5 ml da solução fisiológica; no ptrfodo préastabelecido oompraandldoentre 9.60 0 10,30 hora»1161

1 Segundo Ben, C. H. a Taytor, N. 8. The phyitotoetart batii of medical preetlei, 7 th EdHton. Tf* WINIami ftWWilntCo.. Bfttimort, 1961. <*. 44. p. 743 • T«WM CientíflGM Oocumenta Oeiav, «? fdMon, J. R. Oetfy S Á , IMIaa,1086, p. 621.

2 Indúftrln Farmaeiuitcet Fontoura - Wytih 8.A. - Sêo Barnardo do Campo, S.P.1 Clay Mãrm - Paraippany, N. J , USA.4 OJtdo pila F. Hoffmann - La Hoerw ft Co. Lide - BatfNIa, tutea.

Coletou-se o sangue total dos animais 10 minutos após a administração do hormônio,sacrificando os por decapitação rápida com guilhotina.

As amostras sangüíneos foram centrifugadas a 4°C, durante 20 minutos a 2000 rpm.Determinou se, no soro obtido antes da administração de TRH a concentração de TSH. Nas amostraiséricas, após a administração do TRH, dosaram-se o TSH, as proteínas totais e as frações proteicas.

4 — Técnicas de Dosagem

4.1 — Protefn^s Totais e Frações Proteica»

A concentração das proteínas totais do soro (g/100 ml de soro) foi estimada colorimetricamentepelo método de LOWRY e cols. ', usando como referência uma curva padrão de soro albumina bovina<SAB).

As frações proteicas do soro, pré-albumina, albumina e globulinas, foram separadas pela técnicade eletroforese em acetato de celulose (Cellogel)1, adaptada segundo as instruções do fabricante daifitas»137».

Após diafanização, as fitas foram lidas em fotodensitômetro, delineando seu perfil eletroforéticosobre papel adequado; tendo-se tomado a precaução de utilizar o mesmo papel a fim de manter •homogeneidade entre os traçados obtidos.

Pesando-se em balança analítica Mettler2 a área total ocupada pelo diagrama e as areaicorrespondentes à pré-albumina, albumina e globulinas; calculou-se a porcentagem de distribuição dasfrações proteicas com relação ao peso da superfície total de cada gráfico.

A partir dos valores das proteínas totais do soro obtidos pelo método de Lowry, determinou-se• concentração relativa a cada fração oroteica expressa em gramas por 100 mililitros de soro.

4.2 - Hormônio Tireotróf ico

Determinou-se o hormônio tireotrófíco no soro por radioimunoensak), utilizando a técnica doduplo anticorpo, baseado no método descrito por ODELL • cols. com algumas modificações,segundo as instruções recebidas do National Institute of Arthiritis and Metabolic Diseases (NIAMD).

4.2.1 - Hormônios Padrio a Para Radiolodeçfo i Primeiro Anticorpo

- Hormônio tireotrófíco de rato para construção da curva padrao (NIAMD-Rat TSHRP-1).Potência biológica: 0,22 unidades de TSHUSP (bovinas) por miligrama (ensaio dtMackenzie).

- Hormônio tireotrófíco de rato para radioiodaçfo (NIAMD-Ret TSH-l-3). Potênciabiológica: aproximadamente 36 unidades internacionais por miligrama (entalodtMackenzie).

- Anticorpo contra tireotrofina de rato, preparado am coelhos (NIAMD-Anti-Rat TSH7)

1 Chtmairon - Milano, IUI1»2 MntlOT - M20T - Zurich, Swtat.

Estes materiais biológicos foram cedidos pelo National Institute of Arthritis and MetabolicDiseases, National Institute of Health, Rat Pituitary Hormone Distribution Program1.

4.22 - Obtenção do Segundo Anticorpo

Como segundo anticorpo empregou-se imunesoro de carneiro contra gamaglobuiina (IgG) dacoelho.

4.2.2.1 - Preparação da IgG de Coelho

Do soro normal de coelho, obtido por sangria de animais do biotério do I.E.A., foram separadasas frações gbbulinas por meio de precipitação com sulfato de sódio'371.

0 material obtido foi dialisado inicialmente contra égua destilada para retirada do sulfato aconcentrado através de membrana Diaf Io PM 30 em sistema de ultraf iltraçío Amicon2. Após nova diálisacontra tampão fosfato de potássio 0,01 M, pH 8 3 , dosou-se a proteína pelo método do biurtto, tendodepois cromatografada em DEAE-ceiuIose 4 equilibrado no mesmo tampío146 '761.

A imuneletroforese da fração cromatográf ica revelou, frente ao imunetoro da carneiro anti-sorototal de coelho, uma única linha de precipitação, com mobilidade de IgG (Figura 1).

Figura 1 - Padrio E let rof or ético da Preparaçlo do IgG Obtida am Cromatografta da DEAE-celulem(1) Soro Total de Coelho; (2) Fração ElukJa am DEAE calulo«; (3) Imunaaoro da Carneiro•rrti-soro Total de Coelho

1 Harbor G«ntr*l Hotpfttl - 1000 Wwt Cirson Sum, Torr«m» Callfornl* USA.2 Amioon Cor por «ton - Uxingion, MMMchUMttl, USA.3 Coflipotfçao'. KH,PO« 67,13 mg

K,HPO4 919,48 mgAgia bldMtliidi q. «. P 1 000 ml

4 Blo-Rad (.«boufortof - Richmond, California, USA.

A solução de IgG obtida, contendo 60 miligramas de proteína por mililitro de tampão, foiconservada a 20°C.

4.2.2.2 - Preparação de Soro de Carneiro Anti-lgG de Coelho

Utilizou se um carneiro do sexo masculino da raça Corriedale, com 10 meses de idade,proveniente do Posto de Ovinos e Caprinos do Instituto de Zootecnica da Secretaria de Agricultura deSSo Paulo.

A imunização do animal foi realizada por injeçot; subcutâneas, na região paraesternal, de doismiligramas de IgG emulsionados em adjuvante de Freund completo, durante um período de quatrosemanas.

Quinze dias após a última inoculação, procedeu-se à, imunização de reforço empregando-se seitmiligramas de IgG em solução fisiológica, por via intramuscular na região interna da coxa, semanalmente,por um período de quatro semanas. Sete das após, realizpu-se a sangria pela veia jugular. O imunesoroda carneiro anti-lgG de coelho foi dosado pela técnica de precipitação quantitativa, segundo Heidelberg aKendall, descrita por MAURER1 8 9 1 , obtendo-se 2,4 miligramas de proteína anticorpo por mililitro desoro.

Concomitantemente à sangria, procedeu-se a novo reforço que se repetiu quinzenalmente a fimde manter elevado o nível dos anticorpos.

4.2.3 - T/.cnica de lodacão

Com as precauções usuais na manipulação de material radioativo, efetuou-se a iodação do TSHcom 1 2 5 I 1 , na forma de iodeto de sódio, livre de carregador e agentes redutores; com elevada atividadeespecífica (aproximadamente 300 milicuries por mililitro) pelo método de GREENWOOD e cols.183'modificado.

A um tubo de ensaio que continha 20 microlitros ( /JI) de tampão fosfato 0.6 M, pH 7 , 6 a

adicionaram-se sucessivamente:

a) 1 , 5 m C i d e 1 2 6 l ;

b) h o r m ô n i o tireotrófico para radioiodaçío: 26^1 da «lúcio de concentração de200 microgramas por mililitro (ml),

c) cloramina T: 20>il da solução de concentração de 16 miligramas (mg) por 10 ml;

d) apiiscío moderada a contínua, durante 40 segundos;

a) metabissulfito de sódio: 60 ^1 da soluçlo de concentração da 24 mg/10 ml;

f) continuou-se a agitar o sistema durante 40 segundos;

g) Iodeto da potássio: 200 n\ da solução da concentração da 100 mg/10 ml;

h) soro normal da coelho: 100pi corados com atui da bromofenol.

1 FarbvMrk* Htmt»m AO - Frtnkfwi (Mtln), Germany.2 Compwlçfc: N Í H J POt.H7O 8,9712 g

N*,HPO4 61,76139Aaua bktat liada q.i.p. 1000 ml

10

Observações:

1 - Os reativos dos itens c, e, g, foram diluídos em tampão fosfato 0,05 M, pH 7,6V

2 - 0 hormônio tireotrófico foi diluído em fosfo-salina (tampão fosfato 0,01 M 2 , NaCI 0,16 Me mertiolato 0,01%, pH 7,6).

4.2.4 — Purificação do Hormônio Marcado

A purificação do hormônio marcado foi feita por cromatografia em coluna de exclusãomolecular (Gel Sephadex G-753).

0 gel previamente entumescido com fosfo-salina durante aproximadamente 24 horas, à tempe-ratura ambi nte. foi empacotado em coluna de vidro refrigerada a 4°C, de dimensões de 30 centímetros(cm) de altura e 0.9 cm de diâmetro.

A coluna foi saturada com fosfo-salina contendo 2% de soro albumina bovina (SAB) • emseguida lavada com o tampão de eluição (fosfo-salina).

0 hormônio marcado foi aplicado à coluna, coletando» frações de 0,5 ml em tubos contendo0,5 ml de fosfo-salina com 1% de SAB.

Para previnir a desnaturacão da molécula proteica pela temperatura, fez-se a purificação emsistema refrigerado a 4°C (coletor automático refrigerado LKB 4 ) .

Controlou-se os diversos eluatoi por meio de espectròmetro-automático de cintilografia munidode cristal de Nal(TI), tipo poço (Nuclear Chicago Corporation6), a fim de localizar os picos radioativos.

Obtiverarrvse três picos radioativos: o primeiro pico é hormônio não íntegro, material poucoimunorreativo, o segundo pico corresponde ao hormônio marcado puro, usado para o radíoimunoensafo.0 terceiro pico, acusado em efluentes bem distanciados do hormônio íntegro, contém o íodeto livra(Figura 2).

0 primeiro e o terceiro pico foram desprezados, sendo o TSH-1 2 B I , congelado a -20°C após asprovas de pureza.

4.2.5 - Provas do Rendimento da Marcaçio a da Pureza do Hormônio Marcado

As amostras de TSH marcado com 1 2 B I , obtidas antat a após a purrficaclo paio Saphadex, i iquais adicionou-se plasma humano corado com azul da bromofenol, foram submetidas a eletroforese amfitas de papel Whatman 3MM ( 1 7 8 ) .

A análise eletroforttica foi desenvolvida am tampão varonal (força tônica 0,06), pH 8,6a; a800 V.

1 r»pBí«rto • p»ntf do timpfo fotfito 0,6 M, pH 7,62 Comporiçao: NÊ»J PO«.HaO 0,17942a

N*,HPO4 1 ,23523 BAgut blo«til«dt q. i .p . 1 000 ml

J Phtrrradi - Upçmlt, SiMdtn.4 LKB - Produkter AB - Brommt, Sweden.6 Hutímr Chicago Corporation - O* ?\ê\rm, llllnofc, U8A.• Compoiíefc: Acfdo dtotif bêitttúrleo 134 a

Btrbltal •odieo 10,300Ague btdntllad* q. i. p. 1 000 ml

11

5 10 10 20 20 30 30 40

Ffcurt 2 - Cromatogrwntdt PurlflaçSo do T S H - 1 2 8 I «m Oolurw d« EXCIMIÒ Molwular(StpfwdfxO-76)

1?

A corrida foi interrompida quando as proteínas séricas roracías alcançaram 7,5 cm da origem, oque correspondeu a um tempo médio de 90 minutos.

A radioatividade das fitas foi determinada em segmentos de um centímetro, a partir da orioem,no espectròmetro automático de cintilografia gama tipo poço.

O diagrama da eletroforese, realizada com a amostra de TSH logo após sua iodação, revelou trêtpicos de atividade, correspondentes a um pico na origem de hormônio íntegro que permaneceu no localda aplicação, um pico central de hormônio danificado que migrou com as proteínas séricas coradas e umpico final de iodeto radioativo livre (Figura 3).

Na eletroforese da amostra obtida após a filtração em coluna de Sephadex, identificou-se apenatum pico de TSH marcado localizado na origem, indicando a eficiência da purificação que permitiu aseparação do hormônio íntegro da fração hormonal degredada e do 1 2 5 I livre (Figura 3).

A relação entre as contagens da área em que se localizou o hormônio íntegro e as contagenstotais da fita forneceu 45,02% de rendimento e 90,36% de pureza para o hormônio marcado e purifi-cado respectivamente.

4.2.6 - Protocolo do Ensaio

No protocolo, os tubos de números um a três (traçacores), contém apenas o hormônio marcado.Os tubos de números quatro a seis (controles) contém hormônio marcado sem anti-soro e representam aligação inespecífíca do hormônio marcado com o segundo anticorpo. Os tubos de números sete a 30contém hormônio tireotróficc padrão, nas concentrações de zero, cinco, 25, 50, 100,250, 500 e 1 000manogramas por 0,3 mililitros. Os tubos seguintes contém soro de rato contido antes e após a adminis-tração de TRH.

A seqüência de adição dos reagentes obedeceu i disposição do protocolo (Tabela I).

Após a adição do primeiro anticorpo o sistema foi incubado a quatro graus centígrados duranta72 horas e, após a adição do segundo anticorpo, por 24 horas nas mesmas condições.

A seguir, todos oi tubos, exceto os traçadores, foram centrifugados em centrífuga refrigerada a2500 rpm durante 30 minutos. Ot sobrenadantes foram decantados e as atividades dos precipitadosdeterminadas no espectrômetro-automático de cintilografia gama, acumulandc-se no mínimo 10000contagens.

4.2.7 - Cálculos

Tendo sido ensaiados em triplicate a curva pedrfo, traçadores a controlai, a em duplicata aiamostras tericas; calcularam-te oi valorei médios das contagem correspondentes.

A contagem que representa a ligaçio inespecífica do hormônio marcado com o segundo anti-corpo foi subtraída doi demais valorei; constituindo 0,80% da contagem indicada pelos treçedores.

A partir òos valorei corrigidos, calcularam-se ai porcentagem da ligaçio do hormônio marcadocom o anticorpo específico na presença dai diferantei concentreçoet da hormônio pedrio, am relação icontager.i do ponto zero da curva pedi Io. Estabeleceu-se como lendo 100% a ligaçio neste ponto,devido a ausencie da TSH pedrfo para competir com o T H S - m l peloi lugarM d* ligaçio do anticorpo.

Oi dados assim obtidos foram procanadoi de acordo com o método d« ROOBARO •FRAZIER11 3 O ' que permite a transformação da curva pedrio para a forma linear, por maio da wgulnMequaçfo:

13

2 •

Ant91 éo purificação

o

á.ò

It9.

T«H-'MI

0«nlflc«4*

J

8 TSH-1».

ApÓ9 a purificação

•m ••pftotfM

i

6 9 12 15 18 21 24 270 3

IORÍGEM PLASMA

C0RA00Figura 3 - EMroforttogrtmc do T S H - 1 3 8 !

ÃHODO

Tabelai

Hormônio Tlraotrôfico Protocolo do Ensaio

Tubos

N?

1 a 3i . A

4 1 D7 a 9

10 a 1213 a 15

16 a 1819 a 2122 a 24

25 a 27

«to • J U

31-32

•

TSHpadrfc

ng/300*il

_ _

05

25

50100250

500i ivn

Amostra

Ml

_ _

___

300#

*

Tamplo

Ml

_

200

200

200

200200

200

200•jon

200

*t

TSH-12BI

Ml

100- __

100100

100

100

100100

100m/1

100

#

•

Ac 11:10000

•

200200

200

200

200

200200orwi

200

•

Ac 2

Ml

• i L .

Of)í\

200

200

200

200

200

200

2009fln

200

•

Tampão: fotfc-ulina. pH 7,6. contendo albumina bovina sérica a 1%.

TSH padrio: hormônio tirectróf ico padrão, dissolvido nm tampão.

T S H - 1 2 6 I : hormônio tireotrôf ico marcado, diluído em tampão 120 000 cpm/100 ̂ 1).

Ac l primeiro anticorpo diluído rm fosfo-salina, pH 7,6 contendo EOTA 0,05 M e soro normal de coelho a 3%.

Ac 2: aagundo anticorpo.

15

logit > (Y) - a + b In x

onde:

logito (y) ~ In (v/1 - y),

y é a porcentagem de ligação relativa e

x é a concentração de hormônio tireotrófico padrão.

A reta de regressão linear resultante, obedeceu a equação:

logito (y) = - 0,823 In x + 4,199

coeficiente de correlação (r) = 0,998

Estas determinações e a subseqüente computação dos valores da concentração hormonal da*amostras séricas 'oram efetuadas em calculadora Hewlett-Packard'.

A precisão deste método foi confirmada pela concordância entre as concentrações obtidas pelaequação e as concentrações lidas na curva aritmética.

As leituras na curva supra citada foram compreendidas na região correspondente a concentraçãode 40 a 130 nancgramas por 0,3 mililitros, que se apresentou linear e sensível. (Figura 4).

Fixou se, em ensaio prévio, como sendo de 1:10 a diluição apropriada das amostras séricasobtidas após o estímulo pelo TRH; o que permitiu a leitura das concentrações na região linear.

Os resultados foram expressos em nanogramas d» TSH padrão (NIAMD-Rat TSH-RP-1) pormililitro de soro.

6 — Tratamento Estatístico

O estudo comparativo dos resultados experimentais obtidos pera os grupo* controle • carentecrônico proteico foi efetuado aplicando-se técnicas de comparação de duas médias, análise de regressão •análise de variância.

Neste estudo utilizaram-se os índices de aferição seguintes:

- peso dos ratos,

- concentração de proteínas totais e frações proteicai séricas a

- concentração de hormônio tireotrófico no soro.

6.1 - Peto dos Rito*

A comparação entre ai médias dos pesos iniciais dos ratos dos dois grupos, antet de Nr>msubmetidos ès dietas normoproteica ou hipoproteica, foi feita pelo teste t de Student, verlficando-teininilmon'c, por meio r i" um tf.te F, se havia ou não diferença entre at variinclat.

1 Hfwi..ti Prtckmit. mulato H10TJB, Engluwooii, Colorurio, USA.

16

too

1*f0,000tt mU/mt

I SO 00

19

190 100

(ng/0,3 ml) TSH

1000

Figura 4 - EnMlo d« Hormônio Tlrmtrôflao <to R«to. Curw PMrlo

17

Pelo método de regressão linear simples, estudou-se a evolução do peso dos animais em função

do tempo em que eles foram submetidos às dietas. Realizou-se a análise de variância para avaliar se as

retas resultantes satisfaziam as condições de linearidade, isto ê, o coeficiente angular ser diferente de

zero e não existir falta de ajustamento. A diferença entre as inclinações das retas dos dois grupos foi

analisada por t de Student.

As médias dos pesos atingidos pelos ratos no trigésimo dia de fornecimento das dietas foram

esti nadas a partir das retas de regressão linear correspondentes. A comparação entre estas médias rela-

tivas aos pesos finais dos ratos dos grupos controle e carente foi efetuada pelo teste t de Student.

5.2 - Concentração de Proteínas Totais • Frações Proteicas Seriou

A comparação entre as médias dos dois grupos de animais (GC e GCCP), segundo concentração

sérica de proteínas totais, albumina e globulinas. foi realizada pelo teste t de Student, tomando-se o

cuidado de verificar se possuíam variâncias iguais.

5.3 - Concentração de Hormônio Tireotróf ico no Soro

As comparações entre as concentrações do hormônio tireotróf ico no soro dos ratos dos grupos

controle e carente, antes e após o estímulo com TRH, foram estabelecidas por uma análise de variância.

Em caso dé resultados signíficantes, aplicou-se o método das comparações múltiplas de Scheffé.

RESULTADOS

1 — Paso dos Ratos

Os valores correspondentes aos dados individuais do peso dos animais, verificados durante o

período em que foram submetidos as dietas normoproteicas ou hipoproteica, encontram-se na

Tabela V I I I do apêndice.

Estão representados na Tabela IX do apêndice os valores relativos i s variações individuais do

peso dos ratos, calculados a partir dos pesos estimados no decorrer do período, com relaçio ao peso

inicial. Ver na folha a seguir do ipêndice, a Figura 9.

As médias aritméticas dos pesos inicie! • final dos animais, bem como das variações entre estes

pesos estão expressas na Tabela I I , juntamente «vm os respectivos desvios pedrlo.

1.1 - Pato Inicial

A signíf Idrtcia estatística entra as médias do» pesos iniciais dos ratos que passaram a receber as

dietas normoproteica a hipoproteic* foi avaliada paio teste t de Student

Comparando-se as variJnciat dos pesos dos animais dos dois grupos paio testa F ( 3 " , o valor da

F observado foi igual a 3,9366 (GL: 23 e 23), demonstrando a existência da diferença signiftonta ao

nível de 1% entre elas Aplicou-se entío o testa t da Student para varianclas desiguais'39', dado pala

fórmula seguinte:

I f i

t =

com GL = ni + nj — 2, onde:

Os índices 1 a 2 refeiem-se, respectivamente, aos dados dos grupos controle e carenta crônicoproteico,

n é o número de animai* de cada grupo,

Y representa o valor médio do peso inicial,

s2 representa a variância do referido peso e

GL figura como sigla dos graus de liberdade.

Evidenciou-se pelo valor de t observado, igual a 0,5269 que as médias dos pesos iniciais dotratos dos dois grupos nffo diferem, significantemente, entre si.

Tabela II

PMO Inicial, Pato Final e Variação de Pato dot Ratot do Grupo Controle (GO

a do Grupo Submetido a Carência Crônica Protele* (GCCP)

Grupos

GC

GCCP

Dados

analisados

Xdp.

Xdp.

Peto

inicial

10E,08g

21,09

102,64 g

11,09

Pato

final

174,88 o16,78

84,88 g

12,40

Varlaplo

da pato

• 69,79 g

14,62

-17,67 g

5,18

X : Média

d.p.: Desvio pedrlo

19

1.2 — Evolução do Peso

O estudo, pelo método de regressão linear simples, da evolução do peso dos animais durante os .

30 dias em que foram submetidos às dietas, foi realizado com os valores estimados a partir do segundo

dia. Neste segundo dia, correspondente à primeira pesagem feita após o início do fornecimento das

dietas, inicia-se a avaliação das alterações do peso dos animais em resposta às mesmas.

As retas de regressão linear estimadas, segundo as fórmulas descritas em DRAPER e S M I T H 1 3 9 ' ,

relativas à evolução do peso dos ratos dos grupos de controles (GC) e carente (GCCP), são:

- reta n? 1 (GC) : y = 112,5000 + 2,1079 x

- reta n<? 2 <GCCP) : y = 93,9736 - 0,3162 x

onde:

y è o peso médio estimado no dia x, e

x é o dia do período analisado.

A análise de regressão forneceu as tabelas de análise de variãncia referentes aos dados dos

grupos controle (Tabela II I) e carente (Tabela IV).

Evidenciou-se, pelas análise de variãncia efetuadas que as regressões são significantes e que não

são significantes as faltas de ajustamento linear. Em outras palavras, os coeficientes angulares dot

modelos lineares são diferentes, de zero e não há evidências de que os modelos adotados não sejam os

ideais.

A comparação entre os coeficientes angulares dos modelos lineares teóricos foi feita pelo teste t

de Student, segundo as fórmulas encontradas em DRAPER e S M I T H ( 3 9 > .

0 valor de t observado, igual a 16,6450, demonstrou existir diferença significante ao nível da

1% entre os coeficientes angulares das retas analisadas, ou teia, os modelos lineares teóricos possuem

inclínaçSes diferentes.

A análise estatística permitiu concluir que o peso dos ratos se alterou durante o período em qua

foram alimentadot com at dietas normoproteice ou hipoproteica a que at evoluções de peso apresentadas

pelos dois grupo* diferem entre t i . Itto é, ot animais do grupo controla aumentaram de pato a os do

grupo carente tiveram seus pesoi diminuídos.

Na Figura 5 estio representadas as ratas estimadas que indicam a evolução do peso corpóreo

dot animais. Ainda estio raprewntadat regiões de confiança resultantes da análise da regressfo. Essa*

intervalo» foram obtidos por 9, + dp | ( onda y, * o valor do peto médio estimado no Mt imo dia a dp,

figura como t ímbob do desvio pedrlo, dado pela seguinte fórmula 1 3 9 ' :

/ 1 <xi " *?dp'-y { ;—xr- ) i f

na qual,

N é o número da obterveçoet realizada*,

X, é o f-étlmo dia.

Tabala I I I

Analisa da Varilncla Aplicada ao Modelo Linear Teórico Relativo a Evoluçío do

do* Raw», no Decorrer do Período am qua Foram Submctidoi i Oi«ca Normoprotaica (GCI

Fornada

variação

Ragrauao

Resíduo

Erro puro

Fato da

ajustamento linaar

Total

GL

1

310

290

11

311

SO

106441.3738

108 760,7512

106 332.5765

2 437.1747

214 211,1250

QM

105441.3738

350,8702

355,6273

221,5613

F

300,5139# # l

0,6230 NS

* * * : tfenificantaaonftala < 0,001NS: nio ikjnifwant»

GL: Grauadalibardada

SO: Soma da quadradosQM: Quadrado médio

IV

Analisa da Varilncia ApHcada ao Modelo Linear Teórico Relativo a Evolução do Peso

dos Ratos, no Decorra do P*rfedo em que Faram Submetidos à Dieta Hipoproteica (GCCP)

Fonte de

variação

Regressão

RasTduo

Erro puro

Faltada

ajustamento linear

Total

GL

1

310

299

11

311

SQ

2 372.9107

47 258.6758

46889.7941

368,8817

49 631,4190

QM

2 372,9107

152,4473

156.8221

33,5347

F

15.56S4*"

0,2138 NS

• • • : lignificameaonívela < 0.001

NS: nfo significante

GL: Graus de liberdade

SQ: Soma da quadrados

QM: Quadrado mad»

7?

200

~ 150

#o

a 100

50

GRUPO CONTROLE(OC)

. - — GRUPO CARENTE (OCCP)

T«-O,3I6«* 93,974

t s } é 12 14 16 19 21 23 2*6 2b 30

dias

Figura 5 - Evoluçffo do Pe*o Corpórao doi Hato* Submetido» I t Dietai Normoprote.ca (GO ouHipoprottica (GCCP). A» Curva» Ponderai» foram Calculada» por Regre»»áb Linear, com o»Valore» Eitimedo» em cada Ponto a Partir da PeMBem Efetuada no Segundo Dia do Parfodo,Ouando » Começa Avaliar a» Aheraçfle» do Pe» do» Animai» em Reiporta i« Dieta»Recebida». A» Area* Hachurada» Repre»enttm o Oe»vio Padrlo Acima a Abaixo do» Ponto»P»rtinenta* 1» Retat

23

X representa o valor médio de dias do período analisado, e

$ representa o valor do quadrado médio residual obtido da tabela de análise de variancia.

1.3 — Peso Final

Usando as retas de regressão estimaram-se os valores médios dos pesos finais dos ratos dosgrupos estudados, relativos ao trigésimo dia do período de dieta. As médias foram, respectivamente,175,74 gramas para o grupo controle e 84,48 gramas para o grupo carente.

A comparação entre essas médias foi feita pelo teste t de Student, de acordo com DRAPER eSMITH1391.

O valor t observado, igual a 3,3862 revelou existir diferença significante ao nível de 1% entre amédia do peso final dos ratos do grupo controle e a média do peso final dos ratos do grupo carente emproteínas.

2 — Concentração de Proteínas Totais e Frações Proteicas Séricas

Os valores individuais da concentração de proteínas totais no soro dos ratos, após terem sidosubmetidos,às dietas normoproteicas ou hipoproteica, estão expressos na Tabela X do apênoice. Essesvalores foram estimados colorimetricamente a partir da leitura em uma curva construída com concen-trações conhecidas de soro albumina bovina ISAB) (vide Figura 10 "o apêndice).

A análise eletroforética do soro dos ratos estudados revelou a presença de seis frações proteicas,em ordem decrescente de carga; elétricas: pré-albumina, albumina globulina alfai, globulina alfa],globulina beta e globulina gama. Ver exemplo de perfil eletroforético na Figura 6.

De acordo com o método utilizado para o cálculo da concentração relativa dessas frações, foramdeterminados os valores correspondentes a pré-albumina, albumina e gtobulinas (expressos na referidaTabela X do apêndice). A concentração das quatro frações globulinas foi estimada em conjunto, vistonão ser possível estabelecer com precisão os limites entre as áraas ocupadas por elas nos traçados eletro-forétícos.

As médias aritméticas com os respectivos desvios pidrão das concentrações de proteínas totais •frações proteicas encontram-se na Tabela seguinte (5); a essas médias corresponde a Figura 7. Dada a

pequena área ocupada pela fração pré-albumina no perfil eletroforético determinou-se sua concentração

em apenas quatro e três amostras dos grupos controle e carente respectivamente que apresentaram áreas

de tamanhos passíveis de s *em pesadas.

A comparação das médias das concentrações séricas de proteínas totais, albumina • globulinas,

entra os grupos controle e carente foi feita pelo teste t de Student.

Comparando-se as variincias dessas concentrações, referentes aos dois grupos estudados, pelo

teste F l 3 8 > , o valor de F observado foi igual a 0,8866 para as proteínas totals; 1,4668 para a albumina •

1,0506 para n globulinas, demonstrando não existir diferença significant* «nu* « varilncias comparadas

(GL: 23 e 23). Aplicou-se então o teste t de STUDENT para varilncias Iguais'381, dado pala seguinte

fórmula:

t = — -

) S1

"i

GRUPO CARENTE CRÔNICO PROTEICO

( rafa • • • )

ANOOO

Pt4- A • *»a- Alaamiaa

A • Alaaalaa

• * , . " * . 3 • a* • Claaulina*

0RI6CM ANOOO ORIGEM

FlBur.6 - Perfil Eletroforétioo de Soro de Ratos. Realizado em Fitas de Acetato de Celu.oce. (Tampão Veronal Sôdico 0,04M, PH 8.4. Tea.po de Corrida.

de 45 minutos, Voltagem Fixa de 240 Ve 1,3 mA por Fita)

Tabela V

Concentração de Proteínas Totais, Pré-Albumina, Albumina e Globulinas no Soro dos Ratosdo Grupo Controle (GO e do Grupo Submetido a Carência Crônica de Proteínas IGCCP):

Proteínas totaisg/100 ml

GC GCC.J

X 7.52 5.69

dp. 0.52 0.55

Pré-albuminag/100 ml

GC* GCCP"

0.23 0,15

0,04 0,02

Albuminag/100 ml

GC GCCP

2,63 2.30

0.35 0.29

Globulinasg/100 ml

GC GCCP

4.68 3,14

0,41 0.40

X : Médiad-p. : Desvio padrão

* : valores estimados a partir de quatro amostras* * : valores estimados a partir de três amostras

Moi

26

8

E 6

8

PROTEÍNAS

TOTAIS

O ORUPO CONTROLE ( « O

Í 7 1 GRUPO CARENTE (OCCP)

«LOBULINAS

ALBUM I NA

•Wt-ALBUMINA

Figura 7 - Concfntraçfo da Protaínai Tottli a Fraçflai Protalcai Sérlcai

27

com GL = ni + n2 - 2, onde:

os indices 1 e 2 referem-se respectivamente aos dados dos grupos controle e carente crônicoproteico,

n é o número de animais de cada gripo,

Y representa o valor médio da concentração analisada,

GL figura como sigla dos yraus de liberdade, e

S ! é obtido pela expressão:

s I n , - _ 1 ) s? + _ < n , _ - 1) s22

(n, + n2 - 2)

na qual s2 representa a variância c*a concentração analisada.

O valor de t observado foi igual a 11,8445 para as proteínas totais, 3.5568 para a albumina a13,1712 para as globulinas, com significance ao nível c1: a < 0 , 0 0 1 . Evidenciou-se existir diferençasignificante entre as médias da concentração de proteínas totais dos dois grupos estudados. As médias daconcentração de albumina dos referidos grupos diferem, significantemente, entre si. Analogamente, existadiferença significante entre as médias da concentração de gloòulinas desses grupos.

Apesar dos valores obtidos, referentes a concentração média de pré-albimina terem sido mailelevados no grupo controle, não foi possível aplicar uma análise estatística para comparação dessasmédias em virtude do número restrito de amostras ensaiadas em rada grupo.

3 - Concentração de Hormônio Tireotróf ico (TSH) no Soro

Os valores individuais da concentração de TSH no soro dos ratos do grupo controle e do grupocarente, determinados pela técnica de radioimunsensaio antes e apôs o estímulo pelo TRH, enoontram-Mna Tabela XI do apêndice.

As médias aritméticas e os respectivos desvios padrão das concentrações séricas de TSH,estimadas antes e após o estímuío com o hormônio liberador, bem como das respectivas diferença*calculadas, estão expressos na Tabela VI, a essas médias corresponde a Figura 8.

Os resultados referentes às concentrações de TSH foram submetidos a uma análise da variânciacom uma classificação definindo como tratamento as corroinações Grupos a Tempo. A análise reveloudiferença altamenM significante entre os tratamentos, o que sugeriu testar certos contrastas, usando paraisto o método da comparações múltiplas de SCHEFFÉ1'401, (vide Tabela VII).

Não sa evidenciou diferença significante nas concentrações da TSH entra os ratos dos gruposcontrola a carente antes da serem estimulados com o TRH; estas concentrações foram significantementediferentes das estimadas nos mesmos animais após a administração do hormônio liberador. Evidanciou-Mtambém qua as concentrações determinadas nos dois grupos após o estímulo ditaram, signiflcantementa,antra si. Em outras palavras, a analisa aplicada permitiu concluir qua oi nívtlt basais da TSH sérlco dotratot dos grupos estudados tio similares. Os animais da ambos ot grupos raspondam ao TRH apresen-tando teus níveis séricoi de TSH incrementados, sendo esta incremento malt acantuado not animate

a carência crônica protele»

TabalaVI

Concantraçao da Hormônio Ti'eotrofico (TSH) no Soro dos Ratos do Grupo

Control* (GO • do Grupo Carente Crônico Proteioo (GCCP), Antes e Após o

Estímulo pelo Hormônio Liberador da Tireotrofina (TRH)

Grupos

GC

GCCP

TSH

(ng/ml)

Xdp.

Xdp.

Anta* TRH

226,53

85,53

226.45

75,32

Após TRH

2165,99556,38

3 646,47

639,65

Diferença

1940,46

549,82

3 420,02

639,96

X : Médhi

d p . : Desvio padrão

29

4.I03

g 3.10

ICO

9 3c 2.10

1.10

O «RUPO CONTROLE («O

Q ORUPO CARENTE(SCCP)

APOS TRH

ANTES TRN

Figura 8 - Concentrado de Hormônio Tlreotrófioo (TSH) no Soro dos Rito» do Grupo Controla (GQa do Grupo Carente Crônico Proteles (GCCP), ArrtM a Ap6i o Estimulo paio HormAnioLiberador da Tireotrofina (TRH)

30

Tabela VII

Análise da Variincia Relativa i ComparaçSo dai Concentrações de TSH no Soro dot Ratoi

dot Grupos Controle e Carente, Antes e Depois do Estimulo com TRH

Fonte de

Variação

Entre tratamentos

Contrastes:

GCA x GCD

GCCPA x GCCPD

GCD x GCCPD

GCA x GCCPA

Resíduo

Total

GL

3

92

95

SQ

198 708937

16 828861

216 537 788

QM

66 236 312

162 022

F

362,1008*"

247,0140*"

767,3030*"

143,7882*"

0,000068 NS

** * : significante ao nível a < 0,001

NS: não sígníficante

GCA: Grupo controle antes TRH.

GCD: Grupo controle depois TRH.

GCCP A: Grupo carente crônico protelco antes TRH.

GCCP D: Grupo carente crônico protelco depois TRH.

GL: Graus de liberdade.

SQ: Soma de quadrados

QM: Quadrado

31

D>SCUSSÃO

1 - Modelo Experimental

Os modelos experimentais de má nutrição proteica, com o objetivo de investigar problemas

relacionados com os da espécie humana, incluem o uso de animais e dietas deficientes ou isentas de

proteínas. A maioria das alterações físicas e bioquímicas que ocorrem nesta síndrome carencial tem sido

reproduzida com êxito em ratos jovens ou adultos, após um período experimental relativamente

curto11 • 3 5 9 8 1 5 2 ) .

Muitos autores utilizaram em suas investigações animais de maior porte do que o rato, tais cemo

macacos e porcos • • • ' . Apesar dos resultados obtidos em macacos serem mais adequados para

serem aplicados à espécie humana do que os obtidos em ratos; quando muitas amostras são necessárias, o

uso de grandes animais se torna impraticável.

SREBNIK e NELSON estudaram a função hipofiária anterior em ratos machos que foram

privados de dieta proteica por um período de cinco semanas.

SREBNIK com outros colaboradores estudou também a função tireóidea em ratos fêmeas

mantidos em dieta aproteica por cinco semanas. 0 mesmo tema foi investigado por COWAN •

MARGOSSIAN 1 3 0 1 em ratos fêmeas alimentados com dieta isenta de proteínas e deficiente em iodo,

durante um período que variou de 24 a 32 dias.

GAITONDE e TAWALKAR 1 5 4 * verificaram o efeito do TSH exógeno na liberação de hormô-

nios tireóideos marcados com I em ratos submetidos à dieta carente em proteínas por um período de

quatro semanas.

Considerando as observações acima, utilizou-se na elaboração do presente modelo experimental

período de 30 dias de carência dietética de proteínas, julgando-o suficiente para induzir as alterações

inerentes ao estado de deficiência nutricional.

O modelo deficiente em proteínas foi conseguido alimentando os animais com dieta contendo

3% de caseína, sendo que aos animais controle foi fornecida dieta contendo 15% de caseína.

Estes teores proteioos obedecem ao estudo realizado por H A L A C ' 6 5 1 em ratos, no qual sugere

uma ingestão proteica "mínima adequada" para o crescimento dos animais de 15%. Segundo o autor,

ingestdes abaixo desse nível estariam incluídas no intervalo da má nutrição proteica; assereão esta con-

firmada por KIRSH e cols. 7 I que desenvolveram em ratos alimentados com dieta contendo 5% de

proteínas, distúrbios clínicos, bioquímicos e histológicos similares aos encontrados em crianças porta

doras de "kwashiorkor".

2 - AdinMtaçfo • Manuseio dot Animals

Estudos de carência proteica em ratos revelam • influência da temperatura sobre a ingestão

alimentar e o peso dos animais.

HEGSTED t cols. '6 7 1 em experimento com ratos submetidos ( depleção proteica, evidenciaram

maior perda de peso dot animais expostos durante 11 dias em temperatura baixa (12,8°C) do que nos

mantidos a 25,6°C, pelo mesmo período de tempo. Após 35 dits de exposição a essas temperaturas, os

animaii perderam, respectivamente, 35% • 27% do peso original.

_ JOBIN a S A M E L I 7 3 ) verificaram que a exposição de ratos ao frio moderado (13°C), durante 24

horas, determinava aumento da tireotrof ína e tiroxlna plasmatlcai t partir de 30 minutos a quatro horas

32

de exposição, respectivamente. Comparando as respostas de TSH plasmático ao f r io de intensidade

proi|r OSSIV.Í, fsttís autores observaram estimulo máximo para as temperaturas de oito e dois graus

centiijiitdtiv

Segundo TUOMISTO e cols. ' a exposição de ratos ao frio (quatro graus centígrados)durante 30 minutos, após um período de aclimatação mínimo de sete dias, sob temperatura constante 1e30 C, aumentava muitas vezes o nível de TSH imunoensaiávc!.

ROWE e cols. estudando a relação entre a iluminação ambiental e o eixo hipófise-tireóideo, em ratos, verificaram que a pi ivação de luz resultsva no aumento de peso da tireóide e ailuminação constante diminuia o peso da glândula.

Levando em consideração esses ciados e a fim de evitar padrões díspares no metabolismo perifé-rico dos hormônios tireóideos dos animais, eles foram mantidos, durante toda a experiência, emambiente fechado sujoito à iluminação natural por cerca de 12 horas diárias e provido de condicionadorde ar com temperatura variando entre 22,7 C e 26,1 C.

Além da temperatura e luz, deve-se considerar a influência de outros estímulos nos níveis deTSH circulante dos ratos. Assim, DUCOMMUN e cols. , verificaram que estímulos êxtero-receplivosinespecíficos suaves, a saber, o manuseio e a transferência de ratos de uma sala para outra, conduzem auma rápida diminuição da concentração plüsmática de TSH nesses animais.

Portanto, no presente experimento, evitou-se a variação dos níveis séricos de TSH dos animai»,manipulando-os delicadamente por ocasião das freqüentes determinações de seus pesos corpóreos «mantendo-os no mesmo ambiente até o final do experimento

3 - Método da Depleção do TSH Hipofisário

Alguns fatores foram considerados na aplicação do método da depleção do TSH hipofisário pela

injeção do hormônio liberador da tireotrofina (TRH):

3.1 — Anestesia doí Animais

Trabalhos encontrados na l i f 'atura têm demonstrado que após o estresse ocorre uma dimi-

nuição aguda do TSH plasmático, ao mesmo tempo em que a excreção de hormônio adrenocortico-

trófico (ACTH) é máxima.

SAKIZ e G U I L L E M I N 1 1 3 6 1 verificaram que quando a hipófise é induzida a secretar TSH pelo

TRH, ela concomitantemente secreta menos ACTH em resposta ao estresse; inversamente, quando a

secreçJo do ACTH é inibida pela dexametasona durante o estresse, mais TSH é liberado da hipófise em

resposta ao TRH. As observações de REDDING e S C H A L L Y 1 1 2 6 1 sobre o acúmulo de TSH na hipófise

de camundongos submetidos à injeção intravenosa de histamina, poderoso agente indutor de estresse,

suportam estai evidências.

DUCOMMUN e cols.1411 observaram que em ratos mantidos em ambiente tranqüilo, até 10

minutos após a injeção intraperitoneal de Nembutal (4,50 miligramas por 100 gramas de peso corpóreo),

os níveis de TSH plasmático não diferiam estatisticamente dos níveis determinados nos animais controle,

sacrificados no mesmo horário. Segundo M A R T I N e R E I C H L I N 1 8 8 ' , s resposta do TSH plasmático è

administração de T R H sintético é afetada pelo tipo de anestesia usada. Esses autorei verificaram que o

aumento do nível plasmático de TSH, cinco minutos «pós a administração de 0,1 mlcrograma de T R H ,

era comparável nos ratos anestesiados com éter e com pentobarbital. Entretanto, • resposta era signifi-

cantemente mais prolongada nos animais anestesiados com pentobarbital.

33

Tendo em visti essas observações, no presente experimento os animais foram anestesiados compentolmbital, injetado ntiaperitonealmente na dose de três miligramas por 100 gramas de peso corpo-reo. tomando se a precaução em causar o mínimo possível de estresse no momento da injeção.

3.2 - Administração do TRh

Vários autores já utilizavam a via intracarotídea para a injeção de extratos hipotalâmicos emratos na investigação dos fatores hberadores dos hormônios folículo estimulante, adrenocorticotrófico, decrescimento e tireotrófico, devido a injeção intracarotídea permitir o uso de menor quantidade deprincípios liberadores quando comparada com a intravenosa'2534-1 • .

PIVA e STEINER ' citam no bioensaio do TRH que a via intracarotídea é preferida porqueaumenta a sensibilidade do ensaio e menores quantidades de TRH podem ser usadas. Nesse estudo, osautores observaram a máxima depleção do TSH hipofisjrio administrando, aos ratos, altas doses de TRHjintètico. Com doses de 10 microgramas ( ̂ q), verificaram depleção quase imediata e determinaram altosníveis de TSH em soros coletados 10 minutos após a injeção dessa dose. MARTIN e REICHLIN188 'obtiveram em ratos respostas progressivamente maioros de TSH plasmático aumentando a dose do TRHadministrado que variou de 0,001 a cinco microgramas. Entretanto, somente a resposta s maior doseresultou em depleção significante do TSH hipofisário nos animais sacrificados 15 minutos após a injeçãodo TRH.

A literatura refere-se à existência de um ciclo circadiano de TSH em ratos, porém as observa-ções sobre este ritmo nictemeral não são concorde; e também são um tanto controversas(6,41,52,73,83,129,141,148) S e g u n d o o s trabalhos de BAKKE e LAWRENCE16' em ratos machos e deSINGH e cols. em fêmeas, verifica se que o TSH hipofisário se apresenta elevado as 8,00 horas,diminuindo respectivamente até as 13,00 e 15,00 horas; período no qual SINGH e cols. observaramuma relação inversa entre o TSH hipofisário e plasmático. Apesar de SCHINDLER e cols. 1 I nãoterem encontrado, em animais de ambos os sexos, flutuações significativas da concentração de TSHhipofisário, observaram níveis plasmáticos mais elevados pela /nanhã. Esta observação concorda com osresultados de JOBIN e SAMEL1731 e de DUCOMMUN e cols.1411 em ratos machos que encontraramníveis plasmáticos culminantes as 8,00 e 7,00 horas respectivamente. RETIENE e cols. estimando aconcentração hipofisária por um período de 24 horas evidenciaram alguma variação em ratos machos enenhuma flutuação em fêmeas. Estudando ratos de ambos os sexos, LEPPÀLUOTO e cols.'831 verifi-caram o valor mais alto de TSH serico as 11,00 horas nos machos e um aumento gradua! das 11,00 às15,00 horas nas fêmeas. FUKUDA e cols.'52 ' demonstraram nítida ritcimidade nictemeral do TSHplasmático de ratos machos, caracterizada pelo zènite à< 12,00 horas. A propósito, verifica-se que nasdeterminações de TSH em ratos os investigadores coletam as amostras na mesma hora do dia a fim deminimizarem as flutuações r* concentração desse ho rmôn io ' 7 ' 6 3 ' 7 5 ' 1 1 8 ' 1 * 3 ' 1 6 2 1 .

Considerando o ritmo circadiano de secreção d9 TSH e com o intuito de determinar o horárioem que a hipófise ê mais responsiva ao TRH, avaliou-se em estudo prévio a liberação do TSH hipofisáriopela administração de TRH sintético em ratos fêmeas, no período das 8,00 às 12,00 horas'16 '. Osresultados desta pesquisa sugeriram que entre 9,50 • 10,30 horas a glândula apresenta um nível detecreçJo de TSH elevado e quase constante'16'.

Baseando-se nas considerações acima expostas, procedeu-se h administração intracarotídea de10,jg de TRH sintético aos ratos, no período compreendido entre 9.50 a 10,30 hora», sacrificando-os10 minutos após a injeção.

4 — Paw dot Animais

Os rato» dos dois grupo* esiudados apresentava TI no início do experimento pesos iguais, nfoexistindo diferença siymf icante entre as médias de seus pesos iniciais (páginas 17 a 18).

34

Observou-se que os ratos alimentados oom dieta normoproteica por 30 dias, ganharam69.79 gramas, ao mesmo tempo em que os alimentados com dieta hipoproteica perderam 17.67 gramas.Tanto o acréscimo como o decréscimo de peso foram significantes quando analisados estatisticamente'(páginas 19 a 23 ), da mesma forma que se evidenciou existir diferença significante entre as médias do*pesos atingidos pelos ratos dos dois grupos estudados Ipágina 23).

Encontram-se na literatura relatos similares acerca da evolução do peso corpóreo de rato*em estudos sobre carência proteica. A perda de peso foi observada em estudos realizados comanimais mantidos em dieta proteics como também em estudos que utilizaram dieta hipoproteica,sendo o ganho de peso evidenciado nos respectivos controles, providos de dieta normoproteica12.30.42,47.122.150.151.169)

5 — Concentração de Proteínas Totais e Frações Protela* Sérias

As médias das concentrações séricas de proteínas totais e frações proteicas analisadas,foram significantemente menores, no grupo carente crônico proteico. quando comparadas às médiascorrespondentes do grupo controle; o que está de acordo com dados publicados sobre o assunto«1.42.77.98) ,p á g j n a s 2 3a27 ) .

O nível médio das proteínas totais obtido no grupo controle (7,52 g/100 ml) se aproximados citados por MÉNDE2 e MENCHÚ'91 ' (7,22 g/100 ml), CHANDRASEKHARAN I26)

(6.85 g/100 ml) e ACHILLES11' (7,90 g/100 ml) verificados em ratos alimeniaaos com dietasnormoproteicas, havendo maior similaridade com o nível observado por MÉNDE2 e MENCHÚ'91 ' ,antes de submeterem os animais a períodos de restrição alimentar, que utilizaram o mesmo métodode dosagem. Com relação ao grupo carente, o resultado obtido (5,69 g/100 ml) se assemelha aodescrito por MÉNOEZ e MENCHÚ191' (5,86 g/100 ml) em animais mantidos em dieta hipoproteica,sem subseqüente privado alimentar, • por MORGAN e PETERS108' (5,83g/100 ml) tACHILLES1" (5,47 g/100 ml) em animais alimentados com dietas aproteicas; como também aoobtido por CHANDRASEKHARAN126' (5,88 g/100 ml) em ratos submetidos durante 16 dias àprivação alimentar.

Verifica-se nos trabalhos da literatura que o fracionamento de soro normal de ratos, por eletro-forese em papel ou acetato de celulose, evidencia a presença de cinco trações proteicas. a saber: albu-mina, globulina alfa,, globulina alfaj, globulina beta e globulina gama1 8 7 -9 1 -1 3 2 '1 6 9 ' . No present*experimento, a análise eletroforétiea, realizada em fitas de acetato de celulose, revelou a existência demais uma fração, a pré-albumina (Figura 6). Entretanto, esta fração não toi observada no trabalho d*WEIMER e cols."70 ' • também nos trabalhos de E D O Z I E N ' 4 2 ' , de CHANDRASEKHARAN'26' e d*MAOI e CAMPOS1871 que utilizaram a mesma técnica de fracionamento.

Embora a concentração de pré-albumina tenha sido estimada em um pequeno número d*amostras, o valor médio observado no grupo carente crônico proteico, diminuído em relação ao grupocontrole, ujncorda com o estudo de INGELBLEEK169' em crianças senegalesas portadoras de má nutri-ção proteico-calórica, em que sugere esta determinação como um sensível indicador d* deficiênciaproteico-calórica.

O valor médio da concentração da albumina estimada no oruoo controle 12,63 Q/100 ml) ér.iparável aos valores relatados por WEIMER11691 (2,60 g/100 ml), KIRSCH a cols.177'

(2,82 g/100 ml) • CHANORASEKHARAN1"' (2,50 g/100 ml), referentes aos ratos controla, alimen-tado* com dieta normoproteica. Considerando-se a somatória dos valores médios das frações globulinas,•stimedat separadamente nos mesmos animais do último trabalho citado12*', igual a 4,35 gramas por100 mililitrot de toro, poder-se-fi estabelecer UWÊ correlação com o valor rrwtdio tstirrwJo no presenteestudo, que foi igual a 4,68 gramas por 100 mililitro» d* •oro (Tabela V).

O valor da concentração média d* albumina observada no grupo «rente crônico proteico

35

(2,30 q/100 ml), concorda com os resultados verificados em tiabalhos já mencionados, • l.itivos àsinvestigações realizadas com ratos submetidos a dietas aproteica (2,30 g/100 ml), ou contendo 5%de proteína antes de serem sujeitos à restrição alimentar (2,45 g/100 ml), ou 1% de lacto:

albumina1421 12,40 g/100 ml), ou 0.5% da mesma121 (2,22 g/100 ml) ou mesmo após 16 dias de privaçãoalimentar (2,24 g/100 ml). Baseando-se nas somas dos valores médios das frações globulinas anali-sadas individualmente em estudos já referidos '9 1 > , iguais a 3,39 e 3,65 gramas por 100 mililitros desoro respectivamente, verificar-se ia que as mesmas se aproximam do resultado médio obtido nos animaiscarentes do presente experimento, igual a 3,1'* gramas por 100 mililitros de soro (Tabela V).

Apesar de alguns autores terem observado nos ratos desnutridos níveis de albumina mais altos,ou mais baixos, ou mesmo níveis de globulina menores do que os verificados nos animais desnutridos dopresente trabalho i 4 ' ' * 2 ' 7 7 ' 9 8 ' 1 5 2 / 1 , as concentrações de proteínas totais ou frações proteicas, ouambas, analisadas em trabalhos já citados foram significantemnnte menores quando comparadas com asobservadas nos respetivos animais controle1' 2.4.26.42.77.91.98.1 52.1 691

En t re tan to , a propósito das frações globulinas, MÉNDEZ e MENCHÚ verificaramdiminuição significante apenas na subfração alfa, em ratos mantidos em dieta hipoproteica eCHANDRASEKHARAN nas subfrações alfa e beta em ratos submetidos à privação alimentar.WEIMER e cols. , alguns anos antes já haviam observado, em ratos sujeitos à moderada ou agudarestrição alimentar, níveis de proteínas totais séricas, albumina e globulinas alfai e beta significante-mente diminuídos e níveis de globulinas alfa; e gama normais ou aumentados. Eles concluíram que essasalterações não seriam primariamente um resultado de diferentes graus de hemodiluição, baseando-se nasd ive rgen tes respostas das subfrações séricas à realimentação. No mesmo sentido, MÉNDEZeMENCHú'9 1 ' e CHANDRASEKHARAN126' afirmam que se as alterações na hemoconcentração fossemo único mecanismo ativo, então todas as frações e subfrações «éricas deveriam estar alteradas, proporcio-nalmente, na mesma direção.

A hipoclbuminemia, bioquimicamente. é um achado invariável no desenvolvimento da mánu t r i ca ' o p roteico calónca e têm sido obtida experimentalmente em macacos, porcos e ratos(36,42.48,50,77,84,120.169) «IRSCH e -ois. '771 observaram que ratos alimentados com dieta hipopro-teica apresentaram diminuição de crescimento e hipoalbuminemia, distúrbios estes semelhantes aosapresentados por crianças portadoras de "kwashiorkor".

Segundo EDOZIEN , as alterações associates com má nutrição proteico calónca em ratos,incluem perda de peso corpóreo, perda de pelo e diminuição nas concentrações de proteínas totais ealbumina plasmáticas.

STEAD e BROCK1152(, estudando o efeito da depleção proteica em ratos jovens, precocementedesmamados, utilizaram como índices primários de má nutrição proteico-calórica, entre outros, níveis dealbumina e globulina plasmátícas, os quais se apresentaram diminuídos nesta síndrome carencial.

No presente estudo, os ratos alimentados com dieta hipoproteica desenvolveram os Sintcmasacima mencionados, indicando que eles foram mantidos em dieta o tempo suficiente para seremconsiderados deficientes proteicos.

Do ponto de vista nutricíonal, a proteína mais importante é presumivelmente a albumina.Existem evidências que em condições de carência dietética de proteínas o catabolismo de albumina éreduzido em homens e animais, e que a meia vida de albumina é prolongada em animais.

Em 19S7, GITLIN e JANEWAY1581 já haviam verificado em camundongo» que injestõesproteicat reduzidas conduziam • uma diminuição no catabolismo da albumina plesmática e umadiminuição na líntese da albumina.

Estudando o metabolismo dessa proteína series em crianças com má nutrição proteica, GITLINe cols.'671 concluíram em 1958 que na má nutrição a taxa catabólica de albumina não te alterava e quea hipoalbuminemia seria devido prinwiampnto è tíntese diminuída.

36

Entretanto, em 1962. PICOU e WATER LOW ( 1 1 0 > em estudo similar, g e r i r a m que a rápida

regeneração da albumina plasmática ocorrida em resposta ao tratamento de .crianças malnutrkJai, seria

produzida principalmente pela redução na taxa catabólica antes que por qualquer ejt,tm,ulação de síntese,

No mesmo ano, COHEN e H A N S E N 1 2 9 1 examinando a distribuição e a velocidade ,d,e renovação da

albumina em crianças com "kwashiorkjr", encontraram taxas absoluta de síntese e (fracionárias de

catabolismo diminuídas durante a deploção proteica e aumentadas após a recuperação.

FREf-MAN e GORDON em 1 9 6 4 ( 4 9 \ observaram em ratos deficientes proteiços, .redução nas

taxas absoluta e fracionária de catabolismo e aumento na meia vida da albumina.

KIRSCH e cols'7 8 1 em 1968, estudando a regulação da síntese e catabolismo da albumina em

ratos, verificar ím que a redução ou a retirada de proteínas da dieta causava um decréscimo na taxa de

síntese, presumivelmente mediante redução na utilização de aminoácidos. A taxa catabóJica continuava

normal, refletindo uma diminuição gradual na concentração plasmática e no tamanho de compartimento

da albumina. Em um certo nível crítico, seguia-se um decréscimo na taxa catabólica. Segundo esses

autores, isto seria, provavelmente, uma tentativa para conservar o compartimento de albumina em face

da iminente depleção. Conclusões similares foram descritas no mesmo ano por JAMES e HAY em

estudo com crianças desnutridas, alimentadas com die' - deficiente em proteínas.

Mais recentemente, MORGAN e PETERS 1 9 8 1 também verificaram em ratos desnutridos

diminuição na concentração sérica e biossíntese da albumina, sugerindo que a hipoalbuminemia

dever-st-ia á síntese diminuída que teria como fator limitante o suprimento de aminoácidos. Observaram

ainda que a concentração plasmática diminuía menos do que a taxa de síntese, possivelmente em raí^p

da simultânea redução na taxa catabólica, verificada anteriormente por KIRSCH e cols. '7 8 ' .

Conforme citam WATER L O W 1 1 6 7 1 , WATERLOW e A L L E Y N E * 1 6 8 ' , parece que quando «

ingestão proteica é reduzida, ooorre uma queda na taxa de síntese da albumina, conduzindo a um

pequeno decréscimo na concentração plasmática e na massa intravascular da albumina. Porém, a massa

intravascular é mantida por dois mecanismos adaptativos: transferência da albumina do compartimento

extravascular para o intravascular e redução na taxa carabólica.

6 - Concentração de Hormônio Tireotróf ico (TSH) no Soro

6.1 - Método de Dosagem do TSH

A similaridade imunológica entre o TSH bovino e o TSH de ratos proporcionou a muitos

i nvestigadores a elaboração de imunoensaios capazes de medirem o TSH no plasma de ratos(65,106,127,128,174)

O desenvolvimento de um sistema de radioímunoensaío para TSH de ratos foi descrito

inicialmente em 1966 por REICHLIN e cols. 1 1 2 8 ' . Este ensaio baseavase na inibição da ligação entre

TSH bovino e soro anti-TSH bovino pelo soro e extrato hípofitfrio de ratos.

WILBER 4 I / T I G E R ' 1 7 4 ' , no ano seguinte, desenvolveram um método de radioimunoensaio

suficientemente sensível para detectar o TSH no soro de ratos eutireóideos, empregando TSH de tumor

tireotrófico de camundongo marcado com 1 2 6 I a soro anti-TSH bovino. Nestes radioímunoensaios

heterólogos, os autores citados utilizavam padrdes de TSH b o v i n o 1 1 2 8 ' 1 7 4 1 .

Em 1970, REICHLIN e co ls . ' 1 2 7 1 e GARCIA • MORREALE OE E S C O B A R * " ' desenvolveram

radioimunoensaiot empregando TSH marcado bovino, soro anti-TSH bovino • extrato bruto da hípófises

de ratos, obtendo melhores resultados do que oom o uso da padrões de TSH bovino altamente purifi-

cado.

37

Mi-smo assim, a determinação do nível absoluto de TSH no plasma de ratos, por imunoensaio

de espécies cruzadas, era difícil e a conclusão final sobre a verdadeira concentração dependia do

isolamento e purificação do TSH desses animais. Somente após a obtenção de Ti 'H altamente purificado1

e soro anti-TSH específico pelo National Institute of Arthrits and Metabolic Diseases, National Institute

of Health, Bethesda, Maryland, U.S.A., foi possível a realização de radioimunoensaios completamente

homólogos para TSH de r a t o s 1 7 1 5 - 5 1 - 5 2 - 7 5 - 8 0 8 3 - 1 6 2 1 .

Neste trabalho, pelo motivo exposto, dosou-se o hormônio tireotrófico dos ratos por radioimu-

noensaio homólogo, utilizando a técnica do duplo anticorpo (páginas 7 a 15 ).

Os níveis basais de hormônio tireotrófico no plasma ou soro de ratos, referidos na literatura

quando dosados por radioimunoensaio homólogos são variáveis • - . Esta variabilidade depende

de certos fatores e já foram mencionados alguns fatores que alteram o nível de hormônio circulante:

temperatura1 7 3 '1 6 2 1 , estresse1 1 2 6-1 3 6 1 , manuseio dos animais1411, emprego de anestésicos'41 '88 ' ,

l u z 1 1 3 3 1 e horário da colheita de s a n g u e 1 4 1 - 5 2 ' 7 3 - 8 3 - 1 4 1 - 1 4 8 1 . Além desses fatores, deve-se considerar o

sexo do animal estudado; FUKUDA e cols.152 ' e BAKKE e cols.'7 ' verificaram que ratos macho»

apresentavam níve;s de TSH circulante mais elevados do que fêmeas.

Os níveis médios basais de TSH sérico. obtidos neste experimento (Tabela V I ) , aproximam-se

dos citados por TUOMISTO e cols. verificados em animais controle, expostos à temperatura

ambiente de 30°C e por FUKUDA e cols. '5 3 ' determinados no plasma de ratos fêmeas, antes de serem

submetidos a uma dieta deficiente em iodo.

6.2 - Depleção do TSH Hipof isário

Já se demonstrou que o hipotálamo produz uma substância reguladora, o hormônio liberador da

tireotrofina (TRH), que controla a liberação de hormônio tireotrófico da hipófise anterior. O hormônio

liberador è contido nas terminações nervosas da eminência média do hipotálamo e liberado na circulação

portahipofisária; seguindo até a parte distai da adenohipófise, onde atua na liberação do TSH. A

liberação do TSH da hipófise é estimulada pela T R H e inibida pelos níveis aumentados de hormônio»

tireóideos'1 8-2 1 ' .

0 isolamento e a identificação da estrutura do T R H (piroglutamil histidil prolina am ida) a partir

de centenas de milhares de hipotálamos suínos e ovinos por dois grupos diferentes nos Estados Unidos

da América, respectivamente, de SCHALLY e c o l s . 1 4 5 ' 1 0 3 ' 3 9 1 e de GUILLEMIN e cols.1231, com

subseqüente síntese, possibilitou a realização de estudos em animais sobre as interações hipotálamo-

hipófife-tireóideas, com maior precisão.

Os resultados de vários estudos fisiológicos conduzidos desde o início da década de 1960 com

preparações naturais de TRH, foram confirmados e ampliados com o uso do T R H sintético

(17,10,40,125.126.136,138) E J t u d o s posteriores revelaram que o T R H sintético possui a .nesma

atividade que o T R H natural 1 2 0 - 5 6 1 .

Tem sido estabelecido (,ue o T R H , por meio de um mecanismo de retro-regulação positiva,

estimula a liberação do TSH pré-formado e sua neo-síntese'9 6-1 1 8 ' . Estes dois efeitos podem ser parcial-

mente dissociados, sendo a síntese um processo mais lento e secundário ao efeito de liberação.

Estudos realizados com hipófisos bovinas mostraram que o T R H tricíado é ligado especifica-

mente is membranas receptoras hípofisár.as'811. Adenil ciclase, a enzina que cataliza a formação de

3',5'adenojirw monofosfato cíclico (AMP cíclico) está associada a essas membranas. A atividade da

«denil ciclase é estimulada pela adição de TRH, e o i derivativos do AMP cíclico também podem

estimular a liberação do TSH "in v i t r o " ' 1 6 3 ' . Assim, o TRH atua diretamente estimulando a célula

hipofísíria por meio da formaçio de AMP cíclico

38

A resposta ao TRH pelo, tecido hipofis.írio exige ions cálcio e traduz-se por um aumento dometabolismo oxidativo da glicose e piiuvato, mas não necessita nova síntese proteica ' .

Poderia ainda ser mencionada a possibilidade que o TSH circulante exerça controle direto sobrea secreção hipotalámica de TRH por meio da denominada retro-reguiação de alça curta.

Vários autores, analisando o efeito'do TRH exógeno no nível de TSH circulante, encontraramníveis aumentados em resposta a esse hormônio liberador ' • .

KIEFFER e cols. verificaram em ratos fêmeas imaturas que receberam TRH, nível de TSH(fl 11

12 vezes maior do que o de animais tratados com solução fisiológica e LEPPALUOTO e cols.observaram um incremento de aproximadamente seis vezes na concentração de TSH sérico de ratosfêmeas normais, em resposta à injeção de 50 microgramas de TRH.

Neste trabalho, após a administração de TRH, o grupo controle incrementou em cerca de 10vezes seu nível médio basal de TSH sérico, ao mesmo tempo em que o grupo carente sofro-j emacréscimo de 17 vezes (Tabela VI).

6.3 - Níveis de TSH na Desnutrição

Verificou-se, no presente experimento, após um período de 30 dias no qual os ratos foramsubmetidos à carência proteica dietética que o nível sérico basal de TSH não diferiu significantementeem relação aos respectivos níveis dos animais controle. Após o estímulo com o TRH exógeno, tanto osratos carentes como os controles tiveram um aumento significante nos níveis séricos de TSH, sendo esteincremento maior nos animais carentes (páginas 27 a 30).

Embora PIMSTONE e cols. '1 1 3 ' tenham encontrado níveis basais de TSH circulanteaumentados em crianças com má nutrição proteicocalórica, os dados obtidos no presente trabalhoconcordam com os descritos por GODARD e LEMARCHAND-BÉRAUD159601, GRAHAN e cols.1621,CHOPRA e SMITH1281 e INGENBLEEK e BECKERS1701 na má nutrição proteicocalórica, no marasmo• no "kwashiorkor"; por MERIMEE e FINEBERG1931 no jejum e por TRAVAGLINI e cols.11611 eVIGERSKY e cols. na anorexia nervosa que encontraram níveis basais normais de TSH circulante.

No entanto, são poucos os relatos existentes na literatura que mostra.ti efetivamente ummecanismo de retroregulação alterado para o sistema hipotálamo-hipofise-tireóideo

Na opinião de GODARO e LEMARCHAND BÉRAUD159-601 que estudaram crianças com mánutrição grave, a observação da atividade tireóidea diminuída e níveis normais de TSH basal seriacompatível com uma função adenohipofisária relativamente deprimida.

INGENBLEEK e BECKERS1701 sugeriram uma alteração no mecanismo de retroregulação paraexplicar a falta de correlação negativa observada entre as concentrações séricas de triiodotironina (Tj) eTSH en pacientes senegalese» com má nutrição proteicocalórica grave.

PIMSTONE a cols.'1131 descrevendo níveis basais de TSH elevados e respostas exageradas •prolongadas i estimulacâo pelo TRH em oito entre 24 crianças com desnutrição proteicocalórica,refutaram a hipótese de uma falha da supressão retro-reguladora pelos hormônios tireóideos circulantes,pois a administração da T , exógeno a esses pacientes suprimia prontamente o TSH basal. Propuseram,•ntio qua a cauta mais provável teria um distúrbio primário da funclo tiraóidea a qua a reserva de TSH«ria normal, argumentando contra o antigo conceito de uma pseudo-hiposectomia ocorrente nadetnutricão(1o1).

Embora na desnutrição a glândula tlreoide posta estar realmente alterada estrutural e•unctonalmenta1 3 0-4 3-4 4 '4 7-6 6 '»7-1 1 9 1 2 3 '1 4 7 '1 6 0 1 , e posta ter rn.no. retpontiva ao TSH, fato ette

39

contestado pelos trabalhos de STEPHENS 1 1 5 5 1 e de GAITONDE e T A W A L K A R 1 5 4 1 que encontraram

respostas tireóideas exageradas ou normais, respectivamente, "in vivo" ao fator tireotrófico e "in vitro"

ao TSH exógeno em animais malnutridos, estas alterações, seguramente, não são devidas, pelo menos

quantitativamente, à diminuição de TSH imunorreativo liberado pela hipofise. O conceito de uma

diminuída eficiência biológica do TSH na má nutrição, não foi comprovado, visto que o baixo valor da

relação entre as concentrações de radioiodo na tireóide e no soro (T/S) e a captação de iodo radioativo

pela tireoide, encontrados em ratos privados de proteínas, não aumentaram em resposta ao TSH

exógeno • . A deficiência iódica pode ser afastada teoricamente, conforme citam PIMSTONE e

cols. , considerando que ela levaria à hiperplasia glandular, fato esse não verificado na desnutrição.

A disponibilidade periférica hormonal parece também estar alterada em conseqüência ou como

causa das modificações no eixo hipotálamo hipófise tireóideo decorrentes da má nutrição. Assim, exceto

alguns .elatos de diminuição nos níveis de tiroxina (T.,) total com níveis normais ou alterados de T4

livre , provavelmente causada pela diminuição de proteínas transportadoras, a alteração mais

evidente è um decréscimo no nível de T i total e sua resposta normal ao TRH .

CHOPRA e SMITH sugeriram que o decréscimo de T , total, corrüpondente à diminuição

de T3 livre, com T4 total normal, observado em pacientes indianos com má nutrição proteicc-calórica,

provavelmente seria causado por um defeito reversível na conversão extratireóidea de T4 em T 3 .

Conclusões semelhantes foram relatadas nos estudos de INGENBLEEK e BECKERS realizados com

crianças senegalesas desnutridas e de MERIMEE e FINFBERG com adultos soometidos ao je jum;

esses autores atribuem a diminuição de T , a uma ineficiência da monodesiodação hepática de T 4 .

Portanto, parece estar bem fundamentado o achado de baixos níveis de T i e a manutenção de

um nível normal de T4 circulantes na desnutrição, o que teoricamente poderia ser explicado por várias

proposições.

A diminuição na concentração das proteínas transportadoras de T , poderia ser a causa dos

baixos níveis de T 3 circulante com subseqüente aumento na fração livre, pois a maior parte deste

hormônio está ligada a três proteínas sérícas; a globilina (TLG)1 , a albumina e em menor grau a

pré-albumina (TLPA) . Contribuem para esta hipótese as reduzidas concentrações de TLPA e albumina

encontradas na má nutrição proteico-calórica , porém os níveis de TLG são normais ou mesmo

aumentados . Logo, outros mecanismos devem estar envolvidos, visto que a diminuição das proteínas

transportadoras na desnutrição não poderia explicar a baixa concentração de T 3 livre observada por

alguns autores , bem como as concentrações de T 3 diminuídas com T 4 normal, considerando que a

tiroxina é transportada pelas mesmas proteínas séricas.

0 aumento do consumo periférico de T j acarretaria um incremento do consumo de oxigênio,

resultando em taxa metabólica basal elevada, situação não encontrada na eventualidade em

A síntese glandular alterada não encontra fundamentos visto que as análises qualitativas

realizadas por determinados autores, utilizando técnicas cromatográficas, mostraram distribuição normal

de iodoaminoácidos na desnutrição proteica exper imental ' 3 0 ' 1 2 2 ' . Considerando que apenas 30% do

nível de T j no sangue origina-te da secreção tireoidea, sendo a maior proporção do T 3 circulante

proveniente da monodesiodaçio periférica da t i r o x i n a ' 2 3 ' 1 4 3 ' 1 6 9 ' , mesmo a inexistência de secreção de

T j pela tireoide nío explicaria a considerável diminuição de T 3 observada na má nutrição.

Tem tido demonstrado que a dejíodaçio periférica da tiroxina pode ser processada de duas

format, multando na formação de T } ou de T 3 reverto ( r T } ) . Se o iodo e removido do anel fenólico,

forma-M 3,3',5-tríiodotironina ( T 3 ) ; quando a monodesiodacSo ocorre primeiro no anel tirosil, 4

formado 3,3',5'-triiodotironina reverta | r T 3 ) | 1 6 8 ) .

1 TLG Tlroxln» llgadi • globulini.2 TLPA. Tkoxln* Itgute • prt-albumlnt.

40

A conversão deficiente de T« em T 3 , levando à formação hepática de quantidades aumentadas

de rT 3 , com a recíproca de T 3 diminuída, observada recentemente por CHOPRA e cols.'271 em

pacientes com má nutrição proteico-calórica em Calcutá, fornece um possível esclarecimento para a baixa

concentração de T 3 observada na desnutrição.

Pode-se supor, portanto que a diminuição da frenação hipofisária na secreção de TSH, observada

nos ratos desnutridos do presente trabalho, quando submetidos a administração de TRH, é d-:orrente

desta imperfeita conversão extratireóidea de T 4 . Corrobora esta hipótese o fato da triiodotironina reversa

ser quase inativa, iião tendo participação nos mecanismos de retroregulação. Assim, N I C 0 0 e cols. ,

em recente trabalho, demonstraram que a administração de r T , exógeno não altera as concentrações

séricas basais de T 4 , T 3 , TSH e prolactina, ou mesmo as respostas séricas de TSH, prolactina e T 3 ao

TRH.

Com base na literatura consultada, este estudo permite supor que a diminuição da frenação

hipofisária na secreção de TSH, observada nos animais carentes em resposta ao TRH, possivelmente é

causada pela deficiente conversão periférica de tiroxina, ocorrente na desnutrição, levando à formação

hepática de quantidades diminuídas de triiodotironina ( T , ) , com a recíproca de T j reverso aumentadas.

Porém, deve-se considerar que a ocorrência de padrões anormais de respostas de TSH ao T R H ,

respostas atrasadas ou prolongadas, observadas na anorexia nervosa ' 3 2 - 1 6 1 - 1 6 6 ' , também podem sugerir

a existência de alterações hipotalãmicas na desnutrição.

Espera-se que estudos futuros sobre o conhecimento das alterações endócrinas na desnutrição

venham a concluir estas especulações, definindo o papel adaptativo hormonal do eixo

hipotálamo-hipófise-tireóideo nesta situação.

CONCLUSÕES

Nas condições experimentais em que este trabalho foi realizado e com a metodologia

empregada, os principais fatos observados foram:

1) O peso dos animais dos dois grupos estudados, semelhantes no início do experimento,

alter -use no decorrer do período em que foram submetidos às dietas normoproteica ou

hipoproteica. Os animais do grupo controle aumentaram de peso e os do grupo carente

crônico proteico tiveram seus pesos diminuídos.

2) As concentrações séricas das proteínas totais e das frações proteicas analisadas diferiram

entra os animais dos grupos controle e carente crônico proteico. Os valores médios das

proteínas totais, albumina e globulinas séricas foram significantemente menores ra grupo

carente.

3) Os níveis basais de tireotrofina (TSH) sérica dos animais dos grupos estudados não

diferiram significantemente entre si. O i animais dos dois grupos responderam ao

hormônio liberador da tireotrofina (TRH) sintético, apresentando seus níveis séricos de

TSH significantemente aumentando», sendo este incremento mais acentuado nos animais

submetidos a carência crônica proteica.

T a b * VI I I

P«o. «m Grama*, do* Ratot do Grupo Controla (GQ a do Grupo Submetido i Carência Crônica Proteica (GCCP)

Rato*

N?

GC1234

S6?89

1011

121314

I S

16

PaaaMcfcl

as82

114118

126116126110

94

1028992

123118

134

143

Dia

2

96107IIS123127120126115

109

115103100132132139143

Oia6

101104124135136143129120120125115

109

145144

147151

Dia7

115120136146

140138

139

126

121

132125112155154

155

155

Dia

9

124120142147

141140

144

137

128

140

133

120

158156

156

165

Dia

12

122125147155

150152

150

139

138

140146

124

165167

165

169

Dia14

131137148152154151

148

146

148

153158

131

170168

165

168

PESAGENS

Dia

16

134

140

160

163

163161

159150154

153158

136

171

163

162

175

Dia

19

141

151

165

166

164

166

153

148

154

153

157

138

176

171

168

177

Dia

21

144

157

163

165

162164

155

158

160

158166

141

183177

168

184

Dia

23

144152165169166166

165162168160168147188180

170

185

Dia

26

150

159

168

173

168

170

170

164

169

164

170

148

190

181

168

187

Oia

28

153165

169

176

170

175

170

165

173

160

175

147

198

194

170

193

Pato

final

Dia

30

165176177182176179180166186174177160200197180196

Continua...

Continuação di Tateia VIII

Ratos

N?

GC

17

18

19

20

21

22

23

24

XAP-

GCCP

1

2

3

4

S

6

iniciai

121

93

130

7694

89

77

90

105.08

21.09

93

96

99

100120

100

Da

2

128

96

146

78

99

89

77

62

111.54

21.75

81

81

93

96

112

92

Da

5

135

102

146

88

101

96

85

66

119.46

22.94

81

81

88

89

107

88

Dia

7

140

113

157

99

122

112

96

79

128.63

20.79

80

81

8b

86

106

83

Dia

9

151

119

164104

128

117

101

87

134.25

20.25

74

76

84

86104

81

Dia

12

149

118

166

115

134

124

111

98

140.38

19.83

7774

82

81

102

80

Dia

14

151

124

172

119

140

130

121

102

145.29

18.08

76

73

82

81

100

79

PESAGENS

Dia

16

154

125

172124

146

131

126

106

149,42

17,87

79

72

82

81

102

81

Dia

19

160

128

180

130

153

136

132

108

153.13

17,89

79

72

82

81

102

81

Dia

21

163

128

180141

164

150

143

117

157.96

16,3b

7971

82

80

103

81

Dia

23

164

136

190

143

165

155

147

116

161,29

16,98

78

68

80

80

104

83

Dia

26

170

135

193

146

171

158

144

121

164,04

16,95

78

68

78

80

105

84

Dia

28

174

138

197

159

177

170

165

126

169,13

17,24

76

65

78

81104

82

PMo

final

Dia

30

175

143

200

161

182

172

167

127

174,88

16,78

76

65

78

81

100

81

Continua. . .

Continuarão da Tateia VIII

Rato*N»

GCCP

7

89

to11

12131415161718192021?22324

Xd.p.

Ptto

inicial

102

102

122

92

9191949093

11912111412196

10291

107

105

102.5411.09

Oi*

2

98

100

115

87

8786898687

11011410611484

9189

104

96

95.7511.09

Dia

5

97

94

115

84

8186878685

108114

10511484

8889

10495

93.7511.34

Dia

7

91

90

109

84

8186878078

10611410311484

8886

104

95

91.7111.53

Dia

9

89

84108

80

80

81837978

104114

10211384

9082

104

93

89,7112,31

Dia

12

87

82108

78

7881837978

104114

100111

818482

10392

88.3812.33

Dia14

8578

108

78

7780

827575

104114

100111818882

10392

87,67

12,81

PESAGENS

Dia

16

85

81110

77

7678817372

103114

10011181

9282

102

91

87,7513,16

Dia

19

85

81110

74

7677

807474

103114

9811081

9281

102

91

87,5013,06

Dia

21

85

81

116

74

7677

807676

102114

9811080

9181

10291

87,7513,48

Dia

23

85

81

114

74

7677808077

100109

96107

80

9081

10291

87,2112,63

Dia

26

85

81

118

74

7677807474

100109

96107

80

8880

10190

86,7913,38

Dia

28

82

76

114

72

7677

807777

100" 105

9610676

8780

10190

85,7512,99

Peto

final

Dia

30

81

74

110

72

7677

8074

76

97104

9610676

8860

101

88

84,8812,40

X : Medi»d.p.: Desvio padrão

Tateia IX &

Variação do Paso. am Gramas, dos Ratos do Grupo Controle (GO a do Grupo Carente Crônico Proteico (GCCP). Os Valores desta TateiaForam Calculados a Partir dos Pesos Estimados em cada Dia de Pesagem. No Decorrer do Período Analisado, com Relação ao Peso Inicial

RatosN?

GC1

23456780

10111213141516171819

Da2

11

15151405

15131489

14

5073

16

DiaS

161210171027

310262326172226138

149

16

Dia7

30282225142213162730362032362112192027

Dia9

39282829152418273438442835382222302634

Dia12

37333337243624294438573242493126282536

ACRÉSCIMO DE

Dia14

46453434283522365451693947503125303142

Dia16

49484645374533406051694448452832333242

PESO

Dia19

56595148385027386051

6846535334

34393550

Dia21

596549473648294866567749605934

41423550

Dia23

59605151405039527458795565623642434360

Dia26

656754554254445475628156676334

44494263

Dia28

687355584459445579588655757636

50534567

Dia30

80846364496354569272886877794653545070

Continua...

GMitmuftçio da Tabab IX

Ratos

GCao31222324

X<tp.

GCCPt

23

4567

89

1011

D M

2

2S0

02

6.465.58

1215648842

7

54

D M

5

1277

86

14.387.24

121511

1113125878

10

D M

7

2328231919

23,426.67

1315141414171112138

10

Dia9

2834282427

29.176.87

1920151416191318141211

Dia12

3940353438

35,297.85

162217

1918201520141413

ACRÉSCIMO DE

Dia14

4346414442

40,2110,44

Dia16

485242

4946

44,339,23

DECRÉSCIMO DE

.

172317

1920211724141414

142417

1918191721121515

PESO

Dia19

5459475548

48,0410.00

PESO

1424

17

1918

191721

121815

Dia21

657061

6657

52.8812.58

1425172017

191721

61815

Dia23

6771

66

7056

56,2111,87

1528192016171721

81815

Dia26

7077696761

63,9215,12

1528

212015161721

41815

Continua.

Dia28

838381

8866

64,04

15,14

1731211916182026

82015

Dia30

858883

9067

69,79

14,62

1731211920192128

12

2015

Continuação da Tateia

Ratos

N?

GCCP

121314151617

1819

20

21222324

X<tp.

Dia2

S54

697

87

1211239

6.79

3.34

IX

Dia

5

57

4

8

11

7

97

121423

10

8.79

3.48

Dia

7

57

10

15

13

7

117

121453

10

10.83

3.69

Dia9

10111115157

128

12129

312

12.83

4.02

Dia

12

101111

1515

7

1410

15

1894

13

14.17

4.35

DECRÉSCIMO DE

Dia14

11121518157

1410151494

13

14.88

4.77

Dia16

13131721167

141015109

414

14.79

4,55

PESO

Dia

19

14

14

16

1916

7

1611

151010

514

15.04

4,36

Dia21

14141417177

1611

161110

514

14,79

4.73

Dia23

14

14

10

16

19

12

1814

16

1210

514

15,33

4,71

Dia26

14

14

16

1919

12

1814

161411

615

15,75

4,85

Dia

28

14

14

13

1619

16

1815

201511

615

16,79

5,19

Dia30

14

14

16

1722

17

1815

201411

617

17.67

5,18

X : Média

d.p.: Dasvio padrio

47

w

oV)

a.

d

• 0

6 0

4 0

20

0

-20

- 4 0

0RUP0

— GRUPO

CONTROL!

CARENTE

i 1

(OC)

(6CCP)

2 14 I f \\ ti

• 2 .

23

• -1

^ *

7 3 7

,173

^ ^

i

26 28DIAS

r ,(IUM 9 - Variaçfo do Peso Corpóreo doi Ratoi Mantidos com Dietas Controla (GO ou Carente CrônicaProteica (GCCP). A Indinaçlo da> Retks foi Calculada por Regreufo a Partir dos ValoresMédioi Estimados em Ceda Dia da Pesagem no Decorrer do Período, com Relação ao ValorMédio da Pesagem Inicial (dia 0)

48

Tabela X

Concentração dt Protein»» Totais. Pré-Albumina. ARtumina • Gktbulinas no Soro dot Ratos

do Grupo Controle (GO a do Grupo Submetido i Carência Crônica Prottíca (GCCP)

Ratos

N?

GC

i

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

Xdp.

Proteínas Totais

g/100 ml

7,08

l.M

7,76

7,82

7,66

7,52

7,40

8.30

7,62

8.32

7,50

8,12

7.96

7,30

6,44

7,60

7,90

6,92

8,18

8,02

7,20

7,32

6,62

6,78

7,52

0,52

Pré-Atbumina

9/IOO ml

0,18

0,20

0,26

0,26

0,23

0,04

Album ina

g/100 ml

2,31

2.59

3,06

2.74

2.80

2.54

2,53

3.35

2.48

2,91

2.31

3.13

2,37

2.36

2,40

2,95

2,53

2.25

2,79

3.21

2,91

2,27

2,13

2,19

2,63

0,35

Globulinas

g/100 ml

4.69

4.44

4,55

4.84

4,72

4.75

4.74

4.75

4.95

5,22

5.06

4.74

5,37

4,83

3,85

4.36

4,99

4.60

5,31

4,66

3,71

4,73

4,24

4,21

4,68

0,41

Continua.

49

Continuado da Tabela X

Ratos

N?

GCCP

1

2

3

4

6

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

d.p.

Proteínas Totais

S/100 ml

6,10

4,82

6,26

5,48

6,00

6,28

5,60

6,36

5,80

5,32

5,78

5,40

5,54

5,72

5,60

6,24

5,88

5,40

6,48

4,08

5,10

5,92

6,14

6,18

5,69

0,55

Pré-Albumina

g/100 ml

0,16

0,13

0,16

0,16

0.02

Albumin»

g/100 ml

2 61

2,15

2,29

2.24

1,93

2,47

2,25

2,44

2,82

2,27

2,39

2,35

1,88

2,19

2,11

2,48

2,48

2,01

2,81

1,60

2,57

2,32

2,43

2,05

2,30

0,29

Globulinas

g/100 ml

3,21

2,55

3.67

3,13

3,87

3.54

3.12

3,64

2,74

2,81

3,07

2,89

3,40

3,22

3,25

3,43

3,11

3,09

3,24

2,31

2,35

3,45

3,43

2,94

3,14

0,40

X : MM'a

d.p. : Desvio ptdrio

50

Figura 10 - Rapraiantaofo Gráfica da Curva Padrfo da SAB Ajuittda para Uitura dat Protarnai TotaiiSéricai Ai ConoartraçSat OotkJai a Partir da Rata da Ragraufo Linaar, Foram Expreua»•m Gramai da Proteína por 100 mllllltroi da Soro a Muhiplicadai pelo Fator da Diluiclodai Amoitraid : 400)

51

Tabela XI

Concentração de Hormônio Tireotrófioo (TSH) no Soro dos Ratos do Grupo Controle (GO e

do Grupo Carente Crônico Proteioo (GCCP), Antes e Apôs o Estímulo pelo

Hormônio Liberador da Tireotrofina (TRH)

Ratos

N?

GC

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

Kd.p.

Antes TRH

(ng TSH/ml)

114,00

174,33

413,73

308,27

199,13

287,53

111,40

314,27

360,87

329,40

238,90

145,37

158,17

136,43

247,80

250,40

120,40

197,07

216,13

216,13

211,37

326,80

108,53

226,33

225,63

85,53

Após TRH

(ng TSH/ml)

1 983,50

2 363,50

2 795,00

2 198,67

1 692,00

1 950,00

2 813,00

2 550,00

1 275.00

2 172.00

3 071,67

1 560,00

2 646,67

1 881,33

2 875,33

2 917,00

1 575,00

1 669,00

2 023,33

3 048,67

1 318,00

1 872,00

1 676,67

2 056,33

2 165,99

656,38

Diferença

(ng TSH/ml)

1 869,50

2 189,17

2 381,27

1 890,40

1 492.87

1 662,47

2 701,60

2 235,73

914,13

1 842,60

2 832,77

1 414,63

2 488,50

1 744,90

2 627,53

2 666,60

1 454,60

1 471,93

1 807,20

2 832,54

1 106,63

1 b45,20

1 568,14

1830,00

1940,46

649,82

Continua...

52

Continuação da Tabola XJ

Ratos

N?

GCCP

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

X.d.p.

Antes I R H

(ng TSH/ml)

154,80

137,47

314,27

100.73

209,67

210,33

179,97

206,77

222,40

140,77

283,47

236,00

171,57

305,33

175,27

380,47

166,73

200,20

264,60

139,00

266,43

356,47

309,50

302,60

226,45

75,32

ApósTRH

(ng TSH/ml)

2 719,00

4 059,00

4 563,83

3 565.67

3 138,83

3 381,50

4 059,00

3 910,00

3,118,67

2 079,00

3 493,67

3 459,33

5 285,33

3 547,67

3 416.00

3 533,67

3 410,83

3 188,33

4 435,00

4 421,33

3 547,67

3 640,33

3839,00

3 402,67

3646,47

639,66

Diferença

(ng TSH/ml)

2 564,20

3 921,53

4 249,56

3 464,94

2 929,16

3171,17

3 879,03

3 703,23

2 896,27

1 d38,23

3 210,20

3 223,33

5113,76

3 242,34

3 240,73

3153,20

3 244,10

3 288,13

4 170,40

4 282,33

3 281,24

3 283,88

3 529,50

3 100,07

3420,02

639,96

X : Media

d.p. : Desvio padrSo

53

ABSTRACT

in basalThe purpose of the present work was to evaluate the influences of a protein-deficient diet on rat TSH levelt.conditions and after TRH administration.

Two groups of animals were studied, each on* comsxnad by 24 ret» One group was fed with a normal-proteindiet, with casein content of 16% (control group), and the other was fed with a protein-deficient diet, with a caseincontent of 3%.

The animals were kept in an air-conditioned room, with controlled temperature and exposed to naturaldaylight; the experiment lasted 30 days, during which time the animals received food and water "ad libitum".

During the experiment the rats weight was periodically controlled, and its variation analyzed.

At the end of the experience, the total serum protein, albumin, globulins and TSH concentrations weremeasured. The latter concentration was determined before and after intracarotid administration of 10 mkrograms ofsynthetic for each animal, at a predetermined time, by a radioimmunoassay technique using a double antibodytechnique to separata free and intibody bound labelled TSH.

The data were statistically evaluated according to appropriate methods.

The animals that, ir the two groups studied had similar average initial weight, showed during the experimentalperiod different pattern of weight variation: the control had a weight increase whereas the protein-deficient groupshowed a decrease (p <0,001)

The concentration of total serum proteins, and protein fractions analyzed, presented significantly lower valuesin the protein-deficient group, when compared to the control group ( <0,001).

The basal level of serum TSH was not significantly different in the two groups studied. After TRHadministration, the control group had approximately a tenfold increase in its average basal TSH level, while theprotein-deficient group showed a seventeenfold increase significantly higher in the latter tp <0,CO1).

The present work demonstrated an exaggerated TSH release in responsa to TRH in tha protein-deficientanimals, though there was no evidence of an alteration of the basal levels.

The» result» wara discussed on the basis of the existent literatura related to chnwat and experimentalmalnutrition. The increased responsiveness to TRH in protein-deficient animals it probably related to the reducedmodulation of pituitary TSH secretion by lowar trüodothy nine level* dua to deficient extrathyroidal thyroxineconversion.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Faculdade de Ciências Medicai e Biológicas de Botucatu].

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54

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