conselho nacional de desenvolvimento científico e tecnológico

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Biociências

Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia

Área de Concentração: Psicologia Fisiológica

Plasticidade de células tronco mesenquimais de

medula óssea de ratos na presença de meio

condicionado do nervo facial e do fator de

crescimento fibroblástico 2

Eudes Euler de Souza Lucena

Natal - RN

2014

Eudes Euler de Souza Lucena

Plasticidade de células tronco mesenquimais de medula óssea de

ratos na presença de meio condicionado do nervo facial e do fator de

crescimento fibroblástico 2

Estudo apresentado ao Programa de Pós-Graduação

em Psicobiologia, área de concentração Psicologia

Fisiológica, da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, como requisito para a defesa de doutorado.

Orientador: Professor Doutor Jeferson de Souza Cavalcante

Co-orientador: Professor Doutor Fausto Pierdoná Guzen

Natal - RN

2014

DEDICATÓRIA

À minha família Maria dos Anjos, João Bosco, Fernanda Mara e Alessandra Marinho, dedico a

vocês esse trabalho, que estão ao meu lado e que me fazem sentir seguro a cada passo dado.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, pelo simples fato de que sem Ele, nada existiria. A meus professores e orientadores, Fausto Pierdoná Guzen e Jeferson de Sousa Cavalcante, pelo

apoio constante e incondicional e por despertarem em mim, dia após dia, o desejo de aprofundar meus conhecimentos e a prática docente. Por seus ensinamentos, por suas amizades, pelo caráter de vida que vocês representam e pelo incentivo a participar desse fascinante projeto, muito obrigado.

Aos meus pais João Bosco e Maria dos Anjos, pelo eterno exemplo de sabedoria, ética, moral, amor,

dedicação e persistência. Tudo o que sou, como pessoa, devo a vocês. Vocês são o meu porto seguro. A distância geográfica dos últimos dez anos, apenas ratificou o tamanho do nosso amor e da nossa cumplicidade, obrigado por essa conquista. Agradeço por toda estrutura que recebi durante minha vida para chegar até aqui.

A minha irmã Fernanda Mara, pelo amor, respeito e amizade que a cada dia nos une mais. Você é

exemplo de dignidade, competência, garra e amor, que muito me orgulha. Muito obrigado por você existir. À Alessandra Marinho, por ter sido incansável durante esses anos de formação, pelo constante

apoio, amor incondicional e companheirismo. Ainda que eu tentasse, não seria capaz de exprimir toda gratidão e amor que tenho por você.

Ao Profº. Rodolfo Lopes, que ao longo dessa caminhada tornou-se um grande amigo e companheiro. Nunca aprendi tanto em tão pouco tempo. Muito obrigado pela eterna paciência, pelo altruísmo intelectual e “oportunidade” de acompanhá-lo. Serei eternamente grato a tudo que você fez por mim.

A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia da UFRN, em especial aos

professores, Expedito Júnior e Miriam Estela pela vasta bagagem intelectual adquirida durante esses dois anos de convivência. Foi um privilégio a oportunidade de participar de inúmeros debates de construção e reconstrução do pensar a neuranatomia.

Ao professor Francisco Gilberto, tão valioso na construção do projeto, durante o transcorrer da

disciplina Tópicos Avançados em Psicobiologia, e depois pela forma sempre atenciosa com que me tratou. A todos os amigos do LENQ, em especial a André Pontes, Felipe Fiuza, Janaina Borda, Kaio

Azevedo e Rovena Clara pela forma sempre carinhosa e respeitosa com que me receberam e trataram durante todo esse caminhar.

A Caio Fonseca, Dayanne Elias e Mitally Vieira, pela incansável parceria. Sou muito agradecido a

constante presença de vocês, principalmente nos momentos em que precisei me ausentar. Aos colaboradores Cléber Malhmam e Salvador Vieira, peças chaves na execução da pesquisa, sendo

modelos de dedicação. Aos professores Ângelo Roncalli, Carlos Augusto Barbosa, Gustavo Quedes Emiliano, Kenio Lima,

Osiel Benedito de Almeida e Ruthnaldo Rodrigues, pelos ensinamentos transmitidos da graduação até o docência, sendo exemplos de mestres. Vocês são inspiração, pela grande experiência.

A Maria Jocileide e Worgelsanger Pereira, pela presteza e carinho com que sempre me receberam

no BIOMOL, sempre muito cordiais, pacientes e solícitos quando requisitados nas orientações de nosso estudo.

Aos professores e amigos Fábio Andrey e Hécio Henrique pela amizade e parceria, pelos ensinamentos e pela hospitalidade e carinho sempre dedicados a mim. Espero um dia, poder retribuir ao menos parte do que recebi de vocês.

A todos os amigos de Natal e Caicó, em especial a Handerson Raphael, Marcone Rogério, Ricardo

Bezerra, Roberto José e Sandro Alex pelo incentivo e por terem me ajudado a entender, que a amizade verdadeira independe de diferenças como idade ou ideologia. Você são grandes parceiros.

A todos os profissionais da Universidade do Estado Rio Grande do Norte e da ADUERN, especialmente os parceiros de trabalho diário nos departamentos de Odontologia e Enfermagem. Muito obrigado.

Ao Colégio Diocesano Seridoense por toda estrutura, suporte, investimento e educação que recebi durante os ensinos fundamental e médio e por terem acreditado no meu potencial.

A todos os meus alunos, por me ensinarem a lecionar a cada dia. Muito obrigado!

Resumo

Uma série de evidências mostra a influência do meio no crescimento de fibras nervosas

lesadas no Sistema Nervoso Periférico (SNP), assim como o potencial do implante de

Células Tronco (CTs) em tornar esse meio mais propício à regeneração nervosa. Nessa

perspectiva, esse estudo teve como objetivo avaliar a plasticidade de células tronco

mesenquimais (CTMs) da medula óssea de ratos diante da presença de meio de cultura

condicionado com explantes de nervo facial (D-10) e fator de crescimento fibroblástico-2

(FGF-2). Dessa maneira as células mesenquimais foram cultivadadas com meio DMEM

(grupo 1), só com meio D-10(grupo 2), só com FGF-2(grupo 3) ou com meio D-10 e FGF-

2(grupo 4). O crescimento e a morfologia celular foram avaliados ao longo de 72 horas.

Além disso, a avaliação fenotípica foi feita a partir da imunocitoquímica para GFAP, OX-42,

MAP-2, β-tubulina III, NeuN e NF-200 no quarto dia de cultivo. As células cultivadas com

meio condicionado sozinho ou combinado com FGF-2 demonstraram características

morfológicas semelhantes a neurônios e células gliais e uma significativa atividade

proliferativa nos grupos 2 e 4 ao longo dos dias. As células cultivadas com meio

condicionado desprovido de tratamento com FGF-2 adquiriram fenótipo glial demostrando

imunorreatividade para GFAP e OX-42. As células cultivadas com meio condicionado com

adição de FGF-2 expressaram GFAP, OX-42, MAP-2, β-tubulina III, NeuN e NF-200. Em

média, a área e perímetro das células do grupo 2 positivas para GFAP e a área das células

imunomarcadas para OX-42 foram maiores do que as do grupo 4. O estudo possibilitou a

plasticidade de células mesenquimais (CMs) numa linhagem neuronal e glial e abriu

perspectivas para busca de novas técnicas com terapia e transdiferenciação celular.

Palavras-chave:

Células tronco; fatores de crescimento fibroblastos; medula óssea; nervo facial;

plasticidade; ratos.

Abstract

A number of evidences show the influence of the growth of injured nerve fibers in Peripheral

Nervous System (PNS) as well as potential implant stem cells (SCs) to make it more

suitable for nerve regeneration medium. In this perspective, this study aimed to evaluate

the plasticity of mesenchymal stem cells from bone marrow of mice in the presence of

culture medium conditioned with facial nerve explants (D-10) and fibroblast growth factor-

2 (FGF-2). In this perspective, the cells were cultivated only with DMEM (group 1), only

with D-10(group 2), only with FGF-2(group 3) or with D-10 and FGF-2(group 4). The

growth and morphology were assessed over 72 hours. Quantitative phenotypic analysis

was taken from the immunocytochemistry for GFAP, OX-42, MAP-2, β-tubulin III, NeuN

and NF-200 on the fourth day of cultivation. Cells cultured with conditioned medium alone

or combined with FGF-2 showed distinct morphological features similar apparent at certain

times with neurons and glial cells and a significant proliferative activity in groups 2 and 4

throughout the days. Cells cultived only with conditioned medium acquired a glial

phenotype. Cells cultured with FGF-2 and conditioned medium expressed GFAP, OX-42,

MAP-2, β-tubulin III, NeuN and NF-200. On average, area and perimeter fo the group of

cells positive for GFAP and the área of the cells immunostained for OX-42 were higher than

those of the group 4. This study enabled the plasticity of mesenchymal cells (MCs) in

neuronal and glial nineage and opened prospects for the search with cell therapy and

transdifferentiation.

Keywords:

Stem cells; fibroblast growth factors; bone marrow; facial nerve; plasticity; rats.

Lista de Quadros, Tabelas e Figuras

Lista de Quadros

Quadro 1. Lista de aticorpos primários e secundários ...............................................40

Lista de Tabelas

Tabela 1. Fatores de crescimento utilizados na regeneração periférica e seus respectivos

alvos..................................................................................................................25

Tabela 2. Descrição da amostra dos grupos 1,2,3 e 4 de acordo com o número celular..50

Tabela 3. Descrição da amostra dos grupos 1,2,3 e 4 de acordo com o perímetro celular

.........................................................................................................................53

Tabela 4. Descrição da amostra dos grupos 1,2,3 e 4 de acordo com a área celular......56

Tabela 5. Descrição de amostra positiva para GFAP e OX-42 dos grupos 2 e 4 de acordo

com o número celular...........................................................................................71

Tabela 6. Descrição da amostra positiva para GFAP e OX-42 dos grupos 2 e 4 de acordo

com o perímetro celular........................................................................................71

Tabela 7. Descrição da amostra positiva para GFAP e OX-42 dos grupos 2 e 4 de acordo

com a área celular...............................................................................................72

Lista de Figuras

Figura 1. Anatomia do nervo facial.........................................................................18

Figura 2. Modelo de degeneração e remielinização axonal.........................................22

Figura 3. Células multipotentes derivadas de estroma ósseo......................................28

Figura 4. Extração e cultivo de células mesenquimais de osso longo...........................33

Figura 5. Troca de meio de cultura celular...............................................................34

Figura 6. Acesso cirúrgico nos ramos do nervo facial (#mandibular, *bucal)................35

Figura 7. Remoção do perineuro dos ramos nervosos................................................35

Figura 8. Placas P60 com meio condicionado por explantes de nervo facial..................36

Figura 9. Células precipitadas após centrifugação.....................................................37

Figura 10. Câmara de Neubauer para contagem celular............................................38

Figura 11. Delineamento do estudo: formação dos grupos e observação celular...........39

Figura 12. Campos de observação celular em placas P60...........................................41

Figura 13. Células mesenquimais confluentes antes do primeiro subcultivo(10x). Escala:

100 µm..............................................................................................................46

Figura 14. Explantes de nervo facial reativos. Painel A:4x. Painel B: 10x. Escala: 100µm

.........................................................................................................................47

Figura 15. Ramo mandibular do nervo facial dissecado: painel A:4x. Explante de nervo

facial viável sob magnificação de lupa esteriológica: painel B.....................................47

Figura 16. Morfologia das células mesenquimais após a formação dos grupos experimentais

por 72 horas. Grupo 1: Painéis A (24 horas), B (48 horas), C (72 horas); Grupo 2: Painéis

D (24 horas), E (48 horas), F (72 horas); Grupo 3: Painéis G (24 horas), H (48 horas), I

(72 horas); Grupo 4: Painéis J (24 horas), K (48 horas), L (72 horas). Escala: 100

µ.......................................................................................................................48

Figura 17. Aspecto morfológico das células mesenquimais. Grupo 2: painéis A (Célula

bipolar) e B (Célula com prolongamento secundário); Grupo 4: painéis C (Célula com

prolongamento primário) e D (Célula tripolar) (10x). Escala: 100 µm ........................49

Figura 18. Número de células mesenquimais observadas em cada grupo experimental de

acordo com o dia de observação. P valores (a=0,047; b=0,004; c=0,024; d=0,001;

e=0,001; f=0,0085)............................................................................................51

Figura 19.Número de células mesenquimais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com o

grupo experimental. P valores (a=0,006; b=0,0027; c=0,001; d=0,001; e=0,001;

f=0,001; g=0,002; h=0,001; i=0,001; j=0,001; k=0,001, l=0,001; m=0,001;

=0,001).............................................................................................................52

Figura 20. Perímetro de células mesenquimais observadas em cada grupo experimental de

acordo com o dia de observação.............................................................................54

Figura 21. Perímetro de células mesenquimais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com

o grupo experimental...........................................................................................55

Figura 22. Área de células mesenquimais observadas em cada grupo experimental de

acordo com o dia de observação............................................................................57

Figura 23. Área de células mesenquimais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com o

grupo experimental..............................................................................................58

Figura 24. Células mesenquimais do grupo 2 submetidas a imunofluorescência do anticorpo

GFAP (Alexa Fluor 488) (4x) Escala: 100 µm ............................................................59


OX-42 (TRITC) (4x) Escala: 100 µm .......................................................................59

Figura 26. Células mesenquimais do grupo 4 submetidas a imunofluorescência dos

anticorpos GFAP (Alexa Fluor 488): painel A, OX-42 (Alexa Fluor 594): painel B, MAP-2

(Alexa Fluor 488): painel C, β-tubulina (FITC): painel D, NeuN (Alexa Fluor 488): painel E,

NF-200 (Alexa Fluor 488): painel F. (4x). Escala: 100 µm .........................................60


GFAP (Alexa Fluor 488). Painéis A,B,C,D (10x). Escala: 100 µm ................................61


OX-42 (TRITC). Painéis A,B,C,D (10x). Escala: 100 µm .............................................62


anticorpos GFAP (Alexa FLuor 488): painel A, OX-42 (TRITC): painel B (20x). Escala:

100µm ..............................................................................................................63


GFAP (Alexa Fluor 488). Painéis A,B,C,D (10x)..Escala: 100 µm..................................64


OX-42 (TRITC). Painéis A,B,C,D (10x)..Escala: 100 µm.............................................65


MAP-2 (FITC). Painéis A,B,C,D (10x)..Escala: 100 µm................................................66


β-Tubulina (FITC). Painéis A,B,C,D (10x)..Escala: 100 µm..........................................67


NeuN (Alexa Fluor 488). Painés A,B,D,F (10x). Painel E (4x). Painel C (20x). Escala: 100

µm....................................................................................................................68


NF-200 (Alexa Fluor 488). Painés A,B,D,F (10x). Painel E (4x). Painel C (20x). Escala: 100

µm....................................................................................................................69


anticorpos GFAP (Alexa Fluor 488): painel A, OX-42 (TRITC): painel B, MAP-2 (Alexa Fluor

488): painel C, β-tubulina (FITC): painel D, NeuN (Alexa Fluor 488): painel E, NF-200

(Alexa Fluor 488): painel F. (20x). Escala: 100 µm....................................................70

Figura 37. Número de células mesenquimais observadas nos grupos 2 e 4 positivas para

GFAP e OX-42. P valores (a=0,340; b=0,931)..........................................................73

Figura 38. Perímetro de células mesenquimais observadas nos grupos 2 e 4 positivas para

GFAP e OX-42. P valores (a=0,001; b=0,001)..........................................................74

Figura 39. Área de células mesenquimais observadas nos grupos 2 e 4 positivas para GFAP

e OX-42. P valores (a=0,001; b=0,041)..................................................................75

Lista de Abreviaturas

°c: grau Celsius

µg: Micrograma

µl: Microlitro

µM: Micromolar

µm2: Micrometro quadrado

ASG: Aferente Somático Geral

AVE: Aferente Visceral Especial

AVG: Aferente Visceral Geral

BDNF: Fator neurotrófico derivado do cérebro

BSA: Albumina de soro de boi

CO2: Gás Carbônico

CM: Célula mesenquimal

CS: Célula de Schwann

CSF-1: Fator de crescimento de colônia-1

CT: Célula tronco

CTM: Célula tronco mesenquimal

D-10: Meio condicionado

DMEM: Dulbeco´s Modified Eagle´s Medium

EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético

EVE: Eferente visceral especial

EVG: Eferente Visceral Geral

FGF-2: Fator de crescimento fibroblástico-2

GFAP: Proteína ácida fibrilar glial

HCl: Ácido clorídrico

IGF: Fator de crescimento tipo insulina

IL-1: Interleucina-1

L-15: Meio Leibovitz 15

LIF: Fator inibidor de leucemia

M: Molar

ml: Mililitro

NeuN: Marcador nuclear neuronal

NF200: Neurofilamento 200

MAP-2: Microtúbulo 2

mm: Milímetro

mM: Milimol

NaCl: Cloreto de sódio

NGF: Fator de crescimento neural

NT-3: Neurotrifina-3

PBS: Tampão fosfato

rpm: Rotações por minuto

SNC: Sistema nervoso central

SNP: Sistema nervoso periférico

TGF: Fator transformador de crescimento

TNF-: Fator de crescimento tumoral-

UERN: Universidade do Estado do Rio Grande do Norte

UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Plasticidade de CTs mesenquimais na presença de meio condicionado e FGF-2 em ratos.

15

Sumário

1. Introdução ................................................................................................. 16

1.1. Aspectos anatômicos do nervo facial ................................................................ 17

1.2. Regeneração no SNP e ambiente de lesão ......................................................... 20

1.3. Fatores neurotróficos ...................................................................................... 24

1.4. Terapia com CTs e regeneração nervosa ........................................................... 27

2. Objetivos ................................................................................................... 31

2.1. Geral ............................................................................................................ 31

2.2. Específicos .................................................................................................... 31

3. Metodologia ............................................................................................... 32

3.1. Desenho Experimental .................................................................................... 32

3.1.1.Extração e cultivo das CMs ............................................................................ 32

3.1.2.Condicionamento do meio DMEM por explantes de nervo facial .......................... 34

3.1.3. Subcultivos de CMs e grupos experimentais .................................................... 37

3.1.4.Marcação imunocitoquímica das CMs .............................................................. 40

3.1.5. Análise dos dados ....................................................................................... 41

4. Resultados ................................................................................................. 43

4.1 Mudanças morfológicas e expansão das CMs .................................................. 43

4.2 Mudanças fenotípicas das CMs.....................................................................45

5. Discussão .................................................................................................. 76

5.1 O uso de CTMs e seu potencial regenerativo...................................................76

5.2 Microambiente celular e plasticidade mesenquimal..........................................80

6. Conclusões ................................................................................................ 86

7. Referências Bibliográficas ............................................................................ 87

8. Anexos .................................................................................................... 101


16

1. Introdução

A face humana pode ser considerada um espelho dos nossos sentimentos, pois através

da movimentação de seus músculos, expressamos diferentes tipos de emoções em diversos

graus. Além disso, a face possui uma participação fundamental na comunicação social por estar

integrada ao processo da fala (Faria et al., 2006). O famoso livro de anatomia humana

Gardner/Gray/O´Rahilly descreve que a mímica facial é exercida por 22 grupos musculares

derivados do segundo arco branquial. Todos esses músculos são inervados pela divisão motora

do 7° nervo craniano, o nervo facial (Gardner et al., 1998).

A integridade do nervo facial, responsável pela inervação dos músculos da mímica facial,

apresenta papel relevante nesse contexto. Funções fisiológicas importantes dependem desta

integridade, como o lacrimejamento e a proteção ocular, o paladar (dois terços anteriores da

língua), a ingestão de alimentos (o músculo orbicular da boca toma parte no início do processo),

a salivação, entre outras (Bento e Miniti, 1989). Várias são as causas de sua disfunção, sendo

as mais comuns os processos inflamatórios (Mattox e Felix, 1987).

Na busca do modelo mais adequado para pesquisa experimental de substâncias

sistêmicas que atuem na regeneração pós-traumática do nervo facial, encontram-se na literatura

diversos métodos, com variações nas espécies animais utilizadas, sítio e método de lesão, tempo

de evolução, e meios de análise funcional e histológica. Diversos estudos publicados demonstram

as influências de inúmeros fatores na recuperação do nervo facial, abordando técnica cirúrgica

(Bento e Miniti, 1989), administração de substâncias neurotróficas (Lindsay, 1995; Toriumi et

al., 1997; Choi e Dunn, 2001) e até exposição a pulsos eletromagnéticos (Byers et al., 1998).

Nesse universo, a terapia com uso de CTs tem se mostrado bastante promissora. Essas

células têm a capacidade de auto replicação ou produção de novas células de uma ou várias

linhagens. Dois tipos específicos de CTs tem sido identificadas: células embrionárias tronco e

CTs adultas. A célula ideal deve exibir alto nível de proliferação, um bom controle de sua

atividade proliferativa e plasticidade fenotípica (Sandler, 2013).

O controle da plasticidade é um evento complexo que requer a saída de células de um

estágio indiferenciado para um determinado estado de desenvolvimento. A determinação celular

é vista como um evento estático iniciado por fatores intrínsecos e auxiliado por fatores


17

extrínsecos. A manipulação de sinais ambientais pode induzir diferenciação celular em

determinadas linhagens e pode ajudar na compreensão dos mecanismos de desenvolvimento

neural e glial.

As CMs são as mais usadas nos estudos que envolvam terapia celular. São encontradas

em muitos tecidos, facilmente acessíveis e representam uma fonte autóloga para possíveis

tratamentos. São capazes de secretar fatores neurotróficos, estimular e apoiar o crescimento, a

maturação e a diferenciação de células neurais (Barcelos et al., 2003). Nessa perspectiva, as

CMs poderiam representar uma alternativa ao uso de CTs nervosas. Uma cultura de CMs com

meio condicionado por nervo facial poderia recriar (no mínimo, parcialmente) um micro ambiente

de nervos periféricos.

1.1. Aspectos anatômicos do nervo facial

Os nervos cranianos, os nervos que se originam no encéfalo, são em número de 12 em

cada antímero. São eles: nervo olfatório (I par), nervo óptico (II par), nervo oculomotor (III

par), nervo troclear (IV par), nervo trigêmeo (V par), nervo abducente (VI par), nervo facial (VII

par), nervo vestibulococlear (VIII par), nervo glossofaríngeo (IX par), nervo vago (X par), nervo

acessório (XI par) e nervo hipoglosso (XII par). Alguns dos nervos são exclusivamente ou

totalmente aferentes (I, II e VIII); outros são totalmente eferentes (III, IV, VI, XI e XII); e

ainda, outros são mistos, tanto com fibras aferentes como eferentes (V, VII, IX e X) (Gray,

1995).

O nervo facial divide-se em duas partes: o nervo facial propriamente dito e uma raiz

nervosa adjacente (o nervo intermédio ou raiz intermédia do nervo facial). Ambas as partes

saem juntas da superfície ventro-lateral do tronco encefálico, no sulco bulbopontínuo (Gray,

1995). Suas origens reais são o núcleo motor, o núcleo sensitivo e o núcleo parassimpático. O

primeiro está situado na parte dorsal da ponte (formação reticular). O núcleo sensitivo está

situado no extremo superior do núcleo do tracto solitário e recebe fibras provenientes do gânglio

geniculado. Por fim, o núcleo parassimpático (núcleo salivatório superior) envia fibras ao gânglio

pterigopalatino e ao nervo da corda do tímpano (Figura 1).

O segmento motor envia ramos para os músculos da expressão facial. Estes músculos

desenvolvem-se a partir do segundo arco branquial, sendo a sua inervação branquiomotora ou


18

eferente visceral especial (EVE). O nervo intermédio contém três componentes sensoriais:

aferente visceral geral (AVG), aferente visceral especial (AVE) e aferente somático geral (ASG).

Faz também parte deste nervo, um componente visceromotor pré-ganglionar parassimpático,

eferente visceral geral (EVG) (Machado e Haertel, 2014).

Figura 1. Anatomia do nervo facial (Adaptado: Waxman, 2013).

Os nervos facial e intermédio partem juntos do tronco encefálico, atravessam o meato

auditivo externo e penetram no canal facial (no osso temporal). O gânglio geniculado, contendo

corpos celulares dos neurónios primários ASG, AVG e AVE, fica no canal facial. Os processos

centrais desses neurônios chegam ao sistema nervoso central (SNC) como parte do nervo

intermédio (Madeira, 2010).


19

No canal facial, o nervo facial dá origem a três ramos: o nervo petroso maior, o nervo

para o músculo estapédio e o nervo da corda do tímpano. Ao nível do gânglio geniculado, fibras

EVG e AVG do nervo intermédio formam o nervo petroso maior e saem do canal facial. O nervo

petroso maior une-se ao nervo petroso profundo (fibras pós-gânglionares simpáticas do plexo

carotídeo) e formam o nervo do canal pterigóide (nervo vidiano). Este nervo penetra no canal

pterigóide a caminho do gânglio pterigopalatino. Ao atravessar o canal facial, o nervo facial emite

o pequeno nervo para o músculo estapédio, suprindo a inervação branquiomotora para este

músculo. O terceiro ramo do nervo facial contém fibras EVG e AVE e forma o nervo da corda do

tímpano (Frostick et al., 1998).

Após sair da cavidade do ouvido médio, o nervo da corda do tímpano une-se ao nervo

lingual, levando sensações gustativas AVE dos dois terços anteriores da língua e fibras pré-

gânglionares parassimpáticas EVG até ao gânglio submandibular (Rosenbauer, 2001). Saindo do

crânio pelo forame estilomastóide, o nervo facial passa pelo corpo da glândula parótida e forma

vários ramos terminais que fornecem inervação branquiomotora, EVE, aos músculos da

expressão facial. No ponto de saída, o nervo facial consiste apenas em fibras EVE, além do

componente ASG muito pequeno destinado ao pavilhão da orelha e ao meato auditivo externo

(Sobotta e Becher, 2013).

O nervo facial não fornece inervação parassimpática para a glândula parótida. Em vez

disso, essa inervação chega à glândula parótida por meio do nervo glossofaríngeo, o gânglio

óptico e o ramo auriculotemporal do nervo trigêmeo. Na glândula parótida, ramos terminais do

nervo auriculotemporal, proporcionando inervação motora e sensorial mista, à face e aos

músculos de expressão facial (Schunke, 2013).

Desde o século XVII, a literatura médica já apresenta tentativas de reparação do nervo

facial lesado, mas só em 1927 Bunnell reporta um caso de sucesso. Ele suturou o nervo facial

ainda dentro do osso temporal. Para tanto, o “descobriu” em toda a sua extensão na glândula

Parótida e o transferiu para um novo local (Bunnel, 1927). Na segunda grande guerra do século

XX, aproveitando a infinidade de pacientes traumatizados nos campos de batalha, iniciaram-se

esforços para a recuperação de lesões neurais, os quais culminaram em 1942 na divulgação do

“Senior Consultant in Neurologic Surgery to the European Theater of Operations”, no qual já se


20

defendia uma sutura precoce e sem tensão para um melhor resultado de recuperação funcional

(Davis et al., 1945).

O conhecimento da anatomia cirúrgica do nervo facial e suas correlações com a glândula

parótida e músculos faciais são muito importantes para uma adequada preservação nos casos

de cirurgia nesta área. Dessa maneira, a escolha da abordagem cirúrgica é muito relevante na

cirurgia da parótida por causa da extrema variabilidade anatômica e importância funcional dos

seus ramos (Rodrigues et al., 2009).

As fibras motoras do nervo facial, embora tenham origem no SNC, possuem grande

capacidade regenerativa. Apresenta clearance de debris e de mielina maior do que o SNC e

possui uma espécie de guia para o processo regenerativo, ao contrário do SNC. O nervo facial

apresenta, ainda, maior capacidade de resposta aos fatores de crescimento após lesões (Chu et

al., 2003).

1.2. Regeneração no SNP e ambiente de lesão

Lesões dos nervos periféricos são frequentes na prática clínica, sendo responsáveis por

problemas graves, como dor e sequelas muitas vezes permanentes. Dentre os danos que

diminuem a qualidade de vida das pessoas acometidas, estão incluídas a incapacitação física e

a perda total ou parcial de suas atividades produtivas, o que origina importantes consequências

econômicas (Noble et al., 1998). Além do altíssimo custo social gerado pelo aumento nas

despesas da saúde pública e previdenciária, é importante ressaltar o impacto que as lesões desta

dimensão são capazes de provocar sobre o indivíduo, seus familiares e sociedade como um todo.

O SNP é composto pelas fibras nervosas, formadas por um ou mais axônios, envoltos

pelas células de Schwann (CSs), mantidas pelo endoneuro, mais material amorfo da matriz

extracelular, capilares, fibroblastos e mastócitos, assim como o epineuro e o perineuro (Birdi e

Antia, 2003). Dentro da bainha perineural, os axônios e as CSs são envolvidos pela lâmina basal

e composta por várias moléculas secretadas por múltiplas células, dentre elas, as de Schwann

(Alberts et al., 2010). A lâmina basal, através de interações, com receptores da membrana

celular, participa no metabolismo celular, na organização das proteínas das membranas

plasmáticas, na migração celular, durante a embriogênese e na diferenciação celular. Além disso,


21

influencia a regeneração axonal, servindo de guia das fibras nervosas e possui ainda funções

estruturais e sinalizadoras (Stoll e Muller, 1999).

Nos anos 80, os experimentos de Aguayo et al.(1981) demonstraram o potencial de

crescimento de fibras de neurônios no modelo de transecção de nervo óptico de ratos adultos,

que aloja as fibras nervosas que ligam a retina aos núcleos subcorticais responsáveis por

algumas das funções visuais. Após a transecção, segmento de nervo isquiático foi interposto

entre o coto proximal do nervo óptico seccionado e o colículo superior, no mesencéfalo. Todo o

trajeto do nervo interposto se fez do lado de fora do crânio. Após alguns meses, a regeneração

foi constatada pela obtenção de registros elétricos no mesencéfalo após estimulação visual.

O ambiente de lesão dos axônios do SNC difere muito daquele do SNP. Ao contrário dos

nervos, os axônios do SNC não são estruturalmente separados por bainhas perineurais e

neurilemais, estruturas que fornecem um substrato anatômico para o crescimento da fibra

lesada (Junqueira e Carneiro, 2012). Como os neurônios dos mamíferos geralmente não se

dividem, a destruição de um neurônio representa perda permanente. Seus prolongamentos, no

entanto, dentro de certos limites podem regenerar-se devido à atividade sintética dos

respectivos corpos celulares. Por isso, os nervos se regeneram, embora com dificuldade. Quando

uma célula nervosa é destruída, as que a ela se ligam nada sofrem, exceto nos raros casos em

que um neurônio recebe impulsos exclusivamente de outro. Neste caso, o neurônio que fica

completamente privado de impulsos nervosos, pela destruição do outro, sofre a chamada

degeneração transneuronal (Purves et al., 2010).

Ao contrário dos elementos nervosos, as células da glia do SNC, e as do SNP (CSs e

células satélites dos gânglios), são dotadas de grande capacidade de proliferação. Os espaços

deixados pelas células e fibras nervosas do SNC destruído por acidentes ou doença são

preenchidos por células da neuroglia (Alberts et al., 2010). Quando um nervo é seccionado,

ocorrem alterações degenerativas, seguidas de uma fase de reparação. No nervo lesado deve-

se distinguir a parte da fibra que, pela lesão, desligou-se do seu neurônio (parte distal) e a parte

que continua unida ao neurônio (parte proximal). O segmento proximal, por manter contato com

o corpo celular, que é o centro trófico, frequentemente é regenerado, enquanto o segmento

distal degenera totalmente e acaba por ser reabsorvido (Machado e Haertel, 2014).


22

No coto distal, tanto o axônio, agora separado de seu centro trófico, como a bainha de

mielina degeneram totalmente. Enquanto se processam essas alterações, as CSs proliferam,

formando colunas celulares compactas. Essas colunas servirão de guia para os axônios que vão

crescer durante a fase de regeneração. Por outro lado, o segmento proximal do axônio cresce e

se ramifica, formando vários filamentos que progridem em direção às colunas de CSs. Todavia,

somente as fibras que penetram nessas colunas têm possibilidade de alcançar um órgão efetor

(Figura 2). Quando o segmento distal do nervo é perdida, como ocorre na amputação de um

membro, as fibras nervosas crescem ao acaso (Junqueira e Carneiro, 2013).

Figura 2. Modelo de degeneração e remielinização axonal (Adaptado: Lent et al., 2010).

A eficiência funcional da regeneração depende das fibras ocuparem as colunas de CSs

destinadas aos locais corretos. Num nervo misto, por exemplo, se as fibras sensitivas

regeneradas ocuparem colunas destinadas às placas motoras de um músculo estriado, a função

do músculo não será restabelecida. A possibilidade de recuperação funcional é aumentada pelo

fato de cada fibra em regeneração dar origem a vários prolongamentos e cada coluna receber

prolongamentos de várias fibras (Purves et al., 2010).


23

Após a lesão, axônios fragmentados e restos de bainha de mielina não são rapidamente

e eficientemente removidos do sítio da ferida no SNC, em parte porque o processo de ativação

microglial é inferior ao observado pelos macrófagos nos nervos. Alguns trabalhos sugerem que

células como as de linhagem glial e os fagócitos são decisivas no processo de reparo e

cicatrização, com interferência no fenômeno de crescimento de fibras nervosas (Bootcov et al.,

1997; Zeev-brann et al., 1998; Chan et al., 2001; Markus et al., 2002b).

Mudanças na expressão local de citocinas ocorrem após a lesão do SNC. Citocinas como

interleucina-1 (IL-1) e fator de crescimento tumoral- (TNF-) são expressas pelas células que

invadem o sítio de lesão da medula espinal e parecem contribuir para o recrutamento de células

inflamatórias e modulação da resposta glial à cicatrização (Ghirnikar et al., 1998). TNF- e o

fator de crescimento de colônia-1 (CSF-1) aumentam a migração de macrófagos para a região

de nervos lesados (Lotan e Schwartz, 1994), bem como a adesividade destas células, sugerindo

que elas poderiam melhorar a permissividade do crescimento de fibras (Prewitt et al., 1997).

As lesões completas, com perda de substância, raramente apresentam recuperação sem

intervenção cirúrgica, e as técnicas atuais de reparação oferecem resultados aleatórios e

frequentemente insatisfatórios. O enxerto autólogo de nervo proporciona os melhores resultados

no reparo quando há transecção de nervo periférico. Este, porém, apresenta limitações, como

uma maior morbidade no local de retirada do enxerto, escassez de sítios doadores de nervo,

diferenças estruturais entre o nervo doador e receptor, além do déficit sensitivo resultante na

área da qual foi retirado (Oliveira et al., 2004; Ichihara et al., 2008). Nesse contexto, muitos

pesquisadores buscam terapias alternativas, como transplante de CTs autólogas, técnicas de

tubulização com o uso de diferentes materiais e aplicação de fatores tróficos, com o propósito

de otimizar o reparo de nervos periféricos danificados (Oliveira et al., 2004).

Diversos fatores, como a expressão diferencial de genes envolvidos com o crescimento,

os genes relacionados à estrutura do axônio, as moléculas de adesão celular e outras da matriz

extracelular, o suprimento de fatores neurotróficos, a presença das citocinas inflamatórias e dos

fatores inibidores relacionados à substância branca, em combinações específicas, determinam

como o crescimento axonal será sustentado após a lesão nervosa (Bethea e Dietrich, 2002;

Condic e Lemons, 2002; Nguyen et al., 2002; Snider et al., 2002).


24

1.3. Fatores neurotróficos

Os fatores neurotróficos são polipeptídeos que auxiliam no processo regenerativo do

SNP. Compreendem basicamente um conjunto de famílias de moléculas e seus receptores

responsáveis por manter o crescimento e a sobrevivência dos axônios e neurônios motores e

sensitivos, após danos teciduais. Diversos fatores tróficos, também conhecidos como fatores de

crescimento, são utilizados e testados in vitro e in vivo na regeneração de nervos periféricos.

Essas proteínas atuam diretamente na proliferação e diferenciação de diferentes tipos celulares,

sendo capazes de promover reparo tecidual e recuperação funcional (Boyd e Gordon, 2003).

Vários fatores neurotróficos são liberados e atuam conjuntamente após uma lesão

neural periférica a fim de estimular a regeneração neural; incluem o fator de crescimento do

nervo (NGF), o fator neutrófico derivado do cérebro (BDNF) (Boyd e Gordon, 2003), a

neurotrofina-3 (NT-3) (Markus et al., 2002ª), os fatores de crescimento tipo insulina (IGF-I e

IGF-II) (Perlson et al., 2004) e o fator de crescimento fibroblástico 2(FGF-2) (Terenghi, 1999).

No que diz respeito as interações tróficas que determinariam o melhor microambiente

à regeneração, uma nova fase se iniciou com a descoberta do fator de crescimento do nervo

(NGF) por Rita Levi Montalcini. Foi descrito que a interação entre o neurônio e as CSs poderia

implicar na sinalização recíproca, envolvendo a liberação de moléculas com atividade trófica

(Levi-Montalcini e Angeletti, 1968).

De forma ampla, os fatores neurotróficos influenciam na atividade neural, incluindo-se

a atividade sináptica, o desenvolvimento durante o período embrionário, a manutenção e

sustentação durante a vida adulta e a sobrevivência dos neurônios após a lesão nervosa. Estes

são produzidos pelos órgãos alvo e transportados retrogradamente ao corpo celular dos

neurônios. Quando ocorre uma lesão nervosa, há a interrupção no fornecimento de fatores

neurotróficos, podendo levar à morte neuronal e consequentemente à ausência regenerativa

(Terenghi, 1999). Em virtude disso, os componentes não neurais, por exemplo as CSs, passam

a produzi-los, de forma a proteger os neurônios e estimular a regeneração axonal (Ide, 1996;

Lewin et al., 1997).

Os fatores neurotróficos são divididos em duas classes: as neurotrofinas e as

neurocitocinas. Exemplos clássicos de neurotrofinas são o NGF, BDNF, neurotrofinas 3 e 4/5

(NT-3 e NT-4). Como exemplo de neurocitocinas, destacam-se o fator de crescimento do


25

fibroblasto (FGF), interleucina (IL-1), o fator de crescimento transformado (TGF), e o fator

inibidor de leucemia (LIF) (Lewin et al., 1997). Estes fatores neurotróficos são importantes para

o desenvolvimento e sobrevivência dos neurônios sensitivos, motores, simpáticos do SNP e

neurônios colinérgicos presentes no SNC (Koop et al., 1997; Sendtner et al., 1992; Wang et al.,

2008). Outros fatores, como o FGF, promovem a sobrevivência neural, proliferação das CSs e

interação entre as células da glia e os neurônios (Tabela 1).

Tabela 1. Fatores de crescimento utilizados na regeneração periférica e seus

respectivos alvos (Adaptado: Pfister et al., 2007).

O aprisionamento de FGF-2 em canais sintéticos de orientação em nervos aumenta o

crescimento de mielina e axônios não mielinizados em longos intervalos. Camundongos

transgênicos com superexpressão de FGF-2 tiveram a regeneração de axônios periféricos e

remielinização consideravelmente mais rápidos em comparação com camundongos selvagens

(Jungnickel et al., 2006). No SNC, FGF-2 pode causar remielinização e também proteger

diferentes células neuronais de danos induzidos por morte (Butt e Dinsdale, 2005). O FGF-2

exógeno uma vez aplicado no sistema adulto nigroestriatal, promove a sobrevivência e

crescimento de neurônios dopaminérgicos e os protege da morte induzida por neurotoxinas in

vivo e in vitro (Grothe e Timmer, 2006).

As atividades mitogênicas e neurotróficas do FGF-1 e 2 incluem sua capacidade de

melhorar a sobrevivência e o crescimento de vários tipos de células neuronais, como do

neocórtex, hipocampo, cerebelo, medula espinal e neurônios sensoriais isolados do SNC de


26

adultos (Peulve et al., 1987; Matsuda et al., 1990; Himmelseher et al., 1997; Dono, 2003). Eles

também influenciam na migração e diferenciação das células neuronais (Anderson, 1993; Reuss

et al., 2003). Além disso, tanto FGF-1 e 2 como seus receptores são aumentados após lesão

periférica e central do sistema nervoso (Gomez-Pinilla et al., 1992; Logan et al., 1992; Mocchetti

e Wrathall, 1995; Grothe et al, 2001).

A capacidade dos FGFs para atuarem como potentes fatores neurotróficos tem sido

amplamente demonstrada através da prevenção da morte induzida por axotomia de neurônios

glutamatérgicos (Peterson et al., 1996). In vitro, o FGF-2 protege os neurônios contra

citotoxicidade, diminui a morte celular apoptótica, forma novos vasos sanguíneos e promove

reconstrução da bainha de mielina, exercendo um efeito neuroprotetor nos neurônios motores

após transecção do nervo isquiático ou da injúria contusa da medula espinal (Mattson et al.,

1989; Mattson et al., 1993; Fressinaud, 1994; Baffour et al., 1995; Teng et al., 1998; Teng et

al., 1999; Romero et al., 2001).

Em 2009, Guzen et al. avaliaram o potencial regenerativo do GDNF adicionado a

segmentos de nervos isquiáticos interpostos em medulas espinhais transeccionadas de ratos. O

GDNF adicionado favoreceu a recuperação motora, o crescimento de fibras neuronais locais e a

neuraplasticidade. Em 2012, Guzen et al. utilizaram o mesmo modelo de lesão descrito bem

como o mesmo método terapêutico. No entanto, foi adicionado FGF-2 como fator neurotrófico.

A melhora motora, bem como o crescimento neuronal foram semelhantes aos resultados obtidos

anteriormente.

O transplante de populações purificadas de CSs parece ser uma alternativa viável na

tentativa de contornar fatores restritivos relacionados ao microambiente regenerativo e ao

crescimento de fibras nervosas. As CSs secretam fatores neurotróficos, expressam moléculas de

adesão e produzem numerosas moléculas da matriz extracelular, que sabidamente influenciam

o crescimento das fibras nervosas (Xu et al., 1997). Além disso, a injeção local de CSs está

relacionada à diminuição da cicatriz glial (Martini, 1994). Outra vantagem do uso dessas células

deve-se as características técnicas, já que, o seu número pode ser rapidamente aumentado in

vitro em um curto período de tempo (Morrissey et al., 1991).

As CSs produzem os fatores neurotróficos NGF, BDNF e outras neurotrofinas, além de

membros da família dos fatores de crescimento de fibroblastos, como o FGF-2 e membros dos


27

IGFs (Yamamoto et al., 1993; Springer et al., 1994; Hammarberg et al., 1996; Menei et al.,

1998; Sayers et al., 1998; Russell et al., 2000; Kubo et al., 2002). A expressão gênica de vários

fatores neurotróficos ocorre nas CSs nas porções proximal e distal dos cotos nervosos após a

lesão do nervo isquiático do rato (Cheng et al., 1996; Frostick et al., 1998; Kirsch et al., 1998).

O suprimento aumentado de fatores neurotróficos por estas células serviria para proteger o

axônio de uma maior degeneração retrógrada e, consequentemente, o corpo celular do neurônio,

bem como promover o crescimento da fibra no coto distal do nervo lesado (Raivich e Kreutzberg,

1993; Henderson et al., 1994a).

1.4. Terapia com CTs e regeneração nervosa

Uma outra alternativa para regeneração nervosa é o uso de CTs. As CTs são células

inespecíficas que podem se replicar, e sob determinadas condições, se diferenciam em vários

tipos celulares (Jeong et al., 2003). Todas as células descendem de um ovócito fertilizado. O

blastocisto contem células totipotentes ou CTs embrionárias, que podem formar todas as

linhagens somáticas. Células multipotentes são CTs de tecidos que são capazes de se

desenvolverem em um número restrito de células daquele tecido. Há basicamente dois tipos

celulares nos tecidos: aquelas células pós-mitóticas responsáveis pela atividade fisiológica e as

CTs responsáveis pelo crescimento de tecidos e reparo. Como o organismo passa de um estágio

embrionário para a vida adulta, o número de células pós-mitóticas aumenta e o número de CTs

diminui (Tohill et al., 2004).

CTs neurais têm sido usadas para reparar lesões nervosas com sucesso regenerativo

(Murakami et al., 2003; Heine et al., 2004; Aquino et al., 2006), no entanto, são de difícil

obtenção. Por outro lado, CTs adultas tem a vantagem de serem disponíveis a partir de

procedimentos relativamente não invasivos, métodos de coleta autólogos, e são provavelmente

a mais promissora escolha para a maioria das lesões nervosas. Células estromais de medula

óssea têm atraído vários grupos interessados em estratégias para complementar o reparo

nervoso (Dezawa et al., 2001; Tohill et al., 2004; Keilhoff et al., 2006; Chen et al., 2007; Hu et

al., 2007; Shimizu et al., 2007; Wang et al., 2008). São coletadas a partir de ossos longos, e

quando colocadas em meio de cultura contendo citocina transdiferenciam-se em CSs aderentes


28

com fenótipo expressando a proteína S-100, GFAP e p75 (Dezawa et al., 2001; Tohill et al.,

2004).

A plasticidade, ou habilidade das células se transdiferenciarem, tem despertado grande

interesse na medicina regenerativa. Essa capacidade está diretamente relacionada ao seu

potencial na engenharia tecidual. Nessa perspectiva, o uso de CMs vem se destacando. Esta

linhagem celular promissora é derivada de estroma ósseo. A medula óssea contém duas

populações distintas de células progenitoras: progenitores hematopoéticos e progenitores

estromais (Figura 3). Este é um sítio de origem para CMs de osso, cartilagem, tendões, tecido

adiposo e músculos (Caplan, 1994). Elas se aderem facilmente em cultivo celular em superfícies

quando comparado com o componente hematopoético (Bianco et al., 2001).

Figura 3. Células multipotentes derivadas de estroma ósseo (Adaptado: BD

biosciences, 2006)


29

As CTs têm sido usadas com condutores artificiais e enxertos acelulares, onde têm

contribuído para a melhoria da recuperação eletrofisiológica, morfológica e/ou comportamental

em modelos animais (Vitry et al., 2003). Embora o seu potencial de produzir mielina funcional

in vivo seja questionado, tem sido evidenciado que CSs derivadas de CTs de medula óssea são

capazes de produzir mielina in vitro (Keilhoff et al., 2006).

Há inúmeros paradigmas para descrever os mecanismos regulatórios da divisão e da

auto renovação celular. Os mecanismos de expansão tem sido descritos como assimétrica ou

simétrica. Na divisão assimétrica, cada CT sofre uma divisão na qual uma permanece em repouso

(estágio original de repouso) e outra denominada progenitora, adquire a capacidade de se

diferenciar. Na divisão simétrica, duas CTs filhas ou duas células diferenciadas são formadas a

partir de cada CT. O ambiente influencia as propriedades bioquímicas e morfológicas das CTs.

Estas ajustam suas propriedades de acordo com o meio circundante e selecionam linhagens

específicas de acordo com os estímulos recebidos pelo seu nicho (Fuchs e Segre, 2000). De

maneira geral, há fatores extrínsecos e intrínsecos relacionados a divisão e diferenciação celular.

Os fatores extrínsecos podem ser divididos em interações célula-célula, fatores

secretados localmente e matriz extracelular. As interações célula-célula mediadas pelas

proteínas integrais da membrana, tem demonstrado influência em manter o potencial de auto-

renovação e diferenciação. Por exemplo, certos receptores celulares quando ativados mantem

as células em um estado de indiferenciação e auto-renovação (Henderson et al., 1994b; Kopan

et al., 1994). Fatores secretados localmente ou fatores de crescimento, tais como o fator de

crescimento epidermal e o FGF estimulam a proliferação celular (Reynolds e Weiss, 1996; Gritti

et al., 1996). Eles podem agir seletivamente em progenitores específicos depois da divisão

celular ou estimulam um grupo celular específico a se diferenciar em progenitores específicos

(Sieber-Blum, 2004). Por fim, a matriz extracelular pode modular a concentração local de fatores

de crescimento e indiretamente influenciar na proliferação e diferenciação (Quesenberry e

Becker, 1998).

Os fatores intrínsecos determinam a auto renovação e divisão celular. Sob condições

similares, observou-se que subpopulações de CTs hematopoeticas dependem diretamente da

atividade da telomerase (Morrison et al., 1996). A manutenção de um estágio indiferenciado

pode ser determinado pela herança genética de certas proteínas que influenciam a expressão


30

gênica (Morrison et al., 1997). O papel in vivo de genes de divisão assimétrica pode ser de

fundamental importância para o controle intrínseco de auto renovação celular (Seydoux et al.,

1996).

Segundo Muñoz-Elias et al. (2004), as CMs, após 3 horas expostas ao meio de indução

neural, apresentam alterações morfológicas neuronais típicas. Caddick et al. (2006) e Mahay et

al. (2008) demonstraram que CMs diferenciadas in vitro apresentam características bioquímica

e funcionais semelhantes às CSs. Após 14 dias de diferenciação, Caddick et al. (2006) relataram

à ocorrência de alongamento e bipolaridade em boa parte das células. Nessa mesma perspectiva,

Lin et al. (2008) demonstraram que CMs, quando devidamente induzidas, apresentam padrão

morfológico neural após 3 dias.

Embora as estratégias de aplicação de CTs em um ambiente clínico sejam promissoras,

o entendimento de sua diferenciação, bem como sua capacidade proliferativa ainda in vitro, a

otimização da inoculação de células e a cuidadosa investigação do destino das células

transplantadas são necessários para garantir a segurança e máxima eficácia dessas terapias.

Dessa maneira, o presente estudo teve como objetivo avaliar as mudanças

morfológicas, o crescimento e a plasticidade de CMs diante de meio cultura condicionado por

explantes de nervo facial e pela presença do Fator de Crescimento Fibroblástico-2.


31

2. Objetivos

2.1. Geral

Avaliar o efeito do meio de cultura condicionado com nervo facial e/ou FGF-2 na

plasticidade de CTMs de medula óssea de ratos Wistar.

2.2. Específicos

Avaliar o estado de multipotência das CTs mesenquimais de medula óssea promovida

pelo meio de cultura condicionado com nervo facial e pelo FGF-2 a partir dos seguintes

parâmetros:

1) Evolução de número, área, perímetro e morfologia celular por 72 horas;

2) Marcação das imunorreatividades das proteínas gliais: proteína ácida fibrilar glial (GFAP),

marcador microglial OX-42 através da imunocitoquímica das CMs;

3) Marcação das imunorreatividades da proteína associada ao microtúbulo-2 (MAP-2), β-

tubulina III, das proteínas neuronais de neurofilamentos 200 (NF-200) e da proteína nuclear

neuronal(NeuN) através da imunocitoquímica das CMs;

4) Mensuração de número, área e perímetro de células positivas para GFAP, OX-42, MAP-2, β-

tubulina III, NeuN e NF-200.


32

3. Metodologia

3.1. Desenho experimental

Ratos Wistar machos de aproximadamente 250 gramas foram utilizados sob aprovação

da Comissão de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da Universidade do Estado do Rio

Grande do Norte (UERN), sob protocolo N°007/2012 (Anexo) de acordo com princípios éticos

adotados pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) e de acordo

com a lei n° 11.794, Lei Arouca – Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação (Brasil, 2008).

Os animais foram obtidos do biotério UERN. Foram retirados do convívio materno quando

passado o período de amamentação, não causando assim nenhum tipo de sofrimento e de stress

tanto para os filhotes como para a mãe. Em seguida foram mantidos no biotério do laboratório

de Neurologia Experimental da UERN em gaiolas separadas, com condições adequadas de

alojamento com livre acesso à água e alimento até o peso e idade adequados.

3.1.1. Extração e cultivo das CMs

As CT mesenquimais foram coletadas da medula óssea de seis ratos Wistar com três

meses de vida. Os animais foram eutanasiados com uma excessiva dose de anestésicos (Xilasina

e Quetamina da Agener União®). Os animais foram dissecados sob condições assépticas para a

remoção de fêmures e tíbias. Os ossos recém-dissecados foram mantidos em um tubo cônico

com PBS (pH 7.4) até que foi feita a remoção de toda porção de tecido muscular aderido aos

ossos. Sob fluxo laminar, placas para cultura com 60mm foram preparadas com meio de cultura

celular.

O meio de cultura utilizado foi o Knockout DMEM low (Dulbecco`s modified Eagle`s

medium), suplementado com 10% de soro bovino fetal e 10U/ml de penicilina G, 10µg/ml de

estreptomicina e 25µg/ml de anfotericina B, todos obtidos da Cultilab®. Com auxílio de tesoura

de ponta reta foram feitos cortes nas epífises dos ossos e, utilizando, uma seringa de 1ml, a

medula foi extraída através da inserção no canal medular e posterior lavagem do canal utilizando

1ml de meio de cultura sob pressão (Figura 4).


33

Figura 4. Extração e cultivo de células mesenquimais de osso longo.

Em seguida, foram adicionados mais 3ml de meio de cultura nas placas P60. De cada

animal, foi obtido o extrato da medula dos dois ossos (fêmur e tíbia) por antímero. As células

recém extraídas foram mantidas em estufa úmida a 370C com 5% de CO2 e 95% de oxigênio. A

microscopia de luz invertida com contraste de fases foi utilizada para observação da adesão

celular no fundo das placas. Para possibilitar um suprimento nutricional adequado, eliminar

células hematopoiéticas e desprendidas bem como possibilitar uma adequada adesão celular no

fundo das placas, o meio de cultura foi trocado a cada três ou quatro dias (Figura 5).


34

Figura 5. Troca de meio de cultura celular.

3.1.2. Condicionamento de meio DMEM por explantes de nervo facial

Sob o fluxo laminar, placas para cultura, com tampa de 60mm foram preparadas com

5ml do meio Leibovitz-15 (L15: GIBCO Invitrogen Corporation). Nos animais que foram

submetidos a extração de CMs após a eutanásia, as regiões faciais foram tricotomizadas. Foi

feita anti-sepsia local com clorexidina à 2%. A seguir foram feitos acessos cirúrgicos entre as

regiões pré-auriculares e periorais nos dois antímeros de modo que os ramos bucal e mandibular

fossem evidenciados e isolados. Cada segmento tinha aproximadamente 15 mm de comprimento

por 1 mm de diâmetro (figura 6).

Os ramos dos nervos faciais foram retirados e colocados nas placas de 60mm com meio

L15, sob técnica cirúrgica asséptica com o auxílio de microinstrumentos (tesoura, pinça,

afastadores). Todo excesso de tecido (músculo, gordura e vasos sanquíneos) aderido aos nervos

foi removido sob magnificação por lupa estereoscópica SZ61 (Olympus®).


35

Figura 6. Acesso cirúrgico aos ramos do nervo facial (#mandibular, *bucal)

A seguir, o perineuro dos nervos foi removido sob magnificação e técnica microcirúrgica

(Figura 7).

Figura 7. Remoção do perineuro dos ramos nervosos.

#

*


36

Os nervos dissecados foram segmentados em explantes de 1mm de comprimento cada.

Sob fluxo laminar, os fragmentos dos nervos foram colocados em placas de 60mm com 1,5ml

de meio DMEM acrescido de 10% de soro fetal bovino (Cultilab®) e gentamicina 0,1%, meio

este denominado de D-10.

O excesso do meio foi removido de forma que os explantes não ficassem flutuando, nem

tão pouco submersos no meio (figura 8). O meio D-10 destas culturas era trocado 2 vezes por

semana, sendo os explantes transferidos para uma placa nova com meio novo 1 vez por semana.

O meio trocado era imediatamente desprezado. Esse procedimento possibilitou um suprimento

nutricional adequado aos explantes bem como a sua reatividade. Em média, foram plaqueados

18 explantes de nervo facial em cada placa P60.

Figura 8. Placas P60 com meio condicionado por explantes de nervo facial.


37

3.1.3. Subcultivos de CMs e grupos experimentais

Quando as células tronco mesenquimais atingiram 70-90% de confluência no fundo da

placa, o meio básico foi removido e foram adicionados às placas 2 ml de tripsina/EDTA (0,25%

de tripsina contendo 1 mM de EDTA-Cutilab/Brasil®). A suspensão celular foi colocada em tubo

cônico tipo Falcon com o mesmo volume de meio DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal

Bovino por 10 minutos, com o objetivo de inativar a tripsina. A suspensão foi centrifugada a

1200 rpm durante dez minutos, após o qual o sobrenadante foi desprezado e as células foram

ressuspendidas em 1 mL de meio (Figura 9).

Figura 9. Células precipitadas após centrifugação.

Alíquotas dessa suspensão foram obtidas para a contagem do número de células em

câmera de Neubauer (Figura 10). Decorridos os intervalos de tempo do estudo, a viabilidade

celular foi analisada com o uso do corante Azul de Tripan. A alíquota retirada para contagem

celular foi somada ao mesmo volume de Azul de Tripan e então se realizou a contagem de células

viáveis e não viáveis. As células vitais expulsam o corante do seu citoplasma e não são coradas,

ao contrário das células não vitais na qual o corante permanece no interior da célula sendo então

coradas por solução de Azul de Tripan.

O método da exclusão de células não viáveis coradas pelo azul de trypan, seguiu as

recomendações de Freshney (2001). Para o cálculo do número de células, foi utilizada a seguinte

equação matemática: NC x D x 104 / # Q, onde NC = número de células vitais contadas, D =


38

diluição da amostra (104) e #Q = número de quadrados do hemocitômetro usados para a

contagem das células. Finalmente, o percentual de viabilidade da população celular foi obtido

dividindo-se o número total de células viáveis pelo número total de células e o resultado,

multiplicado por 100.

Figura 10. Câmara de Neubauer para contagem celular.

Alíquotas contendo 1 x 106 células foram depositadas em 48 placas P60, e foram

observadas em três períodos de tempo: 24, 48 e 72 horas. Com este procedimento foi possível

avaliar a adesão e proliferação das CTMs da medula óssea nos seguintes grupos: Grupo 1: CMs

de medula óssea + meio DMEM; Grupo 2: CMs de medula óssea + meio D-10; Grupo 3: CMs de

medula óssea + FGF-2; Grupo 4: CMs de medula óssea + meio D-10 + FGF-2 (Figura 11).


39

Figura 11. Delineamento do estudo: formação de grupos e observação celular.

Para observação celular foi utilizado um microscópio invertido com contraste de fases

CKX41 (Olympus®) com câmera digital Moticam 3.0 (Motic®) acoplada. Nos grupo de estudo 3

e 4 foram acrescidos 1µl de FGF-2 (Sigma®) na concentração 1:10 (Guzen et al., 2012). Nos

grupos 2 e 4 foram acrescidos 1ml de meio condicionado (D-10) por explantes de nervo facial

que já haviam sido transferidos pelo menos uma vez para outra placa.

A contagem de células foi feita usando microscopia de fases em 9 campos não

sobrepostos no aumento de 10x. Foram feitas microfotografias dos 4 grupos em 24 horas, 48

horas e 72 horas. A morfologia das células foi observado usando-se microscopia de contraste de

fases no aumento de 10x. Após 72 horas de observação celular, procedeu-se a

imunocitoquímica.

96 horas: Imunocitoquímica


40

3.1.4. Marcação imunocitoquímica das CMs

No quarto dia (96 horas), com as células já aderidas as placas, o meio foi retirado e as

células lavadas em duas etapas de cinco minutos com tampão de fosfato de sódio, 0,1M, pH 7,4,

fixadas em paraformaldeído (4%) por trinta minutos e, novamente, lavadas em três banhos de

PBS (cinco minutos cada). Em seguida, as células foram tratadas com Triton à 0,5% (Sigma®)

por 10 minutos e lavadas em PBS. Posteriormente, bloqueios de sítios inespecíficos foram feitos

durante 30 minutos em solução PBS 0,1M contendo 0,2% de Triton e 1% de albumina do soro

de boi (BSA). As células foram então incubadas com um dos anticorpos primários por 2 horas à

temperatura ambiente (quadro 1).

Quadro 1. Lista de anticorpos primários.

Anticorpo 1° Animal Concentração Fornecedor

GFAP Mouse 1:400 Sigma

OX 42 Mouse 1:500 Millipore

MAP-2 Mouse 1:2000 Abcam

β-tubulina III Rabbit 1:500 Millipore

NeuN Mouse 1:500 Millipore

NF 200 Mouse 1:1200 Abcam

Ao término desta etapa, as células foram lavadas em PBS (0,1M; pH 7,4) por cinco

minutos e incubadas por 1 hora com anticorpo secundário anti-mouse, produzidos em donkey

(Jackson, EUA) conjugados ao fluorofore AlexaFluor 488 ou AlexaFluor 594 ou FitC ou TritC na

concentração 1:200 mantidas em ambiente refrigerado com ausência de luz (Quadro 1). Após a

incubação secundária, as células foram lavadas com PBS por cinco minutos e, imediatamente,

examinadas no microscópio de fluorescência do Laboratório de Neurologia Experimental da UERN

(Eclipse E200, Nikon®) e posteriormente no microscópio de fluorescência do Laboratório de

Estudos Neuroquímicos da UFRN (Eclipse Ni, Nikon®).

Foram feitas fotomicrografias com as câmeras digitais Moticam 3.0 e 5.0 (Motic®) nos

aumentos de 4x, 10x, 20x em 9 campos numa sequência definido previamente em cada placa


41

(Figura 12). A presença das marcações fluorescentes foi registrada nas CMs, tendo-se o cuidado

de examinar o compartimento subcelular, citoplasmático ou nuclear das imunorreatividades.

Figura 12. Campos de observação celular em placas P60.

Dois investigadores independentes previamente calibrados (kappa = 0,94) contaram as

células por campo em números absolutos, aferiram o perímetro (µm) e a área (µm2) de cada

célula em campos visuais não sobrepostos aleatoriamente, usando cultura de células de no

mínimo 3 experimentos diferentes com aumento de 10x. Foram utilizados o software Motic

Images Plus 2.0 (Motic®) para observação morfológica, o software ImageJ para contagem

celular bem como o software Adobe Photshop CS6.0 (Adobe®) para correção mínima de brilho

e contraste das fotomicrografias.

3.1.5. Análise dos Dados

O banco de dados da pesquisa foi construído na plataforma do software SPSS®

(Statistical Package for Social Sciences) versão 21.0, com posterior verificação de consistência

da digitação. Após a estruturação final do banco de dados, foi realizada inicialmente uma análise

descritiva de todos os dados (número, área e perímetro celular).

Os dados de expansão celular (número de células) ao longo de 72 horas foram

comparados estatisticamente através da análise de variância (ANOVA) com teste de Bonferone

considerando significante quando p < 0,05. O número, o perímetro e a área de células


42

imunomarcadas foi comparado pelo teste U de Mann Whitney e pelo Teste T para grupos

independentes considerando significante quando P < 0,05.


43

4. Resultados

Através dos métodos empregados, obtiveram-se culturas de CMs praticamente livres de

outros tipos celulares. Por sua vez, as células também ficaram aderidas ao fundo da placa e

exibiram morfologia poligonal característica. Estas culturas proliferaram e ao atingirem a

confluência, encontravam-se extremamente justapostas, sendo difícil sua delimitação individual,

mas formando uma monocamada (Figura 13).

Nas placas com explantes de nervo facial, constatou-se uma discreta migração de células

de morfologia fibroblastóide dos fragmentos, após 2 dias de observação. Nesta fase, os explantes

foram removidos após cinco dias para uma nova placa de cultura, o que levou à eliminação

progressiva das células que migraram do tecido para o fundo da placa (Figuras 14 e 15).

Após os procedimentos de subcultivos e formação de grupos do estudo, as CMs ficaram

aderidas ao fundo das placas e foram acompanhadas ao longo de 3 dias para observação de

crescimento populacional, área, perímetro, mudanças morfológicas e fenotípicas. Os dados a

seguir referem-se a expansão, mudanças morfológicas e fenotípicas; resultados de 3

experimentos em 48 placas de cultura P60.

4.1. Mudanças morfológicas e expansão das CMs

As populações de CMs utilizadas foram morfologicamente homogêneas. As culturas de

CTMs derivadas da medula óssea, quando cultivadas em meio condicionado por nervo facial e

FGF-2, apresentaram alterações mais visíveis quando comparadas com as culturas cultivadas

somente em meio D-10, e em meio DMEM com ou sem FGF-2, sobretudo no terceiro dia de

observação microscópica (Figura 16).

Após a exposição ao meio de indução condicionado, as CMs dos grupos 2 e 4 exibiram

alterações morfológicas muito rápidas a maioria das células retraíram seu citoplasma, formando

corpo da célula esférico, e emitiram saliências celulares. No final deste processo, foi possível

identificar subgrupos morfologicamente distintas de CMs, independentemente da sua origem

(Grupo 2 e 4): as CMs apareceram como células bipolares ou tripolares nítidas e alongadas com

processos primários e secundários (Figura 17).


44

Com o acompanhamento das CMs por 72 horas, verificou-se que as populações se

multiplicaram progressivamente desde o primeiro dia até o último dia de observação em todos

os grupos experimentais, exceto no grupo 1 especificamente no segundo dia. No primeiro dia de

registro no grupo 1, alguns campos foram microfotografados sem nenhuma célula. Em

contrapartida, no dia 2, foram contabilizadas 501 células em um único campo do grupo 4.

Contabilizando todas as células ao longo dos três dias em números absolutos, destacaram-se o

grupo 4 (7583) e o grupo 2 (6422) com maior número de células, seguidos do grupo 1 (1171)

e do grupo 3 com 966 células (Tabela 2).

Especificamente, no grupo 1 não houve diferença estatística entre o número de células

nos 3 dias de observação. No grupo 2, a média de células observadas foi maior no terceiro dia

quando comparado ao dia 1 (p=0,047). No grupo 3, a média de células contadas em 72 horas

foi superior ao número de células registradas em 24 (p=0,004) e 48 horas (p=0,024).

Finalmente, no grupo 4, houve diferença estatística no número de células vistas no terceiro dia

para os dois dias anteriores (p=0,001/24horas; p=0,085/48horas) e entre as células observadas

no dia 2 e 1 (p=0,001) (Figura 18).

Comparando a média do número de células observadas de todos os grupos experimentais

por dia de registro (Dias 1, 2 e 3), verificou-se que em 24 horas, a média de células contadas

no grupo 2 foi superior ao número de células do grupo 1 (p=0,001), do grupo 3 (p=0,001) e do

grupo 4 (0,027). A média de células do grupo 4 também foi superior ao grupo 1 (p=0,001) e 3

(p=0,001) no primeiro dia. Após 48 horas de indução, a média de CMs observadas no grupo 4

foi superior aos demais grupos e a média do grupo 2 também foi superior à do grupo 1 (p=0,001)

e do grupo 3 (p=0,001). No último dia de contagem, os grupos 2 e 4 não diferiram quanto ao

número de células, no entanto suas médias foram superiores às do grupo 1 e 3 (Figura 19).

Após a medição do perímetro das células, observou-se que o grupo 1 manteve em média

um perímetro de 4665,73µm ao longo dos três dias de observação. As CMs dos grupos 2, 3 e 4

aumentaram seu perímetro por 72 horas (Tabela 3, Figura 20). Nos dias 1 e 2 de observação

(24 e 48 horas), o perímetro médio das células do grupo 4 foi superior às dos grupos 1,2 e 3.

No dia 3 de aferição, os perímetros médios das células dos grupos 2 e 4 foram bastante

semelhantes (Tabela 3, Figura 21).


45

Considerando a área como aspecto morfológico das CMs, o grupo 1 manteve em média

uma área de 1732325,88 µm2 ao longo dos três dias de observação. As CMs dos grupos 2 e 3

aumentaram sua área progressivamente por 72 horas e a área média das células do grupo 4 foi

semelhante em 48 horas (38267080,00 µm2) e 72 horas (37788644,00 µm2) (Tabela 4, Figura

22). Nos três dias (dias 1,2 e 3) de observação, a área média das células do grupo 4 foi superior

às dos grupos 1,2 e 3 (Figura 23).

4.2. Mudanças fenotípicas das CMs

Após 72 horas de observação, procedeu-se a imunocitoquímica dos 4 grupos do

experimento. Foi realizado o fechamento dos filtros do microscópio de fluorescência para validar

a marcação. As células dos grupos 1 e 3 não expressaram nenhuma proteína glial ou neuronal,

em contrapartida, as populações do grupo 2 expressaram GFAP (Figura 24) e OX-42 (Figura 25).

As populações de células do grupo 4 expressaram GFAP, OX-42, MAP-2, β-tubulina III, NeuN e

NF-200 (Figura 26). Outrossim, as alterações morfológicas das células se fazem novamente

presentes e, agora, mais frequentes no grupo 4.

No grupo 2 observou-se um princípio de migração das imunorreatividades do GFAP e OX-

42 do citoplasma para o compartimento nuclear das células, além de uma maior intensidade

dessa marcação. Ainda é possível observar a marcação no compartimento citoplasmático, com

uma intensidade menor e menos ampla (Figuras 27, 28 e 29).

No grupo 4 foi possível localizar diversas células apresentando um formato bipolar

característico (Figuras 34 e 35), concomitantemente com células com morfologia tipicamente

mesenquimal (Figuras 30 e 36). Observou-se uma marcação de intensidade maior e uniforme

por todo citoplasma para β-tubulina III (Figura 33) bem como nos compartimentos nucleares

para OX-42 e MAP-2 (Figura 31 e 32).

Em média, foram observadas 14 células imunomarcadas para GFAP e 17 células para OX-

42 por campo de observação no grupo experimental 2. No grupo 4, destacou-se o número de

células positivas para NeuN e MAP-2 (Tabela 5). As células positivas para NF-200 apresentaram

maiores perímetro e área no grupo 4 (Tabelas 6 e 7). Comparando-se o número celular dos

grupos 2 e 4, não houve diferença estatística entre as células positivas para GFAP (p=0,931) e

OX-42 (p=0,340) (Figura 37). Em contrapartida, a média dos perímetros das células positivas


46

para GFAP (p=0,001) e OX-42 (p=0,001) do grupo 2 foi maior do que as células do grupo 4

(Figura 38). Nessa mesma perspectiva, em média, as área das células imunomarcadas para

GFAP do grupo 2 foram maiores que as do grupo 4 (p=0,001) (Figura 39).

Figura 13. Células mesenquimais confluentes antes do primeiro subcultivo (10x).

Escala: 100 µm.


47

Figura 14. Explantes de nervo facial reativos. Painel A: 4x. Painel B:10x. Escala: 100 µm.

Figura 15. Ramo mandibular do nervo facial dissecado: painel A. Explante de nervo

facial viável sob magnificação de lupa esteriológica: painel B.

B A

A

B


48

Figura 16. Morfologia de células mesenquimais após formação dos grupos experimentais por

72 horas. Grupo 1: Painéis A (24 horas), B (48 horas), C (72 horas); Grupo 2: Painéis D (24

horas), E (48 horas), F (72 horas); Grupo 3: Painéis G (24 horas), H (48 horas), I (72 horas);

Grupo 4: Painéis J (24 horas), K (48 horas), L (72 horas). Escala: 100 µm.

A B C

D E F

G H I

J K L


49

Figura 17. Aspecto morfológico das células mesenquimais. Grupo 2: painéis A (Célula bipolar)

e B (Célula com prolongamento secundário); Grupo 4: painéis C (Célula com prolongamento

primário) e D (Célula tripolar) (10x). Escala: 100 µm.

B

C

A

D


50

Tabela 2. Descrição da amostra dos grupos 1,2,3 e 4 de acordo com o número celular.

Grupo 1

Número celular Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 45,22 ± 24,21 49,00 28,00 – 62,50 0,00 82,00

48 horas 30,77 ± 9,20 27,00 24,00 – 37,50 20,00 48,00

72 horas 57,22 ± 33,08 51,00 39,00 – 58,00 32,00 142,00

Grupo 2


24 horas 191,00 ± 82,30 148,00 134,50 – 266,50

96,00 336,00

48 horas 209,88 ± 51,37 200,00 161,50 – 261,00

145,00

286,00

72 horas 312,66 ± 142,00

380,00 174,00 – 439,50

107,00

478,00

Grupo 3


24 horas 25,66 ± 13,09 21,00 15,00 – 35,50 12,00 51,00

48 horas 30,77 ± 6,35 31,00 24,50 – 37,50 21,00 38,00

72 horas 50,88 ± 21,06 44,00 35,50 – 69,50 25,00 84,00

Grupo 4


24 horas 124,11 ± 33,24 127,00 87,00 – 145,00

84,00 182,00

48 horas 321,66 ± 108,02

340,00 230,50 – 402,50

166,00

501,00

72 horas 396,88 ± 35,66 413,00 373,00 – 418,00

326,00

435,00


51

Figura 18. Número de células mesenquimais observadas em cada grupo experimental de

acordo com o dia de observação. P valores (a=0,047; b=0,004; c=0,024; d=0,001; e=0,001;

f=0,0085).

a

b

c

d

e f


52

Figura 19. Número de células mesenquimais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com o

grupo experimental. P valores (a=0,006; b=0,0027; c=0,001; d=0,001; e=0,001; f=0,001;

g=0,002; h=0,001; i=0,001; j=0,001; k=0,001, l=0,001; m=0,001; n=0,001).

a

b c d

e

f g

h

i j

k

l m n


53

Tabela 3. Descrição da amostra dos grupos 1,2,3 4 de acordo com a perímetro celular.

Grupo 1

Perímetro celular n Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 404 11054,57 ± 78913,44

4665,73 4665,73 – 4665,73

2469,11

1586803,00

48 horas 254 13077,18 + 11648,15

4665,73 4665,73 – 21136,73

4665,73

81147,50

72 horas 513 16325,49 + 15614,68

4665,73 4665,73 – 29131,72

4665,73

83586,23

Grupo 2


24 horas 1697

5468,59 + 5433,29

4665,73 4665,73 – 4665,73

4665,73

94683,77

48 horas 1893

12925,73 + 6490,62

13064,00 10264,61 – 17731,02

4665,73

90473,96

72 horas 2832

24956,01 + 6247,94

24985,75 22223,14 – 31162,22

13925,48

33413,02

Grupo 3


24 horas 231 8705,32 + 1632,56

7931,74 7465,17 – 8864,89

6998,60

11664,33

48 horas 278 13070,00 +

8908,58 9798,04

9331,46 – 12597,48

7931,74

69635,92

72 horas 457 17082,46 +

7748,90 12597,48

11664,33 – 27809,21

11197,76

65922,86

Grupo 4


24 horas 1123

14331,17 + 7064,46

11197,76 10731,00 – 15863,49

9798,04

80529,78

48 horas 2888

21038,53 + 3894,01

21928,94 18196,35 – 22395,51

11662,94

30391,65

72 horas 3572

23999,42 + 5714,33

25934,65 20529,22 – 27061,24

13997,19

32562,13


54

Figura 20. Perímetro de células mesenquimais observadas em cada grupo experimental de

acordo com o dia de observação.


55

Figura 21. Perímetro de células mesenquimais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo

com o grupo experimental.


56

Tabela 4. Descrição da amostra dos grupos 1,2,3 4 de acordo com a área celular.

Grupo 1

Área celular n Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

24 horas 404 2714381,45 ± 3075368,38

1732325,88

1732325,88 – 1732325,88

121314,31

31381102,00

48 horas 254 6849509,45 + 8815299,34

1732325,88

1732325,88 – 9485166,75

702456,50

60782524,00

72 horas 513 6256836,89 + 8379608,40

1732325,88

1732325,88 – 12591570,00

1064198,8

8

101780568,00

Grupo 2


24 horas 1697

2574334,34 + 7051044,97

1732325,88

1732325,88 – 1732325,88

485233,47

133456776,00

48 horas 1893

12662561,14 + 10291699,26

12628657,00

8141735,50 – 16647654,00

286808,06

211688896,00

72 horas 2832

14559497,66 + 5127512,10

12881083,00

12056712,00 –

17005772,00

7030549,0

0

27579210,00

Grupo 3


24 horas 231 6017155,59 + 2792298,46

50006422,50

4434754,50 – 6253696,50

443474,50

10827037,00

48 horas 278 10089865,47 +

6045171,38 7639557,

50 6929303,50 – 12628657,00

5006422,5

0

71766684,50

72 horas 457 14940910,68 +

4769537,99 1262865

7,00

10827037,00 –

20567784,00

5983066,5

0

51301520,00

Grupo 4


24 horas 1123

14504653,23 + 9516465,87

9978198,00

9164005,00 – 20025690,00

7639557,5

0

108552056,00

48 horas 2888

35313306,33 + 10936165,75

38267080,00

26348680,00 –

39912792,00

5668554,0

0

48661040,00

72 horas 3572

39222612,96 + 17025208,09

37788644,00

21480392,00 –

58275448,00

15590933,

00

62363732,00


57

Figura 22. Área de células mesenquimais observadas em cada grupo experimental de

acordo com o dia de observação.


58

Figura 23. Área de células mesenquimais observadas nos dias 1,2 e 3 de acordo com o

grupo experimental.


59

Figura 24. Células mesenquimais do grupo 2 submetidas a imunofluorescência dos anticorpos

GFAP (Alexa Fluor 488) (4x). Escala: 100 µm.

Figura 25. Células mesenquimais do grupo 2 submetidas a imunofluorescência do

anticorpo OX-42 (TRITC) (4x). Escala: 100 µm


60


anticorpos GFAP (Alexa Fluor 488): painel A, OX-42 (Alexa Fluor 594): painel B, MAP-2 (Alexa

Fluor 488): painel C, β-tubulina (FITC): painel D, NeuN (Alexa Fluor 488): painel E, NF-200

(Alexa Fluor 488): painel F (4x). Escala: 100 µm.

A

E F

B

D C


61


anticorpo GFAP (Alexa Fluor 488). Painéis A,B,C,D (10x). Escala: 100 µm.

A B

C D


62


anticorpo OX-42 (TRITC). Painéis A,B,C,D (10x). Escala: 100 µm.

A B

C D


63


anticorpos GFAP (Alexa Fluor 488): painel A, OX-42 (TRITC): painel B (20x). Escala: 100 µm.

A

B


64


anticorpo GFAP (Alexa Fluor 488). Painéis A,B,C,D (10x). Escala: 100 µm.

A B

C D


65


anticorpo OX-42 (TRITC). Painéis A,B,C,D (10x). Escala: 100 µm.

A

C

B

D


66


anticorpo MAP-2 (FITC). Painéis A,B,C,D (10x). Escala: 100 µm.

A B

C D


67


anticorpo β-Tubulina (FITC). Painéis A,B,C,D (10x). Escala: 100 µm.

A B

C D


68


NeuN (Alexa Fluor 488). Painés A,B,D,F (10x). Painel E (4x). Painel C (20x). Escala: 100 µm.

B

D

A

C

C


69


NF-200 (Alexa Fluor 488). Painés A,B,D,F (10x). Painel E (4x). Painel C (20x). Escala: 100 µm.

A B

C D


70

Figura 36. Células mesenquimais do grupo 4 submetidas a imunofluorescência dos anticorpos

GFAP (Alexa Fluor 488): painel A, OX-42 (TRITC): painel B, MAP-2 (Alexa Fluor 488): painel C,

β-tubulina (FITC): painel D, NeuN (Alexa Fluor 488): painel E, NF-200 (Alexa Fluor 488):

painel F (20x). Escala: 100 µm.

A B

C

E

D

F


71

Tabela 5. Descrição da amostra positiva para GFAP e OX-42 dos grupos 2 e 4 de acordo com o número

celular.

Tabela 6. Descrição da amostra positiva para GFAP e OX-42 dos grupos 2 e 4 de acordo com o perímetro

celular.

Grupo 2


GFAP 13,33 + 4,89 14,00 11,00 – 15,50 4,00 22,00

OX-42 18,44 + 4,39 17,00 16,00 – 21,00 13,00 28,00

Grupo 4


GFAP 17,66 + 9,60 15,00 11,50 – 19,00 8,00 41,00

OX-42 18,55 + 7,23 18,00 12,00 – 25,00 10,00 30,00

MAP-2 21,33 + 7,96 20,00 14,50 – 29,00 11,00 32,00

β Tubulina III 20,44 + 13,29 15,00 11,00 – 28,50 9,00 48,00

NeuN 21,44 + 8,01 20,00 16,00 – 27,00 11,00 37,00

NF-200 19,55 + 7,50 17,00 13,00 – 27,00 11,00 32,00

Grupo 2: Perímetro

Marcador n Média ± dp Mediana Q 25-75 Mín Máx

GFAP 120 22081,21 +

7382,07 22693,31

19519,12 – 27415,13

10731,18

59241,02

OX-42 166 12733,70 +

8725,99 11630,00

8650,60 – 14500,90

5672,10

112434,90

Grupo 4: Perímetro


GFAP 159 15920,77 +

5150,04 14611,17

12163,24 – 20867,68

7477,44

34269,78

OX-42 167 9324,84 + 1607,72

9331,46 7931,74 – 9331,46

5132,30

13064,04

MAP-2 192 6530,98 + 1439,52

6532,02 6065,45 – 6532,02

4665,73

12922,84

β Tubulina III 184 8149,81 +

970,51 8398,32

6998,60 – 8864,89

6065,45

11664,45

NeuN 193 17030,20 +

6712,46 14251,45

12300,69 – 22230,33

8276,89

28180,02

NF-200 176 20935,27 +

4210,19 21278,95

17297,03 – 24781,42

13278,79

26059,92


72

Tabela 7. Descrição da amostra positiva para GFAP e OX-42 dos grupos 2 e 4 de acordo com a área

celular.

Grupo 2: Área


GFAP 120 13488020,55 +

5399889,27 1371787

2,00

11273704,00 -

13989444,00

6208952

48722992

OX-42 166 8081388,05 + 5603578,05

5525187,50

3584212,80 – 10184646,00

1596952,0

0

18865028,00

Grupo 4: Área


GFAP 159 8730083,53 + 5297002,91

5144688,50

4353420,50 – 12947264,00

2660580,0

0

29431936,00

OX-42 167 7101237,98 + 2578826,92

6929303,50

5006422,50 – 6929303,50

2096114,5

0

13581435,00

MAP-2 192 3367148,40 + 1774559,21

3395358,75

2277349,75 – 3395358,75

1732325,8

8

9978198,00

β Tubulina III 184 5360042,52 + 1290120,82

5612736,50

3897733,25 – 6253696,50

2927631,0

0

10827037,00

NeuN 193 8803854,04 + 6860443,50

6967184,00

4483014,00 – 10818813,00

2872880,0

0

31673478,00

NF-200 176 11361022,34 +

3810214,28 1148321

4,00 8932980,00 – 13471005,00

5618929,0

0

23410362,00


73

Figura 37. Número de células mesenquimais observadas nos grupos 2 e 4 positivas para GFAP

e OX-42. P valores (a=0,340; b=0,931).

a

b


74

Figura 38. Perímetro de células mesenquimais observadas nos grupos 2 e 4 positivas para

GFAP e OX-42. P valores (a=0,001; b=0,001).

a

b


75

Figura 39. Área de células mesenquimais observadas nos grupos 2 e 4 positivas para GFAP e

OX-42. P valores (a=0,001; b=0,041).

a

b


76

5. Discussão

5.1. O uso de CTMs e seu potencial regenerativo

Especificamente, o reparo nervoso periférico requer uma complexa interação entre um

guia para crescimento axonal, células de suporte como as CSs, fatores de crescimento e matriz

extracelular (Costa et al., 2009). O reparo de defeitos periféricos nervosos tem sido um problema

para os cirurgiões em diferentes especialidades. Várias modalidades de tratamento tem sido

investigadas ou recomendadas. A neurorrafia direta, coaptação dos cotos distal e proximal, é a

escolha de preferência (Di Summa et al., 2011). No entanto, em muitos casos, isto não é possível

devido ao longo espaço (defeito) entre os segmentos nervosos separados. Enxertos nervosos

autólogos, interposições de enxertos musculares, enxertos venosos e arteriais e o uso de

condutos nervosos tem sido utilizados como alternativas. Muitos modelos de lesão, diferentes

combinações de tipos celulares, o uso de diversos tipos de condutos bem como os protocolos de

avaliação embasam esse novo campo da ciência (Ghoreishian et al., 2013). A combinação de

guias axonais e células transplantadas prevê um suporte adequado para regeneração neural, e

tem sido investigada como uma estratégia para suprir as limitações de procedimentos cirúrgicos

(Rodrigues et al., 2012).

As CSs são células gliais do SNP, que envolvem os axônios e facilitam a condução do

impulso nervoso. Na degeneração axonal Waleriana, as CSs com macrófagos mediam os passos

iniciais para remoção de mielina. Elas proliferam, migram para formar as bandas de Büngner e

secretam fatores neurotróficos que ajudam a estabelecer um ambiente favorável para inervação

precisa do tecido alvo. No entanto, existem limitações inerentes de uso direto no reparo nervoso

experimental, já que essas células vem de recursos restritos e tem disponibilidade limitada (Wei

et al., 2010). CTs ou CSs de forma isolada ou em cultura tem sido empregadas no reparo

cirúrgico de nervos periféricos (Salomone et al., 2013).

As CTs são fundamentais construtoras de blocos de vida, elas não só coordenam o

crescimento do organismo do embrião até a vida adulta, mas também detém um papel

fundamental na regeneração e reparo. São critérios fundamentais para identificar uma CT: ser

indiferenciada; ter capacidade proliferativa; ser auto renovável; produzir um largo número de


77

progenitores funcionais diferenciados e ter capacidade regenerativa tecidual após injurias (Tohill

et al., 2004). Nos últimos anos, tem sido amplamente considerado que as CMs possuem

potencial de se diferenciarem em diversas linhagens celulares.

As CMs derivadas de medula óssea são vistas como uma fonte promissora de CTs pela

sua acessibilidade, pelo seu potencial proliferativo e pela sua capacidade de diferenciação. Essas

células se originam parcialmente da crista neural durante o desenvolvimento. As técnicas

utilizadas para a purificação, expansão e diferenciação osteogênica, condrogênica e adipogênica

de CMs humanas podem sanar os desafios da engenharia tecidual (Liu et al., 2013). CMs, que

são multipotentes, satisfazem o requisito para células transplantadas ideais que guardam acesso

rápido, rápida expansão in vitro e pobre imunogenicidade. Além disso, podem se diferenciar em

CSs (Keilhoff et al., 2006).

As CMs são reconhecidas pela expressão de um complexo de antígenos, incluindo

marcadores de CTs hematopoiéticas (CD45 e CD34), marcadores endoteliais (CD31/PECAM-1)

e pela expressão de marcadores moleculares de superfície (CD105, CD73, CD106, CD44, CD90,

CD29 e STRO-1) (Krampera et al., 2007). Estudos também demonstraram que a aderência direta

foi o método preferencial para o isolamento e purificação de CMs (Rouger et al., 2007; Yang e

Yang, 2008). A identificação de CMs também foi baseada principalmente nas características

morfológicas e funcionais. As imagens do cultivo celular demonstraram que as células tinham

uma forma estrelada e eram aderidas ao fundo das placas. De forma semelhante, a adesão

celular bem como a viabilidade no meio DMEM e o aspecto morfológico das células foram

utilizados para caracterizá-la como mesenquimal em nosso estudo.

Em 2002, Kabos et al. demonstraram em primeira instância, que uma cultura primária

de CMs poderia diferenciar-se tardiamente em neurônios e células da glia. Essas células com sua

acessibilidade e potencial para expansão in vitro poderiam ser boas candidatas para o

transplante e reparo no sistema nervoso. Vários trabalhos tem demonstrado que o uso de CTs

pode substituir o uso de CSs no ambiente lesado (Ishikawa et al., 2009; Wakao et al., 2010;

Wei et al., 2010; Salomone et al., 2013). Seu uso no reparo cirúrgico de nervos periféricos tem

melhorado a regeneração axonal e o reconhecimento funcional (Dezawa et al., 2001).

Recentemente, Costa et al. (2013) concluíram que CTs indiferenciadas associadas a

enxertos nervosos ou condutos de ácido poliglicólico, apresentaram melhora funcional e


78

morfológica em modelos de nervos faciais traumatizados. Salomone et al., (2013) empregaram

implantes celulares em condutos de silicone suturados em nervos. Seus resultados

demonstraram melhores escores de amplitudes de potenciais de ação nos grupos experimentais

que usaram células. De maneira semelhante Wang et al. (2011) demonstraram que CMs de

coelho diferenciadas em CSs foram efetivas na regeneração de nervo facial e mielinização

quando combinadas com condutos venosos autólogos. A recuperação funcional do nervo facial é

dependente do crescimento de novos axônios, mielinização e sua correta reinervação do órgão

alvo. Nesse estudo, os nervos seccionados tratados com CSs e veias foram mais efetivos na

mielinização de novos axônios regenerados.

O uso de células neurais de outros tecidos, tais como as do cérebro, pode causar danos

mais sérios. A zona subventricular e o hipocampo são os principais recursos de CTs neurais

adultas no cérebro humano (Gage, 2000). Uma craniotomia deve ser feita para obtenção de

tecido da zona subventricular ou hipocampo, que pode resultar em grandes áreas de danos

cirúrgicos. Dessa maneira, é necessário a obtenção de células neurais progenitoras ou CSs de

outros recursos. Em resposta a injurias, estas células proliferam, migram para o sítio de lesão e

se diferenciam em neurônios e células gliais que são encarregadas do processo de reparo

(Belkind-Gerson et al., 2013).

Zhang et al. (2008) injetaram CTs neurais em condutos colágenos suplementados com

neurotrofina-3 em nervos faciais transseccionados de coelhos. Essas foram notadas por aderirem

ao tubo e tenderam a se diferenciarem depois de serem cultivadas por 24 e 48 horas. A produção

de processos e crescimento neuríticos foram evidentes, comparado com as neurosferas isoladas.

A neurotrofina-3 que é um fator neurotrófico da família das neurotrofinas ajuda na sobrevivência,

crescimento e diferenciação de novos neurônios in vivo e in vitro. O nicho reativo poderia induzir

CTs neurais em progenitores e células efetoras de linhagem neural que poderiam melhorar a

regeneração e diminuir a degeneração. Além disso, a baixa imunogenecidade e aintigenecidade

são os pontos fortes da CTs neurais.

Em 2005 Parker et al., sumarizaram as propriedades das CTs nervosas como se seguem:

possuem um multipotencial de diferenciação a podem produzir três tipos de células neurais

maduras (neurônios, astrócitos e oligodendrócitos) em muitas regiões; podem produzir novas

células homólogas após uma injuria nervosa; podem ser continuamente transplantadas e podem


79

se autorenovar. A aplicação de CSs em nervos artificiais tem se tornado concreta. No entanto,

existem certas limitações como o recurso limitado de células, a necessidade de uma cirurgia

secundária e a rejeição imunológica de enxertos exógenos (Guo e Dong, 2009).

Para que as células funcionem adequadamente, elas devem se organizar no espaço e

interagir mecanicamente com o ambiente ao se redor. Devem apresentar uma conformação

correta, serem fisicamente robustas e estar estruturadas de forma adequada internamente.

Muitas células devem também ser capazes de modificar sua forma e migrar para outros locais.

Além disso, toda célula deve ser capaz de reorganizar seus componentes internos como

decorrência dos processos de crescimento, divisão e/ou adaptação a mudanças no ambiente

(Alberts et al., 2010).

Ainda não está claro quais mecanismos governam a diferenciação in vivo e a migração

de CMs para as zonas injuriadas; no entanto, é provável, que a presença de fatores

neurotróficos, citocinas e CTs locais tenham alguma influência. A compreensão do ambiente em

que essas células são cultivadas possibilita o entendimento de melhores métodos de expansão

celular bem como a criação de distintos protocolos de plasticidade. Células adultas

indiferenciadas em contato com algum tecido são influenciadas pelo ambiente do órgão que o

envolve, isto é, por fatores epigenéticos. Uma vez que são removidos, elas estão livres para

assumirem um destino diferente (Rieske et al., 2009).

Em nosso estudo foram utilizados 4 meios de cultura distintos. As CMs pertencentes ao

grupo 1 foram cultivadas apenas com meio DMEM. Ao meio DMEM foi adicionado FGF-2 para o

cultivo celular do grupo 3. No grupo 2, o meio DMEM foi condicionado a partir de explantes do

nervo facial. Por fim, no grupo 4 foi usado o meio condicionado acrescido de FGF-2. Nossos

resultados demonstraram que a média de células contadas no grupo 2 foi superior ao número

de células dos demais grupos em 24 horas. No segundo dia pós indução, a média de CMs

observadas no grupo 4 foi superior aos demais grupos e no último dia de contagem, os grupos

2 e 4 não diferiram quanto ao número de células. De uma forma geral, a atividade proliferativa

encontrada sobretudo nos grupos 2 e 4 revelam uma importante característica das CMs: uma

rápida expansão num curto período de tempo.

Outros aspectos importantes destacados em nosso estudo, foram as mudanças

morfológicas adquiridas pelas células ao longo dos dias. As células que foram cultivadas pelo


80

menos com o meio condicionado (grupos 2 e 4) demonstraram mudanças morfológicas mais

rápidas e evidentes semelhantes em alguns momentos com neurônios e células gliais. Os

aspectos fibroblastóide e fusiforme também foram identificados. Esse último foi mais encontrado

nas células do grupo 4.

Kang et al. (2013) investigaram a diferenciação neural de CTs derivadas de músculos

seguidos do tratamento com FGF e um anticonvulsivante. As mudanças morfológicas observadas

nas culturas estimuladas com FGF por 24 horas foram condizentes com neurônios gabaégicos.

Por outro lado, as células tratadas FGF e anticonvulsivante foram mais parecidas com

oligodentrócitos. Ying et al. (2012) usaram o fator de crescimento epitelial o fator de crescimento

fibroblástico básico combinados ou não com BDNF para induzirem a diferenciação neuronal de

adipócitos. Após a diferenciação, as células exibiram mudanças morfológicas compatíveis com

formação axonal e projeções dendríticas.

A área e o perímetro celular foram também parâmetros elencados primordialmente para

descrição morfológica das células ao longo dos dias. No entanto, não foram tão confiáveis para

análise estatística inferencial já que seus valores apresentaram-se muito dispersos após a

aferição. Ou melhor, os perímetros e áreas celulares variaram muito ao longo dos dias de

observação.

5.2. Microambiente celular e plasticidade mesenquimal

O aspecto mais importante para a sobrevivência celular em um tecido receptor é o

microambiente. Inicialmente, esse aspecto está relacionado a expressão celular de marcadores

de adesão de superfície que interagem com componentes da matriz extracelular. Adicionado aos

efeitos parácrinos dos fatores de crescimento secretados pelas células adjacentes, o

microambiente possibilita condições para a sobrevivência, migração, invasão tecidual e

diferenciação (Caddick et al., 2006). Correntemente, a diferenciação neuronal pode ser atingida

de 4 maneiras: uso de fatores neurotróficos ou citocinas, exposição a indutores químicos, a

combinação desses ou com co-culturas de células nervosas (Yang et al., 2014).

Em nosso trabalho, o meio criado a partir de fragmentos nervosos simulou uma situação

in vivo de injuria nervosa. Dessa maneira, esperava-se que os explantes se tornassem reativos

e secretassem naturalmente fatores que possibilitassem um ambiente favorável a regeneração


81

nervosa pós trauma. O número superior de células contadas nos grupos 2 e 4 bem como as

mudanças morfológicas mais evidentes são teoricamente reflexos do meio condicionado. O meio

DMEM utilizado como um controle foi muito importante para averiguar se as CMs adquiriam

fenótipos distintos sem nenhuma indução no decorrer dos dias. Como as propriedades dos

fatores neurotróficos são bastante discutidas, o uso do FGF-2 poderia potencializar os efeitos

fenotípicos das células bem como induzir uma maior atividade proliferativa.

Jia Lu et al. (2007) demonstraram a potencialidade de diferenciação de CMs de medula

óssea em células neuronais e gliais no cultivo e seguimento de infiltrado células em tecidos

cerebrais injuriados. CMs transplantadas em ratos com injurias traumáticas cerebrais exibiram

marcadores neurais. Por 1 semana, após o enxerto, células transplantadas expressaram

marcadores para neurônios, astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Segundo eles, a

diferenciação de CMs injetadas poderiam também ter sido induzida pela produção de fatores

neurotróficos por neurônios/glia locais. O uso desses fatores poderia regular a plasticidade

cerebral em reposta a injuria traumática cerebral.

A diferenciação é mais bem compreendida considerando que cada célula é dotada de duas

características: diferenciação e potencialidade. Diferenciação é o grau de especialização da

célula, enquanto a potencialidade é a capacidade que a célula tem de originar outros tipos

celulares. As primeiras células embrionárias (blastômeros) da maioria das espécies podem

originar qualquer tipo celular. Essas células tem o grau de diferenciação zero, e portanto 100%

de potencialidade. Dessa maneira, são classificadas como totipotentes. São consideradas

pluripotentes as células derivadas dos folhetos embrionários e multipotentes as células que

derivam progenitores exclusivos de suas linhagens (Junqueira e Carneiro, 2013).

Nesse universo, a especificidade primorosa dos anticorpos por antígenos específicos,

transformam-nos em valiosos reagentes para a detecção, purificação e quantificação de

antígenos e consequentemente possibilita o uso de protocolos para denotar diferenciação ou

plasticidade celular. Nessa perspectiva, esse estudo utilizou a imunocitoquímica como técnica

de escolha para possível identificação de plasticidade das CMs diante de meios de cultivo

distintos. Para tanto, foram elencados marcadores de linhagem neuronal (MAP-2, β-tubulina III,

NeuN e NF-200) e marcadores de linhagem glial (GFAP e OX-42).


82

Proteínas que se ligam lateralmente aos microtúbulos são coletivamente chamadas de

proteínas de associação a microtúbulos (MAPs). Assim, as MAPs podem estabilizar os

microtúbulos, prevenindo sua dissociação. Células que superexpressam MAP-2, a qual apresenta

longos domínios projetados, formam feixes de microtúbulos estáveis com um amplo

espaçamento. Os microtúbulos são longos cilindros ocos formados pela proteína tubulina. A

tubulina ocorre em todas as células eucarióticas, podendo ser encontrada sob múltiplas

isoformas. As diferentes formas de tubulina são bastante similares e geralmente copolimerizam

em microtúbulos mistos em testes in vitro. No entanto, elas apresentam posicionamento celular

distinto e realizam tarefas relativamente diferentes (Alberts et al., 2010).

No desenvolvimento neurogênico, β-Tubulina III é expressa em neurônios em um estágio

mais precoce do desenvolvimento, e certas isoformas de MAP-2 são expressas precocemente

durante a diferenciação neuronal de células precursoras (Huang et al., 2007). Β-tubulina III é

um confiável marcador de diferenciação neuronal por ser expresso em neurônios maduros e

células neurais progenitoras (Schwindt et al., 2009).

NeuN é uma proteína nuclear neuronal específica de vertebrados. A coloração

imunocitoquímica é primeiramente vista no núcleo se estendendo até o citoplasma. Sua

imunoreatividade é observada precocemente após mitoses neuronais. É um excelente marcador

de neurônios em culturas primárias. Os filamentos intermediários são fibras compostas por

proteínas de filamentos intermediários, as quais pertencem a uma grande e heterogênea família.

Os neurofilamentos são encontrados em altas concentrações nos axônios dos neurônios

dos vertebrados. Durante o crescimento do axônio, novas subunidades de neurofilamentos são

incorporadas ao axônio em um processo dinâmico que envolve tanto a adição de subunidades

longitudinalmente ao comprimento do filamento quanto a adição de subunidades às

extremidades do filamento (Schwindt et al., 2009). A proteína ácida fibrilar glial é um elemento

estrutural de astrócitos fibrilares. GFAP é usado como um marcador astrocítico, mas também

pode ser expresso em células neurais progenitoras imaturas (Schwindt et al., 2009) e o anticorpo

OX-42 marca células dendríticas extensivamente, granulócitos e células com morfologia de

micróglia no cérebro.

Nossos experimentos demonstraram que as células do grupo 2 e 4 expressaram GFAP e

OX-42. Além desses achados, as células que foram cultivas com o meio condicionado acrescido


83

de FGF-2 expressaram ainda MAP-2, Β-tubulina III, NeuN e NF-200. Hipotetizamos que o fator

de crescimento fibroblástico potencializou a plasticidade das células do grupo 4. A expressão

desses anticorpos num curto período de tempo pós indução (4 dias) pode ser justificado pela

evidente reatividade dos explantes nervosos. A forma histológica com que o nervo facial está

organizado possivelmente explica a alta e rápida reatividade bem como uma possível deposição

de fatores neurotróficos no meio condicionado. O microambiente de lesão periférica simulado

pelo meio condicionado a partir de explantes de nervo facial pode justificar a rapidez da

plasticidade neuronal e glial encontrada.

Recentemente, Liu et al (2013) fizeram indução neuronal em três culturas de CMs e

avaliaram seus achados entre os subcultivos 3 e 5. Em 20% de confluência celular, as CMs foram

induzidas com meio de indução neuronal consistindo em DMEM/F12, soro fetal bovino,

suplemento B27, 20ng/ml de fator de crescimento fibroblástico básico e 20g/ml de fator de

crescimento epidermal. Após 7 dias, o meio foi suplementado com ácido retinóico, e as células

foram cultivadas por mais 7 dias. As CMs tornaram-se mais finas e com longas protrusões. As

CMs normais também expressaram β-tubulina III, sugerindo que essas células foram

multidiferenciadas e então poderiam reter a habilidade de diferenciação neuronal.

De maneira semelhante, Taha et al. (2014) avaliaram a efetividade de um meio contendo

um soro sintético (KoSR) para diferenciação neuronal em CTs embrionárias e CTs derivadas de

adipócitos de ratos. Além disso, também foi comparado o potencial de diferenciação neuronal

de CTs derivadas de adipócitos cultivadas em meio com baixos níveis de soro e com soro sintético

e o efeito de fatores neurogênicos (β-ME) nestas duas condições foi examinado. Seus resultados

demonstraram que a diferenciação neuronal de CTs adipocíticas pode resultar em populações

heterogêneas (dopaminérgicas, glutaminérgicas e colinérgicas). A suplementação do meio de

indução com alguns fatores de crescimento e de diferenciação parecem ser necessários para a

produção de uma população neuronal específica.

Ainda em 2014, Zainal Ariffin et al. examinaram a diferenciação direta de CTs derivadas

de polpa dentária em neurônios na ausência de indução química. Para confirmar a diferenciação

das células de polpa dentária em um fenótipo neuronal e demonstrar que esse estágio não foi

um artefato, 3 análises foram feitas: observação de mudanças morfológicas, expressão de MAP-

2 e expressão de marcadores neuronais. Após dois dias de indução, a maioria das células se


84

assemelhava a neurônios. No entanto, algumas células com morfologia fibroblastóide eram ainda

observadas. Após 5 dias, as células se diferenciaram em neurônios quando cultivas em meio

livre de fatores de crescimento.

Segundo Rieske et al. (2009) a transição de um fenótipo astrocítico das CTs neurais

astrociticas para CMs é acompanhado pela auto regulação de marcadores neurais (GFAP, nestina

e β-tubulina III) e marcadorores característicos de CMs (fibronectina, colágeno I e vimentina).

Em seu estudo foram obtidas CMs a partir de CTs neurais e posteriormente essas células foram

diferenciadas em osteoblastos e adipócitos em resposta a condições indutivas osteogênicas e

adipogênicas. Dessa maneira, concluiu-se que CTs neurais são progenitoras de CMs.

Em 2007, Huang et al. avaliaram a plasticidade de células adiposas. Para iniciar a

diferenciação celular, as células foram lavadas com PBS, e DMEM com 10µM de forscolina, 200µM

de etanol à 0,5%, 5mM de KCl, 2 mM de ácido valpróico, 1 µM de hidrocortisona e 5µg/mL de

insulina. Após a indução neuronal, as CTs adipocíticas demonstraram mudanças na morfologia

celular incluindo retração citoplasmática, formação de axônios e projeções dentríticas. Além

disso, as CTs adipocíticas demonstraram MAP-2 e β-Tubulina III ao longo do corpo celular e

processos neuríticos, em um modelo similar à neurônios. Nesse mesmo ano, Krampera et al.

(2007) trataram CMs de medula óssea com diferentes moléculas e fatores de crescimento. Foram

evidenciadas rápidas mudanças morfológicas típicas de células neurais junto com a expressão

de marcadores neurais, tais como, nestina, neurofilamentos, MAP-2 e NeuN. Para indução

neural, o meio basal foi composto por DMEM e soro fetal bovino suplementado com 5 ng/mL de

fator de crescimento fibroblástico por 24 horas. Após essa pré-indução, as células foram lavadas

com PBS, e suplementadas com KCl, ácido valpróico e fosfolina.

Para iniciar a diferenciação neuronal de CMs, Safford et al. (2004) utilizaram meio alpha-

MEM sem soro, cloreto de potássio, ácido valpróico, forscolina, hidrocortisona e insulina. Após a

indução neuronal, as células adiposas expressaram β-tubulina III, MAP-2, e Tau. Β-tubulina III

e Tau são expressas em neurônios em estágios mais precoces do desenvolvimento, e certas

isoformas de MAP-2 são expressas precocemente durante o desenvolvimento neuronal. Outras

células expressaram NeuN e GFAP, sugerindo que no mínimo, algumas células adiposas podem

reter o potencial para desenvolvimento neuronal e glial. De acordo com Tondreau at al. (2004)

CMs podem co-expressar proteínas neuronais e gliais maduras e imaturas. A habilidade de CMs


85

indiferenciadas expressarem proteínas maduras ou imaturas de outros tecidos sem nenhuma

indução pode explicar sua capacidade de diferenciação facilmente em muitos outros tecidos.

O controle do tamanho da célula é um aspecto importante do desenvolvimento celular e

o controle da morfologia é essencial para a diferenciação e para o desenvolvimento de órgãos e

tecidos. O tamanho da célula depende do tipo celular e de seu estágio no ciclo celular

(Kharitonova e Vasiliev, 2008). No cultivo, as alterações do número, tamanho e área celular

acontecem durante o crescimento (Vasiliev, 2004). A forma é controlada por estruturas do

citoesqueleto interno e estruturas de adesão fixando a célula à superfície (Moizhess e Vasiliev,

2001; Rovensky et al., 2001).

O controle da forma celular envolve uma organização da membrana plasmática dentro

de uma superfície de contato com o ambiente extracelular (células vizinhas, matrix extracelular,

meio de cultura etc) (Levayer e Lecuit, 2007). As integrinas são versáteis receptores que

possibilitam o intercâmbio do meio celular externo com o meio interno. Muitos processos como

morfologia celular, motilidade, proliferação, diferenciação e morte celular são possíveis devido

esse trânsito (Docheva et al., 2007).

Em média, a área e perímetro das células do grupo 2 positivas para GFAP e a área das

células imunomarcadas para OX-42 foram maiores do que as do grupos 4 em nosso estudo.

Podemos inferir que morfologia e plasticidade foram grandezas inversamente proporcionais. As

células do grupo 4 tiveram área e perímetros menores por apresentarem maior plasticidade (isso

é explicado pelo fenótipo dos anticorpos neuronais). Claramente vê-se uma tendência que essas

células apresentaram maiores mudanças morfológicas condizentes com a organização do nosso

sistema nervoso: maior número de células com áreas menores e morfologias distintas (explicado

pelo perímetro). Uma completa caracterização das interações celulares, bioquímicas e

moleculares das CMs com o seu nicho é necessária para compreender como estas células podem

ser reguladas in vitro.


86

6. Conclusões

As CMs isoladas demonstram uma típica morfologia e rápida expansão, sobretudo as

células que foram expostas ao meio condicionado pelo nervo facial. Além disso, as características

morfológicas evidentes em alguns momentos semelhantes com neurônios e células gliais e a

significativa atividade proliferativa nos grupos 2 e 4 em um curto período asseguram seu

potencial de diferenciação in vitro sob a exposição a estímulos adequados. De uma forma geral,

o ambiente condicionado por explantes de nervo facial circundante às CMs, induziu mudanças

morfológicas bem como possibilitou plasticidade das células mesenquimais.

As CMs cultivadas com meio condicionado adquiriram um fenótipo condizente com uma

linhagem glial (GFAP e OX-42). O FGF-2 adicionado ao meio condicionado potencializou esse

efeito, de forma que as CMs expressaram proteínas neuronais (MAP-2, β-tubulina III, NeuN e

NF-200) e proteína gliais (GFAP e OX-42). Em média, a área e perímetro das células do grupo 2

positivas para GFAP e a área das células imunomarcadas para OX-42 foram maiores do que as

do grupo 4. Embora, as mudanças fenotípicas sejam consistentes com uma diferenciação

neuronal e glial nas CMs de medula óssea tratadas, não se pode dizer que essas células são de

fato neurônios ou células da glia funcionais. Mais estudos neurofisiológicos são necessários para

confirmar se essas células diferenciadas funcionam como neurônios no que diz respeito ao

desenvolvimento e manutenção de potenciais de membrana e potenciais de ação; ou células

gliais úteis no arcabouço e regeneração do sistema nervoso.

Nessa perspectiva construímos um protocolo viável, de fácil execução, em curto espaço

de tempo que possibilitou plasticidade de CMs numa linhagem neuronal e glial. Com as

crescentes evidências que suportam a presença de CTs em tecidos adultos e a sua aparente

plasticidade, é provável que estas células tornem-se importantes componentes da

bioengenharia. O presente estudo melhora nosso conhecimento sobre a plasticidade de CMs e

facilita a compreensão na busca por melhores técnicas com terapia celular no uso de doenças e

traumas no SNP.


87

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conselho nacional de desenvolvimento científico e tecnológico

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