Concentração

Potência a emissão de fluorescência (F) é proporcional à potência radiante do feixe de

excitação que é absorvido pelo sistema

F = emissão de fluorescência

Po = potência do feixe incidente

P = potência após ter percorrido um comprimento b do meio

K’ = constante que depende da eficiência quântica da fluorescência

bc

P

P 10

0

Lei de Beer

)101(´0

bcPKF

A expansão do termo exponencial resulta em uma Série de Maclaurin :

ε.b.c = A < 0,05: 2,303 ε.b.c é muito maior que os outros termos:

P0 constante

Concentração

...]!3

)303,2(

!2

)303,2(303,2[´

32

0

bcbcbcPKF

]303,2[´0

bcPKF

KcF

Soluções diluídas: fluorescência proporcional à concentração

Desvios da linearidade:

- 2,303εbc > 0,05: outros termos são significativos

- auto-supressão

- auto-absorção

Concentração

Auto-supressão

Auto-supressão

Colisões entre moléculas excitadas

com a concentração ocorrência de colisões

Transferência de energia não radiativa

Auto-supressão

Antraceno em diclorometano

Auto-absorção

Auto-absorção

de emissão se superpõe a um pico de absorção

Fluorescência: emissão atravessa

a solução e é reabsorvida por outras moléculas

fluorescentes

Antraceno em diclorometano

10-3

10-6

Supressão de fluorescência

do inglês, Quenching

efeito que diminui a intensidade de fluorescência

o mecanismo pode envolver o estado excitado ou o fundamental do fluoróforo

Supressão dinâmica

Transferência de energia não radiativa da espécie

excitada para outras moléculas

Supressão colisional

Contato entre supressor e espécie excitada

Rendimento quântico e o tempo de vida

Supressão de fluorescência

Formação de um complexo não fluorescente entre

supressor e fluoróforo no estado fundamental

Supressão estática

Tempo de vida não é afetado

Espectros de excitação, fluorescência e fosforescência

Fenantreno

Como medir a fluorescência?

Instrumentação similar à UV-VIS

Separar a radiação emitida daquela incidente utilizada para excitar a amostra

Fluorescência ocorre em todas as direções, mas é melhor observada quando medida à 90o

em relação ao feixe incidente

Configuração típica

Configuração típica

Transmite a radiação que excita a

fluorescência, mas exclui ou limita a

radiação do de emissão fluorescente.

Configuração típica

Transmite a radiação que excita a

fluorescência, mas exclui ou limita a

radiação do de emissão fluorescente.

Ângulo reto minimiza as

contribuições do espalhamento e

da radiação intensa da fonte.

Isola a emissão da

fluorescência

Componentes

FONTES DE RADIAÇÃO:

-lâmpadas de mercúrio (mais comum para fluorímetros), deutério, tungstênio e xenônio (para

espectrofluorímetros)

-diodos emissores de luz (450-475nm)

-lasers

SELETORES DE :

-filtros de absorção ou interferência

-monocromadores de rede

CÉLULAS DE MEDIDA:

-cilíndricas/retangulares

-vidro/sílica/quartzo

DETECTORES:

-fotomultiplicadoras

Fluorímetro e espectrofluorímetro

Fluorímetro – apenas filtros

Espectrofluorímetro – 2 monocromadores

Aplicações

Determinação de espécies inorgânicas

direta: formação de complexo fluorescente

supressão de fluorescência

Determinação de espécies orgânicas

produtos de plantas, esteróides, vitaminas

Sensores ópticos para a determinação de metais pesados

Reagente fluorescente sofre supressão na presença de metais pesados

Sensor para oxigênio usando fibra-óptica

Medidas de oxigênio parcialmente dissolvido

Exercício

Um comprimido anti-malárico, contendo quinino, possui uma massa de 1,664 g, e foi

dissolvido com HCl 0,10 mol L-1 em quantidade suficiente para fornecer 500 mL de solução.

Uma alíquota de 20,00 mL foi então diluída para 100,0 mL com o ácido. A intensidade da

fluorescência para a amostra diluída, em 347,5 nm, forneceu uma leitura de 245 em uma

escala arbitrária. Uma solução-padrão de 100 ppm de quinino registrou o valor de 125,

quando medida em idênticas condições. Calcule a massa em miligramas de quinino no

comprimido original.

Fosforescência

Fosforescência geralmente ocorre em um comprimento de onda maior que a

fluorescência (ET < ES)

Diferença entre os comprimentos de onda dos dois processos é uma medida da

diferença de energia entre os estados singlete e triplete

Determinação de espécies bioquímicas como ácidos nucleicos, aminoácidos e enzimas

Necessário medidas à baixas temperaturas

Atualmente: pesquisas para medidas a temperatura ambiente

Quimiluminescência

Reação química produz espécies em estados eletronicamente excitados, que emite luz

ao retornar para o estado fundamental.

Método altamente seletivo, simples e extremamente sensível.

Reação:

A + B → C* + D

C* → C + hν

onde C* representa o estado excitado da espécie C

Quimiluminescência x Bioluminescência

Quimiluminescência é um termo geral para produção de luz quando a energia de excitação

é proveniente de uma reação química (ao invés da absorção de fótons, em fluorescência)

Bioluminescência é a denominação de um fenômeno de quimiluminescência onde a

reação química é realizada em um organismo, como o vaga-lume por exemplo

Medida de quimiluminescência

A instrumentação para medida de quimiluminescência é muito simples e pode consistir

de somente um recipiente para a reação e um detector.

Geralmente não é necessário um dispositivo para seleção de comprimentos de onda,

uma vez que a única fonte de radiação é a reação química.

Sinal obtido:

Após a mistura de reagentes

Aplicações – análise de gases

Aplicações – espécies inorgânicas em fase líquida

Exercício

Íons de ferro (II) catalisam a oxidação do luminol para H2O2. A intensidade da

quimiluminescência resultante aumenta linearmente com a concentração de ferro (II)

entre 10-10 e 10-8 mol L-1.

Exatamente 1,00 mL de água foi adicionado a uma alíquota de 2,00 mL de uma solução

de Fe(II) de concentração desconhecida, seguida pela adição de 2,00 mL de uma solução

diluída de H2O2 e 1,00 mL de uma solução alcalina de luminol. A quimiluminescência da

mistura foi integrada durante um período de 10,0 s e apresentou o valor de 14,3.

A uma segunda alíquota de 2,00 mL da amostra foi adicionado 1,00 mL de uma solução

de Fe(II) 3,58x10-5 mol L-1, seguida pelo mesmo volume de H2O2 e luminol. A intensidade

integrada foi 33,3. Encontre a concentração de Fe(II) na amostra.