Boletín de la Sociedad Argentina de Botánica

Volumen XV I i I , N9 3-4 (Enero 1979), págs. 109-115

ACCION DE VITEXINA Y RUTINA EXÓGENAS SOBREACTIVIDAD Y COMPOSICION DE PEROXIDASAS EN

MELILOTUS ALBUS (LEGUMINOSAE) 1

POR MARIA TERESA AIAZZI y CARLOS A. GUZMAN 2

ABSTRACT

Changes in peroxidase activity and heterogeneity, of Melilotus albus werestudied. Four days old seedlings were treated with different concentrations ofRutine solubilized in destilled water and Vitexine solubilized in diluted Phosphatobuffer .067 M pH 7 and non diluted Phosphate buffer .067 M pH 7. Some variationwas also found at the morphological level as well as a greater development of theseedlings treated with Rutine. The electrophoretic patterns showed no changesamong treatments. Peroxidase activity was higher at 1 ppm of Rutine. Thetreatment with Vitexine showed a low activity when disolved in non dilutedPhosphate buffer .067 M pH 7.

INTRODUCCION

El objeto de este trabajo fue comprobar de qué manera fenolesde dos anillos aromáticos ( Flavonoides ) suministrados en distintas con¬centraciones pueden influir sobre algunos aspectos metabólicos del pro¬ceso de germinación en una especie de leguminosas, Melilotus alben nuestro caso actividad y composición de peroxidasas.

En el mismo se utilizó Vitexina, aislada de la corteza de Prosopisruscifolia vulgarmente llamado “vinal” (Oberti y Juliani, 1971: 101)y Rutina, compuestos clasificados dentro de los Heterósidos, más espe¬cíficamente dentro de los Fenolheterósidos.

Uno de los compuestos usados deriva de una flavona llamadaapigenina, la cual al tener un azúcar (Glucosa) unida C-C en posi¬ción 8 recibe el nombre de Vitexina denominada químicamente 8-C-beta-D-glucopiranosil 5,7,4’-trihidroxiflavona.

1 Trabajo realizado en el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Facultadde Ciencias Exactas, Físicas y Naturales de la Universidad Nacional de Córdoba.

2 Miembro de la Carrera del Investigador, Consejo Nacional de Investigacio¬nes Científicas y Técnicas. Buenos Aires. Argentina.

Aceptado para su publicación: 21-VII-1978.

US,

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Por otra parte el flavonol quercetina, puede glicosidarse en posi¬ción 3 con dos azúcares ( Glucosa -)- Ramnosa = Rutinosa ) originan¬do a la Rutina denominada químicamente 3-Ramnoglucopiranosil5,7,3',4’-tetrahidroxiflavona.

Las peroxidasas son enzimas conjugadas que se encuentran enla mayoría de los tejidos vivos. También se han podido detectaren material muerto y exudados de vegetales (Guzmán, 1972: 27;Guzmán et al. 1975: 87). Son enzimas ferroporfirínicas que actúancon un dador de hidrógeno que pueden ser pirogalol, guayacol,p-fenilendiamina (Goren y Goldschmidt, 1960: 153), bencidina (Isaacy Winch, 1947: 349; Gregory, 1966: 582; Guzmán et al. 1971: 2389)y un dador de oxígeno que pueden ser el peróxido de hidrógeno,metil peróxido (Lück, 1965: 895) y peróxido de urea (Delincéey Radola, 1970: 404).

Danks et al. (1975: 311) trabajando con inhibidores fenólicos:“ácido cinámico”, ácido clorogénico, ácido p-cumárico, ácido ferúlicoy escopoletina, los cuales fueron suministrados en distintas concen- ,

traciones a un cultivo de tejidos de rosa, encontraron que todos estoscompuestos menos el ácido clorogénico fueron inhibidores del creci¬miento a una concentración de 10'3 M produciendo la muerte delas células antes de completar el ciclo del crecimiento.

Van Sumere et al. (1972: 165) encontraron que el ácido ciná¬mico es un efectivo desacoplador de la fosforilación oxidativa en mito-condrias de levaduras. En el mismo estudio se encontró que el ácidoferúlico inhibía la toma e incorporación en embriones de semillasde cebada y lechuga de la fenilalanina marcada.

Se ha prestado mucha atención al establecimiento de relacionesentre la estructura química y la actividad reguladora del crecimientode fenoles sustituidos (Wain y Taylor, 1965: 167).

MATERIAL Y METODOS

Se utilizaron semillas de Melilotus albus Medik, las cuales fueronesterilizadas con una solución de hipoclorito de sodio de 8 gr %c decloro activo, luego lavadas dos veces con agua destilada estéril, colo¬cándolas en Cápsulas de Petri sobre doble papel de filtro humede¬cido con las distintas soluciones estériles de Rutina y Vitexinade 1, 10, 100 y 1000 ppm. La Rutina fue disuelta en agua destiladay la Vitexina en Buffer de Fosfato 0,067 M pH 7 de dos concentra¬ciones: 20 % y 100 %. Como testigo para los tratamientos con Rutinase usó agua destilada estéril y para los tratamientos con Vitexina-Buffer de Fosfato 0.067 M pH 7 en las concentraciones arriba cita¬das. El proceso de siembra se llevó a cabo en una cámara esterili¬zada con luz ultravioleta. El material fue incubado durante 4 díasa 22 ± 2o C y 40 lux.

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1. Homogeneización y preparación del polvo acetónico

El material vegetal de 4 días de germinación fue colocado enmorteros sobre baño de hielo y homogeneizado con Buffer de Fosfa¬to 0,067 M pH 7 utilizando como abrasivo arena lavada. Este pro¬ceso se prolongó hasta obtener una masa semisólida homogénea.

Luego de obtenido el homogeneizado fue tratado con acetonaa temperatura de —10° C en una proporción 1:10 (peso fresco/volu-men). El precipitado acetónico fue lavado repetidas veces con elmismo solvente frío hasta completa eliminación de pigmentos y luegosecado al vacío sobre sílica gel a una temperatura de 4° C. Unavez seco fue pulverizado y guardado en recipientes de cierre hermé¬tico al abrigo de la luz y a la temperatura de 4o C.

De acuerdo a ensayos preliminares se pesaron cantidades ade¬cuadas de polvo acetónico, los cuales fueron suspendidos en Bufferde Fosfato 0,067 M pH 7 durante 8 horas a la temperatura de 4° C.Posteriormente fueron agitados durante 3 minutos y centrifugadosa 2000 xg.

2. Determinación de actividad de peroxidasas

Con el líquido sobrenadante se hicieron las. diluciones corres¬pondientes para realizar la determinación de la actividad enzimática.La misma fue llevada a cabo según Lück (1965: 895). Se midióla velocidad inicial de reacción evidenciada por el desarrollo decolor de la p-fenilendiamina, a una longitud de onda de 485 nm a latemperatura de 20-25° C. Los valores de la actividad específica seobtuvieron relacionando el incremento de densidad óptica por minutoy por los miligramos de proteínas de la muestra. Las determinacio¬nes de proteínas se llevaron a cabo según el método de Kalckar(1947: 461).

3. Electroforesis y revelado de peroxidasas

Los extractos fueron sembrados a iguales pesos de polvos acetó-nicos y en dilución adecuada se realizó la electroforesis vertical sobregel de almidón, según técnica de Smithies (1955: 629), utilizandoBuffer de Borato 0,3 M pH 8,6 y una corriente de 6 volts/cm durante12 horas a la temperatura de 4° C. Los mismos fueron reveladossegún describe Guzmán (1972:18).

RESULTADOS

El aspecto morfológico de las plántulas cuyas semillas fuerontratadas con distintas concentraciones de Rutina fue similar al testigo.

Con respecto a las tratadas con Vitexina no hubo diferencias

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oCoTA B C

Fig. 1. — Representación de la actividad enzimática de peroxidasas de extractos depolvos acetónicos de plántulas de Melilotus albus tratadas con distintas con¬centraciones de Rutina y Vitexina. Las disoluciones fueron realizadas segúnse indica en Material y Métodos. A: Rutina; B: Vitexina disuelta en Bufferde Fosfato 0.067 M pH 7 diluido; C: Vitexina disuelta en igual Buffer nodiluido. Los resultados expresados son el promedio de cinco determinaciones.

morfológicas significativas salvo en la concentración de 1000 ppmen la que se pudo observar un menor crecimiento.

Comparando el material tratado con las distintas concentracio¬nes de Rutina y Vitexina, las primeras fueron más desarrolladas quelas segundas. El porcentaje de germinación con ambos tratamientosfue aproximadamente el 100 %.

1. Actividad enzimática

En la fig. 1 se puede observar que para los tratamientos conRutina y Vitexina en solución al 20 % de Buffer de Fosfato 0,067 MpH 7, la mayor actividad de peroxidasas correspondió a Rutina 1 ppm.Para el caso de Vitexina todas las variantes fueron prácticamenteiguales al testigo. También se puede observar que la actividad deperoxidasas de los tratamientos con distintas concentraciones de Vite¬xina disuelta en Buffer de Fosfato 0,067 M pH 7 no diluido fueronsensiblemente menores a las respectivas de los tratamientos anterior¬mente citados, observándose una mayor actividad a 1000 ppm.

M. T. AIAZZI y col., Acción de Vitexina y Rutina sobre peroxidasas

2. ElectroforesisLos esquemas de las corridas electroforéticas se muestran en

la fig. 2. Las bandas de isoperoxidasas fueron numeradas de acuerdoa la nomenclatura internacional IUPAC-IUB (1972: 1). En el análisisde las mismas se puede observar que el modelo electroforético nosufrió variaciones para cada uno de los tratamientos con los flavo-noides, observándose para Rutina 5 formas moleculares, 2 anódicasy 3 catódicas; y para Vitexina 6 formas moleculares, 2 anódicasy 4 catódicas.

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DISCUSION Y CONCLUSIONES

Algunos compuestos fenólicos son capaces de inhibir el creci¬miento de distintos órganos aislados y tejidos, además no poseenactividad antihormonal específica (Kefeli y Kadyrov, 1971: 185). Sesabe que no todos los compuestos fenólicos naturales son inhibidoresdel crecimiento. Algunos de ellos poseen propiedades estimulantesy algunos son inertes o participan en otros procesos tales como res-

Cátodo

5

E33 ES03 03n rea4 6S4EUHI CZ3

El ES 3 ¡HjH3 E2 m 3

(G)(0)

B E3E3 E3 22

11

100 100010P04= 1T100010010T 1Anodo

ppm de Vitexinappm do Rutina

Fig. 2. — Esquema del modelo electroforético de peroxidasas de extractos de pol¬vos acetónicos de plántulas de Melilotas albus tratadas con distintas concen¬traciones de Rutina y Vitexina. Para ambos tratamientos se usó como testi¬go (T) agua destilada. Además para Vitexina se usó un segundo testigode Buffer de Fosfato 0.067 M‘ pH 7. Las diferentes formas molecularesfueron reveladas con el sistema bencidina-H.,0,. Los resultados expresadosson el promedio de cuatro corridas electroforétitratamientos y no simultáneas.

para cada uno de losras

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piración y fotosíntesis (Bardinskaya 1964: 160). Los tratamientoscon Rutina y Vitexina de distintas concentraciones parecen no influen¬ciar sobre la composición de peroxidasas. La más baja actividadde peroxidasas en el material tratado con Vitexina disuelta en Bufferde Fosfato 0,067 M pH 7 no diluido podría deberse a la presenciade iones fosfato, potasio o sodio, al pH, a la estructura de la moléculade Vitexina o a todos éstos interactuando entre sí.

Por otra parte el pico de actividad observado en 1 ppm de Rutinapuede ser debido a un momento metabólico particular en lo concer¬niente a la posible relación entre la característica molecular de laRutina a esa concentración y el equilibrio hormonal.

Con respecto a los tratamientos con Vitexina disuelta en Bufferde Fosfato 0,067 M pH 7 no diluido a 1000 ppm se observa unligero incremento de actividad que estaría asociada al aspecto mor¬fológico de las plántulas menos desarrolladas pero con todos losórganos más engrosados, concordando en parte con lo encontrado porEvans y Alldridge (1965: 499) para tomates enanos.

Es evidente que la composición de peroxidasas no se ve afectadapor cada uno de los tratamientos en las diferentes concentracionespor lo que se podría inferir que los fenómenos observados son decarácter cuantitativo más que cualitativo.

Las dos moléculas utilizadas para este ensayo no afectan el pro¬ceso de germinación y el posterior desarrollo de las plántulas. Conestos tratamientos se abre un interrogante de cuál será el comporta¬miento bioquímico-fisiológico de la planta en las distintas etapas desu ontogenia.

AGRADECIMIENTOS

Deseamos agradecer a los Dres. J. C. Oberti y H. R. Juliani porfacilitarnos las muestras de Rutina y Vitexina; al INTA Manfredi porsuministrarnos el material vegetal y al Dr. A. Arce por la revisiónde los manuscritos.

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