comportamento de linhagens industriais de...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO DEPARTAMENTO DE PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS

COMPORTAMENTO DE LINHAGENS INDUSTRIAIS DE SACCHAROMYCES FRENTE A COMPOSTOS INIBITÓRIOS

PRESENTES NO MELAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR NA PRODUÇÃO DE BIOETANOL.

Autora: Gisele Mantei Tosetto Orientador: Dr. Silvio Roberto Andrietta

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Engenharia Química como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Engenharia Química.

Campinas – São Paulo Julho/2008

ii

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA E ARQUITETURA - BAE - UNICAMP

T639c

Tosetto, Gisele Mantei Comportamento de linhagens industriais de Saccharomyces frente a compostos inibitórios presentes no melaço de cana-de-açúcar na produção de bioetanol / Gisele Mantei Tosetto.--Campinas, SP: [s.n.], 2008. Orientador: Silvio Roberto Andrietta. Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química. 1. Fermentação alcóolica. 2. Leveduras. 3. Compostos orgânicos. 4. Inibição. 5. Melaço. 6. Cinética. I. Andrietta, Silvio Roberto. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Química. III. Título.

Título em Inglês: Behavior of industrial strains of Saccharomyces front inhibitory

compounds presents in sugarcane Molasses in the production of bioethanol.

Palavras-chave em Inglês: Alcoholic fermentation, Kinetics, Industrial substract, Organic compounds, Inhibition, Yeast.

Área de concentração: Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos. Titulação: Doutor em Engenharia Química Banca examinadora: Daniel Ibraim Pires Atala, Marco Antônio de Castro e Souza,

Francisco Maugeri Filho e Cláudia Steckelberg. Data da defesa: 11/07/2008 Programa de Pós-Graduação: Engenharia Química.

Este exemplar correspondeà versão final da Tese de Doutoradoem Engenharia Química.

~Dr. Silvio Roberto Andrietta

Orientador

...

Tesede Doutorado defendida por Gisele Mantei Tosetto e aprovada em 11 de julho de

2008 pela banca examinadora constituída pelos doutores:

--"

Prof. Dr. - Silvio Roberto Andrietta

~Dr. Daniel Ibraim Pires Atala

~~~

!kDra. Claudia Steckelberg

v

vii

Dedico este trabalho ao meu irmão

Aníbal C.M. Tosetto (in Memorian),

que me incentivou a seguir por este caminho."

ix

AGRADECIMENTOS

• Agradeço a Deus, pela vida ofertada.

• Aos meus pais Aníbal e Alice, que me deram todo o apoio

necessário.

• Ao meu irmão Jean e à minha sobrinha Sarah, pelos momentos de

descontração.

• Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Silvio Roberto Andrietta,

pela sua orientação e amizade.

• À FAPESP pelo apoio financeiro através de bolsa de estudo e

reserva técnica.

• A toda minha família e amigos, que sempre me deram forças nos

momentos de desânimo.

• À Graça, pela contribuição ofertada a este trabalho.

• Aos amigos inesquecíveis da Divisão de Biotecnologia e

Processos/CPQBA: Milene, Klauss, Érika, Raquel e Claudia, pelo bom

ambiente de trabalho.

xi

"Hoje levantei cedo pensando no que tenho a fazer antes que o relógio marque

meia noite. É minha função escolher que tipo de dia vou ter hoje.

Posso reclamar porque está chovendo ou agradecer às águas por lavarem a

poluição. Posso ficar triste por não ter dinheiro ou me sentir encorajado para

administrar minhas finanças, evitando o desperdício. Posso reclamar sobre

minha saúde ou dar graças por estar vivo. Posso me queixar dos meus pais por

não terem me dado tudo o que eu queria ou posso ser grato por ter nascido.

Posso reclamar por ter que ir trabalhar ou agradecer por ter trabalho. Posso

sentir tédio com o trabalho doméstico ou agradecer a Deus por ter um teto

para morar. Posso lamentar decepções com amigos ou me entusiasmar com a

possibilidade de fazer novas amizades. Se as coisas não saíram como planejei

posso ficar feliz por ter hoje para recomeçar.

O dia está na minha frente esperando para ser o que eu quiser. E aqui estou eu,

o escultor que pode dar forma.

Tudo depende só de mim."

(Charles Chaplin) "

Sumário

xiii

UWOıTKQ"

PQOGPENAVWTA00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 zzk TGUWOQ000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 zzkkk ADUVTAEV000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 zzx"

EAR¯VWNQ"K"/""KPVTQFWÑ’Q00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3 30 LWUVKHKEAVKXA"FQ"VTADANJQ 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 5 40 JKUVłTKEQ"FA"HGTOGPVAÑ’Q"ANEQłNKEA"PQ"DTAUKN 00000000000000000000000 7 50 PQXQ"EKENQ"FQ"RTQıNEQQN 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 8 60 RTQEGUUQU"HGTOGPVAVKXQU0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 :

4.1 Processo Batelada.................................................................................... 8

4.2 Processo Batelada Alimentada ................................................................. 9

4.3 Processo Contínuo.................................................................................. 10

70 DKQSW¯OKEA"FA"HGTOGPVAÑ’Q"ANEQłNKEA 0000000000000000000000000000000000000000 32 80 DKDNKQITAHKA 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 34"

EAR¯VWNQ"KK"/"EQORQUKÑ’Q"FG"OGNAÑQU"KPFWUVTKAKU 0000000000000000000000000000 37 QDLGVKXQ 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 39 30 KPVTQFWÑ’Q00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 39

1.1 Efeito da matéria prima sobre as leveduras............................................ 17

1.2 Tratamentos de melaços......................................................................... 18

1.3 Efeito dos meios que contém mais de um substrato............................... 20

1.4 Compostos fenólicos na cana-de-açúcar ................................................ 21

1.4.1 Compostos Fenólicos ...................................................................... 21

1.4.2 Efeito dos compostos fenólicos sobre microrganismos ................... 22

1.4.2.1 Mecanismo de ação dos compostos fenólicos.......................... 22

1.4.2.2 Ação dos compostos fenólicos sobre leveduras ....................... 23

1.4.3 Técnicas de determinação de compostos fenólicos......................... 23

1.4.4 Compostos Fenólicos encontrados na cana-de-açúcar ................... 24

1.4.5 Ácidos orgânicos presentes no melaço ........................................... 26

40 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 49 2.1 Méis analisados ...................................................................................... 27

2.2 Compostos Analisados ........................................................................... 28

2.3 Determinação da Concentração dos Compostos Fenólicos e àcidos

orgânicos presentes nos Méis ........................................................................... 28

Sumário

xiv

50 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 4; 3.1 Compostos Identificados......................................................................... 29

3.2 Concentrações dos Compostos Encontrados nos Méis.......................... 30

60 EQPENWU’Q 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 53 70 DKDNKQITAHKA 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 54"

EAR¯VWNQ"KKK"/"AXANKAÑ’Q"FG"FGUGORGPJQ"FG"FKHGTGPVGU"EGRAU"EQOGTEKAKU"FG"Uceejctqo{egu"GO"EQPFKÑ÷GU"FG"GUVTGUUG 00000000000000 59 QDLGVKXQ 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 5; 30 KPVTQFWÑ’Q00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 5; 40 Rncpglcogpvq"Hcvqtkcn"Eqorngvq 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 63 50 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 64

3.1 Cepas Utilizadas ..................................................................................... 42

3.2 Obtenção do Inóculo ............................................................................... 42

3.3 Meio Utilizado para a Fermentação ........................................................ 42

3.4 Condições dos Ensaios Fermentativos ................................................... 43

3.5 Condução dos Testes ............................................................................. 45

3.6 Métodos Analíticos.................................................................................. 45

3.6.1 Determinação da Massa Celular Produzida..................................... 45

3.6.2 Determinação do Etanol Produzido (Método Colorimétrico) ............ 45

3.6.3 Determinação de ART (Método Colorimétrico) ................................ 46

3.6.4 Tratamento Estatístico ..................................................................... 46

60 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 68 4.1 Consumo de ART.................................................................................... 46

4.2 Rendimento em Etanol............................................................................ 52

4.3 Rendimento Celular ................................................................................ 54

4.4 Produtividade .......................................................................................... 59


EAR¯VWNQ"KX"/"AXANKAÑ’Q"FQ"GHGKVQ"FQU"EQORQUVQU"QTIÛPKEQU"FGVGEVAFQU"PQ"OGNAÑQ"UQDTG"AU"EGRAU"UA3"G"[;260 000000000000000000000000 8; QDLGVKXQ 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 93 30 KPVTQFWÑ’Q00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 93 40 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 95


2.2 Compostos Utilizados ............................................................................. 73

2.3 Meio de Cultivo ....................................................................................... 74

Sumário

xv


2.5 Execução dos Ensaios............................................................................ 75





50 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 98 3.1 Influência do Ácido Gálico....................................................................... 77

3.2 Influência do Ácido Cafeico..................................................................... 78

3.3 Influência do Ácido Vanílico .................................................................... 80

3.4 Influência do Ácido Lático ....................................................................... 81

3.5 Influência do Ácido Siríngico................................................................... 83

3.6 Influência do Ácido Pirúvico .................................................................... 85

3.7 Influência do Ácido Acético ..................................................................... 86

3.8 Influência do Ácido Butírico..................................................................... 88

3.9 Influência do Ácido Fórmico.................................................................... 89

3.10 Influência do HMF................................................................................... 91

60 EQPENWU’Q 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;4 70 DKDNKQITAHKA 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;5"

EAR¯VWNQ"X"/"AXANKAÑ’Q"FQ"GHGKVQ"AEWOWNAVKXQ"FG"ANIWOAU"UWDUVÛPEKAU"QTIÛPKEAU"UQDTG"AU"EGRAU"UA3"G"[;26 000000000000000000000000 ;7 QDLGVKXQ 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;9 30 KPVTQFWÑ’Q00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;9 40 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;:



2.3 Meio de Cultivo ....................................................................................... 98



2.6 Métodos Analíticos................................................................................ 100

2.6.1 Determinação da Massa Celular Produzida................................... 100

2.6.2 Determinação do Etanol Produzido (Método Colorimétrico) .......... 100

2.6.3 Determinação de ART (Método Colorimétrico) .............................. 101

2.6.4 Tratamento Estatístico ................................................................... 101

Sumário

xvi

50 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 323 3.1 Rendimento em Etanol (YP/S) ................................................................ 101

3.2 Rendimento em Células (YX/S) .............................................................. 107

3.3 Viabilidade ............................................................................................ 113

3.4 Produtividade ........................................................................................ 119

3.5 Consumo ART ...................................................................................... 125


EAR¯VWNQ"XK"/"AXANKAÑ’Q"FQU"GHGKVQU"FQU"ıEKFQU"NıVKEQ"G"HłTOKEQ"UQDTG"Q"EQORQTVAOGPVQ"EKPÖVKEQ"FAU"EGRAU"UA3"G"[;260 00000000000 357 QDLGVKXQ 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 359 30 KPVTQFWÑ’Q000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 359

1.1 Cinética dos Processos Fermentativos ................................................. 137

1.1.1 Modelos Cinéticos.......................................................................... 137

40 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 364 2.1 Compostos Utilizados ........................................................................... 142

2.2 Meio de Cultivo ..................................................................................... 142

2.3 Obtenção do Inóculo ............................................................................. 142

2.4 Descrição do Reator ............................................................................. 143

2.5 Execução dos Ensaios.......................................................................... 143

2.6 Preparo das Amostras .......................................................................... 144

2.7 Ajustes dos Parâmetros ........................................................................ 144





50 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 367 3.1 Ajustes de Parâmetros Cinéticos Utilizando a Cepa SA1 ..................... 146

3.2 Ajustes de Parâmetros Cinéticos Utilizando a Cepa Y904.................... 149


EAR¯VWNQ"XKK"/"EQPENWU÷GU"IGTAKU0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 377 QDLGVKXQ 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 379"

Sumário

xvii

APGZQ"A000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 37; 30 Rcftçq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 383 40 Anxqtcfc000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 385 50 Dgpcneqqn 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 387 60 Eqtqn000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 389 70 Etguekwocn00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 38; 80 Etw|"Anvc 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 393 90 Gswkrcx 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 395 :0 Guvkxc00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 397 ;0 Iqkcuc 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 399 320 Iwctcpk00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 39; 330 Octcecî00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3:4"

APGZQ"D000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3:7 30 TGPFKOGPVQ"GO"GVAPQN"*[R1U+ 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3:9

1.1 BG1....................................................................................................... 187

1.2 CL1 ....................................................................................................... 189

1.3 SA1 ....................................................................................................... 190

1.4 Y904...................................................................................................... 192

40 TGPFKOGPVQ"EGNWNAT"*[Z1U+ 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3;5 2.1 BG1....................................................................................................... 193

2.2 CL1 ....................................................................................................... 195

2.3 SA1 ....................................................................................................... 196

2.4 Y904...................................................................................................... 198

50 EqpUWOQ"FG"ATV 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3;; 3.1 BG1....................................................................................................... 199

3.2 CL1 ....................................................................................................... 201

3.3 SA1 ....................................................................................................... 202

3.4 Y904...................................................................................................... 203

60 Rtqfwvkxkfcfg 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 427 4.1 BG1....................................................................................................... 205

4.2 CL1 ....................................................................................................... 206

4.3 SA1 ....................................................................................................... 207

4.4 Y904...................................................................................................... 209

APGZQ"E000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 433 30 ıekfq"Iânkeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 435

1.1 Yxs ........................................................................................................ 214

Sumário

xviii

1.2 Yps........................................................................................................ 214

1.3 Produtividade ........................................................................................ 215

1.4 Conversão............................................................................................. 215

40 ıekfq"Echgkeq 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 438 2.1 YX/S........................................................................................................ 217

2.2 yps ........................................................................................................ 217

2.3 Produtividade ........................................................................................ 218

2.4 Conversão............................................................................................. 218

50 ıekfq"Xcpînkeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 43; 3.1 Yxs ........................................................................................................ 219

3.2 Yps........................................................................................................ 220

3.3 Produtividade ........................................................................................ 221

3.4 Conversão............................................................................................. 221

60 ıekfq"Nâvkeq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 444 4.1 Yxs ........................................................................................................ 223

4.2 Yps........................................................................................................ 223

4.3 Produtividade ........................................................................................ 224

4.4 Conversão............................................................................................. 224

70 ıekfq"Uktîpikeq0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 447 5.1 YX/S........................................................................................................ 226

5.2 yps ........................................................................................................ 226

5.3 Produtividade ........................................................................................ 227

5.4 Conversão............................................................................................. 227

80 ıekfq"Rktûxkeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 44: 6.1 Yxs ........................................................................................................ 229

6.2 Yps........................................................................................................ 229

6.3 Produtividade ........................................................................................ 230

6.4 Conversão............................................................................................. 230

90 ıekfq"Aeêvkeq 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 453 7.1 Yxs ........................................................................................................ 232

7.2 Yps........................................................................................................ 232

7.3 Produtividade ........................................................................................ 233

7.4 Conversão............................................................................................. 233

:0 ıekfq"Dwvîtkeq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 456 8.1 Yxs ........................................................................................................ 235

Sumário

xix

8.2 Yps........................................................................................................ 235

8.3 Produtividade ........................................................................................ 236

8.4 Conversão............................................................................................. 236

;0 ıekfq"Hôtokeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 459 9.1 Yxs ........................................................................................................ 238

9.2 Yps........................................................................................................ 238

9.3 Produtividade ........................................................................................ 239

9.4 Conversão............................................................................................. 239

320 ıekfq"JOH 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 462 10.1 Yxs ........................................................................................................ 241

10.2 Yps........................................................................................................ 241

10.3 Produtividade ........................................................................................ 242

10.4 Conversão............................................................................................. 242

APGZQ"F000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 465 30 ıekfq"Aeêvkeq 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 467

1.1 SA1 ....................................................................................................... 245

1.2 Y904...................................................................................................... 245

40 ıekfq"Dwvîtkeq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 468 2.1 SA1 ....................................................................................................... 246

2.2 Y904...................................................................................................... 246

50 ıekfq"Iânkeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 469 3.1 SA1 ....................................................................................................... 247

3.2 Y904...................................................................................................... 247

60 ıekfq"Nâvkeq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 46: 4.1 SA1 ....................................................................................................... 248

4.2 Y904...................................................................................................... 248

70 ıekfq"Hôtokeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 46; 5.1 SA1 ....................................................................................................... 249

5.2 Y904...................................................................................................... 249

80 JOH 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 472 6.1 SA1 ....................................................................................................... 250

6.2 Y904...................................................................................................... 250

Sumário

xx

APGZQ"G 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 473 30 Egrc"UA3 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 475 40 Egrc"[;26 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 476

xxi

PQOGPENAVWTA"

Kd Constante global de morte celular

KI Constante de inibição pelo substrato

KP Constante de morte celular devido à concentração de produto

KS Constante de saturação do Substrato

K2 Constante empírica

K3 Constante empírica

m Expoente da equação de inibição pela biomassa

n Expoente da equação de inibição pelo produto

P Concentração de etanol

Pmáx Máxima concentração de etanol na qual cessa o crescimento

rx Taxa de produção celular

S Concentração de substrato

X Concentração de biomassa

Xmáx Máxima concentração de biomassa na qual cessa o crescimento

celular

Xv Concentração de células viáveis

Xd Concentração de células mortas

Xt Concentração de células totais

YP/S Rendimento do processo (etanol)

YX/S Taxa de conversão de substrato por concentração de microrganismo

"

"

"

xxii

Ngvtcu"Itgicu"

µ Velocidade específica de crescimento celular

µmáx Velocidade específica máxima de crescimento celular

µmáx,i Velocidade específica máxima de crescimento celular na presença de

produto

µ0 Velocidade específica de crescimento celular aparente

ν Velocidade específica de obtenção de produto

xxiii

TGUWOQ"

O objetivo geral deste trabalho foi avaliar os efeitos de algumas substâncias orgânicas

presentes no melaço de cana-de-açúcar sobre cepas de leveduras de uso industrial.

O Capítulo I refere-se a uma breve introdução e histórico da fermentação alcoólica.

No Capítulo II, foi analisado amostras de melaços industriais, provenientes de 10

unidades produtoras de açúcar e álcool, localizadas nos estados de São Paulo, Minas

Gerais, Goiás e Paraná, com a finalidade de determinar e quantificar alguns

compostos orgânicos presentes no mesmo. Para tanto foi utilizada a técnica de

Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE). No Capítulo III foram realizados

ensaios para escolher as cepas de melhor desempenho em condições de estresse,

utilizando-se o planejamento fatorial 23 tipo estrela com triplicata no ponto central. Os

fatores estudados foram: a pressão osmótica (utilizando KCl), temperatura e

concentração inicial de Álcool. As cepas Y904 e SA1 foram as que mais se

destacaram. No Capítulo IV foram avaliados os efeitos dos compostos orgânicos

(ácidos cafeico, gálico, lático, pirúvico, siríngico, vanílico, acético, fórmico, butírico e

Hidroximetilfurfural) sobre as cepas SA1 e Y904, através de fermentações em

triplicata, utilizando meio sintético controle e variando as concentrações de cada

composto. Dentro das concentrações estudadas, apenas os ácidos gálico, lático,

acético, fórmico, butírico e Hidroximetilfurfural demonstraram influência sobre as

cepas. A avaliação do efeito acumulativo das substâncias quando se trabalha com

reciclo de células está descrita no Capítulo V. Todos os experimentos foram

realizados em triplicata e repetidos por oito vezes consecutivas (8 ciclos). O ácido

lático foi a substância que mais interferiu no rendimento em etanol (YP/S) e na

produtividade, parâmetros estes de maior importância nos processos industriais para

produção de álcool. Por outro lado, o ácido fórmico apresentou a menor interferência

e efeito negativo para praticamente todos os parâmetros estudados. Finalmente no

Capítulo VI, foram analisados os efeitos dos ácidos lático e fórmico sobre o

comportamento cinético das cepas SA1 e Y904. Os testes foram realizados em

biorreator de bancada, por dez horas de fermentação. O ácido lático aumentou tanto a

inibição pelo substrato como pelo produto, mostrando-se ser uma substância com alto

grau de toxicidade para as células de leveduras das linhagens estudadas. "

RANAXTAU/EJAXGU" ⁄ fermentação alcoólica, cinética, substratos industriais,

compostos orgânicos, inibição, levedura.

xxv

ADUVTAEV"

The general objective of this project was the evaluation of the effects of some organic

substances present in molasses, sugar cane on strains of yeast for industrial use.

Chapter I refer to a brief introduction and history of alcoholic fermentation. In Chapter

II, samples of industrial molasses were examined, from 10 units producing sugar,

located in the states of São Paulo, Minas Gerais, Goiás, and Paraná, in order to

determine and quantify some organic compounds present in them. In order to this, the

technique for High Performance Liquid Chromatography (HPLC) was used. In Chapter

III trials were conducted to choose the strains of better performance in terms of stress,

using a 23 factorial planning star type with triplicate in central point. The studied factors

were: the osmotic pressure (using KCl), temperature and initial concentration of

alcohol. The strains Y904 and SA1 were those which stressed most. In Chapter IV

were assessed the effects of organic compounds (caffeic, gallic, lactic, pyruvic,

syringic, vanillic, acetic, formic, butyric and Hidroximetilfurfural acids) on the strains

SA1 and Y904 by the fermentation in triplicate, using synthetic medium and control

varying concentrations of each compound. Within the concentrations studied, only the

gallic acid, lactic acid, acetic acid, formic, butyric and Hidroximetilfurfural demonstrated

influence on the strains. The assessment of the cumulative effect of the substances

when working with recycle cell is described in Chapter V. All experiments were

performed in triplicate and repeated by eight consecutive times (8 cycles). The lactic

acid is the substance that interfere most in income in ethanol (YP/S) and productivity,

these parameters of most importance in industrial processes to produce alcohol.

Moreover, the formic acid showed the smallest negative interference for almost all

parameters studied. Finally in Chapter VI, were analyzed the effects of lactic acid and

formic on the behavior of kinetic strains SA1 and Y904. The tests were performed in

bench bioreactor for ten hours of fermentation. The lactic acid increased by inhibiting

both the substrate and the product, showing to be a substance with a high degree of

toxicity to the strains of yeast cells studied.

MG[" YQTFU" ⁄" alcoholic fermentation, kinetics, industrial substract, organic

compounds, inhibition, yeast.

1

EAR¯VWNQ"K"

KPVTQFWÑ’Q"

30 LWUVKHKEAVKXA"FQ"VTADANJQ 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 5 40 JKUVłTKEQ"FA"HGTOGPVAÑ’Q"ANEQłNKEA"PQ"DTAUKN 00000000000000000000000 7 50 PQXQ"EKENQ"FQ"RTQıNEQQN 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 8 60 RTQEGUUQU"HGTOGPVAVKXQU0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 :

4.1 Processo Batelada.................................................................................... 8

4.2 Processo Batelada Alimentada ................................................................. 9

4.3 Processo Contínuo.................................................................................. 10

70 DKQSW¯OKEA"FA"HGTOGPVAÑ’Q"ANEQłNKEA 0000000000000000000000000000000000000000 32 80 DKDNKQITAHKA 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 34

Introdução

3

30" LWUVKHKEAVKXA"FQ"VTADANJQ"

O Brasil, quando criou o Proálcool (Programa Nacional do Álcool) nos

anos 70, não tinha a dimensão do impacto desse programa no século XXI. O

governo brasileiro, após a primeira crise do petróleo em 1973, decidiu criar esse

programa com o objetivo de produzir um combustível alternativo que substituísse a

gasolina para uso carburante. O Brasil já contava com uma matéria prima

adequada para esse fim, a cana-de-açúcar. (ANDRIETTA gv0"cn0, 2007)

A herança deixada por este programa, após 30 anos de sua implantação,

não se baseou apenas na liderança de produção e utilização de combustível

limpo, mas também no domínio da tecnologia que envolve a produção de

bioetanol. As usinas brasileiras têm sido objeto de visitação de delegações de

todas as partes do mundo, as quais se beneficiam da experiência acumulada pelo

setor nessas três últimas décadas para a produção do bioetanol em seus países.

Mesmo o Brasil detendo o que se entende por mais moderno na produção

de bioetanol, existem muitos questionamentos em relação à influência da matéria-

prima no processo de fermentação alcoólica. A matéria-prima não se restringe

somente ao caldo da cana-de-açúcar. O mel final ou melaço, que é o subproduto

da produção do açúcar, também é utilizado associado ao caldo da cana-de-açúcar

ou simplesmente diluído em água, como substrato do processo fermentativo.

Embora seja atribuído o nome de mel final ou melaço para o produto

obtido depois da cristalização da sacarose contida no caldo de cana-de-açúcar, as

particularidades atribuídas a cada processo não permitem uma generalização em

relação à composição dessa matéria-prima. Mas o que se conhece é que existem

inúmeros compostos comuns, os quais são encontrados em maior ou menor

quantidade nos melaços de cana-de-açúcar.

A cana-de-açúcar já sofre alterações antes de seu processamento nas

usinas. O mel além de carrear de um modo concentrado essas alterações também

é proveniente de um processo, que propicia o acúmulo e ou formação de

produtos, que podem atuar como inibidores da fermentação.

Introdução

4

Entende-se por inibição da fermentação a atuação de compostos sobre as

leveduras, que são as responsáveis pela transformação do açúcar em etanol. O

nível de inibição deste processo de conversão de açúcar em álcool vai depender

do tipo da linhagem de levedura utilizada, associada aos compostos inibitórios e

as suas concentrações.

A contribuição dos fatores de inibição provenientes da cana-de-açúcar

pode ser atribuída à própria variedade utilizada, assim como à deterioração dessa

planta, ocorrida devido às operações envolvidas nos processo de colheita. O

ataque de pragas sofridas ainda no campo antes da colheita também têm forte

influência na qualidade do caldo de cana-de-açúcar. O mel final, por sua vez,

agrega além de todos esses fatores, os provenientes das operações envolvidas na

produção do açúcar. (CRUIKSHANK & PERKIN, 1964; FRIEND, 1979;

GODSHALL & LEGENDRE, 1988).

Entre os compostos que merecem especial destaque, como inibidores das

leveduras dos processos de fermentação alcoólica, estão incluídos, além dos

ácidos orgânicos e os compostos fenólicos. Existem na literatura, vários trabalhos

que descrevem efeitos danosos de compostos fenólicos sobre uma população

microbiana, estando incluídas no grupo suscetível as células de levedura

(BORZANI & FALCONE, 1960; O’CONNOR & RUBINO, 1991; MARTIN &

JÖNSSON, 2003). Alguns destes compostos estão presentes no caldo da cana

como descrito por LEITE (2000). Dentre os compostos citados estão: ácido gálico,

ácido salicílico, ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido sinápico, ácido vanílico entre

outros.

Inserido nesse contexto, esse estudo tem como objetivo investigar a

presença de alguns dos compostos potencialmente inibidores da fermentação

alcoólica em 10 méis finais provenientes de diferentes unidades processadoras da

cana-de-açúcar brasileiras. O desempenho fermentativo, em condições de

estresse, de quatro cepas de leveduras do gênero Uceejctqo{egu" *Y904, SA1,

BG1 e CL1),"mais utilizadas como inóculo nos processos, também foi avaliado

nessa primeira fase do trabalho.

Introdução

5

Esses resultados nortearam a elaboração de um estudo, que avaliou a

ação de cada um desses compostos de forma isolada, isto é, adicionado em meio

sintético, sob duas das linhagens de leveduras (UC3"g"[;26+0 A influência da ação

desses compostos de maneira acumulativa também foi avaliada nesse estudo.

Para isso foram realizadas fermentações com reciclo de células. "

40" JKUVłTKEQ"FA"HGTOGPVAÑ’Q"ANEQłNKEA"PQ"DTAUKN"

No Brasil, produzia-se álcool desde o início do século, mas devido à crise

do petróleo no início da década de 70, o governo investiu na produção de álcool,

implantando o Proálcool (Programa Nacional de Álcool), em 1975. Com isso, o

Brasil tornou-se o primeiro país do mundo a desenvolver um programa alternativo

de combustíveis para substituição à gasolina.

Segundo SIQUEIRA (1993), além das razões pelas quais o programa foi

criado, destaca-se os seguintes fatores:

- Trata-se de energia renovável e combustível menos poluente;

- Utiliza tecnologia 100% nacional;

- Emprega mão-de-obra direta, com fixação do homem no meio

rural;

- É um programa de conteúdo estratégico pelo seu caráter

nacionalístico e pela sua dispersão territorial.

A partir do lançamento do programa houve, segundo BERTELLI (1992),

um crescimento progressivo na produção de álcool, de 500 milhões de litros em

1975, até 12,7 bilhões de litros na safra de 1991/1992. O álcool carburante, anidro

e hidratado, participa aproximadamente com 12% do consumo de derivados de

petróleo.

No Brasil, o etanol era produzido por processo de fermentação

descontínuo, batelada simples. Quando o Proálcool foi implantado, segundo

ZAPERLON & ANDRIETTA (1992), todas as novas destilarias foram montadas

baseadas no processo Melle-Boinot (batelada-alimentada com reciclo de células),

Introdução

6

que se mostrou muito conveniente e satisfatório em relação à operação e

eficiência de conversão de açúcares a álcool. Mas visando a redução dos custos

de produção e o aumento da produtividade, a fermentação alcoólica contínua

mostrou ser um processo bastante atrativo.

ANGELIS (1986) já alertava que mesmo com a diminuição do preço do

petróleo, ocorrido após o plano Proálcool e sua estabilização, os países que não

eram auto-suficientes em petróleo, para prover-se de energia no momento e no

futuro necessitariam desenvolver diretrizes que conduziriam ao aperfeiçoamento

de todas as possibilidades de alternativas de aproveitamento de energia.

Nos E.U.A existe uma associação de 16 estados na produção de álcool

etílico por via fermentativa, utilizando o milho como matéria prima. Segundo

PHILIPPIDIS & HATZIS (1997) a produção de etanol através da fermentação

alcoólica de substrato açucarado está despertando o interesse dos E.U.A,

podendo-se converter em poucos anos num programa vital para a sustentação da

próspera economia americana, reduzindo-se significativamente a importação de

petróleo e garantindo, para um futuro bem próximo, a continuação do uso de um

combustível alternativo e principalmente renovável, tornando-se já um tema de

segurança nacional.

50" PQXQ"EKENQ"FQ"RTQıNEQQN"

“As notícias sobre o etanol estão pipocando na mídia. É o presidente dos

Estados Unidos da América que vem ao Brasil e propõe a “Opep do Etanol”, são

os países da UE que pretendem aumentar o uso para misturar à gasolina, como

forma de reduzir os problemas da poluição atmosférica. É o Japão que se

interessa pelo assunto e também outros países já demandando etanol como

Venezuela, Paraguai, Peru, Colômbia, Canadá, Califórnia/EUA, etc. Esse

interesse pelo produto é visível no aumento das exportações de etanol pelo Brasil,

que em 2001 foi de 343 milhões de litros e em 2006 de 3,42 bilhões. Enfim, são os

consumidores aparecendo. E que consumidores! O tamanho deles impressiona:

somente a demanda de etanol derivada do protocolo de Quioto está estimada

Introdução

7

entre 24 a 64 bilhões de litros até 2010, dependendo do percentual de 5% ou 10%

de mistura à gasolina. O programa norte-americano de substituição da gasolina

em 20%, até 2017, estima produzir 132 bilhões de litros. No Brasil a demanda de

álcool deverá crescer bastante, dado o aumento nas vendas de veículos leves flex

fuel, que alcançou em 2006, participação acima de 70%, e em função da

substituição da frota atual (conforme aponta um estudo, a perspectiva é de haver

um consumo de 25 bilhões de litros no total de seis milhões de veículos até 2010).

A produção mundial de etanol é atualmente de 50 bilhões de litros, sendo que o

Brasil produz 17,4 bilhões e os EUA produzem 18,5 bilhões, representando juntos

72% do total. Assim, comparando com a atual produção brasileira e

estadunidense, que são os principais produtores mundiais de etanol, podemos ver

como esse mercado poderá crescer. Outro sintoma das possibilidades de obter

lucros com a produção, venda e exportação de etanol é mostrada pela entrada de

capital estrangeiro comprando usinas e ou associando-se aos grupos usineiros

nacionais, assim como, recentemente, fundos europeus foram captados para

investir na compra de usinas no país, conforme se noticiou na imprensa. Para

atender esse mercado crescente, incluindo uma participação maior do Brasil no

mercado mundial de açúcar, o volume de matéria-prima deverá ser 670 milhões

de toneladas em 2010, contra a produção atual de 380 milhões, isto é,

crescimento de 76% em poucos anos. A nova área total a ser ocupada ficaria

acima de oito milhões de hectares, e como a participação de São Paulo deverá

ficar igual, em torno de 60%, isso significaria utilizar cinco milhões de ha com a

cana-de-açúcar, representando acréscimo de 1,3 milhões de ha, sendo neste

estado da federação que nos deteremos em analisar as conseqüências desse

crescimento. Muitos acham esse acréscimo pequeno, pois São Paulo ocupa 19

milhões de ha em atividades agrícolas, compostas por culturas anuais (feijão,

milho, soja, hortaliças), perenes (citros, frutas, seringueira), semiperenes (cana-

de-açúcar, banana), produção animal (carne, leite, mel), e reflorestamento (pinus,

eucalipto), e a área de cinco milhões significaria ocupar 26% do total, em

comparação aos 20% atuais. Mas, deve-se alertar que não há mais área

Introdução

8

agricultável inexplorada a ser incorporada, e o crescimento de algumas delas será

sempre por substituição de outras.” (VEIGA FILHO, 2007).

60" RTQEGUUQU"HGTOGPVAVKXQU"

A evolução da fermentação alcoólica segue a tendência de qualquer outro

processo industrial, isto é, a implantação de processos contínuos. Esse tipo de

processo traz como vantagens a modernização da usina, aumento da produção,

redução de tempos não produtivos (carga, descarga, limpeza) condução da

fermentação em estado estacionário, redução de insumos, uniformidade do

produto e maior controle do processo. A modernização das plantas brasileiras, isto

é a migração das plantas de batelada para contínua se dá de forma lenta nas

indústrias brasileiras. Acredita-se que no Brasil 70% das destilarias instaladas

ainda utilizam o processo do tipo batelada. A explicação do atraso reside no fato

de que, no auge do Proálcool, as primeiras plantas contínuas instaladas foram

fruto de adaptações de baixo custo de plantas de batelada já existentes. Essas

adaptações foram feitas de forma empírica, o que resultou no geral em processo

problemáticos. Isto desencorajou e, desencoraja até hoje o setor no que diz

respeito à implantação de plantas que operem de forma contínua. O processo

como qualquer outro processo moderno exige um projeto de engenharia para sua

concepção. ANDRIETTA gv0"cn. (2007). estudou, utilizando modelagem matemática

e simulação um processo de fermentação que opera de forma contínua. O modelo

preconizado por esse autor inclui a instalação de quatro reatores de mistura

perfeita ligados em série, com a seguinte distribuição de volume em relação ao

volume total de reator: 20,96% para o reator 1, 26,72% para o reator 2, 31,56%

para o reator 3 e 20,76% para o reator 4.

A seguir serão apresentadas as principais características dos processos

de fermentação que as unidades brasileiras fazem uso.

603" RTQEGUUQ"DAVGNAFA"

Este processo no passado foi muito utilizado na produção de etanol, mas

segundo MAIORELLA" gv0" cn0 (1981), este processo é lento, pois se gasta muito

Introdução

9

tempo para o preparo do reator. O reator tem que ser, a cada batelada, limpo e

preparado, o mosto e o inóculo carregados no sistema.

Para este processo, podem ser utilizados dois sistemas:

a) Sistema de cortes: consiste em realizar a primeira

fermentação, então o volume de mosto é dividido em dois reatores,

completando ambos com mosto deixando fermentar, e assim

sucessivamente;

b) Sistema de cultura pura ou pé-de-cuba: para cada

fermentação, utiliza-se de uma cultura pura, adiciona-se o mosto até

completar o volume do reator.

604" RTQEGUUQ"DAVGNAFA"ANKOGPVAFA"

Este processo é uma variante do processo batelada. É também conhecido

como Melle-Boinot. Neste processo não se pode ultrapassar um valor limite de

substrato, fazendo a alimentação do substrato ao mosto parceladamente, por

pulsos ou contínua. Neste caso há o reaproveitamento do inóculo que é separado

do vinho por centrifugação.

ALMEIDA (1960) descreve as seguintes vantagens do processo Melle-

Boinot:

- Economia de açúcar devido à menor reprodução celular

elevando o rendimento em etanol;

- Eliminação de contaminantes pela centrifugação do vinho

(separação de células de levedura);

- Fermentação mais pura devido ao tratamento de leite de

levedura (tratamento ácido);

- Eliminação da necessidade de cultura pura no preparo do pé-

de-cuba, prática exigida no processo clássico, diminuindo, portanto a

complexidade das operações da planta.

Introdução

10

605" RTQEGUUQ"EQPV¯PWQ"

Este processo não sofre interrupções, há a retirada contínua do produto a

uma vazão igual à da alimentação, permitindo um fluxo contínuo, diminuindo

assim, o efeito inibitório do etanol e do substrato. Este tipo de processo atinge,

quando bem operado, maior produtividade e rendimento.

Segundo RODRIGUES"gv0"cn0"(1992) este processo tem apresentado uma

maior produtividade, com um aumento que pode atingir 100% em relação à

batelada alimentada. Os novos projetos que estão sendo desenvolvidos

consideram a cinética do processo e utilizam ferramentas matemáticas e

computacionais. Com isto obtêm-se processos que:

- Reduzem gastos em mão-de-obra;

- Aumentam a produtividade;

- Reduzem o tempo não produtivo (carga, descarga, limpeza);

- Trabalham em condições ótimas de operação no estado

estacionário;

- Reduzem a utilização de insumos; entre outros.

70" DKQSW¯OKEA"FA"HGTOGPVAÑ’Q"ANEQłNKEA"

Segundo AMORIM gv0" cn. (1996), a levedura como entidade viva

independente, realiza a fermentação do açúcar com o objetivo de conseguir a

energia química necessária à sua sobrevivência, sendo o etanol apenas e tão

somente um subproduto desse processo. Se o homem pretende beneficiar-se

dessa habilidade metabólica, ele deve buscar os conhecimentos que lhe permitam

propiciar às leveduras, condições ideais para que as mesmas trabalhem a seu

favor, isto é, com maior eficiência na produção de etanol. A célula de levedura

possui compartimentos diferenciados para a atividade metabólica, sendo que a

fermentação alcoólica (glicólise anaeróbia) ocorre no citoplasma, enquanto que a

oxidação total do açúcar (respiração) se dá na mitocôndria.

Introdução

11

As leveduras são organismos eucarióticos e formam uma das classes

mais importantes dos fungos. As células de Uceejctqo{egu" egtgxkukcg

apresentam-se normalmente na forma unicelular e com 2 a 8 micrômetros de

diâmetro. Estas se reproduzem basicamente por brotamento, onde a célula mãe,

após um período de união entre os citoplasmas, dá origem a uma nova célula.

Existem dois ciclos distintos que definem o processo de transformação de

açúcares solúveis em moléculas menores pela ação de levedura. O primeiro,

denominado glicólise, tem a função de “quebrar” a molécula de glicose até ácido

pirúvico, através de uma série de reações catalisadas por enzimas específicas,

que se situam na parede celular e no interior da célula. Na ausência de oxigênio,

há uma tendência para a atuação das enzimas piruvato-descarboxilase e álcool-

desidrogenase, produzindo etanol e água a partir do ácido pirúvico. A equação de

Gay-Lussac faz um balanço desta etapa. Porém, na presença de oxigênio há um

deslocamento reacional de parte do ácido pirúvico para o Ciclo de Krebs, onde

será oxidado enzimaticamente a dióxido de carbono e água.

O balanço global dos dois ciclos pode ser resumido pelas equações:

C6H12O6 + 2Pi + 2 ADP → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 2H2O + 57 Kcal

Equação de Gay-lussac

C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 38ATP + 688 Kcal

Ciclo de Krebs

A reação global da glicólise demonstra que 1 mol de glicose (180g) produz

2 moles de etanol (92g), 2 moles de dióxido de carbono (88g) e 57 Kcal de

energia. Assim, o rendimento teórico (YP/S) para a produção de etanol é de 0,511

g/g. Na prática, segundo OURA (1974), este valor não é observado devido à

utilização de parte da glicose para produção de glicerol e alcoóis superiores,

substâncias necessárias para síntese de material celular e manutenção da

levedura.

Além da presença ou ausência de oxigênio, a disponibilidade de açúcar

pode afetar o metabolismo das leveduras. OKADA (1981) o efeito Crabtree, que é

Introdução

12

o incremento na produção de etanol em concentrações de glicose superiores a

0,5-1,0 g/L (independentemente da concentração de oxigênio) como prejudicial ao

processo de produção de leveduras de panificação, pois parte do açúcar

disponível é convertida a etanol e dióxido de carbono em detrimento à biomassa,

reduzindo o rendimento. Em contrapartida, o efeito Pasteur, causa um elevado

rendimento celular em condições de aerobiose e concentração de glicose inferior a

1,5 g/L, diminuindo assim a taxa de fermentação alcoólica ou glicólise anaeróbia.

Assim, frente ao número elevado de reações catalisadas enzimaticamente

no metabolismo celular, fatores como pH, temperatura, pressão, concentração de

reagentes, concentração de nutrientes, etc., afetam os parâmetros cinéticos que

definem as taxas de reprodução celular, consumo de substrato e produção de

etanol.

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15

EAR¯VWNQ"KK"

EQORQUKÑ’Q"FG"OGNAÑQU"KPFWUVTKAKU"

QDLGVKXQ 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 39 30 KPVTQFWÑ’Q00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 39

1.1 Efeito da matéria prima sobre as leveduras............................................ 17

1.2 Tratamentos de melaços......................................................................... 18

1.3 Efeito dos meios que contém mais de um substrato............................... 20

1.4 Compostos fenólicos na cana-de-açúcar ................................................ 21

1.4.1 Compostos Fenólicos ...................................................................... 21

1.4.2 Efeito dos compostos fenólicos sobre microrganismos ................... 22

1.4.2.1 Mecanismo de ação dos compostos fenólicos.......................... 22

1.4.2.2 Ação dos compostos fenólicos sobre leveduras ....................... 23

1.4.3 Técnicas de determinação de compostos fenólicos......................... 23

1.4.4 Compostos Fenólicos encontrados na cana-de-açúcar ................... 24

1.4.5 Ácidos orgânicos presentes no melaço ........................................... 26

40 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 49 2.1 Méis analisados ...................................................................................... 27

2.2 Compostos Analisados ........................................................................... 28

2.3 Determinação da Concentração dos Compostos Fenólicos e àcidos

orgânicos presentes nos Méis ........................................................................... 28

50 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 4; 3.1 Compostos Identificados......................................................................... 29

3.2 Concentrações dos Compostos Encontrados nos Méis.......................... 30

60 EQPENWU’Q 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 53 70 DKDNKQITAHKA 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 54

Composição de Melaços Industriais

17

QDLGVKXQ"

Fgvgevct"g"swcpvkhkect"qu"eqorquvqu"swg"guvçq"rtgugpvgu"go"32"ogncèqu"

kpfwuvtkcku0"

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30" KPVTQFWÑ’Q"

303" GHGKVQ"FA"OAVÖTKA"RTKOA"UQDTG"AU"NGXGFWTAU"

Segundo BASSO gv0" cn0(1996) as cepas de levedura são capazes de

utilizar muitos compostos nitrogenados, tais como aminoácidos, bases

nitrogenadas, uréia e amônio, utilizando-se de vários sistemas de transporte para

as diversas fontes.

O nitrogênio na forma amoniacal (NH4+) é encontrado no mosto

proveniente do caldo de cana, e sua concentração influi sobre o brotamento da

levedura e a taxa de multiplicação da levedura, além de que a porcentagem de

levedo no vinho também está diretamente relacionada com a concentração de

NH4+. Segundo BASSO" gv0" cn0" (1996) esta forma de nitrogênio na cana é

intermediária, pois o nitrato (NO3-) absorvido do solo pela planta é reduzido a

nitrogênio amoniacal e este transformado em aminoácidos, proteínas, ácidos

nucléicos e demais compostos nitrogenados.

REED (1982) menciona a respeito da necessidade nutricional de

leveduras, a importância de vitaminas como a biotina, tiamina, ou outras, que

devem ser supridas pelo meio de crescimento. Em experimentos laboratoriais isto

é geralmente feito com o uso de extrato de levedura. Em processos comerciais

essa suplementação é feita pela adição de compostos minerais solúveis e

vitaminas sintéticas, geralmente suplementadas com levedura ou extrato de

levedura.

PINOTTI (1991) afirma que nas etapas do processo de produção de álcool

existem perdas significantes de nutrientes, notadamente o nitrogênio. Devido a


18

estas perdas principalmente na etapa de decantação, ocorre a necessidade da

introdução do nitrogênio durante a fermentação, onerando o custo final do álcool.

BASSO gv0"cn0 (1996) relata que a acidez resultante da utilização do sulfato

de amônio, embora auxilie no controle a contaminação bacteriana

(conseqüentemente reduz as formações de ácidos lático e acético), causa

estresse à levedura diminuindo a viabilidade e a sua multiplicação.

SU gv0"cn0"(1969) verificaram que quando a uréia é usada como única fonte

de nitrogênio, a levedura produzida apresenta menor teor em proteína e maior

produção comparada com o sulfato de amônia.

ABRAMOV gv"cn0 (1994) enfatizam que a síntese de biomassa celular pela

levedura é significativamente dependente do conteúdo em nitrogênio no meio de

crescimento, uma vez que a proporção de compostos nitrogenados na célula de

levedura atinge 50%. Reforçam o conhecimento de que as células de levedura

sintetizam todos os aminoácidos e proteínas a partir de nitrogênio inorgânico e

carbono orgânico, e também a partir de produtos intermediários da degradação de

carboidratos formados durante a fermentação e respiração.

304" VTAVAOGPVQU"FG"OGNAÑQU"

O mel final utilizado na fermentação é proveniente da produção de açúcar.

À medida que ocorre a cristalização do açúcar do mel final, a taxa de cristalização

torna-se mais baixa até atingir um ponto em que não se pode mais cristalizar a

sacarose a uma dada temperatura, então se diz que o melaço está esgotado e a

pureza deste depende principalmente do conteúdo de água. Embora todos os

constituintes exerçam certa influência sobre a pureza, somente os que estiverem

em maiores quantidades têm um efeito significativo. Destes, os açúcares

redutores e cinzas são preponderantes. Estes dois ingredientes exercem efeitos

opostos na retenção de sacarose. Os açúcares redutores tomam o lugar da

sacarose, quase peso por peso, de maneira que, quanto mais açúcares redutores

presentes, menor a quantidade de sacarose retida. Desta forma, quanto maior a

porcentagem de açúcares redutores, menor a pureza do melaço esgotado a um

dado teor de água. Por outro lado, cinzas em geral e o cloreto de potássio


19

(principal constituinte das cinzas) em particular, tendem a aumentar a solubilidade

da sacarose dando uma pureza maior do mel esgotado (PAYNE -1989).

O tratamento do melaço consiste em: diluição, aquecimento (ou

Esterilização), e decantação. A Esterilização é baseada no binômio tempo versus

temperatura, para destruição térmica do esporo do microrganismo mais resistente

do meio, não devendo ser utilizada uma temperatura que exija muito tempo para a

destruição do esporo mais termo-resistente, pois se arrisca destruir os fatores de

crescimento essenciais à multiplicação da levedura. Primeiramente, dilui-se o

melaço até obter o º Brix desejado, em seguida aquece (140°C/15-20 seg.).

Depois de aquecido, o melaço é resfriado e decantado. A lama decantada do

melaço é composta principalmente de substâncias inorgânicas contendo muito

sulfato de cálcio, sílica e outros materiais “terrosos”, mas contém também

pequenas quantidades de proteínas precipitadas, gorduras e materiais celulares

vegetais. (FLEISHMAN, 1977)

Métodos mais modernos de tratamento de melaço para a eliminação desta

borra utilizam separadoras centrífugas como substitutos da decantação natural.

A Figura II-1 mostra o fluxograma de tratamento do mel bruto realizado

pela Mauri do Brasil S.A. Este tratamento se dá em três etapas: (a) Na primeira

etapa o mel bruto com concentração inicial de sólidos solúveis (° Brix) em torno de

80% p/p é diluído até uma concentração final de 40% p/p ser atingida. (b) Na

segunda etapa o mel previamente diluído na etapa anterior é centrifugado, onde a

fase leve sofre um tratamento térmico sendo o mel pré-aquecido a temperatura de

121ºC e resfriado a 80ºC obtendo-se assim o mel tratado. (c) Na terceira etapa a

fase pesada obtida na etapa de centrifugação é lavada com água e transferida

para um decantador onde o sobrenadante obtido é utilizado na etapa de diluição

descrita anteriormente juntamente com água, e o decantado obtido é constituído

aproximadamente por 2% de sólidos com concentrações de Açucares Redutores

Totais (ART) em torno de 0,2% do total.


20

Hkiwtc"KK"/"3"⁄"Hnwzqitcoc"fq"vtcvcogpvq"fg"ogn"*Ocwtk"fq"Dtcukn"U0A0+"

Nas unidades de produção de álcool acopladas a unidades de produção

de açúcar, a matéria-prima utilizada para obtenção deste produto é o mel final

diluído em caldo de segundo terno ou filtrado após tratamento, ou somente em

água.

305" GHGKVQ"FQU"OGKQU"SWG"EQPVÖO"OAKU"FG"WO"UWDUVTAVQ"

Segundo SCHLEGEL (1990), um bom exemplo de efeito de substrato na

síntese enzimática é um fenômeno chamado fkcwzkc. O efeito de diauxia consiste

no consumo preferencial de um substrato em relação a outro quando mais de um

estão presentes no meio fermentativo, que é o caso da fermentação alcoólica com

meios à base de sacarose. A aparição de duas fases de crescimento ou duplo

ciclo de crescimento é encontrada em meios que contém misturas de substratos.

Na mistura de glicose e sorbitol, por exemplo, a G0eqnk utiliza somente a glicose em

primeiro. A glicose induz a síntese das enzimas para seu consumo, bloqueando ao

mesmo tempo o consumo de sorbitol. O sorbitol só será consumido quando toda a

glicose for consumida.

Mel

Tratado

80 º Brix 40 º Brix

Água

Tanque

Mel

Água

121ºC

80 ºC

Sólidos

2% dos Sólidos

(10% de ART)

Sobrenadante


21

306" EQORQUVQU"HGPłNKEQU"PA"EAPA/FG/AÑðEAT"

30603" Eqorquvqu"Hgpônkequ"

Os compostos fenólicos consistem basicamente de um anel de benzeno,

ao qual se ligam grupos do tipo hidroxila, carboxila e metoxila. Uma grande

variedade de compostos fenólicos, cumarinas, taninos, ligninas e flavonóides são

considerados fenóis vegetais (BOVI, 1997).

Segundo CLARKE & LEGENDRE (1996), a cor no caldo e no açúcar é

oriunda de diversas fontes, tais como: da planta (flavonóides, compostos

fenólicos), caldo (melanoidinas, produtos de reação de açúcares redutores e

aminas), fábrica (Caramelos e melaninas) e da refinaria (produtos de degradação

da frutose).

Gillet (citado por PULZATTO, 1995) agrupou os compostos coloridos

presentes no caldo de cana e na fabricação do açúcar, de acordo com três

classes:

a. Não-açúcares coloridos, presentes originalmente na cana, sendo estes

clorofilas, xantofilas, carotenos e antocianinas.

b. Não-açúcares da cana que podem desenvolver cor, aqui situando os

compostos polifenólicos e compostos amínicos (aminoácidos e amidas).

c. Não-açúcares coloridos obtidos da decomposição de açúcar, formados

através dos mecanismos de caramelização, decomposição de açúcares e da

reação de Maillard.

Para se estimar a contribuição de diferentes classes de compostos na cor

do caldo ou do açúcar tem sido utilizada a característica de sensibilidade a

elevados valores de pH. O termo valor indicador (V.I) é o termo aplicado para a

razão da cor (absorbância medida a 420 nm) a pH 9,00 e a pH 4,00. O valor

indicador dos compostos fenólicos e flavonóides (5,0-14) são significativamente

maiores que os dos corantes melanoidinas (1,0-2,0) e caramelos (1,0-1,5),

compostos que não apresentam aumento na cor com aumento do pH. Os


22

compostos oriundos da planta possuem, portanto, o maior efeito na cor conforme

o pH é aumentado (CLARKE gv0"cn0 1985).

Segundo SMITH (1976) e CLARKE gv0"cn. (1985), os compostos fenólicos

e flavonóides são considerados como aqueles que mais afetam a cor do caldo de

cana, tendo sido reportados serem responsáveis por 60-75% da cor no açúcar.

A concentração destes compostos na planta está relacionada à existência

de fungos, bactérias e insetos (CRUIKSHANK & PERKIN, 1964; FRIEND, 1979).

Em adição, injúria mecânica e química e doenças virais e bacterianas induzem à

produção de cor vermelha no tecido possivelmente como resposta ao estresse na

cana-de-açúcar (Hokama, citado por GODSHALL & LEGENDRE, 1988).

Os componentes fenólicos sofrem reações não enzimáticas, incluindo

oxidação e autopolimerização com pigmentos marrom escuro, reações com

proteínas e aminoácidos, para produzirem melaninas, pigmentos de coloração

marrom e reações com aldeídos para produzir produtos de condensação

vermelhos na presença de ácidos (BOVI, 1997). Os compostos fenólicos também

sofrem reações de escurecimento por via enzimática. A reação de cor catalisada

por enzima resulta da ação de o-difenol-O2 oxiredutase sobre os fenólicos,

particularmente ácido clorogênico. A o-diquinona resultante dessa oxidação é

quimicamente reduzida a um o-difenol secundário e a quinina secundária assim

formada, polimeriza para formar cor. Compostos poliméricos coloridos podem

também ser formados a partir da quinona clorogênica após reação com

aminoácidos (GROSS & COOMBS, 1976).

30604" Ghgkvq"fqu"eqorquvqu"hgpônkequ"uqdtg"oketqticpkuoqu"

3060403" Ogecpkuoq"fg"cèçq"fqu"eqorquvqu"hgpônkequ"

Vários são os trabalhos realizados que visam determinar a forma de ação

dos compostos fenólicos sobre os microrganismos, principalmente em produtos

desinfetantes. Klarmann & Shternov, 1936 (citados por O’CONNOR & RUBINO,

1991), realizaram testes para comprovar a ação germicida de compostos fenólicos


23

e concluíram que a potência germicida contra os microrganismos testados

aumenta com o aumento do peso molecular dos compostos fenólicos.

Cooper 1912,1913 (também citado por O’CONNOR & RUBINO, 1991)

relatou que o fenol e seus derivados apresentam diversos tipos de ação

bactericida. Em altas concentrações estes compostos atuam como um violento

veneno protoplasmático, penetrando e rompendo a parede celular e precipitando

as proteínas celulares. Entretanto, em baixas concentrações, os fenóis e seus

derivados inativam o sistema de enzimas essenciais.

Segundo BORZANI & FALCONE (1960), o fenol se dissolve no

protoplasma. Sua ação depende de seu coeficiente de distribuição entre o meio e

os lipídeos do protoplasma. Quando a concentração de fenol na célula ultrapassa

um valor máximo, as proteínas precipitam irreversivelmente e a célula morre.

3060404" Aèçq"fqu"eqorquvqu"hgpônkequ"uqdtg"ngxgfwtcu"

MARTIN & JÖNSSON (2003) compararam a resistência de onze cepas

(industrial e laboratório) de Uceejctqo{egu e \{iquceejctqo{egu a inibidores da

fermentação de derivados lignocelulósicos. Eles prepararam um coquetel inibidor,

em diferentes concentrações, contendo dois ácidos alifático, dois furaldeídos e

dois compostos fenólicos. Concluíram que dentro de uma mesma espécie existe

uma cepa que é mais resistente ao coquetel inibidor tendo uma redução no

rendimento em etanol de 10% em presença do coquetel inibidor na concentração

de 100%, enquanto que a cepa mais sensível não produziu etanol na presença de

25% do coquetel inibidor.

30605" Vêepkecu"fg"fgvgtokpcèçq"fg"eqorquvqu"hgpônkequ"

Existem várias técnicas para a determinação dos compostos fenólicos.

PRICE & BUTLER (1977) e BUDINI gv0" cn0 (1980) utilizaram o método Azul da

Prússia para a determinação de compostos fenólicos totais.

Várias pesquisas com objetivos de analisar os compostos fenólicos têm

mostrado a enorme complexidade da mistura de compostos que compõem os

corantes presentes na cana-de-açúcar. FARBER & CARPENTER (1972)


24

empregaram a extração com acetato de etila e análise por eletroforese de alta

voltagem para obterem a separação de sete derivados de ácido benzóico, seis

derivados de ácido cinâmico, três derivados de cumarinas e três flavonóis, que

estão apresentados na Tabela II-1.

PATON (1978) utilizou cromatografia em camada delgada em placas de

celulose para a identificação de ácidos fenólicos presentes em folhas de cana-de-

açúcar, caldo de cana, e outros produtos oriundos da cana-de-açúcar,

identificando treze ácidos fenólicos, também apresentados na Tabela II-1.

Análises qualitativas como cromatografia em papel, cromatografia em

camada delgada e em coluna aberta e cromatografia gasosa têm sido descritas na

literatura para a separação de compostos fenólicos em plantas. Mas para a

análise quantitativa são necessários métodos mais satisfatórios. Para tornar a

análise desses compostos mais rápida e precisa e com grande seletividade em

relação aos métodos clássicos, foi introduzida a cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE).

CURTIN & PATON (1980), PATON & DUONG (1992) e LEITE (2000)

utilizaram CLAE para separação de compostos fenólicos extraídos da cana e seus

derivados.

LARRAHONDO gv0"cn0 (1996) promoveram a separação e identificação do

açúcar bruto empregando cromatografia gasosa (CG) acoplada à espectrometria

de massa (MS). Esta análise indicou a presença de diversos ácidos fenólicos no

açúcar bruto, os quais estavam presentes na cana-de-açúcar como ácido ferúlico,

siríngico e derivados do ácido cinâmico, além de derivados de ácido benzóico.

30606" Eqorquvqu"Hgpônkequ"gpeqpvtcfqu"pc"ecpc/fg/cèûect"

Diversos autores identificaram os compostos fenólicos e flavonóides

presentes na cana-de-açúcar. Estes compostos estão relacionados na Tabela II-1.

"

"


25

Vcdgnc" KK" /" 3" /" Eqorquvqu" hgpônkequ" g" hncxqpôkfgu" go" ecpc/fg/cèûect" g" ugwu" rtqfwvqu."kfgpvkhkecfqu"rqt"fkxgtuqu"cwvqtgu"*ekvcfq"rqt"NGKVG."4222+"

Eqorquvqu"hgpônkequ"g"hncxqpôkfgu"

HATDGT"("EATRGPVGT"

*3;94+"

RAVQP"*3;9:+"

EWTVKP"("RAVQP"*3;:2+"

RAVQP"("FWQPI"*3;;4+"

Fgtkxcfqu"fq"âekfq"dgp|ôkeq"

ác. gentísico - + - - ác. p-hidroxibenzóico + - + - ác. m-hidroxibenzóico - + - - ác. 3,4-dihidroxibenzóico - + - - ác. Vanílico + + + - ác. Siríngico + + + - ác. Salicílico - + + - 3,4-dihidroxibenzaldeído + - + - p-hidroxibenzaldeído + - - - ác. 2,3-dihidroxibenzóico - + - - Vanilina + - - -

Fgtkxcfqu"fq"âekfq"ekpãokeq

ác. o-cumárico - - + - ác. p-cumárico + + + - ác. Cafeico + + + - ác. Ferúlico + + + - ác. Sinápico + + + - ác. Clorogênico + - + - Éster de ác. ferúlico - - - +

Fgtkxcfqu"fq"ewoctkpc

Cumarina + - - - Umbeliferona + - - - Esculina + - - -

Hncxqpcu

Apigenina - - - + Luteolina - - - + Tricina - - - +

Hncxqpôku

Quercetina + - - - Rutina + - - - Kaempferol + - - -

Qwvtqu"fgtkxcfqu

ác. quínico-3’-cafeoil - - - + ác. quínico-3’-p-cumaroil - - - + ác. quínico-4’-p-cumaroil - - - + Coniferina + - - - sinapoil glicose - - - + p-cumaroil glicose - - - + (-) = presente (+) = ausente

LEITE (2000) estudou a presença dos compostos fenólicos no colmo,

bainha, folha e palmito da cana-de-açúcar. Foram encontrados no caldo e

confirmados através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), derivados


26

de ácidos cinâmicos e hidroxibenzóicos, além de derivados de flavonas apigenina,

luteolina, tricina. Observou-se composição mais complexa nas outras partes da

cana, como nove (9) derivados de flavonas na bainha, onze (11) na folha e dezoito

(18) no palmito, além dos ácidos cinâmicos e benzóicos. As folhas, bainhas e

palmito contêm compostos pertencentes às classes já encontradas no colmo com

adição de outros não descritos para este, como ácidos 3,5-dihidróxicinâmico, o-

cumárico e gentísico.

30607" ıekfqu"qtiãpkequ"rtgugpvgu"pq"ogncèq"

Os compostos fenólicos podem agir como inibidores dos microrganismos

(dependendo da concentração) segundo O’CONNOR & RUBINO (1991).

Conforme NARENDRANATH gv0" cn0" *2001), os ácidos orgânicos também são

potenciais inibidores das leveduras.

Estes compostos estão presentes nas plantas da cana-de-açúcar e são

carreados pelo caldo e acabam se acumulando nos méis que posteriormente

serão fermentados. Este acúmulo acontece quando o caldo passa pelos

evaporadores e cozedores para a retirada da água e cristalização do açúcar, mas

à temperatura que o caldo é submetido não é suficiente para evaporar ou

decompor estes compostos que possuem elevados ponto de ebulição e boa

estabilidade térmica. Durante o cozimento, pode ocorrer também a degradação

térmica da sacarose, formando compostos indesejáveis à fermentação alcoólica,

tais como ácidos orgânicos (por exemplo, ácido lático, fórmico e acético) e hidroxi-

metil-furfural (HMF). Estes compostos, por apresentarem ação antimicrobiana,

podem afetar o desempenho das leveduras, podendo ser uma das causas da

baixa qualidade fermentativa de alguns méis. Na presença de temperaturas

elevadas, ocorrem duas transformações químicas envolvendo os carboidratos,

sendo elas a reação de Maillard com degradação de Strecker e a caramelização,

ocorrendo a degradação do carboidrato e formando compostos voláteis. As

reações de Maillard podem produzir compostos como acetaldeído, benzaldeído,

formol, aldeído lático. A caramelização pode produzir ácido fórmico, acético,

hidroximetilfurfural, entre outros. (BOBBIO & BOBBIO, 2001).


27

Segundo DE BRUIJN gv0"cn. (1986), os monossacarídeos dão degradados

em meio alcalino a ácidos carboxílicos. A maior parte dos monossacarídeos é

convertida em ácidos carboxílicos de baixo peso molecular com mesmo ou menor

número de carbonos. Alguns exemplos destes ácidos: lático, fórmico, acético,

glicólico, sacarínico.

Segundo KOHL (2004), a temperatura de fermentação, a deficiência de

nutrientes no substrato e os relativos níveis de concentração de glicose, etanol,

ácido lático, ácido acético e aflatoxinas são típicos fatores de estresse

encontrados no dia-a-dia em uma planta de produção de etanol. Sob condições

ácidas encontradas na fermentação, os ácidos acético e lático podem penetrar na

membrana protetora e entrar na célula, uma vez dentro dela, os ácidos causam

danos aos componentes celulares causando uma perda na viabilidade celular.

Estes danos, associados às altas concentrações de glicose utilizadas na

fermentação podem fazer com que o fermento morra ou pare metabolicamente.

40"OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU"

403" OÖKU"APANKUAFQU"

Amostras de méis foram coletadas em 10 unidades de produção de

açúcar e álcool em diferentes regiões dos estados de: São Paulo, Minas Gerais,

Goiás e Paraná."

A Tabela II-2 apresenta as unidades industriais e suas respectivas

localidades.

"


28

Vcdgnc"KK"/"4"⁄"Nqecnkfcfg"fcu"wpkfcfgu"kpfwuvtkcku"

Ogn" Wpkfcfg"Kpfwuvtkcn" Nqecnkfcfg"

Anxqtcfc" Usina Alvorada Açúcar e Álcool LTDA" Araporã - MG"

Dgpcneqqn" Benalcool Açúcar e Álcool S.A." Bento de Abreu - SP"

Eqtqn" Cooperativa Agropecuária Rolândia LTDA" Rolândia - PR"

Etw|"Anvc" Açúcar Guarani S.A." Olímpia - SP"

Gswkrcx" Equipav S.A. Açúcar e Álcool" Promissão - SP"

Guvkxc" Us. S.José da Estiva S.A.-Açúcar e Álcool" Novo Horizonte - SP"

Iqkcuc" Goiatuba Álcool LTDA" Goiatuba - GO"

Iwctcpk" Açúcar Guarani S.A." Severínia - SP"

Octcecî" Usina Maracaí S.A.- Açúcar e Álcool" Maracaí - SP"

Etguekwocn" Usina Cresciumal S.A." Leme -SP"

404" EQORQUVQU"APANKUAFQU"

Os 10 compostos analisados incluíram ácidos orgânicos e compostos

fenólicos. A saber: Ácido Lático, Ácido Pirúvico, Ácido Gálico, Ácido Cafeico, Ácido

Vanílico, Ácido Siríngico, Ácido Salicílico, Ácido Sinápico, Ácido Ferúlico e Ácido

p-cumárico.

405" FGVGTOKPAÑ’Q"FA"EQPEGPVTAÑ’Q"FQU"EQORQUVQU"HGPłNKEQU"G"‘EKFQU"QTIÛPKEQU"RTGUGPVGU"PQU"OÖKU"

As amostras de méis coletadas foram submetidas à análise

cromatográfica com a finalidade de identificar e quantificar os compostos fenólicos

ácidos orgânicos no mel em maior concentração. Para tanto foi utilizada a técnica

de Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE) utilizando um sistema Dionex

com bomba quaternária e detector UV na faixa de 210nm, com sistema de injeção

automático, cujas condições são descritas abaixo:"

� Eluente – H2SO4 0,005N a vazão de 0,5 mL/min."

� Volume de injeção – 20 µL."

� Coluna – Rezex ROA – Organic Acid H+ (8%) 300x 7,8 mm."

� Coluna de guarda - Rezex ROA – Organic Acid H+ (8%) 50x 7,8 mm."


29

� Temperatura da coluna – 55°C."

Padrões utilizados – grau HPLC

� Ácido Lático - Sigma"

� Ácido Pirúvico - Acros"

� Ácido Gálico - Aldrich"

� Ácido Cafeico (3,4-Dihidroxihidrocinamico) - Aldrich"

� Ácido Vanílico (4-hidroxi-3-metoxibenzoico) - Sigma"

� Ácido Siríngico - Sigma"

� Ácido Salicílico - Sigma"

� Ácido Sinápico - Sigma"

� Ácido Ferúlico (trans-4-hidroxi-3-metoxicinâmico) - Aldrich"

� Ácido p-cumárico - Sigma"

50" TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q"

503" EQORQUVQU"KFGPVKHKEAFQU""

Dos 10 padrões de compostos fenólicos e ácidos orgânicos que foram

analisados, somente seis foram detectados na análise cromatográfica. "

Na Tabela II-3 está relacionado os compostos identificados."

"

Vcdgnc"KK"/"5"/"Eqorquvqu"hgpônkequ"g"âekfqu"qtiãpkequ"wvknk|cfqu"pc"cpânkug"etqocvqitâhkec"


30

Eqorquvqu"Hgpônkequ"

Kfgpvkhkecfqu"

Ácido Lático" �

Ácido Pirúvico" �

Ácido Gálico" �

Ácido Cafeico" �

Ácido Vanílico" �

Ácido Siríngico" �

Ácido Salicílico" /"

Ácido Sinápico" /"

Ácido Ferúlico" /"

Ácido p-cumárico" /"

504" EQPEGPVTAÑ÷GU"FQU"EQORQUVQU"GPEQPVTAFQU"PQU"OÖKU"

A Tabela II-4 apresenta os compostos fenólicos e ácidos orgânicos que

foram identificados e suas respectivas concentrações, em cada um dos méis

estudados.

Vcdgnc"KK"/"6"⁄"Eqpegpvtcèùgu"fqu"eqorquvqu"hgpônkequ"g"âekfqu"qtiãpkequ"gpeqpvtcfqu"pqu"oêku"*go"RRO+"

Wukpc" Ae0"Rktûxkeq"

Ae0"Nâvkeq"

Ae0"Iânkeq"

Ae0"Echgkeq"

Ae0"Xcpînkeq"

Ae0"Uktîpikeq"

Octcecî" 2729,88 3097,59 3,17 X 57,06 60,55

Guvkxc" 2819,46 33578,62 X X 24,19 37,76

Etguekwocn" 2081,96 X X X 22,73 25,30

Iwctcpk" 6696,15 13057,72 0,94 4,52 111,60 108,91

Iqkcuc" 151,89 8116,00 1,51 X 84,29 117,39

Anxqtcfc" 4428,68 9227,98 0,80 X 75,76 X

Gswkrcx" 200,06 44069,17 0,62 X 60,40 X

Eqtqn" 2793,80 49186,20 1,74 X 34,69 70,90

Dgpcneqqn" 9903,27 49502,64 1,64 16,69 X X

Etw|"Anvc" 5634,35 16091,71 X 11,05 66,58 84,45

A Tabela II-5 apresenta a média das concentrações dos compostos

fenólicos e ácidos orgânicos encontrados nos méis.

"


31

Vcdgnc" KK" /" 7" ⁄" Oêfkc" fcu" eqpegpvtcèùgu" fqu" eqorquvqu" hgpônkequ" g" âekfqu" qtiãpkequ"gpeqpvtcfqu"pqu"oêku."go"RRO0""

" Oêfkc"

Rktûxkeq" 3743,95"

Nâvkeq" 25103,07"

Iânkeq" 1,49"

Echgkeq" 10,75"

Xcpînkeq" 59,70"

Uktîpikeq" 72,18"

60" EQPENWU’Q"

Dentre os 10 compostos analisados por cromatografia líquida de alta

eficiência, somente 6 foram detectados nos melaços analisados. São eles: ácido

cafeico, ácido gálico, ácido lático, ácido pirúvico, ácido siríngico e ácido vanílico.

O ácido pirúvico foi o único composto entre os estudados, que foi

encontrado em todas as amostras analisadas. Embora tenha sido identificado em

todas as unidades a variação em relação a concentração foi considerável. A

amostra que contem maior concentração desse composto foi a proveniente da

usina Benalcool (9903,27 PPM) e a menor da usina Goiasa (151,89 PPM). O mel

da unidade Guarani foi o único que apresentou os 6 compostos analisados. No

caso do mel da Cruz Alta apenas a presença do ácido gálico não foi observada.

A unidade que apresentou o menor número de compostos potencialmente

inibidores da fermentação foi a Cresciumal. Apenas os ácidos pirúvico, vanílico e

siríngico foram observados nessa amostra. O mel da Cresciumal foi também o que

apresentou as menores quantidades do ácido vanílico (22,73PPM) e do ácido

siríngico (25,3 PPM). Essa amostra foi ainda, a única que não que apresentou o

acido lático em sua composição.

O ácido cafeíco foi o de menor incidência entre todos os estudados. Foi

encontrado em apenas 3 dos 10 méis analisados.

Considerando as médias dos compostos encontrados nas 10 amostras o

ácido gálico foi o que apresentou os menores valores. A média encontrada foi de


32

1,49 PPM. A média da concentração do ácido lático foi a maior encontrada entre

os 10 méis analisados. MAIORELLA et. al. (1983) postula que concentrações

superiores a 17000 PPM de ácido lático já são suficientes para promover a

inibição da fermentação.

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EAR¯VWNQ"KKK"

AXANKAÑ’Q"FG"FGUGORGPJQ"FG"FKHGTGPVGU"EGRAU"

EQOGTEKAKU"FG"Uceejctqo{egu"GO"EQPFKÑ÷GU"FG"

GUVTGUUG"

QDLGVKXQ 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 5; 30 KPVTQFWÑ’Q00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 5; 40 Rncpglcogpvq"Hcvqtkcn"Eqorngvq 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 63 50 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 64



3.3 Meio Utilizado para a Fermentação ........................................................ 42

3.4 Condições dos Ensaios Fermentativos ................................................... 43

3.5 Condução dos Testes ............................................................................. 45





3.6.4 Tratamento Estatístico ..................................................................... 46

60 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 68 4.1 Consumo de ART.................................................................................... 46

4.2 Rendimento em Etanol............................................................................ 52

4.3 Rendimento Celular ................................................................................ 54

4.4 Produtividade .......................................................................................... 59


Desempenho de Diferentes Cepas Comerciais

39

QDLGVKXQ"

Cxcnkct"q"fgugorgpjq"fg"egrcu"kpfwuvtkcku"fg"ngxgfwtcu"go"eqpfkèùgu"fg"

guvtguug"

"

30" KPVTQFWÑ’Q"

Os microrganismos que mais apresentam características favoráveis para

transformar açúcares em etanol pertencem ao gênero Uceejctqo{egu. Estas

leveduras têm sido utilizadas largamente para a produção de álcool em escala

industrial.

No entanto, outros gêneros de levedura e também bactérias têm sido

estudados com o objetivo de serem utilizados como produtores de álcool.

O microrganismo \{oqoqpcu"oqdknku PRO 910 isolado do caldo de cana,

foi utilizado por RODRIGUES gv0"cn0"(1995), obtendo-se uma concentração máxima

de etanol igual a 106 g/L.

Apesar dos esforços visando à utilização de outros microrganismos para

obtenção de etanol, para as condições das destilarias brasileiras, a utilização de

levedura Uceejctqo{egu"egtgxkukcg continua sendo a mais adequada, pois, por se

tratar de processos não estéreis, necessita-se de um microrganismo “robusto”,

capaz de suportar condições drásticas.

Segundo AMORIM gv0" cn0" (1996), as destilarias brasileiras têm como

prática freqüente iniciar os processos fermentativos com uma determinada

levedura, seja pela tradição de seu uso, como a Uceejctqo{egu"egtgxkukcg, pela

facilidade de obtenção em grandes quantidades, como as leveduras de

panificação, ou ainda, pelo fato da mesma ter sido obtida através de

melhoramento genético para se melhor adequar às necessidades do processo

industrial.

As destilarias brasileiras, por não possuírem unidades de esterilização de

mosto, são consideradas abertas do ponto de vista microbiológico. Elas trabalham


40

com populações mistas, ou seja, várias linhagens de levedura presentes. Estas

linhagens podem ser classificadas como sendo selecionadas, nativas ou

selvagens. As linhagens selecionadas são aquelas adquiridas de forma pura para

serem utilizadas como inóculo nas partidas das plantas. As nativas são aquelas

encontradas no processo, que apresentam características fermentativas

satisfatórias, mas são diferentes às selecionadas. As linhagens selvagens são

aquelas presentes nos processos que apresentam características fermentativas

não adequadas aos processos industriais e normalmente não são

Uceejctqo{egu, sendo consideradas oportunistas, dominando o processo

somente em condições anormais, tais como: operação com baixa concentração de

etanol, paradas prolongadas, paradas curtas ou longas seqüenciais, etc.

(ANDRIETTA, 2007).

Numa planta de etanol, os típicos fatores de estresse incluem:

temperatura da fermentação, deficiência de nutrientes no substrato, oxigênio,

concentração de etanol, pH.

O pH é um fator significativo para as fermentações industriais devido à sua

importância tanto no controle da contaminação bacteriana quanto ao seu efeito

sobre o crescimento da levedura, taxa de fermentação e formação de subprodutos

(AMORIM gv0"cn0, 1996). Segundo Kim & Kim, citados por MAIA (1989), o pH ótimo

para a produção de etanol por leveduras de Uceejctqo{egu" egtgxkukcg situa-se

geralmente na faixa de 4 a 5. Elevando-se o pH até 7, observa-se uma diminuição

do rendimento em etanol, com o aumento da produção de ácido acético.

Segundo KOHL (2004), nas plantas de produção de etanol, se a

temperatura for demasiadamente elevada, esta pode ser mortal para as leveduras,

enquanto que temperatura demasiadamente baixa pode atrasar o seu

metabolismo e prolongar o tempo exigido de fermentação. Se o calor liberado

durante a conversão de glicose a etanol não for removido, a temperatura subirá

rapidamente a níveis críticos, dando origem a temperatura que irá causar estresse

da fermentação, inibição ou possivelmente até mesmo a morte térmica das células

de levedura.


41

O etanol foi a primeira substância a ser reconhecida como inibidor da

fermentação alcoólica. As leveduras dos gêneros Uceejctqo{egu e

Uejk|quceejctqo{egu são consideradas as de melhor resistência ao efeito tóxico

do etanol. Este efeito é considerado resultante de vários aspectos: os mecanismos

inibidores de base, a presença ou não de outros inibidores, composição do meio,

pressão parcial em oxigênio, temperatura, natureza da cepa e condições de cultivo

(batelada ou contínua). Os fatores que influenciam a sensibilidade ao etanol, agem

direta ou indiretamente sobre as propriedades da membrana plasmática.

Entretanto o etanol parece não ter um efeito único, provocando modificações nas

propriedades da membrana lipídica e nos sistemas de transporte de soluto e

agindo sobre algumas enzimas.

40" RNAPGLAOGPVQ"HAVQTKAN"EQORNGVQ"

O método de otimização por análise de superfície de resposta tem como

base o método de planejamento fatorial, e consiste em um grupo de técnicas

usadas para o estudo empírico das relações entre uma ou mais respostas

medidas e um número de variáveis de entrada que possam ser controladas.

Para aplicar o método de análise de superfície de resposta é necessário

primeiramente programar ensaios através de um planejamento fatorial. Este

método consiste em selecionar um número fixo de níveis para cada uma das

variáveis de entrada. Então se executam experimentos com todas as possíveis

combinações. A primeira etapa é usualmente um planejamento fatorial com dois

níveis (nível -1 e nível +1) para cada variável. Assim para “n” variáveis envolvidas

no estudo, o número de experimentos que deve ser realizado para investigar todas

as combinações possíveis é igual a 2n. Para estimativa do erro experimental

associado aos ensaios, são realizados três ensaios no ponto central ou nível 0

(zero) correspondente às condições intermediárias entre os dois níveis atribuídos

a cada variável (BOX gv0"cn., 1978).

Com os resultados obtidos pelo planejamento é possível calcular os

efeitos principais e de interação das variáveis sobre as respostas, determinando


42

assim quais são os efeitos mais significativos, o que possibilita ajustar

empiricamente um modelo linear ou de 1ª ordem, correlacionando-se as variáveis

e as respostas obtidas. Se o modelo de 1ª ordem não apresentar uma boa

correlação com os dados experimentais é possível complementar o planejamento

fatorial inicial realizando-se mais 2*n ensaios distribuídos rotacionalmente (pontos

axiais) a uma distância α da condição do ponto central, sendo (α) definido pela

equação (III.1) (KHURI & CORNELL, 1987), para obter um modelo quadrático ou

de 2ª ordem. Onde: n representa o número de variáveis independentes estudadas.

α = (2n)(1/4) (III.1)


503" EGRAU"WVKNK\AFAU"

As leveduras utilizadas foram cepas industriais de Uceejctqo{egu0" A

saber: Y904 (procedência - Mauri do Brasil), a SA1 (procedência Usina Santa

Adélia), a BG1 (procedência - Usina Barra Grande) e CL1 (procedência - Usina

Clealco). Todas essas linhagens foram obtidas a partir de da coleção de leveduras

de interesse industrial da Divisão de Biotecnologia e Processos

(CPQBA/UNICAMP)."

504" QDVGPÑ’Q"FQ"KPłEWNQ"

As leveduras foram crescidas em tubos contendo PDA (Potato Dextrose

Agar) na forma de “slant” por 24 horas/32oC. A seguir foram suspensas em água

estéril em quantidade igual a 25 ml por tubo contendo a cepa, sendo que 10 ml

dessa suspensão foram transferidos para cada frasco Erlenmayers de 250 ml

contendo o meio de cultivo descrito adiante.

505" OGKQ"WVKNK\AFQ"RATA"A"HGTOGPVAÑ’Q"

A composição básica do meio fermentativo utilizado está descrita na

Tabela III-1.

"


43

Vcdgnc"KKK/"3–"Eqorqukèçq"fq"Ogkq"Ukpvêvkeq"*Eqpvtqng+0"

Eqorqpgpvg" Eqpegpvtcèçq"*i1mi+"

Sacarose" 150"

Extrato de levedura" 6"

Cloreto de amônio" 5"

Fosfato diácido de potássio" 5"

Sulfato de magnésio" 1"

Cloreto de potássio" 1"

506" EQPFKÑ÷GU"FQU"GPUAKQU"HGTOGPVAVKXQU"

Para a realização destes testes fermentativos utilizou-se o planejamento

fatorial 23 tipo estrela com triplicata no ponto central. Os fatores estudados foram:

a pressão osmótica (utilizando KCl), temperatura e concentração inicial de Álcool.

As variáveis independentes estudadas (n=2) em cada ensaio foram a

pressão osmótica no meio PO (3,2 a 36,8 g/L), a temperatura T (29 a 39 °C) e a

Concentração inicial de álcool A (3,2 a 36,8 mL/L).

As variáveis respostas foram: Consumo de ART (%), rendimento em

etanol (YP/S, em g/g), rendimento celular (YX/S, em g/g), e produtividade

(gEtanol/(L.h)) que foram calculadas utilizando-se as equações (III.2), (III.3), (III.4)

e (III.5).

Eqpuwoq"fg"CTV"?"CTV"eqpuwokfq"?"*CTV"gpvtcfq"⁄"CTV"eqpxgtvkfq+" (III.2)

[R1U"?"consumido) (ART

produzido) (Etanol (III.3)

[Z1U"?"consumido) (ART

)produzidas células(" (III.4)

Rtqfwvkxkfcfg"?"o)Fermentaçã de (Tempo

produzido) (Etanol" (III.5)

Onde:

CTV"gpvtcfq"?" mosto ART ãoConcentraçmosto densidade

mosto Peso* "


44

CTV"eqpxgtvkfq"?" final ART ãoConcentraçmosto densidade

fermentado vinho final Peso* ""

Gvcpqn"rtqfw|kfq"?"Rguq"hkpcn"xkpjq"hgtogpvcfq","Eqpegpvtcèçq"hkpcn"fg"Gvcpqn"

Eênwncu"rtqfw|kfcu"?"*Eênwncu"kpîekq"⁄"Eênwncu"hkpcn+"

" " Eênwncu"kpîekq"?"Rguq"fq"kpôewnq","Eqpegpvtcèçq"egnwnct"kpîekq"

" " Eênwncu"hkpcn"?"Rguq"hkpcn"xkpjq"hgtogpvcfq","Eqpegpvtcèçq"egnwnct"hkpcn"

A Tabela III-2 apresenta as condições de cada ensaio realizado seguindo

planejamento fatorial para o estudo de desempenho das cepas SA1, BG1, CL1 e

Y904. Estas variáveis foram adicionadas ao meio descrito na Tabela III-1.

Vcdgnc" KKK" /" 4" ⁄" Gpuckqu" tgcnk|cfqu" pq" rncpglcogpvq" hcvqtkcn" eqorngvq" rctc" guvwfq" fg"fgugorgpjq"fcu"egrcu"UA3."DI3."EN3"g"[;260"Qpfg"qu"gpuckqu"37."38"g"39"tgrtgugpvco"q"rqpvq" egpvtcn" g" A" /" Eqpegpvtcèçq" kpkekcn" fg" ıneqqn." V" ⁄" Vgorgtcvwtc" g" RQ" ⁄" Rtguuçq"Quoôvkec0"

A" V" RQ"A"

*oN1N+"

V"

*£E+"

RQ"

*i1N+"

Gpuckqu" Xcnqtgu"Eqfkhkecfqu" Xcnqtgu"Fgeqfkhkecfqu"

3" -1" -1" -1" 10 31 10

4" -1" -1" +1" 10 31 30

5" -1" +1" -1" 10 37 10

6" -1" +1" +1" 10 37 30

7" +1" -1" -1" 30 31 10

8" +1" -1" +1" 30 31 30

9" +1" +1" -1" 30 37 10

:" +1" +1" +1" 30 37 30

;" -1,68" 0" 0" 3,2 34 20

32" +1,68" 0" 0" 36,8 34 20

33" 0" -1,68" 0" 20 29 20

34" 0" +1,68" 0" 20 39 20

35" 0" 0" -1,68" 20 34 3,2

36" 0" 0" +1,68" 20 34 36,8

37"" 0" 0" 0" 20 34 20

38"" 0" 0" 0" 20 34 20

39"" 0" 0" 0" 20 34 20


45

507" EQPFWÑ’Q"FQU"VGUVGU"

As fermentações foram conduzidas em frascos Elenmayer com

capacidade de 250 mL contendo 100 mL de meio de cultivo. Cada frasco foi

inoculado com 10 mL de inóculo. Os frascos foram incubados em shaker com

agitação de 150 rpm por 24 horas. As diferentes temperaturas de incubação estão

descritas na Tabela III-2, de acordo com os ensaios.

508" OÖVQFQU"APAN¯VKEQU"

50803" Fgvgtokpcèçq"fc"Ocuuc"Egnwnct"Rtqfw|kfc"

Para determinar a massa celular produzida na fermentação foi utilizado o

método direto, que consiste na secagem de um determinado volume do vinho

fermentado. Primeiramente pesaram-se placas de Petri previamente secas (P1), e

com auxílio de uma pipeta volumétrica, transferiu-se 10 ml de amostra de vinho

fermentado para um tubo de centrífuga. Centrifugou-se a mesma a 4500 rpm por

cinco minutos. Lavou-se o precipitado duas vezes transferindo-o então, para a

placa. As placas foram para uma estufa a 80°C até atingirem peso constante.

Depois de resfriada pesou-se novamente as placas (P2). O valor da massa de

levedura seca foi calculado pela diferença (P1-P2) sobre o volume de amostra

centrifugada, obtendo-se assim o valor final expresso em gramas por litro de vinho

fermentado.

50804" Fgvgtokpcèçq"fq"Gvcpqn"Rtqfw|kfq"*Oêvqfq"Eqnqtkoêvtkeq+"

Inicialmente as amostras de vinho fermentado foram submetidas a uma

destilação, em micro destilador, para eliminação de impurezas que interferem na

análise (por exemplo, glicose e outros). A solução hidroalcoólica obtida foi

analisada pelo método espectrofotométrico, que consiste na oxidação do etanol a

ácido acético, através da reação com dicromato de potássio em meio ácido, SALIK

& POVH (1993). A solução adquire uma tonalidade verde proporcional à

concentração de álcool na amostra, possibilitando a leitura em espectrofotômetro

a um comprimento de onda de 600 nm.


46

50805" Fgvgtokpcèçq"fg"ATV"*Oêvqfq"Eqnqtkoêvtkeq+"

A determinação de ART nas amostras foi feita utilizando-se o método do

Ácido Dinitro-salicílico (DNS), descrito por MILLER (1959). Como o substrato

utilizado nos testes é a sacarose, esta determinação foi precedida de uma

inversão ácida, para que a mesma seja transformada em açúcares redutores

(glicose e frutose).

50806" Vtcvcogpvq"Guvcvîuvkeq"

As respostas obtidas através dos ensaios realizados pelo planejamento

experimental proposto foram analisadas utilizando-se o “Software Statistica 5.0”.

Obtiveram-se os valores dos efeitos principais e os de interação de cada variável

para as respostas estudadas: Rendimento em Etanol, Rendimento Celular,

Consumo de ART e Produtividade.


Os dados foram analisados no software Statistica 5.0 que gerou

resultados na forma gráfica de curvas de nível e superfícies de resposta. Estas

figuras bem como a Tabela Anova estão apresentados no Anexo B."

603" EQPUWOQ"FG"ATV"

A Tabela III-3 apresenta o Consumo de ART para cada cepa testada."

"

"

"

"

"

"

"

"

"

"

"

"


47

Vcdgnc"KKK"/"5/"Eqpuwoq"fg"ATV"*'+"rctc"ecfc"egrc"vguvcfc"

Gpuckqu" A" V" RQ" UA3" DI3" EN3" [;26"

3" -1" -1" -1" 78,96" 74,34" 74,34" 72,43"

4" -1" -1" +1" 46,18" 39,73" 40,38" 60,26"

5" -1" +1" -1" 79,49" 75,95" 80,83" 81,00"

6" -1" +1" +1" 48,27" 38,25" 39,28" 61,55"

7" +1" -1" -1" 66,59" 60,36" 56,81" 58,61"

8" +1" -1" +1" 34,52" 30,75" 28,04" 45,44"

9" +1" +1" -1" 62,42" 52,80" 55,96" 58,98"

:" +1" +1" +1" 29,73" 20,38" 24,24" 40,40"

;" -1,68" 0" 0" 78,33" 69,77" 69,78" 83,52"

32" +1,68" 0" 0" 42,95" 29,37" 33,90" 52,14"

33" 0" -1,68" 0" 53,74" 53,74" 41,56" 54,47"

34" 0" +1,68" 0" 54,58" 45,05" 54,42" 61,61"

35" 0" 0" -1,68" 81,61" 80,46" 82,35" 82,83"

36" 0" 0" +1,68" 79,49" 27,47" 31,01" 48,59"

37," 0" 0" 0" 58,18" 45,18" 46,56" 67,03"

38," 0" 0" 0" 56,72" 45,15" 47,22" 67,71"

39," 0" 0" 0" 56,68" 45,87" 45,09" 67,69"

Com base nas curvas de nível e superfícies de resposta (Figuras B25 a

B36) do Anexo B, foi construída a Tabela III-4. . Esta Tabela indica se os fatores

estudados (pressão osmótica, concentração inicial de etanol e temperatura)

influenciam significativamente ou não nas respostas obtidas para o Consumo de

ART.

A Tabela III-4 apresenta a influência da pressão osmótica, concentração

inicial de etanol e temperatura sobre o a Consumo de ART.

Vcdgnc"KKK"/"6"/"Kphnwípekc"fc"rtguuçq"quoôvkec."eqpegpvtcèçq"kpkekcn"fg"gvcpqn"g"vgorgtcvwtc"uqdtg"q"Eqpuwoq"fg"ATV"

" DI3" EN3" UA3" [;26"

ıneqqn" +" +" +" +"

Vgorgtcvwtc" +" +" +" +"

Rtguuçq"Quoôvkec" +" +" +" +"

(+) influência significativa"(-) sem influência significativa"


48

Analisando a Tabela III-4, observando as Figuras B25 a B36 e as Tabelas

B9 a B12 do Anexo B pode-se constatar que todos os fatores estudados (pressão

osmótica, concentração inicial de etanol e temperatura) afetam significativamente

as cepas testadas no que diz respeito a consumo de ART (Açúcares Redutores

Totais). Para obter maiores conversões, a concentração inicial de etanol deve

estar, em média, abaixo de 15 mL/L utilizando qualquer das cepas testadas. A

temperatura deve estar acima de 31 °C e a pressão osmótica deve ser a menor

possível."

A Tabela III-5 apresenta a estimativa dos efeitos principais e de interação

sobre o Consumo de ART para a cepa BG1."

Vcdgnc"KKK"/"7"/"Guvkocvkxc"fqu"ghgkvqu"rtkpekrcku"g"fg"kpvgtcèçq"uqdtg"q"Eqpuwoq"fg"ATV"rctc"c"egrc"DI3"*N"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"nkpgct"g"S"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"swcftâvkeq+"⁄"Gttq"Rwtq"?"2.38676:""

Hcvqt" Ghgkvq" Gttq"Rcftçq"

Média" 45,55 *" 0,23"(1) A (L)" -19,32 *" 0,22"

A (Q)" 1,95 *" 0,24"

(2) T (L)" -4,75 *" 0,22"

T (Q)" 1,83 *" 0,24"

(3) PO (L)" -32,73 *" 0,22"

PO (Q)" 5,06 *" 0,24"

1 L . 2 L" -4,52 *" 0,29"

1 L .3 L" 2,57 *" 0,29"

2 L . 3 L" -1,47 *" 0,29"

* valores significativos (no nível de 95 %); R² = 0,98585 Grau de Ajuste = 0,96765"

Pode-se perceber pelos dados da Tabela III-5 que ao variar a

concentração inicial de etanol (A) de 10 mL/L para 30 mL/L a consumo do ART

diminui em média 19,32 % para a cepa BG1. Para a temperatura, quando passa

do nível -1 (31 °C) para +1 (37°C), a consumo do ART sofre uma diminuição de

4,75 %. Para a pressão osmótica, quando esta passa de 10 g/L para 30 g/L, sofre

uma diminuição de 32,73 %."

Sendo o princípio do planejamento uma análise multivariável, é possível

avaliar o efeito da interação entre as variáveis. Isto significa que ao variar a


49

concentração inicial de etanol de -1 para +1, a mudança na resposta pode não ser

a mesma, pois esta depende também da variação da temperatura e da variação

da pressão osmótica. Na Tabela III-5, isto pode ser verificado através dos efeitos

de interação, que correspondem aos 3 últimos valores apresentados."

O modelo codificado obtido pela regressão que relaciona o rendimento

celular para a cepa BG1 com a concentração inicial de etanol, temperatura e

pressão osmótica, é a equação de 2ª ordem descrita matematicamente pela

equação (III.6)."

EqpuCTV"?"/";.88"C"/"4.59"V"/"38.58"RQ"-"2.;:"C²"-"2.;4"V²"-"4.75"RQ²"/"4.48"A"0"V"-"

3.4;A0RQ"/"2.96"V"0"RQ"-"67.77"" " " " " " " *KKK08+""


sobre o Consumo de ART para a cepa CL1."

Vcdgnc"KKK"/"8"/"Guvkocvkxc"fqu"ghgkvqu"rtkpekrcku"g"fg"kpvgtcèçq"uqdtg"q"Eqpuwoq"fg"ATV"rctc"c"egrc"EN3"*N"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"nkpgct"g"S"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"swcftâvkeq+"⁄"Gttq"Rwtq"?"3.3;2889""


Média" 46,45 *" 0,63"

(1) A (L)" -19,06 *" 0,59"

A (Q)" 2,80" 0,65"

(2) T (L)" 3,28 *" 0,59"

T (Q)" 0,08" 0,65"

(3) PO (L)" -32,56 *" 0,59"

PO (Q)" 6,22 *" 0,65"

1 L . 2 L" -2,51" 0,77"

1 L .3 L" 3,75 *" 0,77"

2 L . 3 L" -2,64" 0,77"



concentração inicial de etanol (A) de 10 mL /L para 30 mL /L a consumo do ART

diminui em média 19,06 % para a cepa CL1. Para a temperatura, quando passa

do nível -1 (31 °C) para +1 (37°C), a consumo do ART sofre um aumento de 3,28

%. Para a pressão osmótica, quando esta passa de 10 g/L para 30 g/L, sofre uma

diminuição de 32,56 %."


50


celular para a cepa CL1 com a concentração inicial de etanol, temperatura e


equação (III.7)."

EqpuCTV"?"/;.75""C"-"3.86""V"/"38.4:"RQ"-"4.9:""RQ²"-"3.::""C"0"RQ"-"69.:9" "*KKK09+""


sobre o Consumo de ART para a cepa SA1.

Vcdgnc"KKK"/"9"/"Guvkocvkxc"fqu"ghgkvqu"rtkpekrcku"g"fg"kpvgtcèçq"uqdtg"q"Eqpuwoq"fg"ATV"rctc"c"egrc"UA3"*N"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"nkpgct"g"S"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"swcftâvkeq+"⁄"Gttq"Rwtq"?"2.94:5647""


Média" 57,83 *" 0,49"(1) A (L)" -17,45 *" 0,46"

A (Q)" -1,93" 0,51"

(2) T (L)" -0,72" 0,46"

T (Q)" -6,51 *" 0,51"

(3) PO (L)" -19,38 *" 0,46"

PO (Q)" 12,15 *" 0,51"

1 L . 2 L" -2,89 *" 0,60"

1 L .3 L" -0,19" 0,60"

2 L . 3 L" 0,23" 0,60"




diminui em média 17,45 % para a cepa SA1. Para a pressão osmótica, quando

passa do nível -1 (10 g/L) para +1 (30 g/L), a consumo do ART sofre uma



celular para a cepa SA1 com a concentração inicial de etanol, temperatura e


equação (III. 8)."


51

EqpuCTV"?"/":.95"C"/";.8;"RR"/"5.47"V²"-"8.2:"RQ²"/"3.67"C"0"V"-"79.:5"" """""*KKK0":+""


sobre o Consumo de ART para a cepa Y904.

Vcdgnc"KKK"/":"/"Guvkocvkxc"fqu"ghgkvqu"rtkpekrcku"g"fg"kpvgtcèçq"uqdtg"q"Eqpuwoq"fg"ATV"rctc"c"egrc"[;26" *N"ê"q"eqghkekgpvg"fq" vgtoq" nkpgct"g"S"ê"q"eqghkekgpvg"fq" vgtoq"swcftâvkeq+"⁄"Gttq"Rwtq"?"2.368:3;5""


Média" 67,72 *" 0,22"(1) A (L)" -18,24 *" 0,21"

A (Q)" -1,44 *" 0,23"

(2) T (L)" 2,52 *" 0,21"

T (Q)" -8,36 *" 0,23"

(3) PO (L)" -17,71 *" 0,21"

PO (Q)" -2,94 *" 0,23"

1 L . 2 L" -3,63 *" 0,27"

1 L .3 L" -0,03" 0,27"

2 L . 3 L" -3,17 *" 0,27"




diminui em média 18,24 % para a cepa Y904. Para a temperatura, quando passa

do nível -1 (31 °C) para +1 (37°C), a conversa do ART sofre um aumento de 2,52

%. Para a pressão osmótica, quando esta passa de 10 g/L para 30 g/L, sofre uma


Na Tabela III-8, pode-se verificar e avaliar os efeitos de interação entre

Álcool e Temperatura e Temperatura e Pressão Osmótica. Ao variar a

concentração inicial de etanol de -1 para +1, a mudança na resposta pode não ser

a mesma, pois esta depende também da variação da temperatura. Ao variar a

temperatura de -1 para +1, esta depende da concentração inicial de etanol e da

pressão osmótica e finalmente, ao variar a pressão osmótica na mesma faixa, a

mudança na resposta depende da variação da temperatura."


52


celular para a cepa Y904 com a concentração inicial de etanol, temperatura e


equação (III.9).

EqpuCTV"?"/";.34"C"-"3.48"V"/":.:8"RQ"/"2.94"C²"/"6.3:"0"V²"/"3.69"RQ²"/"

3.:4"C"0"V"/"3.7;"V"0"RQ"-"89.95" " " " " " " *KKK0;+"

604" TGPFKOGPVQ"GO"GVAPQN"

A Tabela III-9 apresenta o rendimento em etanol (YP/S) para cada cepa

testada.

Vcdgnc"KKK"/";"/"Tgpfkogpvq"go"gvcpqn"*[R1U+"rctc"ecfc"egrc"vguvcfc"*i1mi+"


3" -1" -1" -1" 0,4847" 0,4865" 0,4715" 0,4927"

4" -1" -1" +1" 0,4645" 0,4464" 0,4156" 0,4311"

5" -1" +1" -1" 0,4594" 0,4628" 0,4634" 0,4560"

6" -1" +1" +1" 0,4719" 0,4405" 0,4797" 0,4637"

7" +1" -1" -1" 0,4711" 0,4636" 0,4781" 0,4734"

8" +1" -1" +1" 0,4815" 0,4675" 0,4267" 0,4293"

9" +1" +1" -1" 0,4581" 0,4615" 0,4630" 0,4867"

:" +1" +1" +1" 0,4931" 0,5362" 0,4571" 0,4123"

;" -1,68" 0" 0" 0,4790" 0,4496" 0,4627" 0,4665"

32" +1,68" 0" 0" 0,4415" 0,4532" 0,4445" 0,4495"

33" 0" -1,68" 0" 0,3856" 0,3856" 0,3886" 0,4063"

34" 0" +1,68" 0" 0,3772" 0,3638" 0,3396" 0,3800"

35" 0" 0" -1,68" 0,4581" 0,4591" 0,4518" 0,4436"

36" 0" 0" +1,68" 0,4594" 0,4477" 0,4367" 0,4704"

37," 0" 0" 0" 0,4415" 0,4622" 0,4322" 0,4535"

38," 0" 0" 0" 0,5115" 0,4586" 0,4475" 0,4635"

39," 0" 0" 0" 0,5022" 0,4978" 0,4773" 0,4641"


B12) do Anexo B, foi construída a Tabela III-10. Esta Tabela indica se os fatores


influenciam significativamente ou não nas respostas obtidas para o rendimento em

etanol (YP/S).

"


53

Vcdgnc"KKK"/"32"⁄"Kphnwípekc"fc"rtguuçq"quoôvkec."eqpegpvtcèçq"kpkekcn"fg"gvcpqn"g"vgorgtcvwtc"uqdtg"q"tgpfkogpvq"go"gvcpqn"*[R1U+"

" DI3" EN3" UA3" [;26"

ıneqqn" -" -" -" -"

Vgorgtcvwtc" -" -" -" +"

Rtguuçq"Quoôvkec" -" -" -" +"


Observando a Tabela III-10, as Figuras B1 a 12 e as Tabela B1 a B4 do

Anexo B, pode-se constatar que os fatores estudados (pressão osmótica,

concentração inicial de etanol e temperatura) não tiveram uma influência

significativa para as cepas BG1, CL1 e SA1 no que diz respeito ao rendimento em

etanol (YP/S). Mas com relação à cepa Y904, houve uma influência significativa

para os fatores temperatura e pressão osmótica.


sobre o rendimento em etanol (YP/S) para a cepa Y904."

Vcdgnc" KKK" /" 33" /" Guvkocvkxc" fqu" ghgkvqu" rtkpekrcku" g" fg" kpvgtcèçq" uqdtg" q" tgpfkogpvq" go"gvcpqn"*[R1U+"rctc"c"egrc"[;26"*N"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"nkpgct"g"S"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"swcftâvkeq+"⁄"Gttq"Rwtq"?"2.222258"


Média" 0,4590 *" 0,0035"(1) A (L)" -0,0103" 0,0032"

A (Q)" 0,0077" 0,0036"

(2) T (L)" -0,0076" 0,0032"

T (Q)" -0,0381 *" 0,0036"

(3) PO (L)" -0,0186 *" 0,0032"

PO (Q)" 0,0070" 0,0036"

1 L . 2 L" 0,0001" 0,0042"

1 L .3 L" -0,0161" 0,0042"

2 L . 3 L" 0,0098" 0,0042"* valores significativos (no nível de 95 %); R² = 0,58981 Grau de Ajuste = 0,06243"

Pode-se perceber pelos dados da Tabela III-11 que ao variar a pressão

osmótica (PO) de 10 mL/L para 30 mL/L o rendimento em etanol diminui em média

0,00186 g/kg. "


54

O modelo codificado obtido pela regressão que relaciona o rendimento em

etanol para a cepa Y904 com a concentração inicial de etanol, temperatura e

pressão osmótica é uma equação de 2ª ordem descrita matematicamente pela

equação (III.10)."

[R1U"?"/"2.22;5"0"RQ"/"2.24290"V²"-"2.6884" " " " " *KKK032+"

onde T a temperatura e P a pressão osmótica. "

Em média, para todas as cepas estudadas, os maiores YP/S obtidos foram

na faixa de 32 a 36 °C, e os menores foram nos ensaios 14 e 15 cujas

temperaturas foram os extremos (29 e 39, respectivamente). "

605" TGPFKOGPVQ"EGNWNAT"

A Tabela III-12 apresenta rendimento celular (YX/S) para cada cepa

testada.

Vcdgnc"KKK"/"34"/"Tgpfkogpvq"Egnwnct"*[Z1U+"rctc"ecfc"egrc"vguvcfc"*i1mi+"


3" -1" -1" -1" 0,0434" 0,0501" 0,0489" 0,0473"

4" -1" -1" +1" 0,0569" 0,0614" 0,0568" 0,0518"

5" -1" +1" -1" 0,0415" 0,0441" 0,0322" 0,0403"

6" -1" +1" +1" 0,0461" 0,0471" 0,0449" 0,0354"

7" +1" -1" -1" 0,0560" 0,0626" 0,0631" 0,0609"

8" +1" -1" +1" 0,0679" 0,0675" 0,0695" 0,0595"

9" +1" +1" -1" 0,0558" 0,0601" 0,0489" 0,0391"

:" +1" +1" +1" 0,0619" 0,0757" 0,0560" 0,0430"

;" -1,68" 0" 0" 0,0461" 0,0507" 0,0469" 0,0433"

32" +1,68" 0" 0" 0,0695" 0,0839" 0,0680" 0,0561"

33" 0" -1,68" 0" 0,0566" 0,0566" 0,0586" 0,0532"

34" 0" +1,68" 0" 0,0441" 0,0482" 0,0365" 0,0288"

35" 0" 0" -1,68" 0,0572" 0,0580" 0,0596" 0,0506"

36" 0" 0" +1,68" 0,0415" 0,0645" 0,0587" 0,0538"

37," 0" 0" 0" 0,0532" 0,0576" 0,0533" 0,0446"

38," 0" 0" 0" 0,0555" 0,0602" 0,0548" 0,0451"

39," 0" 0" 0" 0,0585" 0,0637" 0,0597" 0,0481"




55


influenciam significativamente ou não nas respostas obtidas para o rendimento em

etanol (YX/S).


inicial de etanol e temperatura sobre o rendimento celular (YX/S)."

Vcdgnc"KKK"/"35"/"Kphnwípekc"fc"rtguuçq"quoôvkec."eqpegpvtcèçq"kpkekcn"fg"gvcpqn"g"vgorgtcvwtc"uqdtg"q"tgpfkogpvq"egnwnct"*[Z1U+"

" DI3" EN3" UA3" [;26"

ıneqqn" +" +" +" +"

Vgorgtcvwtc" -" +" -" +"

Rtguuçq"Quoôvkec" -" -" -" -"


Como pode ser visto na Tabela III-13, nas Figuras B13 a B24 e Tabelas

B5 a B8 que estão no Anexo B, em todas as cepas testadas a concentração inicial

de etanol influenciou significativamente este parâmetro, obtendo-se sempre

maiores YX/S com concentração inicial de etanol superior a 25 mL/L. O fator

temperatura influencia somente nas cepas CL1 e Y904, obtendo maiores

rendimento numa faixa de 32 a 36 graus. A pressão osmótica não exerce

influência significativa para nenhuma cepa testada."


sobre o rendimento celular (YX/S) para a cepa BG1.


56

Vcdgnc"KKK" /"36"/"Guvkocvkxc"fqu"ghgkvqu"rtkpekrcku"g"fg"kpvgtcèçq"uqdtg"q"tgpfkogpvq"egnwnct"*[Z1U+" rctc" c" egrc" DI3" *N" ê" q" eqghkekgpvg" fq" vgtoq" nkpgct" g" S" ê" q" eqghkekgpvg" fq" vgtoq"swcftâvkeq+"⁄"Gttq"Rwtq"?"2.22222;6"


Média" 0,0606 *" 0,0018"(1) A (L)" 0,0175 *" 0,0017"

A (Q)" 0,0040" 0,0018"

(2) T (L)" -0,0042" 0,0017"

T (Q)" -0,0065" 0,0018"

(3) PO (L)" 0,0067" 0,0017"

PO (Q)" -0,0002" 0,0018"

1 L . 2 L" 0,0065" 0,0022"

1 L .3 L" 0,0016" 0,0022"

2 L . 3 L" 0,0006" 0,0022"



concentração inicial de etanol (A) de 10 mL/L para 30 mL/L o rendimento celular

(YX/S) aumenta em média 0,0175 g/g para a cepa BG1."





[Z1U"?"2.27;70"C"-"2.22:9" " " " " " " *KKK033+""


sobre o rendimento celular (YX/S) para a cepa CL1.


57

Vcdgnc"KKK" /"37"/"Guvkocvkxc"fqu"ghgkvqu"rtkpekrcku"g"fg"kpvgtcèçq"uqdtg"q"tgpfkogpvq"egnwnct"*[Z1U+" rctc" c" egrc" EN3" *N" ê" q" eqghkekgpvg" fq" vgtoq" nkpgct" g" S" ê" q" eqghkekgpvg" fq" vgtoq"swcftâvkeq+"⁄"Gttq"Rwtq"?"2.2222333"


Média" 0,0560 *" 0,0019"(1) A (L)" 0,0132 *" 0,0018"

A (Q)" 0,0002" 0,0020"

(2) T (L)" -0,0137 *" 0,0018"

T (Q)" -0,0069" 0,0020"

(3) PO (L)" 0,0048" 0,0018"

PO (Q)" 0,0013" 0,0020"

1 L . 2 L" 0,0002" 0,0024"

1 L .3 L" -0,0018" 0,0024"

2 L . 3 L" 0,0013" 0,0024"




(YX/S) aumenta em média 0,0132 g/g para a cepa CL1. Para a temperatura,

quando passa do nível -1 (31 °C) para +1 (37°C), o rendimento celular sofre uma

diminuição de 0,0137 g/kg."





[Z1U"= 2.2288"0" A /"2.228:"0 T + 2.275;" " " " " *KKK034+""


sobre o rendimento celular (YX/S) para a cepa SA1."

"

"


58

Vcdgnc"KKK" /"38"/"Guvkocvkxc"fqu"ghgkvqu"rtkpekrcku"g"fg"kpvgtcèçq"uqdtg"q"tgpfkogpvq"egnwnct"*[Z1U+" rctc" c" egrc" UA3" *N" ê" q" eqghkekgpvg" fq" vgtoq" nkpgct" g" S" ê" q" eqghkekgpvg" fq" vgtoq"swcftâvkeq+"⁄"Gttq"Rwtq"?"2.2222294"


Média" 0,0557 *" 0,0015"(1) A (L)" 0,0136 *" 0,0015"

A (Q)" 0,0021" 0,0016"

(2) T (L)" -0,0059" 0,0015"

T (Q)" -0,0032" 0,0016"

(3) PO (L)" 0,0014" 0,0015"

PO (Q)" -0,0039" 0,0016"

1 L . 2 L" 0,0016" 0,0019"

1 L .3 L" 0,0000" 0,0019"

2 L . 3 L" -0,0037" 0,0019"




(YX/S) aumenta em média 0,0136 g/kg para a cepa SA1. "





[Z1U"?"2.228:"0""C"-"2.2758" " " " " " " *KKK035+""


sobre o rendimento celular (YX/S) para a cepa Y904."

"

"

"

"

"

"

"


59

Vcdgnc"KKK" /"39"/"Guvkocvkxc"fqu"ghgkvqu"rtkpekrcku"g"fg"kpvgtcèçq"uqdtg"q"tgpfkogpvq"egnwnct"*[Z1U+" rctc" c" egrc" [;26" *N" ê" q" eqghkekgpvg" fq" vgtoq" nkpgct" g" S" ê" q" eqghkekgpvg" fq" vgtoq"swcftâvkeq+"⁄"Gttq"Rwtq"?"2.2222257"


Média" 0,0460 *" 0,0011"(1) A (L)" 0,0072 *" 0,0010"

A (Q)" 0,0024" 0,0011"

(2) T (L)" -0,0150 *" 0,0010"

T (Q)" -0,0037" 0,0011"

(3) PO (L)" 0,0011" 0,0010"

PO (Q)" 0,0042" 0,0011"

1 L . 2 L" -0,0037" 0,0013"

1 L .3 L" 0,0007" 0,0013"

2 L . 3 L" -0,0010" 0,0013"




(YX/S) aumenta em média 0,0072 g/g para a cepa Y904. Para a temperatura,

quando passa do nível -1 (31 °C) para +1 (37°C), o rendimento celular sofre uma

diminuição de 0,0150 g/g."





[Z1U?"2.2258"0""C"/"2.2297"0""V"-"2.2693" " " " " *KKK036+""

606" RTQFWVKXKFAFG"

A Tabela III-18 apresenta a Produtividade para cada cepa testada.

"


60

Vcdgnc"KKK"/"3:"⁄"Rtqfwvkxkfcfg"*i1N0j+"rctc"ecfc"egrc"vguvcfc"


3" -1" -1" -1" 2,1649" 2,0393" 1,9760" 2,0082"

4" -1" -1" +1" 1,1827" 0,9732" 0,9207" 1,4438"

5" -1" +1" -1" 2,2059" 2,1121" 2,2593" 2,2276"

6" -1" +1" +1" 1,2693" 0,9321" 1,0474" 1,6057"

7" +1" -1" -1" 1,6861" 1,4993" 1,4563" 1,4879"

8" +1" -1" +1" 0,8910" 0,7678" 0,6399" 1,0534"

9" +1" +1" -1" 1,6087" 1,3609" 1,4528" 1,6109"

:" +1" +1" +1" 0,8023" 0,5950" 0,6042" 0,9152"

;" -1,68" 0" 0" 2,1748" 1,8100" 1,8637" 2,2710"

32" +1,68" 0" 0" 1,0157" 0,7095" 0,8045" 1,2648"

33" 0" -1,68" 0" 1,2465" 1,2465" 0,9643" 1,3312"

34" 0" +1,68" 0" 1,2902" 1,0192" 1,1544" 1,4695"

35" 0" 0" -1,68" 2,1888" 2,1662" 2,1863" 2,1552"

36" 0" 0" +1,68" 2,2059" 0,6588" 0,7242" 1,2412"

37," 0" 0" 0" 1,4323" 1,1569" 1,1143" 1,7072"

38," 0" 0" 0" 1,6157" 1,1465" 1,1686" 1,7614"

39," 0" 0" 0" 1,5840" 1,2646" 1,1902" 1,7618"




influenciam significativamente ou não nas respostas obtidas para Produtividade.


inicial de etanol e temperatura sobre a produtividade.

Vcdgnc"KKK"/"3;"/"Kphnwípekc"fc"rtguuçq"quoôvkec."eqpegpvtcèçq"kpkekcn"fg"gvcpqn"g"vgorgtcvwtc"uqdtg"c"Rtqfwvkxkfcfg"

" DI3" EN3" UA3" [;26"

ıneqqn" +" +" +" +"

Vgorgtcvwtc" -" +" +" +"

Rtguuçq"Quoôvkec" +" +" +" +"


Observa-se na Tabela III-19 e nas Figuras B37 a B48 e Tabelas B13 a

B16 do Anexo B que todos os fatores estudados (pressão osmótica, concentração


61

inicial de etanol e temperatura) afetam significativamente as cepas testadas no

que diz respeito à Produtividade, com uma única exceção que ocorre com a cepa

BG1, onde a temperatura não tem uma influência significativa."


sobre a Produtividade para a cepa BG."

Vcdgnc"KKK"/"42"/"Guvkocvkxc"fqu"ghgkvqu"rtkpekrcku"g"fg"kpvgtcèçq"uqdtg"c"Rtqfwvkxkfcfg"rctc"c"egrc"DI3"*N"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"nkpgct"g"S"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"swcftâvkeq+"⁄"Gttq"Rwtq"?"2.226496"


Média" 1,1885 *" 0,0377"

(1) A (L)" -0,5396 *" 0,0354"

A (Q)" 0,0550" 0,0389"

(2) T (L)" -0,0969" 0,0354"

T (Q)" -0,0347" 0,0389"

(3) PO (L)" -0,9195 *" 0,0354"

PO (Q)" 0,1631" 0,0389"

1 L . 2 L" -0,0857" 0,0462"1 L .3 L" 0,1871" 0,0462"

2 L . 3 L" -0,0371" 0,0462"



concentração inicial de etanol (A) de 10 mL/L para 30 mL/L a Produtividade

diminui em média 0,5396 getanol/(L.h) para a cepa BG1. Para a pressão osmótica,

quando passa do nível -1 (10 g/L) para +1 (30 g/L), a produtividade sofre uma

diminuição de 0,9195."





Rtqf"?"/"2.48;:"C"/"2.67;9"RQ"-"3.3::8" " " " " *KKK037+""


sobre a Produtividade para a cepa CL1.


62

Vcdgnc"KKK"/"43"/"Guvkocvkxc"fqu"ghgkvqu"rtkpekrcku"g"fg"kpvgtcèçq"uqdtg"c"Rtqfwvkxkfcfg"rctc"c"egrc"EN3"*N"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"nkpgct"g"S"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"swcftâvkeq+"⁄"Gttq"Rwtq"?"2.22374;6"


Média" 1,1574 *" 0,0225"(1) A (L)" -0,5611 *" 0,0212"

A (Q)" 0,1265 *" 0,0233"

(2) T (L)" 0,1011 *" 0,0212"

T (Q)" -0,0677" 0,0233"

(3) PO (L)" -0,9360 *" 0,0212"

PO (Q)" 0,2122 *" 0,0233"

1 L . 2 L" -0,1123" 0,0277"

1 L .3 L" 0,1506 *" 0,0277"

2 L . 3 L" -0,0472" 0,0277"



concentração inicial de etanol (A) de 10 mL/L para 30 mL/L a produtividade diminui

em média 0,5611 getanol/(L.h) para a cepa CL1. Para a temperatura, quando passa

do nível -1 (31 °C) para +1 (37°C), a produtividade sofre um aumento de 0,1011

getanol/(L.h). Para a pressão osmótica, quando esta passa de 10 g/L para 30 g/L,

sofre uma diminuição de 0,9360 getanol/(L.h)."


Álcool e Pressão Osmótica. Ao variar a concentração inicial de etanol de -1 para

+1, a mudança na resposta pode não ser a mesma, pois esta depende também da

variação da pressão osmótica."





Rtqf"?"/"2.4:28"C"-""2.2728"V"/"2.68:2"RQ-"2.2955"C²"-"2.3383"RQ²"-"2.2975"C"0RQ"-"

3.3364" " " " " " " " " " " *KKK038+""


63


sobre a Produtividade para a cepa SA1."

Vcdgnc"KKK"/"44"/"Guvkocvkxc"fqu"ghgkvqu"rtkpekrcku"g"fg"kpvgtcèçq"uqdtg"c"Rtqfwvkxkfcfg"rctc"c"egrc"UA3"*N"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"nkpgct"g"S"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"swcftâvkeq+"⁄"Gttq"Rwtq"?"2.22;8359"


Média" 1,5581 *" 0,0565"(1) A (L)" -0,5542 *" 0,0531"

A (Q)" -0,0611" 0,0584"

(2) T (L)" 0,0051" 0,0531"

T (Q)" -0,2923 *" 0,0584"

(3) PO (L)" -0,5113 *" 0,0531"

PO (Q)" 0,3646 *" 0,0584"

1 L . 2 L" -0,0734" 0,0693"

1 L .3 L" 0,0793" 0,0693"

2 L . 3 L" 0,0085" 0,0693"




em média 0,5542 getanol/(L.h) para a cepa CL1. Para a pressão osmótica, quando

esta passa de 10 g/L para 30 g/L, sofre uma diminuição de 0,5113 getanol/(L.h)."





Rtqf"?"/"2.4993"C"-"/"2.4779"RQ/"2.35930"V²"-"2.3;36"RQ²"-"3.73;3" " *KKK039+""


sobre a Produtividade para a cepa Y904."

"

"

"

"


64

Vcdgnc"KKK"/"45"/"Guvkocvkxc"fqu"ghgkvqu"rtkpekrcku"g"fg"kpvgtcèçq"uqdtg"c"Rtqfwvkxkfcfg"rctc"c"egrc"[;26"*N"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"nkpgct"g"S"ê"q"eqghkekgpvg"fq"vgtoq"swcftâvkeq+"⁄"Gttq"Rwtq"?"2.222;:79"


Média" 1,7480 *" 0,0181"(1) A (L)" -0,5726 *" 0,0170"

A (Q)" -0,0141" 0,0187"

(2) T (L)" 0,0877 *" 0,0170"

T (Q)" -0,2740 *" 0,0187"

(3) PO (L)" -0,5644 *" 0,0170"

PO (Q)" -0,0634" 0,0187"

1 L . 2 L" -0,0991 *" 0,0222"

1 L .3 L" 0,0140" 0,0222"

2 L . 3 L" -0,0797" 0,0222"




em média 0,5726 getanol/(L.h) para a cepa Y904. Para a temperatura, quando

passa do nível -1 (31 °C) para +1 (37°C), a produtividade sofre um aumento de

0,0877 getanol/(L.h). Para a pressão osmótica, quando esta passa de 10 g/L para 30

g/L, sofre uma diminuição de 0,5644 getanol/(L.h)."


Álcool e Temperatura. Ao variar a concentração inicial de etanol de -1 para +1, a

mudança na resposta pode não ser a mesma, pois esta depende também da

variação temperatura."





Rtqf"?"/"2.4:85"C"-"2.265:"V"/"2.4:44"RQ"/"2.34:4V²""/"2.26;8"C"0"V"-"3.92;:"""""""""*KKK03:+""


65

70" EQPENWU’Q"

Para facilitar o entendimento da escolha das cepas, segue um resumo dos

modelos obtidos de cada resposta estudada (YP/S, YX/S, Produtividade em etanol e

Consumo do ART) para cada variável (Álcool – A, Temperatura – T e Pressão

Osmótica – PO) que influenciou significativamente as cepas testadas (BG1, CL1,

SA1 e Y904)."

ConsART =45,55 - 9,66.A - 2,37.T - 16,36.PO + 0,98.A² + 0,92.T² + 2,53.P² - 2,26.A.T + 1,29.A.PO

- 0,74.T.PO *DI3+" " " (III.6)"

ConsART =47,87 -9,53.A + 1,64.T - 16,28.PO + 2,78.P² + 1,88.A.PO *EN3+" " (III.7)"

ConsART =79.:5 - 8,73.A - 9,69.PO - 3,25.T² + 6,08.PO² - 1,45.A.T *UC3+" " (III.8)"

ConsART =89.95 - 9,12.A + 1,26.T - 8,86.PO - 0,72.A² - 4,18.T² - 1,47.PO² - 1,82.A.T - 1,59.T.PO *[;26+" " " (III.9)"

YP/S =0,4662 - 0,0093.PO - 0,0207.T² *[;26+" " " (III.10)"

YX/S =0,0087 + 0,0595.A *DI3+" " " (III.11)"

YX/S = 2.275; + 0,0066.A - 0,0068.T *EN3+" " " (III.12)"

YX/S =2.2758 + 0,0068.A *UC3+" " " (III.13)"

YX/S =0,0471 + 0,0036.A - 0,0075.T *[;26+" " " (III.14)

Prod =1,1886 - 0,2698.A - 0,4597.PO *DI3+" " " (III.15)"

Prod =1,1142 - 0,2806.A + 0,0506.T - 0,4680.PO+ 0,0733.A² +0,1161.PO² + 0,0753.A.PO *EN3+" " " (III.16)"

Prod =3.73;3 - 0,2771.A + - 0,2557.PO- 0,1371.T² + 0,1914.PO² *UC3+" " (III.17)"

Prod =3.92;:- 0,2863.A + 0,0438.T - 0,2822.PO - 0,1282.T² - 0,0496.A.T

*[;26+" " " (III.18)"


66

Nas equações exemplificadas, os termos independentes representam os

valores médios de cada parâmetro.

Com relação ao Consumo de ART, o melhor desempenho observado foi

para as cepas SA1 e Y904 mostrando uma média mais elevada desta resposta

quando comparadas com as demais cepas testadas, conforme as equações (III.6)

a (III.9).

A equação (III.10) é o modelo que representa a influência dos fatores

estudados sobre o rendimento em etanol (YP/S), sabendo-se que somente a cepa

Y904 foi influenciada significativamente pelos fatores.

Nas equações (III.11) a (III.14), os termos independentes mostram que as

cepas SA1 e CL1 obtiveram melhor desempenho para o rendimento celular.

Quanto a Produtividade, pode-se observar por intermédio das equações

(III.15) a (III.18), que as cepas SA1 e Y904 mostrando uma média mais elevada

desta resposta quando comparadas com as demais cepas testadas.

Da análise dos rendimentos em etanol e celular, Produtividade e Consumo

de ART, conclui-se de uma maneira geral, que as cepas SA1 e Y904 foram as que

mais se destacaram, sendo selecionadas para as etapas posteriores.

80" DKDNKQITAHKA"

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69

EAR¯VWNQ"KX"

AXANKAÑ’Q"FQ"GHGKVQ"FQU"EQORQUVQU"QTIÛPKEQU"

FGVGEVAFQU"PQ"OGNAÑQ"UQDTG"AU"EGRAU"UA3"G"

[;260"

QDLGVKXQ 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 93 30 KPVTQFWÑ’Q00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 93 40 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 95



2.3 Meio de Cultivo ....................................................................................... 74







50 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 98 3.1 Influência do Ácido Gálico....................................................................... 77

3.2 Influência do Ácido Cafeico..................................................................... 78

3.3 Influência do Ácido Vanílico .................................................................... 80

3.4 Influência do Ácido Lático ....................................................................... 81

3.5 Influência do Ácido Siríngico................................................................... 83

3.6 Influência do Ácido Pirúvico .................................................................... 85

3.7 Influência do Ácido Acético ..................................................................... 86

3.8 Influência do Ácido Butírico..................................................................... 88

3.9 Influência do Ácido Fórmico.................................................................... 89

3.10 Influência do HMF................................................................................... 91

60 EQPENWU’Q 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;4 70 DKDNKQITAHKA 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;5

Efeito dos Compostos Orgânicos Sobre as Cepas SA1 e Y904

71

QDLGVKXQ"

Cxcnkct"qu"ghgkvqu"fqu"eqorquvqu"qtiãpkequ"wvknk|cfqu"pguvc"gvcrc"uqdtg"cu"

egrcu"fg"ngxgfwtc"UC3"g"[;260"

"

30" KPVTQFWÑ’Q"

Nas unidades de produção de álcool acopladas a unidades de produção

de açúcar, a matéria-prima utilizada para obtenção deste produto é o mel final

diluído em caldo de segundo terno ou filtrado após tratamento, ou somente em

água. Nos últimos anos, a utilização de mel com maior nível de esgotamento como

matéria prima de fermentação vem se tornando uma prática comum. Neste mel

estão presentes açúcares fermentescíveis e não-fermentescíveis, cinzas, sais,

compostos coloridos e outros. Dentre os compostos coloridos, os compostos

fenólicos são responsáveis por 60 a 75% da cor, segundo SMITH (1976) e

CLARKE gv0"cn. (1985).

Os compostos fenólicos podem agir como inibidores dos microrganismos

(dependendo da concentração) segundo O’CONNOR & RUBINO (1991).

Conforme NARENDRANATH gv0" cn0" *2001), os ácidos orgânicos também são

potenciais inibidores das leveduras.

Estes compostos estão presentes nas plantas da cana-de-açúcar e são

carreados pelo caldo e acabam se acumulando nos méis que posteriormente

serão fermentados. Este acúmulo acontece quando o caldo passa pelos

evaporadores e cozedores para a retirada da água e cristalização do açúcar, mas

à temperatura que o caldo é submetido não é suficiente para evaporar ou

decompor estes compostos que possuem elevados pontos de ebulição e boa

estabilidade térmica. Durante o cozimento, pode ocorrer também a degradação

térmica da sacarose, formando compostos indesejáveis à fermentação alcoólica,

tais como ácidos orgânicos (por exemplo, ácido lático, fórmico e acético) e hidroxi-

metil-furfural (HMF). Estes compostos, por apresentarem ação antimicrobiana,

podem afetar o desempenho das leveduras, podendo ser uma das causas da


72

baixa qualidade fermentativa de alguns méis. Na presença de temperaturas

elevadas, ocorrem duas transformações químicas envolvendo os carboidratos,

sendo elas a reação de Maillard com degradação de Strecker e a caramelização,

ocorrendo a degradação do carboidrato e formando compostos voláteis. As

reações de Maillard podem produzir compostos como acetaldeído, benzaldeído,

formol, aldeído lático. A caramelização podem produzir ácido fórmico, acético,

hidroximetilfurfural, entre outros. (BOBBIO & BOBBIO, 2001).

Segundo DE BRUIJN gv0"cn. (1986), os monossacarídeos são degradados

em meio alcalino a ácidos carboxílicos. A maior parte dos monossacarídeos é

convertida em ácidos carboxílicos de baixo peso molecular com mesmo ou menor

número de carbonos. Alguns exemplos destes ácidos: lático, fórmico, acético,

glicólico, sacarínico.

Segundo KOHL (2004), a temperatura de fermentação, a deficiência de

nutrientes no substrato e os relativos níveis de concentração de glicose, etanol,

ácido lático, ácido acético e aflatoxinas são típicos fatores de estresse

encontrados no dia-a-dia em uma planta de produção de etanol. Sob condições

ácidas encontradas na fermentação, os ácidos acético e lático podem penetrar na

membrana protetora e entrar na célula, uma vez dentro dela, os ácidos causam

danos aos componentes celulares causando uma perda na viabilidade celular.

Estes danos, associados às altas concentrações de glicose utilizadas na

fermentação podem fazer com que o fermento morra ou cesse seu metabolismo.

TOSETTO (2000) mostrou que a qualidade fermentativa dos méis não

está associada somente ao seu nível de esgotamento, como se acreditava até

então. Desta forma, fazem-se necessários estudos complementares para

comprovar a influência destes compostos sobre o desempenho da levedura. A

definição e identificação dos compostos inibidores presentes no mel final são de

fundamental importância para que se possam aperfeiçoar os processos

fermentativos que o utilizam como matéria prima.


73



Nesta etapa foram utilizadas três linhagens de Uceejctqo{egu"egtgxkucg.

As duas linhagens escolhidas com base nos resultados do Capítulo III (SA1 e

Y904). Optou-se por trabalhar com uma terceira cepa de Uceejctqo{egu." que

embora não seja comercializada, foi isolada de uma planta de fermentação. Essa

cepa é denominada CL1 e foi utilizada como referência, uma vez que o

comportamento desta em laboratório é amplamente conhecido. Todas as cepas

pertencem à coleção de leveduras industriais da Divisão de Biotecnologia e

Processos (CPQBA/UNICAMP).

404" EQORQUVQU"WVKNK\AFQU"

Os compostos utilizados foram escolhidos levando-se em consideração os

resultados obtidos no Capitulo II. A saber: ácido cafeico, ácido gálico, ácido lático,

ácido pirúvico, ácido siríngico e ácido vanílico.

Nessa fase do trabalho decidiu-se pela avaliação de outros 4 compostos:

os ácidos acético, o fórmico e Hidroximetilfurfural (HMF) que são provenientes da

decomposição térmica dos açúcares redutores (DE BRUIJN, 1986) e o ácido

butírico citado na literatura como um agente fortemente inibidor de levedura e

presente no melaço (FLEISHMAN, 1977).

Normalmente, os méis para serem utilizados na fermentação industrial são

diluídos 4 vezes. Então, para melhor estudar os efeitos dos compostos fenólicos e

ácidos orgânicos na fermentação, as concentrações médias contidas na Tabela II-

5 foram divididas por quatro, considerando a diluição do mel final. As

concentrações estudadas para cada composto foram as seguintes: a metade da

média utilizada na fermentação, a própria média, o dobro e o quádruplo . A Tabela

IV-1 apresenta essas concentrações."

"

"


74

Vcdgnc"KX"/"3"/"Swctvc"rctvg"fcu"eqpegpvtcèùgu"fqu"eqorquvqu"hgpônkequ"g"âekfqu"qtiãpkequ"gpeqpvtcfqu"pqu"oêku."go"RRO"

" Ogvcfg" Oêfkc" Fqdtq" Swâftwrnq"

Rktûxkeq" 467,99" 935,99" 1871,98" 3743,95"

Nâvkeq" 3137,88" 6275,77" 12551,54" 25103,07"

Iânkeq" 0,19" 0,37" 0,74" 1,49"

Echgkeq" 1,34" 2,69" 5,37" 10,75"

Xcpînkeq" 7,46" 14,93" 29,85" 59,70"

Uktîpikeq" 9,02" 18,05" 36,09" 72,18"

No caso do HMF, e dos ácidos fórmico, acético e butírico as

concentrações utilizadas nos ensaios estão descritas na Tabela IV-2.

Vcdgnc"KX"/"4"/"Eqpegpvtcèùgu"wvknk|cfcu"rctc"q"JOH"g"fqu"âekfqu"hôtokeq."ceêvkeq"g"dwvîtkeq"g."go"RRO"

" Ogvcfg" Oêfkc" Fqdtq" Swâftwrnq"

JOH" 500 1000 1500 2000

Hôtokeq" 250 500 750 1000

Aeêvkeq" 250 500 750 1000

Dwvîtkeq" 250 500 750 1000

405" OGKQ"FG"EWNVKXQ"

A composição básica do meio fermentativo utilizado está descrita na

Tabela IV-3.

Vcdgnc"KX"/"5"–"Eqorqukèçq"fq"Ogkq"Ukpvêvkeq"*Eqpvtqng+0"


Sacarose" 150"






Os meios foram preparados com base no meio descrito na Tabela IV-3,

sendo adicionados os compostos descritos nas Tabelas IV-1 e IV-2, de maneira a

conter isoladamente estes compostos.


75


As leveduras foram crescidas em tubos contendo PDA (Potato Dextrose

Agar) na forma de “slant” por 24 horas/32oC. A seguir foram suspensas em água

estéril em quantidade igual a 25 ml por tubo contendo a cepa, sendo que 10 ml

dessa suspensão foram transferidos para cada frasco Erlenmeyers de 250 ml do

contendo 100 mL do meio de cultivo.

407" GZGEWÑ’Q"FQU"GPUAKQU"

As fermentações foram conduzidas em frascos Erlenmeyer com

capacidade de 250 mL contendo 100 ml de meio de cultivo. Cada frasco foi

inoculado com 10 mL de inóculo. Os frascos foram incubados em shaker nas

seguintes condições: 34 oC/150 rpm /24 horas. Todos os tratamentos foram feitos

em triplicata. Foram determinados nas amostras: concentração de matéria seca

(g/L) , açúcares redutores totais (g/L) e etanol (g/L).

Apenas as cepas Y904 e SA1 foram avaliadas quanto ao seu

desempenho frente aos compostos inibitórios em comparação com o meio

ausente de qualquer composto. No caso da CL1, essa não foi avaliada quando na

presença dos compostos, uma vez que ela foi utilizada apenas como cepa de

referencia.

Os parâmetros obtidos foram: YX/S, YP/S, Produtividade e consumo de

ART. Esses foram corrigidos baseados nos valores de referência, o qual é

fornecido pela linhagem CL1.





fermentado. Primeiramente pesou-se placas de Petri previamente secas (P1), e





76





fermentado.

















No Anexo C encontram-se as Tabelas com as concentrações de ART

(Açúcares Redutores Totais), etanol e massa seca, assim como a média de YX/S,

YP/S, Produtividade e Consumo de ART, com suas respectivas correções

realizadas através da cepa CL1, para uma melhor comparação da influência de

cada composto orgânico sobre as cepas Y904 e SA1.


77

503" KPHNWÙPEKA"FQ"ıEKFQ"IıNKEQ"

As Figuras IV-1 e IV-2 mostram a influência da adição do ácido gálico nos

parâmetros: YX/S, YP/S, Produtividade e Consumo de ART para as cepas SA1 e

Y904, respectivamente.

Hkiwtc"KX"/"3"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"UA3"eqo"ıekfq"Iânkeq"


78

Hkiwtc"KX"/"4"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"[;26"eqo"ıekfq"Iânkeq"

Nas Figuras IV-1 e IV-2, estão os resultados YX/S, YP/S, Produtividade e

Consumo de ART dos ensaios realizados com o ácido gálico para as cepas SA1 e

Y904, respectivamente. Em 24 horas de fermentação houve a consumo de 100 %

do ART para todas as concentrações de ácido gálico testadas para ambas as

cepas, mostrando que nestas concentrações, o ácido em questão não interfere na

velocidade de fermentação. Houve uma tendência de queda nos rendimento de

células (YX/S) e de etanol (YP/S) conforme o aumento da concentração do ácido

gálico para ambas as cepas. Já a produtividade não foi afetada significativamente.

504" KPHNWÙPEKA"FQ"ıEKFQ"EAHGKEQ"

As Figuras IV-3 e IV-4 mostram a influência da adição do ácido cafeico

nos parâmetros: YX/S, YP/S, Produtividade e Consumo de ART para as cepas SA1

e Y904, respectivamente.


79

Hkiwtc"KX"/"5"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"UA3"eqo"ıekfq"Echgkeq"

Hkiwtc"KX"/"6"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"[;26"eqo"ıekfq"Echgkeq"


80

Os resultados dos ensaios utilizando o ácido cafeico, para as cepas SA1 e

Y904, podem ser visto nas Figuras IV-3 e IV-4, respectivamente. Para ambas as

cepas, a consumo foi aproximadamente de 95% do ART, se mantendo constante

e que nas concentrações estudadas o ácido cafeico não interfere na velocidade de

fermentação. Manteve-se também com tendência constante o rendimento celular

(YX/S), o rendimento em etanol (YP/S) e a Produtividade. Portanto, nas

concentrações estudadas, o ácido cafeico não exerce influência nas cepas SA1 e

Y904.

505" KPHNWÙPEKA"FQ"ıEKFQ"XAP¯NKEQ"

As Figuras IV-5 e IV-6 mostram a influência da adição do ácido vanílico



Hkiwtc"KX"/"7"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"UA3"eqo"ıekfq"Xcpînkeq"


81

Hkiwtc"KX"/"8"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"[;26"eqo"ıekfq"Xcpînkeq"

As Figuras IV-5 e IV-6 apresentam os resultados de YX/S, YP/S,

Produtividade e Consumo de ART para as cepas SA1 e Y904. Pelos resultados

mostrados nestas figuras, pode-se observar que, assim como o ácido cafeico, o

ácido vanílico também não exerce influência sobre as cepas SA1 e Y904,

mantendo-se também uma tendência constante nestas respostas (YX/S, YP/S,

Produtividade e Consumo de ART).

506" KPHNWÙPEKA"FQ"ıEKFQ"NıVKEQ"

As Figuras IV-7 e IV-8 mostram a influência da adição do ácido lático nos




82

Hkiwtc"KX"/"9"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"UA3"eqo"ıekfq"Nâvkeq"

Hkiwtc"KX"/":"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"[;26"eqo"ıekfq"Nâvkeq"


83

Nas Figuras IV-7 e IV-8 estão mostrados graficamente as variações dos

parâmetros YX/S, YP/S, Produtividade e Consumo de ART para os ensaios

realizados utilizando o ácido lático para avaliação de sua influência. Para ambas

as cepas testadas, os rendimentos YX/S e YP/S mantém-se constantes até os

ensaios onde foram utilizada a concentração referente ao dobro da média (~

12500 PPM). A partir deste ponto observou-se uma inibição total da fermentação.

Já para a produtividade e consumo de ART, o aumento da concentração do ácido

lático causou uma diminuição gradativa até a concentração de 6276 PPM. Após

este ponto houve uma diminuição mais acentuada e foi detectada a total inibição

da fermentação após a concentração de 12500 PPM, mostrando que o aumento

da concentração de ácido lático presente no meio fermentativo interfere na

velocidade de fermentação mesmo nas concentrações mais baixas, levando a

uma inibição total das cepas estudadas."

507" KPHNWÙPEKA"FQ"ıEKFQ"UKT¯PIKEQ"

As Figuras IV-9 e IV-10 mostram a influência da adição do ácido siríngico




84

Hkiwtc"KX"/";"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"UA3"eqo"ıekfq"Uktîpikeq"

Hkiwtc"KX"/"32"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"[;26"eqo"ıekfq"

Uktîpikeq"


85

Nas Figuras IV-9 e IV-10, estão os resultados YX/S, YP/S, Produtividade e

Consumo de ART dos ensaios realizados com o ácido siríngico para as cepas SA1

e Y904, respectivamente. Houve uma pequena tendência de queda no consumo

de substrato conforme o aumento da concentração do ácido siríngico para ambas

as cepas testadas. Para o parâmetro YP/S e YX/S, houve uma tendência de

aumento em função do aumento da concentração do ácido até a concentração

média, após esta concentração ocorreu uma ligeira queda nos rendimentos. Já a

produtividade não foi afetada significativamente. Nas concentrações estudadas, o

ácido siríngico não afetou significativamente as cepas testadas.

508" KPHNWÙPEKA"FQ"ıEKFQ"RKTðXKEQ"

As Figuras IV-11 e IV-12 mostram a influência da adição do ácido pirúvico



Hkiwtc"KX"/"33"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"UA3"eqo"ıekfq"Rktûxkeq"


86

Hkiwtc"KX"/"34"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"[;26"eqo"ıekfq"Rktûxkeq"

Os resultados dos ensaios utilizando o ácido pirúvico para as cepas SA1 e

Y904, podem ser vistos nas Figuras IV-11 e IV-12, respectivamente. Para ambas

as cepas, o consumo de ART manteve-se constante nas concentrações

estudadas, mostrando que o ácido pirúvico não interfere na velocidade de

fermentação. Mantiveram-se constante também o rendimento celular (YX/S), o

rendimento em etanol (YP/S) e a Produtividade. Portanto, nas concentrações

estudadas, o ácido pirúvico não exerce influência nas cepas SA1 e Y904.

509" KPHNWÙPEKA"FQ"ıEKFQ"AEÖVKEQ"

As Figuras IV-13 e IV-14 mostram a influência da adição do ácido acético




87

Hkiwtc"KX"/"35"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"UA3"eqo"ıekfq"Aeêvkeq"

Hkiwtc"KX"/"36"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"[;26"eqo"ıekfq"Aeêvkeq"


88

As Figuras IV-13 e IV-14 apresentam os resultados de YX/S, YP/S,

Produtividade e Consumo de ART para as cepas SA1 e Y904, quando ácido

acético foi adicionado ao meio. Pelos resultados mostrados nestas figuras, pode-

se observar que a presença do ácido acético no meio de fermentação provoca

uma queda nos parâmetros YX/S, Produtividade e Consumo de ART.

50:" KPHNWÙPEKA"FQ"ıEKFQ"DWV¯TKEQ"

As Figuras IV-15 e IV-16 mostram a influência da adição do ácido butírico



Hkiwtc"KX"/"37"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"UA3"eqo"ıekfq"Dwvîtkeq"


89

Hkiwtc"KX"/"38"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"[;26"eqo"ıekfq"Dwvîtkeq"



realizados utilizando o ácido Butírico para avaliação de sua influência. Para ambas

as cepas testadas, o rendimento em etanol (YP/S) mantiveram tendência constante,

ao contrário de YX/S que apresentou uma queda significativa conforme o aumento

da concentração de ácido butírico.

50;" KPHNWÙPEKA"FQ"ıEKFQ"HłTOKEQ"

As Figuras IV-17 e IV-18 mostram a influência da adição do ácido fórmico




90

Hkiwtc"KX"/"39"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"UA3"eqo"ıekfq"Hôtokeq"

Hkiwtc"KX"/"3:"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"[;26"eqo"ıekfq"Hôtokeq"


91



realizados utilizando o ácido fórmico para avaliação de sua influência. Para ambas

as cepas testadas, conforme o aumento da concentração do ácido há um aumento

no rendimento celular. Até a concentração de 0,50 g/L de ácido fórmico, os

parâmetros YP/S, Produtividade e Consumo de ART mantêm-se constantes e após

esta concentração ocorre uma queda rápida nestes parâmetros, sendo que para a

cepa Y904 praticamente chegam a zerar. Este comportamento indica que o ácido

fórmico interfere na fermentação, inibindo as cepas estudadas.

5032" KPHNWÙPEKA"FQ"JOH"

As Figuras IV-19 e IV-20 mostram a influência da adição do HMF nos



Hkiwtc"KX"/"3;"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"UA3"eqo"ıekfq"JOH"


92

Hkiwtc"KX"/"42"/"[Z1U."[R1U."Rtqfwvkxkfcfg"g"Eqpuwoq"fg"ATV"fc"egrc"[;26"eqo"ıekfq"JOH"

As Figuras IV-19 e IV-20 mostram graficamente as variações dos


realizados utilizando o composto 5-hidroximetilfurfural (HMF) para avaliação de

sua influência. Semelhantemente ao ácido fórmico, conforme o aumento da

concentração do ácido há um aumento no rendimento celular, mas ocorre uma

queda nos parâmetros YP/S, Produtividade e Consumo de ART de acordo com o

aumento da concentração do HMF, sendo que para a cepa SA1 a produtividade e

o consumo de ART praticamente chegam a zerar. O HMF leva a uma inibição das

cepas utilizadas."

60" EQPENWU’Q"

Dos 10 compostos testados na primeira etapa deste projeto que foram:

ácido gálico, ácido cafeico, ácido vanílico, ácido lático, ácido siríngico, HMF, ácido

butírico, ácido acético, ácido fórmico e ácido pirúvico, apenas os ácidos gálico,

lático, butírico, acético e fórmico e o HMF mostraram influência nas cepas SA1 e


93

Y904 dentro das concentrações estudadas. Desta forma, estes compostos são

aqueles que serão estudados na segunda fase do trabalho."

A Tabela IV-4 mostra as concentrações dos ácidos que influenciaram as

cepas de levedura durante a fermentação alcoólica determinadas por esta etapa."

Vcdgnc" KX" /"6"⁄"Eqpegpvtcèçq"fqu"eqorquvqu"swg" kphnwgpekco"cu"egrcu"fg" ngxgfwtc"UA3"g"[;26."go"RRO0"

Eqorquvq" Eqpegpvtcèçq""

ıe0"Aeêvkeq"" 1000"ıe0"Dwvîtkeq"" 1000"

ıe0"Hôtokeq"" 750"

ıe0"Iânkeq"" 1,49"

JOH"" 1000 "

ıe0"Nâvkeq"" 6280"

70" DKDNKQITAHKA"

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95

EAR¯VWNQ"X"

AXANKAÑ’Q"FQ"GHGKVQ"AEWOWNAVKXQ"FG"ANIWOAU"

UWDUVÛPEKAU"QTIÛPKEAU"UQDTG"AU"EGRAU"UA3"G"

[;26"

QDLGVKXQ 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;9 30 KPVTQFWÑ’Q00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;9 40 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 ;:



2.3 Meio de Cultivo ....................................................................................... 98







2.6.4 Tratamento Estatístico ................................................................... 101

50 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 323 3.1 Rendimento em Etanol (YP/S) ................................................................ 101

3.2 Rendimento em Células (YX/S) .............................................................. 107

3.3 Viabilidade ............................................................................................ 113

3.4 Produtividade ........................................................................................ 119

3.5 Consumo ART ...................................................................................... 125


Efeito Acumulativo de Substâncias Orgânicas sobre as Cepas SA1 e Y904

97

QDLGVKXQ"

Cxcnkct"q"ghgkvq"cewowncvkxq"fcu"uwduvãpekcu"wvknk|cfcu"pguvc"gvcrc"uqdtg"cu"

egrcu"UC3"g"[;260""

"

30" KPVTQFWÑ’Q"

Os processos de fermentação normalmente utilizados nas destilarias

alcoólicas brasileiras são os chamados Melle-Boinot ou com fermentação contínua

(AMORIM, 1985; GHOSE,1979; RHEINBOLDT, 1987), nos quais as células de

levedura recuperadas são recirculadas por fermentações consecutivas durante

toda a safra canavieira.

MARQUES & SERRA (2004) estudaram a eficiência fermentativa,

rendimento, teor de etanol no vinho, cinética de produção de CO2 e produção de

alcoóis superiores na reciclagem de células na produção biológica de etanol. Eles

concluíram que a interferência no metabolismo devido a reciclagem de células

torna-se mais clara à medida que se aumenta a concentração de açúcares no

mosto e, por conseqüência o teor de etanol no vinho fermentado.

MARIANO-DA-SILVA & PRADO-FILHO (1999), estudaram o acúmulo de

cádmio (Cd) por Uceejctqo{egu"egtgxkukcg, fermentando mosto de caldo de cana-

de-açúcar com contaminações controladas, em níveis sub-tóxicos do citado metal.

As condições de fermentação foram similares às reinantes na produção industrial

de etanol. Eles concluíram que a Uceejctqo{egu" egtgxkukcg concentra cádmio

durante a fermentação de mosto de caldo de cana-de-açúcar, com contaminações

sub-tóxicas de acetato de cádmio.

Desta forma, torna-se importante o estudo dos compostos orgânicos

presentes no substrato, uma vez que eles podem ter efeito acumulativo no meio,

podendo ocasionar perda na viabilidade, abaixando a eficiência e piorando a

produtividade industrial.


98



Nesta etapa foram utilizadas as 2 linhagens de Uceejctqo{egu"egtgxkucg.

escolhidas com base nos resultados do Capítulo II (Y904 e SA1) . Todas as cepas

pertencem à coleção de leveduras industriais da Divisão de Biotecnologia e

Processos (CPAQB/UNICAMP).



resultados obtidos no Capitulo IV. As concentrações escolhidas foram aquelas que

interferiram no desempenho da fermentação. A saber: ácido acético, ácido butírico

e HMF na concentração de 1000 PPM cada, ácido fórmico na concentração de

750 PPM, ácido gálico na concentração de 1,49 PPM e ácido lático na

concentração de 6280ppm.


Para esta etapa, foram utilizados dois meios fermentativos. Um para a

multiplicação da levedura, onde os compostos inibitórios ainda não foram

adicionados, e o outro para os ciclos subseqüentes, no qual foram feitas a adição

dos compostos a serem testados. A variação de composição diz respeito apenas

à sacarose. No meio de multiplicação foram utilizados 150 g/L de sacarose e no

meio contendo os compostos essa concentração passa a ser de 200g/L, devido a

diluição ocorrida ao se adicionar o volume de inóculo a cada ciclo.

A Tabela V-1 apresenta a composição base do meio de fermentação

"

"

"

"


99

Vcdgnc"X"/"3"–"Eqorqukèçq"fq"Ogkq"Ukpvêvkeq""








O inóculo foi obtido em duas etapas. Na primeira a levedura foi crescida

em tubos contendo PDA na forma de “slant” por 24 horas a 32oC. A seguir foram

suspensas em água estéril em quantidade igual a 25 mL por tubo contendo a

cepa, sendo que 10 mL dessa suspensão foram transferidos para frascos

Erlenmayers de 250 ml contendo 100 mL do meio de cultivo descrito no item 2.3

deste capítulo, sem a adição dos ácidos e com 150 g/L de sacarose. Os frascos

foram incubados por 24 horas a 34oC e 150 rpm. Uma alíquota de 10 mL do vinho

fermentado foi retirada para análise, e o restante foi centrifugado a 4000 rpm para

separação da levedura. A levedura já separada do meio de fermentação foi

ressuspendida em água destilada até obter-se 20 g de inóculo.


As fermentações foram feitas em triplicata para todos os compostos

estudados assim como para controle. Todo o procedimento a seguir foi realizado

por 8 vezes, isto é 8 ciclos. Os frascos Erlenmeyer de 250 ml, contendo 90 ml dos

meios de cultivo, foram inoculados com quantidade igual a 20 g de suspensão de

levedura proveniente do inóculo inicial. Esses foram incubados por 10 horas a

340C e 150 rpm. Após o término da fermentação, uma alíquota de 10 ml foi

retirada para determinação da massa celular produzida. O fermentado foi então

centrifugado por 6 minutos a 4000rpm e 100C. A levedura já separada do meio de

fermentação foi ressuspendida em uma quantidade suficiente de água destilada

estéril a se obter 20g de inóculo para o próximo ciclo. Uma amostra de 10 ml do

sobrenadante foi recolhida para determinação de ART (açúcares redutores totais)

e etanol.


100

Parâmetros estudados: Os parâmetros estudados foram: YX/S (rendimento

em etanol), YP/S (rendimento em células), Viabilidade, Produtividade e Consumo

de Substrato.

Os cálculos dos parâmetros estudados foram realizados através de um

balanço de massa, pesando-se os frascos a cada etapa realizada.





fermentado. Primeiramente pesou-se placas de Petri previamente secas (P1), e








fermentado.











101







40806" Vtcvcogpvq"Guvcvîuvkeq""

O tratamento estatístico dos dados experimentais obtidos seguiu o método

de ajuste por mínimos quadrados, com análise da variância (ANOVA) e

significância estatística da regressão, para F1,6 = 3,78 com um nível de confiança

de 90%.


As substâncias que demonstraram influências sobre as cepas SA1 e Y904

no Capítulo IV foram testadas com o intuito de determinar que tipo de influência

elas exercem sobre as cepas de levedura quando se utiliza o reciclo de células na

fermentação alcoólica. São elas: ác. acético, ác. butírico, ác. fórmico, ác. gálico,

ác. lático e 5-hidroxi-2-metil furfural (HMF).

Os parâmetros estudados foram: rendimento em etanol (YP/S), rendimento

em células (YX/S), viabilidade celular, produtividade em etanol e consumo de ART

(açúcar redutor total). As Tabelas contendo todos os resultados dos parâmetros

estão no Anexo D.

Nas Figuras V-1 até V-10 a variação, a cada ciclo, dos parâmetros em

questão representados no item (h) foi calculada levando em consideração a

equação linear {"?"c0z"-"d. Logo a Xct"?"*c"1"d+0"322."

503" TGPFKOGPVQ"GO"GVAPQN"*[R1U+"

A Figura V-1 mostra graficamente os valores calculados para [R1U a cada

ciclo para a cepa SA1.


102

"*c+"

"*d+"

"*e+"

"*f+"

"*g+"

"*h+"

"*i+""

"*j+"

Hkiwtc"X"/"3"⁄"Xcnqtgu"fg"[R1U"c"ecfc"ekenq"rctc"c"egrc"UA30"Q"kvgo"*j+"tgrtgugpvc"c"xctkcèçq"c"ecfc"ekenq"fqu"eqorquvqu"go"'0"

A Tabela V-2 mostra os valores da razão da média quadrática devida à

regressão e média quadrática residual (MQR/MQr) de YP/S para a cepa SA1."


103

Vcdgnc"X"/"4"⁄"Tc|çq"fc"oêfkc"swcftâvkec"fgxkfc"c"tgitguuçq"g"fc"oêfkc"swcftâvkec"tgukfwcn"*OST1OSt+"fg"[R1U"rctc"c"egrc"UA3"*Rctc"H3.8"?"5.9:"eqo"pîxgn"fg";2"'"fg"eqphkcpèc+0"

OST1OSt"

ıe0Aeêvkeq" 14,8490*"ıe0Dwvîtkeq" 17,2541*"

Ae0"Hôtokeq" 5,4262*"

ıe0Iânkeq" 1,0355"

JOH" 0,0600"

ıe0Nâvkeq" 0,0189"

Eqpvtqng" 9,9870*"

* valores estatisticamente significativos"

Para se dizer que uma regressão é estatisticamente significativa, a razão

MQR/MQr deve ser maior que F1,n-2, neste caso, maior que o valor de F1,6 que é de

3,78 com nível de 90% de confiança, do ponto de vista do teste F."

Um ensaio contendo somente meio sintético controle foi realizado com o

propósito de servir de base para avaliar o comportamento das cepas de levedura

perante as possíveis interferências causadas pela adição das substâncias

pesquisadas. Pelos dados contidos na Figura V-1 (g), pode-se afirmar que para a

cepa SA1, o rendimento em etanol (YP/S) teve um comportamento ascendente no

decorrer dos ciclos quando meio sintético controle foi utilizado, sem adição de

nenhuma substância estudada. A cada ciclo houve um aumento de YP/S de 2,14

%, como mostra a Figura V-1 (h), em relação ao valor inicial obtido pela regressão

(0,3690 g de etanol produzido / g de substrato consumido), ou seja, a cada ciclo

realizado, YP/S teve em média um acréscimo de 0,0079 g/g."

Analisando a Figura V-1 (a, b, c) e a Tabela V-2, observa-se que para a

cepa SA1, o valor de YP/S variou significativamente com a adição dos ácidos

acético, butírico e fórmico. Para o ensaio realizado com a adição de ácido acético

houve uma tendência de aumento do rendimento em etanol no decorrer dos ciclos.

A cada ciclo houve um aumento de 0,40 %, conforme Figura V-1 (h), sobre o valor

de YP/S inicial obtido pela regressão (0,4041 g/g). Para o ensaio com adição de

ácido fórmico houve a mesma tendência de aumento no decorrer dos ciclos,

porém mais acentuada, como mostrado na Figura V-1 (h), sendo de 2,05 % do


104

valor de YP/S inicial obtido pela regressão (0,3409 g/g). Já para o ácido butírico,

essa tendência de aumento foi ainda mais acentuada, superando o valor obtido no

ensaio realizado utilizando meio sintético controle sem adição de nenhuma

substância testada. Sendo assim, somente o ácido butírico apresentou influência

positiva sobre esta variável, já que superou a variação inerente ao ensaio descrita

pelo comportamento desta cepa em meio controle. O ácido fórmico e acético,

apesar de apresentar tendência de elevação no decorrer dos ciclos, esta foi

inferior ao comportamento padrão do ensaio, mostrando que estes ácidos

interferem negativamente no rendimento em etanol desta cepa."

Já a adição dos ácidos gálico, HMF e ácido lático não apresentaram

comportamento estatisticamente significativo no que diz respeito ao rendimento

em etanol. Pela Figura V-1 (d, e, f), nota-se que YP/S não apresentou uma

tendência de variação para este parâmetro no decorrer dos ciclos, podendo-se

dizer que ficaram próximo da estabilidade. Sendo assim, pode-se afirmar que

estas substâncias afetaram de forma negativa e com mais intensidade que o ácido

fórmico e acético para esta cepa."

A Figura V-2 mostra graficamente os valores calculados para [R1U a cada

ciclo para a cepa Y904.

"


105

"*c+"

"*d+"

"*e+"

"*f+"

"*g+"

"*h+"

"*i+""

"*j+"

Hkiwtc"X"/"4"/"Xcnqtgu"fg"[R1U"c"ecfc"ekenq"rctc"c"egrc"[;260"Q"kvgo"*j+"tgrtgugpvc"c"xctkcèçq"c"ecfc"ekenq"fqu"eqorquvqu"go"'0"


106

A Tabela V-3 apresenta os valores da razão da média quadrática devida à

regressão e da média quadrática residual (MQR/MQr) de YP/S para a cepa Y904."

Vcdgnc"X"/"5"⁄"Tc|çq"fc"oêfkc"swcftâvkec"fgxkfc"c"tgitguuçq"g"fc"oêfkc"swcftâvkec"tgukfwcn"*OST1OSt+"fg"[R1U"rctc"c"egrc"[;26"*Rctc"H3.8"?"5.9:"eqo"pîxgn"fg";2"'"fg"eqphkcpèc+0"

" OST1OSt"

ıe0"Aeêvkeq" 0,2728"ıe0"Dwvîtkeq" 3,9250*"

ıe0"Hôtokeq" 0,0305"

ıe0"Iânkeq" 0,7021"

JOH" 19,2064*"

ıe0"Nâvkeq" 0,2281"

Eqpvtqng" 12,3024*"


Para esta cepa em meio sintético controle sem adição de nenhuma

substância, apresentou uma tendência estatisticamente significativa de aumento

deste parâmetro com o decorrer dos ciclos, como ocorrido para a cepa SA1. Pelos

dados contidos na Figura V-2 (g) tem-se que a cada ciclo houve um aumento de

YP/S de 1,69 % em relação ao valor inicial obtido pela regressão (0, 3726 g/ g), ou

seja, a cada ciclo realizado, YP/S teve em média um acréscimo de 0,0063 g/g."

Os dados contidos na Tabela V-3 mostram que para a cepa Y904 as

variações de YP/S são estatisticamente significativas para meios com adição de 5-

hidroxi-2-metil furfural (HMF) e de ácido butírico."

Como ocorrido nos ensaios com a cepa SA1, o ácido butírico foi a única

substância que apresentou variação superior de YP/S por aquele obtido pelo meio

sintético controle pela cepa Y904, utilizada para determinar a variação deste

parâmetro inerente ao ensaio. Sendo assim, esta substância afeta o rendimento

em etanol de forma positiva para a cepa Y904. Com a adição do ácido butírico no

ensaio realizado com a cepa Y904, o rendimento em etanol superou o

desempenho do meio sintético controle. Com base nos dados contidos na Figura

V-2 (b), pode-se afirmar que a cada ciclo houve um aumento de 1,92 % sobre o

valor de YP/S inicial obtido pela regressão (0,3750 g/g)."


107

Já para os ensaios onde HMF foi adicionado ao meio, no decorrer dos

ciclos houve uma tendência de aumento do rendimento em etanol, como pode ser

visto na Figura V-2 (e). A cada ciclo houve um aumento de 0,75 %, sobre o valor

de YP/S inicial obtido pela regressão (0,4004 g/g). Este aumento é inferior ao valor

obtido no ensaio realizado utilizando meio sintético controle, mostrando que a

adição deste ácido afetou negativamente o rendimento em etanol. "

As demais substâncias estudadas não apresentaram uma tendência de

variação estatisticamente significativa para este parâmetro, podendo o mesmo ser

considerado constante ao longo dos ciclos. Sendo assim, pode se afirmar que o

efeito destas substâncias sobre o rendimento em etanol foi mais efetivo do que

para o HMF, mostrando um efeito negativo mais acentuado."

De uma forma geral, o comportamento das cepas SA1 e Y904 foram

similares para este parâmetro, quando se utilizou meios de cultivos sem adição de

nenhuma das substâncias estudadas. A única substância cuja adição afetou

positivamente este parâmetro foi o ácido butírico para as duas cepas testadas. A

cepa SA1 mostrou-se menos sensível ao ácido fórmico e ao ácido acético,

enquanto a cepa Y904 mostrou menor sensibilidade ao HMF."

504" TGPFKOGPVQ"GO"EÖNWNAU"*[Z1U+"

A Figura V-3 mostra graficamente os valores calculados para [Z1U a cada

ciclo para a cepa SA1."

"

"

"

"


108

"*c+"

"*d+"

"*e+"

"*f+"

"*g+"

"*h+"

"*i+"

"*j+"

Hkiwtc"X"/"5"⁄"Xcnqtgu"fg"[Z1U"c"ecfc"ekenq"rctc"c"egrc"UA30"Q"kvgo"*j+"tgrtgugpvc"c"xctkcèçq"c"ecfc"ekenq"fqu"eqorquvqu"go"'0"

"


109


regressão e da média quadrática residual (MQR/MQr) de YX/S para a cepa SA1."

Vcdgnc"X"/"6"⁄"Tc|çq"fc"oêfkc"swcftâvkec"fgxkfc"c"tgitguuçq"g"fc"oêfkc"swcftâvkec"tgukfwcn"*OST1OSt+"fg"[Z1U"rctc"c"egrc"UA30"*Rctc"H3.8"?"5.9:"g"pîxgn"fg";2"'"fg"eqphkcpèc+0"

OST1OSt"


Ae0"Hôtokeq" 0,2779"

ıe0Iânkeq" 59,4812*"

JOH" 9,2438*"

ıe0Nâvkeq" 4,2426*"

Eqpvtqng" 9,8293*"


A Figura V-3 (g) mostra que para a cepa SA1, o rendimento celular (YX/S)

apresentou um comportamento decrescente no decorrer dos ciclos quando

somente o meio sintético controle, sem a adição de nenhuma substância, foi

utilizado. Os resultados deste ensaio foram utilizados para determinar a variação

deste parâmetro inerente ao experimento. Pelos dados contidos na Figura V-3, a

cada ciclo houve um decréscimo no valor de YX/S de 6,56 %, em relação ao valor

inicial obtido pela regressão (0,0320 g/g), ou seja, a cada ciclo realizado, YX/S teve

em média um decréscimo de 0,0021 g/g."

Pelos dados contidos na Tabela V-4, somente no ensaio com adição de

ácido fórmico não foi obtido variação estatisticamente significativa, indicando que

este ácido causa um efeito altamente positivo neste parâmetro. "

A Figura V-3 (a, d) mostra que somente os ácidos gálico e acético

afetaram negativamente o rendimento celular acima do valor obtido pelo meio de

referência, mostrando uma alta sensibilidade desta cepa a estes ácidos em

relação ao rendimento em células. Para o ensaio realizado com a adição de ácido

acético, de acordo com os dados da Figura V-3 (a), observa-se que a cada ciclo

houve um decréscimo de 7,79 % do valor de YX/S sobre o valor inicial obtido pela

regressão (0,0244 g/g). Para o ácido gálico, com base nos dados da Figura V-3


110

(d), a cada ciclo realizado, o decréscimo foi de 6,76 %, sobre o valor de YX/S inicial

obtido pela regressão (0,0296 g/g). "

As demais substâncias, apesar de mostrar uma tendência de queda ao

longo dos ciclos, esta não superou o valor obtido no meio de referência,

mostrando um efeito positivo, apesar de pequeno, sobre este parâmetro. Pelos

dados contidos na Figura V-3 (b), nos ensaios utilizando meios com adição de

ácido butírico, a cada ciclo realizado, o decréscimo foi de 5,56 % sobre o valor de

YX/S inicial obtido pela regressão (0,0108 g/g). Para o ensaio com adição de ácido

lático, a cada ciclo realizado este decréscimo foi de 5,83 %. Para o ensaio com

adição de HMF, a cada ciclo foi observado um decréscimo de 4,39 % do valor de

YX/S inicial obtido pela regressão (0,0342 g/g)."

A Figura V-4 mostra graficamente os valores calculados para [Z1U a cada

ciclo para a cepa Y904."

"

"

"

"

"

"


111

"

*c+"

"

*d+"

"

*e+"

"

*f+"

"

*g+"

"

*h+"

"

*i+""

"

*j+"

Hkiwtc"X"/"6"⁄"Xcnqtgu"fg"[Z1U"c"ecfc"ekenq"rctc"c"egrc"[;260"Q"kvgo"*j+"tgrtgugpvc"c"xctkcèçq"c"ecfc"ekenq"fqu"eqorquvqu"go"'0"


112


regressão e da média quadrática residual (MQR/MQr) de YX/S para a cepa Y904."

Vcdgnc"X"/"7"⁄"Tc|çq"fc"oêfkc"swcftâvkec"fgxkfc"c"tgitguuçq"g"fc"oêfkc"swcftâvkec"tgukfwcn"*OST1OSt+"fg"[Z1U"rctc"c"egrc"[;260"*Rctc"H3.8"?"5.9:"g"pîxgn"fg";2"'"fg"eqphkcpèc+0"

MQR/MQr"

ıe0"Aeêvkeq" 13,81753*"ıe0"Dwvîtkeq" 6,2299*"

ıe0"Hôtokeq" 5,9228*"

ıe0"Iânkeq" 320,0974*"

JOH" 7,0713*"

ıe0"Nâvkeq" 7,9574*"

Eqpvtqng" 110,7999*"

*valores estatisticamente significativos"

Analisando a Figura V-4 (g), pode-se observar que como ocorrido para a

cepa SA1, o rendimento celular (YX/S) para a cepa Y904 mostrou um

comportamento decrescente no decorrer dos ciclos quando foi utilizado somente o

meio sintético controle, sem a adição de nenhuma das substâncias estudadas.

Este ensaio teve como objetivo determinar a variação inerente ao ensaio, deste

parâmetro para a cepa Y904. Pela Figura V-4, a cada ciclo houve um decréscimo

de YX/S de 7,25 %, em relação ao valor inicial obtido pela regressão (0,0345 g/g),

ou seja, a cada ciclo realizado, YX/S teve em média um decréscimo de 0,0025 g/g. "

Pelos dados contidos na Figura V-4 e na Tabela V-5, pode-se afirmar que

para a cepa Y904, o YX/S variou significativamente com a adição das seis

substâncias (acido acético, butírico, fórmico, gálico e lático e HMF). O ensaio com

adição de ácido gálico apresentou um decréscimo de YX/S superior ao ensaio

utilizando somente meio sintético controle, assim como ocorreu para a cepa SA1.

Para o ácido gálico, observa-se pela Figura V-4 (d) que a cada ciclo realizado, o

decréscimo foi de 8,24 % do valor de YX/S inicial obtido pela regressão (0,0340

g/g)."

Nos ensaios utilizando os ácidos acético, butírico, fórmico, lático e HMF,

os decréscimos dos valores de rendimento celular no decorrer dos ciclos foram

inferiores ao dos ensaios onde somente o meio de referência foi utilizado. Pela


113

Figura V-4 (a) tem-se que quando se adicionou ácido acético ao meio, a cada ciclo

foi observado um decréscimo de 6,79 % do valor YX/S com relação ao valor inicial

obtido pela regressão (0,0221 g/g). Para o ensaio com adição de ácido butírico, a

cada ciclo o decréscimo foi de 5,98 % do valor de YX/S inicial obtido pela regressão

(0,0117 g/g), já para o ensaio com adição de ácido fórmico, o decréscimo por ciclo

foi de 3,91 % do valor de YX/S inicial obtido pela regressão (0,0230 g/g). Para o

ensaio com adição de HMF, o decréscimo foi de 5,91 % do valor de YX/S inicial

obtido pela regressão (0,0372 g/g) e para o ensaio com adição de ácido lático, o

decréscimo foi de 6,94 % do valor de YX/S inicial obtido pela regressão (0,0288

g/g). "

Analisando os dados dos ensaios para as duas cepas testadas, observa-

se que o ácido gálico foi a substância que mais influenciou negativamente este

parâmetro para as duas cepas. O ácido acético também afetou negativamente o

desempenho da cepa SA1. As outras substâncias testadas apresentaram efeito

positivo sobre está variável. O comportamento das duas cepas testadas foi

bastante similar quando cultivadas em meio sem adição de nenhuma das

substâncias. "

505" XKADKNKFAFG"

A Figura V-5 mostra graficamente os valores calculados para a Xkcdknkfcfg

a cada ciclo para a cepa SA1."

"

"


114

"

*c+"

"

*d+"

"

*e+"

"

*f+"

"

*g+"

"

*h+"

"

*i+""

"

*j+"

Hkiwtc"X"/"7"⁄"Xcnqtgu"fg"Xkcdknkfcfg"c"ecfc"ekenq"rctc"c"egrc"UA30"Q"kvgo"*j+"tgrtgugpvc"c"xctkcèçq"c"ecfc"ekenq"fqu"eqorquvqu"go"'0"


115


regressão e da média quadrática residual (MQR/MQr) de Viabilidade para a cepa

SA1."

Vcdgnc"X"/"8"⁄"Tc|çq"fc"oêfkc"swcftâvkec"fgxkfc"c"tgitguuçq"g"fc"oêfkc"swcftâvkec"tgukfwcn"*OST1OSt+"fc"Xkcdknkfcfg"rctc"c"egrc"UA30"*Rctc"H3.8"?"5.9:"g"pîxgn"fg";2"'"fg"eqphkcpèc+0"

OST1OSt"

ıe0"Aeêvkeq" 13,7437*"ıe0"Dwvîtkeq" 9,4456*"

ıe0"Hôtokeq" 12,5804*"

ıe0"Iânkeq" 47,6724*"

JOH" 5,2713*"


Eqpvtqng" 15,5029*"


Através da análise da Figura V-5 (g), pode-se dizer que para a cepa SA1,

o parâmetro Xkcdknkfcfg teve um comportamento decrescente quando da

realização do ensaio utilizando somente o meio sintético controle, sem a adição de

nenhuma das substâncias estudadas. Os resultados deste ensaio foram utilizados

para determinar a variação deste parâmetro inerente à metodologia utilizada. Pela

Figura V-5 observa-se que a cada ciclo houve um decréscimo no valor de

Xkcdknkfcfg de 5,62 % em relação ao valor inicial obtido pela regressão (72,358

%), em outras palavras, a cada ciclo realizado, a Xkcdknkfcfg teve em média um

decréscimo de 4,0667 %."

Pelos dados contidos na Tabela V-6 e Figura V-5 (a, b, c, d, e), pode-se

afirmar que para a cepa SA1, a Xkcdknkfcfg variou significativamente com a adição

dos ácidos acético, butírico, fórmico, gálico e HMF. Nota-se ainda pela Figura V-5

que o ácido gálico e fórmico afetaram negativamente este parâmetro, pois,

mostraram uma variação maior que aquela observada para o ensaio onde meio

sem adição de nenhuma substância foi utilizada. Para o ensaio com adição de

ácido fórmico, pelos dados contidos na Figura V-5 (c), a cada ciclo, o decréscimo

do valor da viabilidade foi de 7,94 % em relação ao valor de Xkcdknkfcfg" inicial

obtido pela regressão (73,957 %). Para o ácido gálico o decréscimo por ciclo foi de


116

6,87 % em relação ao valor de Xkcdknkfcfg inicial obtido pela regressão (81,717

%). "

Nos ensaios utilizando os ácidos acético, butírico e HMF, o decréscimo na

Xkcdknkfcfg no decorrer dos ciclos foram inferiores ao ensaio utilizando somente o

meio de referência, indicando que a adição destas substâncias teve um efeito

favorável a este parâmetro. Para o ensaio realizado com a adição de ácido acético

houve uma tendência de decréscimo na Xkcdknkfcfg no decorrer dos ciclos, que

pelos dados contidos na Figura V-5 (a) a cada ciclo houve um decréscimo de 3,46

% em relação ao valor de Xkcdknkfcfg inicial obtido pela regressão (84,336 %).

Para o ensaio com adição de ácido butírico, o decréscimo por ciclo foi de 2,14 %

em relação ao valor de Xkcdknkfcfg inicial obtido pela regressão (88,548 %) e para

o ensaio com adição de HMF, o decréscimo por ciclo foi de 4,69 % em relação ao

valor de Xkcdknkfcfg inicial obtido pela regressão (64,569 %)."

A adição do ácido lático não apresentou variação estatisticamente

significativa no que diz respeito ao valor de viabilidade, indicando que este

parâmetro para a cepa SA1 esta substância possui um efeito positivo sobre esta

variável."

A Figura V-6 mostra graficamente os valores calculados para Xkcdknkfcfg a

cada ciclo para a cepa Y904."

"

"

"

"

"


117

*c+"

"

*d+"

"

*e+"

"

*f+"

"

*g+"

"

*h+"

"

*i+""

"

*j+"

Hkiwtc"X"/"8"⁄"Xcnqtgu"fg"Xkcdknkfcfg"c"ecfc"ekenq"rctc"c"egrc"[;260"Q"kvgo"*j+"tgrtgugpvc"c"xctkcèçq"c"ecfc"ekenq"fqu"eqorquvqu"go"'0"


118


regressão e da média quadrática residual (MQR/MQr) de Viabilidade para a cepa

Y904."

Vcdgnc"X"/"9"⁄"Tc|çq"fc"oêfkc"swcftâvkec"fgxkfc"c"tgitguuçq"g"fc"oêfkc"swcftâvkec"tgukfwcn"*OST1OSt+"fc"Xkcdknkfcfg"rctc"c"egrc"[;260"*Rctc"H3.8"?"5.9:"g"pîxgn"fg";2"'"fg"eqphkcpèc+0"

OST1OSt"


Ae0"Hôtokeq" 7,0119*"


JOH" 8,1673*"


Eqpvtqng" 11,1093*"


Pelos dados contidos na Figura V-6 (g), pode-se afirmar que para a cepa

Y904, o parâmetro Xkcdknkfcfg teve um comportamento decrescente quando da

realização do ensaio utilizando somente o meio sintético controle, sem a adição

das substâncias estudadas, meio este que serviu de base para discutir o

comportamento das cepas de levedura perante as possíveis interferências

causadas pela adição das substâncias estudadas. A cada ciclo houve um

decréscimo da Xkcdknkfcfg de 2,40 %, conforme Figura V-6 (h), em relação ao

valor inicial obtido pela regressão (87,196 %), em outras palavras, a cada ciclo

realizado, a Xkcdknkfcfg teve em média um decréscimo de 2,092 %."

Pelos resultados contidos na Figura V-6 (a, b, c, d, e) e a Tabela V-7,

pode-se afirmar que para a cepa Y904, a Xkcdknkfcfg variou significativamente com

a adição dos ácidos acético, butírico, fórmico, gálico e HMF. "

Nos ensaios utilizando os ácidos acético, butírico e HMF, o decréscimo na

Xkcdknkfcfg"pq decorrer dos ciclos foram superiores ao ensaio utilizando somente o

meio de referência, indicando que estas substâncias afetaram negativamente esta

variável. Para o ensaio realizado com a adição de ácido acético houve uma

tendência de decréscimo na Xkcdknkfcfg no decorrer dos ciclos. Como mostra a

Figura V-6 (a), a cada ciclo houve um decréscimo de 3,64 % do valor de


119

Xkcdknkfcfg inicial obtido pela regressão (84,42 %). Para o ensaio com adição de

ácido butírico, o decréscimo a cada ciclo foi de 5,52 % do valor de Xkcdknkfcfg

inicial obtido pela regressão (98,907 %) e para o ensaio com adição de HMF o

decréscimo por ciclo foi de 3,18 % do valor de Xkcdknkfcfg inicial obtido pela

regressão (90,835 %)."

Nos ensaios utilizando os ácidos fórmico e gálico, o decréscimo na

Xkcdknkfcfg no decorrer dos ciclos foram inferiores ao ensaio utilizando somente o

meio de referência, indicando um efeito positivo sobre esta variável. Pela Figura V-

6, tem-se que para o ensaio com adição de ácido fórmico, a cada ciclo realizado

foi observado um decréscimo de 1,74 % do valor de Xkcdknkfcfg"inicial obtido pela

regressão (90,287 %). Para o ácido gálico, este decréscimo foi de 1,91 %, sobre o

valor de Xkcdknkfcfg inicial obtido pela regressão (87,793 %). "

A adição do ácido lático não foi estatisticamente significativa no que diz

respeito ao rendimento celular mostrando que esta substância afeta positivamente

a viabilidade. "

O comportamento das duas cepas testadas, SA1 e Y904, foram similares

quando meio sintético controle sem adição das substâncias testadas foi utilizado.

O ácido láctico foi a substância que mais afetou de forma positiva esta variável

para as duas cepas testadas. Para a cepa SA1, as substâncias que mais afetou

negativamente esta variável foi o ácido fórmico e gálico, enquanto que para a cepa

Y904, o efeito negativo foi provocado pelo acido acético e butírico e HMF."

506" RTQFWVKXKFAFG"

A Figura V-7 mostra graficamente os valores calculados para

Rtqfwvkxkfcfg a cada ciclo para a cepa SA1."

"


120

"

*c+"

"

*d+"

"

*e+"

"

*f+"

"

*g+"

"

*h+"

"

*i+""

"

*j+"

Hkiwtc"X"/"9"/"Xcnqtgu"fg"Rtqfwvkxkfcfg"c"ecfc"ekenq"rctc"c"egrc"UA30"Q"kvgo"*j+"tgrtgugpvc"c"xctkcèçq"c"ecfc"ekenq"fqu"eqorquvqu"go"'0"


121


regressão e da média quadrática residual (MQR/MQr) de Produtividade para a

cepa SA1."

Vcdgnc"X"/":"⁄"Tc|çq"fc"oêfkc"swcftâvkec"fgxkfc"c"tgitguuçq"g"fc"oêfkc"swcftâvkec"tgukfwcn"*OST1OSt+"fc"Rtqfwvkxkfcfg"rctc"c"egrc"UA30"*Rctc"H3.8"?"5.9:"g"pîxgn"fg";2"'"fg"eqphkcpèc+0"

OST1OSt"

ıe0Aeêvkeq" 1,7919"ıe0Dwvîtkeq" 11,6488*"

Ae0"Hôtokeq" 2,4064"


JOH" 1,1985"


Eqpvtqng" 10,6528*"


Observando-se a Figura V-7 (g), pode-se afirmar que para a cepa SA1, a

Rtqfwvkxkfcfg teve um comportamento ascendente quando da realização do

ensaio utilizando somente o meio s sintético controle, sem a adição de nenhuma

das substâncias estudadas. Por esta figura tem-se que a cada ciclo houve um

aumento da Rtqfwvkxkfcfg de 3,58 %, em relação ao valor inicial obtido pela

regressão (6,2236 g / (L.h)), ou seja, a cada ciclo realizado, a Rtqfwvkxkfcfg teve

em média um acréscimo de 0,2229 g/(L.h)."

Analisando a Figura V-7 (b, d) e a Tabela V-8, pode-se afirmar que para a

cepa SA1, a Rtqfwvkxkfcfg variou significativamente somente com a adição dos

ácidos butírico e gálico, sendo que a mesma foi inferior àquela obtida pelo ensaio

utilizando o meio de referência, mostrando que estas substâncias apresentaram

um efeito negativo sobre esta variável. Pelos dados contidos na Figura V-7,

observa-se que a cada ciclo o aumento da Rtqfwvkxkfcfg foi de 2,84 % em relação

ao valor inicial obtido pela regressão (6,6937 g/(L.h)). Já para o ensaio realizado

com adição do ácido gálico, o aumento por ciclo realizado, foi de 0,53 % em

relação ao valor inicial obtido pela regressão (7,1233 g/(L.h)). "

Para os ensaios realizados com adição dos ácidos acético, fórmico, HMF

e lático, o parâmetro Rtqfwvkxkfcfg não foi estatisticamente significativo, como


122

pode ser observado na Tabela V-8. Sendo assim, estas substâncias mostraram

um maior efeito negativo em relação a esta variável. "

A Figura V-8 mostra graficamente os valores calculados para

Rtqfwvkxkfcfg a cada ciclo para a cepa Y904.


123

"

*c+"

"

*d+"

"

*e+"

"

*f+"

"

*g+"

"

*h+"

"

*i+""

"

*j+"

Hkiwtc"X"/":"⁄"Xcnqtgu"fg"Rtqfwvkxkfcfg"c"ecfc"ekenq"rctc"c"egrc"[;260"Q"kvgo"*j+"tgrtgugpvc"c"xctkcèçq"c"ecfc"ekenq"fqu"eqorquvqu"go"'0"


124


regressão e da média quadrática residual (MQR/MQr) de Produtividade para a

cepa Y904."

Vcdgnc"X"/";"⁄"Tc|çq"fc"oêfkc"swcftâvkec"fgxkfc"ä"tgitguuçq"g"fc"oêfkc"swcftâvkec"tgukfwcn"*OST1OSt+"fc"Rtqfwvkxkfcfg"rctc"c"egrc"[;260"*Rctc"H3.8"?"5.9:"g"pîxgn"fg";2"'"fg"eqphkcpèc+0"

OST1OSt"

ıe0"Aeêvkeq" 0,0565"ıe0"Dwvîtkeq" 3,1512"



JOH" 22,0954*"


Eqpvtqng" 10,3655*"


Analisando a Figura V-8 (g), pode-se afirmar, que da mesma forma que

para a cepa SA1, a cepa Y904 apresentou um comportamento ascendente para o

valor de Rtqfwvkxkfcfg em função dos ciclos realizados quando foi utilizado

somente o meio sintético controle, sem a adição de nenhuma das substâncias

testadas. Pela Figura V-8 observa-se que a cada ciclo houve um aumento da

Rtqfwvkxkfcfg de 2,76 % em relação ao valor inicial obtido pela regressão (6,4088

g / (L.h)), ou seja, a cada ciclo realizado a Rtqfwvkxkfcfg teve em média um

acréscimo de 0,177 g/(L.h)."

Pelos dados contidos na Figura V-8 (e) e na Tabela V-9, pode-se dizer

que para a cepa Y904, a Rtqfwvkxkfcfg variou significativamente somente com a

adição do HMF, sendo esta tendência de aumento, mas inferior àquela obtida no

ensaio utilizando o meio de referência, mostrando assim um efeito negativo sobre

esta variável. Pelos dados contidos na Figura V-8, a cada ciclo realizado

observou-se um aumento da Rtqfwvkxkfcfg de 0,85 % em relação ao valor inicial

obtido pela regressão (5,9572 g/(L.h))."

Para os ensaios realizados com adição dos ácidos acético, butírico,

fórmico, gálico e lático, o parâmetro Rtqfwvkxkfcfg não foi estatisticamente


125

significativo, como pode ser observado na Tabela V-9. Sendo assim, estas

substâncias apresentaram um efeito fortemente negativo sobre esta variável."

As cepas SA1 e Y904 mostraram um aumento na produtividade com o

decorrer dos ciclos realizados. Todas as substâncias testadas afetaram

negativamente esta variável, com destaque para o ácido lático. O ácido butírico foi

a substância que menos afetou negativamente esta variável para as duas cepas

testadas. "

507" EQPUWOQ"ATV"

Para se dizer que uma regressão é estatisticamente significativa, a razão

MQR/MQr deve ser maior que F1,n-2, neste caso, maior que o valor de F1,5 que é de

4,06 com nível de 90% de confiança, do ponto de vista do teste F."

A Figura V-9 mostra graficamente os valores calculados para Eqpuwoq"

CTV a cada ciclo para a cepa SA1."

"

"

"

"

"


126

"

*c+"

"

*d+"

"

*e+"

"

*f+"

"

*g+"

"

*h+"

"

*i+""

"

*j+"

Hkiwtc"X"/";"⁄"Xcnqtgu"fg"Eqpuwoq"ATV"c"ecfc"ekenq"rctc"c"egrc"UA30"Q"kvgo"*j+"tgrtgugpvc"c"xctkcèçq"c"ecfc"ekenq"fqu"eqorquvqu"go"'0"


127

A Tabela V-10 apresenta os valores da razão da média quadrática devida

à regressão e da média quadrática residual (MQR/MQr) de Consumo de ART para

a cepa SA1."

Vcdgnc" X" /" 32" ⁄" Tc|çq" fc" oêfkc" swcftâvkec" fgxkfc" ä" tgitguuçq" g" fc" oêfkc" swcftâvkec"tgukfwcn"*OST1OSt+"fq"Eqpuwoq"fg"ATV"rctc"c"egrc"UA30"*Rctc"H3.7"?6.28"g"pîxgn"fg";2"'"fg"eqphkcpèc+0"

OST1OSt"

ıe0Aeêvkeq"" 51,5407*"ıe0"Dwvîtkeq" 0,1080"


ıe0"Iânkeq" 5,5849*"

JOH" 3,5750"


Eqpvtqng" 8,4407*"


Analisando a Figura V-9 (g), pode-se dizer que para a cepa SA1, o

parâmetro Eqpuwoq" CTV teve um comportamento ascendente quando da

realização do ensaio utilizando somente o meio sintético controle, sem a adição de

nenhuma das substâncias testadas. Esta figura mostra que a cada ciclo realizado

foi observado um aumento no valor desta variável de 0,48 % em relação ao valor

inicial obtido pela regressão (96,375 %), ou seja, a cada ciclo realizado, a

Eqpuwoq"CTV teve em média um acréscimo de 0,4595 %."

Pelos dados contidos na Figura V-9 (a, d) e na Tabela V-10, pode-se dizer

que para a cepa SA1, a Eqpuwoq" CTV teve uma variação estatisticamente

significativa com a adição dos ácidos acético e gálico no decorrer dos ciclos,

sendo que para o ácido acético, a variação foi negativa, enquanto que para o

ensaio utilizando o meio sintético controle teve uma tendência positiva. Este fato

mostra a que o ácido acético influencia fortemente de forma negativa o valor desta

variável. Pela Figura V-9, observa-se um decréscimo por ciclo no valor do

Eqpuwoq"CTV de 0,04% em relação ao valor inicial obtido pela regressão quando

ácido acético foi adicionado ao meio. Já para o ácido gálico, a tendência foi de

aumento com os ciclos realizados. No entanto, esta variação foi inferior àquela

apresentada pelo ensaio onde o meio sintético controle foi utilizado. Sendo assim,


128

esta substância apresenta um efeito negativo sobre esta variável, mas com menor

intensidade. Pela Figura V-9, observa-se um aumento por ciclo de 0,32 % do valor

inicial obtido pela regressão (97,426 %). "

Para os ensaios realizados com adição dos ácidos butírico, fórmico, HMF

e lático, o parâmetro Eqpuwoq"CTV não foi estatisticamente significativo, como

pode ser observado na Tabela V-10, mostrando assim um efeito negativo sobre

esta variável. "

A Figura V-10 mostra graficamente os valores calculados para Eqpuwoq"

CTV a cada ciclo para a cepa Y904.


129

"

*c+"

"

*d+"

"

*e+"

"

*f+"

"

*g+"

"

*h+"

"

*i+""

"

*j+"

Hkiwtc" X" /" 32" ⁄" Xcnqtgu" fg" Eqpuwoq" ATV" c" ecfc" ekenq" rctc" c" egrc" [;260" Q" kvgo" *j+"tgrtgugpvc"c"xctkcèçq"c"ecfc"ekenq"fqu"eqorquvqu"go"'0"


130

A Tabela V-11 apresenta os valores da razão da média quadrática devida

à regressão e da média quadrática residual (MQR/MQr) de Consumo de ART para

a cepa Y904."

Vcdgnc" X" /" 33" ⁄" Tc|çq" fc" oêfkc" swcftâvkec" fgxkfc" ä" tgitguuçq" g" fc" oêfkc" swcftâvkec"tgukfwcn"*OST1OSt+"fq"Eqpuwoq"fg"ATV"rctc"c"egrc"[;260"*Rctc"H3.7"?6.28"g"pîxgn"fg";2"'"fg"eqphkcpèc+0"

OST1OSt"

ıe0"Aeêvkeq" 5,4565*"ıe0"Dwvîtkeq" 1,6877"



JOH" 21,4588*"


Eqpvtqng" 12,9899*"


Analisando a Figura V-10 (g), pode-se dizer que para a cepa Y904, o

parâmetro Eqpuwoq" CTV teve um comportamento ascendente quando da

realização do ensaio utilizando somente o meio sintético controle, sem a adição

dos ácidos. A cada ciclo houve um aumento do Eqpuwoq" CTV de 0,06 %,

conforme Figura 30 (h), em relação ao valor inicial obtido pela regressão (99,129

%), ou seja, a cada ciclo realizado, a Eqpuwoq"CTV teve em média um acréscimo

de 0,0585 %, o que pode ser considerado insignificante."

Pelos dados contidos na Figura V-10 (a, e) e a Tabela V-11, pode-se dizer

que para a cepa Y904, a Eqpuwoq" CTV teve uma variação estatisticamente

significativa com a adição dos ácidos acético e HMF no decorrer dos ciclos. Para o

acido acético, a tendência foi de queda na consumo em função dos ciclos

realizados, como observado para a cepa SA1. Este fato mostra que esta

substância possui um forte efeito negativo sobre esta variável. Pela Figura V-10,

observa-se um decréscimo por ciclo de 0,01% do valor deste parâmetro em

relação ao valor inicial obtido pela regressão. Já para o HMF, a cada ciclo

realizado, houve um aumento de 0,04 % do valor inicial obtido pela regressão

(98,803 %). Apesar de apresentar valores crescentes no decorrer dos ciclos, esta

ficou abaixo do valor apresentado no ensaio onde o meio sintético controle foi


131

utilizado. Sendo assim, esta substância mostrou um efeito negativo sobre o valor

desta variável, mas menos acentuados que aquele apresentado pelo ácido

acético. "

Para os ensaios realizados com adição dos ácidos butírico, fórmico, gálico

e lático, o parâmetro Eqpuwoq"CTV não foi estatisticamente significativo, como

pode ser observado na Tabela V-11. Sendo assim, estas substâncias afetam de

forma negativa este parâmetro."

As duas cepas testadas, SA1 e Y904, mostraram comportamento similar

quando crescidas em meio padrão sem adição de nenhumas das substâncias

testadas, aumentando o valor do parâmetro Consumo ART no decorrer dos ciclos

realizados. Todas as substâncias testadas apresentaram efeito negativo sobre

esta variável, destacando-se o ácido acético para as duas cepas. As substâncias

que menos efeito tiveram sobre esta variável foram o ácido fórmico e o gálico para

a cepa SA1 e para a cepa Y904 o HMF e o ácido gálico. As variações sofridas por

esta variável foram pequenas para todos os ensaios realizados.

60" EQPENWU’Q"

Como discutido no item 3.1 deste capítulo, o comportamento das cepas

SA1 e Y904 foram similares para o rendimento em etanol quando se utilizou meios

de cultivos sem adição de nenhuma das substâncias estudadas. A única

substância cuja adição afetou positivamente este parâmetro foi o ácido butírico

para as duas cepas testadas. A cepa SA1 mostrou-se menos sensível ao ácido

fórmico e ao ácido acético, enquanto a cepa Y904 mostrou menor sensibilidade ao

HMF."

Para o rendimento celular discutido no item 3.2 deste capítulo concluiu-se

que o ácido gálico foi a substância que mais influenciou negativamente as cepas

SA1 e Y904. O ácido acético também afetou negativamente o desempenho da

cepa SA1. As outras substâncias testadas apresentaram efeito positivo sobre está

variável. O comportamento das duas cepas testadas foi bastante similar quando

cultivadas em meio sem adição de nenhuma das substâncias. "


132

No item 3.3 deste capítulo, concluí-se que para a viabilidade que o

comportamento das duas cepas testadas, SA1 e Y904, foram similares quando

meio sintético controle sem adição das substâncias testadas foi utilizado. O ácido

láctico foi a substância que mais afetou de forma positiva esta variável para as

duas cepas testadas. Para a cepa SA1, as substâncias que mais afetou

negativamente esta variável foi o ácido fórmico e gálico, enquanto que para a cepa

Y904, o efeito negativo foi provocado pelo acido acético e butírico e HMF."

A Produtividade das cepas SA1 e Y904, apresentada no item 3.4 deste

capítulo, aumentou no decorrer dos ciclos realizados. Todas as substâncias

testadas afetaram negativamente esta variável, com destaque para o ácido lático.

O ácido butírico foi a substância que menos afetou negativamente esta variável

para as duas cepas testadas. "

As duas cepas testadas, SA1 e Y904, mostraram comportamento similar

quando crescidas em meio padrão sem adição de nenhuma das substâncias

testadas, aumentando o valor do parâmetro Consumo ART no decorrer dos ciclos

realizados, apresentado no item 3.5. Todas as substâncias testadas apresentaram

efeito negativo sobre esta variável, destacando-se o ácido acético para as duas

cepas. As substâncias que menos efeito tiveram sobre esta variável foram o ácido

fórmico e o gálico para a cepa SA1 e para a cepa Y904 o HMF e o ácido gálico. As

variações sofridas por esta variável foram pequenas para todos os ensaios

realizados.

Como observado pelos dados obtidos nos ensaios com reciclo de células,

o efeito de cada substância para cada parâmetro estudado apresentaram

diferenças significativas. Isto mostra que quando todas as substâncias estiverem

presentes no meio fermentativo, os efeitos podem-se somar provocando sérios

prejuízos ao processo de fermentação. Este fato é um indicativo dos problemas

ocorridos nos processos industriais quando uma grande quantidade de mel é

utilizada como matéria-prima para fermentação.

O ácido lático foi a substância que mais interferiu no rendimento em etanol

(YP/S) e na produtividade, parâmetros estes de maior importância nos processos


133

industriais para produção de álcool. Em contrapartida, o ácido fórmico apresentou

a menor interferência negativa para praticamente todos os parâmetros estudados."

70" DKDNKQITAHKA""

AMORIM, H.V.; OLIVEIRA, A.J.; ZAGO, E.A. Fermentação descontínua:

otimização do processo Melle-Boinot. In: Semana de Fermentação Alcoólica

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1987.




135

EAR¯VWNQ"XK"

AXANKAÑ’Q"FQU"GHGKVQU"FQU"ıEKFQU"NıVKEQ"G"

HłTOKEQ"UQDTG"Q"EQORQTVAOGPVQ"EKPÖVKEQ"FAU"

EGRAU"UA3"G"[;260"

QDLGVKXQ 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 359 30 KPVTQFWÑ’Q000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 359

1.1 Cinética dos Processos Fermentativos ................................................. 137

1.1.1 Modelos Cinéticos.......................................................................... 137

40 OAVGTKAKU"G"OÖVQFQU000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 364 2.1 Compostos Utilizados ........................................................................... 142

2.2 Meio de Cultivo ..................................................................................... 142

2.3 Obtenção do Inóculo ............................................................................. 142

2.4 Descrição do Reator ............................................................................. 143

2.5 Execução dos Ensaios.......................................................................... 143

2.6 Preparo das Amostras .......................................................................... 144

2.7 Ajustes dos Parâmetros ........................................................................ 144





50 TGUWNVAFQU"G"FKUEWUU’Q0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 367 3.1 Ajustes de Parâmetros Cinéticos Utilizando a Cepa SA1 ..................... 146

3.2 Ajustes de Parâmetros Cinéticos Utilizando a Cepa Y904.................... 149


Efeitos dos ácidos Lático e Fórmico sobre a Cinética das Cepas SA1 e Y904

137

QDLGVKXQ"

Cxcnkct"qu"ghgkvqu"fqu"âekfqu"Nâvkeq"g"Hôtokeq"uqdtg"q"eqorqtvcogpvq"

ekpêvkeq"fcu"egrcu"UC3"g"[;260""

"

30" KPVTQFWÑ’Q"

303" EKPÖVKEA"FQU"RTQEGUUQU"HGTOGPVAVKXQU"

O estudo da cinética de processos fermentativos tem como propósitos:

- Medir a velocidade de transformação que ocorre durante uma

fermentação;

- Estudar a influência dos fatores nestas velocidades (pH,

temperatura, etc.);

- Correlacionar por meio de equações empíricas, ou de módulos

matemáticos, as velocidades com os fatores que nelas influem;

- Aplicar as equações na otimização e controle do processo.

30303" Oqfgnqu"Ekpêvkequ"

Segundo BAYLEY & OLLIS (1986), os modelos cinéticos normalmente

usados em fermentações, podem ser divididos em:

- Não-estruturados e não-segregados, nos quais a célula de

microrganismos é considerada como soluto;

- Estruturados e não-segregados, onde as células são tratadas

como indivíduos de múltiplos componentes, porém com composição

média semelhante;

- Não-estruturados e segregados, onde as células são tratadas

como seres individuais distintos, porém descritos por um único

componente; e


138

- Estruturados e segregados, onde as células de

microrganismos são consideradas como indivíduos distintos e formados

por múltiplos componentes.

Segundo MOULIN gv0" cn0 (1980) a cinética da fermentação alcoólica é

complexa. A taxa de fermentação muda continuamente com o desaparecimento

do substrato e formação do produto. O tipo de modelo mais encontrado na

literatura para descrever a fermentação alcoólica é o tipo não-estruturado e não-

segregado. ANDRIETTA (1994) explica que devido a esta complexidade, é pouco

aconselhável a utilização de modelos que consideram as células como indivíduos

distintos constituídos de vários componentes e que utilizando modelos mais

simples, a imprecisão que possa ocorrer é compensada pela facilidade de

obtenção e diminuição do número de parâmetros cinéticos necessários.

MONOD (1949) expressa a velocidade específica de crescimento do

microrganismo (µ) como uma função da concentração de substrato limitante (S),

como pode ser observado na equação 1.

(1)

onde µmáx e KS são, respectivamente, a velocidade específica máxima de

crescimento é a constante de Monod.

Em trabalhos publicados, GHOSE & TYAGI (1979b) e BAZUA & WILKE

(1977) verificou-se que a inibição pelo etanol afetava µmáx e não KS, logo a

velocidade de crescimento pode ser representada pela equação 2.

(2)

onde µmáxi é a velocidade específica máxima de crescimento na presença de

etanol.

LUONG (1985) cita que se pode dividir os modelos cinéticos que

correlacionam a inibição pelo produto em 4 tipos:

)(.

SK

S

S

máx += µµ

)(.,

SK

S

S

imáx += µµ


139

- Relação linear (equação 3):

µi = µmáx.

−

máxP

P1 (3)

- Relação exponencial (equação 4):

µk"?"µoâz0g/"M40R (4)

K2 é a constante de inibição empírica

- Relação hiperbólica (equação 5):

µi

3

1

1.

K

Pmáxi

+= µµ (5)

K3 é a constante de inibição empírica

- Relação parabólica (equação 6):

5,0

1.

−=

máx

máxiP

Pµµ (6)

LEVENSPIEL (1980) revisou e generalizou uma equação matemática para

o crescimento celular contendo um termo para inibição pelo produto:

+

−=

SK

S

P

P

S

n

máx

máx 1µµ (7)

sendo Pmáx a concentração limite do produto inibidor. LEVENSPIEL (1980)

demonstrou que para uma concentração de P bem menor que o valor de Pmáx, e

equação (7) se reduz à equação 1, que é a cinética de Monod.

DOURADO" gv" cn (1987) apresenta para a fermentação alcoólica, um

resumo dos modelos matemáticos propostos por vários autores:


140

• Ghose & Thyagi (1979) (equação 8):

−

++

=L

i

S

máxP

P

K

SSK

S1.

2.µµ (8)

∗ características do modelo:

- Efeito do substrato limitante (Monod)

- Inibição pelo substrato (exponencial)

- Inibição pelo produto (linear)

- Relação linear entre µ e v

• Sevely gv"cn"(1980) (equação 9):

−⋅

+⋅

+=

LP

P

KpP

Kp

SKs

S1.0µµ (9)

∗ características:

- Efeito do substrato limitante (Monod)

- Sem inibição do substrato

- Inibição pelo produto (parabólica)

- Relação linear entre µ e v (lei de Luedeking-Piret)

• Jin, Chiang E Wang (1981) (equação 10):

( ) ( )

SK

Se

S

SKPK

máx +⋅⋅= ⋅−⋅⋅− 21

µµ (10)

∗ Características:

- Efeito substrato limitante (Monod)

- Inibição pelo substrato (exponencial)

- Inibição pelo produto (exponencial)


141

- Relação entre µ e v não linear"

"

• Lee, Poulard E Coulman (1983) (equação 11):

m

máx

n

máxS

máxX

X

P

P

SK

S

−⋅

−⋅

+= 11.µµ (11)

onde m=1, n=1

∗ Características:

- Efeito substrato limitante (Monod)

- Sem inibição pelo substrato

- Inibição pelo produto (não linear generalizada)

- Inibição pela concentração de células

- Relação linear entre µ e v

JARZEBSKI & MALINOWSKI (1989) apresenta um modelo (equação 12),

considerando a perda da viabilidade celular, utilizando quando se tem alta

concentração celular:

SKs

XvS

X

Xt

P

Pr

A

máx

A

máx

x +⋅

⋅

−⋅

−=

21

0 11µ (12)

onde:

Xt = Xv + Xd

Xv – células viáveis

Xd – células inativas (mortas)


142




resultados obtidos no Capitulo V. A saber: lático na concentração de 6280ppm e

ácido fórmico na concentração de 750 PPM.

O ácido lático foi a substância que mais interferiu no rendimento em etanol

(YP/S) e na produtividade, parâmetros estes de maior importância nos processos

industriais para produção de álcool. Em contrapartida, escolheu-se o ácido fórmico

para ensaios em biorreatores por este apresentar a menor interferência negativa

para praticamente todos os parâmetros estudados.


Para o preparo do meio de cultivo foram utilizados por quilograma de meio

150 g/ de sacarose, 6 g de extrato de levedura, 5 g de cloreto de amônio, 5 g de

fosfato diácido de potássio, 1 g de sulfato de magnésio e 1 g de cloreto de

potássio. A este meio foram adicionados isoladamente o ácido lático e o fórmico,

nas concentrações descritas no item 2.1 deste capítulo.


A levedura foi crescida em tubos contendo PDA na forma de “slant” por 24

horas a 32oC. A seguir foram suspensas em água estéril em quantidade igual a 25

mL por tubo contendo a cepa, sendo que 10 mL dessa suspensão foram

transferidos para 21 frascos Erlenmayers de 250 ml contendo 100 mL do meio de

cultivo descrito no item 2.2 deste capítulo, porém sem a adição dos ácidos. Os 21

frascos foram incubados por 24 horas a 34oC e 150 rpm. O vinho fermentado foi

centrifugado por 6 minutos a 4000 rpm e 100C para sedimentação da massa de

levedura produzida. A levedura já separada do meio de fermentação foi pesada e

ressuspendida em água destilada na proporção de 10 g de massa celular para 100

g de inóculo.


143

406" FGUETKÑ’Q"FQ"TGAVQT"

O sistema utilizado foi um reator de vidro com 6 litros de capacidade,

dotado de agitação mecânica e temperatura controlada através da circulação de

água proveniente de um banho termostatizado pela serpentina do mesmo. O

esquema do reator está representado na Figura VI-1.

Hkiwtc"XK/3"⁄"Guswgoc"fq"Tgcvqt"


Após a ressuspensão do inóculo, 400 g do mesmo foram transferidos para

o reator contendo 1600 g do mosto previamente preparado, resultando num

volume inicial de 2000 mL. A massa do inóculo correspondeu a 20% da massa

total adicionada ao reator."

A temperatura e a agitação do meio de fermentação foram mantidas a 34

°C e 150rpm, respectivamente. Sendo que amostras foram retiradas em intervalos

de uma hora, a partir do momento de inoculação, até a décima hora de

fermentação."

Para o cálculo do balanço de massa, em cada ensaio realizado, uma

planilha foi montada contendo: o peso do reator vazio, com o mosto, com adição

do inóculo, o peso de cada amostra retirada, o peso final do reator e a densidade

do mosto.

Para que se pudesse avaliar a influência destas substâncias sobre o

desempenho das duas cepas estudadas, foi realizado um experimento onde o

meio utilizado foi o padrão sem a adição das substâncias estudadas."


144

408" RTGRATQ"FAU"AOQUVTAU"

Depois de retiradas as amostras, estas foram imediatamente pesadas e

em seguida 10 mL de amostra foram destiladas para análise de etanol e 10 mL de

amostra foi centrifugada a 4500 rpm por cinco minutos. O sobrenadante foi

recolhido e congelado para análise posterior. O precipitado foi utilizado para

determinar a concentração de biomassa no reator. "

409" ALWUVGU"FQU"RATÛOGVTQU"

Os parâmetros cinéticos foram calculados a partir de uma rotina de ajuste

desenvolvido em DELPHI 5.0 por pesquisadores da Divisão de Biotecnologia e

Processos do CPQBA/UNICAMP. Foi avaliado o modelo cinético segundo GHOSE

(1979) (equação 29), que leva em consideração a inibição pelo substrato, onde n é

igual a 1,0 e µ é igual a 0,5. "

n

máx

I

S

máxP

P

K

SSK

S

−

++

= 1..2

µµ "

40:" OÖVQFQU"APAN¯VKEQU"

40:03" Fgvgtokpcèçq"fc"Ocuuc"Egnwnct"Rtqfw|kfc"



fermentado. Primeiramente pesaram-se placas de Petri previamente secas (P1), e








fermentado.


145

40:04" Fgvgtokpcèçq"fq"Gvcpqn"Rtqfw|kfq"*Oêvqfq"Eqnqtkoêvtkeq+"









40:05" Fgvgtokpcèçq"fg"ATV"*Oêvqfq"Eqnqtkoêvtkeq+"







Lembrando que os resultados a seguir foram calculados a partir de uma

rotina de ajuste desenvolvido em DELPHI 5.0 por pesquisadores da Divisão de

Biotecnologia e Processos do CPQBA/UNICAMP. Foi avaliado o modelo cinético

segundo GHOSE (1979) (equação 29), que leva em consideração a inibição pelo

substrato, onde n é igual a 1,0 e µ é igual a 0,5. "

n

máx

I

S

máxP

P

K

SSK

S

−

++

= 1..2

µµ

No Anexo E estão as Tabelas com os dados experimentais e ajustados,

para cada composto utilizado neste capítulo.

"


146

503" ALWUVGU"FG"RATÛOGVTQU"EKPÖVKEQU"WVKNK\APFQ"A"EGRA"UA3"

A Figura VI-1 mostra os dados, experimentais e ajustados, da

concentração de ART, etanol e massa seca em função do tempo para o ensaio

utilizando meio sintético controle e como microrganismo agente a cepa SA1.

Hkiwtc"XK/"3"⁄"Eqpegpvtcèçq"fg"ATV."gvcpqn"g"ocuuc"ugec"go"hwpèçq"fq"vgorq"rctc"q"gpuckq"wvknk|cpfq" ogkq" ukpvêvkeq" eqpvtqng" g" eqoq" oketqticpkuoq" cigpvg" c" egrc" UA3" *fcfqu"gzrgtkogpvcku"g"clwuvcfqu+."go"i1N0"

"



utilizando meio sintético controle com adição de ácido fórmico e como

microrganismo agente a cepa SA1.


147

Hkiwtc"XK/"4"⁄"Eqpegpvtcèçq"fg"ATV."gvcpqn"g"ocuuc"ugec"go"hwpèçq"fq"vgorq"rctc"q"gpuckq"wvknk|cpfq" ogkq" ukpvêvkeq" eqpvtqng" eqo" cfkèçq" fg" âekfq" hôtokeq" g" eqoq" oketqticpkuoq"cigpvg"c"egrc"UA3"*fcfqu"gzrgtkogpvcku"g"clwuvcfqu+."go"i1N0"

"



utilizando meio sintético controle com adição de ácido lático e como

microrganismo agente a cepa SA1.

Hkiwtc"XK/"5"⁄"Eqpegpvtcèçq"fg"ATV."gvcpqn"g"ocuuc"ugec"go"hwpèçq"fq"vgorq"rctc"q"gpuckq"wvknk|cpfq"ogkq"ukpvêvkeq"eqpvtqng"eqo"cfkèçq"fg"âekfq"nâvkeq"g"eqoq"oketqticpkuoq"cigpvg"c"egrc"UA3"*fcfqu"gzrgtkogpvcku"g"clwuvcfqu+."go"i1N0"


148

Com base nos dados experimentais contidos na Figura VI-1, VI-2 e VI-3 e

utilizando uma rotina de ajuste baseado no Modelo de GHOSE (1979), foi possível

obter os parâmetros cinéticos do modelo que melhor se ajustaram aos dados

experimentais sendo n = 1 e µ = 0,5."

A Tabela VI-1 mostra este grupo de parâmetros cinéticos ajustados."

Vcdgnc" XK" /" 3⁄" Rctãogvtqu" ekpêvkequ" clwuvcfqu" rctc" q" gpuckq" wvknk|cpfq" ogkq" ukpvêvkeq"eqpvtqng."âekfq"hôtokeq"g"âekfq"nâvkeq"g"eqoq"oketqticpkuoq"cigpvg"c"egrc"UA3"

" MU" MK" ROıZ" Fguxkq"

Rcftçq" 3" 69" 69" 248,06"

Ae0"Hôtokeq" 3" 24" 72" 157,60"

Ae0"Nâvkeq" 3" 48" 61" 317,51"

Observa-se por esta Tabela que para o meio sintético controle a cepa SA1

apresentou valores de KI, que está vinculado com a inibição pelo substrato,

bastante elevado. Já o valor de PMÁX ficou abaixo do normalmente obtido para

processo de fermentação alcoólica. Já para o ensaio onde o ácido fórmico foi

adicionado, observa-se que o valor de KI obtido foi muito inferior àquele obtido

para o ensaio com meio padrão. Este fato mostra que o ácido fórmico aumenta o

efeito de inibição do substrato sobre a cepa SA1. No entanto para o experimento

contendo ácido fórmico o valor de PMÁx encontrado foi superior ao encontrado no

ensaio padrão, mostrando que apesar da inibição pelo substrato ser maior, o

termo de inibição pelo produto foi menor. Este fato explica o pequeno efeito que

esta substância causou nos ensaios com reciclo de células nos parâmetros

estudados.

Observando-se os dados contidos na Tabela VI-1, pode-se afirmar que o

ácido lático aumenta a inibição pelo substrato e a inibição pelo produto. Apesar de

não interferir tão fortemente quanto o ácido fórmico no termo de inibição pelo

substrato, o ácido lático atua também no termo de inibição pelo produto. Este

comportamento demonstra a alta toxicidade desta substância para as células de

levedura, explicando os efeitos observados nos ensaios com reciclo de células

descritos no Capítulo V."


149

504" ALWUVGU"FG"RATÛOGVTQU"EKPÖVKEQU"WVKNK\APFQ"A"EGRA"[;26"

A Figura VI-4 mostra os dados de concentração de ART, etano sintético

controle padrão e como microrganismo agente a cepa Y904."

Hkiwtc"XK/"6"⁄"Eqpegpvtcèçq"fg"ATV."gvcpqn"g"ocuuc"ugec"go"hwpèçq"fq"vgorq"rctc"q"gpuckq"wvknk|cpfq" ogkq" ukpvêvkeq" eqpvtqng" g" eqoq" oketqticpkuoq" cigpvg" c" egrc" [;26" *fcfqu"gzrgtkogpvcku"g"clwuvcfqu+."go"i1N0"

"



utilizando meio sintético controle com adição de ácido fórmico e como

microrganismo agente a cepa Y904."

"

"

"

"

"

"

"

"

"

"

"

"


150

Hkiwtc"XK/"7"⁄"Eqpegpvtcèçq"fg"ATV."gvcpqn"g"ocuuc"ugec"go"hwpèçq"fq"vgorq"rctc"q"gpuckq"wvknk|cpfq" ogkq" ukpvêvkeq" eqpvtqng" eqo" cfkèçq" fg" âekfq" hôtokeq" g" eqoq" oketqticpkuoq"cigpvg"c"egrc"[;26"*fcfqu"gzrgtkogpvcku"g"clwuvcfqu+."go"i1N0"



utilizando meio sintético controle com adição de ácido lático e como

microrganismo agente a cepa Y904."

Hkiwtc"XK/"8"⁄"Eqpegpvtcèçq"fg"ATV."gvcpqn"g"ocuuc"ugec"go"hwpèçq"fq"vgorq"rctc"q"gpuckq"wvknk|cpfq"ogkq"ukpvêvkeq"eqpvtqng"eqo"cfkèçq"fg"âekfq"nâvkeq"g"eqoq"oketqticpkuoq"cigpvg"c"egrc"[;26"*fcfqu"gzrgtkogpvcku"g"clwuvcfqu+."go"i1N0"


151

Com base nos dados experimentais contidos na Figura VI-4, VI-5 e VI-6 e

utilizando uma rotina de ajuste baseado no Modelo de GHOSE (1979), foi possível

obter os parâmetros cinéticos do modelo que melhor se ajustaram aos dados

experimentais sendo n = 1 e µ = 0,5."

A Tabela VI-2 mostra este grupo de parâmetros cinéticos ajustados. "

Vcdgnc" XK" /" 4" ⁄" Rctãogvtqu" ekpêvkequ" clwuvcfqu" rctc" q" gpuckq" wvknk|cpfq" ogkq" ukpvêvkeq"eqpvtqng"eqoq"oketqticpkuoq"cigpvg"c"egrc"[;26"

" MU" MK" ROıZ" Fguxkq"

Rcftçq" 5" 76" 67" 102,88"

Ae0"Hôtokeq" 5" 32" 77" 212,66"

Ae0"Nâvkeq" 5" 42" 54" 229,21"

Observa-se pela Tabela VI-2 que para o meio sintético controle a cepa

Y904 apresentou valores de KI, que está vinculado com a inibição pelo substrato,

superior àquele apresentado pela cepa SA1 no mesmo ensaio. Este fato mostra

que a cepa Y904 possui uma inibição pelo substrato utilizado neste ensaio menor

que a cepa SA1. Já a cepa SA1 apresenta uma inibição pelo etanol menor que a

cepa Y904, pois apresenta um valor de PMÁX maior que o apresentado pela cepa

Y904. Da mesma forma como observado para a cepa SA1, o valor de KI obtido no

ensaio onde o ácido fórmico foi adicionado foi inferior àquele obtido para o ensaio

com meio padrão. Este fato mostra que o ácido fórmico aumenta o efeito de

inibição do substrato sobre a cepa Y904. No entanto para o experimento contendo

ácido fórmico o valor de PMÁx encontrado foi superior ao encontrado no ensaio

padrão, mostrando que apesar da inibição pelo substrato ser maior, o termo de

inibição pelo produto foi menor. O comportamento observado para a cepa Y904 foi

o mesmo da cepa SA1, com a diferença de que o efeito do ácido fórmico na

inibição pelo substrato foi menor. Este fato explica o pequeno efeito que esta

substância causou nos ensaios com reciclo de células nos parâmetros estudados."

Observando-se os dados contidos na Tabela VI-2, pode-se afirmar que

assim como ocorrido com a cepa SA1, o ácido lático aumenta a inibição pelo

substrato e a inibição pelo produto quando a cepa Y904 é utilizada como

microrganismo agente. Apesar de não interferir tão fortemente quanto o ácido


152

fórmico no termo de inibição pelo substrato, o ácido lático atua também no termo

de inibição pelo produto. Este efeito foi maior para a cepa Y904 que para a cepa

SA1. Este comportamento demonstra a alta toxicidade desta substância para as

células de levedura, explicando os efeitos observados nos ensaios com reciclo de

células descritos no Capítulo V.

60" EQPENWU’Q"

O ácido fórmico aumentou a inibição pelo substrato de uma forma mais

acentuada que o ácido lático e diminuiu o efeito da inibição pelo etanol quando

ensaios de biorreatores foram realizados."

O ácido lático aumentou tanto a inibição pelo substrato como pelo produto,

mostrando-se ser uma substância com alto grau de toxicidade para as células de

leveduras das linhagens estudadas."

70" DKDNKQITAHKA"

ANDRIETTA, S.R. Oqfgncigo." ukowncèçq" g" eqpvtqng" fg" hgtogpvcèçq" cneqônkec"

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"

155

EAR¯VWNQ"XKK"

EQPENWU÷GU"IGTAKU"

Conclusões Gerais

157

QDLGVKXQ"

Pguvg"ecrîvwnq"uçq"crtgugpvcfcu"cu"eqpenwuùgu"igtcku"crôu"cxcnkcèçq"

eqorngvc"fqu"tguwnvcfqu"qdvkfqu"fwtcpvg"c"tgcnk|cèçq"fguvg"vtcdcnjq0""

"

� Foram encontrados no melaço em quantidades significativas alguns ácidos

fenólicos e ácidos orgânicos provenientes da destruição térmica de açúcares

redutores durante o processo de fabricação de açúcar."

� O ácido pirúvico foi o único composto entre os estudados, que foi

encontrado em todas as amostras analisadas. Embora tenha sido identificado em

todas as unidades a variação em relação a concentração foi considerável. A

amostra que contem maior concentração desse composto foi a proveniente da

usina Benalcool (9903,27 PPM) e a menor da usina Goiasa (151,89 PPM). O mel

da unidade Guarani foi o único que apresentou os 6 compostos analisados. No

caso do mel da Cruz Alta apenas a presença do ácido gálico não foi observada.

� A unidade que apresentou o menor número de compostos potencialmente

inibidores da fermentação foi a Cresciumal. Apenas os ácidos pirúvico, vanílico e

siríngico foram observados nessa amostra. O mel da Cresciumal foi também o que

apresentou as menores quantidades do ácido vanílico (22,73PPM) e do ácido

siríngico (25,3 PPM). Essa amostra foi ainda, a única que não que apresentou o

acido lático em sua composição.

� O ácido cafeíco foi o de menor incidência entre todos os estudados. Foi

encontrado em apenas 3 dos 10 méis analisados.

� Considerando as médias dos compostos encontrados nas 10 amostras o

ácido gálico foi o que apresentou os menores valores. A média encontrada foi de

1,49 PPM. A média da concentração do ácido lático foi a maior encontrada entre

os 10 méis analisados."

� As cepas SA1 e Y904 foram as que apresentaram maior resistência a

temperatura, pressão osmótica e concentração de álcool."

Conclusões Gerais

158

� Entre as substâncias testadas, os ácidos acético, butírico, fórmico, gálico e

lático e HMF, foram as que apresentaram efeitos sobre as cepas SA1 e Y904

quando testadas em um único ciclo."

� O ácido lático foi a substância que mais afetou negativamente os

parâmetros de rendimento em etanol e a produtividade nos ensaios com reciclo de

células para as cepas Y904 e SA1."

� As substâncias testadas afetaram de forma diferente cada parâmetro

estudado, indicando que fermentações com meios contendo todas essas

substâncias, os efeitos podem se somar causando sérios problemas no processo

fermentativo. "

� O ácido fórmico aumentou a inibição pelo substrato de uma forma mais

acentuada que o ácido lático e diminuiu o efeito da inibição pelo etanol quando

ensaios de biorreatores foram realizados."

� O ácido lático aumentou tanto a inibição pelo substrato como pelo produto,

mostrando-se ser uma substância com alto grau de toxicidade para as células de

leveduras das linhagens estudadas."

159

APGZQ"A"

30 Rcftçq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 383 40 Anxqtcfc000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 385 50 Dgpcneqqn 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 387 60 Eqtqn000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 389 70 Etguekwocn00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 38; 80 Etw|"Anvc 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 393 90 Gswkrcx 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 395 :0 Guvkxc00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 397 ;0 Iqkcuc 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 399 320 Iwctcpk00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 39; 330 Octcecî00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3:4

Anexo A - Cromatogramas

161

30" RAFT’Q"

Ucorng"Pcog<" Rcftcq"3" Kplgevkqp"Xqnwog<" 42.2"""Xkcn"Pwodgt<" IA3" Ejcppgn<" " WXaXKUa3"

Ucorng"V{rg<" uvcpfctf" Ycxgngpivj<" 432"

Eqpvtqn"Rtqitco<" cekfqu4" Dcpfykfvj<" 3"

Swcpvkh0"Ogvjqf<" ıekfqu" Fknwvkqp"Hcevqt<" 3.2222"""

Tgeqtfkpi"Vkog<" 431914226"37<64" Ucorng"Ygkijv<" 3.2222"""Twp"Vkog"*okp+<" 387.22" Ucorng"Coqwpv<" 3.2222"""

0 20 40 60 80 100 120 140 165-5,0

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0 Análise dos Méis #1 Padrao 1 UV_VIS_1mAU

min

3"/";.;624"/"32.79:5"/"34.7:5

6"/"Rktûx keq"/"35.;;7

7"/"3:.5678"/"Nâvkeq"/"3;.7429"/"4:.4;4

:"/"Iânkeq"/"55.:5;

;"/"Echgkeq"/"67.75;

32"/"72.6;8

33"/"Xcpînkeq"/"333.3:7

34"/"Ucnkeînkeq"/"336.958

35"/"Uktîpikeq"/"368.764

WVL:210 nm


162

Pq0"" Tgv0Vkog"" Rgcm"Pcog"" Jgkijv"" Atgc"" Tgn0Atgc"" Aoqwpv"" V{rg"""" okp" "" oAW" oAW,okp" '" rro" ""

1 9,94 n.a. 1,243 0,263 0,27 n.a. BMb 2 10,58 n.a. 0,117 0,139 0,14 n.a. bM 3 12,58 n.a. 0,051 0,029 0,03 n.a. MB 4 13,99 Pirúvico 4,537 1,442 1,46 5,000 BMB 5 18,34 n.a. 0,067 0,026 0,03 n.a. BMB 6 19,52 Lático 0,269 0,104 0,11 4,500 BMB 7 28,29 n.a. 0,208 0,117 0,12 n.a. BMB 8 33,84 Gálico 25,422 20,817 21,13 5,000 BMB 9 45,54 Cafeico 8,723 9,348 9,49 5,000 BM

10 50,50 n.a. 0,382 1,652 1,68 n.a. MB 11 111,18 Vanílico 6,865 16,699 16,95 5,000 BM 12 114,74 Salicílico 9,894 28,784 29,22 5,000 MB 13 146,54 Siríngico 5,301 19,078 19,37 5,000 BMB

Vqvcn<" 63,078 98,499 100,00 34,500


163

40" ANXQTAFA"

Ucorng"Pcog<" Anxqtcfc"8" Kplgevkqp"Xqnwog<" 42.2"""Xkcn"Pwodgt<" IA8" Ejcppgn<" " WXaXKUa3"Ucorng"V{rg<" wpmpqyp" Ycxgngpivj<" 432"





164

Pq0"" Tgv0Vkog"" Rgcm"Pcog"" Jgkijv"" Atgc"" Tgn0Atgc"" Aoqwpv"" V{rg"""" okp" "" oAW" oAW,okp" '" rro" ""

1 9,98 n.a. 2410,100 1318,849 53,89 n.a. BM 2 11,49 n.a. 376,326 107,439 4,39 n.a. Rd 3 14,28 Pirúvico 59,422 38,053 1,55 4428,68 M 4 15,52 n.a. 1287,659 617,744 25,24 n.a. M 5 18,47 n.a. 102,120 200,146 8,18 n.a. M 6 19,52 Lático 12,817 8,114 0,33 9227,98 Rd 7 20,87 n.a. 4,301 1,231 0,05 n.a. Rd 8 22,08 n.a. 15,526 17,794 0,73 n.a. Rd 9 23,60 n.a. 4,900 2,156 0,09 n.a. Rd

10 24,39 n.a. 2,635 0,846 0,03 n.a. Rd 11 24,93 n.a. 1,248 0,551 0,02 n.a. Rd 12 26,07 n.a. 19,462 13,993 0,57 n.a. M 13 27,53 n.a. 21,063 29,780 1,22 n.a. M 14 30,27 n.a. 11,836 20,941 0,86 n.a. M 15 31,75 n.a. 11,332 17,774 0,73 n.a. M 16 33,61 Gálico 0,181 0,105 0,00 0,80 Rd 17 35,03 n.a. 1,069 0,670 0,03 n.a. Ru 18 36,42 n.a. 6,542 14,167 0,58 n.a. Mb 19 41,06 n.a. 0,297 0,221 0,01 n.a. bMB 20 43,70 n.a. 5,208 5,930 0,24 n.a. BMB 21 50,06 n.a. 0,337 0,283 0,01 n.a. BMB 22 51,43 n.a. 0,026 0,013 0,00 n.a. BMB 23 55,11 n.a. 1,627 2,556 0,10 n.a. BMB 24 68,68 n.a. 0,366 0,781 0,03 n.a. BMB 25 74,87 n.a. 0,417 0,840 0,03 n.a. BMB 26 82,25 n.a. 0,205 0,337 0,01 n.a. Ru 27 87,16 n.a. 1,841 4,404 0,18 n.a. BMB 28 93,97 n.a. 0,145 0,230 0,01 n.a. BMB 29 98,31 n.a. 0,097 0,176 0,01 n.a. BMB 30 111,58 Vanílico 3,048 8,996 0,37 75,76 BMB 31 127,41 n.a. 0,357 1,031 0,04 n.a. BMB 32 147,04 n.a. 3,141 11,365 0,46 n.a. BMB

Vqvcn<" 4365,650 2447,514 100,00 ########


165

50" DGPANEQQN"

Ucorng"Pcog<" Dgpcneqqn";" Kplgevkqp"Xqnwog<" 42.2"""Xkcn"Pwodgt<" IA32" Ejcppgn<" " WXaXKUa3"

Ucorng"V{rg<" wpmpqyp" Ycxgngpivj<" 432"



Tgeqtfkpi"Vkog<" 451914226"2;<55" Ucorng"Ygkijv<" 3.2222"""Twp"Vkog"*okp+<" 387.22" Ucorng"Coqwpv<" 3.2222"""

0 20 40 60 80 100 120 140 165-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000 Análise dos Méis #10 Benalcool 9 UV_VIS_1mAU

min

3"/";.35;

4"/"32.2865"/"32.75;

6"/"33.79:

7"/"Rktûx keq"/"35.7738"/"36.557

9"/"37.8;9

:"/"3:.773;"/"Nâvkeq"/"3;.78832"/"43.38:33"/"43.9:634"/"46.22535"/"46.84736"/"47.59;37"/"48.48638"/"49.;2:39"/"52.3383:"/"52.:283;"/"54.37842"/"Iânkeq"/"56.2;643"/"58.:7844"/"5:.;;445"/"65.;9546"/"Echgkeq"/"67.9:;47"/"73.:5;48"/"77.96749"/"7;.5234:"/"86.97:4;"/"8;.:6:52"/"98.25653"/"::.26; 54"/"334.652 55"/"36:.2;8

WVL:210 nm


166

Pq0"" Tgv0Vkog"" Rgcm"Pcog"" Jgkijv"" Atgc"" Tgn0Atgc"" Aoqwpv"" V{rg"""" okp" "" oAW" oAW,okp" '" Rro" ""

1 9,14 n.a. 4,663 3,377 0,12 n.a. BM 2 10,06 n.a. 320,396 150,243 5,20 n.a. M 3 10,54 n.a. 287,232 120,554 4,17 n.a. M 4 11,58 n.a. 807,643 432,555 14,96 n.a. M 5 13,55 Pirúvico 67,099 85,093 2,94 9903,27 M 6 14,33 n.a. 4,704 1,296 0,04 n.a. Rd 7 15,70 n.a. 2795,119 1224,674 42,36 n.a. M 8 18,55 n.a. 83,550 51,142 1,77 n.a. M 9 19,57 Lático 43,141 43,526 1,51 49502,64 M

10 21,17 n.a. 3,872 1,161 0,04 n.a. Ru 11 21,78 n.a. 34,813 76,818 2,66 n.a. M 12 24,00 n.a. 3,037 1,221 0,04 n.a. Ru 13 24,62 n.a. 20,034 36,172 1,25 n.a. M 14 25,38 n.a. 1,797 0,694 0,02 n.a. Rd 15 26,26 n.a. 23,937 18,843 0,65 n.a. M 16 27,91 n.a. 19,931 32,408 1,12 n.a. M 17 30,12 n.a. 0,576 0,294 0,01 n.a. Ru 18 30,81 n.a. 14,258 31,980 1,11 n.a. M 19 32,16 n.a. 15,391 35,082 1,21 n.a. M 20 34,09 Gálico 0,291 0,215 0,01 1,64 Rd 21 36,86 n.a. 12,836 70,826 2,45 n.a. M 22 38,99 n.a. 0,688 0,729 0,03 n.a. Rd 23 43,97 n.a. 7,897 44,346 1,53 n.a. M 24 45,79 Cafeico 0,600 1,266 0,04 16,69 Rd 25 51,84 n.a. 0,254 0,443 0,02 n.a. Ru 26 55,75 n.a. 11,561 57,603 1,99 n.a. M 27 59,30 n.a. 7,440 28,377 0,98 n.a. M 28 64,76 n.a. 0,233 0,339 0,01 n.a. Ru 29 69,85 n.a. 0,283 0,571 0,02 n.a. Ru 30 76,03 n.a. 0,199 0,330 0,01 n.a. Ru 31 88,05 n.a. 5,688 147,283 5,09 n.a. M 32 112,43 n.a. 5,164 112,667 3,90 n.a. M 33 148,10 n.a. 2,715 78,922 2,73 n.a. MB

Vqvcn<" 4607,042 2891,048 100,00 ########


167

60" EQTQN"

Ucorng"Pcog<" Eqtqn":" Kplgevkqp"Xqnwog<" 42.2"""Xkcn"Pwodgt<" IA:" Ejcppgn<" " WXaXKUa3"





0 20 40 60 80 100 120 140 165-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000 Análise dos Méis #8 Corol 8 UV_VIS_1mAU

min

3"/";.;;4

4"/"33.738

5"/"Rktûx keq"/"36.4:5

6"/"37.754

7"/"3:.6948"/"Nâvkeq"/"3;.7369"/"42.::::"/"44.272;"/"44.74532"/"45.79833"/"46.62:34"/"48.28:35"/"49.79636"/"52.55;37"/"53.92538"/"Iânkeq"/"55.66;39"/"57.2393:"/"58.5:53;"/"5:.76442"/"63.32643"/"65.89:44"/"72.26645"/"73.72:46"/"77.34847"/"8:.96948"/"96.9:;49"/":9.3654:"/";5.8;64;"/"Xcpînkeq"/"333.65752"/"35;.89353"/"Uktîpikeq"/"368.948

WVL:210 nm


168


1 9,99 n.a. 2719,355 1118,516 36,97 n.a. BM 2 11,52 n.a. 954,241 504,710 16,68 n.a. M 3 14,28 Pirúvico 53,114 24,005 0,79 2793,80 M 4 15,53 n.a. 2519,985 1076,319 35,57 n.a. M 5 18,47 n.a. 70,351 48,731 1,61 n.a. M 6 19,51 Lático 43,665 43,248 1,43 49186,20 M 7 20,89 n.a. 28,536 17,404 0,58 n.a. M 8 22,05 n.a. 29,586 69,981 2,31 n.a. M 9 22,52 n.a. 4,714 1,935 0,06 n.a. Rd

10 23,58 n.a. 2,610 1,104 0,04 n.a. Rd 11 24,41 n.a. 2,568 1,963 0,06 n.a. Rd 12 26,07 n.a. 25,158 16,631 0,55 n.a. M 13 27,57 n.a. 17,272 25,743 0,85 n.a. M 14 30,34 n.a. 9,764 14,851 0,49 n.a. M 15 31,70 n.a. 10,066 14,539 0,48 n.a. M 16 33,45 Gálico 0,389 0,229 0,01 1,74 Rd 17 35,02 n.a. 0,457 0,267 0,01 n.a. Ru 18 36,38 n.a. 5,039 6,722 0,22 n.a. Mb 19 38,54 n.a. 0,474 0,579 0,02 n.a. bMB 20 41,10 n.a. 0,163 0,146 0,00 n.a. BMb 21 43,68 n.a. 3,927 4,409 0,15 n.a. bMB 22 50,04 n.a. 0,130 0,104 0,00 n.a. BM 23 51,51 n.a. 0,455 0,413 0,01 n.a. MB 24 55,13 n.a. 2,566 3,597 0,12 n.a. BMB 25 68,75 n.a. 0,422 0,787 0,03 n.a. BMB 26 74,79 n.a. 0,287 0,566 0,02 n.a. BMB 27 87,14 n.a. 2,484 12,943 0,43 n.a. BMB 28 93,69 n.a. 0,031 0,019 0,00 n.a. Rd 29 111,43 Vanílico 1,639 4,119 0,14 34,69 BMB 30 139,67 n.a. 0,018 0,050 0,00 n.a. BMB 31 146,73 Siríngico 2,917 10,948 0,36 70,90 BMB

Vqvcn<" 6512,384 3025,580 100,00 ########


169

70" ETGUEKWOAN"

Ucorng"Pcog<" Etguekwocn"5" Kplgevkqp"Xqnwog<" 42.2"""Xkcn"Pwodgt<" IA5" Ejcppgn<" " WXaXKUa3"





0 20 40 60 80 100 120 140 165-200

500

1000

1500

2000 Análise dos Méis #3 Cresciumal 3 UV_VIS_1mAU

min

3"/";.;98

4"/"32.662

5"/"33.722

6"/"34.;797"/"Rktûx keq"/"36.473

8"/"37.747

9"/"38.828:"/"3:.6:5;"/"42.26932"/"44.2:833"/"45.63934"/"46.62535"/"48.28:36"/"49.35;37"/"4:.9:938"/"52.54439"/"53.9;:3:"/"56.;763;"/"58.58442"/"5:.74243"/"63.37244"/"65.87745"/"69.59:46"/"73.76247"/"77.37:48"/"85.:8549"/"8:.6;84:"/"96.:6:4;"/"97.2:652"/":8.;3353"/";5.39; 54"/"Xcpînkeq"/"333.36255"/"339.646 56"/"Uktîpikeq"/"368.65657"/"374.422

WVL:210 nm


170


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3500 Análise dos Méis #2 Estiva 2 UV_VIS_1mAU

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3500 Análise dos Méis #5 Goiasa 5 UV_VIS_1mAU

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WVL:210 nm


178


1 10,01 n.a. 3232,902 1522,429 40,48 n.a. BM 2 11,52 n.a. 944,801 515,440 13,70 n.a. M 3 13,35 n.a. 89,372 111,357 2,96 n.a. M 4 14,27 Pirúvico 5,487 1,305 0,03 151,89 Rd 5 15,53 n.a. 2292,137 1029,140 27,36 n.a. M 6 18,47 n.a. 106,782 151,886 4,04 n.a. M 7 19,52 Lático 13,333 7,136 0,19 8116,00 Rd 8 20,84 n.a. 2,191 0,523 0,01 n.a. Rd 9 21,58 n.a. 49,824 121,805 3,24 n.a. M

10 21,98 n.a. 2,789 1,228 0,03 n.a. Rd 11 23,56 n.a. 3,940 1,705 0,05 n.a. Rd 12 24,36 n.a. 1,578 0,477 0,01 n.a. Rd 13 24,94 n.a. 1,403 0,625 0,02 n.a. Rd 14 26,07 n.a. 25,653 20,046 0,53 n.a. M 15 27,50 n.a. 24,680 39,350 1,05 n.a. M 16 30,28 n.a. 18,840 32,822 0,87 n.a. M 17 31,76 n.a. 20,979 37,650 1,00 n.a. M 18 33,52 Gálico 0,337 0,198 0,01 1,51 Rd 19 35,01 n.a. 1,405 0,915 0,02 n.a. Ru 20 36,40 n.a. 11,521 60,031 1,60 n.a. M 21 38,43 n.a. 0,304 0,257 0,01 n.a. Rd 22 41,21 n.a. 0,283 0,306 0,01 n.a. Rd 23 43,60 n.a. 7,809 36,617 0,97 n.a. M 24 49,97 n.a. 0,145 0,107 0,00 n.a. Rd 25 51,45 n.a. 0,049 0,030 0,00 n.a. Rd 26 54,96 n.a. 5,510 32,540 0,87 n.a. M 27 58,19 n.a. 0,579 0,866 0,02 n.a. Rd 28 63,76 n.a. 0,040 0,030 0,00 n.a. Rd 29 68,64 n.a. 0,327 0,541 0,01 n.a. Rd 30 74,65 n.a. 0,473 1,046 0,03 n.a. MB 31 81,88 n.a. 0,212 0,332 0,01 n.a. BMB 32 87,02 n.a. 1,527 3,023 0,08 n.a. BMB 33 94,00 n.a. 0,193 0,313 0,01 n.a. BMB 34 105,08 n.a. 0,205 0,480 0,01 n.a. BMB 35 111,36 Vanílico 3,004 10,008 0,27 84,29 BMB 36 127,21 n.a. 0,241 0,603 0,02 n.a. BMB 37 146,70 Siríngico 4,511 18,125 0,48 117,39 BMB

Vqvcn<" 6875,365 3761,292 100,00


179

320" IWATAPK"

Ucorng"Pcog<" Iwctcpk"6" Kplgevkqp"Xqnwog<" 42.2"""Xkcn"Pwodgt<" IA6" Ejcppgn<" " WXaXKUa3"





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1000

2000

3000

4000 Análise dos Méis #4 Guarani 4 UV_VIS_1mAU

min

3"/"32.2354"/"32.272

5"/"33.738

6"/"Rktûx keq"/"36.479

7"/"37.765

8"/"3:.6989"/"Nâvkeq"/"3;.6;9:"/"42.:95;"/"43.6:632"/"44.37;33"/"45.82334"/"46.59535"/"46.;3836"/"48.28537"/"49.78538"/"4;.83939"/"52.4:63:"/"53.2993;"/"53.8:242"/"Iânkeq"/"55.86;43"/"58.5:;44"/"5:.4:445"/"62.;4446"/"65.82547"/"Echgkeq"/"67.;2748"/"6;.;8349"/"73.6534:"/"76.;324;"/"7:.35752"/"8:.79;53"/"96.:3654"/"99.57755"/":3.93256"/":8.::857"/";5.95958"/"327.39:59"/"Xcpînkeq"/"333.37;5:"/"Uktîpikeq"/"368.639

WVL:210 nm


180


1 10,01 n.a. 3399,019 2266,018 49,01 n.a. BM 2 10,05 n.a. 41,543 37,601 0,81 n.a. Rd 3 11,52 n.a. 471,234 118,018 2,55 n.a. Rd 4 14,26 Pirúvico 100,925 57,536 1,24 6696,15 M 5 15,54 n.a. 2734,723 1289,422 27,89 n.a. M 6 18,48 n.a. 168,475 202,366 4,38 n.a. M 7 19,50 Lático 21,556 11,481 0,25 13057,72 Rd 8 20,87 n.a. 10,749 3,501 0,08 n.a. Rd 9 21,48 n.a. 49,816 142,217 3,08 n.a. M

10 22,16 n.a. 7,722 7,509 0,16 n.a. Rd 11 23,60 n.a. 6,464 2,720 0,06 n.a. Rd 12 24,37 n.a. 3,387 1,080 0,02 n.a. Rd 13 24,92 n.a. 2,266 1,022 0,02 n.a. Rd 14 26,06 n.a. 44,627 34,284 0,74 n.a. M 15 27,56 n.a. 34,386 55,829 1,21 n.a. M 16 29,62 n.a. 1,006 0,514 0,01 n.a. Ru 17 30,28 n.a. 0,562 0,194 0,00 n.a. Ru 18 31,08 n.a. 25,063 94,390 2,04 n.a. M 19 31,68 n.a. 2,973 2,280 0,05 n.a. Rd 20 33,65 Gálico 0,221 0,123 0,00 0,94 Rd 21 36,39 n.a. 17,410 90,955 1,97 n.a. M 22 38,28 n.a. 0,281 0,309 0,01 n.a. Rd 23 40,92 n.a. 0,360 0,325 0,01 n.a. Rd 24 43,60 n.a. 13,264 67,127 1,45 n.a. M 25 45,90 Cafeico 0,382 0,342 0,01 4,52 Rd 26 49,96 n.a. 0,724 0,641 0,01 n.a. Rd 27 51,43 n.a. 0,051 0,025 0,00 n.a. Rd 28 54,91 n.a. 9,216 71,790 1,55 n.a. M 29 58,14 n.a. 0,897 1,411 0,03 n.a. Rd 30 68,58 n.a. 0,657 1,153 0,02 n.a. Rd 31 74,81 n.a. 2,421 18,653 0,40 n.a. M 32 77,36 n.a. 0,080 0,095 0,00 n.a. Rd 33 81,71 n.a. 0,460 1,061 0,02 n.a. Rd 34 86,89 n.a. 2,920 9,880 0,21 n.a. MB 35 93,74 n.a. 0,550 1,229 0,03 n.a. Rd 36 105,18 n.a. 0,198 0,404 0,01 n.a. BMB 37 111,16 Vanílico 4,728 13,255 0,29 111,60 BMB 38 146,42 Siríngico 4,490 16,816 0,36 108,91 BMB

Vqvcn<" 7185,809 4623,578 100,00 ########


181

0 20 40 60 80 100 120 140 161-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000 ÁCIDO PIRÚVICO E MEL 1 #2 Maracaí 1 UV_VIS_1mAU

min

3"/";.;;;

4"/"32.6;3

5"/"33.737

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9"/"37.748

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WVL:210 nm


182

330" OATAEA¯"

Ucorng"Pcog<" Octcecî"3" Kplgevkqp"Xqnwog<" 42.2"""Xkcn"Pwodgt<" TA5" Ejcppgn<" " WXaXKUa3"




Tgeqtfkpi"Vkog<" 431914226"34<73" Ucorng"Ygkijv<" 3.2222"""Twp"Vkog"*okp+<" 382.:5" Ucorng"Coqwpv<" 3.2222"""

0 20 40 60 80 100 120 140 161-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000 ÁCIDO PIRÚVICO E MEL 1 #2 Maracaí 1 UV_VIS_1mAU

min

3"/";.;;;

4"/"32.6;3

5"/"33.737

6"/"34.8397"/"34.;468"/"Rktûx keq"/"36.474

9"/"37.748

:"/"38.828;"/"3:.69:32"/"Nâvkeq"/"3;.75733"/"42.86534"/"43.;6535"/"45.62436"/"46.5::37"/"47.46238"/"48.28839"/"49.6783:"/"52.5653;"/"53.:3742"/"Iânkeq"/"55.56643"/"56.;7344"/"58.62345"/"5:.84;46"/"63.39847"/"65.73348"/"69.54:49"/"73.6:24:"/"77.3884;"/"86.22752"/"8:.:6353"/"96.84354"/":8.;:;55"/";6.38856"/";;.54457"/"Xcpînkeq"/"333.58:58"/"339.85: 59"/"Uktîpikeq"/"368.9955:"/"374.492

WVL:210 nm


183


1 10,00 n.a. 2497,195 995,441 39,05 n.a. BM 2 10,49 n.a. 59,479 9,300 0,36 n.a. Rd 3 11,51 n.a. 797,517 270,447 10,61 n.a. M 4 12,62 n.a. 39,008 42,828 1,68 n.a. M 5 12,92 n.a. 3,297 0,808 0,03 n.a. Rd 6 14,25 Pirúvico 38,004 23,456 0,92 2729,88 M 7 15,53 n.a. 2175,542 836,780 32,83 n.a. M 8 16,61 n.a. 97,226 94,746 3,72 n.a. M 9 18,48 n.a. 81,279 73,575 2,89 n.a. M

10 19,53 Lático 6,825 2,723 0,11 3097,59 Rd 11 20,64 n.a. 2,161 0,843 0,03 n.a. Rd 12 21,94 n.a. 36,391 64,936 2,55 n.a. M 13 23,40 n.a. 0,480 0,179 0,01 n.a. Rd 14 24,39 n.a. 6,208 2,813 0,11 n.a. Rd 15 25,24 n.a. 0,163 0,050 0,00 n.a. Rd 16 26,07 n.a. 22,046 14,504 0,57 n.a. M 17 27,46 n.a. 14,103 23,113 0,91 n.a. M 18 30,34 n.a. 10,388 13,032 0,51 n.a. M 19 31,81 n.a. 14,637 22,618 0,89 n.a. M 20 33,34 Gálico 0,796 0,415 0,02 3,17 Rd 21 34,95 n.a. 1,254 0,847 0,03 n.a. Ru 22 36,40 n.a. 7,133 29,835 1,17 n.a. MB 23 38,63 n.a. 0,702 0,882 0,03 n.a. Rd 24 41,18 n.a. 0,697 0,551 0,02 n.a. Rd 25 43,51 n.a. 0,756 0,841 0,03 n.a. Rd 26 47,33 n.a. 0,737 1,112 0,04 n.a. Rd 27 51,48 n.a. 0,173 0,138 0,01 n.a. BMB 28 55,17 n.a. 1,390 1,774 0,07 n.a. BMB 29 64,01 n.a. 0,117 0,137 0,01 n.a. BMB 30 68,84 n.a. 0,385 0,689 0,03 n.a. BMB 31 74,62 n.a. 0,191 0,273 0,01 n.a. BMB 32 86,99 n.a. 1,204 2,241 0,09 n.a. BMB 33 94,17 n.a. 0,021 0,033 0,00 n.a. BMB 34 99,32 n.a. 0,125 0,222 0,01 n.a. BMB 35 111,37 Vanílico 2,180 6,777 0,27 57,06 BMB 36 117,64 n.a. 0,278 0,484 0,02 n.a. Rd 37 146,77 Siríngico 2,631 9,350 0,37 60,55 BM 38 152,27 n.a. 0,109 0,245 0,01 n.a. MB

Vqvcn<" 5922,832 2549,039 100,00

185

APGZQ"D"

30 TGPFKOGPVQ"GO"GVAPQN"*[R1U+ 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3:9

1.1 BG1....................................................................................................... 187

1.2 CL1 ....................................................................................................... 189

1.3 SA1 ....................................................................................................... 190

1.4 Y904...................................................................................................... 192

40 TGPFKOGPVQ"EGNWNAT"*[Z1U+ 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3;5

2.1 BG1....................................................................................................... 193

2.2 CL1 ....................................................................................................... 195

2.3 SA1 ....................................................................................................... 196

2.4 Y904...................................................................................................... 198

50 EqpUWOQ"FG"ATV 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 3;;

3.1 BG1....................................................................................................... 199

3.2 CL1 ....................................................................................................... 201

3.3 SA1 ....................................................................................................... 202

3.4 Y904...................................................................................................... 203

60 Rtqfwvkxkfcfg 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 427

4.1 BG1....................................................................................................... 205

4.2 CL1 ....................................................................................................... 206

4.3 SA1 ....................................................................................................... 207

4.4 Y904...................................................................................................... 209

Anexo B

187

30" TGPFKOGPVQ"GO"GVAPQN"*[R1U+"

303" DI3"

Hkiwtc"D"3"/"ıneqqn"z"Vgorgtcvwtc"

Hkiwtc"D"4"/"ıneqqn"z"Rtguuçq"Quoôvkec"

0,334 0,351 0,368 0,385 0,401 0,418 0,435 0,451 0,468 0,485 above

Fitted Surface; Variable: YPS

2 factors, 1 Blocks, 17 Runs; MS Residual=,001163

DV: YPS

0,334 0,351 0,368 0,385 0,401 0,418 0,435 0,451 0,468 0,485 above



DV: YPS

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,450 0,465 0,481 0,497 0,512 0,528 0,544 0,559 0,575 0,591 above



DV: YPS

0,450 0,465 0,481 0,497 0,512 0,528 0,544 0,559 0,575 0,591 above



DV: YPS

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

188

Hkiwtc"D"5"/"Vgorgtcvwtc"z"Rtguuçq"Quoôvkec"

Vcdgnc"D"3⁄"[R1U"."egrc"DI3"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

0,353 0,366 0,380 0,394 0,407 0,421 0,435 0,448 0,462 0,476 above



DV: YPS

0,353 0,366 0,380 0,394 0,407 0,421 0,435 0,448 0,462 0,476 above



DV: YPS

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

189

304" EN3"

Hkiwtc"D"6/"ıneqqn"z"Vgorgtcvwtc"

Hkiwtc"D"7/"ıneqqn"z"Rtguuçq"Quoôvkec"

Hkiwtc"D"8/"Vgorgtcvwtc"z"Rtguuçq"Quoôvkec"

0,365 0,378 0,390 0,403 0,416 0,429 0,441 0,454 0,467 0,479 above



DV: YPS

0,365 0,378 0,390 0,403 0,416 0,429 0,441 0,454 0,467 0,479 above



DV: YPS

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,432 0,444 0,456 0,468 0,481 0,493 0,505 0,517 0,530 0,542 above



DV: YPS

0,432 0,444 0,456 0,468 0,481 0,493 0,505 0,517 0,530 0,542 above



DV: YPS

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,315 0,334 0,352 0,371 0,389 0,408 0,426 0,445 0,463 0,482 above



DV: YPS

0,315 0,334 0,352 0,371 0,389 0,408 0,426 0,445 0,463 0,482 above



DV: YPS

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

190

"

Vcdgnc"D"4/"[R1U"."egrc"EN3"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

305" UA3"


0,378 0,390 0,401 0,412 0,423 0,435 0,446 0,457 0,468 0,480 above



DV: YPS

0,378 0,390 0,401 0,412 0,423 0,435 0,446 0,457 0,468 0,480 above



DV: YPS

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

191

Hkiwtc"D":/"ıneqqn"z"Rtguuçq"Quoôvkec"

Hkiwtc"D";/"Vgorgtcvwtc"z"Rtguuçq"Quoôvkec"

Vcdgnc"D"5/"[R1U"."egrc"UA3"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

0,455 0,464 0,473 0,481 0,490 0,499 0,507 0,516 0,525 0,533 above



DV: YPS

0,455 0,464 0,473 0,481 0,490 0,499 0,507 0,516 0,525 0,533 above



DV: YPS

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,348 0,362 0,377 0,391 0,405 0,419 0,433 0,448 0,462 0,476 above



DV: YPS

0,348 0,362 0,377 0,391 0,405 0,419 0,433 0,448 0,462 0,476 above



DV: YPS

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

192

306" [;26"




0,383 0,393 0,404 0,414 0,424 0,434 0,444 0,454 0,465 0,475 above



DV: YPS

0,383 0,393 0,404 0,414 0,424 0,434 0,444 0,454 0,465 0,475 above



DV: YPS

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,440 0,451 0,462 0,473 0,484 0,495 0,506 0,517 0,528 0,539 above



DV: YPS

0,440 0,451 0,462 0,473 0,484 0,495 0,506 0,517 0,528 0,539 above



DV: YPS

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,374 0,386 0,398 0,410 0,422 0,434 0,446 0,458 0,470 0,482 above



DV: YPS

0,374 0,386 0,398 0,410 0,422 0,434 0,446 0,458 0,470 0,482 above



DV: YPS

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

193

Vcdgnc"D"6/"[R1U."egrc"[;26"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

40" TGPFKOGPVQ"EGNWNAT"*[Z1U+"

403" DI3""


0,027 0,033 0,039 0,045 0,051 0,057 0,063 0,069 0,076 0,082 above

Fitted Surface; Variable: YXS


DV: YXS

0,027 0,033 0,039 0,045 0,051 0,057 0,063 0,069 0,076 0,082 above



DV: YXS

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

194



"

Vcdgnc"D"7⁄"[Z1U"."egrc"DI3"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

0,053 0,058 0,062 0,067 0,072 0,076 0,081 0,085 0,090 0,094 above



DV: YXS

0,053 0,058 0,062 0,067 0,072 0,076 0,081 0,085 0,090 0,094 above



DV: YXS

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,036 0,039 0,042 0,045 0,048 0,052 0,055 0,058 0,061 0,064 above



DV: YXS

0,036 0,039 0,042 0,045 0,048 0,052 0,055 0,058 0,061 0,064 above



DV: YXS

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

195

404" EN3"



Hkiwtc"D"3:/"Vgorgtcvwtc"z"Rtguuçq"Quoôvkec"

0,020 0,025 0,030 0,036 0,041 0,046 0,052 0,057 0,062 0,067 above



DV: YXS

0,020 0,025 0,030 0,036 0,041 0,046 0,052 0,057 0,062 0,067 above



DV: YXS

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,044 0,047 0,050 0,054 0,057 0,060 0,064 0,067 0,070 0,074 above



DV: YXS

0,044 0,047 0,050 0,054 0,057 0,060 0,064 0,067 0,070 0,074 above



DV: YXS

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,028 0,031 0,035 0,039 0,043 0,047 0,050 0,054 0,058 0,062 above



DV: YXS

0,028 0,031 0,035 0,039 0,043 0,047 0,050 0,054 0,058 0,062 above



DV: YXS

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

196

Vcdgnc"D"8⁄"[Z1U"."egrc"EN3"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

405" UA3"

Hkiwtc"D"3;/"ıneqqn"z"Vgorgtcvwtc"

0,037 0,040 0,044 0,048 0,051 0,055 0,059 0,063 0,066 0,070 above



DV: YXS

0,037 0,040 0,044 0,048 0,051 0,055 0,059 0,063 0,066 0,070 above



DV: YXS

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

197



Vcdgnc"D"9⁄"[Z1U."egrc"UA3"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

0,042 0,045 0,048 0,051 0,054 0,058 0,061 0,064 0,067 0,070 above



DV: YXS

0,042 0,045 0,048 0,051 0,054 0,058 0,061 0,064 0,067 0,070 above



DV: YXS

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,031 0,034 0,037 0,039 0,042 0,045 0,048 0,050 0,053 0,056 above



DV: YXS

0,031 0,034 0,037 0,039 0,042 0,045 0,048 0,050 0,053 0,056 above



DV: YXS

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

198

406" [;26"




0,028 0,032 0,036 0,041 0,045 0,049 0,054 0,058 0,062 0,066 above



DV: YXS

0,028 0,032 0,036 0,041 0,045 0,049 0,054 0,058 0,062 0,066 above



DV: YXS

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,044 0,047 0,050 0,052 0,055 0,058 0,060 0,063 0,066 0,068 above



DV: YXS

0,044 0,047 0,050 0,052 0,055 0,058 0,060 0,063 0,066 0,068 above



DV: YXS

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,027 0,031 0,035 0,038 0,042 0,045 0,049 0,053 0,056 0,060 above



DV: YXS

0,027 0,031 0,035 0,038 0,042 0,045 0,049 0,053 0,056 0,060 above



DV: YXS

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

199

Vcdgnc"D":⁄"[Z1U."egrc"[;26"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

50" EQPUWOQ"FG"ATV"

503" DI3"


22,413 27,568 32,724 37,880 43,035 48,191 53,347 58,503 63,658 68,814 above

Fitted Surface; Variable: CONV_ART

2 factors, 1 Blocks, 17 Runs; MS Residual=347,2806

DV: CONV_ART

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

22,413 27,568 32,724 37,880 43,035 48,191 53,347 58,503 63,658 68,814 above



DV: CONV_ART

Anexo B

200



Vcdgnc"D";/"Eqpxgtuçq"."egrc"DI3"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

21,128 30,591 40,054 49,517 58,980 68,443 77,905 87,368 96,831 106,294 above



DV: CONV_ART

21,128 30,591 40,054 49,517 58,980 68,443 77,905 87,368 96,831 106,294 above



DV: CONV_ART

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

24,657 31,470 38,283 45,096 51,909 58,722 65,535 72,348 79,161 85,974 above



DV: CONV_ART

24,657 31,470 38,283 45,096 51,909 58,722 65,535 72,348 79,161 85,974 above



DV: CONV_ART

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

201

504" EN3"

Hkiwtc"D"4:/"ıneqqn"z"Vgorgtcvwtc"

Hkiwtc"D"4;/"ıneqqn"z"Rtguuçq"Quoôvkec"


32,402 36,779 41,155 45,532 49,909 54,285 58,662 63,038 67,415 71,792 above



DV: CONV_ART

32,402 36,779 41,155 45,532 49,909 54,285 58,662 63,038 67,415 71,792 above



DV: CONV_ART

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

29,718 39,103 48,488 57,873 67,258 76,643 86,028 95,413 104,798 114,183 above



DV: CONV_ART

29,718 39,103 48,488 57,873 67,258 76,643 86,028 95,413 104,798 114,183 above



DV: CONV_ART

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

29,844 36,724 43,604 50,483 57,363 64,242 71,122 78,001 84,881 91,760 above



DV: CONV_ART

29,844 36,724 43,604 50,483 57,363 64,242 71,122 78,001 84,881 91,760 above



DV: CONV_ART

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

202

Vcdgnc"D"32/"Eqpxgtuçq."egrc"EN3"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

505" UA3"

Hkiwtc"D"53"/"ıneqqn"z"Vgorgtcvwtc"


16,060 21,717 27,374 33,032 38,689 44,347 50,004 55,662 61,319 66,977 above



DV: CONV_ART

16,060 21,717 27,374 33,032 38,689 44,347 50,004 55,662 61,319 66,977 above



DV: CONV_ART

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

40,623 48,386 56,149 63,913 71,676 79,440 87,203 94,966 102,730 110,493 above



DV: CONV_ART

40,623 48,386 56,149 63,913 71,676 79,440 87,203 94,966 102,730 110,493 above



DV: CONV_ART

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

203

Hkiwtc"AD"55/"Vgorgtcvwtc"z"Rtguuçq"Quoôvkec"

Vcdgnc"D"33/"Eqpxgtuçq."egrc"UA3"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

506" [;26"


46,099 51,631 57,163 62,696 68,228 73,760 79,293 84,825 90,357 95,889 above



DV: CONV_ART

46,099 51,631 57,163 62,696 68,228 73,760 79,293 84,825 90,357 95,889 above



DV: CONV_ART

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

31,983 37,237 42,490 47,743 52,996 58,249 63,502 68,755 74,008 79,261 above



DV: CONV_ART

31,983 37,237 42,490 47,743 52,996 58,249 63,502 68,755 74,008 79,261 above



DV: CONV_ART

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

204



Vcdgnc"D"34/"Eqpxgtuçq."egrc"[;26"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

34,014 40,551 47,089 53,627 60,164 66,702 73,240 79,778 86,315 92,853 above



DV: CONV_ART

34,014 40,551 47,089 53,627 60,164 66,702 73,240 79,778 86,315 92,853 above



DV: CONV_ART

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

29,490 34,614 39,737 44,860 49,983 55,107 60,230 65,353 70,476 75,600 above



DV: CONV_ART

29,490 34,614 39,737 44,860 49,983 55,107 60,230 65,353 70,476 75,600 above



DV: CONV_ART

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

205

60" RTQFWVKXKFAFG"

603" DI3"


Hkiwtc"D"5:/"ıneqqn"z"Rtguuçq"Quoôvkec"

Hkiwtc"D"5;/"Vgorgtcvwtc"z"Rtguuçq"Quoôvkec"

0,471 0,609 0,748 0,886 1,024 1,162 1,301 1,439 1,577 1,716 above

Fitted Surface; Variable: PROD


DV: PROD

0,471 0,609 0,748 0,886 1,024 1,162 1,301 1,439 1,577 1,716 above



DV: PROD

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,808 1,075 1,342 1,609 1,876 2,143 2,409 2,676 2,943 3,210 above



DV: PROD

0,808 1,075 1,342 1,609 1,876 2,143 2,409 2,676 2,943 3,210 above



DV: PROD

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,517 0,709 0,901 1,093 1,285 1,477 1,670 1,862 2,054 2,246 above



DV: PROD

0,517 0,709 0,901 1,093 1,285 1,477 1,670 1,862 2,054 2,246 above



DV: PROD

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

206

Vcdgnc"D"35/"Rtqfwvkxkfcfg"."egrc"DI3"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

604" EN3"



0,621 0,768 0,914 1,060 1,206 1,352 1,498 1,644 1,791 1,937 above



DV: PROD

0,621 0,768 0,914 1,060 1,206 1,352 1,498 1,644 1,791 1,937 above



DV: PROD

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,857 1,138 1,420 1,701 1,982 2,263 2,545 2,826 3,107 3,389 above



DV: PROD

0,857 1,138 1,420 1,701 1,982 2,263 2,545 2,826 3,107 3,389 above



DV: PROD

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

207


Vcdgnc"D"36/"Rtqfwvkxkfcfg."egrc"EN3"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

605" UA3"


0,629 0,823 1,017 1,211 1,405 1,599 1,793 1,987 2,181 2,375 above



DV: PROD

0,629 0,823 1,017 1,211 1,405 1,599 1,793 1,987 2,181 2,375 above



DV: PROD

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,145 0,333 0,520 0,708 0,895 1,083 1,270 1,458 1,645 1,833 above



DV: PROD

0,145 0,333 0,520 0,708 0,895 1,083 1,270 1,458 1,645 1,833 above



DV: PROD

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

208



Vcdgnc"D"37/"Rtqfwvkxkfcfg."egrc"UA3"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

1,082 1,329 1,575 1,822 2,068 2,315 2,562 2,808 3,055 3,301 above



DV: PROD

1,082 1,329 1,575 1,822 2,068 2,315 2,562 2,808 3,055 3,301 above



DV: PROD

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

1,051 1,226 1,400 1,575 1,749 1,924 2,098 2,272 2,447 2,621 above



DV: PROD

1,051 1,226 1,400 1,575 1,749 1,924 2,098 2,272 2,447 2,621 above



DV: PROD

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

209

606" [;26"



Hkiwtc"D"6:/"Vgorgtcvwtc"z"Rtguuçq"Quoôvkec"

0,687 0,851 1,016 1,180 1,344 1,508 1,672 1,837 2,001 2,165 above



DV: PROD

0,687 0,851 1,016 1,180 1,344 1,508 1,672 1,837 2,001 2,165 above



DV: PROD

ALCOOL

TE

MP

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,839 1,046 1,253 1,460 1,666 1,873 2,080 2,287 2,493 2,700 above



DV: PROD

0,839 1,046 1,253 1,460 1,666 1,873 2,080 2,287 2,493 2,700 above



DV: PROD

ALCOOL

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,605 0,766 0,927 1,087 1,248 1,408 1,569 1,730 1,890 2,051 above



DV: PROD

0,605 0,766 0,927 1,087 1,248 1,408 1,569 1,730 1,890 2,051 above



DV: PROD

TEMP

PO

SM

OT

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Anexo B

210

Vcdgnc"D"38/"Rtqfwvkxkfcfg."egrc"[;26"⁄"Vcdgnc"Apqxc"

211

APGZQ"E

30 ıekfq"Iânkeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 435

1.1 Yxs ........................................................................................................ 214

1.2 Yps........................................................................................................ 214

1.3 Produtividade ........................................................................................ 215

1.4 Conversão............................................................................................. 215

40 ıekfq"Echgkeq 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 438

2.1 YX/S........................................................................................................ 217

2.2 yps ........................................................................................................ 217

2.3 Produtividade ........................................................................................ 218

2.4 Conversão............................................................................................. 218

50 ıekfq"Xcpînkeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 43;

3.1 Yxs ........................................................................................................ 219

3.2 Yps........................................................................................................ 220

3.3 Produtividade ........................................................................................ 221

3.4 Conversão............................................................................................. 221

60 ıekfq"Nâvkeq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 444

4.1 Yxs ........................................................................................................ 223

4.2 Yps........................................................................................................ 223

4.3 Produtividade ........................................................................................ 224

4.4 Conversão............................................................................................. 224

70 ıekfq"Uktîpikeq0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 447

5.1 YX/S........................................................................................................ 226

5.2 yps ........................................................................................................ 226

5.3 Produtividade ........................................................................................ 227

5.4 Conversão............................................................................................. 227

80 ıekfq"Rktûxkeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 44:

6.1 Yxs ........................................................................................................ 229

6.2 Yps........................................................................................................ 229

6.3 Produtividade ........................................................................................ 230

6.4 Conversão............................................................................................. 230

"90 ıekfq"Aeêvkeq 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 453

212

7.1 Yxs ........................................................................................................ 232

7.2 Yps........................................................................................................ 232

7.3 Produtividade ........................................................................................ 233

7.4 Conversão............................................................................................. 233

:0 ıekfq"Dwvîtkeq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 456

8.1 Yxs ........................................................................................................ 235

8.2 Yps........................................................................................................ 235

8.3 Produtividade ........................................................................................ 236

8.4 Conversão............................................................................................. 236

;0 ıekfq"Hôtokeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 459

9.1 Yxs ........................................................................................................ 238

9.2 Yps........................................................................................................ 238

9.3 Produtividade ........................................................................................ 239

9.4 Conversão............................................................................................. 239

320 ıekfq"JOH 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 462

10.1 Yxs ........................................................................................................ 241

10.2 Yps........................................................................................................ 241

10.3 Produtividade ........................................................................................ 242

10.4 Conversão............................................................................................. 242

Anexo C

213

30" ıEKFQ"IıNKEQ"" " Ocuuc"Ugec" ATV" Gvcpqn"" " i1N" i1N" i1N"" UA3" 0,26 - - " [;26" 0,29 - - " EN3" 0,32 - - " OquvqaD" - 165,81 - " OquvqaOV" - 168,94 - " OquvqaOF" - 169,98 - " OquvqaF" - 169,98 - " OquvqaS" - 178,32 -

DaH3" 6,19 2,27 65,17 DaH4" 6,14 2,14 64,68 DaH5" 6,40 2,02 64,92 OVaH3" 6,21 2,22 65,66 OVaH4" 6,23 1,88 65,66 OVaH5" 6,18 2,04 65,91 OFaH3" 6,29 2,02 64,92 OFaH4" 6,40 2,18 69,37 OFaH5" 6,15 2,18 65,42 FaH3" 6,42 2,11 65,17 FaH4" 6,38 1,91 65,91 FaH5" 6,32 1,98 65,66 SaH3" 6,37 1,94 65,91 SaH4" 6,33 2,00 68,63

UA3"

SaH5" 6,36 1,91 69,12 DaH3" 6,13 3,18 63,20 DaH4" 5,82 4,59 60,97 DaH5" 5,87 4,54 62,70 OVaH3" 5,84 4,40 68,63 OVaH4" 6,34 3,16 63,94 OVaH5" 5,99 3,61 62,95 OFaH3" 5,97 3,91 64,18 OFaH4" 5,84 3,88 64,18 OFaH5" 5,95 4,10 66,41 FaH3" 6,03 3,91 66,16 FaH4" 6,02 4,59 65,42 FaH5" 6,00 3,96 64,18 SaH3" 5,88 4,55 63,69 SaH4" 6,10 4,39 64,92

[;26"

SaH5" 6,71 3,70 64,92 DaH3" 6,51 16,16 58,51 DaH4" 6,26 21,27 55,54 EN3"DaH5" 6,31 22,11 60,97

Anexo C

214

303" [ZU"

" Rcftçq" Tghgtípekc" Eqttgèçq" Egrc" Eqttkikfc" Fguxkq"Tgh0"

DaUA3" 0,0480 0,04 1,200937 0,0414 2.2567" -15,85

OVaUA3" 0,0480 0,04 1,200937 0,0404 2.2559" -18,71

OFaUA3" 0,0480 0,04 1,200937 0,0406 2.255;" -18,07

FaUA3" 0,0480 0,04 1,200937 0,0412 2.2566" -16,33

SaUA3" 0,0480 0,04 1,200937 0,0390 2.2547" -22,89

Da[;26" 0,0480 0,04 1,200937 0,0399 2.2555" -20,12

OVa[;26" 0,0480 0,04 1,200937 0,0398 2.2554" -20,49

OFa[;26" 0,0480 0,04 1,200937 0,0388 2.2545" -23,78

Fa[;26" 0,0480 0,04 1,200937 0,0395 2.254;" -21,55

Sa[;26" 0,0480 0,04 1,200937 0,0389 2.2546" -23,43

304" [RU"


DaUA3" 0,4432 0,46 0,9634 0,4328 2.66;5" -2,38

OVaUA3" 0,4432 0,46 0,9634 0,4303 2.6689" -2,98

OFaUA3" 0,4432 0,46 0,9634 0,4331 2.66;8" -2,30

FaUA3" 0,4432 0,46 0,9634 0,4265 2.664:" -3,89

SaUA3" 0,4432 0,46 0,9634 0,4196 2.6578" -5,61

Da[;26" 0,4432 0,46 0,9634 0,4210 2.6593" -5,24

OVa[;26" 0,4432 0,46 0,9634 0,4311 2.6697" -2,79

OFa[;26" 0,4432 0,46 0,9634 0,4274 2.6659" -3,68

Fa[;26" 0,4432 0,46 0,9634 0,4304 2.668:" -2,95

Sa[;26" 0,4432 0,46 0,9634 0,4047 2.6423" -9,49

Anexo C

215

305" RTQFWVKXKFAFG"


DaUA3" 2,4309 2,5 0,972362 2,7051 4.9:43" 10,14

OVaUA3" 2,4309 2,5 0,972362 2,7394 4.:395" 11,26

OFaUA3" 2,4309 2,5 0,972362 2,7737 4.:748" 12,36

FaUA3" 2,4309 2,5 0,972362 2,7326 4.:325" 11,04

SaUA3" 2,4309 2,5 0,972362 2,8286 4.;2;2" 14,06

Da[;26" 2,4309 2,5 0,972362 2,5954 4.88;4" 6,34

OVa[;26" 2,4309 2,5 0,972362 2,7154 4.9;48" 10,48

OFa[;26" 2,4309 2,5 0,972362 2,7051 4.9:43" 10,14

Fa[;26" 2,4309 2,5 0,972362 2,7188 4.9;84" 10,59

Sa[;26" 2,4309 2,5 0,972362 2,6880 4.9866" 9,57

306" EQPXGTU’Q"


DaUA3" 87,55 90 0,9728 98,67 322.22" 10,00

OVaUA3" 87,55 90 0,9728 98,75 322.22" 10,00

OFaUA3" 87,55 90 0,9728 98,71 322.22" 10,00

FaUA3" 87,55 90 0,9728 98,79 322.22" 10,00

SaUA3" 87,55 90 0,9728 98,88 322.22" 10,00

Da[;26" 87,55 90 0,9728 97,45 322.22" 10,00

OVa[;26" 87,55 90 0,9728 97,73 322.22" 10,00

OFa[;26" 87,55 90 0,9728 97,60 322.22" 10,00

Fa[;26" 87,55 90 0,9728 97,48 322.22" 10,00

Sa[;26" 87,55 90 0,9728 97,57 322.22" 10,00

Anexo C

216

40" ıEKFQ"EAHGKEQ"

" " Ocuuc"Ugec" ATV" Gvcpqn"" " i1N" i1N" i1N"" UA3" 0,76 - - " [;26" 0,40 - - " EN3" 0,35 - - " OquvqaD" - 167,43 - " OquvqaOV" - 174,88 - " OquvqaOF" - 164,24 - " OquvqaF" - 175,95 - " OquvqaS" - 165,30 -


UA3"


[;26"

SaH5" 6,64 8,87 59,79 DaH3" 5,83 18,55 56,01 DaH4" 6,41 17,28 56,27 EN3"DaH5" 6,24 17,81 55,26

Anexo C

217

403" [Z1U"

" Rcftçq" Tghgtípekc" Eqttgèçq" Egrc" Eqttkikfc"Fguxkq"

Tgh0"

DaUA3" 0,0448 0,04 1,119607 0,0529 2.2695" 15,41

OVaUA3" 0,0448 0,04 1,119607 0,0508 2.2676" 11,89

OFaUA3" 0,0448 0,04 1,119607 0,0539 2.26:4" 17,01

FaUA3" 0,0448 0,04 1,119607 0,0501 2.2669" 10,52

SaUA3" 0,0448 0,04 1,119607 0,0533 2.2698" 15,92

Da[;26" 0,0448 0,04 1,119607 0,0461 2.2634" 2,80

OVa[;26" 0,0448 0,04 1,119607 0,0440 2.25;5" -1,71

OFa[;26" 0,0448 0,04 1,119607 0,0470 2.2642" 4,81

Fa[;26" 0,0448 0,04 1,119607 0,0411 2.2589" -9,02

Sa[;26" 0,0448 0,04 1,119607 0,0447 2.25;;" -0,31

404" [RU"


Tgh0"

DaUA3" 0,4084 0,46 0,887741 0,4181 2.6932" 2,33

OVaUA3" 0,4084 0,46 0,887741 0,4002 2.672:" -2,04

OFaUA3" 0,4084 0,46 0,887741 0,4230 2.6987" 3,46

FaUA3" 0,4084 0,46 0,887741 0,3966 2.6689" -2,97

SaUA3" 0,4084 0,46 0,887741 0,4128 2.6872" 1,07

Da[;26" 0,4084 0,46 0,887741 0,4132 2.6876" 1,16

OVa[;26" 0,4084 0,46 0,887741 0,3885 2.6598" -5,12

OFa[;26" 0,4084 0,46 0,887741 0,4121 2.6864" 0,90

Fa[;26" 0,4084 0,46 0,887741 0,3980 2.66:6" -2,59

Sa[;26" 0,4084 0,46 0,887741 0,4187 2.6939" 2,47

Anexo C

218

405" RTQFWVKXKFAFG"


Tgh0"

DaUA3" 2,3269 2,5 0,930772 2,5299 4.93:2" 8,02

OVaUA3" 2,3269 2,5 0,930772 2,5368 4.9477" 8,27

OFaUA3" 2,3269 2,5 0,930772 2,5019 4.8:9;" 6,99

FaUA3" 2,3269 2,5 0,930772 2,5194 4.9289" 7,63

SaUA3" 2,3269 2,5 0,930772 2,4704 4.8763" 5,80

Da[;26" 2,3269 2,5 0,930772 2,5229 4.9327" 7,76

OVa[;26" 2,3269 2,5 0,930772 2,4778 4.8838" 6,07

OFa[;26" 2,3269 2,5 0,930772 2,4564 4.85;3" 5,26

Fa[;26" 2,3269 2,5 0,930772 2,5508 4.9628" 8,77

Sa[;26" 2,3269 2,5 0,930772 2,5194 4.9289" 7,63

406" EQPXGTU’Q"

" Rcftçq" Tghgtípekc"Eqttgèç

q" Egrc"Eqttkikf

c"

Fguxkq"

Tgh0"

DaUA3" 89,06 90 0,9896 94,18 ;7.39" 5,43

OVaUA3" 89,06 90 0,9896 94,12 ;7.33" 5,37

OFaUA3" 89,06 90 0,9896 93,63 ;6.84" 4,88

FaUA3" 89,06 90 0,9896 93,77 ;6.97" 5,02

SaUA3" 89,06 90 0,9896 93,98 ;6.;9" 5,23

Da[;26" 89,06 90 0,9896 94,89 ;7.::" 6,14

OVa[;26" 89,06 90 0,9896 94,75 ;7.96" 6,00

OFa[;26" 89,06 90 0,9896 94,44 ;7.66" 5,70

Fa[;26" 89,06 90 0,9896 94,69 ;7.8:" 5,94

Sa[;26" 89,06 90 0,9896 94,52 ;7.74" 5,78

Anexo C

219

50" ıEKFQ"XAP¯NKEQ"" " Ocuuc"Ugec" ATV" Gvcpqn"" " i1N" i1N" i1N"" UA3" 0,44 - - " [;26" 0,33 - - " EN3" 0,32 - - " OquvqaD" - 163,18 - " OquvqaOV" - 167,43 - " OquvqaOF" - 171,69 - " OquvqaF" - 171,69 - " OquvqaS" - 164,24 -


UA3"


[;26"

SaH5" 5,75 5,68 64,39 DaH3" 6,11 18,45 60,92 DaH4" 6,03 17,28 59,19 EN3"DaH5" 6,20 16,96 59,19

503" [ZU"

" Rcftçq" Tghgtípekc" Eqttgèçq" Egrc" Eqttkikfc" Fguxkq"

Anexo C

220

Tgh0"

DaUA3" 0,0462 0,04 1,154274 0,0428 2.2593" -7,78

OVaUA3" 0,0462 0,04 1,154274 0,0413 2.257:" -11,85

OFaUA3" 0,0462 0,04 1,154274 0,0405 2.2573" -13,89

FaUA3" 0,0462 0,04 1,154274 0,0402 2.256:" -14,87

SaUA3" 0,0462 0,04 1,154274 0,0421 2.2587" -9,59

Da[;26" 0,0462 0,04 1,154274 0,0397 2.2566" -16,38

OVa[;26" 0,0462 0,04 1,154274 0,0388 2.2558" -19,16

OFa[;26" 0,0462 0,04 1,154274 0,0372 2.2544" -24,27

Fa[;26" 0,0462 0,04 1,154274 0,0372 2.2545" -24,02

Sa[;26" 0,0462 0,04 1,154274 0,0389 2.2559" -18,72

504" [RU"


Tgh0"

DaUA3" 0,4537 0,46 0,986297 0,4359 2.663;" -4,09

OVaUA3" 0,4537 0,46 0,986297 0,4276 2.6557" -6,11

OFaUA3" 0,4537 0,46 0,986297 0,4147 2.6426" -9,41

FaUA3" 0,4537 0,46 0,986297 0,4170 2.644:" -8,79

SaUA3" 0,4537 0,46 0,986297 0,4382 2.6665" -3,53

Da[;26" 0,4537 0,46 0,986297 0,4400 2.6683" -3,10

OVa[;26" 0,4537 0,46 0,986297 0,4282 2.6564" -5,95

OFa[;26" 0,4537 0,46 0,986297 0,4111 2.638;" -10,35

Fa[;26" 0,4537 0,46 0,986297 0,4153 2.6433" -9,25

Sa[;26" 0,4537 0,46 0,986297 0,4466 2.674:" -1,59

Anexo C

221

505" RTQFWVKXKFAFG"


Tgh0"

DaUA3" 2,4903 2,5 0,996103 2,6382 4.86:7" 5,60

OVaUA3" 2,4903 2,5 0,996103 2,6759 4.8:87" 6,94

OFaUA3" 2,4903 2,5 0,996103 2,6725 4.8:52" 6,82

FaUA3" 2,4903 2,5 0,996103 2,6759 4.8:87" 6,94

SaUA3" 2,4903 2,5 0,996103 2,6931 4.9259" 7,53

Da[;26" 2,4903 2,5 0,996103 2,6312 4.8638" 5,35

OVa[;26" 2,4903 2,5 0,996103 2,6415 4.873;" 5,72

OFa[;26" 2,4903 2,5 0,996103 2,6140 4.8465" 4,73

Fa[;26" 2,4903 2,5 0,996103 2,6140 4.8465" 4,73

Sa[;26" 2,4903 2,5 0,996103 2,7000 4.9328" 7,77

506" EQPXGTU’Q"


Tgh0"

DaUA3" 88,84 90 0,9871 97,40 ;:.89" 8,79

OVaUA3" 88,84 90 0,9871 97,97 ;;.47" 9,32

OFaUA3" 88,84 90 0,9871 98,15 ;;.65" 9,49

FaUA3" 88,84 90 0,9871 97,98 ;;.48" 9,33

SaUA3" 88,84 90 0,9871 97,89 ;;.39" 9,24

Da[;26" 88,84 90 0,9871 96,23 ;9.6;" 7,68

OVa[;26" 88,84 90 0,9871 96,72 ;9.;:" 8,15

OFa[;26" 88,84 90 0,9871 97,06 ;:.55" 8,47

Fa[;26" 88,84 90 0,9871 96,35 ;9.83" 7,80

Sa[;26" 88,84 90 0,9871 96,51 ;9.98" 7,94

Anexo C

222

60" ıEKFQ"NıVKEQ"" " Ocuuc"Ugec" ATV" Gvcpqn"" " i1N" i1N" i1N"" UA3" 0,57 - - " [;26" 0,57 - - " EN3" 0,35 - - " OquvqaD" - 153,98 - " OquvqaOV" - 152,90 - " OquvqaOF" - 153,98 - " OquvqaF" - 155,07 - " OquvqaS" - 162,68 -


UA3"


[;26"

SaH5" 0,00 146,37 0,00 DaH3" 6,11 15,12 56,07 DaH4" 5,91 16,76 57,58 EN3"DaH5" 5,97 14,31 58,34

Anexo C

223

603" [ZU"


Tgh0"

DaUA3" 0,0471 0,04 1,177391 0,0440 2.2596" -6,90

OVaUA3" 0,0471 0,04 1,177391 0,0420 2.2579" -12,04

OFaUA3" 0,0471 0,04 1,177391 0,0412 2.2573" -14,09

FaUA3" 0,0471 0,04 1,177391 0,0516 2.265;" 8,83

SaUA3" 0,0471 0,04 1,177391 0,0000 2.2222" 0,00

Da[;26" 0,0471 0,04 1,177391 0,0406 2.2567" -15,86

OVa[;26" 0,0471 0,04 1,177391 0,0417 2.2576" -12,93

OFa[;26" 0,0471 0,04 1,177391 0,0398 2.255:" -18,22

Fa[;26" 0,0471 0,04 1,177391 0,0538 2.267:" 12,58

Sa[;26" 0,0471 0,04 1,177391 0,0000 2.2222" 0,00

604" [RU"


Tgh0"

DaUA3" 0,4529 0,46 0,984586 0,4615 2.68::" 1,87

OVaUA3" 0,4529 0,46 0,984586 0,4655 2.694:" 2,71

OFaUA3" 0,4529 0,46 0,984586 0,4580 2.6874" 1,12

FaUA3" 0,4529 0,46 0,984586 0,4849 2.6;48" 6,61

SaUA3" 0,4529 0,46 0,984586 0,0000 2.2222" 0,00

Da[;26" 0,4529 0,46 0,984586 0,4475 2.6768" -1,20

OVa[;26" 0,4529 0,46 0,984586 0,4341 2.6632" -4,32

OFa[;26" 0,4529 0,46 0,984586 0,4315 2.65:5" -4,96

Fa[;26" 0,4529 0,46 0,984586 0,4190 2.6479" -8,07

Sa[;26" 0,4529 0,46 0,984586 0,0000 2.2222" 0,00

Anexo C

224

605" RTQFWVKXKFAFG"


Tgh0"

DaUA3" 2,3887 2,5 0,955477 2,7219 4.:6::" 12,24

OVaUA3" 2,3887 2,5 0,955477 2,6131 4.9572" 8,59

OFaUA3" 2,3887 2,5 0,955477 2,3816 4.6;49" -0,29

FaUA3" 2,3887 2,5 0,955477 1,4486 3.7383" -64,90

SaUA3" 2,3887 2,5 0,955477 0,0000 2.2222" 0,00

Da[;26" 2,3887 2,5 0,955477 2,6342 4.9792" 9,32

OVa[;26" 2,3887 2,5 0,955477 2,2869 4.5;57" -4,45

OFa[;26" 2,3887 2,5 0,955477 2,0098 4.3257" -18,85

Fa[;26" 2,3887 2,5 0,955477 0,8838 2.;472" -170,26

Sa[;26" 2,3887 2,5 0,955477 0,0000 2.2222" 0,00

606" EQPXGTU’Q"


"Tgh0"

DaUA3" 89,61 90 0,9957 99,34 ;;.98" 9,79

OVaUA3" 89,61 90 0,9957 95,61 ;8.24" 6,27

OFaUA3" 89,61 90 0,9957 88,53 ::.;4" -1,22

FaUA3" 89,61 90 0,9957 51,84 74.28" -72,87

SaUA3" 89,61 90 0,9957 2,94 4.;7" -2949,68

Da[;26" 89,61 90 0,9957 99,27 ;;.92" 9,73

OVa[;26" 89,61 90 0,9957 90,18 ;2.79" 0,63

OFa[;26" 89,61 90 0,9957 80,16 :2.72" -11,80

Fa[;26" 89,61 90 0,9957 37,11 59.49" -141,47

Sa[;26" 89,61 90 0,9957 1,19 3.42" -7405,94

Anexo C

225

70" ıEKFQ"UKT¯PIKEQ"" " Ocuuc"Ugec" ATV" Gvcpqn"" " i1N" i1N" i1N"" UA3" 0,34 - - " [;26" 0,53 - - " EN3" 0,39 - - " OquvqaD" - 143,80 - " OquvqaOV" - 143,80 - " OquvqaOF" - 143,80 - " OquvqaF" - 143,80 - " OquvqaS" - 143,80 -


UA3"


[;26"

SaH5" 4,42 22,72 52,15 DaH3" 4,54 23,27 51,64 DaH4" 4,66 21,53 54,97 EN3"DaH5" 4,65 22,29 53,43

Anexo C

226

"

703" [Z1U"


Tgh0"

DaUA3" 0,0417 0,04 1,042634 0,0422 2.2627" 1,16

OVaUA3" 0,0417 0,04 1,042634 0,0410 2.25;5" -1,71

OFaUA3" 0,0417 0,04 1,042634 0,0408 2.25;4" -2,15

FaUA3" 0,0417 0,04 1,042634 0,0411 2.25;7" -1,36

SaUA3" 0,0417 0,04 1,042634 0,0416 2.25;;" -0,35

Da[;26" 0,0417 0,04 1,042634 0,0383 2.2589" -9,00

OVaUA3" 0,0417 0,04 1,042634 0,0378 2.2584" -10,35

OFaUA3" 0,0417 0,04 1,042634 0,0375 2.2582" -11,24

Fa[;26" 0,0417 0,04 1,042634 0,0385 2.258;" -8,45

Sa[;26" 0,0417 0,04 1,042634 0,0400 2.25:6" -4,18

704" [RU"


Tgh0"

DaUA3" 0,4856 0,46 1,055674 0,4864 2.6829" 0,16

OVaUA3" 0,4856 0,46 1,055674 0,4772 2.6742" -1,76

OFaUA3" 0,4856 0,46 1,055674 0,4780 2.674:" -1,59

FaUA3" 0,4856 0,46 1,055674 0,4779 2.6749" -1,61

SaUA3" 0,4856 0,46 1,055674 0,5012 2.696:" 3,11

Da[;26" 0,4856 0,46 1,055674 0,4938 2.6899" 1,65

OVaUA3" 0,4856 0,46 1,055674 0,4650 2.6627" -4,42

OFaUA3" 0,4856 0,46 1,055674 0,4632 2.65:9" -4,85

Fa[;26" 0,4856 0,46 1,055674 0,4865 2.682:" 0,18

Sa[;26" 0,4856 0,46 1,055674 0,4919 2.6882" 1,28

Anexo C

227

705" RTQFWVKXKFAFG"


Tgh0"

DaUA3" 2,2228 2,5 0,889131 2,3364 4.849:" 4,86

OVaUA3" 2,2228 2,5 0,889131 2,3826 4.89;9" 6,71

OFaUA3" 2,2228 2,5 0,889131 2,3116 4.7;;:" 3,84

FaUA3" 2,2228 2,5 0,889131 2,3080 4.7;7:" 3,69

SaUA3" 2,2228 2,5 0,889131 2,3080 4.7;7:" 3,69

Da[;26" 2,2228 2,5 0,889131 2,3329 4.845:" 4,72

OVaUA3" 2,2228 2,5 0,889131 2,2370 4.7382" 0,63

OFaUA3" 2,2228 2,5 0,889131 2,1980 4.6942" -1,13

Fa[;26" 2,2228 2,5 0,889131 2,2725 4.777;" 2,19

Sa[;26" 2,2228 2,5 0,889131 2,2370 4.7382" 0,63

706" EQPXGTU’Q"


Tgh0"

DaUA3" 83,81 90 0,9312 87,60 ;6.29" 4,33

OVaUA3" 83,81 90 0,9312 90,96 ;9.8:" 7,86

OFaUA3" 83,81 90 0,9312 88,29 ;6.:3" 5,08

FaUA3" 83,81 90 0,9312 88,04 ;6.77" 4,81

SaUA3" 83,81 90 0,9312 84,29 ;2.74" 0,57

Da[;26" 83,81 90 0,9312 86,37 ;4.97" 2,96

OVaUA3" 83,81 90 0,9312 87,80 ;6.4;" 4,55

OFaUA3" 83,81 90 0,9312 86,88 ;5.52" 3,53

Fa[;26" 83,81 90 0,9312 85,42 ;3.95" 1,89

Sa[;26" 83,81 90 0,9312 83,36 :;.74" -0,54

Anexo C

228

80" ıEKFQ"RKTðXKEQ"" " Ocuuc"Ugec" ATV" Gvcpqn"" " i1N" i1N" i1N"" UA3" 1,80 - - " [;26" 0,50 - - " EN3" 0,30 - - " OquvqaD" - 151,74 - " OquvqaOV" - 151,74 - " OquvqaOF" - 151,74 - " OquvqaF" - 151,74 - " OquvqaS" - 151,74 -


UA3"


[;26"

SaH5" 5,69 1,53 67,03 DaH3" 5,47 9,42 62,94 DaH4" 5,53 9,16 60,89 EN3"DaH5" 5,50 9,42 63,96

Anexo C

229

"

803" [ZU"


Tgh0"

DaUA3" 0,0420 0,04 1,049365 0,04548 2.2655" 7,72

OVaUA3" 0,0420 0,04 1,049365 0,04185 2.25;;" -0,30

OFaUA3" 0,0420 0,04 1,049365 0,04325 2.2634" 2,95

FaUA3" 0,0420 0,04 1,049365 0,04156 2.25;8" -1,01

SaUA3" 0,0420 0,04 1,049365 0,03703 2.2575" -13,34

Da[;26" 0,0420 0,04 1,049365 0,04470 2.2648" 6,09

OVaUA3" 0,0420 0,04 1,049365 0,04303 2.2632" 2,44

OFaUA3" 0,0420 0,04 1,049365 0,04510 2.2652" 6,93

Fa[;26" 0,0420 0,04 1,049365 0,04310 2.2633" 2,61

Sa[;26" 0,0420 0,04 1,049365 0,04127 2.25;5" -1,70

804" [RU"


Tgh0"

DaUA3" 0,4801 0,46 1,043643 0,50000 2.69;3" 3,98

OVaUA3" 0,4801 0,46 1,043643 0,48878 2.68:5" 1,78

OFaUA3" 0,4801 0,46 1,043643 0,49885 2.69:2" 3,76

FaUA3" 0,4801 0,46 1,043643 0,49340 2.694:" 2,70

SaUA3" 0,4801 0,46 1,043643 0,50717 2.6:82" 5,34

Da[;26" 0,4801 0,46 1,043643 0,49849 2.6998" 3,69

OVaUA3" 0,4801 0,46 1,043643 0,48639 2.6883" 1,30

OFaUA3" 0,4801 0,46 1,043643 0,49552 2.696:" 3,12

Fa[;26" 0,4801 0,46 1,043643 0,48451 2.6865" 0,92

Sa[;26" 0,4801 0,46 1,043643 0,48653 2.6884" 1,33

Anexo C

230

805" RTQFWVKXKFAFG"


Tgh0"

DaUA3" 2,6083 2,5 1,043309 2,87447 4.9773" 9,26

OVaUA3" 2,6083 2,5 1,043309 2,83898 4.9433" 8,13

OFaUA3" 2,6083 2,5 1,043309 2,89222 4.9944" 9,82

FaUA3" 2,6083 2,5 1,043309 2,86737 4.96:5" 9,04

SaUA3" 2,6083 2,5 1,043309 2,94546 4.:454" 11,45

Da[;26" 2,6083 2,5 1,043309 2,59053 4.6:52" -0,69

OVaUA3" 2,6083 2,5 1,043309 2,76089 4.8685" 5,53

OFaUA3" 2,6083 2,5 1,043309 2,80703 4.8;27" 7,08

Fa[;26" 2,6083 2,5 1,043309 2,79994 4.8:59" 6,85

Sa[;26" 2,6083 2,5 1,043309 2,81413 4.8;95" 7,32

806" EQPXGTU’Q"


Tgh0"

DaUA3" 93,64 90 1,0404 98,63 ;6.:2" 5,06

OVaUA3" 93,64 90 1,0404 99,44 ;7.79" 5,83

OFaUA3" 93,64 90 1,0404 99,33 ;7.69" 5,73

FaUA3" 93,64 90 1,0404 99,43 ;7.79" 5,82

SaUA3" 93,64 90 1,0404 99,35 ;7.6:" 5,74

Da[;26" 93,64 90 1,0404 89,52 :8.26" -4,61

OVaUA3" 93,64 90 1,0404 97,42 ;5.86" 3,88

OFaUA3" 93,64 90 1,0404 97,21 ;5.65" 3,67

Fa[;26" 93,64 90 1,0404 99,07 ;7.44" 5,48

Sa[;26" 93,64 90 1,0404 99,12 ;7.49" 5,53

Anexo C

231

"90" ıEKFQ"AEÖVKEQ"

" " Ocuuc"Ugec" ATV" Gvcpqn"" " i1N" i1N" i1N"" UA3" 0,33 - - " [;26" 0,42 - - " EN3" 0,33 - - " Oquvqa2.22" - 146,84 - " Oquvqa2.47" - 146,84 - " Oquvqa2.72" - 146,84 - " Oquvqa2.97" - 146,84 - " Oquvqa3.22" - 146,84 -

2.22aH3" 5,69 10,04 59,05 2.22aH4" 5,72 7,93 53,20 2.22aH5" 5,95 9,51 61,34 2.47aH3" 5,25 19,55 49,89 2.47aH4" 5,32 17,17 52,44 2.47aH5" 5,23 17,70 53,71 2.72aH3" 5,13 21,39 49,13 2.72aH4" 5,15 21,66 52,95 2.72aH5" 5,15 21,39 52,44 2.97aH3" 4,90 22,71 47,86 2.97aH4" 4,92 21,92 52,69 2.97aH5" 4,94 21,13 54,98 3.22aH3" 4,69 20,07 50,66 3.22aH4" 4,64 21,66 52,69

UA3"

3.22aH5" 4,66 21,39 52,69 2.22aH3" 5,50 7,66 58,29 2.22aH4" 5,55 5,81 56,25 2.22aH5" 5,65 5,02 60,07 2.47aH3" 5,51 7,66 54,47 2.47aH4" 5,71 6,61 57,52 2.47aH5" 6,58 2,38 61,34 2.72aH3" 5,36 8,98 54,47 2.72aH4" 0,00 1,85 1,56 2.72aH5" 5,39 9,77 54,47 2.97aH3" 5,31 8,72 51,67 2.97aH4" 5,15 8,98 54,73 2.97aH5" 5,34 8,45 57,02 3.22aH3" 4,95 9,25 56,25 3.22aH4" 5,08 8,45 54,47

[;26"

3.22aH5" 4,95 9,25 57,02 2.22aH3" 5,68 8,72 52,18 2.22aH4" 5,59 8,98 57,02 EN3"2.22aH5" 5,66 8,19 57,27

Anexo C

232

903" [ZU"


2.22aUA3" 0,0445 0,04 1,111725 0,04578 2.2634" 2,86

2.47aUA3" 0,0445 0,04 1,111725 0,04493 2.2626" 1,04

2.72aUA3" 0,0445 0,04 1,111725 0,04518 2.2628" 1,58

2.97aUA3" 0,0445 0,04 1,111725 0,04335 2.25;2" -2,58

3.22aUA3" 0,0445 0,04 1,111725 0,04074 2.2588" -9,16

2.22a[;26" 0,0445 0,04 1,111725 0,04291 2.25:8" -3,62

2.47a[;26" 0,0445 0,04 1,111725 0,04554 2.2632" 2,36

2.72a[;26" 0,0445 0,04 1,111725 0,04256 2.25:5" -4,48

2.97a[;26" 0,0445 0,04 1,111725 0,04143 2.2595" -7,35

3.22a[;26" 0,0445 0,04 1,111725 0,03936 2.2576" -12,97

904" [RU"


2.22aUA3" 0,4398 0,46 0,956023 0,46022 2.6:36" 4,44

2.47aUA3" 0,4398 0,46 0,956023 0,44655 2.6893" 1,52

2.72aUA3" 0,4398 0,46 0,956023 0,45514 2.6983" 3,38

2.97aUA3" 0,4398 0,46 0,956023 0,45930 2.6:26" 4,25

3.22aUA3" 0,4398 0,46 0,956023 0,45741 2.69:6" 3,86

2.22a[;26" 0,4398 0,46 0,956023 0,45178 2.6948" 2,66

2.47a[;26" 0,4398 0,46 0,956023 0,44683 2.6896" 1,58

2.72a[;26" 0,4398 0,46 0,956023 0,43471 2.6769" -1,16

2.97a[;26" 0,4398 0,46 0,956023 0,43193 2.673:" -1,82

3.22a[;26" 0,4398 0,46 0,956023 0,44431 2.6869" 1,02

Anexo C

233

905" RTQFWVKXKFAFG"


2.22aUA3" 2,3121 2,5 0,92483 2,41101 4.8292" 4,10

2.47aUA3" 2,3121 2,5 0,92483 2,16721 4.5656" -6,68

2.72aUA3" 2,3121 2,5 0,92483 2,14601 4.5426" -7,74

2.97aUA3" 2,3121 2,5 0,92483 2,16014 4.5579" -7,03

3.22aUA3" 2,3121 2,5 0,92483 2,16721 4.5656" -6,68

2.22a[;26" 2,3121 2,5 0,92483 2,42514 4.8445" 4,66

2.47a[;26" 2,3121 2,5 0,92483 2,40747 4.8254" 3,96

2.72a[;26" 2,3121 2,5 0,92483 2,26968 4.6764" -1,87

2.97a[;26" 2,3121 2,5 0,92483 2,26968 4.6764" -1,87

3.22a[;26" 2,3121 2,5 0,92483 2,32974 4.73;3" 0,76

906" EQPXGTU’Q"


2.22aUA3" 93,90 90 1,0434 93,54 :;.87" -0,39

2.47aUA3" 93,90 90 1,0434 87,12 :5.72" -7,78

2.72aUA3" 93,90 90 1,0434 84,73 :3.43" -10,82

2.97aUA3" 93,90 90 1,0434 84,43 :2.;4" -11,22

3.22aUA3" 93,90 90 1,0434 85,06 :3.75" -10,39

2.22a[;26" 93,90 90 1,0434 95,66 ;3.8:" 1,83

2.47a[;26" 93,90 90 1,0434 96,08 ;4.2;" 2,27

2.72a[;26" 93,90 90 1,0434 93,37 :;.6;" -0,57

2.97a[;26" 93,90 90 1,0434 93,84 :;.;6" -0,07

3.22a[;26" 93,90 90 1,0434 93,66 :;.98" -0,27

Anexo C

234

:0" ıEKFQ"DWV¯TKEQ"" " Ocuuc"Ugec" ATV" Gvcpqn"" " i1N" i1N" i1N"" UA3" 0,78 - - " [;26" 0,36 - - " EN3" 0,73 - - " Oquvqa2.22" - 160,09 - " Oquvqa2.47" - 160,09 - " Oquvqa2.72" - 160,09 - " Oquvqa2.97" - 160,09 - " Oquvqa3.22" - 160,09 -

2.22aH3" 6,34 3,60 66,45 2.22aH4" 6,48 3,75 65,43 2.22aH5" 6,63 2,03 61,83 2.47aH3" 5,49 1,20 65,94 2.47aH4" 5,55 1,23 66,45 2.47aH5" 5,64 1,14 66,20 2.72aH3" 4,62 4,47 64,40 2.72aH4" 4,68 -0,03 49,51 2.72aH5" 4,72 3,06 67,22 2.97aH3" 4,06 10,16 62,34 2.97aH4" 4,00 9,39 64,40 2.97aH5" 4,07 8,00 64,14 3.22aH3" 3,56 17,35 61,83 3.22aH4" 3,53 15,63 59,52

UA3"


[;26"

3.22aH5" 3,09 10,40 65,17 2.22aH3" 6,09 12,85 60,29 2.22aH4" 6,04 13,52 59,52 EN3"2.22aH5" 6,03 13,23 57,98

Anexo C

235

:03" [ZU"

" Rcftçq"Tghgtípek

c" Eqttgèçq" Egrc" Eqttkikfc"Fguxkq"

Tgh0"

2.22aUA3" 0,0446 0,04 1,114945 0,04437 2.25;:" -0,52

2.47aUA3" 0,0446 0,04 1,114945 0,03744 2.2558" -19,12

2.72aUA3" 0,0446 0,04 1,114945 0,03166 2.24:6" -40,88

2.97aUA3" 0,0446 0,04 1,114945 0,02864 2.2479" -55,71

3.22aUA3" 0,0446 0,04 1,114945 0,02650 2.245:" -68,32

2.22a[;26" 0,0446 0,04 1,114945 0,04221 2.259;" -5,65

2.47a[;26" 0,0446 0,04 1,114945 0,03208 2.24::" -39,02

2.72a[;26" 0,0446 0,04 1,114945 0,02599 2.2455" -71,62

2.97a[;26" 0,0446 0,04 1,114945 0,02421 2.2439" -84,24

3.22a[;26" 0,0446 0,04 1,114945 0,02245 2.2423" -98,67

:04" [RU"



Tgh0"

2.22aUA3" 0,4415 0,46 0,959778 0,44710 2.687:" 1,25

2.47aUA3" 0,4415 0,46 0,959778 0,45155 2.6927" 2,23

2.72aUA3" 0,4415 0,46 0,959778 0,41619 2.6558" -6,08

2.97aUA3" 0,4415 0,46 0,959778 0,45934 2.69:8" 3,88

3.22aUA3" 0,4415 0,46 0,959778 0,46149 2.6:2:" 4,33

2.22a[;26" 0,4415 0,46 0,959778 0,47991 2.7222" 8,00

2.47a[;26" 0,4415 0,46 0,959778 0,45177 2.6929" 2,27

2.72a[;26" 0,4415 0,46 0,959778 0,48663 2.7292" 9,27

2.97a[;26" 0,4415 0,46 0,959778 0,47314 2.6;52" 6,69

3.22a[;26" 0,4415 0,46 0,959778 0,46823 2.6:9:" 5,71

Anexo C

236

:05" RTQFWVKXKFAFG"



Tgh0"

2.22aUA3" 2,4693 2,5 0,987724 2,69044 4.945;" 8,22

2.47aUA3" 2,4693 2,5 0,987724 2,75821 4.9;47" 10,47

2.72aUA3" 2,4693 2,5 0,987724 2,51568 4.768;" 1,84

2.97aUA3" 2,4693 2,5 0,987724 2,65121 4.8:64" 6,86

3.22aUA3" 2,4693 2,5 0,987724 2,50498 4.7583" 1,42

2.22a[;26" 2,4693 2,5 0,987724 2,72611 4.9822" 9,42

2.47a[;26" 2,4693 2,5 0,987724 2,76891 4.:255" 10,82

2.72a[;26" 2,4693 2,5 0,987724 2,97577 5.234:" 17,02

2.97a[;26" 2,4693 2,5 0,987724 2,84024 4.:977" 13,06

3.22a[;26" 2,4693 2,5 0,987724 2,66904 4.9244" 7,48

:06" EQPXGTU’Q"



"Tgh0"

2.22aUA3" 91,46 90 1,0162 97,99 ;8.64" 6,66

2.47aUA3" 91,46 90 1,0162 99,24 ;9.87" 7,83

2.72aUA3" 91,46 90 1,0162 98,39 ;8.:4" 7,04

2.97aUA3" 91,46 90 1,0162 94,08 ;4.7:" 2,78

3.22aUA3" 91,46 90 1,0162 88,80 :9.5:" -3,00

2.22a[;26" 91,46 90 1,0162 92,92 ;3.66" 1,57

2.47a[;26" 91,46 90 1,0162 99,42 ;9.:5" 8,01

2.72a[;26" 91,46 90 1,0162 99,19 ;9.82" 7,79

2.97a[;26" 91,46 90 1,0162 97,44 ;7.::" 6,13

3.22a[;26" 91,46 90 1,0162 92,91 ;3.64" 1,56

Anexo C

237

;0" ıEKFQ"HłTOKEQ"" " Ocuuc"Ugec" ATV" Gvcpqn"" " i1N" i1N" i1N"" UA3" 1,29 - - " [;26" 0,42 - - " EN3" 0,37 - - " Oquvqa2.22" - 161,84 - " Oquvqa2.47" - 161,84 - " Oquvqa2.72" - 161,84 - " Oquvqa2.97" - 161,84 - " Oquvqa3.22" - 161,84 -


UA3"


[;26"

3.22aH5" 0,00 0,00 0,00 2.22aH3" 5,76 10,74 62,96 2.22aH4" 5,64 10,90 62,44 EN3"2.22aH5" 0,00 0,00 0,00

Anexo C

238

;03" [ZU"



Tgh0"

2.22aUA3" 0,0408 0,04 1,021176 0,04065 2.25;:" -0,48

2.47aUA3" 0,0408 0,04 1,021176 0,03583 2.2573" -14,01

2.72aUA3" 0,0408 0,04 1,021176 0,03192 2.2535" -27,96

2.97aUA3" 0,0408 0,04 1,021176 0,04948 2.26:7" 17,46

3.22aUA3" 0,0408 0,04 1,021176 0,04677 2.267:" 12,66

2.22a[;26" 0,0408 0,04 1,021176 0,03949 2.25:9" -3,44

2.47a[;26" 0,0408 0,04 1,021176 0,03581 2.2573" -14,06

2.72a[;26" 0,0408 0,04 1,021176 0,03438 2.2559" -18,80

2.97a[;26" 0,0408 0,04 1,021176 0,03654 2.257:" -11,79

3.22a[;26" 0,0408 0,04 1,021176 0,05376 2.2748" 24,02

;04" [RU"



Tgh0"

2.22aUA3" 0,4523 0,46 0,983153 0,45194 2.67;9" -0,07

2.47aUA3" 0,4523 0,46 0,983153 0,46237 2.6925" 2,19

2.72aUA3" 0,4523 0,46 0,983153 0,46449 2.6946" 2,63

2.97aUA3" 0,4523 0,46 0,983153 0,47902 2.6:94" 5,59

3.22aUA3" 0,4523 0,46 0,983153 0,44596 2.6758" -1,41

2.22a[;26" 0,4523 0,46 0,983153 0,46970 2.6999" 3,72

2.47a[;26" 0,4523 0,46 0,983153 0,45482 2.6848" 0,57

2.72a[;26" 0,4523 0,46 0,983153 0,46455 2.6947" 2,65

2.97a[;26" 0,4523 0,46 0,983153 0,46390 2.693;" 2,51

3.22a[;26" 0,4523 0,46 0,983153 0,12016 2.3444" -276,36

Anexo C

239

;05" RTQFWVKXKFAFG"



Tgh0"

2.22aUA3" 2,6124 2,5 1,044968 2,80161 4.8:32" 6,75

2.47aUA3" 2,6124 2,5 1,044968 2,86345 4.9624" 8,77

2.72aUA3" 2,6124 2,5 1,044968 2,84163 4.93;5" 8,07

2.97aUA3" 2,6124 2,5 1,044968 2,20495 4.3323" -18,48

3.22aUA3" 2,6124 2,5 1,044968 0,78606 2.9744" -232,34

2.22a[;26" 2,6124 2,5 1,044968 2,77614 4.8789" 5,90

2.47a[;26" 2,6124 2,5 1,044968 2,79797 4.8998" 6,63

2.72a[;26" 2,6124 2,5 1,044968 2,87801 4.9764" 9,23

2.97a[;26" 2,6124 2,5 1,044968 2,42324 4.53;2" -7,81

3.22a[;26" 2,6124 2,5 1,044968 0,07833 2.2972" -3235,22

;06" EQPXGTU’Q"



"Tgh0"

2.22aUA3" 93,10 90 1,0345 99,18 ;7.:9" 6,13

2.47aUA3" 93,10 90 1,0345 99,31 ;8.22" 6,25

2.72aUA3" 93,10 90 1,0345 98,17 ;6.;2" 5,16

2.97aUA3" 93,10 90 1,0345 75,24 94.95" -23,74

3.22aUA3" 93,10 90 1,0345 30,38 4;.59" -206,46

2.22a[;26" 93,10 90 1,0345 95,16 ;3.;;" 2,17

2.47a[;26" 93,10 90 1,0345 98,71 ;7.64" 5,68

2.72a[;26" 93,10 90 1,0345 99,24 ;7.;5" 6,18

2.97a[;26" 93,10 90 1,0345 84,88 :4.27" -9,69

3.22a[;26" 93,10 90 1,0345 8,86 :.79" -950,74

Anexo C

240

320" ıEKFQ"JOH"" " Ocuuc"Ugec" ATV" Gvcpqn"" " i1N" i1N" i1N"" UA3" 0,37 - - " [;26" 0,65 - - " EN3" 0,29 - - " Oquvqa2.22" - 157,04 - " Oquvqa2.72" - 157,04 - " Oquvqa3.22" - 157,04 - " Oquvqa3.72" - 157,04 - " Oquvqa4.22" - 157,04 -


UA3"


[;26"

4.22aH5" 4,48 60,42 37,69 2.22aH3" 5,52 9,16 63,61 2.22aH4" 5,89 5,49 65,46 EN3"2.22aH5" 5,50 8,91 64,41

Anexo C

241

3203" [ZU"



Tgh0"

2.22aUA3" 0,0409 0,04 1,022602 0,04274 2.263:" 4,29

2.72aUA3" 0,0409 0,04 1,022602 0,04452 2.2657" 8,13

3.22aUA3" 0,0409 0,04 1,022602 0,05224 2.2733" 21,70

3.72aUA3" 0,0409 0,04 1,022602 0,06508 2.2858" 37,15

4.22aUA3" 0,0409 0,04 1,022602 0,06023 2.27:;" 32,09

2.22a[;26" 0,0409 0,04 1,022602 0,03557 2.256:" -15,00

2.72a[;26" 0,0409 0,04 1,022602 0,03734 2.2587" -9,55

3.22a[;26" 0,0409 0,04 1,022602 0,04149 2.2628" 1,42

3.72a[;26" 0,0409 0,04 1,022602 0,04651 2.2677" 12,06

4.22a[;26" 0,0409 0,04 1,022602 0,05352 2.2745" 23,57

3204" [RU"



Tgh0"

2.22aUA3" 0,4704 0,46 1,022701 0,48476 2.6962" 2,95

2.72aUA3" 0,4704 0,46 1,022701 0,46370 2.6756" -1,45

3.22aUA3" 0,4704 0,46 1,022701 0,46307 2.674:" -1,59

3.72aUA3" 0,4704 0,46 1,022701 0,43395 2.6465" -8,41

4.22aUA3" 0,4704 0,46 1,022701 0,31092 2.5262" -51,31

2.22a[;26" 0,4704 0,46 1,022701 0,46369 2.6756" -1,46

2.72a[;26" 0,4704 0,46 1,022701 0,46669 2.6785" -0,80

3.22a[;26" 0,4704 0,46 1,022701 0,47070 2.6825" 0,05

3.72a[;26" 0,4704 0,46 1,022701 0,46334 2.6753" -1,53

4.22a[;26" 0,4704 0,46 1,022701 0,45793 2.669:" -2,73

Anexo C

242

3205" RTQFWVKXKFAFG"



Tgh0"

2.22aUA3" 2,6873 2,5 1,074911 2,81952 4.8452" 4,69

2.72aUA3" 2,6873 2,5 1,074911 2,68728 4.7222" 0,00

3.22aUA3" 2,6873 2,5 1,074911 1,83135 3.9259" -46,74

3.72aUA3" 2,6873 2,5 1,074911 0,68889 2.862;" -290,09

4.22aUA3" 2,6873 2,5 1,074911 0,22603 2.4325" -1088,89

2.22a[;26" 2,6873 2,5 1,074911 2,62483 4.663;" -2,38

2.72a[;26" 2,6873 2,5 1,074911 2,58809 4.6299" -3,83

3.22a[;26" 2,6873 2,5 1,074911 2,43013 4.482:" -10,58

3.72a[;26" 2,6873 2,5 1,074911 2,07748 3.;549" -29,35

4.22a[;26" 2,6873 2,5 1,074911 1,59625 3.6:72" -68,35

3206" EQPXGTU’Q"



"Tgh0"

2.22aUA3" 94,84 90 1,0538 96,55 ;3.84" 1,76

2.72aUA3" 94,84 90 1,0538 96,28 ;3.59" 1,50

3.22aUA3" 94,84 90 1,0538 67,19 85.98" -41,16

3.72aUA3" 94,84 90 1,0538 27,74 48.55" -241,87

4.22aUA3" 94,84 90 1,0538 12,92 34.48" -633,87

2.22a[;26" 94,84 90 1,0538 94,20 :;.5;" -0,68

2.72a[;26" 94,84 90 1,0538 92,43 :9.93" -2,61

3.22a[;26" 94,84 90 1,0538 86,45 :4.26" -9,71

3.72a[;26" 94,84 90 1,0538 75,65 93.9;" -25,37

4.22a[;26" 94,84 90 1,0538 59,53 78.6;" -59,31

243

APGZQ"F"

"""""""

"30 ıekfq"Aeêvkeq 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 467

1.1 SA1 ....................................................................................................... 245

1.2 Y904...................................................................................................... 245

40 ıekfq"Dwvîtkeq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 468

2.1 SA1 ....................................................................................................... 246

2.2 Y904...................................................................................................... 246

50 ıekfq"Iânkeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 469

3.1 SA1 ....................................................................................................... 247

3.2 Y904...................................................................................................... 247

60 ıekfq"Nâvkeq000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 46:

4.1 SA1 ....................................................................................................... 248

4.2 Y904...................................................................................................... 248

70 ıekfq"Hôtokeq 00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 46;

5.1 SA1 ....................................................................................................... 249

5.2 Y904...................................................................................................... 249

80 JOH 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 472

6.1 SA1 ....................................................................................................... 250

6.2 Y904...................................................................................................... 250

Anexo D

245

30" ıEKFQ"AEÖVKEQ"

303" "UA3"

Tgekenq" T3" T4" T5" T6" T7" T8" T9" T:"

ATV"*i1N+" 1,16 0,87 0,86 0,86 0,98 1,04 1,18 1,28

Gvcpqn"*i1N+" 78,97 81,67 82,34 80,74 83,77 83,18 83,43 84,36

Ocuuc"Egnwnct"*i1N+"

1,26 1,44 1,63 1,76 1,91 1,91 1,97 1,89

[z1u"*i1i+" 0,0245 0,0168 0,0180 0,0174 0,0163 0,0116 0,0139 0,0073

[r1u"*i1i+" 0,3970 0,4030 0,4023 0,3999 0,4085 0,4053 0,4066 0,4566

Rtqf0"*igvcpqn1*N0j++"

7,7005 7,8347 7,8161 7,6289 7,8940 7,7934 7,8073 8,8056

Eqpuwoq"ATV"*'+"

99,41 99,56 99,56 99,55 99,49 99,46 99,39 99,34

Xkcdknkfcfg"*'+" 83,10 78,74 74,16 72,88 61,29 74,63 66,97 57,99

304" [;26"


ATV"*i1N+" 2,10 0,76 0,74 0,76 0,87 0,84 0,83 0,83

Gvcpqn"*i1N+" 78,13 80,57 81,41 82,00 80,15 80,74 83,10 82,42


1,11 1,33 1,51 1,61 1,80 1,79 1,84 1,81

[z1u"*i1i+" 0,0217 0,0177 0,0168 0,0137 0,0189 0,0103 0,0131 0,0096

[r1u"*i1i+" 0,3966 0,3989 0,3999 0,4010 0,3918 0,3950 0,4051 0,3997


7,6320 7,7638 7,7634 7,7828 7,5612 7,6126 7,8212 7,7316

Eqpuwoq"ATV"*'+"

98,92 99,61 99,62 99,61 99,55 99,56 99,57 99,57

Xkcdknkfcfg"*'+" 83,10 78,74 74,16 72,88 62,93 73,43 53,54 65,97

Anexo D

246

40" ıEKFQ"DWV¯TKEQ"

403" UA3"


ATV"*i1N+" 10,84 2,17 1,49 1,27 1,19 1,86 1,63 2,13

Gvcpqn"*i1N+" 64,40 75,58 77,36 77,27 84,02 82,78 83,84 82,78


0,81 0,89 0,97 1,05 1,06 1,06 1,05 1,08

[z1u"*i1i+" 0,0101 0,0087 0,0096 0,0105 0,0061 0,0063 0,0085 0,0078

[r1u"*i1i+" 0,3503 0,3878 0,3932 0,3960 0,4223 0,4158 0,4214 0,4150


6,3031 7,3683 7,4718 7,4221 8,0714 7,9018 7,9873 7,8606

Eqpuwoq"ATV"*'+"

94,32 98,87 99,22 99,33 99,38 99,03 99,15 98,89

Xkcdknkfcfg"*'+" 84,06 89,81 81,55 81,25 73,27 81,07 78,05 71,04

404" [;26"


ATV"*i1N+" 17,76 2,06 1,26 1,02 1,05 1,36 1,97 3,02

Gvcpqn"*i1N+" 60,04 73,99 80,11 83,75 82,95 81,62 82,95 77,89


0,74 0,86 0,93 1,03 1,04 1,05 1,04 1,10

[z1u"*i1i+" 0,0117 0,0101 0,0093 0,0105 0,0060 0,0068 0,0079 0,0088

[r1u"*i1i+" 0,3423 0,3813 0,4074 0,4244 0,4174 0,4149 0,4221 0,3960


5,8773 7,2371 7,7639 8,0739 7,9586 7,8283 7,9517 7,4230

Eqpuwoq"ATV"*'+"

90,63 98,93 99,34 99,47 99,45 99,29 98,96 98,42

Xkcdknkfcfg"*'+" 85,85 92,99 84,24 78,83 70,73 70,30 62,44 49,26

Anexo D

247

50" ıEKFQ"IıNKEQ"

503" UA3"


ATV"*i1N+" 13,74 5,50 2,46 1,10 0,90 1,18 0,91 1,25

Gvcpqn"*i1N+" 69,88 75,29 77,65 79,68 81,45 77,99 78,07 79,26


1,17 1,52 1,77 1,96 2,13 2,18 2,27 2,23

[z1u"*i1i+" 0,0264 0,0274 0,0238 0,0205 0,0200 0,0164 0,0182 0,0118

[r1u"*i1i+" 0,4053 0,4083 0,4113 0,4141 0,4173 0,3970 0,3970 0,4051


6,8267 7,2394 7,3739 7,5069 7,6110 7,2227 7,2312 7,3367

Eqpuwoq"ATV"*'+"

92,46 96,99 98,65 99,40 99,51 99,36 99,50 99,31

Xkcdknkfcfg"*'+" 82,63 69,42 59,43 56,14 54,35 43,44 50,24 36,11

504" [;26"


ATV"*i1N+" 13,98 1,07 0,76 0,69 0,70 0,70 0,73 0,72

Gvcpqn"*i1N+" 67,60 76,38 77,90 80,18 80,61 78,16 78,66 77,14


1,14 1,53 1,79 1,99 2,14 2,24 2,25 2,21

[z1u"*i1i+" 0,0331 0,0276 0,0243 0,0220 0,0199 0,0173 0,0140 0,0119

[r1u"*i1i+" 0,3953 0,4039 0,4088 0,4150 0,4125 0,3964 0,3974 0,3918


6,5973 7,3682 7,3956 7,5427 7,5105 7,2305 7,2680 7,1138

Eqpuwoq"ATV"*'+"

92,28 99,42 99,58 99,62 99,62 99,62 99,60 99,60

Xkcdknkfcfg"*'+" 92,50 84,69 75,56 78,54 79,08 80,09 72,05 79,34

Anexo D

248

60" ıEKFQ"NıVKEQ"

603" UA3"


ATV"*i1N+" 1,44 1,35 1,32 1,24 1,18 1,15 1,34 1,20

Gvcpqn"*i1N+" 77,43 78,52 79,45 79,87 80,88 80,21 81,55 78,27


1,19 1,41 1,59 1,67 1,89 1,94 2,04 2,07

[z1u"*i1i+" 0,0293 0,0177 0,0172 0,0134 0,0209 0,0135 0,0162 0,0142

[r1u"*i1i+" 0,3888 0,3829 0,3853 0,3933 0,3948 0,3898 0,3966 0,3786


7,6041 7,5249 7,5581 7,5780 7,6212 7,4942 7,6385 7,2224

Eqpuwoq"ATV"*'+"

99,27 99,32 99,33 99,36 99,39 99,40 99,31 99,38

Xkcdknkfcfg"*'+" 85,29 59,91 71,29 62,98 55,60 67,65 50,00 63,73

604" [;26"


ATV"*i1N+" 2,36 1,41 1,34 1,14 1,11 1,13 1,20 1,22

Gvcpqn"*i1N+" 75,08 80,80 79,03 78,95 80,12 80,63 82,06 76,67


1,24 1,53 1,73 1,83 2,00 2,12 2,19 2,24

[z1u"*i1i+" 0,0345 0,0213 0,0208 0,0139 0,0190 0,0171 0,0163 0,0147

[r1u"*i1i+" 0,3790 0,3940 0,3901 0,3859 0,3900 0,3881 0,3984 0,3669


7,3753 7,7380 7,5055 7,4682 7,5358 7,5305 7,6786 7,0778

Eqpuwoq"ATV"*'+"

98,80 99,26 99,31 99,41 99,43 99,42 99,38 99,37

Xkcdknkfcfg"*'+" 93,40 87,21 82,48 91,81 78,60 82,51 81,90 84,93

Anexo D

249

70" ıEKFQ"HłTOKEQ"

703" UA3"


ATV"*i1N+" 9,20 7,66 27,06 28,93 18,03 15,19 11,05 16,95

Gvcpqn"*i1N+" 60,28 63,73 60,28 55,50 64,63 59,66 70,10 70,19


0,89 1,02 1,13 1,20 1,36 1,44 1,53 1,60

[z1u"*i1i+" 0,0138 0,0130 0,0153 0,0125 0,0175 0,0140 0,0140 0,0146

[r1u"*i1i+" 0,3443 0,3579 0,3814 0,3555 0,3864 0,3462 0,3975 0,4110


5,8922 6,1857 5,7988 5,3365 6,2513 5,6973 6,7349 6,6845

Eqpuwoq"ATV"*'+"

94,89 95,76 84,84 83,83 89,98 91,55 93,89 90,56

Xkcdknkfcfg"*'+" 80,30 67,00 50,25 38,99 31,19 34,98 42,50 34,96

704" [;26"


ATV"*i1N+" 12,15 0,73 0,69 0,66 0,68 0,65 0,70 0,66

Gvcpqn"*i1N+" 64,99 63,47 72,82 62,14 74,17 62,49 72,93 72,84


0,88 1,17 1,45 1,63 1,80 1,93 2,08 2,08

[z1u"*i1i+" 0,0198 0,0214 0,0221 0,0188 0,0203 0,0179 0,0195 0,0122

[r1u"*i1i+" 0,3792 0,3415 0,3898 0,3261 0,3967 0,3226 0,3838 0,3781


6,3647 6,1509 7,0277 5,8637 7,0889 5,8153 6,9038 6,8111

Eqpuwoq"ATV"*'+"

93,25 99,60 99,62 99,63 99,62 99,64 99,61 99,64

Xkcdknkfcfg"*'+" 89,52 90,05 85,90 79,09 81,30 77,00 85,53 77,42

Anexo D

250

80" JOH""

803" UA3"


ATV"*i1N+" 4,86 1,14 0,99 0,82 0,89 0,89 0,87 0,89

Gvcpqn"*i1N+" 62,76 64,18 65,04 67,89 66,51 67,73 67,72 67,63


1,07 1,45 1,69 1,92 2,09 2,17 2,34 2,43

[z1u"*i1i+" 0,0354 0,0324 0,0260 0,0285 0,0251 0,0204 0,0274 0,0236

[r1u"*i1i+" 0,4194 0,4097 0,4110 0,4270 0,4154 0,4211 0,4179 0,4136


6,1317 6,1803 6,1794 6,4257 6,2397 6,3194 6,2689 6,2211

Eqpuwoq"ATV"*'+"

96,78 99,25 99,35 99,46 99,41 99,41 99,42 99,41

Xkcdknkfcfg"*'+" 68,12 61,54 47,32 56,94 33,33 48,47 46,31 45,54

804" [;26"


ATV"*i1N+" 2,42 1,71 1,72 1,52 1,46 1,45 1,42 1,42

Gvcpqn"*i1N+" 60,46 62,80 64,69 66,08 67,03 68,41 68,15 68,50


1,05 1,44 1,74 1,84 2,16 2,22 2,33 2,37

[z1u"*i1i+" 0,0366 0,0338 0,0305 0,0191 0,0342 0,0200 0,0242 0,0191

[r1u"*i1i+" 0,3979 0,4064 0,4113 0,4156 0,4170 0,4241 0,4184 0,4192


5,9191 6,0524 6,1456 6,2221 6,2458 6,3446 6,2684 6,2844

Eqpuwoq"ATV"*'+"

98,40 98,87 98,86 99,00 99,04 99,04 99,06 99,06

Xkcdknkfcfg"*'+" 92,68 87,13 69,52 81,68 79,78 75,36 64,79 71,75

251

APGZQ"G"

30 Egrc"UA3 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 475 40 Egrc"[;26 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 476

Anexo E

253

30" EGRA"UA3"

Vcdgnc"G/"3""⁄"Eqpegpvtcèçq"fg"ATV."gvcpqn"g"ocuuc"ugec"go"hwpèçq"fq"vgorq"rctc"q"gpuckq"wvknk|cpfq"ogkq"ukpvêvkeq"eqpvtqng"g"eqoq"oketqticpkuoq"cigpvg"c"egrc"UA3."go"i1N0"

" Gzrgtkogpvcn" Alwuvcfq"

Aoquvtc" ATV" Gvcpqn" Ocuuc"Ugec"

ATV" Gvcpqn" Ocuuc"ugec"

Mosto" 216,05" "

0" 177,27" 0,00" 4,74" 177,27 0,00 4,74

1" 171,56" 0,51" 5,36" 161,53 6,57 5,43

2" 148,75" 8,89" 6,85" 144,30 13,76 6,18

3" 127,08" 18,56" 8,37" 125,77 21,50 6,99

4" 96,29" 28,88" 9,28" 106,34 29,61 7,84

5" 82,93" 39,19" 10,27" 86,63 37,83 8,70

6" 67,53" 43,71" 10,75" 67,51 45,81 9,54

7" 53,44" 50,15" 11,21" 50,06 53,10 10,30

8" 39,18" 55,96" 11,33" 35,30 59,26 10,94

9" 26,64" 60,47" 11,83" 23,89 64,02 11,44

10" 18,08" 65,63" 11,95" 15,83 67,38 11,80

Vcdgnc"G/"4⁄"Eqpegpvtcèçq"fg"ATV."gvcpqn"g"ocuuc"ugec"go"hwpèçq"fq"vgorq"rctc"q"gpuckq"wvknk|cpfq" ogkq" ukpvêvkeq" eqpvtqng" eqo" cfkèçq" fg" âekfq" hôtokeq" g" eqoq" oketqticpkuoq"cigpvg"c"egrc"UA3."go"i1N0"


Aoquvtc" ATV" Gvcpqn" Ocuuc"Ugec"


Mosto" 209,60" " "

0" 161,09" 0,00" 5,13" 161,09 0,00 5,13

1" 157,79" 1,75" 5,30" 148,61 5,79 5,47

2" 141,25" 10,05" 5,73" 135,50 11,87 5,82

3" 123,61" 18,34" 6,48" 121,79 18,22 6,19

4" 105,98" 27,27" 7,33" 107,56 24,82 6,58

5" 91,02" 35,57" 7,62" 92,90 31,62 6,97

6" 74,48" 43,86" 8,10" 78,02 38,52 7,37

7" 59,60" 50,88" 8,45" 63,22 45,38 7,77

8" 48,27" 58,53" 8,93" 48,97 51,99 8,16

9" 36,97" 63,64" 9,35" 35,95 58,02 8,51

10" 27,24" 67,46" 9,41" 25,02 63,10 8,80

Anexo E

254

Vcdgnc"G/"5"⁄"Eqpegpvtcèçq"fg"ATV."gvcpqn"g"ocuuc"ugec"go"hwpèçq"fq"vgorq"rctc"q"gpuckq"wvknk|cpfq"ogkq"ukpvêvkeq"eqpvtqng"eqo"cfkèçq"fg"âekfq"nâvkeq"g"eqoq"oketqticpkuoq"cigpvg"c"egrc"UA3."go"i1N0"


Aoquvtc" ATV" Gvcpqn" Ocuuc"ugec"

ATV" Gvcpqn" Ocuuc"Ugec"

Mosto" 213,76" " " "

0" 171,56" 0,00" 5,04" 171,56 0,00 5,04

1" 164,72" 1,80" 5,44" 158,19 5,71 5,59

2" 144,19" 8,89" 6,75" 143,96 11,79 6,19

3" 131,64" 17,27" 7,89" 129,07 18,15 6,80

4" 114,53" 25,01" 8,69" 113,85 24,65 7,44

5" 96,29" 33,39" 9,34" 98,79 31,08 8,06

6" 84,64" 39,19" 9,73" 84,50 37,18 8,65

7" 70,95" 45,00" 10,16" 71,67 42,66 9,19

8" 60,57" 51,44" 10,67" 60,90 47,26 9,63

9" 50,30" 54,02" 10,76" 52,49 50,85 9,98

10" 40,61" 57,89" 11,00" 46,39 53,46 10,24

40" EGRA"[;26"

Vcdgnc"G/"6⁄"Eqpegpvtcèçq"fg"ATV."gvcpqn"g"ocuuc"ugec"go"hwpèçq"fq"vgorq"rctc"q"gpuckq"wvknk|cpfq"ogkq"ukpvêvkeq"eqpvtqng"g"eqoq"oketqticpkuoq"cigpvg"c"egrc"[;26."go"i1N0"




Mosto" 210,88" " " "

0" 171,72" 0,00" 4,65" 171,72 0,00 4,65

1" 162,77" 8,59" 5,25" 157,41 6,30 5,41

2" 145,98" 14,52" 6,98" 141,71 13,22 6,24

3" 129,20" 23,42" 8,82" 124,89 20,63 7,13

4" 102,34" 31,14" 10,01" 107,44 28,32 8,05

5" 87,54" 38,26" 10,63" 90,04 35,98 8,97

6" 71,87" 42,42" 11,63" 73,54 43,25 9,84

7" 60,12" 51,32" 12,08" 58,76 49,76 10,63

8" 46,85" 55,47" 12,31" 46,31 55,25 11,28

9" 36,77" 60,81" 12,58" 36,37 59,62 11,81

10" 28,38" 63,19" 12,53" 28,76 62,97 12,21

Anexo E

255

Vcdgnc"G/"7"⁄"Eqpegpvtcèçq"fg"ATV."gvcpqn"g"ocuuc"ugec"go"hwpèçq"fq"vgorq"rctc"q"gpuckq"wvknk|cpfq" ogkq" ukpvêvkeq" eqpvtqng" eqo" cfkèçq" fg" âekfq" hôtokeq" g" eqoq" oketqticpkuoq"cigpvg"c"egrc"[;26."go"i1N0"




Mosto" 203,92" " " "

0" 164,93" 0,00" 4,71" 164,93 0,00 4,71

1" 158,60" 0,00" 4,93" 154,05 4,79 5,10

2" 150,17" 4,51" 5,33" 142,36 9,94 5,52

3" 137,53" 11,02" 5,85" 129,83 15,46 5,98

4" 118,56" 17,53" 6,65" 116,46 21,35 6,46

5" 101,70" 27,96" 7,60" 102,27 27,61 6,97

6" 81,68" 33,17" 8,27" 87,30 34,20 7,51

7" 67,71" 40,98" 8,74" 71,71 41,07 8,08

8" 54,01" 46,85" 9,31" 55,79 48,09 8,65

9" 39,12" 54,01" 9,68" 40,07 55,02 9,22

10" 29,11" 60,53" 9,96" 25,53 61,42 9,74

Vcdgnc"G/"8"⁄"Eqpegpvtcèçq"fg"ATV."gvcpqn"g"ocuuc"ugec"go"hwpèçq"fq"vgorq"rctc"q"gpuckq"wvknk|cpfq"ogkq"ukpvêvkeq"eqpvtqng"eqo"cfkèçq"fg"âekfq"nâvkeq"g"eqoq"oketqticpkuoq"cigpvg"c"egrc"[;26."go"i1N0"




Mosto" 201,81" " " "

0" 158,60" 0,00" 4,82" 158,60 0,00 4,82

1" 157,55" 0,60" 5,13" 148,89 3,49 5,33

2" 147,01" 5,81" 6,53" 138,25 7,31 5,88

3" 131,20" 11,02" 8,01" 126,65 11,48 6,48

4" 112,24" 16,88" 8,77" 114,11 15,98 7,13

5" 100,65" 23,40" 9,50" 100,72 20,80 7,83

6" 84,84" 25,35" 10,05" 86,70 25,84 8,56

7" 70,09" 32,52" 10,58" 72,47 30,95 9,30

8" 56,39" 37,73" 10,90" 58,73 35,88 10,01

9" 47,16" 39,03" 11,07" 46,42 40,31 10,65

10" 39,26" 44,24" 11,42" 36,43 43,90 11,17

comportamento de linhagens industriais de...

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