classificaÇÃo de mÉtodos cromatogrÁficos …home.utad.pt/~lcarv/cromatografia.pdf · luís h....

1

SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

Fase móvelAmostra

A + B

BA

BA

B

Sin

al d

o de

tect

or

Tempo

t0 t1 t2 t3 t4

t0 t1 t2 t3 t4

Detector

BA

B

A

Luís H. Melo de Carvalho Complementos de Química I - Módulo de cromatografia

Classificação geral Método

específico Fase estacionária Tipo de equilíbrio

Cromatografia líquida

(LC)

(fase móvel: líquido)

Líquido-líquido

ou partição

Líquido adsorvido

num sólido

Partição entre líquidos

imiscíveis

Líquido-fase

ligada

Espécies

orgânicas ligadas

a uma superfície

sólida

Partição

líquido/superfície ligada

Líquido-sólido ou

adsorção

Sólido Adsorção

Troca iónica Resina de troca

iónica

Troca iónica

Exclusão por

tamanho

Líquido nos

interstícios de um

sólido polimérico

Partição/peneiragem

Cromatografia gasosa

(GC)

(fase móvel: gás)

Gás-líquido

Líquido adsorvido

num sólido

Partição gás/líquido

Gás-fase ligada Espécies

orgânicas ligadas

a uma superfície

sólida

Partição gás/superfície

ligada

Gás-sólido Sólido Adsorção

Cromatografia de

fluido supercrítico

(SFC)

(fase móvel: fluido

supercrítico)

Partição fluido

supercrítico/superfície

ligada

CLASSIFICAÇÃO DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOSEM COLUNA


2

Fase móvel

Fase estacionária

M

S

CC

K =

TEORIA DA CROMATOGRAFIA

ALARGAMENTO DE BANDA

Tempo

Tempo

Res

post

a do

det

ecto

r

Comportamento ideal

Comportamento real


Distância migrada

Con

cent

raçã

o

A

B

A

B

t1

t2

SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

TempoS

inal

do

dete

ctor

Cromatograma original

Aumento da separaçãodas bandas

Diminuição do alargamento das bandas

MELHORANDO A SEPARAÇÃO


3

Tm

Tr

T’r

0Tempo

Sin

al d

o de

tect

or

W1/2

Tm= tempo morto

Tr = tempo de retenção total

T’r = tempo de retenção ajustado (ou líquido)

W1/2 = largura do pico a meia altura

ALGUMAS QUANTIDADES IMPORTANTES


QUANTIDADES IMPORTANTES (CROMATOGRAMA)

Tempo de retenção (Tr)

Tr= Testacionária + Tmóvel

Tempo morto (Tm)

Tempo de retenção ajustado (Tr’)

Tr’= Tr - Tm

Factor de retenção (k’)medida de retenção na fase estacionária

Coeficiente de separação ou selectividade (α)medida de retenção na fase estacionária

( )( ) m1r

m2r

1

2TTTT

k'k'

−−

==a

m

r

m

mrTT

TTT

ase móvelpassa na fo analito Tempo que onáriaase estacipassa na fo analito Tempo que

k'

'=

−=

==


4

(L+1σ)(L-1σ)L

Distância migrada

Nº

de m

oléc

ulas

DetectorIntroduçãoda amostra

Enchimento

Tempo

Sin

al d

o de

tect

or

W

Tm

Tr

ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO

DETERMINAÇÃO DE H E N


Processo Termo na equação Relação com as propriedades da

coluna e do analito

Difusão longitudinal

uB

uDk

uB MD2

=

Transferência de massa

(fase estacionária líquida*)

uCS

S

fS

D)'k(

ud'qkuC

2

2

1 +=


(fase estacionária sólida**)

uCS 21

2

)'k(

u'ktuC d

S+

=


(fase móvel)

uCM u

D

)u,d,d(fuC

M

cpM

22=

uCuCuB

H MS ++=

PROCESSOS CINÉTICOS QUE CONTRIBUEMPARA O ALARGAMENTO DOS PICOS

f: “função de”; kD, q : constantes; td tempo médio de dessorção do analito da superfície; dc: diâmetro da coluna; B: coeficiente de difusão longitudinal; CS e CM: coeficientes de transferência de massa nas fases estacionária e móvel, respectivamente.* a fase estacionária é um líquido imiscível imobilizado** a fase estacionária é uma superfície sólida onde ocorre adsorção.

Variável Símbolo Unidades

Velocidade linear da fase móvel u cm.s-1

Coeficiente de difusão na fase móvel(a) DM cm2.s-1

Coeficiente de difusão na fase estacionária(a) DS cm2.s-1

Coeficiente de capacidade k’ -

Diâmetro de partícula do enchimento dp cm

Espessura do revestimento líquido na fase estacionária df cm (a) Aumenta quando a temperatura aumenta e a viscosidade diminui


5

Velocidade linear de fluxo, cm/s

Con

trib

uiçã

o pa

ra H

, cm H

CSu

CMu

B/u

uCuCuB

H MS ++=

EQUAÇÃO DE VAN DEEMTER

Velocidade linear de fluxo, cm/s

H, m

m

2 4 6 8 10glc

2

4

6

8

2.01.0

0.2

0.4

0.6

0.8

lc

GLC

LC


Largura de banda inicial

Largura de banda final

1 2

ALARGAMENTO DE BANDAS

Efeito de percursos múltiplos

Fase móvel “estagnada”

Grau de alargamentode banda

Fluxo de fase móvel


6

Tm

(Tr)B

(Tr)A∆Z

WA/2 WB/2

WA WB

A B

A B

BA

RS=0.75

RS=1.0

RS=1.5

Tempo

Sin

al d

o de

tect

or

SEPARAÇÃO E RESOLUÇÃO


W = 4σ

W1/2= 2.35σh

2h

Tempo

Res

post

a do

det

ecto

r

LARGURA DE PICO NA BASE (W) E A MEIA ALTURA (W1/2)


7

TÉCNICAS PARA MELHORAR A RESOLUÇÃO

Objectivo:Separações eficientes em tempos de análise curtos.

1. Aumentar a distância entre os picos, ∆Tr=T2-T1

(a) Aumentar o comprimento da coluna, L(b) Aumentar a quantidade de fase estacionária, VS ou VL

(c) Usar um coeficiente de selectividade melhor, α=T2’/T1’• Diminuir a temperatura• Escolher uma fase estacionária diferente• Escolher uma fase móvel diferente (se for líquida)

2. Diminuir a largura da banda, W(a) Usar um enchimento mais uniforme

• Encher mais cuidadosamente• Usar partículas mais pequenas

(b) Aumentar a área de interface entre as fases(c) Optimizar a velocidade de fluxo(d) Reduzir o tamanho da amostra(e) Reduzir o espaço morto no sistema(f) Reduzir a constante de tempo do detector(g) Diminuir o diâmetro da coluna


EFEITO DO COMPRIMENTO DA COLUNA

NA RESOLUÇÃO E NO TEMPO DE RETENÇÃO


8

0.6 – 0.8 mm

0.4 – 0.6 mm0.3 – 0.4 mm

0.25 – 0.3 mm

0.1 – 0.15 mm

Velocidade linear, cm/s

H, c

m

0.1

0.2

5 10 15 20

Coeficiente de capacidade, k’B

RS/Q

ou

(Tr) B

/Q’

5.0 15.010.00

Resolução, RS

Tempo de eluição, (Tr)B

EFEITO DO TAMANHO DE PARTÍCULA E H

EFEITOS DO FACTOR DE CAPACIDADE


EFEITO DA TEMPERATURA NA CG

12

3

4

5

56

78

876

5

4

3219

302010Tempo (min)

30º 60º 90º 120º 150º 180º

Temperatura (ºC)

Isotérmica a 45ºC

Isotérmica a 145ºC

Programada de 30ºC a 180ºC

x 4


9

40% metanol,60% água




Tempo de retenção, min

EFEITO DA COMPOSIÇÃO DA FASE MÓVEL

NA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

1 → 9,10-antraquinona2 → 2-metil-9,10-antraquinona3 → 2-etil-9,10-antraquinona4 → 1,4-dimetil-9,10-antraquinona5 → 2-t-butil-9,10-antraquinona


PARÂMETROS USADOS NAS TÉCNICASDE OPTIMIZAÇÃO

Variação de NAlteração do comprimento da coluna

Variação de HAlteração da velocidade do fluxo da fase móvelAlteração do tamanho de partícula do enchimentoAlteração da espessura do filme líquido que serve de fase estacionária (LC)Alteração do diâmetro da colunaAlteração da viscosidade da fase móvel (e assim DM ou DS)Alteração da temperatura da coluna (GC)

Variação de k’ e de αAlteração da temperaturaAlteração da composição da fase móvelAlteração do enchimento da colunaUtilização de efeitos químicos especiais


10

Tm

Inicial

aumentar k’diminuir k’

Variação de k’

Aumento de N

Aumento de α

VARIAÇÃO DA RESOLUÇÃO


EFEITOS DE α E N NA RESOLUÇÃO DE PICOS

Factor de separação fracoN pequeno

Factor de separação bomN pequeno

Factor de separação bomN elevado

Factor de separação fracoN elevado

Tempo

Res

post

a do

det

ecto

r


11

Tempo

Sin

al d

o de

tect

or

O PROBLEMA GERAL DA ELUIÇÃO


Razão de altura dos picos = 1:1

Razão de altura dos picos = 8:1

RS = 0.4 0.5 0.6 0.7

0.8 1.0 1.25

RS = 0.4 0.5 0.6 0.7

0.8 1.0 1.25


12

Posição aparente

Posição verdadeira

SOBREPOSIÇÃO DE PICOS

1) Localização

2) Medição de áreas

Luís Herculano Melo de Carvalho Complementos de Química I

Rs = 1

1:1 4:1

8:1 16:1

100% 96%

93% 88%

% erro na área do pico maior = - (1/x) % erro na área do pico menor

% erro na área do pico menor = (% indicada -100 %)

SOBREPOSIÇÃO DE PICOS

Erro na quantificação por área de pico


13


QUANTIDADES EXPERIMENTAIS IMPORTANTES EM CROMATOGRAFIA

Nome Símbolo Determinada a partir de:

Tempo morto Tm Cromatograma

Tempos de retenção (de A e de B) (Tr)A e (Tr)B Cromatograma

Tempo de retenção ajustado (de A e de B) (T’r)A e

(T’r)B (T’r)A= (Tr)A - Tm

Largura de picos (de A e de B) WA e WB Cromatograma

Comprimento do enchimento da coluna L Medição directa

Velocidade média das moléculas da fase

móvel u Medição directa

Volume da fase estacionária VS Dados da preparação do

enchimento

Concentração de analito nas fases móvel e

estacionária CM e CS Análise e dados da preparação


EXPRESSÕES E QUANTIDADES IMPORTANTES EM CROMATOGRAFIA

Nome Expressão Relação com outras

quantidades

Velocidade linear da fase

móvel mTL

u =

Volume da fase móvel FTV mM =

Coeficiente de capacidade ( )m

mr

TTT

'k−

= M

S

VKV

'k =

Coeficiente de partição S

M

VV'k

K = M

S

CC

K =

Factor de selectividade ( )( ) mAr

mBr

TTTT

−−

=α A

B

A

B

KK

'k'k

==α

Resolução ( ) ( )[ ]

BA

ArBrS WW

TTR

+−

=2

+

−

=B

BS 'k

'kNR

11

4 αα

Nº de pratos 2

16

=WT

N r 22

2 11

16

+

−=

B

BS 'k

'kRN

αα

Altura de prato NL

H =

Tempo de retenção ( ) ( )( )2

322 11

16

B

BSBr

'k

'ku

HRT

+

−=

αα

14

INJECTOR DIRECTO

COMPONENTES FUNDAMENTAIS DE UM SISTEMA DE GC

Septo

Purga do septo

Gás de arraste

Câmara devaporização

Agulha daseringa

SeringaColuna

Gás de arraste

Gásde arraste

InjectorDetector

Forno Coluna

Tratamentode dados


COLUNAS PARA CROMATOGRAFIA GASOSA

Tipo de coluna

CaracterísticaCapilar

(WCOT)

Enchimento

Comprimento (m) 10 - 100 1 - 6

Diâmetro interno (mm) 0.25 – 0.75 2 - 4

Eficiência (pratos/m) 1000 - 4000 500 - 1000

Quantidade de amostra (ng) 10 - 103 10 - 106

Pressão relativa Baixa Alta

Velocidade relativa Rápida Lenta

COLUNA TUBULAR ABERTA ( ou COLUNA CAPILAR)


15

N

10 102 103 104

Tempo (s)

103

104

105

106

Capilares (WCOT)

Empacotadas

20 40 60

Velocidade linear média (cm/s)

0.5

1.0

1.5

2.0

H(m

m)

Empacota

das

Capilares (WCOT)

EFICIÊNCIA DE COLUNAS CAPILARES E EMPACOTADAS


Velocidade linear média (cm/s)

20 40 60 80

0.2

0.4

0.6

0.8

H(m

m)

1.0

1.2

N2

He

H2

GASES DE ARRASTE


16

Parede do forno

ar

H2

Chama ar-H2

Colector

Bico de queima

Coluna

Gás de complemento

DETECTOR DE IONIZAÇÃO DE CHAMA

DETECTOR DE CONDUTIVIDADE TÉRMICA

Fluxo de entrada

Fluxo de saída


Plasma

Coluna

777 nm748 nm690 nm

656 nm

480 nm

250 nm

170 nmRede dedifracção

Bateria dedíodos

DETECTOR DE EMISSÃO ATÓMICA

10 20 300

0 1 2 3 4 5

Tempo (min)S

inal

do

dete

ctor

Monitoraçãoda linha do C

Monitoraçãoda linha do O

Amostra duma gasolina


17

Coluna

Aquisição e processamentode dados

Unidade deinjecção

Solventes

Bomba + sistema degradiente

Detector

COMPONENTES PRINCIPAIS DE UM SISTEMA DE HPLC


SISTEMA DE INJECÇÃO DA AMOSTRA

1) Carregamento da amostra 2) Injecção da amostra

Da bomba Da bomba

Para a coluna Para a coluna

“loop” “loop”

SaídaSaída

DETECTOR DE UV PARA HPLC

Da coluna

Para o esgoto

Janelasde quartzo

Fonte de UV Detector


18

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

Polaridades dos solutos: A > B > C

Fase normal

C B A

Tempo

Fase móvel de polaridade baixa

C B A

Tempo

Fase móvel de polaridade média

Fase reversa

A B C

Tempo

Fase móvel de polaridade alta

A B C

Tempo

Fase móvel de polaridade média


0 5 10 15 3025200 5 10 15 302520Tempo (min) Tempo (min)

EFEITO DA ELUIÇÃO EM GRADIENTE

Eluição isocrática50:50 (v/v) MeOH/H2O

Eluição em gradienteInicio: 40:60 (v/v) MeOH/H2O

MeOH ä 8%/min

Mistura de clorobenzenos

BOMBA RECÍPROCA PARA HPLC

Motor

Pistão devaivém

Junta selada

Coluna

Solvente

Válvulasde esfera

Amortecedorde pulsações


19

Eluente:

NaHCO3 0.0028M / Na2CO3 0.0023M

Volume de amostra: 50 µL

Eluente:

Fenilenodiamina.2HCl 0.025M / HCl 0.0025M

Volume de amostra: 100 µL

APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA IÓNICA


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