citogenética de cinco espécies de pequenos mamíferos não...
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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM
PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA TROPICAL E RECURSOS NATURAIS
Citogenética de cinco espécies de pequenos mamíferos não voadores de três localidades na Amazônia Central
Carlos Eduardo Faresin e Silva
MANAUS-AM 2008
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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM
PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA TROPICAL E RECURSOS NATURAIS
Citogenética de cinco espécies de pequenos mamíferos não voadores de três localidades na Amazônia Central
Carlos Eduardo Faresin e Silva
Orientador: Eliana Feldberg, Dra.
Co-orientador: Maria Nazareth Ferreira da Silva, PhD.
Dissertação apresentada ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais do convênio INPA/UFAM, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.
MANAUS-AM
2008
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FICHA CATALOGRÁFICA
S586 Silva, Carlos Eduardo Faresin e Citogenética de cinco espécies de pequenos mamíferos não voadores de três localidades / Carlos Eduardo Faresin e Silva .--- Manaus : [s.n.], 2008. xiii, 61f. : il. Dissertação (mestrado)-- INPA/UFAM, Manaus, 2008 Orientador: Eliana Feldberg Co-orientador : Maria Nazareth Ferreira da Silva Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva 1. Marmosa. 2. Micoureus. 3. Didelphis. 4. Proechimys. 5. Ag-RONs. 6. Rearranjos cromossômicos. 7. Cariótipo. I. Título. CDD 19. ed. 599.20415
Sinopse: Com o intuito de contribuir para a caracterização cromossômica dos os pequenos mamíferos da Amazônia central foram analisadas cinco espécies comuns a essa região em três pontos de coleta. A aplicação das técnicas de bandeamentos –C, -G e Ag-RON mostraram-se úteis como marcadores espécie-específicos para os marsupiais Micoureus demerarae, Marmosa murina e Didelphis marsupialis e mostraram que os roedores Proechimys cuvieri apresentam variação no padrão de banda-C, enquanto que o cariótipo com 46 cromossomos encontrado para Proechimys guyannensis teve seu padrão de bandeamento aqui descrito pela primeira vez.
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ORIENTADOR
CO-ORIENTADOR
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Nada é mais doloroso para a alma humana do que a lassidão, o trágico marasmo que sobrevêm à rápida seqüência de fatos e sentimentos tumultuosos, como a paisagem desoladora da
floresta após a passagem da tormenta.
Mary Shelley
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Dedico aos meus pais que, mesmo à distância, me apoiaram em todas as situações.
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Apoio:
Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais do Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e Universidade Federal do Amazonas (UFAM),
Curso de Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.
Laboratório de Genética Animal/CPBA e Coleção de Mamíferos, INPA, onde este trabalho
foi realizado.
CNPq – Concessão da bolsa de mestrado
Projeto (PPI/INPA) – “Caracterização genética (cromossomos, proteínas e DNA) de peixes e
pequenos mamíferos”, coordenado pela Dra. Eliana Feldberg, no financiamento da excursão
realizada à Usina hidroelétrica de Balbina e no fornecimento de material laboratorial.
Petrobrás S/A – Projeto Muruatá, no financiamento das coletas realizadas no município de
Manaus.
Instituto de Pesquisas Ecológicas (IPÊ) – no financiamento da viagem ao rio Cuieiras, onde
parte do material foi coletada.
FAPEAM – no fornecimento de material laboratorial.
CPBA / INPA – fornecimento de infra-estrutura e logística.
IBAMA / REBio – Concessão das licenças de coleta, infra-estrutura e logística.
Secretaria Executiva Adjunta de Pesca e Aqüicultura do Estado do Amazonas – ao dispor
infra-estrutura da Estação de Piscicultura de Balbina, para instalação temporária de
laboratório.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha orientadora, Dra. Eliana Feldberg pela oportunidade de explorar um
campo inédito na minha vida acadêmica. Pelas discussões, incentivo, orientação,
aconselhamento, paciência e principalmente por confiar nos meus esforços.
À minha co-orientadora, Dra. Maria Nazareth Ferreira da Silva, por fornecer base para
continuar meu aprendizado com pequenos mamíferos, pelas excelentes sugestões feitas em
todos os textos que lhe apresentei.
Ao colega Rodrigo Andrade, pelo auxílio em laboratório, e à colega Maria Claudia
Gross, por ensinar, opinar e pelo auxílio fundamental na minha rotina de laboratório e no
desfecho desse trabalho.
Aos colegas Marco Antônio Schetino, Rodrigo Andrade e Eduardo Eler, pela sincronia
e parceria nos trabalhos de campo, foram as melhores saídas de campo que tive.
Às secretárias, Hercília e Alessandra, pela prestatividade e por esclarecerem minhas
dúvidas.
Aos meus amigos, Renato Machado e Sílvia Mardegan, por me receberem em Manaus
e me aceitarem na sua casa. Aos parceiros de república Rafael “Narck“ Silva e Pedro Simões,
pelos momentos de descontração em casa.
Aos meus amigos, Marco Schetino, Rafael Maia, Rafael Angrizani e Gabriela Müller,
pela amizade e companheirismo nos momentos mais difíceis do começo do mestrado. E
também a todos os amigos que fiz em Manaus.
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RESUMO
Na Amazônia, roedores e marsupiais representam uma parcela importante da riqueza de espécies de mamíferos. Apesar da crescente quantidade de estudos mostrarem a grande diversidade dessa fauna, aspectos sistemáticos e taxonômicos ainda permanecem incompreendidos. Nesse contexto a citogenética constitui uma ferramenta adequada para o reconhecimento das espécies e compreensão de eventos evolutivos. Este trabalho teve objetivo de caracterizar cromossomicamente marsupiais dos gêneros Didelphis, Micoureus e Marmosa e roedores do gênero Proechimys, de três localidades da Amazônia Central em busca de marcadores que auxiliassem na taxonomia e evolução desses táxons. Indivíduos foram coletados na UHE de Balbina, na Refinaria de Manaus (REMAN-Petrobrás) e na PAREST rio Negro setor Sul, rio Cuieiras totalizando 38 espécimes de marsupiais e 11 do gênero Proechimys. Os cariótipos de Didelphis marsupialis e Micoureus demerarae não apresentaram diferenças dos encontrados na literatura, porém os indivíduos de Marmosa murina apresentaram uma inversão pericêntrica em um dos cromossomos do par seis, que foi detectada com o auxílio das técnicas de banda C e Ag-RON. Para M. murina, foi possível ainda, por comparação com dados bibliográficos, detectar quatro citótipos com diferenças na morfologia dos cromossomos sexuais. O alto grau de conservação dos cariótipos dos marsupiais tem sido repetidamente comentado na literatura, porém o heteromorfismo observado em M. murina mostra a existência de rearranjos cromossômicos, mas o real significado destes na evolução do grupo ainda é incompreendido. No gênero Proechimys foram encontrados dois cariótipos: 2n=28, NFa=46 nos indivíduos do rio Cuieiras e REMAN-Manaus e 2n=46, NFa=50 nos indivíduos da UHE de Balbina (presente trabalho). O cariótipo com 2n=28 cromossomos pertence à espécie Proechimys cuvieri e compartilhou semelhanças com indivíduos de mesmo número diplóide de outras duas regiões: UHE de Balbina (dados da literatura) e vale do Jarí, diferenciando desse último apenas na morfologia do cromossomo X. Na Amazônia Central, espécimes de Proechimys cuvieri mostraram um polimorfismo no padrão de banda C e no número fundamental, sendo que três citótipos podem ser identificados. Aparentemente não existe um padrão de distribuição geográfica para estes citótipos que pudesse definir um cline. O cariótipo com 2n=46 cromossomos mostrou-se similar aos dos indivíduos do rio Jatapu, Roraima, porém os dados de bandeamento não estiveram disponíveis na literatura para comparação. Proechimys com 2n=46 e NFa=50, foram incluídos em P. guyannensis tendo por base resultados adicionais de análises moleculares, reforçado pela comparação do padrão de banda G, que mostrou homeologias com o cariótipo de 2n=38 do grupo guyannensis.
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ABSTRACT
In the Amazon rainforest, rodents and marsupials account for an important part of mammal’s species richness. Although the number of researches showing the great diversity of animal species is increasing, systematic and taxonomic aspects are still not fully understood. In this context, cytogenetics is a very adequate tool for recognizing species and comprehending evolutionary processes. This work aimed to characterize karyotypically individuals from genus’ Didelphis, Micoureus, Marmosa, and Proechimys, of three locations of central Amazon, searching for markers to help comprehending taxonomy and evolution of these groups. Specimens were collected in the Balbina Hydroelectric Power Plant Dam, Manaus Oil Refinery (Petrobrás) and the National State Park (PAREST) rio Negro Setor Sul, Cuieiras river, amounting 38 marsupial specimens and 11 specimens of genus Proechimys. Karyotypes of Didelphis marsupialis and Micoureus demerarae did not show any differences from those found on scientific literature, but individuals of Marmosa murina showed a pericentric inversion on one of the chromosomes of pair 6, detected with use of C-banding and Ag-NOR techniques. Still, in M. murina, through comparison with bibliographic data, it was possible to distinguish four different cytotypes with differences in the sexual chromosomes. The high conservation of marsupials karyotype is heavily defended in past works, but the heteromorphism in M. murina reveal the presence of chromosomal rearrangements, although the true significance of these rearrangements on the evolution of this group is still unknown. In genus Proechimys, two karyotypes were found: 2n=28, FNa=46 in specimens from both Cuieiras river and Manaus Oil Refinery, and 2n=46, FNa=50 in specimens from the Balbina dam. The karyotype 2n=28 was assigned Proechimys cuvieri and shares traits with individuals with the same diploid number from other two localities: Balbina dam and the Jari river valley, differing from the latter only in the X chromosome morphology. In central Amazon, Proechimys cuvieri showed a C-banding pattern polymorphism and FNa, and three cytotypes can be identified. Apparently, there are no geographic distribution pattern relations, which could define a cline for these species. The 2n=46 karyotype showed morphologic characteristics similar to individuals from Jatapu river, Roraima state, but banding techniques data could not be found on the literature for comparison. Proechimys specimens with 2n=46 and NFa=50 were included in P. guyannensis based on additional results of molecular tests, reinforced by comparing the pattern of G-bands, which showed homeologies with the karyotype 2n=38 of the group guyannensis.
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Sumário
1. Introdução.......................................................................................................................................................... 1 1.1 Características ecológicas de pequenos mamíferos não voadores ................................................................. 2 1.2 Ordens Didelphimorphia e Rodentia ............................................................................................................. 3 1.3 Citogenética................................................................................................................................................... 6
1.4.1. Objetivo geral ...................................................................................................................................... 10 1.4.2. Objetivos específicos........................................................................................................................... 10
2. Material e Métodos.......................................................................................................................................... 11 2.1 Material ....................................................................................................................................................... 11 2.2 Locais de Coleta .......................................................................................................................................... 13 2.3. Métodos...................................................................................................................................................... 15
2.3.1. Técnica de coleta ................................................................................................................................. 15 2.3.2. Obtenção de cromossomos mitóticos .................................................................................................. 16 2.3.3. Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C).......................................................................... 17 2.3.4. Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (RONs) ................................................................ 18 2.3.5. Bandeamento G (GTG) ....................................................................................................................... 18 2.3.6. Análise cariotípica ............................................................................................................................... 19
3. Resultados ........................................................................................................................................................ 20 3.1. Ordem Didelphimorphia - Família Didelphidae......................................................................................... 20
3.1.1 Micoureus demerarae – 2n=14; NFa=20 ............................................................................................. 20 3.1.2 Marmosa murina – 2n=14; NFa=22..................................................................................................... 23
3.2. Ordem Rodentia - Família Echimyidae ...................................................................................................... 29 3.2.1 Proechimys cuvieri - 2n=28; NFa=46................................................................................................... 30 3.2.2 Proechimys guyannensis - 2n=46; NFa=50.......................................................................................... 32
4. Discussão .......................................................................................................................................................... 34 4.1. Micoureus demerarae e Marmosa murina – 2n=14 ................................................................................... 34 4.2 Didelphis marsupialis – 2n = 22.................................................................................................................. 40 4.3 Gênero Proechimys ..................................................................................................................................... 43
4.3.1 Proechimys cuvieri – 2n=28 ................................................................................................................. 43 4.3.2 Proechimys guyannensis – 2n=46 ........................................................................................................ 46
5. Conclusão ......................................................................................................................................................... 50
6. Referências Bibliográficas .............................................................................................................................. 51
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figuras
Figura 1. Espécimes analisados no presente trabalho............................................................... 13
Figura 2. Mapa indicando os locais de coleta dos espécimes analisados: UHEBalbina –
01°55’ S, 59°28’; REMAN – 03°08’S, 59°57’W; PAREST – 02°47’S, 60°27’W. ............ 15
Figura 3. Cariótipos de Micoureus demerarae ......................................................................... 22
Figura 4. Cariótipos de Marmosa murina ................................................................................ 25
Figura 5. Cariótipos de Didelphis marsupialis (2n=22)........................................................... 28
Figura 6. Características cariotípicas de Proechimys cuvieri (2n=28) ..................................... 31
Figura 7. Cariótipos de Proechimys guyannensis (2n=46)....................................................... 33
Figura 8. Posição do centrômero e padrão de heterocromatina dos pares 5, 6 e sexuais, de
Micoureus demerarae e Marmosa murina. ......................................................................... 35
Figura 9. Par seis de Marmosa murina em coloração convencional, impregnação por Ag-
NO3 e banda C. .................................................................................................................... 36
Figura 10. Esquema mostrando a inversão pericêntrica em um dos homólogos do par seis.... 36
Figura 11. Distribuição dos citótipos de Proechimys cuvieri.................................................. 45
Figura 12. Distribuição de três cariótipos de P. guyannensis................................................... 47
xii
Tabelas e quadros
Tabela 1. Número diplóide, freqüências relativas (%) e total de células analisadas e locais
de coleta para machos e fêmeas de Micoureus demerarae (identificados pela sua
numeração de campo). ......................................................................................................... 21
Tabela 2: Número diplóide, freqüências relativas (%), total de células analisadas e local de
coleta para machos e fêmeas de Marmosa murina (identificados pela sua numeração de
campo). ................................................................................................................................ 24
Tabela 3: Número diplóide, freqüências relativas (%), total de células analisadas e locais
de coleta para machos e fêmeas de Didelphis marsupialis (identificados pela sua
numeração de campo). ......................................................................................................... 27
Tabela 4: Número diplóide, freqüências relativas (%) e total de células analisadas por
locais de coleta para machos e fêmeas do gênero Proechimys (identificados pela sua
numeração de campo). ......................................................................................................... 29
Quadro 1: Formas de cromossomos sexuais descritos para M. murina. ................................. 39
xiii
1
1. Introdução A floresta amazônica é uma das maiores florestas tropicais do mundo, e no Brasil
ela ocupa nove Estados. Nela são encontrados diversos tipos de ecossistemas, como por
exemplo: matas de terra firme, matas de várzea, igapós, campos, campinarana, campina e
cerrados (Ab’Saber, 1977; INPE, 1999; IBAMA, 2006). Essa riqueza de ecossistemas
abriga uma fauna igualmente diversificada. Na Amazônia brasileira foram registradas 311
espécies de mamíferos, das quais 22 são marsupiais e 72 roedores, porém esses números
tendem a aumentar, seja por avanços na área da taxonomia, seja pela realização de
inventários de longo prazo que combinem diversos métodos de coleta (Voss & Emmons,
1996; da Silva et al., 2001).
Uma revisão realizada por Voss & Emmons (1996) aponta dez sítios de amostragem
que podem ser considerados exemplares na Amazônia; destes, apenas dois estão localizados
no Brasil, nas áreas do Projeto Dinâmica Biológica de Fragmentos Florestais (PDBFF)
próximas a Manaus (AM) e na região do rio Xingú no Pará. Desde então, outros esforços
significativos foram realizados com mamíferos amazônicos, incluindo descrições de
espécies novas de roedores e marsupiais.
Patton et al. (2000), por exemplo, registraram 81 espécies de mamíferos não
voadores em 16 sítios amostrais distribuídos ao longo do rio Juruá, no oeste da região
amazônica e em decorrência desses estudos de campo, descreveram nove espécies novas de
roedores (Patton & da Silva, 1995; da Silva, 1998; Patton et al., 2000). Outro estudo foi o
de Voss et al. (2001), que realizaram um amplo inventário de mamíferos em Paracou, na
Guiana Francesa e encontraram 64 espécies de mamíferos não voadores, sendo 12 espécies
de marsupiais e 22 de roedores, incluindo a descoberta de novas espécies, extensão da
distribuição geográfica de espécies já conhecidas e resolução de problemas taxonômicos há
anos existentes.
Esses poucos exemplos demonstram a falta de conhecimento e a necessidade de
amostragens adequadas nesta região, seguidas de estudos detalhados dos materiais obtidos.
Portanto, não é difícil concluir que a diversidade real dos pequenos mamíferos continua
desconhecida e provavelmente subestimada. Esses autores ainda comentam a existência de
uma diminuição na diversidade de mamíferos no sentido oeste-leste (veja também Emmons
1984), sendo que no oeste está uma das regiões mais ricas das Américas ou mesmo do
mundo, com aproximadamente 200 espécies de mamíferos vivendo em simpatria. Patton et
al. (2000) obtiveram um padrão semelhante quando compararam a comunidade de
pequenos mamíferos do rio Juruá com outros 14 sítios, e estabeleceram dois grupos
geográficos delimitados por um eixo norte-sul que está representado pelos rios Madeira ao
sul do eixo Solimões-Amazonas e o rio Negro ao norte, conforme sugerido por Wallace
(1852) ao observar as comunidades de primatas na Amazônia.
1.1 Características ecológicas de pequenos mamíferos não voadores
Roedores e marsupiais apresentam enorme variação de nichos, hábitats e também de
hábitos, o que pode refletir de forma marcante nas características morfológicas das
espécies. Em geral, apresentam modo de vida noturno e solitário, porém algumas espécies
podem ser avistadas durante o dia e possivelmente em grupo, como esquilos e capivaras
(Voss & Emmons, 1996). Algumas espécies apresentam modo de vida colonial, como
Trinomys yonenagae e as do gênero Clyomys. Nos gêneros de marsupiais Caluromys,
Micoureus, Gracilinanus (família Didelphidae) e de roedores Kannabateomys, Isothrix,
Mesomys (família Echymyidae), os indivíduos exibem adaptações nas patas e caudas para o
modo de vida arborícola. Já nos gêneros Chironectes (família Didelphidae) e Ichtyomys,
Neusticomys e Nectomys (família Cricetidae), os indivíduos possuem membranas
interdigitais incompletas, próprias para o hábito semi-aquático. Existem ainda roedores com
outras adaptações para salto, escavação e planeio (Nowak, 1991; Eisenberg & Redford,
1999).
A dieta desses animais também apresenta uma grande amplitude, possibilitando
classificá-los em seis categorias tróficas: herbívoro, insetívoro, onívoro, seminívoro-
frugívoro, herbívoro/seminívoro-frugívoro, herbívoro/insectívoro (Silva, 2005). Devido ao
hábito frugívoro, eles podem atuar como dispersores ou predadores de sementes,
selecionando as plantas participantes das sucessões ecológicas (Malcolm, 1991).
Além da dispersão e seleção de sementes, roedores e marsupiais também fazem
parte da dieta de outros animais como aves, mamíferos e répteis. Em cachorros-do-mato
(Cerdocyon thous), por exemplo, os vestígios de roedores nas fezes podem chegar a 36%
(Rocha et al., 2004), enquanto em lobos-guará (Chrysocyon brachiurus), roedores e
marsupiais representaram juntos cerca de 22,8% da dieta (Bueno et al., 2002; Silva &
2
Talamoni, 2003). Acunã et al. (2004) estudaram a variação sazonal sobre o consumo de
roedores por suindaras (Tito alba) numa área suburbana chilena e verificaram que cerca de
85% da sua dieta era composta de roedores.
Os primeiros estudos ecológicos de pequenos mamíferos na Amazônia brasileira
tiveram como enfoque a ecologia de comunidade e foram conduzidos na região central,
avaliando os parâmetros ecológicos de riqueza, abundância e biomassa. Essas pesquisas
foram conduzidas por Emmons (1984) e Malcolm (1991) em áreas do Projeto “Dinâmica
Biológica de Fragmentos Florestais”, cujos fragmentos variaram em área e período de
isolamento, mas todos situados próximos à cidade de Manaus.
Estudos subseqüentes demonstraram que algumas espécies de roedores tornaram-se
mais abundantes mediante os efeitos da fragmentação florestal e extração seletiva de
madeira, sendo a única exceção as espécies do gênero Proechimys, que se tornaram mais
raras nessas circunstâncias (Malcolm, 1991; Tavares, 1998). Segundo estes estudos, as
espécies de roedores exploram os ambientes alterados, devido a maior oferta de alimento e
condições mais adequadas para sua proliferação. Dessa forma, espécies de pequenos
mamíferos representam importantes componentes nas comunidades, como indicadores
biológicos do estado de degradação dos fragmentos (Lima, 1998; Rittl, 1998).
Com essa grande diversidade e representatividade dentro dos ecossistemas, a
taxonomia de roedores e marsupiais ainda apresenta-se como um desafio, consideradas a
existência de espécies crípticas, a variabilidade e polimorfismos em diversas características.
Dessa forma muito de sua diversidade pode estar sendo subestimada.
1.2 Ordens Didelphimorphia e Rodentia
A ênfase de nosso estudo será nos marsupiais dos gêneros Micoureus, Marmosa e
Didelphis (Didelphidae) e em roedores do gênero Proechimys (Echimyidae). Além de
nosso interesse científico na sistemática de mamíferos de modo geral, existe também a
disponibilidade de suspensões celulares para os táxons acima indicados nos acervos
biológicos do INPA, e trabalhos em colaboração já estabelecidos para a amostragem desses
animais.
Segundo Stoddart (1979), os pequenos mamíferos compreendem marsupiais,
quirópteros e roedores com massa inferior a seis quilogramas. Roedores e marsupiais são
3
considerados pequenos mamíferos não voadores, pertencentes à classe Mammalia,
subclasse Theria. Os marsupiais estão classificados dentro da Infraclasse Metatheria e
representam cerca de 7% das espécies de mamíferos mais recentemente descritas
(Patterson, 2000). Esta infraclasse contém sete ordens: Didelphimorphia, Microbiotheria e
Paucituberculata, encontradas nas Américas do Sul e do Norte, e as ordens de marsupiais
australianos Dasyuromorphia, Diprotodontia, Peramelemorphia e Notoryctemorphia, que
juntas possuem cerca de 270 espécies conhecidas (Gardner, 1993; Groves, 1993, Carvalho
et al., 2002).
No continente americano, os marsupiais estão distribuídos desde as florestas
austrais da Patagônia passando pelas florestas andinas de grandes altitudes, florestas
tropicais e subtropicais de terras baixas, cerrados, caatingas até as regiões temperadas da
América do Norte, onde estão representados por uma única espécie de gambá, Didelphis
virginiana (Costa, 2005). Na América do Sul, a ordem Paucituberculata é representada por
uma única família, que contém três gêneros viventes e seis espécies encontradas em
florestas e planaltos da região andina; a ordem Microbiotheria é representada por uma única
espécie, Dromiciops gliroides, encontrada em florestas do Chile e Argentina; e a ordem
Didelphimorphia, a mais diversificada, com uma família, 15 gêneros e 87 espécies. No
Brasil todos os marsupiais pertencem exclusivamente a esta última ordem e à família
Didelphidae, sendo que na Amazônia, 12 gêneros podem ser encontrados (Gardner, 1993;
Albuja & Patterson, 1996; da Silva et al., 2001; Wilson & Reeder, 2005).
Os marsupiais contemporâneos são considerados remanescentes de uma fauna que
foi dominante no continente sul-americano durante o período Cenozóico. A família
Didelphidae é considerada entre as mais antigas com provável origem na América do
Norte, mas com radiação praticamente isolada na América do Sul. Atualmente, os
marsupiais dessa família são considerados como um grupo especializado, porém mais
proximamente relacionado aos primeiros didelfimorfos do Cretáceo (Costa, 2005).
O gênero Marmosa é considerado de taxonomia problemática e muitas espécies,
inclusive Micoureus demerarae, foram anteriormente alocadas neste táxon, que segundo o
conceito de Tate (1933) chegou a englobar o que é hoje reconhecido como pertencente a
cinco gêneros distintos de marsupiais didelfídeos de pequeno porte, porém atualmente são
reconhecidas nove espécies para o gênero Marmosa (M. andersoni, M. robinsoni, M.
4
lepida, M. mexicana, M. quichua, M. tyleriana, M. xerophila e M. murina) e seis para o
gênero Micoureus (M. demerarae, M. regina, M. paraguayanus, M. constantiae, M. alstoni
e M. phaeus) (Wilson & Reeder, 2005; Gardner, 2007).
A semelhança entre espécies dos gêneros Marmosa e Micoureus é observada na
morfologia externa, assim como na morfologia craniana dessas espécies (Creighton &
Gardner 2007; Gardner & Creighton 2007), porém estudos morfológicos detalhados
auxiliam no reconhecimento dessas espécies (Patton et al., 2000; Voss et al. 2001).
Segundo Patton et al. (2000), Marmosa murina e espécies de mesmo tamanho pertencentes
ao gênero Marmosops, quando em simpatria, também podem ser confundidos e caracteres
externos e cranianos também se mostram úteis na distinção entre ambas. De fato, em
análises filogenéticas recentes da família Didelphidae, os gêneros Micoureus e Marmosa
apresentaram uma relação filogenética próxima, porém a relação entre eles ainda é incerta,
com Marmosa apresentando-se como um gênero parafilético (Voss & Jansa, 2003; Voss et
al., 2004).
Dentro do gênero Didelphis são conhecidas seis espécies: D. virginiana, D.
albiventris, D. imperfecta, D. aurita, D. pernigra e D. marsupialis (Wilson & Reeder,
2005). Dentre essas espécies, pode-se dizer que Didelphis marsupialis é a única encontrada
na bacia amazônica, embora indivíduos de Didelphis de orelha branca também tenham sido
registrados na região (MNF da Silva, comunicação pessoal). Contudo D. marsupialis e D.
albiventris já foram registradas em simpatria na região das Guianas (Julien-Laferrière,
1991).
Apesar de exemplares de Didelphis marsupialis dificilmente serem confundidos
com didelfídeos pertencentes a outros gêneros, a identificação específica pode ser
dificultada em locais onde ocorram D. marsupialis e D. aurita ou em locais onde ocorram
D. marsupialis e D. albiventris (Cerqueira, 1985; Catzeflis et al., 1997; Lavergne et al.,
1997). Essa dificuldade, contudo, pode ser devidamente superada por pesquisadores
experientes pelo fácil reconhecimento das características diagnósticas (Voss et al., 2001).
A ordem Rodentia está inserida na infraclasse Eutheria. De acordo com a mais
recente classificação, esta ordem possui cinco subordens: Sciuromorpha (quatro famílias),
Castorimorpha (duas famílias), Myomorpha (sete famílias), Anomaluromorpha (duas
famílias) e Hystricomorpha (18 famílias) (Wilson & Reeder, 2005). Destas, três ocorrem na
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Amazônia e estão representadas por oito famílias: Sciuridae, Cricetidae, Erethizontidae,
Dinomyidae, Hydrochaeridae, Dasyproctidae, Agoutidae e Echimyidae com cerca de 25
gêneros e 70 espécies (da Silva et al., 2001; Wilson & Reeder, 2005).
Dentre todos os mamíferos, pode-se dizer que a ordem Rodentia representa um dos
táxons de maior diversificação. Esta ordem possui cerca de 40% das espécies existentes de
mamíferos, apresentando cerca de 2.000 espécies distribuídas em todos os continentes,
exceto na Antártica (Myers, 2000). Na região Neotropical, 60% das novas espécies
descritas de mamíferos pertencem a esta ordem (Patterson, 2000).
Especificamente entre os roedores histricognatos, a família Echimyidae representa a
família mais numerosa com 20 gêneros e 78 espécies, sendo que 20 destas podem ser
encontradas na Amazônia (Voss & Emmons, 1996; Patton et al., 2000).
No caso do gênero Proechimys, atualmente são reconhecidas 25 espécies e as
relações filogenéticas entre as mesmas ainda permanecem incertas, principalmente nos seus
níveis mais basais (Patton & Reig, 1989; da Silva, 1998; Patton et al., 2000; Wilson &
Reeder, 2005). Um dos principais trabalhos abordando a taxonomia do gênero Proechimys
foi realizado por Patton (1987) que, por meio de estudos morfológicos, pôde agrupar 59
nomes dos nomes existentes na literatura em nove grupos de espécie: guyannensis, goeldii,
longicaudatus, simonsi, cuvieri, trinitatus, semispinosus, canicollis e decumanus. Ainda
assim o reconhecimento das espécies pela morfologia carece de amostragens geográficas
abrangentes, mas mostra-se útil para diferenciar espécies simpátricas (Patton & Gardner,
1972; Gardner & Emmons, 1982).
1.3 Citogenética
Os dados citogenéticos têm sido úteis para o delineamento taxonômico de espécies
de pequenos mamíferos e amplamente utilizados em estudos mais recentes, como pode ser
observado nos trabalhos de da Silva (1998), Musser et al. (1998), Bonvicino & Weksler
(1998), Patton et al. (2000), Weksler et al. (2001), Oliveira & Bonvicino (2002), Bonvicino
et al. (2003a; b), entre outros.
A citogenética como ferramenta torna-se particularmente útil no estudo dos
roedores, devido ao fato deste grupo apresentar convergências e homoplasias morfológicas,
que geram inúmeras controvérsias taxonômicas (Bonvicino et al., 2005).
6
Apesar das similaridades em sua morfologia, algumas populações de roedores
possuem cariótipos que podem variar intra-especificamente em nível regional, simpátrica
ou alopatricamente, ou entre populações morfologicamente semelhantes, constituindo as
denominadas espécies crípticas (Mayr, 1977; Futuyma,1992).
Em estudos comparativos utilizando bandeamento cromossômico (banda G), dados
moleculares e morfológicos, Silva et al. (2006) puderam inferir que uma população de
roedores akodontinos com 2n=10 cromossomos era filogeneticamente próxima à outra com
2n=16 cromossomos. Ambas teriam derivado de um ancestral comum que possuía 2n=16
cromossomos, onde vários rearranjos cromossômicos estiveram envolvidos.
Freitas (2006) demonstrou que algumas espécies do gênero Ctenomys têm ampla
variação cromossômica intra-específica regional. Este autor apontou 11 formas cariotípicas,
que se sobrepunham geograficamente umas com as outras, formando zonas híbridas.
Segundo o autor, esta situação concorda com os dados da história geográfica da costa do
estado do Rio Grande do Sul, onde estas espécies habitam, sugerindo que tais zonas
representam um contato secundário destas espécies após o desaparecimento das barreiras.
Taylor (2000) aponta essas diferenciações cromossômicas como barreiras pré- ou pós-
zigóticas devido a incompatibilidades ocasionadas por cruzamentos inter-populacionais,
tornando-as reprodutivamente isoladas.
A descoberta de diferentes cariótipos intra-específicos tem sugerido a existência de
espécies crípticas e levado à realização de novos estudos em taxonomia e sistemática dos
grupos em questão. Nesse âmbito, as técnicas de bandeamentos cromossômicos (C e G, por
exemplo) possibilitam inferir os tipos de rearranjos que ocorreram nas populações,
possibilitando relacioná-los com a história evolutiva do grupo. Essas técnicas têm sido
utilizadas tanto em roedores como em marsupiais da Mata Atlântica (Aniskin &
Volobouev, 1999; Andrade-Miranda et al., 2001; Silva et al., 2006; Freitas, 2006), e mais
recentemente elas têm sido empregadas em espécies amazônicas (Weksler et al., 2001;
Carvalho et al., 2002; Bonvicino et al., 2003a; Machado et al., 2005, Eler, 2008).
Diversos estudos têm enfocado a citogenética de marsupiais e nesse âmbito é
possível reconhecer três principais características comuns: (1) baixos números diplóides,
com variação de 10 a 32 cromossomos, (2) grandes cromossomos (Hayman, 1990) e (3)
alto grau de conservação (Svartman & Vianna-Morgante, 1999). Essas características
7
também são observadas nos marsupiais sul-americanos e na família Didelphidae são
encontrados apenas três números diplóides: 2n=14, 18 e 22 (Reig et al., 1977).
Reig et al. (1977) propuseram três direções para a evolução desses cariótipos. O
primeiro considera o 2n=14 cromossomos como o ancestral e a partir deste teria ocorrido
um aumento para 2n=18 e posteriormente para 2n=22. O segundo seria o surgimento
bidirecional dos cariótipos com 14 e 22 cromossomos a partir do 2n=18. A última
alternativa seria a redução do número diplóide do 2n=22 para 18 e posteriormente para 14.
Hayman (1990), observando os padrões de banda G de diversas espécies de marsupiais,
propôs que o número diplóide 2n=14 seria o ancestral. Recentemente, com a aplicação de
técnicas de hibridização in situ foram observadas seqüências teloméricas próximas ao
centrômero de cromossomos com dois braços, o que corrobora a hipótese de que eventos de
diferenciação cromossômica nos marsupiais teria seguido a direção da redução do número
diplóide por meio de fusões (Svartman & Vianna-Morgante, 1998; Carvalho & Mattevi,
2002).
Já nas espécies do gênero Proechimys são observadas 57 formas cromossômicas
para cerca de 25 espécies (Eler, 2007). Os números diplóide e fundamental autossômico
(NFa conforme Gardner & Patton, 1976) variam de 2n=14 e NFa=18, como em Proechimys
sp. (Barros, 1978) até 2n=62 e NFa=80 em P. trinitatis (Aguilera & Corti, 1994). Dentro
dessa variação um mesmo número diplóide pode apresentar mais de um NFa e uma espécie
pode mostrar mais de um número diplóide, o que gera essa grande quantidade de citótipos.
Nesse contexto a análise cromossômica, combinada a análises morfológicas e moleculares,
tem se mostrado útil para distinção de espécies simpátricas (Patton & Gardner, 1972; da
Silva 1998), porém existem variações geográficas nos cariótipos das espécies de
Proechimys (Reig et al., 1980; Gardner & Emmons, 1984). Mesmo com diversos cariótipos
já registrados, nenhuma hipótese para a evolução cromossômica pôde ser elaborada para
este grupo em grande parte devido à carência de informações citogenéticas para a grande
maioria dos táxons de Proechimys e em função da inexistência de uma filogenia robusta
estabelecendo as relações interespecíficas neste gênero.
Apesar de sua grande diversidade, espécies amazônicas ainda foram pouco
exploradas no campo da citogenética, mais especificamente em relação aos bandeamentos
cromossômicos. Desse modo, dada a importância das técnicas citogenéticas em auxiliar na
8
caracterização e identificação das espécies de pequenos mamíferos da Amazônia, e sua
importância para o entendimento dos eventuais fatores que podem levar a eventos de
especiação, o presente trabalho teve como proposta fornecer dados cromossômicos de três
espécies de marsupiais dos gêneros Micoureus, Marmosa e Didelphis e duas de roedores do
gênero Proechimys de três localidades da Amazônia Central, visando contribuir para a
eventual compreensão do processo evolutivo destes táxons na Amazônia.
9
1.4. Objetivos
1.4.1. Objetivo geral
● Descrever os cariótipos de pequenos mamíferos representantes de três localidades
da Amazônia Central, com ênfase nos gêneros Micoureus, Marmosa e Didelphis
(Didelphimorphia, Didelphidae) e do gênero Proechimys (Rodentia, Echimyidae),
em busca de dados que auxiliem na taxonomia e na compreensão da evolução
desses táxons.
1.4.2. Objetivos específicos
● Apresentar o cariótipo de espécies dos gêneros Micoureus, Marmosa e Didelphis
(Didelphimorphia, Didelphidae) e do gênero Proechimys (Rodentia, Echimyidae)
da Amazônia Central.
● Estabelecer os padrões de distribuição da heterocromatina constitutiva (banda C),
das regiões organizadoras do nucléolo (RONs) e da banda G nos cromossomos
mitóticos dos indivíduos coletados, para a detecção de polimorfismos e/ou
variabilidade cromossômica.
● Comparar os resultados encontrados com dados citogenéticos existentes na
literatura para esses táxons provenientes de outras áreas da Amazônia para
identificar as peculiaridades dos cariótipos das populações estudadas.
10
2. Material e Métodos 2.1 Material
Os animais analisados neste estudo foram obtidos a partir da colaboração
estabelecida com os seguintes projetos: (1) Projeto Muruatá da Petrobrás em convênio com
a Universidade Federal do Amazonas; (2) Levantamento faunístico de mamíferos de
pequeno porte na região do Parque Estadual do Rio Negro Setor Sul – Instituto de
Pesquisas Ecológicas (Ipê); (3) Caracterização genética (cromossomos, proteínas e DNA)
de peixes e pequenos mamíferos da Amazônia – INPA/PPI. Dentre os táxons coletados no
âmbito desses projetos e para os quais existiam suspensões celulares, foram escolhidos os
mais comuns a cada local de coleta: Proechimys e Didelphis estavam presentes em todas as
localidades, Micoureus em duas e Marmosa em apenas uma localidade. A seguir, é
apresentada uma breve descrição da morfologia externa de cada um dos táxons analisados
no presente estudo.
Roedores sauiá do gênero Proechimys
Os representantes do gênero Proechimys podem ser facilmente reconhecidos, pela
sua forma generalizada e típica de roedores terrestres. Sua pelagem dorsal consiste de uma
mistura de pêlos setiformes, um pouco mais suaves, com pêlos aristiformes mais alongados
e enrijecidos, característicos dos equimídeos. A coloração da pelagem dorsal e lateral
geralmente é castanho avermelhado e o ventre é branco e raramente com tons de cinza ou
avermelhado na região da garganta, peitoral e inguinal. O comprimento da cauda é sempre
menor que o comprimento da cabeça e corpo (comprimento da cabeça e corpo varia de 80 a
500 milímetros e o comprimento da cauda 124 a 180 milímetros). A cabeça e o rostro são
alongados, as orelhas são grandes e eretas quando comparadas aos demais equimídeos de
porte similar. As patas posteriores são longas (com variação de 38 a 56 milímetros) e
estreitas e possuem cinco dedos compridos e delgados, enquanto as patas anteriores são
curtas e possuem quatro dedos (Patton et al., 2000) (Figura 1a).
11
Mucuras-chichica do gênero Micoureus
São marsupiais didelfídeos arbóreos de porte médio cujo comprimento da cabeça e
corpo varia de 158 a 210 milímetros e o comprimento da cauda varia de 225 a 270
milímetros e podem pesar 80 a 152 gramas. A cauda geralmente exibe uma única cor ou
pode ser “malhada”. A pelagem dorsal é espessa e lanosa e a coloração varia do castanho
ao castanho acinzentado. A pelagem ventral é curta de textura lisa ou menos lanosa
enquanto a coloração varia do cinza pálido ao amarelo creme ou bege alaranjado (Gardner,
2007) (Figura 1b).
Mucuras do gênero Marmosa
Esse gênero inclui didelfídeos com uma variação ampla no comprimento corporal
(95-176 mm) e, como observado em Micoureus, o comprimento da cauda (130-211 mm)
sempre supera o comprimento da cabeça e corpo e o peso pode variar de 10 a 132 gramas
entre as espécies. A coloração da cauda pode ser uniforme, parcialmente corada ou
fracamente bicolor. A cor, comprimento e densidade da pelagem variam
interespecificamente, porém nunca é tão grossa ou lanosa como em Micoureus.
Dorsalmente, a pelagem exibe coloração que varia do cinza, “castanho arenoso” e canela
vivo ao castanho avermelhado. Na porção ventral a variação da pelagem pode ser de branco
creme ao bege pálido e em algumas espécies, os pêlos ventrais possuem a base acinzentada,
principalmente nas porções laterais do corpo (Gardner, 2007) (Figura 1c).
Mucura-preta do gênero Didelphis
Esse gênero inclui as espécies de maior porte dentre os didelfídeos, seus
comprimentos corporais variam de 305 até 437 milímetros na cabeça e corpo enquanto que
o comprimento da cauda varia 290 a 430 milímetros, o peso varia de 500 gramas até 2
quilogramas. São facilmente distinguíveis dos demais gêneros da família, porém a
identificação das espécies pode ser problemática em zonas de simpatria, como por exemplo,
Didelphis marsupialis e D. aurita do sudeste brasileiro (Cerqueira, 1985). A pelagem
consiste de longos pêlos-guarda que se sobrepõem por uma camada inferior mais lanosa.
Existem duas formas notáveis de coloração da pelagem, uma preta e outra branca ou
grisalha, sendo que ambas podem ser encontradas em simpatria. A mancha preta sobre os
12
olhos, típica de outros didelfídeos está ausente neste gênero. Outra característica particular
deste grupo é o forte odor que marca a presença do animal, quando não é possível observá-
lo diretamente (Patton et al., 2000) (Figura 1d).
Figura 1. Exemplares dos gêneros analisados no presente trabalho: a) Proechimys cuvieri
(Foto: Marco Antônio Schetino); b) Micoureus demerarae jovem (Foto: Rafael Benhard); c) Marmosa sp. (fonte: http://www.knowyoursto.com/images); d) Didelphis marsupialis (Foto: Rafael Benhard).
2.2 Locais de Coleta
• Reservatório da Usina Hidroelétrica de Balbina (dados retirados do site do
IBAMA, 2006) A Usina Hidrelétrica de Balbina (UHE Balbina) localiza-se no rio Uatumã, afluente
da margem norte do rio Amazonas, município de Presidente Figueiredo, Estado do
Amazonas está situada nas coordenadas geográficas 01o 55' S, 59o 28' W. O reservatório de
Balbina foi formado com o represamento do rio Uatumã, teve um longo período de
enchimento (15 meses) e o tempo médio de residência da água é elevado (11,7 meses) em
13
função das características morfológicas da bacia de drenagem (relevo extremamente plano,
com entalhamentos pouco pronunciados), que favoreceram a formação de um grande lago
(área inundada de aproximadamente 2.360 km²), raso (profundidade média de 7 metros),
com inúmeras ilhas (cerca de 3.300), margens dendríticas e uma grande quantidade de
árvores mortas afogadas ("paliteiros"). A vegetação da reserva de Balbina é composta
basicamente por florestas naturais, com poucas áreas desmatadas, sendo que nas margens
do grande lago e igarapés ocorre uma vegetação de igapó. De modo geral, antes da
formação do reservatório, foram identificadas as seguintes tipologias florestais: mata de
terra-firme, mata de igapó, mata de baixio, campina e campinarana (Figura 2).
• Mata da Refinaria de Manaus (REMAN-Município de Manaus)
São dois os fragmentos que pertencem à refinaria de petróleo Isaac Sabbá (UN-
REMAN) da empresa estatal Petrobrás, localizada no Distrito Industrial, zona leste de
Manaus (03° 08’ S, 59° 57’ W). Esses dois pequenos fragmentos são constituídos de mata
secundária e estão isolados dentro do perímetro urbano. Ambos estão claramente sob forte
influência antrópica, vestígios de atividade humana, como o lixo encontrado. O sub-bosque
é fechado, apresentando uma grande quantidade de cipós e palmeiras (Figura 2).
• Parque Estadual do Rio Negro Setor Sul
O Parque Estadual do Rio Negro Setor Sul (PAREST – rio Cuieiras) foi formado a
partir do Decreto Estadual 16.497/1995, gerido pelo IPAAM (Ipê, 2006). Ocupa uma área
de 257.422 hectares na margem esquerda do baixo rio Negro, nos municípios de Manaus e
Novo Airão nas coordenadas geográficas 02° 47’ S, 60° 27’ W. A vegetação é constituída
por floresta primária, com tipologias florestais semelhantes às descritas para o reservatório
de Balbina (Figura 2).
14
Figura 2. Mapa indicando os locais de coleta dos espécimes analisados: UHEBalbina –
01°55’ S, 59°28’; REMAN – 03°08’S, 59°57’W; PAREST – 02°47’S, 60°27’W.
2.3. Métodos
2.3.1. Técnica de coleta
No presente trabalho foram utilizadas armadilhas “live-traps” dos tipos “tomahawk”
(14x14x40cm) e “sherman” (8x8x23cm). Na REMAN foram estabelecidos dois transectos,
um em cada fragmento. No rio Cueiras (PAREST) foi estabelecido um transecto em cada
margem. Na UHE de Balbina foi estabelecido um transecto em cada uma das duas ilhas
escolhidas. As armadilhas foram dispostas aos pares (uma “tomahawk” e uma “sherman”)
em 40 estações espaçadas por uma distância de cerca de 30 metros. A disposição das
armadilhas, em cada estação, foi feita obedecendo ao seguinte critério: em estações
ímpares, as “shermans” foram instaladas no sub-bosque em árvores ou cipós que faziam
15
alguma ligação com o dossel, enquanto as “tomahawks” foram instaladas no chão em frente
a tocas ou troncos caídos. Em estações pares foi feito o inverso.
Em cada localidade, as armadilhas permaneceram ativadas por um período de 10
noites e foram vistoriadas a cada dia, no período matutino. As iscas foram compostas por
fatias de banana com pasta de amendoim torrado e moído, que foram substituídas a cada
dois dias ou de acordo com a necessidade.
Cada espécime coletado teve seus dados de idade, sexo, estágio reprodutivo, peso,
medidas, localidade, ambiente e condições climáticas anotados em caderno de campo
padronizado pela curadoria da Coleção de Mamíferos do INPA e foram depositados nesta
coleção, onde foram identificados pela Dra. Maria Nazareth Ferreira da Silva, curadora da
Coleção de Mamíferos do INPA. Os espécimes tiveram a pele, crânio, esqueleto, suspensão
celular preparados e seus tecidos coletados. Os indivíduos cujas peles não foram
taxidermizadas foram fixados em formol 10% e depois preservados em álcool etílico 70%.
As licenças de coleta e transporte foram emitidas pelo IBAMA (número: 10985-1).
2.3.2. Obtenção de cromossomos mitóticos
Os cromossomos mitóticos foram obtidos pelo método in vivo segundo Ford &
Harmerton (1956), utilizando-se colchicina diluída a 0,025% em uma proporção de 1 mL
para cada 100 gramas de peso animal. Essa substância foi injetada intraperitonealmente no
animal vivo que foi colocado em descanso por um período de trinta minutos logo após a
injeção. Após esse tempo, o animal foi morto utilizando-se inalação de éter etílico. Em
seguida, os fêmures foram retirados e suas epífises cortadas e com o auxílio de uma seringa
de 10 mL, a medula óssea foi expelida do canal medular por meio de lavagens sucessivas
com solução hipotônica de cloreto de potássio 0,075M, e colocada em placa de Petri até a
remoção total desse material. O material foi homogeneizado e colocado em banho-maria ou
estufa a 37 ºC por 30 minutos para efetuar a hipotonização das células. A solução foi
transferida para um tubo Falcon de 15mL onde foram adicionadas oito a 10 gotas de
fixador Carnoy (metanol 3:1 ácido acético) e foi novamente homogeneizada. Essa solução
foi centrifugada e o sobrenadante descartado, sendo que o “pelet” foi ressuspendido em
fixador Carnoy. Esses passos foram repetidos duas vezes. Após a última centrifugação, o
sobrenadante foi novamente descartado e o fixador foi adicionado na proporção de 2:1 em
16
relação à quantidade de sedimento, homogeneizando a seguir. Por fim o material foi
transferido para um tubo Eppendorf devidamente identificado com o número do espécime e
guardado em freezer (-10°C).
No laboratório, duas a três gotas das suspensões celulares foram pingadas em
lâminas de vidro limpas e aquecidas em água destilada a 55 °C, deixando secar à
temperatura ambiente. Posteriormente foram coradas com solução de Giemsa, diluída a 5%
em tampão fosfato pH 6,8, por 10 minutos e lavadas em água destilada, deixando-se secar
ao ar.
2.3.3. Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C) Para a detecção da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica de banda C
descrita por Sumner (1972), com modificações específicas para roedores e marsupiais
descritas a seguir.
Para Proechimys, as lâminas contendo duas ou três gotas da suspensão celular foram
envelhecidas em estufa a 60 ºC por uma semana. Após esse período, as lâminas foram
tratadas durante 2 minutos com HCl 0,2N a 45 ºC, lavadas em água destilada e secas ao ar.
Posteriormente, foram incubadas em solução salina 2xSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato
trissódico 0,03M, pH 6,8) a 60 ºC, por 15 minutos, lavadas em água destilada e secas ao ar.
Em seguida cada lâmina foi tratada separadamente em solução de hidróxido de bário 5%,
filtrada e recém preparada a 47 ºC, por 20 a 30 segundos. A ação do hidróxido de bário foi
interrompida imergindo rapidamente a lâmina em solução de HCl 0,2N (45 ºC), sendo
posteriormente lavada em água destilada. Após secas, as lâminas foram incubadas em
solução 2xSSC a 60 ºC, por um período de 40 minutos, sendo posteriormente lavadas, secas
ao ar, coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato 0,06M, pH 6,8 por 20 minutos, lavadas e
novamente secas ao ar.
Para os marsupiais não foi necessário envelhecer as lâminas. Estas foram incubadas
em solução salina 2XSSC a 60 ºC por 15 minutos, lavadas em água destilada, secas ao ar e
posteriormente tratadas com HCl 0,2N por 20 minutos em temperatura ambiente. O tempo
de incubação na solução de Hidróxido de Bário variou de 10 a 20 segundos e o tempo de
coloração em Giemsa 5% foi de 25 a 30 minutos.
17
2.3.4. Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (RONs)
Para a detecção das RONs foi utilizada a técnica de precipitação de cristais de Prata
(Ag-RON), descrita por Howell & Black (1980), que consistiu em pingar sobre a lâmina,
uma gota de solução aquosa de gelatina a 2% acrescida de ácido fórmico na proporção de
1mL/100mL de solução, foram adicionadas sobre a gota de gelatina duas gotas de solução
aquosa de Nitrato de Prata (AgNO3) a 50%, quando se agitou levemente a lâmina que foi
então coberta com lamínula; a lâmina foi colocada em câmara úmida e levada ao banho-
maria ou estufa a 60 °C, por um período de dois a quatro minutos, ou até que a lâmina
apresenta-se uma coloração marrom-dourada; as lâminas foram lavadas em água destilada,
permitindo que a lamínula e o excesso de soluções fossem removidos e deixadas secar ao
ar. Para melhor visualização das marcas, algumas lâminas foram coradas com solução de
Giemsa diluído a 2% em tampão fosfato pH 6,8, por 20-30 segundos, lavadas e deixadas
secar ao ar.
2.3.5. Bandeamento G (GTG)
Para o bandeamento G foi utilizada a técnica descrita por Seabright (1971), com
pequenas modificações. Para Proechimys, as lâminas contendo duas ou três gotas da
suspensão celular foram envelhecidas por uma semana em estufa a 28 ºC e para os
marsupiais as lâminas tratadas eram recém preparadas. As lâminas foram tratadas por 15
minutos em solução 2XSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trissódico 0,06M e pH 6,8) a
60 °C; lavadas e deixadas secar ao ar. Em seguida, estas foram imersas em uma solução
contendo 5 mL de tripsina 1:250 1% e 95mL de solução tampão fosfato pH 6,8, a uma
temperatura próxima do congelamento, por um período de cinco a oito segundos. A ação da
tripsina foi bloqueada em uma solução de 49 mL de tampão fosfato e 1 mL de soro fetal
bovino e em seguida, as lâminas foram imersas em uma solução tampão fosfato pH=6,8 e
por último lavadas em água destilada e secas ao ar. Em seguida, as lâminas foram coradas
com solução de Giemsa, diluída a 3% em tampão fosfato pH 6,8. O tempo de coloração
utilizado para Proechimys foi de 7 minutos e para os marsupiais variou de cinco a 10
minutos. As lâminas foram lavadas e secas ao ar.
18
2.3.6. Análise cariotípica
As preparações cromossômicas foram examinadas em microscópio óptico comum
com objetiva de imersão. Foram contadas pelo menos 30 metáfases de cada indivíduo, com
o intuito de estabelecer o valor modal (2n) e o número fundamental de braços autossômicos
(NFa) de cada espécime, de acordo com Gardner & Patton (1976). As melhores metáfases
foram digitalizadas com uma câmera fotográfica digital acoplada a um microscópio na
objetiva de imersão. Para a montagem dos cariótipos, os arquivos fotográficos foram
editados no programa Adobe Photoshop 7,0. Os cromossomos foram recortados,
emparelhados, medidos utilizando o programa ImageJ e agrupados de acordo com a
morfologia e em ordem decrescente de tamanho. A morfologia dos cromossomos foi
determinada de acordo com a posição do centrômero segundo Levan et al. (1964), com
base no índice de relação de braços (RB= comprimento do braço maior/comprimento do
braço menor) e classificados em metacêntricos (RB=1,0-1,69), submetacêntricos (RB=1,7-
2,99), subtelocêntricos (RB=3,00-6,99) e acrocêntricos (RB =7,00).
Na determinação do número fundamental autossômico (NFa), para efeito de
contagem, foram considerados apenas os autossomos, sendo que os metacêntricos,
submetacêntricos e subtelocêntricos como tendo dois braços distintos e os acrocêntricos
um.
19
3. Resultados
3.1. Ordem Didelphimorphia - Família Didelphidae
Desta família foram analisadas três espécies em três gêneros: Micoureus demerarae,
Marmosa murina e Didelphis marsupialis.
3.1.1 Micoureus demerarae – 2n=14; NFa=20
Desta espécie foram analisados oito machos e três fêmeas coletados na REMAN e
dois machos e uma fêmea coletados no rio Cuieiras, totalizando 378 células utilizadas para
a determinação do número diplóide (Tabela 1). Todos os indivíduos apresentaram o número
diplóide igual a 14 cromossomos e NFa= 20. Dentre os autossomos, os três pares
submetacêntricos foram os maiores do complemento, com um decréscimo gradual de
tamanho. O par metacêntrico possui um tamanho médio em relação aos demais, enquanto
os dois pares acrocêntricos corresponderam à metade do tamanho do par metacêntrico. O
par sexual consistiu de dois acrocêntricos, sendo o Y cerca de um terço do tamanho do X
(fórmula cariotípica: 2m+6sm+4a+XX/XY) (Figura 3a).
A região organizadora de nucléolo foi detectada na porção terminal dos dois pares
acrocêntricos, sendo nos braços longos no par 5 e nos braços curtos no par 6 (próximas ao
centrômero). Nenhuma variação quanto à distribuição das RONs foi observada entre os
indivíduos (Figura 3b).
A heterocromatina constitutiva foi observada em grandes blocos na região
pericentromérica de todos os autossomos. O cromossomo Y esteve inteiramente
heterocromático, enquanto o cromossomo X esteve quase todo heterocromático, exceto por
uma estreita faixa eucromática proximal. Em ambos os pares cromossômicos, a RON foi
negativa para banda C (Figura 3c).
A banda G possibilitou o emparelhamento correto dos homólogos, principalmente
dos maiores pares autossômicos (Figura 3d).
20
Tabela 1. Número diplóide, freqüências relativas (%) e total de células analisadas para machos e fêmeas de Micoureus demerarae (identificados pela numeração de campo) para cada localidade de coleta.
2n Local Sexo Indivíduos
12 13 14 15
Total de
células
Número diplóide
Número fundamental
EE 149 0 1 29 0 30 14 20 EE 154 0 6 24 0 30 14 20 Fêmea EE 158 3 4 22 1 30 14 20 EE 148 0 4 24 2 30 14 20 EE 151 3 3 22 2 30 14 20 EE 157 3 3 22 1 29 14 20 EE 167 0 2 8 0 10 14 20 EE 170 2 4 24 30 14 20 EE 176 5 5 20 0 30 14 20 EE 189 0 4 24 2 30 14 20
Macho
EE 235 0 0 8 1 9 14 20 Total 16 36 227 9 288
REM
AN
(M
anau
s)
% 5,55 12,5 78,81 3,12 Fêmea EE 193 5 6 19 0 30 14 20
EE 194 4 4 21 1 30 14 20 Macho
EE 196 3 5 20 2 30 14 20 Total 12 15 60 3 90 PA
RES
T rio
Cui
eira
s
% 13,33 16,66 66,66 3,33
21
Figura 3. Cariótipos de Micoureus demerarae (EE 167): a) em coloração convencional; b)
regiões organizadoras de nucléolo, impregnadas por nitrato de prata; c) após a
aplicação da técnica de banda C; d) após aplicação da técnica de banda G. Em
destaque os cromossomos sexuais do sexo oposto. Barra igual a 5 µm.
22
3.1.2 Marmosa murina – 2n=14; NFa=22
A fim de determinar o número diplóide de M. murina foram analisadas 201 células
de cinco machos e duas fêmeas (Tabela 2). Todos os indivíduos apresentaram 2n=14 e
NFa= 22. Dentre os autossomos os três pares submetacêntricos foram os maiores do
complemento, com um decréscimo gradual de tamanho. O par metacêntrico possui um
tamanho médio em relação aos demais. Os últimos dois pares, um subtelocêntrico e um
acrocêntrico, foram os menores do complemento autossômico com metade do tamanho do
par meatcêntrico. O cromossomo X foi classificado como acrocêntrico e o Y como
puntiforme, com aproximadamente a metade do tamanho do cromossomo X (fórmula
cromossômica: 2m+6sm+2st+2a+XX/XY) (Figura 4a). O par seis apresentou um
heteromorfismo em todos os indivíduos, quanto à morfologia dos seus acrocêntricos, onde
um dos homólogos desse par possui um pequeno braço acima de seu centrômero.
A região organizadora de nucléolo foi evidenciada em dois pares cromossômicos. A
primeira marcação foi observada na porção terminal dos braços longos do par
subtelocêntrico (par 5), enquanto que no par 6 a região organizadora de nucléolo localizou-
se terminalmente nos braços curtos, porém uma inversão pericêntrica foi observada em um
dos homólogos (Figura 4b, 9 e 10).
A heterocromatina constitutiva foi observada na região pericentromérica dos
autossomos, porém muito tênue. No maior par submetacêntrico uma marcação foi
evidenciada na região telomérica dos braços longos. Os cromossomos sexuais
apresentaram-se completamente heterocromáticos. Um dos homólogos do par 6 apresentou
uma marcação pericentromérica e outra pequena quantidade na porção distal do pequeno
braço curto, acima da região organizadora de nucléolo (Figura 4c, 9 e 10).
A banda G possibilitou o emparelhamento correto dos homólogos, principalmente
dos maiores pares autossômicos (Figura 4d).
23
Tabela 2: Número diplóide, freqüências relativas (%) e total de células analisadas para machos e fêmeas de Marmosa murina (identificados pela numeração de campo) coletados em Balbina.
2n Local Sexo Indivíduos
12 13 14 15
Total de
células
Número diplóide
Número fundamental
CEF 04 4 8 13 5 30 14 22
CEF 08 2 8 10 1 21 14 22
CEF 18 5 7 18 0 30 14 22
CEF 28 5 10 14 1 30 14 22
Macho
CEF 32 3 8 19 0 30 14 22
CEF 16 2 4 23 1 30 14 22 Fêmea
CEF 27 4 7 19 0 30 14 22
Total 25 52 115 8 201
UH
E B
albi
na
% 12,6 25,8 57,6 4,0
24
Figura 4. Cariótipos de Marmosa murina (CEF 08): a) em coloração convencional; b)
regiões organizadoras de nucléolo, após impregnação por nitrato de prata; c) após
bandeamento C; d) após bandeamento G. Em destaque os cromossomos sexuais
do sexo oposto. Barra igual a 5 µm.
25
3.1.3 Didelphis marsupialis – 2n=22; NFa=20 Esta espécie foi encontrada nas três áreas de coleta e um total de 17 indivíduos
foram analisados, sendo sete machos e quatro fêmeas da REMAN, dois machos e duas
fêmeas do rio Cuieiras e um macho e uma fêmea da UHE de Balbina, totalizando 465
células observadas para a determinação do número diplóide. Todos os indivíduos desta
espécie, das três localidades, apresentaram 2n=22, NFa=20 e fórmula cariotípica: 20a +
XX/XY (Tabela 3). Três pares foram de tamanho grande e os demais de tamanho médio. O
cromossomo X é um acrocêntrico pequeno e o Y puntiforme (Figura 5a).
As regiões organizadoras de nucléolo foram evidenciadas em três pares
cromossômicos, provavelmente, nos pares 5,7 e 8. Nos pares 5 e 8 as marcações foram
observadas em posição terminal dos braços longos, enquanto que no par 7 foram
observadas marcações terminais em ambos os braços (Figura 5b). Porém, quanto à
atividade, as marcações variaram de quatro a oito.
A heterocromatina constitutiva apresentou-se num padrão difuso e se distribuiu na
região centromérica de todos os cromossomos e na região telomérica de alguns, sendo que
em um par foi mais evidente. No par sexual, o X marcou o centrômero e o Y apresentou-se
totalmente heterocromático (Figura 5c).
A banda G possibilitou o emparelhamento correto dos homólogos, principalmente
dos maiores pares autossômicos (Figura 5d).
26
Tabela 3: Número diplóide, freqüências relativas (%) e total de células analisadas para machos e fêmeas de Didelphis marsupialis (identificados pela numeração de campo) por área de coleta.
2n Local Sexo Indivíduos
20 21 22 23 Total de células
Número diplóide
Número fundamental
Macho CEF 13 1 1 16 0 18 22 20 Fêmea CEF 05 7 5 21 2 35 22 20
Total 8 6 37 2 53 UH
E B
albi
na
% 13,33 10,00 61,66 3,33 EE 174 3 3 11 2 19 22 20 EE 224 3 4 20 0 27 22 20 EE 227 1 4 17 0 22 22 20 Fêmea
EE 250 3 4 17 3 30 22 20 EE 155 3 4 20 3 30 22 20 EE 173 8 5 15 2 30 22 20 EE 183 5 4 18 3 30 22 20 EE 190 7 5 12 0 24 22 20 EE 232 5 5 15 5 30 22 20 EE 237 3 6 19 2 30 22 20
Macho
EE 249 2 4 24 0 30 22 20 Total 42 47 188 20 297
REM
AN
(M
anau
s)
% 14,14 17,60 63,29 6,73 EE 203 2 2 21 5 30 22 20
Macho EE 206 1 1 9 5 16 22 20
EE 197 2 2 25 1 30 22 20 Fêmea
EE 204 4 2 23 1 30 22 20
Total 9 9 78 12 108
PAR
EST
rio C
uiei
ras
% 8,33 8,33 72,22 11,11
27
Figura 5. Cariótipos de Didelphis marsupialis (EE 249): (a) em coloração convencional; (b)
regiões organizadoras de nucléolo, após impregnação por Nitrato de Prata; (c)
após bandeamento C; (d) após bandeamento G. Em destaque os cromossomos
sexuais do sexo oposto. Barra igual a 5 µm.
28
3.2. Ordem Rodentia - Família Echimyidae
Foram analisados citogeneticamente 11 indivíduos do gênero Proechimys, sendo
dois machos e uma fêmea da REMAN, dois machos da PAREST- rio Cuieiras,
identificadas como Proechimys cuvieri, e quatro machos e duas fêmeas da UHE Balbina,
identificados como Proechimys guyannensis, totalizando 314 células para a determinação
do número diplóide (Tabela 4). Dois números diplóides foram detectados: 2n=28
cromossomos para os indivíduos da REMAN e da PAREST- rio Cuieiras e 2n=46 para os
indivíduos da UHE Balbina.
Tabela 4: Número diplóide, freqüências relativas (%) e total de células analisadas por locais de coleta para machos e fêmeas do gênero Proechimys (identificados pela sua numeração de campo).
Número diplóide Local Sexo Indivíduos
26 27 28 29 30 44 45 46 47 Total de células
Número fundamental autossômico
EE 238♂ 4 5 17 3 1 30 46 Macho
EE 251♂ 6 6 15 2 1 30 46
EE 252♀ 3 3 13 1 0 20 46 Fêmea
Total 13 14 45 6 2 80
REM
AN
(Man
aus)
% 16,2 17,5 56,3 7,5 2,5
EE 217♂ 7 4 12 3 4 30 46 Macho
EE 218♂ 6 8 15 1 0 30 46
Total 13 12 27 4 4 60
PAR
EST
- rio
C
uiei
ras
% 21,6 20,0 45,0 6,7 6,7
CEF 01♂ 4 9 17 0 30 52
CEF 10♂ 4 5 20 1 30 52
CEF 12♂ 7 7 16 0 30 52 Macho
CEF 15♂ 6 6 18 0 30 52
CEF 14♀ 9 7 14 0 30 52 Fêmea
CEF 24♀ 7 6 11 0 24 52
Total 37 40 96 1 174
UH
E B
albi
na
% 21,2 23,0 55,2 0,6
29
3.2.1 Proechimys cuvieri - 2n=28; NFa=46 Os indivíduos coletados na PAREST - rio Cuieiras (dois machos) e na REMAM -
Manaus (dois machos e uma fêmea) apresentaram número diplóide 2n=28 cromossomos e
NFa=46, sendo que os autossomos consistiram de: sete pares metacêntricos, dois pares
submetacêntricos e três acrocêntricos. O cromossomo X apresentou-se como um
acrocêntrico médio e o Y como um cromossomo puntiforme (fórmula cariotípica:
14m+4sm+2st+6a+XX/XY). Os maiores cromossomos do cariótipo consistiram de um par
metacêntrico (par 1), um par subtelocêntrico (par 10) e um par acrocêntrico (par 11) (Figura
6a).
A região organizadora de nucléolo (RON) localizou-se intersticialmente, nos braços
longos de um par de cromossomos submetacêntricos (par 9). Em algumas metáfases em
coloração convencional, essa região foi facilmente reconhecida como uma constrição
secundária (Figura 6b).
A heterocromatina banda C positiva foi observada na região centromérica de sete
pares autossômicos: os três pares metacêntricos pequenos, o par 9 submetacêntrico e todos
os acrocêntricos. Porém, foi observado um heteromorfismo quanto ao tamanho dos blocos
heterocromáticos do par portador da RON (par 9). Nos cromossomos sexuais, apenas o X
apresentou um bloco heterocromático proximal no braço longo fracamente corado (Figura
6c).
A banda G possibilitou o emparelhamento correto dos homólogos, principalmente
dos maiores pares cromossômicos. O padrão observado mostrou-se idêntico em todos os
indivíduos analisados (Figura 6d).
30
Figura 6. Cariótipos de Proechimys cuvieri (EE 238): (a) coloração convencional; (b)
regiões organizadoras de nucléolo, após impregnação por Nitrato de Prata, em
conjunto à constrição secundária em Giemsa; (c) após bandeamento C; (d) após
bandeamento G. Em destaque os cromossomos sexuais do sexo oposto. Barra
igual a 5 µm.
31
3.2.2 Proechimys guyannensis - 2n=46; NFa=50 Os indivíduos coletados na UHE Balbina (quatro machos e duas fêmeas)
apresentaram número diplóide igual a 46 cromossomos, número de braços autossômicos
NFa=50, sendo que os autossomos consistiram de: dois pares metacêntricos, um
submetacêntrico e 19 pares acrocêntricos. Os cromossomos X e Y são acrocêntricos, sendo
o Y aproximadamente metade do tamanho do X (fórmula cariotípica
4m+2sm+38a+XX/XY). Os maiores cromossomos foram os pares acrocêntricos 4, 5 e 6
(Figura 7a).
A região organizadora de nucléolo localizou-se intersticialmente no braço longo de
um par submetacêntrico (par 3), sendo que a constrição secundária não foi observada em
todas as metáfases, em coloração convencional (Figura 7b).
A banda C positiva foi observada na região centromérica e se distribuiu entre 10
pares cromossômicos, sendo um par metacêntrico, um par submetacêntrico e os demais
acrocêntricos, e nos cromossomos sexuais. Nos autossomos e no cromossomo X a
heterocromatina localizou-se na região pericentromérica enquanto o Y apresentou-se
totalmente heterocromático (Figura 7c).
A banda G possibilitou o emparelhamento correto dos homólogos e neste citótipo a
RON, presente no terceiro par, mostrou-se negativa para banda G (Figura 7d).
32
Figura 7. Cariótipos de Proechimys guyannensis (CEF 01): (a) em coloração
convencional; (b) regiões organizadoras de nucléolo, após impregnação por
Nitrato de Prata; (c) após bandeamento C; (d) após bandeamento G. Em
destaque os cromossomos sexuais do sexo oposto.
33
4. Discussão
Os primeiros dados citogenéticos de marsupiais remontam ao trabalho de Jordan
(1911) apud Reig et al. (1977) sobre a espermatogênese de Didelphis virginiana. Desde
então, dados citogenéticos de espécies de marsupiais australianos e americanos têm sido
gerados e atualmente são conhecidos os cariótipos de aproximadamente 180 espécies.
Considerando-se apenas a família Didelphidae, três números diplóides são encontrados:
2n=14, 18 e 22, sendo que o 2n=14 é o mais freqüente tanto nesta família como nos demais
marsupiais (Reig et al., 1977; Hayman, 1990, Palma & Yates, 1996; Carvalho et al., 2002).
Os cariótipos dos marsupiais possuem um alto grau de conservação e isso pode ser
observado pela grande similaridade dentro de cada número diplóide e entre eles (Reig et al.,
1977; Svartman & Vianna-Morgante, 1998; Carvalho et al., 2002). Por exemplo, os
cariótipos com 2n=14 cromossomos são muito similares em sua estrutura, variando apenas
nos dois pares menores do conjunto autossômico, quanto à posição do centrômero,
registrando-se diversas morfologias. Esse grau de conservação também pode ser observado
na porção eucromática dos cromossomos como demonstrado por Svartman & Vianna-
Morgante (1999) com a aplicação de técnicas de hibridização in situ, .
4.1. Micoureus demerarae e Marmosa murina – 2n=14
No presente trabalho foram analisadas duas espécies com número diplóide igual a
14: Micoureus demerarae e Marmosa murina (Figuras 3 e 4).
O gênero Marmosa é considerado de taxonomia problemática e muitas espécies,
inclusive Micoureus demerarae, foram anteriormente alocadas neste táxon, que segundo o
conceito de Tate (1933) chegou a englobar o que é hoje reconhecido como pertencente a
cinco gêneros distintos de marsupiais didelfídeos de pequeno porte. A semelhança entre
Marmosa e Micoureus é observada na morfologia externa, onde indivíduos adultos podem
ser confundidos com jovens da outra espécie e vice-versa, assim como na morfologia
craniana dessas espécies (Voss & Jansa, 2003; da Silva comunicação pessoal). Já em
relação aos seus cariótipos, podem ser facilmente identificados. A diferença entre os dois
34
cariótipos está evidente tanto na coloração convencional como no padrão de banda C,
principalmente nos pares cromossômicos sexuais (Figura 8).
Figura 8. Posição do centrômero e padrão de heterocromatina dos pares 5, 6 e sexuais, de
Micoureus demerarae e Marmosa murina.
Em M. demerarae tanto o par cinco quanto o seis são acrocêntricos com grandes
blocos de heterocromatina constitutiva na região centromérica, enquanto que em M. murina
o par cinco é subtelocêntrico e o par seis é acrocêntrico e os blocos de heterocromatina são
muito pequenos. Ainda, em Marmosa murina foi encontrado um heteromorfismo entre os
homólogos do par seis. Essa diferença revela-se como um pequeno braço acima do
centrômero em um dos homólogos em coloração convencional, mas também na posição da
RON, que em um dos homólogos está entre dois blocos de heterocromatina e no outro
35
ocupa a região distal, e na banda C, que em um dos homólogos aparece em um bloco
centromérico e outro terminal, e no outro sendo apenas centromérico (Figura 9).
Figura 9. Par seis de Marmosa murina em coloração convencional, impregnação por Ag-
NO3 e banda C.
Considerando as semelhanças entre o cariótipo de M. murina apresentado e o
registrado por Reig et al. (1977) onde o par 6 possui morfologia acrocêntrica, parece
plausível apontar que o evento gerador desse heteromorfismo foi uma inversão pericêntrica
que alterou a posição da RON e a distribuição da heterocromatina constitutiva em um dos
homólogos (Figura 10).
Figura 10. Esquema mostrando a inversão pericêntrica em um dos homólogos do par seis.
As faixas pretas representam os blocos heterocromáticos e os círculos, a região
organizadora de nucléolo.
36
Uma outra característica que permite diferenciar estas duas espécies é o padrão geral
da heterocromatina constitutiva, onde M. demerarae apresenta grandes blocos
heterocromáticos na região centromérica de todos os autossomos e do X, mas o Y não é
heterocromático. Por outro lado, M. murina apresentou heterocromatina na região
centromérica de todos os autossomos e do X, porém os blocos são tênues e o Y é totalmente
heterocromático.
Como mostrado nas figuras 3 e 4, as duas espécies têm um sistema múltiplo de
regiões organizadoras de nucléolo, estando uma localizada na porção terminal dos braços
longos do par cinco e a outra na porção terminal dos braços curtos do par seis. Na literatura
foram descritos outros dois padrões para M. murina procedentes de uma região que engloba
uma vasta área que se estende desde o Peru e noroeste da Amazônia e através do Amapá e
Tocantins até o estado do Pernambuco, no nordeste do Brasil. O primeiro foi descrito por
Palma & Yates (1996), para indivíduos coletados em Goiás (Serra da Mesa), onde eles
observaram marcações apenas nos braços curtos do par seis, enquanto Souza et al. (1990)
encontraram marcações nos braços curtos dos pares três e cinco e nos braços longos do par
seis em indivíduos coletados em Pernambuco. Já em M. demerarae a posição da região
organizadora de nucléolo não foi diferente da registrada na bibliografia, em toda sua
distribuição já analisada (Casartelli et al., 1986; Souza et al., 1990; Palma & Yates, 1996;
Svartman & Vianna-Morgante, 1999).
A banda G possibilitou emparelhar corretamente os pares de cromossomos e
reconhecer algumas homeologias entre os pares das duas espécies, sobretudo nos maiores
pares. A comparação dos padrões de bandas obtidos neste estudo com os da literatura foi
dificultada devido à baixa resolução das bandas obtidas para os espécimes analisados no
presente trabalho.
Os cromossomos sexuais também possibilitam distinguir as duas espécies. Em M.
demerarae os cromossomos X e Y são acrocêntricos e em M. murina o X é
submetacêntrico e o Y é puntiforme (Figura 8). A morfologia do par sexual de M.
demerarae não diferenciou dos dados disponíveis na literatura, porém para M. murina a
literatura apresenta diferentes morfologias para os cromossomos sexuais. Souza et al.
(1990) descreveram, em indivíduos coletados no estado de Pernambuco, o X como
acrocêntrico e o Y puntiforme; Palma & Yates (1996) descreveram o X como metacêntrico
37
e o Y como acrocêntrico em indivíduos coletados em duas localidades da Serra da Mesa;
Carvalho et al. (2002) descreveram o X e o Y como acrocêntricos, em indivíduos coletados
nos estados do Amapá, Tocantins e Goiás (Quadro 1).
Os cromossomos sexuais dos indivíduos de M. murina analisados no presente
trabalho são semelhantes aos encontrados por Reig et al. (1977) em indivíduos coletados
em três localidades no Peru e Venezuela, nos quais o X é submetacêntrico e o Y é
acrocêntrico. Portanto, quanto aos cromossomos sexuais de M. murina, quatro formas
foram descritas, sendo que apenas em Serra da Mesa, Goiás, duas dessas formas foram
encontradas juntas sendo as demais de localidades bastante distantes entre si. Assim,
embora os cariótipos com 2n=14 cromossomos apresentem uma estrutura conservada, a
presença de rearranjos não Robertsonianos do tipo inversão (paracêntricas e pericêntricas) é
evidente. Estes rearranjos aparentemente estão ocorrendo principalmente nos menores pares
do conjunto autossômico e nos sexuais. Porém, apenas um estudo mais amplo envolvendo
dados biogeográficos, morfológicos, moleculares e citogenéticos poderá avaliar o real
significado destes rearranjos.
38
Quadro 1: Formas de cromossomos sexuais descritos para M. murina.
Formas
X Y Localidade Referência
Goiás (Serra da Mesa), Brasil Palma & Yates, (1996)
Amapá, Tocantins e Goiás (Serra
da Mesa), Brasil Carvalho et al. (2002)
Pernambuco Souza et al. (1990)
Peru, Venezuela e UHE Balbina
(Amazonas, Brasil) Reig et al. (1977) e presente
trabalho
Entretanto, alguns fatores devem ser considerados antes de se concluir que exista
diferenciação intraespecífica em Marmosa murina. Como Bueno et al. (1989) observaram,
o estado de condensação pode dificultar a determinação da morfologia dos cromossomos de
dois braços. Por outro lado, existem problemas na taxonomia e sistemática do gênero
Marmosa e estudos recentes apontam para a falta de suporte desse gênero como um táxon
monofilético (Voss & Jansa, 2003; Voss et al., 2004). Historicamente, muitas espécies já
foram inseridas e removidas desse gênero, ilustrando a problemática do grupo e,
principalmente, como para a grande maioria das espécies de pequenos marsupiais
didelfídeos, os limites entre as espécies ainda não foram devidamente estabelecidos.
39
4.2 Didelphis marsupialis – 2n = 22
No presente trabalho a única espécie analisada com 2n=22 cromossomos foi
Didelphis marsupialis. Este número diplóide também é encontrado nas demais espécies de
maior porte dentre os didelfídeos como nos gêneros: Lutreolina, Philander, Chironectes,
além de outras espécies de Didelphis e em uma espécie de catita mexicana, Tlacuatzin
canescens (Engstrom and Gardner, 1988; Zarza et al., 2003).
Esses cariótipos são compostos por 10 pares de autossomos acrocêntricos com uma
diminuição gradual de tamanho, sendo mais acentuada entre os pares três e quatro.
Os cromossomos sexuais também apresentam variação interespecífica quanto ao
tamanho relativo e à posição do centrômero, mas geralmente são menores que os
autossomos. Os cromossomos X e Y são acrocêntricos, exceto em Lutreolina
crassicaudata, onde o X é metacêntrico e em Philander frenata, onde o Y é metacêntrico
(Reig et al., 1977).
A heterocromatina não esteve presente em todos os cromossomos e os blocos
heterocromáticos localizaram-se de forma difusa na região centromérica de alguns pares,
como observado por Carvalho et al. (2002) em indivíduos do Amapá, Pará e Bahia, e de
forma diferente da descrita por Svartman & Vianna-Morgante (1999), em que os blocos
estiveram na posição distal.
Yonenaga-Yassuda et al. (1982) observaram uma variação de 1 a 9 regiões
organizadoras de nucléolo para essa espécie, mas a variação encontrada nos espécimes do
presente trabalho foi semelhante àquela registrada por Svartman & Vianna-Morgante
(2003), consistindo de quatro a oito marcações. Os últimos autores verificaram, com a
utilização de sondas de rDNA, que D. marsupialis possui oito cístrons ribossomais
presentes nos cromossomos e que estes são menores nos braços curtos, mostrando que
existe uma expressão diferencial entre essas regiões.
Os pares 5 e 7 foram descritos como portadores das RONs originalmente por
Yonenaga-Yassuda et al. (1982), com a utilização da precipitação por Nitrato de Prata e
reconhecimento pela banda G. Aqui, estes mesmos pares e adicionalmente o par 8
apresentaram marcações. Devido a baixa qualidade do padrão de bandas G obtidas neste
estudo, não foi possível perceber exatamente quais pares corresponderiam aos portadores
40
das RONs entre os números diplóides 2n=14 e 2n=22. Svartman & Vianna-Morgante
(2003) concluíram que o par 7 do cariótipo 2n=22 corresponderia ao par 6 do 2n=14
enquanto o par 5 estaria na mesma posição em ambos os cariótipos.
Evolução cromossômica na Família Didelphidae
O número diplóide 2n=22 cromossomos foi apontado inicialmente como o ancestral,
porém esta hipótese não pôde ser sustentada devido aos poucos dados dos primeiros
estudos (Reig et al., 1977). Posteriormente, comparações dos padrões de bandeamento G
sugeriram que o número diplóide ancestral seria o 2n=14 cromossomos e o 2n=22 teria sido
originado por uma série de eventos de fissão cêntrica e que este último número diplóide
poderia ter originado novos cariótipos inclusive 2n=14, diferente do “cariótipo básico”, por
fusões (Hayman, 1990). Entretanto, Svartman & Vianna-Morgante (1998), a partir de
estudos de hibridização in situ, sugeriram que o cariótipo dos didelfídeos teria derivado do
número diplóide 2n=22 por fusões cêntricas, uma vez que seqüências teloméricas foram
identificadas próximas aos centrômeros de cromossomos com dois braços dos cariótipos
com 2n=14. Nesse panorama o 2n=18 representaria uma forma intermediária. Carvalho &
Mattevi (2000) observaram três diferentes padrões de sinais de sondas teloméricas no grupo
dos 2n=14. Estes autores interpretaram que provavelmente a existência desses padrões se
deve à não-retenção dessas seqüências em algumas espécies e reafirmam a ancestralidade
dos cariótipos 2n=22.
Voss & Jansa (2003) realizaram uma ampla análise filogenética da família
Didelphidae e nessa análise as espécies portadoras do número diplóide igual a 22
cromossomos agruparam-se em um único grupo monofilético, com exceção de Tlacuatzin
canescens, anteriormente considerada como pertencente ao gênero Marmosa, tendo sido
retirada deste gênero. Ainda, nessa análise é possível observar que o número diplóide igual
a 14 está presente em várias espécies de outros grupos, inclusive naquelas consideradas
mais basais.
Infelizmente o uso de dados citogenéticos em estudos filogenéticos ainda é muito
restrito, porém a cada cariótipo analisado, não se pode negar a importância dos rearranjos
cromossômicos no processo evolutivo dos marsupiais, tornando-se necessária uma
41
interpretação desses dados como um caráter passível de ser analisado dentro de um
contexto filogenético.
42
4.3 Gênero Proechimys
As relações filogenéticas entre as espécies de Proechimys ainda permanecem
incertas, principalmente nos seus níveis mais basais (Patton & Reig, 1989; da Silva 1998;
Patton et al., 2000). A falta de uma hipótese filogenética dificulta as tentativas de propor
um modelo de evolução cromossômica para este grupo. Tentando contribuir para essas e
outras questões sobre a sistemática desses organismos, estudos morfológico e molecular
estão sendo feitos em conjunto com o presente trabalho (da Silva, dados não publicados;
Schetino, da Silva & Porto, dados não publicados, respectivamente).
Eler (2007), em uma revisão da literatura dos dados citogenéticos do gênero
Proechimys, incluindo os seus, encontrou 57 formas cariotípicas descritas para 35 espécies
nominais, sendo que o número diplóide variou de 14 a 62 cromossomos. Nesta revisão foi
observado que grupos de espécies (sensu Patton, 1987) apresentam mais de um número
diplóide e mais de um número fundamental, assim como uma mesma espécie apresenta
diversos citótipos ou um mesmo número diplóide é encontrado em mais de um táxon,
evidenciando-se a grande diversidade cariotípica nesse gênero.
4.3.1 Proechimys cuvieri – 2n=28
O número diplóide 2n=28 está presente em cinco espécies pertencentes a três grupos
sensu Patton (1987): em P. quadruplicatus do grupo goeldii; em P. longicaudatus, P.
brevicauda e Proechimys sp.1 do grupo longicaudatus e em P. cuvieri do grupo cuvieri
(Eler 2007). Alguns desses grupos de espécies possuem mais de um número diplóide, mas
considerando apenas as formas com 2n=28, 15 fórmulas cromossômicas foram verificadas
e o número fundamental variou de 44 a 50. Segundo Patton (1987), Proechimys cuvieri
está distribuído na bacia amazônica, desde o sudeste do Peru e Acre, Brasil (a oeste) até a
região das Guianas e no Pará, Brasil (a leste). Esta área se sobrepõe com as dos grupos:
goeldii, longicaudatus, simonsi e guyannenesis. Desses, os únicos que possuem citótipos
semelhantes ao do presente trabalho (2n=28 e NFa=46) são os grupos cuvieri e
longicaudatus. Apesar das similaridades na fórmula cromossômica, os cromossomos
sexuais apresentam diferenças no tamanho e na posição do centrômero. Assim, a
morfologia dos cromossomos sexuais e o padrão de distribuição da heterocromatina
43
constitutiva permitiram relacionar os espécimes do presente trabalho com os cariótipos
descritos para indivíduos do rio Jaú (Patton et al., 2000), com os indivíduos da UHE
Balbina, rio Uatumã analisados por Maia & Langguth (1993), e indivíduos do vale do Jarí
(Eler, 2007), todos classificados como do grupo cuvieri. Devido às similaridades
cariotípicas observadas entre os exemplares deste estudo e aqueles descritos por esses
autores e considerando as análises em andamento com dados moleculares e morfológicos
(respectivamente, Schetino, da Silva & Porto, com. pess.; da Silva, com. pess.) dos mesmos
indivíduos aqui estudados, esses espécimes foram classificados como pertencentes ao grupo
cuvieri.
Embora Patton (1987) considere o grupo cuvieri como monotípico, atualmente são
registradas três formas cariotípicas para este grupo, todas possuindo 2n=28 cromossomos,
mas variando no número fundamental: NFa=46 foi encontrado em indivíduos coletados em
quatro localidades na Amazônia central (UHE de Balbina no rio Uatumã, no rio Jaú,
REMAN-Petrobrás (município de Manaus) e rio Cuieiras), assim como em uma localidade
no leste amazônico ao norte do rio Amazonas, no vale do Jarí; NFa=48 foi encontrado
também no leste amazônico mas ao sul do rio Amazonas em Altamira, Pará (Brasil); e
NFa=50 foi encontrado em localidades tão distantes quanto o alto rio Juruá (Acre, Brasil) e
Caiena, na Guiana Francesa (Figura 11) (Reig et al., 1979; Maia & Langguth, 1993; Patton
et al., 2000; Eler 2007 e presente trabalho).
Se compararmos os dados do presente trabalho com aqueles do rio Jaú (Patton et al.,
2000), considerando apenas a coloração convencional, verificamos que estes cariótipos são
muito semelhantes entre si e diferem dos indivíduos da UHE de Balbina (Maia &
Langguth, 1993) e do vale do Jari (Eler, 2007) na morfologia do par sexual. O indivíduo
analisado por Eler (2007), uma fêmea, possui o cromossomo X metacêntrico. Já nos
indivíduos analisados no presente trabalho (REMAN e rio Cuieiras) e nos do rio Jaú, o X é
acrocêntrico e o Y é puntiforme, enquanto que nos indivíduos da UHE Balbina X e Y são
acrocêntricos (Maia & Langguth,1993).
Porém, quando comparamos os padrões de banda C, verificamos que os dados do
presente trabalho (REMAN e rio Cuieiras) são diferentes em relação aos espécimes da
UHE Balbina, onde os pares cinco e seis não possuem heterocromatina, os pares quatro e
onze são polimórficos, o X apresenta dois blocos heterocromáticos, um proximal e outro
44
centromérico e o Y é totalmente heterocromático. Entretanto, o padrão de banda C
autossômico se assemelha ao descrito para os indivíduos do vale do Jari (Eler, 2007). Não
existem dados de banda C para os indivíduos do rio Jaú.
Figura 11. Distribuição dos citótipos de Proechimys cuvieri. (a) 2n=28, NFa=50, rio Juruá,
Acre, Brasil (Patton et al., 2000) e Caiena, na Guiana Francesa (Reig et al.,
1979); (b) 2n=28, NFa=46, rio Uatumã (Maia&Langguth, 1993), rio Jaú (Patton
et al., 2000), rio Cuieiras e REMAN-Manaus (presente trabalho) e vale do Jari
(Eler, 2007); (e) 2n=28, NFa=48, rio Xingu, Pará, Brasil (Patton et al., 2000).
Aparentemente, o padrão de distribuição geográfica para estes citótipos não sugere
um cline, uma vez que NFa=50 foi encontrado em localidades situadas no oeste e leste da
Amazônia na Guiana Francesa, correspondendo aproximadamente aos extremos da
distribuição do grupo, enquanto NFa=48 está no leste ao sul do eixo Solimões-Amazonas e
NFa=46 está na Amazônia central ao norte do eixo Solimões-Amazonas. Assim, apesar da
monotipia do grupo cuvieri sugerida por Patton (1987), a presença de rearranjos pode estar
indicando que este grupo é na realidade formado por com um complexo de espécies. De
fato, análises moleculares do gene mitocondrial citocromo b realizadas por Patton et al.,
45
(2000) e por Schetino, da Silva & Porto (dados não publicados) indicam a existência de
unidades regionais bastante diferenciadas cujas seqüências apresentam níveis de
divergência similares aos apresentados entre outras espécies de Proechimys. Esses
resultados reforçam a necessidade de ampliação da amostragem em toda a área de
distribuição do grupo cuvieri associada a estudos genéticos e morfológicos a fim de
elucidar a composição específica do grupo.
4.3.2 Proechimys guyannensis – 2n=46
No grupo guyannensis existem quatro números diplóides descritos (30, 38, 40 e 46)
e uma variação do número fundamental de 50 a 56 (Reig & Useche, 1976; Reig et al.,
1979; Gardner & Emmons, 1984; Weksler et al., 2001; Machado et al., 2005; Bonvicino et
al., 2005, Eler, 2007). Weskler et al (2001: Tab. 1) também associaram o número diplóide
2n=40 encontrado em P. pattoni e P. gardneri (da Silva, 1998) ao grupo guyannensis, mas
não apresentam explicação para tal associação, que não parece ser apoiada pelos dados
existentes. Do mesmo modo, esses mesmos autores associam espécimes de Balta, Peru,
com 2n=40 ao grupo guyannensis, provavelmente em função da identificação taxonômica
original realizada por Gardner & Patton (1972). Entretanto, posteriormente, Patton (1987)
inclui os animais de Balta no grupo cuvieri e da Silva (1998) considera esses animais como
pertencentes a P. pattoni. Adicionalmente, também foi registrada a ocorrência do número
diplóide 2n=44 para a região ao norte de Manaus (Machado et al., 2005), mas devido à
inexistência de espécime testemunho associado a esse cariótipo, apenas novas coletas de
animais com esse mesmo número diplóide permitirão avaliar de forma definitiva a
associação desse cariótipo ao grupo guyannensis.
O cariótipo de 46 cromossomos descrito no presente trabalho foi encontrado em
animais provenientes da UHE de Balbina, localidade situada dentro da área de distribuição
geográfica dos grupos goeldii, guyannensis e cuvieri (Patton, 1987).
Este número diplóide já foi identificado em outros três táxons de Proechimys, como
P. guairae do grupo trinitatis, com variação no NFa: 68, 70 e 72 (George & Weir, 1973;
Reig & Useche, 1976; Aguilera & Corti, 1994). Porém, a forma encontrada no presente
trabalho é idêntica, tanto em relação ao número diplóide (2n=46) quanto ao número
fundamental (NFa=50), àquela descrita por Bonvicino et al. (2005) para os espécimes do
46
rio Jatapu (Roraima, Brasil). Devido às similaridades cariotípicas observadas entre os
exemplares deste estudo e aqueles descritos por Bonvicino et al. (op. cit.), e considerando a
associação destes exemplares com outras espécies do mesmo grupo, demonstrada por
análises moleculares e morfológicas em andamento (Schetino, da Silva & Porto,
comunicação pessoal; da Silva, comunicação pessoal), os espécimes aqui analisados foram
classificados como pertencentes ao grupo guyannensis.
Figura 12. Distribuição de três cariótipos de P. guyannensis: (a) 2n-44; NFa=52,
Acampamento Cabo Frio, Manaus (Machado et al., 2005); (b) 2n=38, NFa=52,
rio Negro Amazonas e vale do Jari, Pará (Bonvicino et al., 2005; Eler, 2007);
(c) 2n=46, NFa=50, rio Jatapu (Bonvicino et al., 2005) e UHE Balbina
(presente trabalho).
Comparando o cariótipo (2n=46, NFa=50) analisado neste trabalho com o descrito
por Machado et al. (2005) com 2n=44 e NFa=52 da região de Manaus, muitas similaridades
47
podem ser observadas. As diferenças entre os dois cariótipos são: a presença de um par de
submetacêntricos grandes no último cariótipo e a morfologia do par sexual. No citótipo
2n=46, os cromossomos X e Y são acrocêntricos, enquanto que no 2n=44 o X é
subtelocêntrico. Apesar das semelhanças entre os cariótipos, aquele com 2n=44 não pôde
ser relacionado com o grupo guyannensis devido à inexistência de espécimes testemunho
associado a esse cariótipo. Entretanto, considerando que são atualmente reconhecidas
apenas duas espécies de roedores do gênero Proechimys para a região da Amazônia central
(P. cuvieri e P. guyannensis), é possível que o número diplóide de 44 cromossomos
represente um caso de polimorfismo cromossômico para essa última espécie ou que
represente um terceiro táxon ainda não descrito para essa região. A elucidação dessa
questão é parte de tese de doutorado em nosso laboratório.
A distribuição da heterocromatina constitutiva também difere entre os dois citótipos.
No citótipo com 2n=44, a heterocromatina constitutiva está presente na região
pericentromérica de todo os autossomos e do Y, exceto no par 1. O cromossomo X possui
apenas uma marcação tênue na região proximal do braço curto. Já nos espécimes com
2n=46, a heterocromatina está presente apenas em alguns pares autossômicos e o X possui
uma marcação centromérica e outra marcação intersticial mais tênue.
Quanto ao padrão de banda C, os dois cariótipos (2n=38 e 2n=46) foram muito
semelhantes, apresentando o mesmo número de blocos heterocromáticos e a morfologia dos
cromossomos sexuais também foi a mesma em ambos.
Bonvicino et al. (2005) encontraram uma relação de monofilia entre espécimes de
Proechimys sp. A (2n=38), com Proechimys sp. B (2n=46) e Proechimys guyannensis.
Portanto, seria plausível sugerir que eventos de fissão/fusão cêntrica e fusão em tandem
estariam envolvidos na diferenciação do número diplóide deste grupo, sem descartar a
presença de rearranjos não Robertsonianos do tipo inversões.
Região organizadora de nucléolo em Proechimys
Segundo Yonenaga-Yassuda et al. (1982) o par nucleolar é homeólogo em todas as
espécies da família Echimyidae, entretanto a posição do par nucleolar no cariótipo das
diferentes espécies de Proechimys é muito variável, devido aos rearranjos Robertsonianos
nos outros pares de cromossomos autossômicos. As duas espécies de Proechimys
48
analisadas no presente trabalho não fugiram à regra. Em P. cuvieri esta região localizou-se
no par 9 enquanto que em P. guyannensis (2n=46, FN=50) esteve no par 3.
Apesar dos cariótipos não terem sido encontrados em simpatria em nenhum dos
estudos citogenéticos citados, estudos ecológicos como o de Malcolm (1991) indicam que
indivíduos de Proechimys pertencentes aos grupos cuvieri e guyannensis (sensu Patton
1987) pertencem à mesma fauna que habita a margem esquerda (leste) do rio Negro e ao
norte do rio Amazonas.
49
5. Conclusão
Marsupiais representam um grupo com grande conservação na macro-estrutura
cariotípica, porém pequenos rearranjos podem ser identificados, principalmente quando
bandeamentos são aplicados, como demonstrado em Marmosa murina.
Variação na morfologia dos cromossomos sexuais de Marmosa murina é evidente
quando se compara o cariótipo de indivíduos de diferentes localidades, portanto novos
estudos são necessários para investigar qual o significado dessa diversidade de formas.
Os dados obtidos neste estudo reforçam a existência de grande diversidade
cariotípica no gênero Proechimys, mas quanto dessa diversidade cariotípica está associada à
variabilidade interespecífica ou intraespecífica ainda está por ser determinado. Avanços
nessa área dependem de estudos taxonômicos e sistemáticos envolvendo dados
citogenéticos associados a estudos moleculares, morfológicos, ecológicos, entre outros, dos
táxons em questão.
Proechimys cuvieri da Amazônia central apresenta um polimorfismo em relação ao
padrão de banda C.
Os indivíduos com número diplóide 2n=46 foram referidos como Proechimys
guyannensis, porém outros cariótipos são registrados para essa espécie. Assim sendo,
futuros estudos são necessários a fim de revelar se essas formas cariotípicas são indicativas
de variabilidade intra ou interespecífica.
50
6. Referências Bibliográficas Ab’Saber, A.N. 1977. Os domínios morfoclimáticos na América do Sul: primeira
aproximação. Geomorfologia, 52: 1-23.
Acuña, D.G.; Salgado, M.A.; Ramm, O.S.; Rojas, R.A.F. 2004. Variación estacional en el
consumo de roedores por la lechuza de campanario (Tyto alba) en un área suburbana
de Chillán, Centro-Sur de Chile. Hornero, 19(2):61-68.
Aguilera, M.; Corti, M. 1994. Craniometric differentiation and chromosomal speciation of
the genus Proechimys (Rodentia: Echimyidae). Zeitschrift fürSaügertierkunde, 59:
366-377.
Aguilera, M.; Reig, O.A.; Pérez-Zapata, A. 1995. G- and C-banding karyotypes of spiny
rats (Proechimys) of Venezuela. Revista Chilena de História Natural, 68: 185-196.
Albuja, L.V.; Patterson, B.D. 1996. A new species of northern shrew-opossum
(Paucituberculata: Caenolestidae) from the Cordillera del Condor, Ecuador. Journal of
Mammalogy, 77: 41–56.
Andrade-Miranda, J.; Oliveira; L.F.B.; Lima-Rosa, A.V.; Nunes, A.; Zanquin, N.I.T.;
Mattevi, M.S. 2001. Chromosome studies of seven species of Oligoryzomys (Rodentia;
Sigmodontinae) from Brazil. Journal of Mammalogy, 82(4):1080–1091.
Aniskin, V.M.; Volobouev, V.T. (1999). Comparative chromosome banding of two South-
American species of rice rats of the genus Oligoryzomys (Rodentia:Sigmodontinae).
Chromosome Research, 7: 557-562.
51
Barros, R. M. S. 1978, Variabilidade cromossômica em Proechimys e Oryzomys
(Rodentia) da Amazônia. Dissertação de mestrado. Instituto de Biociências, USP, São
Paulo. 184p.
Bonvicino, C.R.; Weksler, M. 1998. A new species of Oligoryzomys (Rodentia,
Sigmodontinae) from northeastern and central Brazil. International Journal of
Mammalian Biology, 63: 90-103.
Bonvicino, C.R.; Menezes, A.R.E.A.N.; Oliveira, J.A. 2003a. Molecular and karyologic
variation in the genus Isothrix (Rodentia, Echimyidae). Hereditas, 139: 206–211.
Bonvicino, C.R.; Lima, J.F.S.; Almeida, F.C. 2003b. A new species of Calomys
Waterhouse (Rodentia, Sigmodontinae) from the cerrado of the Central Brazil.
Revista Brasileira de Zoologia, 20(2): 301-307.
Bonvicino, C.R.; Otazú, I.B.; Vilela, J.F. 2005. Karyologic and molecular analysis of
Proechimys Allen, 1899 (Rodentia, Echimyidae) from the Amazonian region.
Arquivos do Museu Nacional do Rio de Janeiro, 63 (1): 191-200.
Bueno M. L.; Gomez-Laverde, M.; Morales. M. 1989. Caracterización cariológica de
Proechimys sp. (Rodentia: Echimyidae) de una colonia experimental. Biomedica, 9:
13-22.
Bueno, A.A.; Belentani, S.C.S.; Mota-Junior, J.C. 2002. Feeding Ecology of the Maned
Wolf, Chrysocyon brachiurus (ILLIGER, 1815) (Mammalia: Canidae), in the
Ecological Station of Itirapina, São Paulo state, Brazil. Biota Neotropica, 2(2): 1-9.
Carvalho, B.A.; Oliveira, L.F.; Nunes, A.P.; Mattevi, M.S. 2002. Karyotypes of nineteen
marsupial species from Brazil. Journal of Mammalogy, 83(1): 58-70.
52
Carvalho, B.A. e Mattevi, M. 2000. (T2AG3)n telomeric sequence hybridization suggestive
of centric fusion in karyotype marsupials evolution. Genetica 108: 205–210, 2000.
Casartelli, C., Rogatto, S.R., Ferrari, I. 1986. Cytogenetic analiysis of some Brazilian
marsupials (Didelphidae: Marsupialia). Canadian Journal of Genetics Cytol. 28:21-
29
Costa, L.P. Filogenia de marsupiais didelfídeos e implicações para taxonomia. In: N. C.
Cáceres; E.L.A. Monteiro-Filho. (Org.). Os marsupiais do Brasil: biologia, ecologia
e evolução. Curitiba: UNIDERP e Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, 699-
736p.
Costa, L.P.; Patton, J.L. 2005.Diversidade, limites geográficos e sistemáticos de marsupiais
Brasileiros. In: N C Cáceres; E L A Monteiro-Filho. (Org.). Os marsupiais do Brasil:
biologia, ecologia e evolução. Curitiba: UNIDERP e Universidade Federal do Mato
Grosso do Sul, 655-693 p.
Creighton, G.K. & Gardner, A.L. 2007. Genus Marmosa Gray, 1821. In: Mammals of
South América, Vol. 1: Marsupials, Xenarthrans, Shrews and Bats. Ed. A. L. Gardner.
The University of Chicado Press.
Eisenberg, J.F.; Redford, K.H. 1999. Mammals of the Neotropics. The University of
Chicago Press. 609 p.
Eler, E. S.,2007. Citotaxonomia de roedores do gênero Proechimys (Echimyidae) da região
amazônica, Brasil. Dissertação de Mestrado, INPA/UFAM, 2007 59p.
Emmons, L.H. 1984. Geographic Variation in Densities and Diversities of Non-Flying
Mammals in Amazonia. Biotropica, 16(3): 210-222.
53
Engstrom, M.D.;Gardner, A.L. 1988. Karyotype of Marmosa canescens (Maruspialia:
Didelphidae): a mouse opossum with 22 chromosomes. Southwestern Naturalist
33:231-233.
Ford, C.; Hamerton, J. 1956. A colchicines hypothonic citrate squash sequence for
mammalian chromosomes. Stain Technology 31: 247-251.
Freitas, T.R.O. 2006. Cytogenetics status of four Ctenomys species in the South of Brazil.
Genetica, 126: 227–235.
Futuyma, D.J. 1992. Biologia evolutiva. 2ª ed. Editora, Sociedade Brasileira de
Genética/CNPq. Ribeirão Preto, 646pp.
Gardner, A.L.; Patton, J.L. 1972. Notes on the systematics of Proechimys (Rodentia;
Echimyidae), with emphasis on peruvian forms. Occasional Papers of the Museum of
Zoology, 4: 1-30.
Gardner, A. L.; Patton, J.L.. 1976. Karyotipic variation in Oryzomine rodents (Cricetidae)
with comments on chromosomal evolution in the Neotropical cricetinae complex.
Occasional Papers of Museum of Zoology, 49:1-48.
Gardner, A. L.; Emmons, L. H. 1984. Species group in Proechimys (Rodentia: Echimyidae)
as indicated by karyology and bullar morphology. Journal of Mammalogy, 65: 10-25.
Gardner, A.L. 1993. Order Didelphimorphia. In D.E. Wilson and D.M. Reeder, eds.
Mammal species of the world: a taxonomic and geographic eference. Smithsonian
Institution Press, Washington, D.C. 15-23p.
Gardner, A.L. 2007. Marsupials, Xenarthrans, Shrews and Bats. In: Mammals of South
America. 912 pp., vol. 1. The University Chicago Press. ISBN; 978-0-226-28240-4
54
George W.; Weir, B. J. 1973. A note on the karyotype of Proechimys guairae (Rodentia:
Hystricomorpha). Mammalia, 37: 330-332.
Goulding, M.; Barthem, R.; Ferreira, E.J.G. 2003. The Smithsonian Atlas of the Amazon.
Washington. Smithsonian Institution, 253pp.
Groves, C.P. 1993. Order Dasyuromorphia, Peramelemorphia, Notoryctemorpha,
Diprodontia. In D.E. Wilson and D.M. Reeder, eds. Mammal species of the world: a
taxonomic and geographic reference. Smithsonian Institution Press, Washington, D.C.
29–62.
Hayman, D.L., 1990. Marsupial cytogenetics. Australian Journal of Zoology. 37:331-349.
Howell, W.M.; Black, D.A. 1980. Controlled silver-staining of nucleolus organizer region
with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, 36: 1014-1015.
IBAMA, 2006. Ecossistemas Brasileiros (http://www.ibama.gov.br/ecossistemas
/amazonia.htm). Acesso: 12/10/2006.
INPE, 1999. Relatório Projeto PRODES (http://www.inpe.br/ Informações_Eventos/
amz/amz.html). Acesso 10/11/2006.
IPÊ, 2006. http://www.ipe.org.br/html/programas_anavilhanas_mosaico.htm. Acesso
10/11/2006.
Jordan, H.E., 1911. The spermatogenesis of the opossum, with special reference to the
accessory chromosome and the chondriosomes. In:
Levan, A.; Fredga, K.; Sandberg, A.A. 1964. Nomenclature for centromeric position on
chromosomes. Hereditas, 52: 201-220.
55
Lima, M.G., 1998. Composição da comunidade de pequenos mamíferos e sapos de liteira
em remanescentes lineares no Projeto Dinâmica Biológica de Fragmentos Florestais
(PDBFF). Dissertação de mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia /
Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Amazonas. 62 pp.
Machado, T.; Silva, M.J.J.; Leal-Mesquita, E.R.; Carmignotto A.P.; Yonenaga-Yassuda,
Y.Y. 2005. Nine karyomorphs for spiny rats of the genus Proechimys (Echimyidae,
Rodentia) from North and Central Brazil. Genetics and Molecular Biology, 28(4): 682-
692.
Maia, V.; Langguth, A. 1993. Constitutive heterochromatin polymorphism and NORs in
Proechimys cuvieri Petter, 1978. Brazilian Journal of Genetics,16: 145–154.
Malcolm, J.R. 1991. The small mammals of Amazonian Forest Fragments: Pattern and
Process. Dissertation presented to the graduated school of the University of Florida in
partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy.
University of Florida. 218pp.
Mayr, E. 1977. Populações, espécies e evolução. trad. Hans Reichardt. São Paulo, Ed. Da
Universidade de São Paulo, 485 pp.
Musser, G.G.; Carleton, M.D.; Brothers, E.M.; Gardner, A.L. 1998. Systematic studies of
Oryzomyinae rodents (Muridae, Sigmodontinae): diagnoses and distribuitions of
species formerly assigned to Oryzomys “Capito”. Bulletin of the American Museum of
Natural History, 236: 1-376.
Myers, P. 2000. "Rodentia". Animal Diversity Web. Acesso em 23/10/2006,
http://animaldiversity.ummz.umich.edu/site/accounts/information/Rodentia.html.
56
Nelson, B.W.; Oliveira, A.A. 2001. Área Botânica. In: Capobianco, J.P.R.; Veríssimo, A.;
Moreira, A.; Sawyer, D.; Santos, I.; Pinto, L.P. (Eds). Biodiversidade na Amazônia
Brasileira: avaliação e ações prioritárias para a conservação, uso sustentável e
repartição de benefícios. Estação Liberdade: Instituto Socioambiental. São Paulo.
540pp.
Nowak, R.M. 1991. Walker’s Mammals of the World. The John Hopkins University Press
5ª ed., 1629 pp.
Oliveira, J.A.; Bonvicino, C.R. 2002. A new species of sigmodontinae rodent from the
Atlantic forest of Eastern Brazil. Acta Theriologica, 47(3): 307-322.
Palma, R.E., Yates, T.L. 1996. The chromosomes of the Bolivian didelphid marsupials.
Occas. Papers Mus. Texas Univ.162: 1-20.
Patterson, B.D. 2000. Patterns and trends in the discovery of New Neotropical Mammals.
Diversity and Distribuitions, 6: 145-151.
Patton, J.L., 1987. Species group of spiny rats, genus Proechimys (Rodentia, Echimyidae).
Fieldiana Zoology, Chicago, 39:305-345.
Patton, J.L.; da Silva, M.N.F.; Malcolm, J.R. 2000. Mammals of the rio Juruá and the
evolutionary and ecological diversification of Amazonia. Bulletin of the American
Museum of Natural History, 244: 1-306.
Reig, O.A. & Useche, M., 1976. Diversidad cariotípica y sistemática em poblaciones
venezolanas de Proechimys (Rodentia, Echimyidae), con datos adicionales sobre
poblaciones de Perú y Colombia. Acta Científica Venezolana, In: Eler, E. S. 2007.
Citotaxonomia de roedores do gênero Proechimys (Echimyidae) da região amazônica,
Brasil. Dissertação de mestrado, INPA/UFAm, 2007 Xiii+59p.
57
Reig, O.A., Gardner, A. L., Bianchi, N.O., Patton, J.L., 1977. The chromosomes of
Didelphidae (Marsupialia) and their evolutontionary significance. Biol. J. Linn.Soc. 9:
191-216.
Reig, O.; Trainer, M. & Barros, M.A., 1979. Sur l’ídentification chromosomique de
Proechimys guyannensis (E. Geoffroy, 1803) et de Proechimys cuvieri Petter, 1978
(Rodentia, Echimyidae). In: Bonvicino, C. R.; Otazú, I. B.; Vilela, J. F. 2005.
Karyologic and molecular analysis of Proechimys Allen, 1899 (Rodentia, Echimyidae)
from the Amazonian region. Arquivos do Museu Nacional do Rio de Janeiro, 63 (1):
191-200.
Rittl, C.E. 1998. Efeitos da extração seletiva de madeira sobre a comunidade de pequenos
mamíferos de uma floresta de terra firme na Amazônia Central. Dissertação de
mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, Amazonas, 88pp.
Rocha, V.J.; Reis, N.R.; Sekiama, M.L. 2004. Dieta e dispersão de sementes por Cerdocyon
thous (Linnaeus) (Carnívora, Canidae), em um fragmento florestal no Paraná, Brasil.
Revista Brasileira de Zoologia, 21(4): 871–876.
Seabright, M. 1971. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet, 2: 971-
972.
da Silva, M.N.F. 1998. Four New species of spiny rats of the genus Proechimys (Rodentia:
Echimyidae) from the western Amazon of Brazil. Proceedings of Biology Society.
Washington,111: 436-471.
da Silva, M.N.F.; Rylands, A.B.; Patton, J.L. 2001. Biogeografia e conservação da
mastofauna na Floresta Amazônica Brasileira. In: Capobianco, J.P.R.; Veríssimo, A.;
Moreira, A.; Sawyer, D.; Santos, I.; Pinto, L.P. (Eds). Biodiversidade na Amazônia
Brasileira: avaliação e ações prioritárias para a conservação, uso sustentável e
58
repartição de benefícios. Estação Liberdade: Instituto Socioambiental. São Paulo.
540p.
Silva, J.A.; Talamoni, S.A. 2003. Diet adjustments of maned wolves, Chrysocyon
brachiurus (Illiger) (Mammalia, Canidae), subjected to supplemental feeding in a
private natural reserve, Southeastern Brazil. Revista brasileira de Zoologia, 20(2): 339-
345.
Silva, S.I. 2005. Posiciones tróficas de pequeños mamíferos en Chile: una revisión. Revista
Chilena de Historia Natural, 78: 589-599.
Silva, M.J.J.; Patton, J.L.; Yonenaga-Yassuda, Y. 2006. Phylogenetic relationships and
karyotype evolution in the sigmodontine rodent Akodon (2n=10 and 2n=16) from
Brazil. Genetics and Molecular Biology, 29(3): 469-474.
Souza, M J., Maia, V.and Santos, J.F.1990. Nucleolar organizer regions, G- and C-band in
some Brazilian species of Didelphidae. Revista Brasileira de Genética 13:767–775.
Stoddart, D.M. 1979. Ecology of small mammals. Texts, figures and tables. 386 pp
Chapman & Hall, London.
Sumner, A.T. 1972. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin.
Experimental Cell Research, 75: 304-306.
Svartman, M., Vianna-Morgante, A.M. 1998. Karyotype evolution of marsupials: from
higher to lower diploid numbers. Cytogenetics and Cell Genetics. 82:263–266.
Svartman, M., Vianna-Morgante, A.M. 1999. Comparative genome analysis in American
marsupials: chromosomes banding and in-situ hybridization. Chromosome Research.
7: 267-275.
59
Svartman, M., Vianna-Morgante, A.M. 2003. Conservation of chromosomal location of
nucleolus organizer in American marsupials (Didelphidae). Genetica 118: 11–16.
Tavares, L.N.J. 1998. Efeito de borda e do crescimento secundário sobre pequenos
mamíferos nas florestas de terra firme da Amazônia Central. Dissertação de mestrado.
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia / Universidade Federal do Amazonas,
Manaus, Amazonas. 60 pp.
Taylor, P.J. 2000. Patterns of Chromosomal Variation in Southern Africa Rodents. Journal
of Mammalogy, 81(2): 317-331.
Voss, R.L; Emmons, L.H. 1996. Mammalian diversity in Neotropical lowland rainforests: a
preliminary assessment. Bulletin of the American Museum of Natural History, 230: 1-
115.
Voss, R.S.; Lunde, D.P.; Simmons, N.B. 2001. The mammals of Paracou, French Guiana:
A Neotropical lowland rainforest fauna. Part 2. Non volant species. Bulletin of
American Museum of Natural History, 263:1-236.
Voss, R.S and Jansa, S. 2003. Phylogenetic studies on didelphid marsupials II.
Nonmolecular data and new IRBP sequences: and combined analyses of didelphinae
relationships with denser taxon sampling. Bulletin of American Museum of Natural
History. nº 276, 82pp.
Voss, R.S.; Gardner, A.L.; Jansa, S.A. 2004. On the Relationships of ‘‘Marmosa’’ formosa
Shamel, 1930 (Marsupialia: Didelphidae), a Phylogenetic Puzzle from the Chaco of
Northern Argentina. American Museum Novitates. n° 3442, 18p.
Wallace, A.R. 1852. On the monkeys of the Amazon. Proceedings of Zoological. Society
London, 20: 107-110.
60
61
Weksler, M.; Bonvicino, C.R.; Otazu, I.B.; Junior, J.S.S. 2001. Status of Proechimys
roberti and P. oris (Rodentia:Echimyidae) from Eastern Amazonia and Central Brasil.
Journal of Mammalogy, 82(1): 109-122.
Wilson, D.E.; Reeder, D.M. 2005. Mammal Species of the World. Johns Hopkins
University Press. 2142 pp.
Yonenaga-Yassuda, Y.; S. Kasahara, M.J. Souza & M.L’Abbate, 1982. Constitutive
heterochromatin, G-bands and nucleolusorganizer regions in four species of
Didelphidae (Marsupialia). Genetica 58: 71–77.
Zarza,H. Ceballos, G.; Steele, M A 2003. Marmosa canescens. Mammalian Species no.
725: 1–4.
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