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CELTON PEREIRA DE MOURA

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO, ANTICOAGULANTE E HEMORRÁGICO DE HEPARINÓIDES

PRESENTES EM Artemia franciscana

NATAL 2004

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

CELTON PEREIRA DE MOURA

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO, ANTICOAGULANTE E HEMORRÁGICO DE HEPARINÓIDES

PRESENTES EM Artemia franciscana

Dissertação de mestrado apresentada ao Departamento de Bioquímica do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Dra. Suely Ferreira Chavante

Co-orientadora: Dra. Edda Lisboa Leite

NATAL 2004

Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede

Moura, Celton Pereira de. Avaliação do potencial antiinflamatório, anticoagulante ehemorrágico de hiperinóides presentes em Artemia franciscana/CeltonPereira de Moura. – Natal, RN, 2004.

73 f.

Orientadora: Suely Ferreira Chavante. Co-orientadora: Edda Lisboa Leite.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande doNorte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação emBioquímica.

1. Proteínas – Dissertação. 2. Heparinóides – Artemia franciscana –Dissertação. 3. Heparinóides – Propriedades antinflamatórias –Dissertação. 4. Heparinóides – Propriedades anticoagulantes –Dissertação. 5. Heparinóides – Propriedades hemorrágicas – Dissertação.I. Chavante, Suely Ferreira. II. Leite, Edda Lisboa. III. UniversidadeFederal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BCZM CDU 577.112 (043.3)

Dedico este trabalho

A minha família, em especial a minha avó Marina, e a todos que sempre com

carinho, dedicação e muita paciência, souberam me orientar, apoiar e incentivar em

cada momento de minha vida acadêmica.

AGRADECIMENTOS

A Deus por ter me concedido este momento de estudo e trabalho com meus amigos.

Aos meus pais Josué Alves de Moura e Maria do Socorro Pereira de Moura por terem me apoiado e incentivado em todos os momentos de minha vida, juntamente

com minha irmã Tasia Pereira de Moura..

A minha família, por ter me dado a base e a segurança que todos nós precisamos, apoiando-me em todos os sentidos de minha vida, seja ela profissional ou pessoal.

Aos meus amigos Biólogos e em especial: Ana Viviane que me incentivou e estudou junto comigo, Adriana a quem eu tenho muita admiração por ser uma verdadeira

amiga, Vanessa por ter me ensinado no início do trabalho na bancada, Cybelle pela paciência. À Beth, por me mostrar que coragem e espiritualidade andam lado a lado, Janice (farmacêutica) pelos momentos de descontração que muito me ajudaram no

decorrer de meu trabalho. Todos contribuindo sempre com ações e palavras amigas, agradeço-os de coração.

Aos Professores : Elizeu , Hugo, Luiz, Maurício, Fernanda, Selma, João Felipe, Dilma e Jacira, meu muito obrigado pelos conhecimento transmitidos durante esta

minha vida acadêmica . Saúde e sucesso sempre para todos vocês! Agradeço, também, à professora Aurigena pela grande ajuda no tratamento dos dados

estatísticos.

Em especial, Suely Ferreira Chavante por ter me aceito como seu orientando e trabalhado comigo no Departamento de Bioquimica e a professora Edda Lisboa Leite por ter me auxiliado e me orientado no final de meu trabalho; uma pessoa a

quem eu tenho profundo respeito e admiração pela coragem e disposição em estar sempre pronta a ajudar.

À equipe da Universidade Potiguar (UNP), pelo auxílio no fornecimento de material biológico para realização deste trabalho, meus agradecimentos.

À Eliene, pessoa muito amiga, muito humana, você sabe ser feliz, tenho satisfação em ser seu amigo.

À Michelle tenho admiração pela responsabilidade do seu trabalho, mostrando que os jovens são capazes e competentes.

À Creuza e Mônica agradeço pela confiança e por estarem sempre prontas a ajudar.

Marcos, Itamar e Jonas agradeço-lhes a amizade e a confiança.

Aos Amigos do Departamento de Bioquímica do dia a dia que conheci durante estes dois anos : Taciana, Celina, Valquiria, Guiliana, Dácio, Rodolfo, Glória, Carlos,

Raniere, Roseane, Karla, Luciana e Ivan, um forte abraço

À Margarita, nova secretária do Programa de Pós Graduação em Bioquímica, às professoras Selma e Dilma, Coordenadora e Vice-coordenadora do Programa, meu

reconhecimento pelo bom trabalho e obrigado por tudo.

Aos órgãos financiadores CNPq e CAPES que tornaram possível a realização deste trabalho.

Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede Moura, Celton Pereira de. Avaliação do potencial anti-inflamatório, anticoagulante e hemorrágico de heparinóides presentes em Artemia franciscana / Celton Pereira de Moura. – Natal, RN, 2004. 73 f. : il.

Orientadora : Suely Ferreira Chavante. Co-orientadora : Edda Lisboa Leite.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Departamento de Bioquímica.

1. Heparina – Tese. 2. Heparinóides – Propriedades anti-

inflamátoria - Tese. 3. Artemia – Tese. 4. Crustáceos – Tese. 5 Atividade hemorrágica – Tese. I. Chavante, Suely Ferreira. II. Leite, Edda Lisboa. III. Título.

RN/UF/BCZM CDU 577.112 (043.2)

RESUMO

Heparam sulfato (HS) e Heparina (Hep) são glicosaminoglicanos

(GAGs), heterogêneos e altamente polianiônicos. HS é estruturalmente

relacionado a heparina, mas contém uma quantidade menor de grupos

sulfatados que a Hep. Devido às similaridades estruturais entre estes dois

polímeros, eles têm sido denominados conjuntamente de heparinóides. Ambas

as cadeias ligam-se a uma variedade de proteínas mediadas por vários

processos fisiológicos importantes, incluindo a coagulação sanguínea, adesão

celular e regulação dos fatores de crescimento. O presente estudo descreve a

presença de uma população de heparinóides (F-3.0M) diferenciados presentes

em Artemia franciscana os quais foram isolados por proteólise e fracionados

por cromatografia de troca iônica com variadas concentrações de NaCl. Neste

trabalho, utilizamos modelos “in vivo” para avaliar a homeostasia e a atividade

anti-inflamatória destes heparinoides. A hemostasia foi avaliada por modelo de

escarificação em caudas de ratos Wistar enquanto que o processo inflamatório

foi observado através de peritonite induzida por tioglicolato de sódio a 3%. Os

heparinóides eluidos com 3,0M de NaCl mostraram por eletroforese em

diversos tampões uma única banda com comportamento intermediário entre a

Hep de mamífero e HS. O principal produto obtido da fração F-3.0M de Artemia

franciscana após a degradação enzimática com heparitinases I e II de Flavo

bacterium Heparinum foram dissacarídeos N-sulfatados (�U-GlcNS,6S/

�U,2S-GlcNS e ∆U-GlcNS) e dissacarídeos N-acetilados (∆U, GlcNAc). Estes

heparinóides apresentaram uma baixa atividade hemorrágica somente na

concentração de 400µg/ml, é similar a heparina na concentração de 25µg/ml.

Os resultados sugerem ainda, que esta fração tem baixa ação anticoagulante

APTT (62,2s); não apresentando ação sobre PT, indicando que não tem ação

sobre a via extrínseca da cascata. Os testes de atividade anti-inflamatória,

desta fração tem efeito inibitório sobre a migração dos leucócitos da ordem de

64,5% na concentração de 10 µg/ml (P<0.001).

Palavras Chaves: Heparinóides . Artemia. Coagulação . Anti- inflamatório.

ABSTRACT

Heparan sulfate (HS) and Heparin (Hep) glycosaminoglycans (GAGs) are

heterogeneous and highly charged polysaccharides. HS is structurally related to Hep but is

much less substituted with sulfo groups than heparin and has a more varied structure (or

sequence). Because of structural similiarities between these two polymers, they have been

described together as “heparinoids”. Both chains bind a variety of proteins and mediate

various physiologically important processes including, blood coagulation, cell adhesion

and growth factor regulation. Heparinoids with structural characteristics similar to these

described from HS and/or Hep from mammalian tissues have been isolated from different

species of invertebrates, although only a few heparinoids from unusual sources have been

characterized. The present study describes the presence of unusual heparinoids

population from Artemia franciscana, isolated after proteolysis and fractionation by ion

exchange resin and named, F-3.0M. The study model “in vivo” were hemostasis (rat tail

scarification) and inflamatoty activity. The tests “in vitro” were used for coagulations

assays (PT and APTT). The analyse of the heparinoids eluted with 3,0M NaCl showed

electrophoretic migration in different buffer systems a single band with a behaviour

intermediate between those of mammalian HEP and HS. The main products obtained from

Artemia heparinoids after enzymatic degradation with heparitinases I and II from F.

heparinum were N-sulphated disaccharides (∆U-GlcNS,6S/ ∆U,2S-GlcNS and ∆U-

GlcNS) and N-acetylated disaccharides (∆U, GlcNAc). This heparinoid had a lower

hemorrhagic effect (400µg/ml) when compared to unfractiionated heparins(25µg/ml).The

results also suggest a negligible APTT activity of this heparinoid (62.2s). No action was

observed on PT indicating that F-3.0M haven’t action on the extrinsic pathway. The results

showed that the fraction F- 3.0M have inhibitory effect on migration of leukocytes, 64.5% in

the concentration of 10 µg/ml (P<0.001). The search for new heparin and/or heparan

sulphates analogs devoid of anticoagulant activity is an atractive alternative and may open

up a wide variety of new therapeutic applications.

Key Words : Heparinoids. Artemia. Coagulation. Anti-inflamatory.

LISTA DE TABELAS:

Tabela 1 - Principais diferenças entre heparina e heparam sulfato.................... 05

Tabela 2 - Relação molar dos componentes haparina e heparam sulfato de F-

3,0M de Artemia franciscana ............................................................ 44

Tabela 3 - Relação molar dos constituintes das frações de GAGS de Artemia

franciscana ....................................................................................... 51

LISTA DE ILUSTRAÇÕES:

Figura 1 - Principal unidade dissacarídica de repatição da heparina ................ 05

Figura 2 - Esquema de distribuição filogenética dos GAGS em Invertebrados . 07

Figura 3 - Esquema da Cascata de Coagulação ............................................... 12

Figura 4 - Interação da heparina não fracionada com a antitrombina ............... 14

Figura 5 - Rolamento de Leucócitos e distribuição celular das moléculas de

adesão (TIBS) ................................................................................. 20

Figura 6 - Crustáceos da espécie Artemia franciscana utilizado neste estudo.. 24

Figura 7 - Esquema de extração e fracionamento dos heparinóides de Artemia

franciscana ........................................................................................ 31

Figura 8 - Esquema de fracionamento da fração F-3,0M de por Artemia

franciscana precipitações crescentes em acetona ............................ 32

Figura 9 - Eletroforese em gel de agarose da F-3,0M de Artemia franciscana em

diversos sistemas de tampões .......................................................... 43

Figura 10 - Eletroforese em gel de agarose em tampão PDA 0.05 pH 9,0 dos

polissacarídeos de Artemia franciscana após fracionamento com

acetona ............................................................................................. 47

Figura 11 - Eletroforese em gel de agarose em tampão Tris-acetato das frações

de Artemia franciscana obtidas após fracionamento com acetona ... 48

Figura 12 - Eletroforese em gel de agarose no sistema Ba/PDA das frações

obtidas após tratamento da F-3,0 com acetona ................................ 49

Figura 13 - Caracterizaçcão da fração F-3,0M de Artemia franciscana pelas

enzimas HEPARITINASE I e HEPARITINASE II ............................. 54

Figura 14 - Caracterizaçcão das sub frações F-3,0M de Artemia franciscana pelas

enzimas HEPARITINASE I e HEPARITINASE II ............................. 55

Figura 15 - Avaliação da atividade anticoagulante pelo teste de tromboplastina

parcial ativada (APTT) in vitro da fração F-3,0 de Artemia franciscana,

haparam sulfato e de heparina padrão bovina ................................ 57

Figura 16 - Ação anticoagulante, tempo de protrombina (PT) da heparina padrão

bovina, heparam sulfato e fração F-3,0 de Artemia franciscana ...... 58

Figura 17 - Efeito hemorrágico de F-3,0M de Artemia e da heparina de pulmão

bovino padrão .................................................................................. 59

Figura 18 - Efeito da fração heparina padrão na migração de leucócitos em ratos

Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de sódio ................. 62

Figura 19 - Efeito da heparina desaminada na migração de leucócitos em ratos

Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de sódio .................. 63

Figura 20 - Efeito da fração F-3,0M de Artemia franciscana na migração de

leucócitos em ratos Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de

sódio ................................................................................................ 64

LISTA DE ABREVIATURAS:

aPTT tromboplastina pacial ativada

CETAVLON brometo de cetiltrimetilamonio

CS condroitim sulfato

Da Dalton

DS dermatam sulfato

g gravidade

Glc AU ácido glucurônico

Hep Heparina

HepDEA Heparina desaminada

HNF Heparina não fracionada

HBPM Heparina de baixo peso molecular

HS Heparam sulfato

IL interleucina

nm nanômetro

PDA 1,3 diaminopropano

rpm rotações por minuto

PT tempo de protrombina

TNFα Fator de Necrose Tumoral alfa

V volume

∆ Di-4S Dissacarídeo insaturado 4 sulfatado

∆ Di-6S Dissacarídeo insaturado 6 sulfatado

∆ presença de insaturação

∆U- GlcNS, 6S: O-ácido α-D-glico(enopiranosilurônico)-(1-4)-2-desoxi-2-sulfamino-

D-glicopiranose 6-O-sulfato (dissacarídeo insaturado dissulfatado).

∆U- GlcNS: O-ácido α-D-glico (enopiranosilurônico)-(1-4)-2-desoxi-2-sulfamino-D-

glicopiranose (dissacarídeo insaturado N-sulfatado).

∆U- GlcNAc: O-ácido α-D-glico (enopiranosilurônico)-(1-4)-2-desoxi-2-acetamido-

D-glicopiranose (dissacarídeo insaturado N-acetilado).

Ditri: Dissacarídeo trisulfatado.

Didi: Dissacarídeo disulfatado.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 15

1.1 GLICOSAMINOGLICANOS 15

1.2 HEPARINÓIDES 16

1.3 HEPARINÓIDES EM INVERTEBRADOS 19

1.4 AÇÕES BIOLÓGICA E FARMACOLÓGICA DOS HEPARINÓIDES 22

1.5 CASCATA DE COAGULAÇÃO SANGÜÍNEA 24

1.6 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 27

1.7 HEPARINAS NÃO FRACIONADAS (HNF) E HEPARINAS DE BAIXO PESO

MOLECULAR (HBPM) 29

1.8 RESPOSTA INFLAMATÓRIA 31

1.8.1 Princípios da Resposta Inflamatória 31

1.9 PROPRIEDADE ANTIINFLAMATÓRIA DOS HEPARINÓIDES 34

2 OBJETIVOS 37

3 MATERIAIS E MÉTODOS 38

3.1 MATERIAL BIOLÓGICO 38

3.1.2 Artemia franciscana 39

3.1.2 Enzimas 39

3.1.3 Animais utilizados nos ensaios in vivo 39

3.2 PADRÕES DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS UTILIZADOS COMO

REFERÊNCIA DE MOBILIDADE ELETROFORÉTICA 40

3.2.1 Monossacarídeos 41

3.2.2 Outros Materiais 41

3.3 APARELHOS 42

3.4 MÉTODOS 43

3.4.1 Extração dos Polissacarídeos Sulfatados de Artemia franciscana 43

3.4.2 Fracionamento dos Heparinóides com diferentes concentrações de

Acetona 44

3.4.3 Eletroforese em Gel de Agarose 47

3.4.4 Sistema 1,3 - diaminopropano acetato (PDA) 48

3.4.5 Sistema Descontínuo Acetato de Bário/PDA 48

3.4.6 Sistema Tris-acetato 49

3.5 DEGRADAÇÕES ENZIMÁTICAS 49

3.6 CROMATOGRAFIAS EM PAPEL 50

3.7 ANÁLISES QUÍMICAS 50

3.8 PERITONITE INDUZIDA POS TIOGLICOLATO DE SÓDIO 51

3.9 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 52

3.10 ATIVIDADE HEMORRÁGICA 53

3.11 MÉTODOS ESTATÍSTICOS 55

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 56

4.1 ELETROFORESE DA FRAÇÃO F - 3,0M 56

4.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA F - 3,0M DE ARTEMIA FRANCISCANA 58

4.3 FRACIONAMENTO DA F- 3,0M EM ACETONA 59

4.4 COMPORTAMENTO ELETROFORÉTICO DAS SUB FRAÇÕES DE

ARTEMIA FRANCISCANA PROVENIENTE DO FRACIONAMENTO COM

ACETONA 60

4.5 DOSAGENS QUÍMICAS E CROMATOGRAFIA EM PAPEL DAS

FRAÇÕES 64

4.6 CARACTERIZAÇÃO DOS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO DE FRAÇÕES

DE ARTEMIA FRANCISCANA 65

4.6.1 Por Degradação Enzimática 65

4.6.2 Efeito in vitro dos Heparinóides de Artemia franciscana na

coagulação sangüínea 70

4.6.3 Atividade Hemorrágica 72

4.6.4 Efeito da Fração F - 3,0M no Processo Inflamatório 73

5 CONCLUSÕES 80

REFERÊNCIAS 81

APÊNDICE 88

Introdução 15

1 INTRODUÇÃO

1.1 Glicosaminoglicanos

Os glicosaminoglicanos sulfatados (GAGS) são um conjunto de

macromoléculas que estão amplamente distribuídas em todos os filos de animais

que apresentam organização tissular (DIETRICH et al., 1983). Estes compostos

são polissacarídeos não ramificados constituídos por resíduos alternados de ácido

urônico e de hexosamina cuja estrutura básica é formada por unidades

dissacarídicas repetitivas de D-glucurônico ou L-idurônico unidas através de

ligações glicosídicas a D-glucosamina ou D-galactosamina ou seus derivados

acetilados. Estes açúcares apresentam ainda, grupos sulfatos que juntos com os

grupos carboxilas do ácido urônico conferem a estas moléculas características

polianiônicas. Os pontos mais relevantes da estrutura dos GAGS dizem respeito

ao grau de sulfatação e as proporções de tipos de dissacarídeos constituintes

fortes indicativos de sua grande heterogeneidade estrutural (CONRAD, 1998).

Os glicosaminoglicanos desempenham inúmeras funções essenciais ao

organismo e dentre elas pode-se citar: resistência a infecções, auxílio no controle

da divisão celular, reconhecimento e adesão celular, lubrificação das articulações,

etc. (NADER & DIETRICH, 1989; DIETRICH, 1984; ESKO 1991). Estas funções

variam de acordo com as particularidades estruturais destes compostos e com o

tipo de tecido onde estão presentes.

Introdução 16

De uma forma geral, podemos afirmar que a grande maioria dos

glicosaminoglicanos está associada às proteínas formando os proteoglicanos.

Tendo-se como principal exceção o ácido hialurônico, glicosaminoglicano não

sulfatado, presente nos tecidos sob a forma de cadeia exclusivamente

polissacarídica. O condroitim sulfato, dermatam sulfato, heparina e heparam

sulfato apresentam-se ligados covalentemente ao esqueleto protéico através da

unidade tetrassacarídica glucuronil-galactosil-galactosil-xilose. A extremidade não

redutora do glicosaminoglicano é livre e a outra extremidade encontra-se unida

por meio de uma ligação do tipo O-glicosídica a um resíduo de L-serina ou L-

treonina do esqueleto protéico. Diferentemente o queratam sulfato encontra-se N-

ligado a uma glicoproteína. (FRANSSON, 1983; POOLE, 1986; RODÉN &

SCHWARTZ, 1975).

1.2 Heparinóides

Tanto heparina como heparam sulfato são glicosaminoglicanos sulfatados

formados por unidades alternadas de ácido urônico e glucosamina, unidos por

ligações glicosídicas α-1,4 ou β-1,4. Estes dois polímeros são misturas de

compostos polidispersos, estruturalmente similares e são denominados

conjuntamente de heparinóides (CASU, 1989; CONRAD, 1998;).

Os blocos constitutivos dos heparinóides, apresentam unidades

dissacarídicas, em que o resíduo de ácido urônico, pode ser do tipo β-D-

Introdução 17

glucurônico (GlcA) ou α-L-idurônico (IdoA), que podem ou não estar sulfatados na

posição 2 (GlcA-2S ou IdoA-2S). Os resíduos de α-D-glucosamina podem ser N-

sulfatados (GlcNS) ou N-acetilados (GlcNAc). Há ainda, a possibilidade dos

resíduos de GlcNS serem O-sulfatados em C3 ou C6, ou ainda em ambos C3 e

C6; enquanto os resíduos de GlcNAc podem ser O-sulfatados em C-6.

Considerando-se que cada unidade dissacarídica apresenta um dos 4 possíveis

resíduos de ácido urônico (GlcA, GlcA-2S, IdoA ou IdoA-2S) ligado a um dos 6

resíduos de glucosamina (GlcNS, GlcNS,6-OS, GlcNS-3S, GlcNS-3,6diS, GlcNAc

ou GlcNAc, 6S) existe ainda, uma enorme possibilidade de combinações entre

esses monômeros, o que justificaria a heterogeneidade estrutural apresentada

pelas cadeias de heparina e de heparam sulfato (CASU, 1985; CXHARLE &

SCOTT, 1993). Na figura 1 temos a principal unidade dissacarídica da heparina.

Essa grande variabilidade dificulta uma definição estrutural mais precisa de

heparam sulfato e heparina; embora, muitos critérios estejam sendo usados para

distingui-los. Assim, admite-se que a diferença estrutural entre heparina e

heparam sulfato seja, essencialmente, quantitativa com pouca ou nenhuma

distinção qualitativa. Em geral, a heparina contém mais ácido idurônico e mais

glic-N-sulfato, e menos N-acetil e ácido glucurônico do que o heparam sulfato.

Outro modo de se distinguir heparina de heparam sulfato, está na sua

suscetibilidade a enzimas heparinases e heparitinases que são liases extraídas de

Flavobacterium heparinum (CONRAD, 1998). Na tabela 1 estão relacionadas as

diferenças principais entre estes dois compostos.

Introdução 18

Figura 1- Principal unidade dissacarídica de repetição da heparina.

As heparinas têm mais altas relações IdoaA/ GlcA do que as encontradas

nos heparam sulfatos e contêm elevados teores de dissacarídeos altamente

sulfatados. Entretanto, a distinção entre estes dois polímeros é muito mais

complexa que esta diferença. Diversas pesquisas têm estabelecido algumas

formas para se distinguir heparina de heparan sulfato

Casu, 1989 sugeriram que o termo heparina deve ser restrito a um

heparinóide em que mais de 80% dos resíduos de GlcN são N-sulfatados e o

número de O-sulfatos são maiores que o número de N-sulfatos. Por outro lado,

todos os outros heparinóides podem ser referidos como heparam sulfato. Já

segundo Gallagher et al; 1989, todo heparam sulfato tem cerca de 50% de seus

resíduos GlcN N- sulfatados e uma razão de O-sulfato para N-sulfato igual ou

menor que 1. Entretanto, na opinião de Nader e Dietrich 1989, heparam sulfato e

heparina são distinguíveis por meio de uma combinação de suas propriedades

físicas e biológicas.

Tabela 1. Principais diferenças entre heparina e heparam sulfato.

Introdução 19

Características Heparam

sulfato

Heparina

Solubilidade em acetato de potássio 2 M (pH 5,7; 4°C)

sim

não

Tamanho 10 70 kD 10 12 kD

Relação Sulfato/hexosamina 0,8 1,8 1,8 2,4

GlcN NS 40 60% 85%

Conteúdo de IdoA 30 50% 70%

Ligação com a antitrombina 0 0,3% ~30%

Sítio de síntese Virtualmente em todas as células

mastócitos

Fonte : Jeffrey Esko e Varki, 1998.

1.3 Heparinóides em Invertebrados

O primeiro relato de um heparinóide em invertebrados foi feito por Thomas

em 1951. Este autor, empregando o método clássico de Charles & Scott (1933)

para a extração de GAGs, obteve em tecidos de molusco Spisula solidissima um

composto ácido que continha uma considerável atividade anticoagulante.

Subseqüentemente, com a realização de novos estudos foram consideradas, cada

vez mais, as semelhanças de compostos polianiônicos extraídos dos moluscos

com a heparina de mamífero e outros glicosaminoglicanos.

Introdução 20

O primeiro trabalho envolvendo uma metodologia mais específica para a

pesquisa de GAGS, inclusive com utilização das liases de F. heparinum, foi

realizado por CÁSSARO & DIETRICH, 1977. Neste trabalho, os autores relataram

a ocorrência de heparina em um grande número de espécies principalmente em

moluscos e crustáceos.

Posteriormente, Dietrich et al., 1985 e 1989 demonstraram a presença de

heparina nos extratos do molusco Anomalocardia brasiliana. A caracterização

deste composto envolvia análise de sua composição química, propriedades físico-

químicas, atividades farmacológicas e, especialmente, a susceptibilidade para as

enzimas heparinase e heparitinase II de Flavobacterium heparinum, bem como, os

produtos por elas formados (NADER et al,1999). Comparativamente, a heparina

desse molusco apresentou-se semelhante à de mamíferos, mostrando apenas

algumas variações quantitativas, como a alta atividade anticoagulante (320

U.I./mg), alto peso molecular (27-43 kDa) e maior grau de afinidade pela

antitrombina, assemelhando-se a heparina de mucosa intestinal bovina. A

presença de heparina neste molusco despertou a busca deste composto em

outros moluscos tais como: Donax striatus e Tivela mactroides. Além da

abordagem experimental já citada foi utilizada espectroscopia de ressonância

magnética nuclear, concluindo-se, mais uma vez, que a heparina de invertebrados

é virtualmente indistinguível da heparina de vertebrados (DIETRICH et al,1989).

Em 1995, a mesma equipe fez um estudo comparativo do mecanismo de

ação anticoagulante da heparina entre mamíferos e moluscos. Analisando alguns

passos da ação sobre a cascata da coagulação, constatou-se que a heparina de

Introdução 21

molusco tem a mesma ação na inibição do fator Xa e na trombina, ao se ligar à

antitrombina, apresentando uma atividade inibitória da trombina quatro vezes

maior que a heparina de mamíferos, quando este efeito é mediado pelo cofator II

da heparina (PAIVA,et al.,1995).

Devido aos relatos sobre a ocorrência de heparinoides em invertebrados,

Medeiros et al., (2000) desenvolveram um extenso trabalho de investigação dos

glicosaminoglicanos de filos de invertebrados para os quais havia pouca ou

nenhuma informação. Assim, foram isolados os GAGS de 23 espécies de 13 filos,

sendo a heparina encontrada em 12 dessas espécies (Figura 2).

Figura 2- Esquema de distribuição filogenética dos GAGS em invertebrados.

Introdução 22

A distribuição de heparina em invertebrados foi estudada no molusco A.

brasiliana foi estruturada por meio de abordagens bioquímicas e histológicas. O

estudo levou os autores a concluírem que a heparina encontra-se distribuída em

células semelhantes aos mastócitos, no palpo labial, intestino, manto e ctenídeo,

órgãos que estabelecem contacto com o meio externo. Os resultados sugeriram

mais uma vez, que a função da heparina em moluscos estaria relacionada com os

processos de defesa independentes do sistema imune (SANTOS et al., 2002,

NADER et al., 2004).

Outros glicosaminoglicanos sulfatados também tem sido detectados em

ascidias e esponjas estes por sua vez possuem atividade anticoagulante.

(PAVÃO et al., 1995 , SPILLMAN et al. ,1995 ).

1.4 Ações Biológica e Farmacológica dos Heparinóides

Apesar do surgimento de vários fármacos anticoagulantes nos dias atuais,

a heparina continua sendo muito estudada e analisada por vários pesquisadores

sobre óticas diferentes. Uma das funções mais bem estabelecidas da heparina é

sua reconhecida ação anticoagulante, a qual é amplamente utilizada na medicina

a mais de meio século (MURRAY, 1936).

Farmacologicamente, é inegável sua ação anticoagulante por potencializar

a ação inibitória da antitrombina sobre as demais serino-proteases constituintes da

cascata de coagulação. Embora sua função fisiológica ainda não seja muito bem

conhecida, seria um erro inferir que sua ação anticoagulante se aplicaria também

Introdução 23

a nível fisiológico, uma vez que este composto se localiza de forma restrita dentro

de grânulos de mastócitos. Além disso, a heparina está presente também, em

células de animais que não apresentam sistema de coagulação, como é o caso

dos moluscos. Os coelhos, por sua vez possuem sistema de coagulação, mas não

possuem a heparina nos seus tecidos (BJORK & LINDAHL, 1982; FARRED et al.,

1998; SANTOS, 2002).

O heparam sulfato é encontrado na superfície celular de uma variedade de

células e na membrana basal. Funções biológicas atribuídas a esses compostos

são decorrentes de sua capacidade de interagir com proteínas devido ao seu

caráter polianiônico bastante alto. Como polieletrólitos são capazes de controlar a

difusão de várias macromoléculas, tais como, fatores de crescimento e

neurotransmissores (SILVA, 2003)

Atualmente, é extremamente importante a realização de estudos mais

detalhados acerca de outras atividades farmacobiológicas além das já

observadas para heparinas de mamíferos. Por exemplo, a ligação da heparina a

lipopolissacarídeos (LPS) de bactérias causando bacteremia em pacientes com

bactérias Gram-negativas e ainda estimulando a ligação de LPS com células

CD14 induzindo a cascata de sinalização que resulta na ativação de alguns

mediadores inflamatórios, como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)

(PLAYFORD et al., 1999; HEINZELMANN et al., 1999).

Experimentos realizados com linhagens de camundongos demonstraram

que as relações inversas de heparina a títulos de anticorpos implicavam em maior

resistência à infecção quando os teores de heparina estavam altos. Sugeriu-se

Introdução 24

assim, de forma explícita, a participação da heparina nos mecanismos de defesa

do organismo (STRAUS et al, 1984). Com base também em outros estudos foi

evidenciado que a heparina possui uma ação inibitória do sistema complemento

atuando nos componentes terminais do referido sistema. O sistema complemento

auxilia o sistema imune na defesa do organismo contra possíveis infecções. Tal

efeito é atribuído a massa molecular destes compostos e às suas características

estruturais, ou seja, diretamente relacionado com o aumento do número de

resíduos de sulfato e de ácido glucurônico ou idurônico, sugerindo-se assim, que

estes resíduos seriam essenciais para uma total atividade sobre o sistema imune

(WESTON & PARISH, 1991).

1.5 Cascata de coagulação sangüínea

O processo de coagulação envolve duas vias denominadas de vias

intrínseca e extrínseca. O mecanismo extrínseco de coagulação inicia-se em

presença de fator tecidual que é liberado e posto em contato com o sangue

somente após uma injúria vascular. Quando os coágulos são formados em área

de fluxo sangüíneo lento ou em resposta a um vaso sangüíneo com membrana

anormal, sem que tenha havido injúria tissular, esta via é denominada de

mecanismo intrínseco. Ambos os mecanismos convergem num mecanismo

comum final no qual participam diversos fatores de coagulação, proteínas inativas

que se tornam ativas e que são determinantes para a ativação de protrombina em

trombina e a conversão do fibrinogênio em fibrina conforme mostra a figura 3.

Introdução 25

(WILCOX et al. 1989; MORAES, 2001). O plasma possui várias proteases

capazes de inibir a geração da fibrina, sendo a antitrombina (AT) um dos mais

importantes por bloquear a atividade da trombina além dos fatores XIIa, XIa, IXa,

e fator Xa, (PETITOU et al., 1999; HARENBERG et al., 1995; AVCI et al., 2003)

figura 3. Um outro inibidor natural da cascata de coagulação é a proteína C, que

uma vez ativada pelo complexo formado entre a trombomodulina e a trombina,

esta proteína inicia uma via anticoagulante natural pela clivagem dos fatores Va e

VIIIa, cofatores pertencentes a via intrínseca. (RAND et al., 1996; DI CERA, 1998).

O mecanismo estabelecido a partir da ativação da proteína C favorece a mudança

de função da trombina que passa de procoagulante para anticoagulante como

descrito por (DI CERA, 1998).

Inúmeros autores atribuem a atividade anticoagulante apresentada por

polissacarídeos sulfatados naturais como a heparina, por exemplo, a uma

seqüência pentassacarídica especifica destes compostos, com grupos N e O-

sulfatados capazes de formar sítios de ligação para a AT (LINDAHL & KJELLÉN,

1989; CHOAY, 1989). Sabe-se ainda que a heparina não apenas causa uma

mudança conformacional na AT, sua ação implica também, na formação de uma

superfície catalítica na qual a trombina e a AT se ligam (DANIELSSON et al.,

1986). Apesar de apresentar-se amplamente difundida na clinica como

anticoagulante, a heparina apresenta uma série de desvantagens relacionadas a

sua utilização, tal como uma possível contaminação por ser de origem animal

podendo também provocar a trombocitopenia (HIT). (HIRSH, 1991; BEIJERING &

CATE, 1997).

Introdução

26

Figura 3- Esquema da cascata da coagulação

1.6 Atividade anticoagulante

XXIIIIaa

XXIIII

XXII

IIXX

PPrroottrroommbbiinnaa ((IIII))

Fibrinogênio ((II))FFIIBBRRIINNAA

XXIIaa

XXaa

IIXXaa VVIIIIaa VVIIIIIIaa

VVaa

IIII

VVIIII

IIIaaI

TTrroommbbiinnaa

Superfície “Ativa”

Traumatismo

VVIIAA IINNTTRRÍÍNNSSEECCAA

VVIIAA EEXXTTRRÍÍNNSSEECCAA

VVIIAA FFIINNAALL CCOOMMUUMM

XXXX

Antitrombina

Proteína C

(Trombomodulina )

TPA

Plasminogênio Plasmina

Introdução 27

O plasma possui várias proteases capazes de inibir a geração da fibrina,

sendo a antitrombina (AT) um dos mais importantes inibidores por bloquear a

atividade da trombina, do fator IXa e fator Xa ( DAVIE, FUJIHAWA & KISiEL,

1991). A interação entre a região pentassacarídica da heparina e a AT pode ser

observada na figura 3. Um outro inibidor natural da cascata de coagulação é a

proteína C, que uma vez ativada pelo complexo formado entre a trombomodulina

e a trombina, inicia uma via anticoagulante natural pela clivagem dos fatores Va e

VIIIa, cofatores pertencentes a via intrínseca (RAND et al., 1996; DI CERA, 1998).

O mecanismo estabelecido a partir da ativação da proteína C favorece a mudança

de função da trombina que passa de procoagualnte para anticoagulante como

descrito por DI CERA em 1998.

Inúmeros autores atribuem a atividade anticoagulante apresentada por

polissacarídeos sulfatados naturais como a heparina, por exemplo, à seqüência

pentassacarídica destes compostos com grupos N e O-sulfatados capazes de

formar sítios de ligação com a antitrombina (LINDHAL & KJELLÉN, 1991; CHOAY,

1989). Sabe-se ainda que a heparina não apenas causa uma mudança

conformacional na AT, sua ação implica também, na formação de uma superfície

catalítica na qual a trombina e a AT se ligam (DANIELSSON et al 1986 ;

PETITOU, et al., 1999). Apesar de apresentar-se amplamente difundida na clínica

como anticoagulante, a heparina apresenta uma série de desvantagens

relacionadas à sua utilização, tal como uma possível contaminação por ser de

origem animal, podendo também provocar a trombocitopenia (HIRSH, 1991;

BEIJRING, et al., 1997). PETITOU & VAN BOECCKEL, 2004 analisando

Introdução 28

recentemente um pentassacarídeo sintético, análogo a região pentassacarídica da

heparina, que interage com a AT propuseram que novos fármacos lançados no

mercado, tais como, idraparinux e novos oligossacarídeos deverão agir de forma

mais seletiva em modo de ação do que a heparina e com menores chances de

promoverem a trombocitopenia.

Figura 4- Interação da heparina com a antitrombina.

1.7 Heparinas não fracionadas (HNF) e heparinas de baixo peso molecular

(HBPM)

Introdução 29

A alta incidência de enfermidades coronarianas no mundo inteiro e os

custos que estas geram em termos de recursos hospitalares, ambulatoriais e a

incapacidade resultante para o trabalho, têm induzido a investigações na área de

heparinóides.

Durante décadas a heparina não fracionada (HNF) tem sido o fármaco de

escolha no tratamento da enfermidade tromboembolítica venosa (ETV). A ação

inibitória é exercida mediante a inativação dos fatores da coagulação ativados:

calicreína, factores XIIa, XIa, IXa, Xa e trombina (IIa). (DAVIE, et al, 1991).

Com o avanço da pesquisas neste campo, verificou-se que as heparinas de

baixo peso molecular (HBPM) eram também importantes anticoagulantes. Estas

foram desenvolvidas a partir da década de 1970 estimuladas por três

observações: 1) Atividade antifator II menor que a atividade antifator X (JONHSON

et al.,1976; ANDERSSON et al., 1976). 2) A relação custo benefício mais

favorável (CARTER et al.,1984) 3) As HBPM atuais possuem diferentes pesos

moleculares, variando de 4.000 a 6.500 tendo portanto um terço do tamanho da

heparina não-fracionada e apresentando baixos efeitos colaterais (HIRSH &

LEVINE, 1994 ).

No entanto, um dos questionamentos com relação ao uso a HBPM é a

variabilidade de pesos moleculares. Uma grande base de dados pré clínicos é

atualmente levada em consideração apesar de serem usadas pequenas doses

deste tipo de heparina (30-40 mg ou 2.500 a 4000 unidades anti Xa). Tendo em

vista a possibilidade de seu uso terapêutico utilizando-se doses maiores, estudos

Introdução 30

foram realizados por FAREED et al., 2004 avaliando os aspectos bioquímicos e

farmacológicos de heparinas de baixo peso molecular. A justificativa deste estudo

foi baseada em diferenças na eficácia clínica da heparina quando é administrada

na angina instável. MOUSA 2002; HIRSH et al., 1994 tem direcionado seus

estudos para as propriedades clínicas das heparinas de baixo peso molecular.

Todas as HBPM são obtidas a partir da heparina não fracionada por um dos

seguintes métodos: a) despolimerização com ácido nitroso; b) tratamento com

heparinase; c) clivagem com peróxido de hidrogênio ou benzilação seguida de

despolimerização alcalina (BARROWCLIFFE et al.,1988).

Atualmente, as heparinas não fracionadas e fracionadas possuem diversas

aplicações na terapêutica e são utilizadas profilaticamente em cirurgias de lesão

da medula espinhal e traumas múltiplos, assim como, no tratamento de

tromboembolismo venoso e angina instável (NADER et al., 1999; AVCI et al.,

2003; MORAES 2001).

Outro estudo recente realizado com heparina não fracionada, heparina de

baixo peso molecular e hirudina, demonstrou que estes 3 compostos atenuavam

de forma similar os efeitos da adesão endotelial de leucócitos na pós isquemia.

(HABAZETTL et al., 2004).

1.8 Resposta inflamatória

Introdução 31

A injúria e morte celular podem ser determinadas por processos externos e

internos às células, os quais promovem uma reação complexa em tecidos

vascularizados denominada inflamação. A resposta inflamatória nos tecidos

conjuntivos vascularizados inclui a participação do plasma, células circulantes,

vasos sangüíneos e constituintes celulares e extracelulares dos tecidos

conjuntivos. Esta reação, que fundamentalmente apresenta-se como uma

resposta de proteção utilizada pelo organismo para livrar-se da causa e das

conseqüências da injúria celular, caracteriza-se pelo acúmulo de fluídos e de

células do sangue nos tecidos extravasculares (COTRAN et al.,1999).

1.8.1 Princípios da resposta Inflamatória

A resposta inflamatória é caracterizada pela dor, rubor, calor e edema no

sítio da infecção. Tais alterações são refletidas nos três tipos de mudanças nos

vasos sangüíneos locais. A primeira delas é o aumento do diâmetro vascular,

levando a um aumento no fluxo sangüíneo local resultando em calor e rubor e em

uma redução na velocidade do fluxo sangüíneo, especialmente nas superfícies

dos pequenos vasos sangüíneos locais. A segunda ocorre nas células endoteliais

que circundam os vasos sangüíneos as quais são ativadas para expressar

moléculas de adesão celular que promovem a união dos leucócitos circulantes. A

combinação da taxa e do fluxo sangüíneo reduzido e moléculas de adesão

induzidas, permitem aos leucócitos aderirem ao endotélio e migrarem para os

tecidos, em um processo denominado extravasamento. Todas essas mudanças

Introdução 32

são produzidas pelas citocinas liberadas pelos macrófagos ativados. Uma vez

tendo início à inflamação, as primeiras células atraídas ao local da injúria são

geralmente os neutrófilos, seguidos pelos monócitos, que se diferenciam em

macrófagos nos tecidos. Na última etapa da inflamação, outros leucócitos como os

eosinófilos e linfócitos chegam ao local infectado (ROBBINS & COLTRAN, 1998).

A terceira mudança nos vasos sangüíneos locais é o aumento da

permeabilidade vascular. Em vez de permanecerem firmemente juntas, as células

endoteliais que limitam as paredes dos vasos sangüíneos se desprendem,

permitindo a saída de fluido e proteínas do sangue ocorrendo o seu acúmulo no

local do tecido atingido. Essas mudanças são induzidas por uma variedade de

mediadores inflamatórios liberados como conseqüência do reconhecimento de

patógenos, esses incluem os mediadores lipídicos da inflamação- prostaglandinas,

leucotrienos e o fator ativador de plaquetas (PAF)-que são rapidamente

produzidos pelos macrófagos por meio de vias enzimáticas que degradam os

fosfolipídeos de membrana. Suas ações são seguidas por aquelas das citocinas e

das quimiocinas- (citocinas quimioatraentes) que são sintetizadas e secretadas

pelos macrófagos em resposta aos agentes promotores do processo inflamatório.

A citocina fator de necrose tumoral-α (TNF-α), por exemplo, é um potente ativador

de células endoteliais. Ocorre também que o sistema de coagulação sangüínea

participa do mecanismo da resposta inflamatória onde a cascata de enzimas

plasmáticas induzidas pelo dano aos vasos sangüíneos, estimula à formação do

coágulo, que evita à entrada de qualquer microrganismo na corrente sangüínea

Introdução 33

limitando desta forma a dispersão de qualquer agente infeccioso dentro do

organismo hospedeiro (ABBAS; POBER; LITCHEMAN, 2003).

No processo inflamatório estão envolvidas diversas moléculas

denominadas de moléculas de adesão. A adesão dos leucócitos ao tecido tipo

(endotélio vascular), é o passo inicial que desencadeia a resposta inflamatória.

Este processo é intensamente regulado por interações especificas receptor-

ligante, e ocorrem em seqüência ordenada de eventos. Inicialmente, os leucócitos

ficam ancorados numa interação de baixa afinidade, em seguida, deslocam-se

linearmente sobre o endotélio ativado num processo de rolagem, ancoram-se

firmemente e por último extravasam para o local da infecção (Figura 5). Todos

estes estágios são realizados por três classes distintas de moléculas de adesão:

as selectinas, integrinas e imunoglobulinas.

Neste ponto em especial estudos relataram que a heparina também atua

como componente anti-inflamatório e que a mesma possui afinidade com a L e

P-selectina impedindo a fase inicial do processo de inflamação uma vez que a

heparina liga-se a elas inibindo-as, por se ligarem a domínios relacionados ao

SLex (HAYWARD, NOSSULI & LEFER 1997; KOENIG,1997).

Porém, nenhum efeito sobre a E-selectina foi comprovado, visto que

experimentos realizados em grupos de animais com gene nocauteado para

expressão da L- e P- selectina mas expressavam a E-selectina, quando tratados

com heparina desenvolviam o processo inflamatório de modo mais tardio.

Contudo para que estas interações fossem efetivas, seria necessário, se

conhecer os sítios específicos da molécula de heparina que tem afinidade para

Introdução 34

Figura 5 - Rolamento de leucócitos e distribuição celular das moléculas de adesão

(TIBS). Fonte: www.glycoforum.org

1.9 Propriedades antiinflamatória dos heparinóides

heparinóides, compostos altamente

acídicos, portanto, negativamente carregados, justificam sua interação com

proteínas diversas, tais como AT e moléculas de adesão. Esta interação requer na

estrutura primária destes polímeros sítios (motivos) específicos; (LAWRENCE et

a morfogênese, inflamação, defesa do hospedeiro, e metabolismo energético.

(BERNFIELD et al., 1999)

ligar-se a estas moléculas de adesão, uma vez que, a heparina pode provocar

efeitos colaterais do tipo hemorrágico e de trombocitopenia, invibializando sua

utilização como componente antiinflamatório (XIE et al., 2000).

As características estruturais dos

al., 2004). Estas interações específicas implicam em diversos eventos envolvendo

Introdução 35

grande influência sobre

inúmeras moléculas, tipos celulares e processos relevantes na inflamação. Este

GAGS

inflamatório o heparam sulfato presente na matriz e na

superf

nquica e doenças inflamatórias do intestino. Diversos

estudo

de reperfusão,

O heparam sulfato da superfície celular tem

liga-se a proteínas da matriz, citocinas e quimiocinas. Estas interações

modulam efeitos na maturação de células inflamatórias: 1) a ativação, rolamento

de leucócitos e a estrita adesão ao endotélio, bem como extravasamento e

quimiotaxia. (GOTTE, 2003). Segundo este autor, o complexo papel do heparam

sulfato na inflamação é refletido pelas múltiplas funções de seus carreadores

fisiológicos, os sindecans.

Durante o processo

ície de células endoteliais liga-se a quimiocinas, estabelecendo um

gradiente de concentração local. Foi visto também que os proteoglicanos de

heparam sulfato de células endoteliais e da superfície de leucócitos possuem

também um papel chave em sua interação adesiva direta com moléculas de

adesão como as selectinas e beta 2 integrina (ROPS et al., 2004)

Por outro lado, o efeito da heparina como anti-inflamatório, tem sido

analisado em diversos modelos de inflamação com animais, e em pacientes com

artrite reumatóide, asma brô

s têm indicado que a heparina e o heparam sulfato são ligantes para a L e

P-selectina.

Entretanto, oligossacarídeos de heparina e outros heparinoides podem

inibir P e L- selectina ligando-se a compostos relacionados as SLex ou células

HL60. No entanto não estão bem definidos os determinantes estruturais que se

ligam a P e L-selectinas. Na prática clínica a isquemia da injúria

Introdução 36

observ

m heparinas de mamíferos seria interessante a nosso ver, verificar a

ação d

adas em várias condições como infarto do miocárdio, é importante, neste

processo, se destacar o papel dos grupos sulfatos presentes nos heparinóides

(XIE et al., 2000).

Baseado nestes relatos, e considerando que estes estudos foram

realizados co

e heparinóides obtidos do invertebrado Artemia franciscana no processo

inflamatório.

Objetivos 37

2. OBJETIVOS

No filo crustáceo, tem sido relatada a ocorrência de tipos incomuns de

glicosaminoglicanos, como por exemplo, híbridos de heparina e heparam sulfato

os quais foram observados em algumas espécies de lagosta e camarão. A Artemia

franciscana é um crustáceo primitivo dentro da sequência evolutiva de sua classe,

por isto, torna-se importante o estudo desta espécie para a compreensão da

ocorrência filogenética, destas moléculas durante a evolução.

Com a intenção de ampliar o conhecimento sobre a estrutura e função

biológica destes heparinóides o presente trabalho tem como objetivo:

1-Determinar a estrutura dos heparinóides, presentes na espécie do

crustáceo Artemia franciscana empregando-se análises químicas, degradações

enzimáticas com liases espécificas.

2-Avaliar atividades farmacológicas in vitro e em vivo destes compostos

naturais em relação a sua atividade anticoagulante, hemorrágica e anti-

inflamatória.

Material e Métodos 38

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 MMAATTEERRIIAALL BBIIOOLLÓÓGGIICCOO

Figura 6. Crustáceo da espécie Artemia franciscana

corresponde a animal adulto que mede 10 a 12 mm de co

Filo: Arthropoda

Classe: Crustacea

Sub classe:Branchiopoda

Ordem: Anostraca

Família: Artemiidae

Gênero: Artemia

Espécie: Artemia franciscana

utilizado neste estudo. A figura

mprimento.


3.1.2 Artemia franciscana

A biomassa congelada de Artemia franciscana foi adquirida junto à empresa

distribuidora Henrique Lage Salineira do Nordeste, Macau/RN. O material foi mantido

a –20°C até o momento do processamento. A biomassa utilizada neste estudo

corresponde, principalmente, a pré adultos e adultos desta espécie, capturados com

uma malha seletiva (1 mm) nos evaporadores das salinas.

3.1.3 Enzimas

Foram utilizadas neste estudo as enzimas heparitinases I e II provenientes de

Flavobacterium heparinum gentilmente cedidas pela Profa. Helena B. Nader

(UNIFESP) e Maxatase, (protease alcalina P126) foi adquirida da BIOCON do Brasil

Indústria Ltda (Rio de Janeiro, RJ).

3.1.4 Animais utilizados nos ensaios in vivo

Para a realização do ensaio hemorrágico foram utilizados ratos Wistar

machos, adultos de 4 a 6 meses de idade, com peso entre 250 e 350g, oriundos do

biotério da Universidade Potiguar (UNP). Os animais utilizados no experimento

receberam água e dieta “ad libitum” e foram mantidos em condições controladas de

iluminação e temperatura (23 a 25°C).


3.2 Padrões de polissacarídeos sulfatados utilizados como referência de

mobilidade eletroforética.

Condroitim 4–sulfato (extraído da cartilagem de baleia) e dermatam

sulfato (extraído de pele de porco) adquiridos de Miles Laboratories

Inc. (Elkhart, IN, EUA).

Heparina da mucosa intestinal bovina foi adquirida daSigma

Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA).

Heparina desaminada da mucosa intestinal suína foi adquirida da

Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA).

Heparam sulfato (de pâncreas bovino) preparado na Opocrin

Laboratories (Modena, Itália).

Os dissacarídeos insaturados N-6- dissulfatado (∆U, 2S-GLcNS,

6S), N-sulfatado foram obtidos por degradação enzimática de

heparam sulfato de pâncreas bovino com heparitinases I e II,

conforme descrito por Nader et al, 1990.

Heparina desaminada foi adquirida da Sigma Chemical Co. (St.

Louis, MO, EUA).


3.2.1 Monossacarídeos

D–glucosamina, D–galactosamina, N-acetil-D–galactosamina, N-

acetil-D–glucosamina, D–galactose, D-manose, D-glucose, ácido

D–glucurônico, adquiridos da British Drug House (BDH) Chemicals

Ltda. (Poole, Inglaterra) e Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO,

EUA).

3.2.2 Outros materiais

Ácido sulfúrico, acetona e tioglicolato de sódio foram adquiridos da

Merck (Darmstadt, Alemanha).

Agarose (Standard-Low-Mr) adquirida da Bio Rad Laboratories

(Richmond, CA. EUA).

Azul de Toluidina; ácido isobutírico, vermelho de cresol e coomasie

briliant blue R 250 foram obtidos da Sigma Chemical Co. (St. Louis,

Mo, EUA.

Cloreto de sódio, ácido acético, ácido clorídrico da Reagen

Quimibrás Indústrias Químicas S.A. (Rio de Janeiro, RJ, Brasil).

Carbazol, 1,3–diamino propano adquiridos da Aldrich Chemical Co.

Inc. (WI, EUA).

Maxatase (protease alcalina P 126) da BIOCON do Brasil indústria

Ltda (Rio de Janeiro, RJ, Brasil).


Brometo de cetiltrimetilamônio (CETAVLON) da Britsh Drug House

Chemical Ltda. (Poole, Inglaterra).

Papel Whatman nº 1 foi adquirido por meio da R. Balston Ltda

( Maidstone, England)

Todos os demais reagentes utilizados foram da melhor qualidade disponível.

3.3 Aparelhos

Além dos aparelhos habitualmente empregados em nosso laboratório

podemos citar os seguintes equipamentos disponíveis no Departamento de

Bioquímica:

Agitador orbital, modelo 255, FANEM Ltda. (São Paulo, SP, Brasil).

Liofilizador da EDWARDS do Brasil (São Paulo, SP, Brasil.

Fontes de corrente contínua regulável, desenvolvidas Bio Rad.

Banho maria e estufas de temperaturas constantes, FANEM Ltda.

(São Paulo, SP, Brasil).

Câmaras para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido

por Jaques et al (1968) (Técnica Permatron Ltda., São Paulo, SP,

Brasil).

Microscópio Olympus modelo BX-40. (Tokyo, Japão).

Espectrofotômetro U-200 da Hitachi Koki Co., Ltd. (Tóquio, Japão).

Medidor de pH, Orion Research model 701 A/ digital lonalyzer

(Cambridge, MA, EUA).

Coagulômetro modelo: Quick time da (DRAKE Ltda).


3.4 Métodos

3.4.1 Extração dos polissacarídeos sulfatados de Artemia franciscana.

A biomassa (3kg) de A. franciscana foi submetida a delipidação com 3

volumes de acetona, durante 24 horas, à temperatura ambiente. O pó cetônico

obtido foi homogeneizado com NaCl 1,0 M, sendo o pH ajustado para 8,0 pela

adição de NaOH. Após adição de maxatase na proporção 4g/Kg, a mistura foi

submetida à proteólise sob uma camada de tolueno e mantida 24 horas a 60°C, sob

agitação periódica. Em seguida, a suspensão foi filtrada e do proteolisado obtido foi

retirada uma alíquota de 10 ml para análise do conteúdo total de polissacarídeos e o

restante foi adicionado a resina iônica Amberlite IRA 900 (100 mg/Kg de tecido) para

complexação dos polissacarídeos. A suspensão permaneceu sob agitação à

temperatura ambiente durante 24 horas. O sobrenadante, denominado F-1,0 M, foi

removido por filtração e a resina foi tratada com NaCl 2,0 M e NaCl 3,0 M com o

objetivo de eluir os compostos mais fortemente aderidos. Os heparinóides presentes

na fração F-3,0M foram precipitados com 2 litros de metanol, coletados por

centrifugação e submetidos às análises subseqüentes (Figura 7). A F-3,0 M foi a

fração escolhida neste trabalho para os estudos de caracterização parcial da

estrutura e análises farmacológicas.


3.4.2 Fracionamento dos heparinóides com diferentes concentrações de

acetona.

A fração F-3,0M obtida após extração dos polissacarídeos do tecido do

crustáceo A. franciscana, foi submetida a fracionamento com volumes

crescentes de acetona. Na fração foi adicionada acetona na proporção de 1:1

(v/v) e mantido a 4°C. Após 18 horas, o precipitado foi coletado e denominado

F0,5. Ao sobrenadante foi adicionado acetona na proporção de 2:1 (v/v) e o

mesmo procedimento anteriormente descrito foi realizado. O precipitado obtido

foi identificado como F-0,6; repetiu-se o mesmo procedimento para se obter as

frações F-0,9 e F-1,2.


Atividade anticoagulante, Hemorrágica e Anti-inflamatória

PÓ CETÔNICO

PROTEOLISADO

MAXATASE 60°C, 24 h

RESINA + PS

RESINA + PS

FRAÇÃO

NaCl 2.0 M

RESINA

Fracionamen

Eletroforeses e Dosag

DELIPIDAÇÃO

ANIMAL

FRAÇÃO 2.0

Figura 7. Esquema de extração e fracionamento dos heparinóides de A . f

polissacarídeos sulfatados.

NaCl 3.0 M

3.0

to com Acetona

ens químicas

ranciscana. PS :


Fração F- 3,0M

0.5V ACETONA 4°C 18h 10.000 rpm10 min

F- 0.5

F 1.2

1.2 V ACETONA 4°C 18h 10.000 rpm10 min

F 0.9


F 0.6


F 0.5

Figura 8. Esquema de fracionamento da fração F-3,0M de A . franciscana por

precipitações crescentes em acetona.


3.4.3 Eletroforese em gel de agarose

O gel de agarose (0,6%) diluído em tampão 1,3 diamino propano acetato

(PDA) 0,05 M, pH 9,0 foi colocado sobre lâminas de vidro medindo (7,5x 5,0x 0,2 cm)

ou (7,5x 10x 0,2 cm). Alíquotas de 5 µl (aproximadamente 5 µg de amostra) foram

aplicadas em canaletas no gel e submetidas à eletroforese (5 V/cm durante 1 hora)

em caixa resfriada a 4ºC. A origem correspondia ao polo negativo (DIETRICH &

DIETRICH, 1976).

Os padrões de glicosaminoglicanos, condroitim sulfato, dermatam

sulfato e heparam sulfato foram utilizados como referência de mobilidade na

eletroforese. Após o tempo previsto de migração eletroforética para o sistema de

tampão PDA, os compostos foram precipitados no gel de agarose pela submersão

da lâmina por um tempo mínimo de duas horas, à temperatura ambiente, em

CETAVLON 0,1% (brometo de N-cetil-N-N-N-trimetilamônio). Após a precipitação

dos polissacarídeos, o gel foi secado sob uma corrente contínua de ar quente e

corado com azul de toluidina 0,1%, numa solução de ácido acético 1% e etanol 50%.

O excesso de corante foi removido em solução descorante, (ácido acético 1% em

etanol 50%). A etapa de descoloração do gel de agarose foi então repetida até que o

fundo da lâmina descorasse completamente. Em seguida, o gel foi então posto para

secar a temperatura ambiente. As bandas de migração eletroforética dos

polissacarídeos de A. franciscana e dos padrões de glicosaminoglicanos sulfatados

foram reveladas pela atividade metacromática específica de cada composto.


3.4.4 Sistema 1,3- diaminopropano acetato (PDA).

As amostras foram aplicadas em lâminas de gel de agarose (0,6%) no

tampão PDA 0,05M, pH 9.0. O sistema PDA, de acordo com o grau de interação da

diamina com os polissacarídeos sulfatados, permite discriminar por ordem

decrescente: condroitim sulfato, dermatam sulfato e, juntos, heparam sulfato e

heparina. O gel foi submetido a 100 V em cuba refrigerada a 4°C e como indicador

de corrida utilizou-se o vermelho de cresol. Após a corrida o gel foi fixado com

CETAVLON (0,1%) por, no mínimo, 2h, seco sob corrente de ar quente e corado

com azul de toluidina 0,1% em ácido acético 1% e etanol 50%. Depois de retirado o

excesso com solução descorante, o gel foi seco a temperatura ambiente e os

polissacarídeos sulfatados foram quantificados por densitometria a 525 nm.

3.4.5 Sistema descontínuo Acetato de Bário/PDA.

As amostras foram aplicadas em lâmina de gel de agarose em tampão

acetato de bário 0,04 M, pH 5,8 e esta submetida a 75 V, durante 10 min. Em cuba

refrigerada a 4°C e em seguida transferida para outra cuba (com tampão PDA), onde

é mantida em repouso durante 15 min a 4° e depois submetida a 100 V. Nesse

sistema a heparina foi fracionada em seus componentes: lento, intermediário e

rápido, ocorrendo diferenciação dos outros polissacarídeos sulfatados que

apresentam comportamento eletroforético como no sistema PDA.


Os procedimentos de fixação e coloração empregados no sistema

Ba/PDA são os mesmos utilizados para tampão PDA.

3.4.6 Sistema Tris – acetato.

A eletroforese em tampão Tris-Acetato (0,05M, pH 8,0) foi também

empregada na identificação dos polissacarídeos sulfatados. Neste método, os

polissacarídeos sulfatados são discriminados pelo número de cargas negativas que

possuem. Assim sendo é a heparina que apresenta maior migração eletroforéica.

Portanto, este tipo de eletroforese serve para diferenciar os heparam sulfatos das

heparinas presentes nos extratos de polissacarídeos sulfatados.

3.5 Degradações enzimáticas.

Após tratamento com acetona, as amostras foram submetidas a incubações

com liases específicas provenientes de F. heparinum, heparitinase I e heparitinase II.

Inicialmente, 100µg de cada uma das frações foram solubilizados em tampão etileno-

diaminoacetato (EDA) e adicionados 5 µl de enzima de forma a obter como volume

final da solução 30 µl. A incubação foi realizada durante 18 horas em banho-maria

regulado a 25°C, e os produtos de degradação foram analisados por cromatografia

em papel.


3.6 Cromatografias em papel

As amostras foram aplicadas em papel Whatman n°1 sob corrente de ar quente

e submetidas a cromatografia descendente de papel. O solvente utilizado foi ácido

isobutírico: amônia 1,25 N na proporção de 5: 3,6 (v/v) ou na proporção de 5:3 (v/v),

no caso das demais amostras. Após 48 horas no caso da incubação com

heparitinase I e II, o cromatograma foi seco á 60°C. As amostras detectadas por

ultra-violeta foram em seguida reveladas com reagente de nitrato de prata em meio

alcalino (TREVELYAN et al. 1950).

3.7 Análises químicas

Ácidos urônicos

O conteúdo de ácido urônico foi estimado pela reação do carbazol

descrita por Dische (1974), utilizando-se como padrão o ácido D-glucurônico

sendo as leituras realizadas a 525 nm.

Proteínas

O conteúdo de proteínas foi determinado com o reagente de coomassie

blue R segundo o método de Spector (1978) e a leitura realizada a 595 nm,

empregando como curva padrão soro albumina bovina.


Hexosaminas

A hexosamina total foi determinada pela reação de Élson-Morgan, 1955

modificada, após hidrólise ácida com HCl 4N durante 6h a 100°C em ampolas

seladas e evaporação do ácido a vácuo sob NaOH.

Sulfato

O teor de sulfato total foi determinado após hidrólise ácida (HCl 6N, 6

horas, 100ºC) por turbidimetria pelo método da gelatina-bário (Dodgson &

Price, 1962). O sulfato de sódio (1 mg/ml) foi utilizado como curva padrão

sendo submetido às mesmas condições das amostras em estudo.

3.8 Peritonite induzida por tioglicolato de sódio

Todos os grupos experimentais e controles foram formados por 10 ratos da

linhagem Wistar com dois meses de idade pesando 150-200g. Os animais foram

pesados para calcular as doses individuais de heparinóides. Foram empregadas as

seguintes concentrações: 5, 10, 15, 20, 25 µg/Kg, para os diferentes tipos de

heparinóides testados. Os compostos nas diferentes concentrações foram pesados e

dissolvidos em 1 ml de solução salina a 0,9% e aplicados subcutaneamente nos

animais. O grupo controle foi submetido ao mesmo procedimento sendo que os

animais receberam 1 ml de solução salina 0,9% estéril sem heparinóides

Após 30 minutos, os animais receberam intraperitonealmente uma injeção

contendo uma solução de tioglicolato de sódio a 3% conforme metodologia proposta


por Xie et al, (2000). Os animais foram então mantidos com “água” e dieta ad libitum.

Três horas após a aplicação do tioglicolato de sódio 3% os animais foram

sacrificados e submetidos à lavagem da cavidade peritoneal com 10 mL de solução

salina contendo EDTA 2mM. O líquido peritoneal e o sangue total de cada animal

foram colhidos, e acondicionados em tubos de hemólise contendo EDTA.

Os leucócitos presentes no líquido coletado na cavidade peritoneal dos

animais foram corados pela solução de Turck e então contados em câmara de

Neubauer, enquanto os leucócitos presentes no sangue total foram contados por

cotagem diferencial.

3.9 Atividade anticoagulante

A atividade anticoagulante das frações foram avaliadas por aPTT e PT.

a) APTT- Tempo de tromboplastina parcialmente ativada.

Foram colocadas em um tubo de ensaio e misturadas cuidadosamente, 9

partes de sangue recentemente colhido com 1 parte de citrato de sódio. O sangue

contendo o anticoagulante foi centrifugado a aproximadamente 300 rpm a fim de

serem separadas a parte sólida da líquida. O plasma obtido foi então acondicionado

em tubode ensaio. Foram utilizados no ensaio 0,1 mL de plasma e 0,1 mL de

cefalina líquida (ativada com complexo caolin). Os reagentes foram homogeneizados

e incubados por 3 min. a 37°C. Pipetou-se 0,1mL de cloreto de cálcio aquecido a

37°C. A leitura foi realizada em coagulometro a fim de se observar a formação ou

não da rede de fibrina.


b) PT- Tempo de pró-trombina

O plasma foi obtido da mesma forma que mencionado para APTT. Adicionou-

se ao plasma 0,1 ml do reagente REPLASTIN (tromboplastina extraída do cérebro de

coelho). Incubou-se 0,1 ml de cloreto de cálcio 25 mM previamente aquecido a 37°C.

O tempo de PT foi avaliado em um coagulometro.

3.10Atividade hemorrágica

O método utilizado para realização da atividade hemorrágica foi o

desenvolvido por CRUZ & DIETRICH em 1967, com algumas modificações propostas

por DIETRICH et al., 1999.

Através do trabalho desses autores foi observado que a aplicação da heparina

no local da lesão (escarificação) causava a ruptura do sistema hemostático, mesmo

após várias lavagens da cauda com solução salina. Este efeito foi denominado de

efeito hemorrágico residual da heparina.

Para observar esse efeito das frações em estudo, foram feitas raspagens na

parte terminal das caudas dos ratos, seguida de uma escarificação (10 X 1 X 0,5

mm) com uma lâmina de tricotomia na porção distal da cauda.

Em seguida a cauda escarificada foi introduzida em tubos de ensaio de 3mL

contendo 2 ml de solução salina tamponada (NaCl 0,85%; NaHCO3 0,1 mM a pH 7,0,

37°C), para acompanhar o sangramento foi utilizada uma potente lupa. Após esse

procedimento inicial o experimento consistiu em mergulhar, verticalmente, a cauda


escarificada em solução salina e acompanhar o processo de sangramento. A seguir,

por estímulo mecânico (friccionando uma gaze sobre a escarificação), obteve-se

novo sangramento, e a cauda foi, então, mergulhada numa solução salina nova. A

quantidade de proteína liberada da lesão, neste processo, serve como controle para

ensaios posteriores. O tempo de sangramento normal é de 60±20 s, enquanto que a

proteína total liberada é de 1500±500 µg. Para os experimentos, foram realizadas

três reaberturas da lesão, com intervalos de 10 minutos, tomando-se uma média

referente a um controle de sangramento.

Após os três estímulos mecânicos, a cauda foi mergulhada numa solução

contendo drogas a serem analisadas. Decorridos determinados períodos regulares

de tempo, a cauda foi retirada da solução e lavada intensamente com solução salina,

e o efeito hemorrágico residual observado, mergulhando-se a cauda numa nova

solução salina sem droga.

Os resultados foram expressos pela razão entre a soma cumulativa da taxa de

proteínas liberadas da lesão antes e após o contato com a droga.


3.11 Métodos Estatísticos:

Nas análises estatisticas dos modelos experimentais de inflamação em ratos da linhagem

Wistar foram utilizados os seguintes testes:

• Teste de Kolmogorov-Smirnov, para avaliar a distribuição normal dos grupos

analisados com p>0,10

• Estatística de Bartlett para verificar a homogeneidade das variâncias.

• Análise de variância (ANOVA) com nível de significância de 5%.

• Teste de Tukey, para determinar que grupos que diferem entre os valores obtidos para

os grupos controle e experimental (comparações múltiplas).

Resultados e Discussão 56

4. Resultados e Discussão

4.1 Eletroforese da fração F-3,0 M

Os GAGS são polímeros aniônicos requerendo nas etapas de purificação

complexação com resinas de troca iônica ou precipitação com CTV. O

procedimento de eluição é geralmente feito com concentrações crescentes de

NaCl e posterior precipitação com álcool metílico ou etílico. Glicosaminoglicanos

extraídos de A. fraciscana após proteólise foram complexados com resina de troca

iônica (LEWATIT) e eluídos com concentrações variadas de NaCl (1,0; 2,0 e 3,0

M). As frações obtidas nas concentrações de NaCl (1,0 e 2,0 M) foram analisadas

por Chavante em 1997. Neste estudo, a autora se propunha a verificar a estrutura

de um heparam sulfato deste micro-crustáceo e para isto escolheu a fração F-2,0

M por possuir maior rendimento. Tendo em vista que a F-3,0 M apresentava um

perfil eletroforético homogêneo indicando a ausência de contaminantes,

resolvemos caracterizar este polímero e avaliar suas atividades farmacológicas.

Vários sistemas de tampão foram utilizados para avaliar o perfil de

migração da F- 3,0 M de A franciscana. Na figura 9 podemos observar que a F-

3,0M é um composto metacromático que migra entre o dermatam e heparam

sulfato. Como este polissacarídeos apresenta uma única banda polidispersa e de

migração atípica resolvemos fazer então uma purificação adicional em acetona

para verificarmos a presença ou não de outros componentes nesta fração.


PDA

CS DS HS

Figura

em diversos s

8,0; Tris –acet

bário 0,04 M p

CSDS

0 0
P F-3,0
9. Eletroforese em gel

istemas de tampões.

ato, tampão tris acetato

H 5,8.

TRIS- ACETATO

de

PDA

0,0

P F-3,

HS

agarose da F-3,0 M de Artemi

, tampão diamino propano aceta

5 M , pH 8,0; Bário PDA, tamp

Bário/PDA

a

to

ão

P F-3,

CS DS HS

franciscana

0,05 M pH

acetato de


4.2 Composição Química da F-3,0 M de Artemia. franciscana.

A fração F-3,0M foi submetida à analise de seus componentes por meio de

dosagens colorimétricas e turbidimétricas para (SO4) como descrito em métodos.

Tabela 2- Relação molar dos componentes constituintes da F-3,0M de Artemia

franciscana, heparina e heparm sulfato.

Frações Ácidos Urônicos Hexosamina Sulfato

F-3,0M 0,9 1,0 1,7

Heparina 1,6 1,0 2,6

Heparam Sulfato 1,4 1,0 1,1

• Heparina comercial de intestino bovino. • Heparam Sulfato de pâncreas bovino.

A fração F-3,0M apresentou composição característica de GAGS o quê

somando-se aos dados das eletroforeses indicou a presença de GAGS nesta

fração.

Comparando-se as dosagens de F-3,0M a heparina e heparam sulfato

observa-se que elas não se assemelham em valores molares, indicando que os

componentes de F-3,0M são compostos tipo heparinóides.


4.3 Fracionamento da F 3,0 M em acetona

O fracionamento em acetona é uma metodologia de fácil execução e repro-

dutibilidade. Segundo Johson, 1982, compostos hidrofílicos como proteínas e

polissacarídeos, GAGS e outros, são prontamente precipitáveis com solventes

mais apolares que o etanol, como por exemplo, a acetona.

Fracionamentos prévios feitos por Nader, 1996, comprovaram que os

GAGS podem ser fracionados com êxito com este solvente em diferentes

concentrações. O acompanhamento do material fracionado geralmente é feito por

eletroforese em gel de agarose em diferentes sistemas de tampões, dosagens

colorimétricas, hidrólises químicas e/ou enzimáticas com cromatografias em papel

dos hidrolisados das frações.

A fração F-3,0M quando fracionada em acetona originou 4 sub- frações por

nós denominadas de 0,5, 0,6, 0,9 e 1,2. Estas sub-frações foram posteriormente

caracterizadas por eletroforese e pelas análises químicas.


4.4 Comportamento eletroforético das sub-frações de Artemia franciscana

proveniente do fracionamento com acetona

Uma das formas de caracterização e de acompanhamento de um processo

de purificação dos GAGS é a eletroforese. Tampões como acetato de bário/PDA,

1,3 diamaminopropano acetato (PDA) e tris-acetato por sua vez, interagem com

estes compostos acídicos devido às características químicas destas biomoléculas.

Podemos observar na figura 10 que a fração F-3,0 de Artemia franciscana

apresentou um composto com uma migração eletroforética abrangendo o DS e

HS. Este comportamento sugere a presença destes dois GAGS e possivelmente

outros compostos com migrações eletroforéticas nesta região, além de sugerir que

esta fração seria dotada de algumas peculiaridades estruturais.

As sub-frações quando submetidas à eletroforese em gel de agarose em

tampão PDA apresentaram diferentes comportamentos eletroforéticos. As frações

F-0,5 e F-0,6 apresentaram dois compostos, um deles com maior migração e

comportamento eletroforético semelhante ao heparam sulfato enquanto que a

outra banda demonstrou migração bem mais lenta neste sistema.


Figura 10. Eletroforese em gel de agarose em tampão PDA 0.05M pH 9,0, dos

polissacarídeos de Artemia franciscana após fracionamento com acetona.

P – padrões de condroitim sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS).

Os números 0,5; 0,6; 0,9;1,2 e 3,0 representam, respectivamente, as frações F-0,5; F-

0,6; F-0,9; F-1,2 e F-3,0.

No tampão tris-acetato figura 11 observou-se que todas as frações de

polissacarídeos mostraram-se pouco polidispersas, sendo que as sub frações F-

0,9 e F-1,2 apresentaram parte de seus perfis eletroforéticos coincidentes com a

heparina e heparam sulfato. Estes resultados, somados aos resultados obtidos

sugerem que os compostos obtidos são heparinóides, embora, contenham

dermatam sulfato como contaminante.


Figura 11. Eletroforese em gel de agarose em tampão Tris-acetato das frações de

Artemia franciscana obtidas após fracionamento com acetona. P– padrões de GAGS

contendo condroitim sulfato(CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS) . Hep-

heparina padrão. 0,5; 0,6; 0,9;1,2 e 2,0 representam, respectivamente, as frações F-0,5;

F-0,6; F-0,9; F-1,2 e F-2,0, provenientes do fracionamento da F-3,0 com acetona.

No sistema descontínuo Ba/PDA figura 12 observou-se nas sub-frações F-

0,5 e F-0,6 a presença de uma banda de migração rápida e outra lenta,

coincidentes com as observadas com a heparina padrão. A sub-fração F-0,9

apresentou também, estas duas bandas sendo que a banda de maior migração

continha compostos com perfis coincidentes com DS e HS. Os resultados obtidos,

embora preliminares, sugerem que a F-3,0 M apresentou um conjunto de

heparinóides, incluindo, um composto com características de um híbrido HS/HeP.

As análises realizadas por Silva, 2003 e Paiva, 2002 indicaram também em outros


crustáceos, a ocorrência de polissacarídeos sulfatados com características

estruturais distintas daquelas descritas na literatura.

Figura 12. Eletroforese em gel de agarose no sistema Ba/PDA das frações de A.

franciscana obtidas após tratamento da F-3,0 com acetona. P–padrões de GAGS

contendo condroitim sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS). Hep--

heparina padrão. 0,5; 0,6; 0,9;1,2 e 2,0 representam, respectivamente, as frações F-0,5;

F-0,6; F-0,9; F-1,2 e F-3,0, provenientes do fracionamento da F-3,0 com acetona.


4.5 Dosagens químicas e cromatografia em papel das frações obtidas

com acetona.

Tanto a F-3,0 M como as sub-frações 0,5, 0,6, 0,9 e 1,2 foram analisadas

quimicamente e os resultados estão demonstrados na tabela 2. Com relação às

análises químicas, a proporção molar de ácidos urônicos: hexosamina: sulfato

identificada para a fração F-3,0M foi da ordem de 0,9: 1,0: 1,7 respectivamente. A

sub-fração 1,2 apresentou uma relação molar similar a observada na fração F-

3,0M. Analisando-se ainda esta tabela, podemos observar que as sub-frações F-

0,6 e F-0,9 apresentaram proporções inferiores de sulfato em relações às demais

frações. Por outro lado, a sub-fração 0,5 mostrou-se enriquecida em ácidos

urônicos, conforme mostra a tabela 3. A fração F-3,0M e a heparina bovina

apresentaram diferenças com relação ao sulfato e a proporção de ácidos urônicos.

Resultado semelhante foi obtido por Silva, 2003 em trabalho realizado com

glicosaminoglicano de Panulirus laevicauda.


Tabela 3- Relação molar dos constituintes das frações de GAGS de A. franciscana.

FRAÇÕES ÁCIDOS

URÔNICOS

HEXOSAMINA SULFATO

F-0,5

2,1

1,0

1,6

F-0,6 1,1 1,0 0,9

F-0,9 1,1 1,0 0,7

F-1,2 1,1 1,0 1,5

F-3,0 0,9 1,0 1,7

Heparina* 1,6 1,0 2,6

* Heparina comercial de intestino bovino.

4.6 Caracterização dos produtos de degradação das frações de Artemia

franciscana

4.6.1 Por degradação enzimática

A degradação enzimática tem sido bastante usada na caracterização de

heparinóides. As liases mais extensivamente estudadas são as de F. heparinum.

Este organismo foi isolado do solo e mantido em meio de cultura cuja fonte de

carbonos era heparina. As enzimas heparitinases I e II quando incubadas com as

frações de polissacarídeos extraídos da A. franciscana formaram os seguintes


produtos: F-0,5, Didi (dissacarídios dissulfatados); F-0,6 Didi. As demais frações

não foram utilizadas por não dispormos de material suficiente.

A ocorrência de heparinóides foi constatada por eletroforese no sistema

PDA e no sistema descontínuo Ba/PDA. Para uma caracterização mais completa

da fração F-3,0M de A. franciscana esta foi incubada com heparitinases I e II

comerciais. Os resultados observados após a incubação com heparitinase I

revelaram como principal produto, dissacarídeos trissulfatados (Ditri). Quando a F-

3,0M foi submetida à ação conjunta de ambas heparitinases I e II liberou como

produto além do dissacarídeo trissulfatado, o dissacarídeo dissulfatado (Didi),

produto característico da ação da heparitinase II sobre o tetrassacarídeo

pentassulfatado, liberado pela heparitinase I figura 13.

Os dados obtidos pela degradação com heparitinases I e II corroboram com

os resultados de outros compostos tipo heparina de invertebrados

(SANTOS,1997), bem como, com a heparina intestinal bovina (PAIVA et al., 1995;

NADER et al., 1999) que são mais susceptíveis a ação conjunta das heparinases

do que a ação isolada da heparinase I, sugerindo uma maior ocorrência de

resíduos de ácido glucurônico nesses compostos.

No que diz respeito a F-3,0M de Artemia quando a mesma é submetida à

ação conjunta de ambas heparitinases, a fração F-3,0M, liberou principalmente,

dissacarídeos trissulfatados (∆U,2S-GlcNS,6S) juntamente com dissulfatados (∆U-

GlcNS,6S) e N-sulfatados, o que reforçaria a idéia de ser este composto um

híbrido tipo heparina /heparam sulfato. Na figura 14 o incubado das sub-frações

0,5 e 0,6 apresentou dois produtos de degradação Didi e um composto que migra


na altura do DiNAC, 6S. Este último composto é característico de um heparam

sulfato.

Em 1997, FERNANDES, estudando glicosaminoglicanos na lagosta

Panulirus argus identificaram um heparam sulfato com alto grau de sulfatação,

também semelhante, ao encontrado em outros crustáceos como A. franciscana

em trabalho anterior realizado por CHAVANTE et al., 2000 com frações distintas

de F-3,0M, frações F-1,0 M e F-2,0M. Tais resultados só vêm reforçar a idéia que

nesta fração existiria heparam sulfato e também resíduos de moléculas tipo

heparina.


A

Figura 13. Caracterização

HEPARITINASE I e HEPARIT

I + II; C- F3,0M+ Heparitinase

+II; F- Heparam sulfato + he

Heparam sulfato + heparitinas

(dissacarídio trissulfatado ∆U,
B C D E F G H I J
da F-3,0 M de A. fran

INASE II. A-F3,0M + Heparitin

I; D- Heparina + HeparitinaseII

paritinase II;G- Heparam sulfa

e I; I- Didi (dissacarídeo dissu

2S-GlcNS,6S).

Ditriidi

OR

ciscana pelas enzimas

ase II; B- F3,0 + Hepariniase

; E- Heparina + HeparitinaseI

to + heparitinase I + II; H-

lfatado ∆U-GlcNS,6S; J-Ditri

D

DiNs

DiNAc,6s

DiNAc


A B

Figura 14. Caracterização das

enzimas HEPARITINASE I e

Heparina + Heparitinase I + II; C

heparitinase I +II; E- Didi (dissac

trissulfatado ∆U,2S-GlcNS,6S).

C D E F

sub frações da F-3,0 M

HEPARITINASE II. A- He

- sub-fração 0,5+ Hepariti

arídeo dissulfatado ∆U-Glc

Ditri

OR

de A. franciscana com as

parina + Heparitinase I; B-

naseI+II; D- sub-fração 0,6+

NS,6S; F- Ditri (dissacarídio

Didi

DiNs


4.6.2 Efeito in vitro dos heparinóides de Artemia franciscana na coagulação

sanguínea

A heparina pode ser utilizada em esquemas terapêuticos com baixas ou

altas doses. A sua utilização, em baixas doses, está indicada quando se deseja

prevenir a TVP em pacientes com determinado risco trombótico (pós-operatório de

cirurgias abdominais e ortopédicas, portadores de neoplasias ou sepse, pacientes

em repouso prolongado etc.). As altas doses são utilizadas com fins terapêuticos,

quando se pretende prevenir a ocorrência de um segundo episódio

tromboembólico em TVP já instalado, em pacientes com TVP, EP, tromboses ou

embolias arteriais ou que estejam sendo submetidos a procedimentos, que

implicam em risco trombótico, como cateterismos arteriais ou angioplastias,

hemodiálise e cirurgia cardiovascular com circulação extracorpórea.

Avaliando a atividade anticoagulante com relação ao tempo de

tromboplastina parcial ativada APTT que indica a deficiência dos fatores da via

intrínseca (VIII, IX, XI, XII) e da via comum (X, II, I).

Os resultados obtidos pelo ensaio da APTT, demonstraram que os

heparinóides (F-3,0M) de Artemia franciscana apresentam baixa atividade

anticoagulante (62.2s em 25 µg/ml) quando comparados com o heparam sulfato

(201s em 15 µg/ml) e heparina comercial de pulmão bovino (240s em 5 µg/ml).

Estes resultados demonstraram que a F-3,0M não tem ação sobre a via intrínseca

da cascata de coagulação figura 15.


Atividade Anticoagulante - aPTT

050

100150200250300

0 2 5 7 10 15 20 25

ug/ml

Tem

po (s

) Heparina

Heparamsulfato F3,0M

Figura 15-Avaliação da atividade anticoagulante pelo teste de tromboplastina

parcial ativada (APTT) in vitro da fração F-3,0 de A. fanciscana, heparam sulfato e

de heparina padrão bovina.

A atividade anticoagulante foi avaliada também através do tempo de

protrombina PT que revela deficiência no fator VII da via extrínseca e nos fatores

da via comum X, V, II, e I ou inibição deles. Os resultados obtidos revelaram que

fração F-3,0M, assim como o heparan sulfato, não tem efeitos sobre a via

extrínseca da cascata de coagulação figura 16.


Atividade Anticoagulante-PT

0

50

100

150

0 2 5 7 10 15 20 25

ug/ml

Tem

po (s

)

Heparina PadrãoHeparam SulfatoF3,0M

Figura 16. Ação anticoagulante, tempo de protrombina (PT) da heparina padrão

bovina, heparam sulfato e fração F-3,0 de Artemia franciscana.

4.6.3 Atividade hemorrágica

Os experimentos realizados em ratos Wistar para se verificar a atividade

hemorrágica dos heparinóides de A . franciscana mostraram que este composto

apresenta uma ação menos efetiva quando comparada com a heparina de pulmão

bovino. Observa-se na figura 17 que a heparina tem uma ação hemorrágica

efetiva em baixas concentrações (25 µg/ml). A F-3,0 M de Artemia franciscana

apresentou uma ação hemorrágica na concentração de 400 µg/ml equivalente a

heparina padrão. Em concentrações mais baixas a 400 µg/ml não foi observada a

atividade hemorrágica indicando que esta atividade neste componente poderia ser

do tipo dose dependente nas diversas concentrações testadas figura 17.


0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 2 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

Tempo (min)

Potê

ncia

de

sang

ram

ento

F-3,0M 100ug/ml

F-3,0M 200ug/ml

F-3,0M 400ug/ml

Heparina P 25ug/ml

Figura 17. Efeito hemorrágico de F-3,0M de Artemia e da heparina de pulmão

bovino padrão.

4.6.4 Efeito da fração F-3,0 M no processo inflamatório.

Conforme já foi mencionado, os heparinóides desempenham importantes

papeis com relação a muitos processos que tem por base o sistema imunológico e

a cascata de coagulação. Estes dois processos estão intrinsecamente ligados pois

as proteases da cascata de coagulação induzem a síntese de mediadores pro-

inflamatórios que tem atividade pro-anticoagulante, amplificando assim, a cascata

de coagulação (LEVI, 2003). A inflamação aguda, como uma resposta à infecção

severa ou trauma, resulta em uma ativação sistêmica do processo de coagulação.

Portanto, o processo inflamatório tem relação direta com o sistema de coagulação.


No presente trabalho, após caracterização parcial dos heparinóides deste

crustáceo e sabendo-se que existe uma interrelação entre coagulação e

inflamação resolvemos verificar o efeito destes compostos no processo

inflamatório. Uma justificativa adicional para o direcionamento deste trabalho neste

sentido, relacionou-se com o fato dos heparinóides deste crustáceo ter em

peculiaridades estruturais como baixas massas moleculares e diferentes graus de

sulfatação em relação as heparinas comerciais.

A fração 3,0 M obtida da Artemia franciscana foi utilizada para os testes de

inflamação induzida por tioglicolato de sódio a 3% em ratos Wistar. O nosso

objetivo estava centrado em verificar as potencialidades desta fração no processo

de inibição da migração de células (leucócitos) para o local da inflamação. Teria

este composto os grupamentos capazes para reconhecer os sítios das moléculas

adesivas impossibilitando desta forma que esta molécula chegue a se tornar

competidora pelos sítios das L- e P- selectinas ?

Xie et al. (2000) utilizando derivados quimicamente modificados da heparina

em um modelo de inflamação aguda mostraram, uma redução da migração de

neutrófilos em torno de 58-73% em relação ao grupo controle. Trabalhos

realizados por Wang et al. (2002) também demonstraram a ação inibitória da

heparina em animais deficientes em P e L-selectinas sendo observado uma

redução na infiltração de neutrófilos da ordem de 50%.

A Analise de Variância (ANOVA), realizada com o grupo controle positivo e

negativo, e os grupos experimentais da heparina padrão (Figura 18),

apresentaram diferenças significantes entre as médias (p<0,001). O pós teste de

Tukey-Kramer para o controle positivo e negativo foram considerados


extremamente significantes (p<0.001). Desta forma estes padrões serviram de

parâmetro para comparação dos grupos experimentais constituídos de heparina

padrão, heparina desaminada e fração F-3,0M de Artemia franciscana.O pós teste

de Tukey-Kramer confirmou as diferenças entre o controle positivo (TG) e a

heparina padrão nas concentrações de 5 µg/Kg (p<0.001) e 10 µg/Kg (p<0.05).

Por outro lado, não foram observadas diferenças entre o controle positivo e a

heparina padrão nas concentrações 15, 20, 25µg/Kg. As diferenças observadas

entre o controle negativo foram significantes para todos os grupos experimentais

(p<0.001). Quando comparada a eficácia das diferentes concentrações da

heparina padrão, constatou-se que a redução do número de leucócitos na

concentração de 5 µg/Kg foi significante em relação a concentração de 10µg/Kg

(p<0.05). As concentrações de 15, 20 e 25 µg/Kg obtiveram um valor de p<0.01.

Ao se comparar a heparina padrão na concentração de 10 µg/Kg com os grupos

15, 20 e 25 µg/Kg as diferenças entre o número de células não foram

estatisticamente significantes (p >0.05).


Heparina Padrão

01.0002.0003.0004.0005.0006.0007.0008.000

Contro

le+

Contro

le- 5 10 15 20 25

Núm

ero

de c

elul

as (m

m3)

Figura 18. Efeito da fração de heparina padrão na migração de leucócitos em ratos Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de sódio.

O gráfico representa a comparação entre as médias do número de

leucócitos do líquido peritoneal 3 horas após a administração intraperitoneal de

tioglicolato de sódio a 3% grupo controle positivo) salina estéril a 0,9% (grupo

controle negativo) e Heparina nas concentrações de 5,10,15,20,25 µg/Kg.

Partindo do princípio de que a heparina padrão tem ação sobre as P e L-

selectinas, resolvemos verificar a ação de uma heparina quimicamente modificada

sobre este sistema. A figura 19 apresenta o número de leucócitos para os grupos

experimentais com a heparina desaminada nas concentrações de 5, 10, 15 , 20 e

25 µg/Kg. A análise de variância (ANOVA) apresentou diferenças significantes

entre o controle positivo, negativo e os grupos experimentais. O pós teste de

Tukey-Kramer identifcou que as diferenças entre as médias do controle positivo e


experimentais foram significantes (p<0,0001). No entanto, quando comparado ao

controle negativo, apenas as médias dos grupos de concentrações 15 e 25 µg/Kg

apresentaram diferenças significantes, ou seja, apesar destas concentrações a

heparina desaminada não conseguiu trazer o número de leucócitos a níveis

basais.

Heparina Desaminada

01.0002.0003.0004.0005.0006.0007.0008.000

Controle +

Controle -

5 10 15 20 25Núm

ero

de c

elul

as (m

m3)

Figura 19 . Efeito da heparina desaminada na migração de leucócitos em ratos Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de sódio.


leucócitos do líquido peritoneal 3 horas após a administração intraperitoneal

de tioglicolato de sódio a 3% (controle positivo) e salina estéril a 0,9%

(grupo controle negativo) e Heparina nas concentrações de 5,10,15,20,25

µg/Kg.


No grupo experimental de F-3,0 M da A franciscana a análise de variância

(ANOVA) apresentou diferenças entre as médias (figura 20). O pós teste de

Tukey-Kramer demonstrou que as diferenças se deram entre o controle positivo e

o grupo experimental em todas as suas concentrações (p<0,0001). O número de

leucócitos no grupo F-3,0 M (20 µg/Kg) não foi reduzido ao padrão de normalidade

quando comparado com o controle negativo (p<0,05). A média do número de

células do grupo F-3,0M na concentração de 10 µg/Kg foi menor que aquelas

encontradas nos grupos F-3,0 M com 15 µg/Kg (p<0,05) e F-3,0 M quando

utilizado 20 µg/Kg (p<0,01). Nas concentrações de 15 µg/Kg e 20 µg/Kg não

existiram diferenças (p>0,05).

F 3,0 M Artemia franciscana

01.0002.0003.0004.0005.0006.0007.0008.000

Contro

le+

Contro

le- 10 15 20

Núm

ero

de c

elul

as (m

mm

3)

Figura 20. Efeito da fração F-3,0 M de Artemia franciscana na migração de leucócitos em ratos Wistar com peritonite induzida por tioglicolato de sódio.



leucócitos do líquido peritoneal 3 horas após a administração intraperitoneal de

tioglicolato de sódio a 3% (controle positivo) e salina estéril a 0,9% (controle

negativo) e Heparina nas concentrações de 10,15,20 µg/Kg.

A comparação foi realizada primeiramente pela constatação de que na

concentração de 10 µg/Kg para os diferentes grupos experimentais apresentaram

diferenças estatísticamente significante em relação ao grupo controle positivo.

Além disso, a atividade da heparina padrão no controle da inflamação é

confirmado pelos seguintes trabalhos da literatura (KOENING et al, 1998; XIE et

al, 2000). Ao se comparar os diferentes grupos experimentais na concentração de

10 µg/Kg constatamos que as diferenças foram significantes pela análise de

variância (p<0,0001). As médias do número de leucócitos para a heparina padrão

10 µg/Kg (3702 mm3) foi maior quando comparado com a heparina desaminada 10

µg/Kg (3465mm3) e com a F3,0 M Artemia franciscana 10 µg/Kg (3400 mm3)

constatada pelo pós teste de Tukey-Kramer (p<0,0001). Os grupos experimentais

testados com heparina desaminada e a F-3,0 M apresentaram um padrão de

afinidade aumentada em relação a interação com a P ou L-selectinas.

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