CCAARROOLLIINNEE CCRRIISSTTIINNAA FFEERRNNAANNDDEESS DDAA SSIILLVVAA

ANLISE QUMICA E ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E CITOTXICA DE AMOSTRAS DE PRPOLIS DE ALECRIM

SSoo PPaauulloo

2008

CAROLINE CRISTINA FERNANDES DA SILVA

ANLISE QUMICA E ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E CITOTXICA DE AMOSTRAS DE PRPOLIS DE ALECRIM

OOrriieennttaaddoorr:: PPrrooffaa DDrraa MMaarriiaa LLuuiizzaa FFaarriiaa SSaallaattiinnoo

DDiisssseerrttaaoo aapprreesseennttaaddaa aaoo IInnssttiittuuttoo ddee BBiioocciinncciiaass ddaa UUnniivveerrssiiddaaddee ddee SSoo PPaauulloo,, ppaarraa aa oobbtteennoo ddee TTttuulloo ddee MMeessttrree eemm CCiinncciiaass,, nnaa rreeaa ddee BBoottnniiccaa

SSoo PPaauulloo

22000088

FFiicchhaa CCaattaallooggrrffiiccaa

CCoommiissssoo JJuullggaaddoorraa

Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

Profa. Dra. Maria Luiza Faria Salatino

Silva, Caroline Cristina Fernandes da

Anlise qumica e atividades antioxidante e citotxica de amostras de

prpolis de alecrim

Nmero de pginas - 102

Dissertao (Mestrado) Instituto de Biocincias da Universidade de

So Paulo. Departamento de botnica

1. Atividade antioxidante 2. Atividade citotxica 3. Prpolis verde.

DDeeddiiccoo eessttee ttrraabbaallhhoo mmiinnhhaa ffaammlliiaa ee

aaoo mmeeuu nnaammoorraaddoo ZZ,, ppoorr eexxiissttiirreemm nnaa

mmiinnhhaa vviiddaa..

AAggrraaddeecciimmeennttooss

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eellaabboorraaoo ddeessttee ttrraabbaallhhoo::

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AAooss PPrrooffeessssoorreess DDrr.. AAnnttnniioo SSaallaattiinnoo ee DDrraa.. DDbboorraahh YY.. AA.. CC.. ddooss SSaannttooss,,

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ppeellooss ccoonnsseellhhooss,, ppeelloo ssuuppoorrttee ee ppeelloo ccaarriinnhhoo;;

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eessppeecciiaallmmeennttee ppaarraa oo BBrruuttuuss,, CCaarroollaa,, GGiiuu,,FFooccaa,, LLeell,, NNeellaass,, NNiinnjjaa,, PPiiggoozzzzoo,, RReeccooddeerr

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AAoo ZZgguuii ee aaoo VViittoo,, ppeelloo aauuxxlliioo nnaass aannlliisseess eessttaattssttiiccaass;;

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pprrvviiaass;;

FFaappeesspp,, ppeelloo ssuuppoorrttee ffiinnaanncceeiirroo..

nnddice

1. Introduo1

1.1. Elaborao e uso da prpolis pelas abelhas........................................2

1.2. Origem botnica e composio qumica da prpolis.............................2

1.3. Origem botnica e composio qumica da prpolis brasileira...............5

1.4. Atividades biolgicas e farmacolgicas atribudas prpolis.................8

1.5. Atividade antioxidante....................................................................9

1.6. Atividade cititxica.......................................................................11

2. Objetivos................................................................................................13

3. Material e mtodos...................................................................................14

3.1. Amostras de prpolis....................................................................14

3.2. Massa seca..................................................................................14

3.3. Preparao dos extratos metanlicos..............................................15

3.4. Extrao fracionada......................................................................15

3.5. Determinao do teor de fenis totais.............................................15

3.6. Determinao do teor de flavonas e flavonis totais..........................16

3.7. Determinao do teor de flavanonas e isoflavonas totais....................17

3.8. Determinao do teor de ceras totais..............................................18

3.9. Identificao das substncias presentes nas amostras.......................18

3.10. Derivao das fraes de clorofrmio............................................19

3.11. Testes de atividade antioxidante...................................................20

3.11.1. Mtodo de seqestro de radicais livres DPPH......................20

3.11.2. Sistema -caroteno/cido linolico....................................21

3.11.3. Atividade antioxidante por cromatografia em camada

delgada....................................................................................23

3.12. Ensaio de citotoxicidade em embries de ourio do mar...................24

3.13 Anlises estatsticas.....................................................................25

4. Resultados..............................................................................................27

4.1.Massa seca...................................................................................27

4.2. Determinao do teor de fenis totais.............................................27

4.3. Determinao do teor de flavonas e flavonis totais..........................29

4.3. Determinao do teor de flavanonas e isoflavonas totais....................31

4.5. Determinao do teor de ceras totais..............................................32

4.6. Teste de regresso linear...............................................................33

4.7. Identificao das substncias presentes nas amostras.......................35

4.8. Atividade antioxidante...................................................................47

4.8.1. Mtodo de seqestro de radicais livres DPPH..........................47

4.8.2. Atividade antioxidante dos extratos fracionados pelo mtodo do

DPPH................................................................................50

4.8.3. Atividade antioxidante no sistema -caroteno/cido

linolico.............................................................................51

4.8.4. Atividade antioxidante dos extratos fracionados no sistema -

caroteno/cido linolico.................................................................54

4.8.5.Teste de regresso linear relacionando a atividade

antioxidante...................................................................56

4.8.6. Atividade antioxidante por cromatografia em camada

delgada.............................................................................59

4.9. Ensaio de citotoxicidade em embries de ourio do mar.....................65

5. Discusso................................................................................................73

6. Consideraes finais.................................................................................86

7. Referncias bibliogrficas..........................................................................90

8. Resumo................................................................................................101

9. Abstract................................................................................................102

1

11.. IINNTTRROODDUUOO

A palavra prpolis deriva do Grego pro, em defesa de, e polis, cidade, ou

seja, um produto utilizado pelas abelhas na defesa da colmia (Ghisalberti,

1979). Trata-se de uma mistura complexa de substncias, com aspecto resinoso,

elaborada por abelhas Apis mellifera e tambm por abelhas indgenas sem ferro

(Melipona compressipes, Tetragonisca clavipes, Melipona quadrifasciata,

Friesomelitta varia, Melipona favosa, Scaptotrigona depilis, Paratrigona anduzei,

Tetragonisca angustula, entre outras) (Tomas-Barbern et al., 1993; Bankova et

al., 1999; Pereira et al., 2003).

Sua aparncia bastante varivel, tanto na colorao (desde amarelo claro

at marrom escuro ou vermelho) quanto na textura (desde rgida, se pulverizando

facilmente, at elstica e pegajosa) (Ghisalberti, 1979; Salatino et al., 2005).

composta principalmente por cera de abelhas e substncias derivadas de plantas,

que so incorporadas sem alterao (Burdock, 1998). Para a produo da prpolis,

as abelhas coletam substncias que so ativamente secretadas, tais como resinas e

compostos volteis, ou substncias que so exudadas por ferimentos, como

materiais lipoflicos em folhas e gemas foliares, alm de mucilagem, gomas, ltex

etc. (Bankova, 2005). Desse modo, a composio da prpolis ir depender da

planta da qual o material foi coletado e, portanto, da localizao geogrfica da

colmia, pois as plantas disponveis para as abelhas sero diferentes dependendo

do local onde a colmia est localizada.

2

11..11.. EEllaabboorraaoo ee uussoo ddaa pprrppoolliiss ppeellaass aabbeellhhaass

As abelhas fragmentam os pices vegetativos das plantas (gemas,

primrdios foliares e folhas jovens) com as mandbulas, coletando as resinas

liberadas. Com o primeiro par de pernas, transferem a massa de resina para as

pernas medianas e ento para a corbcula (parte posterior da tbia), nas pernas

posteriores. O tempo gasto do incio do processo de coleta at o depsito da massa

de resina na corbcula, leva em mdia 7 minutos. A freqncia de visita varia

dependendo de diversos fatores, dentre eles a necessidade da colmia por prpolis

(Teixeira et al., 2005).

As abelhas utilizam a prpolis para diversos fins, entre eles, selar aberturas e

cobrir a entrada da colmia, impedindo dessa forma a entrada de microrganismos,

como fungos e bactrias. A prpolis contribui tambm para a manuteno da

temperatura interna da colmia por volta de 35C. As paredes das clulas

hexagonais dos ninhos contm uma mistura de cera de abelha e prpolis. Dessa

forma, a prpolis no s enrijesse a clula, mas mantm o ambiente interno

assptico. Quando as abelhas no conseguem transportar para fora os animais

invasores mortos, elas revestem sua carcaa com prpolis. Este processo se

assemelha a um embalsamento e impede a putrefao do material (Ghisalberti et

al., 1979).

11..22.. OOrriiggeemm bboottnniiccaa ee ccoommppoossiioo qquummiiccaa ddaa pprrppoolliiss

Diversos estudos foram realizados na tentativa de elucidar quais seriam as

plantas utilizadas como fonte de resinas para a elaborao da prpolis. Os

primeiros trabalhos envolvendo a anlise qumica de amostras de prpolis datam

3

dos anos 70, com Lavie, na Frana (Lavie, 1975 apud Bankova et al., 2000) e

Popravko, na Rssia (Popravko et al., 1980 apud Bankova et al., 2000). Estudos

envolvendo a anlise de amostras de prpolis de regies temperadas atravs de

CLAE (Cromatografia Lquida de Alta Eficincia) demonstraram que exudatos da

gema de Populus e seus hbridos so a origem botnica da prpolis em diversos

locais como Monglia (P. suaveolens), Albnia (P. nigra e P. canadensis), Bulgria,

Frana, Gr-Bretanha, Hungria, Espanha, Mxico (P. nigra) (Marcucci et al., 2001),

Amrica do Norte (P. fremontii), Reino Unido (P. euramericana) (Marcucci, 1995),

Norte da Argentina, sul do Brasil e Uruguai (P. alba) (Park et al., 2002; Park et al.,

2004; Isla et al., 2005). Na Turquia, a principal fonte tambm P. nigra, porm

foram descritas amostras com a composio qumica semelhante de P.

euphratica, espcie nunca descrita anteriormente como fonte de resinas para

elaborao da prpolis (Popova et al., 2005). Na Nova Zelndia, espcies de

Populus introduzidas so fonte de substncias presentes na prpolis (Markham et

al., 1996).

Em regies onde Populus no nativo, as abelhas retiram exudatos de

outras plantas para a fabricao da prpolis. Na Rssia, a principal fonte Betula

verrucosa (Popravko et al., 1980 apud Bankova et al., 2000), enquanto na Polnia,

substncias da prpolis so retiradas de Betula spp. e Alnus spp.; no Hava,

Plumeria acutifolia e P. acuminata so fontes de resinas (Marcucci, 1995) e na

Austrlia as abelhas utilizam Xantorrea spp. (Ghisalberti, 1979). Na Venezuela, as

abelhas coletam resinas de Clusia minor e C. major (Tomas-Barbern et al., 1993).

Em Cuba, a principal origem botnica C. nemorosa (Cuesta-Rubio et al., 1999).

4

No Brasil, as abelhas coletam substncias principalmente de Baccharis

dracunculifolia.

Em geral, amostras de prpolis de diferentes regies do mundo so

constitudas por 30% de ceras, 50% de resinas vegetais, 10% de leos volteis,

5% de plen e 5% de outras substncias, incluindo compostos orgnicos (Burdock,

1998), alm de microelementos (Walker & Crane, 1987).

A prpolis apresenta uma frao solvel em lcool, denominada blsamo da

prpolis e uma insolvel em lcool, ou frao de cera (Marcucci, 1995). Estudos

comparativos da cera da prpolis e dos ninhos das abelhas demonstraram como

principais constituintes steres, e hidrocarbonetos. No foram observadas

diferenas que permitissem distino entre as duas amostras de cera, o que sugere

uma fonte comum para ambas. O contedo total de cera nos ninhos varia de 1,5 a

3% e na prpolis de 4,8 a 19,3%; o contedo de hidrocarbonetos varia de 15,5 a

25,2% nos ninhos e de 6,4 a 33,3% na prpolis, enquanto o teor de steres de

67,4 a 75,8% nos ninhos e 49,2 a 77,1% na prpolis (Negri et al., 2000).

Entre as amostras de prpolis parece haver uma variao gradual na

proporo de substncias derivadas da via do mevalonato (terpenides, incluindo

sesqui, di e triterpenos) e os tpicos derivados da via do chiquimato (substncias

fenlicas, preniladas ou no) (Salatino et al., 2005). At o momento, mais de 300

substncias j foram descritas como constituintes da prpolis (Walker & Crane,

1987; Marcucci, 1995; Bankova et al., 2000; Pereira et al., 2003). A maioria das

substncias identificadas constitutiva da prpolis europia e grande parte delas

pertence ao grupo dos flavonides (flavonas, flavonis e flavanonas) (Kujumgiev et

al., 1999; Simes et al., 2004).

5

Apesar da atividade de algumas substncias isoladas j ter sido comprovada,

em alguns casos no possvel atribuir uma atividade para uma substncia

especfica (Kujumgiev et al., 1999), sendo muitas vezes feito o uso de extratos, o

que leva necessidade de haver uma padronizao entre amostras de prpolis.

Nesse sentido, alguns trabalhos foram realizados na tentativa de se aproximar de

uma padronizao ou controle de qualidade em amostras de prpolis. Woisky e

Salatino (1998) realizaram um trabalho com o objetivo de determinar o perfil

qumico de amostras de prpolis de diversas regies do Brasil. Foi quantificado o

teor de fenis totais, flavonides, substncias volteis, ceras, cinzas e resduos

secos livres de compostos volteis, sendo estes fatores considerados determinantes

para um controle de qualidade. Park e colaboradores (2000) realizaram um

trabalho com diversas amostras de prpolis brasileiras e, de acordo com a origem

botnica e composio qumica, reconhecem 12 grupos de prpolis brasileiras. Ao

trabalhar com material padronizado, os cientistas poderiam associar um tipo

qumico de prpolis a um tipo especfico de atividade biolgica.

11..33.. OOrriiggeemm bboottnniiccaa ee ccoommppoossiioo qquummiiccaa ddaa pprrppoolliiss bbrraassiilleeiirraa

No Brasil a principal fonte de resinas para a elaborao da prpolis verde (a

prpolis mais comercializada no pas e para exportao) Baccharis dracunculifolia.

Essa colorao verde caracterstica devida clorofila existente nos tecidos jovens

(gemas vegetativas) e folhas no-expandidas coletadas pelas abelhas. Essas folhas

jovens contm tricomas secretores, provavelmente com leos volteis e aromticos

(Salatino et al., 2005).

6

Baccharis dracunculifolia, conhecida popularmente como alecrim-do-campo,

devido sua semelhana morfolgica com o alecrim europeu, uma Asteraceae

arbustiva com cerca de 2-3 m de altura. Ocorre na Amrica do Sul, do sudeste ao

sul do Brasil, Argentina, Uruguai, Paraguai e Bolvia. Possui caractersticas de

plantas invasoras, produzindo um grande nmero de frutos e alta capacidade de

crescimento natural, alm de se desenvolver em reas que sofreram impacto

humano (Gomes et al., 2002).

Alm de B. dracunculifolia, outras espcies vegetais j foram descritas como

fonte de resinas para a elaborao de prpolis no Brasil. Em Alagoas Dalbergia

ecastophyllum (Fabaceae) a origem botnica de um tipo de prpolis conhecido

como prpolis vermelha (Silva et al., 2007). Na Bahia, a origem botnica da

prpolis marrom Hyptis divaricata (Lamiaceae), enquanto na regio Sul, as

resinas so retiradas de Populus alba (Salicaceae) (Park et al.,2002).

Park e colaboradores (2000), numa tentativa de classificar as amostras de

prpolis brasileiras de acordo com a origem botnica e composio qumica,

reconhecem 12 grupos diferentes de amostras, classificadas de acordo com suas

caractersticas fsico-qumicas. Essa classificao em 12 tipos porm ainda

subestimada, uma vez que as abelhas podem coletar resinas numa grande

variedade de plantas, dada a imensa diversidade da flora brasileira.

Dentre os componentes principais da prpolis verde brasileira, podem-se

citar os fenilpropanides prenilados, que so cidos fenlicos contendo um grupo

prenila. So substncias formadas a partir do cido cinmico e seus derivados

(cidos -cumrico, cafico, ferlico e sinpico), como a artepilina C (cido 3,5-

diprenil-4-hidroxicinmico), substncia caracterstica da prpolis verde (Figura 1)

7

(Aga et al., 1994; Loayza et al., 1995; Tazawa et al., 1998; Tazawa et al., 1999;

Marcucci et al., 2001; Kumazawa et al., 2003; Negri et al., 2003a; Negri et al.,

2003b; Park et al., 2004; Salatino et al., 2005; Teixeira et al., 2005). Na prpolis

vermelha, os constituintes principais so benzofenonas preniladas (Trusheva et al.,

2006).

O OH O OH

OH

O OH

OH

OH

O OH

OH

OMe

O OH

OH

OMeMeO

O OH

OH

Figura 1 Frmula estrutural de alguns fenilpropanides, classe de substncias mais

abundantes nas prpolis verde brasileiras.

cido cinmico

cido -cumrico cido cafico

cido ferlico cido sinpico

artepilina C

8

Os flavonides, mesmo no sendo um dos principais constituintes, esto

presentes esto presentes nas prpolis brasileira. Quercetina, campferida,

isosacuretina, pinocembrina, crisina, naringenina, campferol e galangina so seus

principais representantes (Tazawa et al., 1998; Tazawa et al., 1999; Park et al.,

2002; Park et al., 2004). Esto presentes tambm na prpolis verde terpenides e

seus derivados, alm de derivados do cido benzico.

11..44.. AAttiivviiddaaddeess bbiioollggiiccaass ee ffaarrmmaaccoollggiiccaass aattrriibbuuddaass pprrppoolliiss

O comportamento de microrganismos frente s aes antibiticas da prpolis

tem sido amplamente investigado. Estudos sobre a atividade antibacteriana de

amostras de prpolis de diferentes regies demonstraram que o crescimento de

bactrias gram-positivas (Staphylococcus aureus) inibido por baixas

concentraes de prpolis, enquanto bactrias gram-negativas (Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa) so menos suscetveis (Kujumgiev et al., 1999; Sforcin

et al., 2000; Prytzyk et al. 2003; Popova et al., 2005; Silici et al. 2005). Extratos

etanlicos de amostras de prpolis do Brasil e da Bulgria mostraram-se ativos

contra Neisseria meningitidis e Streptococcus pneumoniae (Salomo et al., 2004).

O cido 3,5-diprenil-4-hidroxicinmico (Artepilina C) um dos principais compostos

antimicrobianos da prpolis brasileira (Aga et al., 1994).

A atividade antifngica da prpolis em baixas concentraes tambm foi

verificada contra Candida albicans (Kujumgiev et al., 1999; Sforcin et al., 2001;

Prytzyk et al., 2003; Salomo et al., 2004), C. tropicalis (Sforcin et al., 2001),

dezesseis linhagens de Actinobacillus actinomiycetecomitans (Santos et al., 2003),

Sporothrix schenckii e Paracoccidioides brasiliensis (Salomo et al., 2004).

9

A atividade antiviral foi demonstrada contra o vrus da gripe aviria

(Kujumgiev et al., 1999), vrus da herpes simples tipo 1 (HSV-I) (Amoros et al.,

1992a), poliovrus (Amoros et al., 1992b), vrus influenza A e B e vaccnia vrus

(Marcucci, 1995).

Alm dessas atividades principais apresentadas pela prpolis, muitas outras

esto descritas, como por exemplo, antiinflamatria (Krol et al., 1996);

antiprotozoa, principalmente contra Trypanosoma cruzi in vitro e in vivo (Higashi e

de Castro, 1994; de Castro e Higashi, 1995; Marcucci et al., 2001; Prytzyk et al.,

2003; Dantas et al., 2006); atividade hepatoprotetora (Banskota et al., 2000);

regenerao de tecido cartilaginoso, tecido sseo e da polpa dental; propriedade

anestsica; ao imunomodulatria; anti-lcera; anticries em ratos; proteo

contra radiao gama em camundongos, anti-leishmaniose em hamsters; entre

outras (Marcucci, 1995).

11..55.. AAttiivviiddaaddee aannttiiooxxiiddaannttee

Espcies reativas de oxignio (EROs) so formadas nas clulas, como

conseqncia de reaes bioqumicas oxidativas. Esses radicais desempenham

papis importantes no organismo, atuando na produo de energia, fagocitose,

regulao do crescimento celular e sinalizao intercelular, e na sntese de

compostos biologicamente importantes (Pietta, 2000). No entanto, EROs podem ser

danosas se sua produo for excessiva sob condies anormais (inflamao, fatores

externos), causando danos em membranas lipdicas, inativao de enzimas e

protenas e danos no DNA (Pietta, 2000). Esses danos podem estar relacionados na

etiologia de diversas doenas humanas, como envelhecimento precoce, doenas

10

cardacas, inflamao, doenas neurodegenerativas (Parkinson e Alzheimer) e

cncer (Pietta, 2000; Russo et al., 2002). O organismo humano possui substncias

antioxidantes endgenas (ex. Se-glutationa peroxidase, catalase, e superxido

dismutase), porm quando estas no so capazes de conter a produo excessiva

de EROs, o uso de antioxidantes exgenos atravs da dieta se faz necessrio

(Pietta, 2000).

A atividade antioxidante da prpolis foi verificada em amostras de diversas

localidades, atravs de metodologias diversas. Extratos de prpolis do Brasil, China,

Peru, Holanda, Coria, Austrlia, Bulgria, Chile, Ucrnia e Argentina,

demonstraram possuir significativa atividade varredora de radicais livres DPPH

(Banskota et al., 2000; Ahn et al., 2004; Kumazawa et al., 2004; Isla et al., 2005).

Tambm foi verificada a capacidade de proteo de substratos lipdicos da

oxidao, avaliada pelo mtodo do descoramento do -caroteno (Kumazawa et al.,

2004).

Russo et al. (2002) avaliaram a capacidade antiperoxidativa de extratos de

prpolis e de seus compostos ativos (CAPE, do ingls caffeic acid phenethyl ester, e

galangina). Demonstraram que os extratos possuam efeito protetor contra a

peroxidao e uma potente capacidade de varrer radicais hidroxila.

Estudos com amostras brasileiras demonstraram a capacidade de substncias

presentes em extratos de prpolis em modular a produo de espcies reativas de

oxignio por neutrfilos estimulados in vitro, indicando que a ao destas

substncias no se restringe ao varredora de radicais livres (Simes et al.,

2004).

11

Estudos envolvendo induo de isquemia cerebral em coelhos demonstraram

que a administrao subaguda de CAPE desempenha um papel neuroprotetor

contra isquemia cerebral, devido atenuao da peroxidao de lipdeos e suas

propriedades antioxidantes (Altug et al., 2008).

11..66.. AAttiivviiddaaddee cciittoottxxiiccaa

A busca por substncias com atividade anticancergena sempre foi umas das

prioridades da qumica medicinal e um grande nmero de abordagens diferentes

vem sendo utilizado nessa busca. No entanto, a descoberta de substncias

antitumorais seletivas permanece um objetivo elusivo na pesquisa do cncer.

Conseqentemente, novas abordagens so necessrias para uma busca eficiente de

candidatos a serem testados como drogas anticancergenas (Pisco et al., 2006).

Estudos a cerca da atividade antitumoral de extratos e substncias isoladas

da prpolis vm crescendo muito nos ltimos anos, mostrando que diversas

linhagens de clulas tumorais so sensveis prpolis.

No estudo de Orsolic et al. (2004) investigou-se o efeito da prpolis, e de

substncias polifenlicas isoladas dela, no crescimento e potencial metstico de um

carcinoma mamrio transplantvel de um camundongo CBA. Nesses camundongos

foram geradas metstases no pulmo, e os componentes testados diminuram

significantemente o nmero desses ndulos tumorais.

Duas substncias isoladas da prpolis brasileira, drupanina e baccharina,

derivados prenilados do cido cinmico, mostraram efeitos antitumorais in vivo em

camundongos com fibrosarcoma murino S-180. Os camundongos que receberam

administrao oral dessas substncias apresentaram diminuio na formao dos

12

tumores. Esta atividade est relacionada com a morte celular das clulas tumorais,

sendo que a citotoxicidade mostrou-se preferencial para as clulas tumorais, no

afetando as clulas normais do fgado (Mishima et al., 2005a).

Watanabe e colaboradores (2004) demonstraram que o CAPE, conhecido por

inibir o NFkB, induz a morte celular por apoptose em clulas de cncer de mama

MCF-7, pela ativao de receptores Fas (mediador inicial da sinalizao da morte

celular); O CAPE tambm demonstrou induzir a apoptose mediada pela

mitocndria, em clulas tumorais U937 de leucemia mielide humana (Jin et al.,

2008)

13

22.. OOBBJJEETTIIVVOOSS

O presente trabalho teve como objetivos principais a caracterizao qumica,

por meio do doseamento de fenis, ceras e flavonides, de seis amostras de

prpolis verde, provenientes de Minas Gerais e do Paran, e a identificao de

algumas substncias presentes nas amostras por GC/EM e CLAE/EM. Alm disso,

foram testados os extratos brutos metanlicos e as fraes hexnicas,

clorofrmicas, metanlicas e de acetato de etila das amostras, quanto atividade

citotxica em embries de ourio-do-mar, e quanto atividade antioxidante. A fim

de se verificar possveis relaes entre os teores de fenis totais, os de flavonas e

flavonis totais, e os teores de ceras entre si e tambm com a atividade

antioxidante das amostras, foram realizados testes de correlao linear. A fim de se

avaliar possveis substncias que apresentavam atividade antioxidante, foi testado

o poder antioxidante de uma das amostras estudadas por meio de cromatografia

em camada delgada, seguida de anlises por cromatografia a gs e cromatografia

lquida de alta eficincia.

14

33.. MMAATTEERRIIAALL EE MMTTOODDOOSS

33..11.. AAmmoossttrraass ddee pprrppoolliiss

No presente trabalho foram estudadas seis amostras de prpolis verde,

sendo quatro delas provenientes de Minas Gerais (amostras A, B, C e D) e duas do

Paran (amostras E e F). As amostras de Minas Gerais foram gentilmente cedidas

pela Cia da Abelha. As amostras do Paran foram fornecidas pela Breyer e Cia Ltda

(Tabela 1).

Tabela 1 Amostras de prpolis verde e

localizao geogrfica.

Amostra* Localidade

A Trs Pontas/MG

B Esmeralda/MG

C Esmeralda/MG

D Esmeralda/MG

E Unio da Vitria/PR

F Unio da Vitria/PR

*A, B, C e D - Cia da Abelha Ltda Contagem, MG; Amostras E e F Breyer e Cia Ltda Unio da Vitria, PR.

33..22.. MMaassssaa sseeccaa

Para a obteno da massa seca, pesou-se exatamente 1 g de cada amostra,

previamente pulverizada, e esta foi mantida em estufa a 80C, at que fosse

atingido peso constante.

15

33..33.. PPrreeppaarraaoo ddooss eexxttrraattooss mmeettaannlliiccooss

Os extratos das amostras de prpolis verde foram preparados partindo-se de

2,5 g das amostras previamente pulverizadas com nitrognio lquido, at a

obteno de um p fino. Estes foram ento tratados com metanol em extrator

soxhlet por 5 hs. O volume final foi ajustado para 250 mL em balo volumtrico, e

estes extratos foram utilizados nos ensaios qumicos para determinao dos fenis,

flavonas e flavonis e flavanonas e isoflavonas totais, e tambm para os testes de

atividade antioxidante e citotxica das amostras.

33..44.. EExxttrraaoo ffrraacciioonnaaddaa

Exatamente 5 g de prpolis bruta previamente pulverizadas foram

submetidas a quatro extraes sucessivas em extrator Soxhlet, com solventes de

polaridade crescente. Primeiramente, foram tratadas com 200 mL de hexano, sendo

em seguida tratadas, consecutivamente, com 200 mL de clorofrmio, 200 mL de

acetato de etila e 200 mL de metanol. Aps cada tratamento, secava-se a amostra,

a fim de que ela fosse submetida ao tratamento seguinte. Os extratos obtidos

foram concentrados sob presso reduzida e ressuspendidos em volume e solvente

apropriados para anlises posteriores.

33..55.. DDeetteerrmmiinnaaoo ddoo tteeoorr ddee ffeenniiss ttoottaaiiss

A determinao da concentrao de fenis totais nas amostras foi feita com

base em uma curva de calibrao, preparada a partir de uma soluo padro de

cido p-cumrico 100 g/mL.

16

Cada volume da soluo padro (0, 10, 20, 30-...-100 L) foi transferido

para um tubo de microcentrfuga, contendo 1 mL de gua destilada, ao qual foram

adicionados 160 L do reagente Folin-Ciocalteau e 240 L de soluo saturada de

carbonato de sdio, sendo o volume final completado com gua destilada para 2

mL. Aps duas horas foi feita a leitura em espectrofotmetro UV-visvel a 760 nm.

Para os ensaios com os extratos das amostras, 4 L de cada extrato

metanlico bruto a 10 mg/mL foi transferido para um tubo de microcentrfuga,

contendo 1 mL de gua destilada. Em seguida, foram realizados os mesmos passos

utilizados para a construo da curva de calibrao (Woisky & Salatino, 1998).

33..66.. DDeetteerrmmiinnaaoo ddoo tteeoorr ddee ffllaavvoonnaass ee ffllaavvoonniiss

O procedimento descrito a seguir segue a adaptao de Woisky & Salatino

(1998) do mtodo da German Pharmacopoeia (Deutches Arzneibuch, 1978) e

determina a concentrao de flavonas e flavonis nas amostras. Foi utilizada para

isso, uma curva de calibrao de quercetina, preparada a partir de uma soluo

padro de 20 g/mL.

Alquotas de soluo padro foram transferidas para tubos de microcentrfuga

(0, 200, 400, 600, ...., 1600 L), ao qual foram adicionados 400 L de soluo

metanlica de cloreto de alumnio 5%, e o volume completado com metanol para 2

mL. A seguir a absorbncia foi lida em espectrofotmetro UV-visvel a 420 nm.

Para a determinao do teor de flavonas e flavonis totais, foi utilizada uma

alquota de 32 L do extrato metanlico bruto a 10 mg/mL sendo em seguida,

realizados os mesmos passos utilizados na construo da curva padro.

17

33..77.. DDeetteerrmmiinnaaoo ddoo tteeoorr ddee ffllaavvaannoonnaass ee iissooffllaavvoonnaass

O procedimento a seguir segue o mtodo descrito por Nagy & Grancai

(1996), com pequenas modificaes. A determinao da concentrao dessas

substncias nas amostras foi feita com base em uma curva de calibrao de

pinocembrina, preparada a partir de uma soluo padro de 1 mg/mL, dissolvida

em isopropanol. Para o preparo da curva de calibrao, 200 L da soluo de

pinocembrina foram transferidos para um tubo de microcentrfuga, ao qual foi

acrescentado 400 L de soluo do reagente dinitrofenil-hidrazina (0,1g de DNP

seco previamente a 60 C por 3 horas, dissolvido em 200 L de cido sulfrico

96%, e completando-se o volume para 10 mL com metanol). Esta mistura foi

mantida a 50 C em banho-maria, por 50 min. Aps esfriar, foram adicionados 1,4

mL de KOH (100 mg/mL), completando o volume para 2 mL. Desta soluo foram

transferidas alquotas de 40, 80, 120...320 L para novos tubos, adicionando-se

metanol suficiente para completar 2 mL. Esta mistura foi ento centrifugada a 3000

rpm por 5 min, e a absorbncia do sobrenadante lida a 486 nm.

Para determinao do teor de flavanonas e isoflavonas das amostras, 200 L

do extrato metanlico das amostras a 10 mg/mL foram tratados com 400 L do

reagente DNP. Esta mistura foi mantida a 50 C por 50 min. Aps esfriar,

acrescentou-se 1,4 mL de soluo de KOH (100 mg/mL). Uma alquota de 143 L

da soluo acima foi transferida para um novo tubo, adicionando-se metanol

suficiente para completar 2 mL. Esta mistura foi ento centrifugada a 3000 rpm por

5 min, e a absorbncia do sobrenadante lida a 486 nm.

18

33..88.. DDeetteerrmmiinnaaoo ddoo tteeoorr ddee cceerraass

Pores de 3g de cada amostra previamente pulverizadas foram submetidas

extrao exaustiva com clorofrmio em extrator Soxhlet, durante 6 horas. Em

seguida, os extratos foram concentrados sob presso reduzida, e 120 mL de

metanol quente foi adicionado ao resduo. A mistura foi mantida em ebulio at

que fossem separadas duas fases: uma soluo clara na poro superior e pequena

quantidade de resduo oleoso na poro inferior. A fase metanlica superior foi

filtrada a quente atravs de papel de filtro Whatman no 1 para um frasco de 150

mL, previamente pesado, evitando a passagem do resduo oleoso. O filtrado foi

ento resfriado a 0oC, e o contedo novamente filtrado atravs de papel de filtro

Whatman no 1 previamente pesado. O frasco e o resduo foram lavados com 25 mL

de metanol frio. Aps secagem em capela, o frasco e o resduo no papel de filtro

foram transferidos ao dessecador at que atingissem peso constante (Woisky &

Salatino, 1998).

33..99.. IIddeennttiiffiiccaaoo ddaass ssuubbssttnncciiaass pprreesseenntteess nnaass aammoossttrraass

As anlises qualitativas das substncias que compem as amostras de

prpolis foram feitas utilizando-se cromatografia a gs acoplada espectrometria

de massas (CG/EM) e cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a

espectrometria de massas (CLAE/EM). As anlises que necessitaram espectrometria

de massas foram realizadas na Central Analtica do Instituto de Qumica USP.

Os perfis cromatogrficos das fraes clorofrmicas (metiladas ou no) e de

hexano foram obtidos por cromatografia gasosa. Um volume de 1 L das fraes

ressuspendidas em metanol foi injetado no cromatgrafo a gs 5890 Series II Plus,

19

operando no modo split, sendo o split ajustado de acordo com a concentrao de

cada amostra. Foi utilizada uma coluna Zebron ZB 5-HT (30 m X 0,32 mm) a 100

C, tendo como gs de arraste o Hlio em fluxo de 1 mL/min. O mtodo utilizado

consistiu numa rampa de aquecimento de 8 C/min, com temperatura inicial de 100

C e temperatura final de 300 C, permanecendo por 10 min a 300 C ao trmino

do aquecimento; a temperatura do injetor e do detector foi ajustada para 300 C

(Negri et al., 2003a).

Para obteno do perfil cromatogrfico das fraes metanlicas e de acetado

de etila, 21,7 L das amostras foram injetados em cromatgrafo lquido de alta

eficincia HP 1090 series II, com detector de arranjos de fotodiodos e uma coluna

de fase reversa Zorbax C18 (4,6 X 250 mm). A fase mvel utilizada foi cido

actico 0,1% (solvente A) e metanol (solvente B), com fluxo constante de 0,5

mL/min e a leitura foi feita a 270 nm. O gradiente iniciou com 10% do solvente B

por 7 min, 10 a 35% de B de 7 a 12 min, 35 a 38% de B de 12 a 27 min, 38% de B

de 27 a 35 min, 38 a 50% de B de 35 a 50 min e 50 a 100% de B de 50 a 100 min.

Posteriormente as fraes foram enviadas Central Analtica do Instituto de

Qumica da Universidade de So Paulo, sendo submetidas a CLAE/EM (fraes de

metanol e acetato de etila) e CG/EM (fraes de clorofrmio e hexano), para

identificao dos constituintes presentes nas amostras.

33..1100.. DDeerriivvaaoo ddaass ffrraaeess ddee cclloorrooffrrmmiioo

Para a metilao das fraes de clorofrmio, 30 L das amostras foram

adicionados a 4 mL de soluo de H2SO4 5% (em metanol) e 2 mL de tolueno. A

mistura foi mantida aquecida a 80 oC por 4hs. Em seguida, acrescentou-se 4 mL de

20

soluo de NaCl 0,5 M e 1 mL de cloreto de metileno, misturando vigorosamente

em vrtex. A mistura foi ento centrifugada a 5000 rpm por 5 min, transferindo-se

a fase orgnica inferior para um novo tubo. O cloreto de metileno foi adicionado ao

primeiro tubo por mais duas vezes, centrifugando-se e transferindo-se a fase

orgnica para o tubo novo. Posteriormente, esses extratos de cloreto de metileno

foram lavados com 2 mL de NaCl 0,5 M, misturando-se vigorosamente em vrtex e

centrifugando a 5000 rpm por 5 min. A fase superior aquosa foi descartada, e a

lavagem repetida por trs vezes. Adicionou-se ao extrato sulfato de sdio anidro,

permanecendo em repouso por 1h. A seguir o extrato foi filtrado para um novo

frasco, e seco sob fluxo de nitrognio.

33..1111.. TTeesstteess ddee aattiivviiddaaddee aannttiiooxxiiddaannttee

33..1111..11.. MMttooddoo ddee sseeqqeessttrroo ddee rraaddiiccaaiiss lliivvrreess DDPPPPHH

No presente mtodo, foi avaliada a capacidade das substncias presentes nas

amostras em seqestrar o radical livre 1,1-difenil-2-picril-hidrasila (DPPH, Sigma).

Foi preparada uma soluo metanlica do radical livre DPPH em concentrao

aproximada de 20 g/mL, de modo que o controle (800 L da soluo de DPPH +

400 L de metanol) apresentasse sua absorbncia entre 0,7 e 0,8 a 517 nm.

Para os testes de atividade antioxidante das amostras de prpolis, 400 L

dos extratos metanlicos das amostras nas concentraes de 8, 12,5 e 25 g/mL,

foram transferidos para tubos de microcentrfuga. Em seguida, com dois minutos de

intervalo entre cada amostra, foram adicionados 800 L da soluo de DPPH. Aps

a adio do DPPH, as amostras foram agitadas e mantidas no escuro por 20 min.

Aps este tempo, foi feita a leitura da absorbncia em espectrofotmetro UV-visvel

21

a 517 nm. Como branco foram utilizados 400 L da amostra em cada uma das

concentraes, adicionados a 800 L de metanol. Como substncia de referncia,

foi utilizado o cido sinpico, nas mesmas concentraes das amostras. A

porcentagem de atividade antioxidante (%AAox) das amostras foi avaliada de

acordo com a equao abaixo (Nieva-Moreno et al., 2000; Duarte-Almeida et al.,

2006):

% Aaox =

Na qual, Abs C = absorbncia do controle; Abs Am = absorbncia da amostra;

Abs B = absorbncia do branco.

Para testar a atividade antioxidante das fraes das amostras (hexano,

clorofrmio, acetado de etila e metanol), 400 L dos extratos fracionados

ressuspendidos em metanol (25 g/mL) foram transferidos para tubos de

microcentrfuga, e em seguida foram realizados os mesmos passos utilizados nos

extratos brutos metanlicos.

O cido sinpico foi utilizado como substncia de referncia por ser um

fenilpropanide, classe de substncia principal dentre os componentes da prpolis

verde brasileira, com propriedades antioxidantes (Hayashi et al., 1999).

33..1111..22.. SSiisstteemmaa --ccaarrootteennoo//cciiddoo lliinnoolliiccoo

A avaliao da capacidade antioxidante das amostras no sistema -

caroteno/cido linolico seguiu o mtodo utilizado por Duarte-Almeida et al.,

(2006), com pequenas modificaes. Para o preparo da soluo reativa, uma

alquota de 500 L de uma soluo de -caroteno em clorofrmio (0,2 mg/mL) foi

Abs C (Abs Am Abs B) AbsC

X 100

22

misturada com 12,5 L de cido linolico e 100 L de Tween 40. Em seguida o

clorofrmio foi evaporado at secagem completa, sob nitrognio. Aps a retirada do

clorofrmio, foram adicionados aproximadamente 12,5 mL de gua destilada,

saturada de oxignio. A absorbncia da soluo foi ento ajustada com gua, de

modo que a absorbncia do controle (1 mL da soluo reativa, adicionado de 20 L

de metanol.) apresentasse um valor entre 0,8 e 0,9 a 470 nm.

Para a reao de oxidao foram utilizadas cubetas plsticas, s quais foram

adicionados 1 mL de soluo reativa e 120 L dos extratos de prpolis nas

seguintes concentraes: 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL e 1 mg/mL. A

reao foi mantida em temperatura ambiente por 2 h, tendo a absorbncia medida

a 470 nm a cada 30 min, incluindo o tempo inicial, at o final das 2 h. Foi utilizado

como branco 120 L de cada concentrao de amostra, adicionados de 1 mL de

metanol; como substncia de referncia foi utilizado o cido sinpico, nas mesmas

concentraes da amostra. Os resultados foram expressos como porcentagem de

inibio (%I), comparando-se a queda da absorbncia nas amostras (Am=

absorbncia final absorbncia inicial), com a queda da absorbncia no controle

(Ac = absorbncia final absorbncia inicial), segundo a equao abaixo:

% I = (Ac Am) x 100 x Ac-1

Nos testes de atividade antioxidante das fraes das amostras (hexano,

clorofrmio, acetado de etila e metanol), 120 L dos extratos fracionados

ressuspendidos em metanol (1 mg/mL) foram transferidos para cubetas

23

plsticas, sendo em seguida realizados os mesmos passos utilizados nos

extratos brutos metanlicos.

33..1111..33.. AAttiivviiddaaddee aannttiiooxxiiddaannttee ppoorr ccrroommaattooggrraaffiiaa eemm ccaammaaddaa

ddeellggaaddaa

As anlises por cromatografia em camada delgada seguiram o mtodo

descrito por Jasprica et al. (2007), com pequenas modificaes. Foram utilizadas

placas cromatogrficas de 20 X 10 cm, recobertas com slica gel. A aplicao da

amostra foi feita em faixas de 15 cm, tendo como controle positivo o cido sinpico

na concentrao de 30 g/mL. As placas foram desenvolvidas com fases mveis

diferentes para cada uma das fraes, aps testes preliminares, tendo sido utilizada

a fase mvel que melhor separou as faixas: para as fraces de hexano e acetato de

etila: tolueno clorofrmio - acetona (40:25:35) (Nieva-Moreno et al.,2000); para

as fraes clorofrmicas: hexano - acetato de etila cido actico (31:14:5)

(Jasprica et al, 2004); para as fraes metanlicas: acetato de etila acetona -

cido actico - gua (60:20:10:10) (Birk et al., 2005). Aps o desenvolvimento da

cromatografia, uma pequena parte das placas foi nebulizada com DPPH 0,3 mM, e

mantidas por 30 segundos em temperatura ambiente. As faixas contendo

substncias antioxidantes foram visualizadas como uma mancha amarela no fundo

violeta, devido transformao do radical DPPH violeta na forma reduzida amarela.

As pores das faixas que no foram nebulizadas com o DPPH foram ento isoladas,

e submetidas cromatografia lquida de alta eficincia e cromatografia a gs, para

identificao destas substncias.

24

33..1122.. EEnnssaaiioo ddee cciittoottooxxiicciiddaaddee eemm eemmbbrriieess ddee oouurriioo ddoo mmaarr

Os ensaios de citotoxicidade foram realizados no Centro de Biologia Marinha da

Universidade de So Paulo (Cebimar), com a colaborao do Prof. Dr. Jos Carlos

de Freitas, do Departamento de Fisiologia do Instituto de Biocincias da

Universidade de So Paulo.

A atividade antimittica foi avaliada como a habilidade dos extratos em inibir

a clivagem dos ovos de ourio do mar Lytechinus variegatus, coletados em Ilhabela,

So Sebastio, So Paulo, por tcnicos do Cebimar. A eliminao dos gametas foi

induzida pela injeo de KCl 0,5 M na cavidade perivisceral dos ourios. Os gametas

foram recolhidos em recipientes de vidro, contendo gua do mar filtrada. Os vulos

foram lavados duas vezes em gua do mar filtrada, para a remoo da cobertura

gelatinosa envolvendo as clulas. Os espermatozides foram mantidos em

refrigerador sem diluio at o momento do uso. Os ensaios foram realizados em

placas de 12 poos (CorningTM) e consistiu em misturar 1 mL da suspenso de

vulos com 20 L da suspenso de espermatozides (0,1 mL de espermatozides +

4,9 mL de gua do mar filtrada). Dois minutos aps a fertilizao foram adicionados

10 L dos extratos nas concentraes finais de 8, 16 e 32 g/mL, diludos em

etanol, sendo em seguida adicionada gua do mar filtrada, completando um volume

final de 2 mL. Como controle, foi realizado um ensaio utilizando 10 L de etanol em

lugar das amostras. As placas foram mantidas em temperatura ambiente (26 2

C). Em intervalo apropriado, quando a maioria dos embries apresentava-se na

segunda e terceira clivagens (quatro e oito clulas), alquotas de 500 L foram

fixadas no mesmo volume de formaldedo 4%, para observao posterior. Cem

ovos ou embries foram contados em triplicata para cada concentrao de extrato,

25

a fim de determinar o nmero de embries com desenvolvimento normal (Costa et

al., 1996).

33..1133.. AAnnlliisseess eessttaattssttiiccaass

Para verificar se os valores obtidos nos diferentes ensaios estatisticamente

diferente entre as amostra estudadas (cada triplicada foi considerada um grupo),

foi realizado o teste estatstico ANOVA (ANalysis Of VAriance) one-way,

considerando como significativos valores de P< 0,05. Alm disso, foi realizado o

ps-teste de comparao mltipla de Tukey, que comparou pares de amostras

individualmente, verificando se os valores obtidos eram estatisticamente diferentes

entre si.

Possveis relaes entre os resultados obtidos nos diferentes ensaios foram

testadas atravs de correlao linear (mtodo dos mnimos quadrados),

considerando como significativas as correlaes com R > 0,5. Para ambos os

testes foi utilizado o Software Prism 4.0.

Todos os ensaios foram realizados em triplicatas, a fim de minimizar o erro

do mtodo, e os resultados esto expressos na forma de mdias desvio padro.

As triplicatas com valores muito discrepantes das demais foram desconsideradas

das anlises.

Os dados referentes composio qumica e atividades biolgicas foram

submetidos tambm a uma anlise de componente principal (PCA) com o software

Fitopac v1 (Shepherd, 1996), a fim de avaliar as correlaes entre as amostras

provenientes de Minas Gerias e Paran. A fim de se avaliar qualitativamente as

amostras quanto s substncias identificadas, os dados obtidos foram submetidos

26

anlise de coordenadas principais (PCO) atravs do mesmo software utilizado

anteriormente.

27

44.. RREESSUULLTTAADDOOSS

44..11.. MMaassssaa sseeccaa

A massa seca das amostras de prpolis verde analisadas apresentou valores

entre 84 e 90% (Tabela 2), indicando que a quantidade de umidade presente nas

amostras variou de 10 a 16%.

Tabela 2 Massa seca das amostras de prpolis

verde.

Amostra* Massa Seca (%)

A 86

B 89

C 86

D 90

E 84

F 84

* A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas Gerais; E e F

prpolis provenientes do Paran.

44..22.. TTeeoorr ddee ffeenniiss ttoottaaiiss

A curva padro de cido p-cumrico obtida, bem como sua equao da reta e

coeficiente de determinao (R2), esto representados na Figura 2.

28

Figura 2 Curva padro obtida a partir do cido p-cumrico, para

determinao dos teores de fenis totais de amostras brasileiras de

prpolis verde.

Com relao ao teor de fenis totais, foram obtidos valores variando de

132,69 0,26 mg/g (13,27 %, amostra F) a 187,57 7,17 mg/g (18,76 %,

amostra B) (Tabela 3).

Tabela 3- Teores de fenis totais dos extratos metanlicos brutos de amostras de prpolis verde.

Fenis totais

Amostra* mg/g** %

A 166,63 9,62*** 16,66 0,96

B 187,57 7,17 18,76 0,72

C 155,3 3,98 15, 53 0,4

D 153,43 7,54 15,34 0,75

E 136,92 5,73 13,69 0,57

F 132,68 0,26 13,27 0,03

* = A a D amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran; ** = mg de fenis totais presentes em 1g de prpolis; resultados expressos em relao massa seca; *** = valores expressos como equivalente de cido p-cumrico; mdia desvio padro, n=3.

29

O teste estatstico ANOVA demonstrou que houve diferenas significativas

entre os teores de fenis totais das amostras (P= 0,0002; F= 12,5), o que permitiu

comparar os resultados obtidos. O ps-teste de Tukey demonstrou que a amostra B

(MG) estatisticamente diferente das demais amostras (P< 0,05).

44..33.. TTeeoorr ddee ffllaavvoonnaass ee ffllaavvoonniiss ttoottaaiiss

A curva padro de quercetina obtida bem como sua equao da reta e

coeficiente de determinao (R2), esto representados na Figura 3.

Figura 3 Curva padro obtida a partir da quercetina para determinao

dos teores de flavonas e flavonis de amostras de prpolis verdes

brasileiras.

30

As amostras apresentaram valores de flavonas e flavonis totais variando de

15,17 0,44 mg/g (1,52 %, amostra E) a 40,42 1,06 mg/g (4,04 %, amostra B)

(Tabela 4).

Tabela 4 Teores de flavonas e flavonis dos extratos

metanlicos brutos de amostras de prpolis verde.

Teor de flavonas e flavonis

Amostra* (mg/g)** (%)

A 33,71 2,73*** 3,37 0,27

B 40,21 1,06 4,02 0,11

C 34,98 2 3,5 0,2

D 31,5 1,66 3,15 0,17

E 15,17 0,42 1,52 0,04

F 18,34 1,12 1,83 0,11

* = A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran;

** = mg de flavonas e flavonis presentes em 1g de prpolis, resultados expressos em relao massa seca;

*** = valores expressos como equivalente de quercetina; mdia desvio padro, n=3.

O teste estatstico ANOVA demonstrou que os valores de flavonas e flavonis

totais das amostras analisadas so estatisticamente diferentes entre si (P <

0,0004; F= 11,5), o que permitiu a comparao dos resultados obtidos. O ps-teste

de Tukey demonstrou que as amostras de Minas Gerais, individualmente, so

estatisticamente diferentes das do Paran (P < 0,001).

31

44..44.. TTeeoorr ddee ffllaavvaannoonnaass ee iissooffllaavvoonnaass ttoottaaiiss

A curva padro de pinocembrina obtida, bem como sua equao da reta e

coeficiente de determinao (R2), esto representados na Figura 4.

Figura 4 Curva padro obtida a partir da pinocembrina para a

determinao dos teores de flavanonas e isoflavonas de amostras de

prpolis verdes brasileiras.

As anlises do teor de flavanonas e isoflavonas nas amostras de prpolis

mostraram resultados variando de 11,95 mg/g 0,57 (1,2%, amostra E) a 18,91

0,89 mg/g (1,9%, amostra B) (Tabela 5).

32

Tabela 5 Teores de flavanonas e isoflavonas dos extratos

metanlicos brutos de amostras de prpolis verde.

Flavonas e isoflavonas totais

Amostra* mg/g** %

A 16,05 1,55*** 1,61 0,16

B 18,91 0,89 1,89 0,09

C 13,91 1,21 1,39 0,12

D 15,54 1,1 1,55 0,11

E 11,95 0,57 1,19 0,06

F 15,23 0,93 1,52 0,09

* = A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran;

** = mg de flavonas e isoflavonas presentes em 1 g de prpolis, resultados expressos em relao massa seca;

*** = valores expressos como equivalente de pinocembrina; mdia desvio padro, n=3.

O teste estatstico ANOVA demonstrou que os valores de flavanonas e

isoflavonas totais das amostras analisadas so estatisticamente diferentes entre si

(P= 0,0001; F= 13,64), o que permitiu comparar os resultados obtidos. O ps-teste

de Tukey demonstrou que as amostras A, C e D (MG), individualmente, no so

estatisticamente diferentes da amostra F (PR) (P > 0,05), e as amostras C e D no

apresentam diferenas estatsticas da amostra E (P > 0,05).

44..55.. TTeeoorr ddee cceerraass ttoottaaiiss

O contedo de ceras totais nas amostras variou de 38,79 11,06 mg/g

(3,88 %, amostra A) a 104,6 5,7 mg/g (10,46 %, amostra F). A amostra A de

Minas Gerais apresentou um teor de ceras muito mais baixo do que das demais

amostras (Tabela 6).

33

Tabela 6 Teores de ceras totais de amostras de

prpolis verde.

Ceras totais

Amostra* mg/g** %

A 38,79 11,06** 3,88 1,11

B 49,573 0,76 4,96 0,08

C 99,8 11,25 9,98 1,13

D 73,62 7,51 7,36 0,75

E 88,49 5,88 8,85 0,59

F 104,6 5,7 10,47 0,57

* = A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran; **

=mg de ceras presentes em 1g de prpolis, resultados expressos em relao massa seca; *** = valores expressos como equivalente de cido sinpico; mdia desvio padro, n=3.

O teste estatstico ANOVA demonstrou que os valores de ceras totais das

amostras analisadas so estatisticamente diferentes entre si (P= 0,0007; F=

23,37), o que permitiu que os resultados obtidos fossem comparados. O ps-teste

de Tukey demonstrou que as amostras C e D (MG), individualmente, no so

estatisticamente diferentes das amostras E e F (PR) (P > 0,05). Entretanto, as

amostras A e B mostraram-se estatisticamente diferentes das demais (P < 0,05).

4.6 Teste de regresso linear

A fim de verificar possveis correlaes entre os diversos resultados obtidos,

foram realizados testes de regresso linear, pelo mtodo dos mnimos quadrados.

Os resultados indicam uma correlao inversa significativa entre os teores de ceras

e os teores de fenis totais (R = 0,626) (Figura 5 A), porm tal relao no foi

verificada em comparao com os teores de flavonas e flavonis (R2 = 0,3687)

(Figura 5 B).

34

Figura 5 Relaes entre o contedo de ceras nas amostras de prpolis verde

e os teores de fenis (A) e flavonas e flavonis totais (B) dos extratos

metanlicos brutos, obtidas pela anlise de regresso linear pelo mtodo dos

mnimos quadrados. Correlao significativa - R2>0,5. A a D - amostras de

Minas Gerais; E e F amostras do Paran.

35

44..77.. IIddeennttiiffiiccaaoo ddaass ssuubbssttnncciiaass pprreesseenntteess nnaass aammoossttrraass

As anlises dos espectros de massas nos permitiram a identificao de 34

substncias, sendo predominantes os derivados prenilados do cido p-cumrico,

com presena de cidos cafeoilqunicos e alguns flavonides (Figura 6).

Figura 6 Frmulas estruturais das substncias presentes nas amostras de prpolis verde

brasileiras estudadas, provenientes dos estados de Minas Gerais e Paran. As substncias

foram identificadas atravs de CLAE/EM e CG/EM.

36

Figura 6 Continuao

37

A identificao das substncias pelo CG/EM foi realizada atravs da

reconstruo da frmula estrutural das substncias, a partir dos fragmentos

gerados no espectrmetro de massas. A Figura 7 um exemplo dessa

reconstituio.

Figura 7 Padro de fragmentao e frmula estrutural do ster allico do cido 3-prenil

cinmico que apresentou on molecular= 256, identificado nas fraes hexnica e

clorofrmica da amostra de prpolis B, de Minas Gerais.

38

Para a identificao das substncias submetidas ao CLAE/EM, comparou-se o

on molecular formado e seus espectros de absoro no UV com os de substncias

descritas na literatura. A Figura 8 representa um exemplo dessa identificao.

Figura 8 - Artepilina C, identificada nas fraes metanlica e de acetato de etila da

amostra D, de Minas Gerais A: Espectro de massas, x105 (m/z)-= 299,1; B: espectro

de absoro no UV (315 nm); C: frmula estrutural, peso molecular = 300.

Nas fraes de hexano e clorofrmio foram identificadas 4 substncias

(Tabela 7, Figuras 9 e 10). As frmulas estruturais propostas esto descritas na

Figura 6.

39

Tabela 7 Constituintes das fraes de hexano e clorofrmio de amostras de

prpolis verde brasileiras, identificados por CG/EM.

Pico TR* Substncia Estrutura proposta

on molecular e Fragmentos

1

15,3 1-benzilideno-

2,2,3,3,tetrametil-ciclopropano

Fig. 6 XIX 186 (C14H18, 30**), 171 (100***), 128 (20), 115 (20), 91 (20), 77 (20)

2

16,7 cido benzeno propanico Fig. 6 XVII

150 (C9O2H10, 40), 104 (70), 91 (100), 77 (30)

3

21 p-vinil-O-prenilfenol Fig. 6 XVIII

188 (C13OH16, 70), 133 (100), 104 (30), 91 (30),

77 (30).

4

28,6 ster allico do cido 3-prenil

cinmico Fig. 6 XXVIII

256 (C17O2H20, 80), 201 (100), 185 (70), 157 (50), 145 (100), 115 (40), 91 (40), 77 (20), 69 (30)

*= Tempo de reteno

**= abundncia relativa

***= pico base, abundncia relativa =100

40

Figura 9 Cromatogramas das fraes de hexano de seis amostras de prpolis verde

brasileiras, obtidos por cromatografia gasosa. A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas

Gerais; E e F prpolis provenientes do Paran.

41

Figura 10 Cromatogramas das fraes de clorofrmio de seis amostras de prpolis verde

brasileiras, obtidos por cromatografia gasosa. A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas

Gerais; E e F prpolis provenientes do Paran.

As fraes de clorofrmio foram metiladas e obteve-se 13 picos que, devido a

sua derivao, foram identificados como steres metlicos das substncias

presentes nas prpolis (Tabela 8, Figura 11). As frmulas estruturais propostas

esto descritas na Figura 6.

42

Tabela 8 steres metlicos das substncias presentes nas fraes clorofrmicas de

amostras de prpolis verde brasileiras, obtidos aps metilao, identificados por

CG/EM.

Pico TR

(min)* Substncia Estrutura

on molecular e fragmentos

1 4,284 ster metlico do cido

benzenopropanico Fig. 6 XVII

164 (13**, C10H1202+),

104 (100***)

2 13,452 ster metlico do cido palmtico Fig. 6 XV 270 (1, C17H3402

+), 41 (98,98)

3 15,461 ster metlico do cido 4-hidroxi 3-

prenil cinmico (drupanina) Fig. 6 XXI

246 (70, C15H18 O3+),

191 (100), 171 (20), 131 (23).

4 16,309 ster metlico do cido esterico Fig. 6 XVI 298 (4, C19H34O2

+), 74(100)

5 17,479 ster metlico do cido 2,2-dimetil

8-prenilcromeno 6-propenico Fig. 6

312 (14, C20 H24O3+),

297 (100)

6 19,105 ster metlico do cido 3-hidroxi 2,2-dimetil 8-prenilcromano 6-

propenico Fig. 6 XXX

330 (100, C20H26 O4+),

297 (30), 272 (50), 225 (60), 197 (50),

171 (50).

7 19,230 ster metlico do cido 4-hidroxi

3,5-diprenilcinmico (artepilina C) Fig. 6 XXII

314 (68, C20H26 O3+),

259 (100), 243 (54), 211 (38), 203 (90).

8 19,561 ster metlico do cido 4-hidroxi 6-

metoxi 3,5-diprenilcinmico Fig. 6 XXXI

344 (18, C21H28 O4+),

86 (100),

9 19,905 ster metlico do cido 4-hidroxi 2-

metoxi 3,5-diprenilcinmico Fig. 6 XXXII

344 (8, C21H28 O4+), 43

(100)

10 20,782 ster metlico do cido 4-hidroxi 6-metoxi 3,5-diprenildiidrocinmico

Fig. 6 XXXIII

346 (2, C21H30 O4+), 43

(100)

11 21,02 ster metlico do cido 4-hidroxi 2-metoxi 3,5-diprenildiidrocinmico

Fig. 6 XXXIV

346 (1,51, C21H30 O4+),

73 (100)

12 21,733 ster metlico do cido 3-prenil 4(2-

metilpropioniloxi) cinmico Fig. 6 XXV

330 (13, C20H26 O4+ ),

43 (100)

13 22,117 ster metlico do cido 3 prenil 4-

cinamoiloxi cinmico Fig. 6 XXIV

376 (3, C24H24 O4+), 75

(100)

*= Tempo de reteno; **= abundncia relativa; **= pico base, abundncia relativa =100

43

Figura 11 Cromatogramas obtidos por CG-FID, das fraes de clorofrmio metiladas, de

seis amostras de prpolis verde brasileiras. A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas

Gerais; E e F prpolis provenientes do Paran.

44

Nas fraes de acetato de etila foram obtidos 11 picos (Tabela 9, Figura 12):

cujas frmulas estruturais esto descritas na Figura 6.

Tabela 9 Constituintes da frao de acetato de etila de amostras de prpolis verde

brasileira, identificados por CLAE/MS.

Pico Substncia TR* UVmx** (m/z)- (m/z)+ PM*** Estrutura

1 cido -cumrico 34,073 310 162,9 nd**** 164 Fig. 6 XX

2 Metoxipinobanksina 65,9 290 301,1 303,1 302 Fig. 6 II

3 Isoramnetina 71,084 268, 365

315 317,1 316 Fig. 6 I

4 Luteolina-5-metil ter 74,355 265, 350

299 301,2 300 Fig. 6 V

5 Drupanina 78,433 315 231 nd 232 Fig. 6 XXI

6 cido 3-prenil-4-(2-

metilpropioniloxi) cinmico 81,54

275Sh, 318

315 nd 316 Fig 6 XXV

7 Campferida 82,883 268, 365

299 301,2 300 Fig. 6 IV

8 cido 3-hidroxi 2,2-dimetil

8-prenilcromano 6-propenico.

87,077 320 315,1 nd 316 Fig. 6 XXX

9 Artepilina C 91,43 315 299,1 nd 300 Fig. 6 XXII

10 5-metoxi-4'-hidroxi-

flavanona-7-O-glicosdeo 95,352 280 447,3 nd 448 Fig. 6 III

11

Baccharina (cido 3-prenil-4

(diidrocinamoiloxi) cinmico)

97,179 290, 330

363,1 nd 364 Fig. 6 XXIII

*TR = tempo de reteno; ** UVmx= pico mximo de absoro no ultra-violeta; *** PM = Peso molecular; ****nd = no

determinado.

45

Figura 12 Cromatogramas das fraes de acetato de etila de seis amostras de prpolis

verde brasileira, obtidos por cromatografia lquida de alta eficincia, com deteco a 270

nm. A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas Gerais; E e F prpolis provenientes do

Paran.

46

Nas fraes de metanol foram obtidos 13 picos (Tabela 10, Figura 13), cujas

frmulas estruturais esto descritas na figura 6.

Tabela 10 Constituintes da frao metanlica de amostras de prpolis verde

brasileira, identificados por CLAE/EM.

Pico Substncia TR* mx (nm)** (m/z)- (m/z)+ PM*** Estrutura

1 cido qunico 6,029 279 191 nd**** 192 Fig. 6 VI

2 cido 3-O-

cafeoilqunico 19,18 300, 330 353 355,1 354 Fig. 6 VII

3 cido 5-O-

cafeoilqunico 21,651 300, 330 352,9 355,2 354 Fig. 6 IX

4 cido 4-O-

cafeoilqunico 25,823 312 nd 355,1 354 Fig. 6 VIII

5

4-hidroxi 3-(3-metilbutano 4-sec-

butil-diidrocinamoiloxi 5-prenilcinmico

37,155 290, 325 519,1 521,3 520 Fig. 6 XXVI

6 cido 3,5-di-O-cafeoilqunico

39,621 300, 330 515,1 nd 516 Fig. 6 X

7 cido 4,5-di-O-cafeoilqunico

50,098 300, 330 515,1 517,2 516 Fig. 6 XI

8 cido 5-O-cafeoil-3-O-feruloilqunico

53,138 295, 325 529,2 531,3 530 Fig. 6 XIII

9 cido 3-O-feruloil-5-O-cafeoilqunico

56,988 300, 325 529,1 nd 530 Fig. 6 XIV

10 cido 3,4,5-

tricafeoilqunico 61,798 300, 330 677,1 679,3 678 Fig. 6 XII

11 Artepilina C 91,486 315 299 nd 300 Fig. 6 XXII

12 cido 7-prenil benzofuranil propenico

95,299 312 255,2 nd 256 Fig. 6 XXVII

*TR = tempo de reteno; ** mx = pico mximo de absoro no ultra-violeta; ***PM = peso molecular;

****nd = no determinado.

47

Figura 13 Cromatogramas das fraes de metanol de seis amostras de prpolis verde

brasileira, obtidos por cromatografia lquida de alta eficincia, com deteco a 270 nm. A,

B, C e D - prpolis provenientes de Minas Gerais; E e F prpolis provenientes do Paran.

44..88.. AAttiivviiddaaddee aannttiiooxxiiddaannttee

4.8.1. Mtodo de seqestro dos radicais livres DPPH

A fim de se obter um grfico que ilustrasse a cintica de reao antioxidante

do cido sinpico, foi feito um teste utilizando concentraes variadas desse cido.

Os resultados obtidos demonstraram que a partir de 30 g/mL a atividade

antioxidante do cido sinpico atinge um plat (Figura 14). Portanto, para testar a

48

atividade antioxidante das amostras, foram utilizadas as concentraes de 8, 12,5 e

25 g/mL.

Figura 14 Atividade antioxidante do cido sinpico, pelo mtodo do DPPH.

O mtodo de seqestro dos radicais livres DPPH nos permite verificar, de

uma maneira rpida e simples, se a amostra em questo possui atividade

antioxidante. Os resultados obtidos permitiram concluir que todas as amostras

analisadas possuem atividade antioxidante, e que esta dose-dependente (Figura

15).

49

Figura 15 Atividade antioxidante, pelo mtodo do DPPH, dos extratos metanlicos brutos de amostras de prpolis verde, em comparao com o cido sinpico. A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas Gerais; E e F prpolis provenientes do Paran

As amostras A e B apresentaram maior capacidade antioxidante, com valores

de 19,2 e 18,56 respectivamente, na concentrao de 25 g/mL (Tabela 11).

Tabela 11 Valores da atividade antioxidante dos extratos metanlicos brutos das amostras de prpolis verde, em diferentes concentraes, pelo mtodo do DPPH.

Atividade antioxidante (%)

Amostra* 8 g/mL 12,5 g/mL 25 g/mL

A 8,16 0,16** 10,9 0,32 19,2 0,6

B 7,57 0,57 10,02 0,77 18,56 0,62

C 6,32 0,13 8,61 0,83 14,97 1,17

D 6,71 0,65 11,79 0,56 15,19 0,47

E 4,55 0,5 4,76 0,76 12,57 0,66

F 4,02 0,3 5,27 0,7 10,5 0,17

* = A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran; ** = resultados expressos em relao massa seca; mdia desvio padro, n=3.

50

A atividade antioxidante do cido sinpico foi bastante superior das

amostras testadas. Porm, importante salientar que o padro corresponde a uma

substncia isolada, ao contrrio dos extratos de prpolis, que so misturas

complexas de substncias, que podem ou no possuir atividade antioxidante.

O teste estatstico ANOVA demonstrou que os valores de atividade

antioxidante do extrato metanlico bruto das amostras analisadas (25 g/mL) so

estatisticamente diferentes entre si (P < 0,0001; F= 56,11), o que permitiu a

comparao dos resultados obtidos. O ps-teste de Tukey demonstrou que as

amostras de Minas Gerais, individualmente, so estatisticamente diferentes das

amostras do Paran (p > 0,05).

4.8.2. Atividade antioxidante dos extratos fracionados pelo mtodo

do DPPH

Alm dos testes feitos com o extrato metanlico bruto, foi testado o poder

antioxidante dos extratos fracionados, na concentrao de 25 g/mL. Quanto

frao de hexano, a amostra A apresentou maior atividade antioxidante (20,43

0,55%), enquanto as demais amostras apresentaram valores entre 5,03 0,7% e

17,48 0,97%. J nas fraes de clorofrmio, os maiores valores apresentados

foram 20,22 1,57 e 20,69 0,18 % para as amostras A e B, respectivamente,

estando as demais amostras entre 8,13 0,57% e 17,45 0,47%. No que se

refere s fraes de acetato de etila, os resultaram variaram entre 10,79 1,1 e

25,59 0,73%, com maior valor para a amostra D. As fraes metanlicas

apresentaram os maiores valores de atividade antioxidante dentre as fraes

51

analisadas, com valores variando de 25,6 0,68 a 41,68 1,15%, sendo que

apenas as amostras A e C apresentaram valores abaixo de 35% (Tabela 12).

Tabela 12 Valores da atividade antioxidante das fraes das amostras de

prpolis verde, pelo mtodo do DPPH.

Fraes (25 g/mL) (%)

Amostra* Hexano Clorofrmio Acetato de Etila Metanol

A 20,43 0,55** 20,22 1,57 21,67 1,04 25,6 0,68

B 17,48 0,97 20,69 0,18 20,35 0,32 41,68 1,15

C 11,54 0,13 17,65 0,47 21,28 0,48 26,02 0,76

D 8,61 0,33 15,82 0,71 25,59 0,73 39,79 0,24

E 5,03 0,7 8,13 0,57 10,79 1,1 35,12 1,01

F 13,06 0,64 13,43 0,75 16,6 0,7 37,83 0,73

** = A, B, C e D - prpolis provenientes de Minas Gerais; E e F prpolis provenientes do Paran;

** = resultados expressos em relao massa seca;mdia desvio padro, n=3.

4.8.3. Atividade antioxidante no sistema -caroteno/cido linolico

A primeira etapa realizada foi um teste com concentraes variadas de cido

sinpico (0,05; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; e 2,0 mg/mL), a fim de se obter um perfil de

sua capacidade antioxidante no presente sistema. Os resultados obtidos

demonstraram que a partir de 1 mg/mL de cido sinpico, no h aumento

significante em sua capacidade antioxidante (Figura 16). Dessa maneira a

capacidade antioxidante das amostras foi testada na concentrao de 1 mg/mL,

bem como em concentraes menores (0,05; 0,1 e 0,5 mg/mL).

52

Figura 16 Atividade antioxidante do cido sinpico em diferentes

concentraes, no sistema -caroteno / cido linolico

Atividade antioxidante do sistema -caroteno/cido linolico permite verificar

a capacidade de proteo de uma amostra contra a oxidao de substratos lipdicos

(Duarte-Almeida et al., 2006). Os resultados aqui obtidos mostram que todas as

amostras analisadas possuem tal atividade, e que esta dependente da

concentrao (Figura 17), com decaimento da absorbncia com o tempo,

semelhante do cido sinpico (Figura 18). As amostras B, C e D apresentaram

maior capacidade antioxidante, com valores de 84,11, 80,86 e 83,52%

respectivamente, na concentrao de 1 mg/mL (Tabela 13).

53

Figura 17 Atividade antioxidante dos extratos metanlicos brutos das

amostras de prpolis verde pelo sistema -caroteno/cido linolico. A a D

amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran.

Figura 18 Descoramento do -caroteno relativamente ao tempo, na

presena de diferentes concentraes de cido sinpico.

54

Tabela 13 Atividade antioxidante dos extratos metanlicos brutos das amostras

de prpolis verde, em diferentes concentraes, no sistema -caroteno/cido

linolico.

Atividade Antioxidante (%)

Amostra* 0,05 mg/mL 0,1 mg/mL 0,5 mg/mL 1 mg/mL

A 41,83 0,91** 53,781,21 73,34 0,89 76,82 0,56***

B 59,56 1,36 66,01 0,21 81,63 0,48 84,11 1,07

C 54,19 1,85 63,99 0,88 78,76 0,5 80,86 1,57

D 61,6 0,69 68,48 1,25 81,65 0,14 83,52 0,71

E 47,12 2,9 52,59 1,18 69,15 1,69 71,25 0,86

F 56,37 1,58 61,07 2,28 74,91 1,49 76,44 1,58

** = A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran;

* = resultados expressos em relao massa seca; mdia desvio padro, n=3.

O teste estatstico ANOVA demonstrou que os valores de atividade

antioxidante do extrato metanlico das amostras analisadas (1 mg/mL) so

estatisticamente diferentes entre si (P= 0,0003; F= 11,65), o que permitiu a

comparao dos resultados obtidos. O ps-teste de Tukey demonstrou que as

amostras A, B, C, e D (MG), individualmente, no so estatisticamente diferentes

da amostra F (PR) (p > 0,05); a amostra A (MG) tambm no apresentou

diferenas estatsticas da amostra E (PR).

4.8.4. Atividade antioxidante dos extratos fracionados no sistema -

caroteno/cido linolico

Tambm foi testada a atividade antioxidante, na concentrao de 1 mg/mL,

das fraes (hexano, clorofrmio, acetato de etila e metanol) das amostras de

55

prpolis analisadas. Quanto frao de hexano, os resultados variaram de 50,55

0,52% a 86,27 1,19%, com as amostras A e D apresentando valores acima de

80%. J as fraes de clorofrmio apresentaram atividade antioxidante entre 65,18

0,16 e 87,75 1,37%, sendo que as amostras A, C e D apresentaram valores

acima de 80%. Nas fraes de acetato de etila, os resultados variaram entre 60,15

1,58 e 88,16 0,97%, com maior valor para a amostra D. As fraes de metanol

apresentaram valores de atividade antioxidante variando de 61,16 3,95 a 84,95

0,64%, sendo que as amostras A, C e D apresentaram valores acima de 80%

(Tabela 14). As amostras A, C e D apresentaram os valores mais altos de atividade

antioxidante, em todas as fraes testadas.

Tabela 14 Atividade antioxidante pelo sistema -caroteno / cido linolico, de

fraes de amostras de prpolis verde

Fraes (1mg/mL)

Amostra* Hexano (%) Clorofrmio(%) Acetato de etila(%) Metanol (%)

A 80,89 0,57** 81,07 1,64 80,7 0,57 80,39 1,74

B 54,67 1,42 65,18 0,16 60,15 1,58 61,16 3,95

C 76,23 0,33 83,72 0,44 83,05 1,45 82,95 1,6

D 86,27 1,19 87,75 1,37 88,16 0,97 84,95 0,64

E 70,69 0,93 77,69 0,4 79,17 1,32 77,03 1,07

F 50,55 0,72 73,79 0,72 76,72 0,54 73,91 0,54

* = A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran;

** = % de prpolis, resultados expressos em relao massa seca; mdia desvio padro, n=3.

56

4.8.5. Teste de regresso linear relacionando a atividade

antioxidante

Quanto s atividades antioxidantes, houve uma correlao positiva

significativa entre a atividade antioxidante do extrato metanlico bruto e o teor de

fenis totais (R2= 0,835) (Figura 19 A), resultado obtido tambm entre o teor de

flavonas e flavonis totais (R= 0,738) (Figura 19 B), no mtodo do DPPH. No

sistema -caroteno/cido linolico, os resultados mostraram no haver uma

correlao significativa (R= 0,450) entre o teor de fenis totais e a capacidade

antioxidante do extrato metanlico bruto das amostras (Figura 20 A), entretanto,

houve uma correlao positiva significativa quanto a capacidade antioxidante e o

teor de flavonas e flavonis totais (R = 0,693, < 0,5) (Figura 20 B).

57

Figura 19 Relaes entre a atividade antioxidante, pelo mtodo do DPPH, e os

teores de fenis (A) e flavonas e flavonis totais (B) dos extratos metanlicos

brutos de amostras de prpolis verde, obtidas pela anlise de regresso linear

A

B

58

Figura 20 Relaes entre a atividade antioxidante, no sistema -caroteno/cido

linolico, e os teores de fenis (A) e flavonas e flavonis totais (B) dos extratos

metanlicos brutos de amostras de prpolis verde, obtidas pela anlise de

regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados. Correlao significativa -

R2>0,5. A a D - amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran.

A

B

59

4.8.6. Atividade antioxidante por cromatografia em camada delgada

Com o intuito de uma possvel elucidao sobre quais substncias seriam

responsveis pela atividade antioxidante nas amostras de prpolis estudadas, foi

realizado um teste de atividade antioxidante em cromatografia de camada delgada.

O padro de manchas com atividade antioxidante nas diferentes fraes foi

semelhante entre as amostras estudadas (Figura 21). Desse modo, o isolamento

das faixas, e as anlises por CLAE e CG foram realizados somente com a amostra

A, MG. Foram obtidas duas bandas contendo atividade antioxidante na frao de

hexano (Figura 21 I), seis na frao de clorofmio (Figura 21 II), seis na frao de

acetato de etila (Figura 21 III) e quatro na frao de metanol (Figura 21 IV).

60

Figura 21 Atividade antioxidante de amostras de prpolis verde brasileiras, por cromatografia em camada delgada. A visualizao foi feita pela nebulizao com soluo de DPPH 0,3 mM. I: frao de hexano, fase-mvel: toluenoclorofrmio-acetona (40:25:35); II: frao de clorofrmio, fase-mvel: hexano-acetato de etilacido actico (31:14:5); III: frao de acetato de etila, fase-mvel: toluenoclorofrmio-acetona (40:25:35); IV: frao de metanol, fase-mvel: acetato de etilaacetona-cido actico-gua (60:20:10:10). AS = padro de cido sinpico; A a D, amostras de Minas Gerais; E e F, amostras do Paran. Os algarismos arbicos correspondem s bandas com atividade antioxidante.

61

Na faixa 1 da frao hexnica observou-se a presena de duas substncias

principais, que correspondem aos picos 3 e 4 (Figura 22 A), enquanto na faixa 2

observou-se um pico principal, que correspondeu ao pico 4 (Figura 22 B). O pico 3

corresponde ao p-vinil-O-prenil fenol (Figura 6 XVIII), enquanto o pico 4

corresponde ao ster allico do cido prenilcinmico (Figura 6 XXVIII). A

identificao ocorreu por comparao do tempo de reteno dos picos obtidos no

presente teste, com o das substncias descritas na seo anterior.

Figura 22 Cromatogramas obtidos por CG-FID, das faixas isoladas por cromatografia em

camada delgada da frao hexnica da amostra A (MG), nas quais foi detectada atividade

antioxidante. A: faixa 1; B: faixa 2.

Nas faixas 1 e 2 da frao clorofrmica, verificou-se a presena de muitas

substncias, em quantidade muito pequena, de tal maneira que no foi possvel

atribuir a atividade antioxidante a uma delas, especificamente (Figura 23 A e B). A

cromatografia a gs da faixa 3 mostrou tambm a presena de vrias substncias,

entre elas o 1-benzilideno-2,2,3,3,tetrametil-ciclopropano (pico 1, Fig. 6 XIX), o -

vinil-O-prenilfenol (pico 3, Fig. 6 XVIII) e o ster allico do cido prenilcinmico

(pico 4, Fig. 6 XXVIII) (Figura 23 C). Nas faixas 4 e 5, observou-se a

62

predominncia do -vinil-O-prenilfenol (pico 3, Fig. 6 XVIII), alm de outros picos

de menor abundncia (Figura 23 D e E), enquanto na faixa 6 apareceu como pico

principal o ster allico do cido 3-prenilcinmico (pico 4, Fig. 6 XXVII) (Figura 23

F).

Figura 23 Cromatogramas obtidos por CG-FID das faixas isoladas por cromatografia em

camada delgada da frao clorofrmica da amostra A (MG), nas quais foi detectada

atividade antioxidante. A: faixa 1; B: faixa 2; C: faixa 3; D: faixa 4; E: faixa 5; F: faixa 6.

63

Nas faixas isoladas das fraes de acetato de etila, observamos a presena

do cido qunico (pico A, Figura 6 VI) como pico principal na faixa 1, alm da

presena de diversos picos de menor abundncia (Figura 24 A). Apesar do cido

qunico no ter sido identificado na frao de acetato de etila, o espectro de UV e o

tempo de reteno do pico A correspondem ao do cido qunico, identificado apenas

na frao de metanol. A faixa 2 correspondeu a um aglomerado de picos de baixo

tempo de reteno, muito difceis, portanto, de serem identificados (Figura 24 B).

Na faixa 3 a substncia predominante foi o cido p-cumrico (pico 1, Figura 6 XX),

mas encontramos tambm alguns picos com abundncia baixa, entre eles o cido

3-prenil-4-(2-metilpropioniloxi) cinmico (pico 6, Figura 6 XXV) (Figura 24 C). Na

faixa 4, tambm predominante o cido p-cumrico (pico 1, Figura 6 XX), com a

presena do cido qunico (pico A, Figura 6 VI), drupanina (pico 5, Figura 6 XXI),

cido 3-prenil-4-(2-metilpropioniloxi) cinmico (pico 6, Figura 6 XXV), cido 3-

hidroxi 2,2-dimetil 8-prenilcromano 6-propenico (pico 8, Figura 6 XXX), artepilina

C (pico 9, Figura 6 XXII) e 5-metoxi-4'-hidroxi-flavanona-7-O-glicosdeo (pico 10,

Figura 6 III) em menor quantidade (Figura 24 D). Na faixa 5 foi encontrado como

pico mais abundante a drupanina (pico 5, Figura 6 XXI), embora tambm estejam

presentes em grande quantidade o cido 3-prenil-4-(2-metilpropioniloxi) cinmico

(pico 6, Figura 6 XXV), a 5-metoxi-4'-hidroxi-flavanona-7-O-glicosdeo (pico 10,

Figura 6 III ) e uma substncia no identificada (pico B); com menor abundncia,

verificamos a presena do cido qunico (pico A, Figura 6 VI), campferida (pico 7,

Figura 6 IV) e artepilina C (pico 9, Figura 6 XXII) (Figura 24 E). Na faixa 6 foi

encontrado em grande quantidade uma substncia que no pode ser identificada

(pico C), a metoxipinobanksina (pico 2, Figura 6 II), a drupanina (pico 5, Figura 6

64

XXI) e o cido p-cumrico (pico 1, Figura 6 XX), embora este ltimo esteja

presente em menor quantidade (Figura 24 F).

Figura 24 Cromatogramas obtidos por CLAE, das faixas isoladas por cromatografia em

camada delgada da frao de acetato de etila da amostra A (MG), nas quais foi detectada

atividade antioxidante . A: faixa 1; B: faixa 2; C: faixa 3; D: faixa 4; E: faixa 5; F: faixa 6.

65

Nas faixas da frao de metanol observamos a predominncia do cido

qunico (pico 1, Figura 6 VI) nas faixas 1, 2, e 4 (Figuras 25 A, B e D). Na faixa 3,

temos a predominncia do cido 4,5-di-O-cafeoilqunico (pico 7, Figura 6 XI), com a

presena do cido 4-O-cafeoilqunico (pico 3, Figura 6 VIII) em menor abundncia

(Figura 25 C).

Figura 25 Cromatogramas obtidos por CLAE, das faixas isoladas por cromatografia em

camada delgada da frao de metanol da amostra A (MG), nas quais foram detectadas

atividade antioxidante. A: faixa 1; B: faixa 2; C: faixa 3 e D: faixa 4.

4.9. Ensaio de citotoxicidade em embries de ourio-do-mar

Os ensaios de atividade citotxica das amostras de prpolis, tanto das

fraes, como dos extratos metanlicos brutos, demonstraram haver grandes

diferenas entre o potencial citotxico das amostras, bem como das diferentes

66

fraes de uma mesma amostra. Alm disso, todas as atividades se mostraram

dose-dependentes.

Todos os extratos metanlicos brutos apresentaram alta atividade citotxica

na concentrao de 32 g/mL (97,33 1,53% a 100 0%) (Figura 26).

Quanto s fraes de hexano, apenas as amostras A e B apresentaram alta

atividade (98,5 2,12% e 68,5 4,95%, respectivamente). As outras amostras,

mesmo na maior concentrao testada (32 g/mL), apresentaram uma atividade

citotxica baixa, com valores entre 4,33 2,08% e 27,5 0,7% (Figura 27).

As fraes de clorofrmio das amostras A, B, C e D apresentaram alta

atividade citotxica, com valores entre 64 4,24% e 92,5 0,7% na concentrao

de 32 g/mL, enquanto as amostras E e F apresentaram atividade citotxica baixa

(2 1% a 15 1,41%) (Figura 28).

As fraes de acetato de etila apresentaram alta atividade citotxica, com

valores prximos de 100% na concentrao de 32 g/mL para todas as amostras.

As amostras C, D e F alcanaram valores superiores a 80% na concentrao de 16

g/mL (Figura 29).

As fraes metanlicas apresentaram atividade citotxica baixa, menor do

que 5% em todas as amostras, mesmo na concentrao mais alta utilizada (Figura

30).

67

Figura 26 Atividade citotxica dos extratos brutos metanlicos, em

diferentes concentraes, de amostras de prpolis verde brasileiras. A a D -

amostras de Minas Gerais; E e F amostras do Paran.

Figura 27 Atividade citotxica das fraes de hexano, em diferentes

concentraes, de amostras de prpolis verde brasileiras. A a D - amostras

de Minas Gerais; E e F amostras do Paran.

68

Figura 28 Atividade citotxica das fraes de clorofrmio, em diferentes

concentraes, de amostras de prpolis verde brasileiras. A a D - amostras

de Minas Gerais; E e F amostras do Paran.

Figura 29 Atividade citotxica das fraes de acetato de etila, em

diferentes concentraes, de amostras de prpolis verde brasileiras. A, B, C

e D - prpolis provenientes de Minas Gerais; E e F prpolis provenientes

do Paran.

69

Figura 30 Atividade citotxica das fraes metanlicas, em diferentes

concentraes, de amostras de prpolis verde brasileira. A a D amostras de

Minas Gerais; E e F amostras do Paran.

Como as fraes de acetato de etila foram as que apresentaram a maior

atividade citotxica dentre as testadas, foi realizada uma curva dose-resposta de

uma das amostras (amostra D), com concentraes logartmicas de razo 1,2, a fim

de traar o perfil da atividade citotxica desta amostra. Os resultados obtidos

apresentam-se na Figura 31, demonstrando que a partir de 15,48 g/mL, a inibio

da clivagem dos embries desta amostra foi prxima de 100%.

70

Figura 31 Curva dose-resposta da atividade citotxica da frao de acetato de

etila da amostra de prpolis verde D (Minas Gerais).

Embries tratados com 10 L de etanol foram utilizados como controles, e

apresentaram clivagens normais (Figura 32 A). Dentre os embries tratados com

32 g/mL de extrato metanlico bruto, a maioria apresentou inibio da 1a

clivagem (Figura 32 B), apresentando anomalias de diviso em concentraes

menores; j os embries tratados com 32 g/mL de extrato da frao de hexano

apresentaram anomalias de diviso (Figura 32 C); os embries tratados com 32

g/mL de extrato da frao de clorofrmio tambm apresentaram maioria das

divises anormais (Figura 32 D); os embries tratados com 32 g/mL de extrato da

frao acetato de etila apresentaram anomalias de diviso e ausncia de clivagem

nas mesmas propores (Figura 32 E); os embries tratados com 32 g/mL de

extrato da frao metanlica apresentaram clivagens normais (Figura 32 F).

71

Figura 32 Micrografias mostrando a atividade citotxica de amostras de prpolis verde em embries de Lytechinu