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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Rita de Cássia Soares Cardoso
CARACTERÍSTICAS IN VITRO DO ESPERMATOZÓIDE CANINO CRIOPRESERVADO
EM ÁGUA DE COCO
Fortaleza - Ceará Dezembro, 2005
2
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Rita de Cássia Soares Cardoso
CARACTERÍSTICAS IN VITRO DO ESPERMATOZÓIDE CANINO CRIOPRESERVADO
EM ÁGUA DE COCO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias - Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Veterinárias.
Área: Reprodução e Sanidade Animal Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva
Fortaleza – Ceará Dezembro, 2005
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Universidade Estadual do Ceará Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Título do trabalho: Características in vitro do espermatozóide canino criopreservado
em água de coco
Autor(a): Rita de Cássia Soares Cardoso
Defesa em: 15/12/2005 Conceito obtido: Satisfatório
Nota obtida: 10,0
Banca Examinadora
__________________________________ Prof. Dr. Marcos Antônio Lemos de
Oliveira Examinador
_____________________________ Prof. Dr. José Fereira Nunes
Examinador
___________________________ Prof. Dra. Maria Denise Lopes
Co-orientadora
___________________________Profa. Dr. Fabiana Ferreira de
Souza Examinadora
__________________________________
Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva
Orientadora
4
DEDICATÓRIA
Dedico a Deus por tudo o que
representa em minha vida. Por ser a
verdadeira força e abrigo nos
momentos de aflição.
5
AGRADECIMENTOS
A DEUS por permitir que eu chegasse até aqui, sendo a minha maior fonte
de força nos momentos difíceis. Por ser aquele a me fazer acreditar que tudo o que
acontece na vida tem uma explicação mesmo que eu não a compreenda.
A meus pais por me proporcionarem uma boa educação. Em especial à
minha mãe por sempre pensar em mim em primeiro lugar e na minha felicidade acima
de tudo. Agradeço também por ensinar os valores de uma vida honesta e de ajuda ao
próximo.
À minha orientadora, Profa. Lúcia Daniel Machado da Silva, em primeiro
lugar por ser uma amiga e repassar os seus valores de honestidade, humildade e, ainda
a simplicidade da vida. Agradeço ainda pelos ensinamentos profissionais, preparando-
me inicialmente para ser uma Médica Veterinária e, posteriormente, para orientar
futuros profissionais. E ainda por estar sempre disposta a ajudar e sempre
compreendendo todos os problemas sejam pessoais ou profissionais.
À Profa. Dra. Maria Denise Lopes que proporcionou a realização de parte
do experimento na UNESP-Botucatu, estando sempre disposta a superar qualquer
obstáculo. E ainda, por ser extremamente acolhedora, preocupando-se com nosso bem
estar e fazendo-nos sentir protegidos mesmo estando longe de casa.
À Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza pela valiosíssima colaboração no
experimento, estando sempre disponível não somente para a realização do trabalho,
mas também pelo acolhimento em sua cidade.
6
À Universidade Estadual do Ceará, em especial ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias nas pessoas dos professores, funcionários e
alunos.
Aos Laboratórios de Fisiologia e Controle da Reprodução, Tecnologia do
Sêmen Caprino e Ovino e MOIFOPA pela concessão no uso de equipamentos para a
realização deste experimento.
À ACP Biotecnologia na pessoa da Dra. Cristiane Clemente de Mello
Salgueiro e do Dr. João Monteiro Gondim pelo fornecimento do diluente ACP® 106,
objeto de estudo deste trabalho.
Ao Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da UNESP-Botucatu, onde agradeço à Direção e professores
pelo uso das instalações, e ainda, aos funcionários pela hospitalidade.
Aos funcionários do Laboratório de Microscopia Eletrônica (Instituto de
Biologia da UNESP-Botucatu) pelo preparo do material e fotodocumentação da
análise ultra-estrutural espermática.
A todos do REPAS (Laboratório de Reprodução de Pequenos Animais e
Silvestres), em especial à doutoranda Viviane Helena Chirinéa, pela valiosa ajuda e
amizade. Agradeço ainda à Profa. Dra. Maria Isabel Melo Martins pela acolhida em
sua residência. À M.Sc. Lilian Rigato Martins pelo auxílio na fotodocumentação dos
resultados do teste de interação espermatozóide-oócito.
À INTERVET pelo fornecimento de água ultra-pura para o preparo dos
diluentes.
À Associação Pró-Carnívoros pela concessão no uso do Dry shipper.
7
A CAPES, pela concessão da bolsa e ao CNPq pelo apoio finaceiro.
Ao Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo por me levar para o “mundo” da
pesquisa, “mundo” este que eu não quero deixar.
Aos colegas do PPGCV pelo ótimo convívio durante disciplinas e pelos
bons momentos como Marcos Renato Franzosi Mattos, Lucilene Simões Mattos,
Regiane Rodrigues e Ana Carolina Melo.
Aos animais experimentais, que mesmo sem saber, contribuíram de forma
valiosa, e ainda, aos proprietários dos mesmos.
Aos meus cães, Kaue e Tchutchuca, que do modo deles, sabem demonstrar
a sua fidelidade, parecendo entender quando precisamos de um carinho.
Aos companheiros do Laboratório de Reprodução de Carnívoros (LRC):
Janaína de Fátima Saraiva Cardoso, Ana Kelen Felipe Lima, Raimundo Diones
Carneiro, Iran Áquila Maciel, Camila Louise Ackerman, Cristina Vidal, Belarmino
Eugênio Lopes Neto, Daniel Falcão Menezes Brilhante, Áurea Helena Rocha Lima,
Henna Roberta Quintino e Thiago da Silva pelos diversos momentos de alegria e
ajuda. Ao amigo Carlos Gabriel de Almeida Dias, que apesar do pequeno convívio,
percebe-se que é uma pessoa muito especial, que te faz sempre se sentir bem e cuja
amizade vale a pena ser cultivada. Àqueles que fizeram parte do LRC e contribuíram
para a realização deste trabalho como o acadêmico Leonardo Tavernezzi.
Àqueles companheiros de LRC que são também amigos como a doutoranda
Ticiana Franco Pereira da Silva que além de ser uma verdadeira amiga, estando
sempre disposta a ajudar, é uma pessoa com quem se tem prazer de conviver e
trabalhar.
8
Ao amigo Daniel Couto Uchoa, que além de contribuir na realização do
experimento, é uma pessoa com quem sempre se pode contar.
Ao amigo Alexandre por também contribuir para que eu concluisse mais
esta etapa em minha vida, dividindo não só os bons momentos, mas também os
difíceis. Por estar presente em todas as etapas do experimento e com quem o trabalho
se tornava mais fácil.
À minha amiga Christiane Barreto por todos os momentos de alegria,
recebendo-me em sua casa e fazendo eu me sentir menos sozinha. Por ser uma
verdadeira amiga, pelas conversas, conselhos, risadas, mostrando que a vida deve ser
vivida intensamente.
Ao meu noivo Edilson Soares Lopes Júnior pelo companheirismo,
orientação e ajuda para enfrentar qualquer problema em minha vida. Agradeço ainda
pelo carinho, paciência, dedicação, por me fazer rir quando estou triste e por me
mostrar que não há problema sem solução e, quando não há solução, enfrentá-los e ver
o lado bom. E ainda por seu caráter, mostrando que estamos aqui para ajudar aos
outros, sendo sempre humilde, honesto e verdadeiro com os sentimentos.
9
RESUMO
A avaliação do sêmen geralmente inclui a análise da motilidade, vigor e
morfologia espermática. Porém para conhecer a extensão dos danos causados à célula
espermática e aperfeiçoar os métodos de criopreservação, é de grande importância a
análise de outros parâmetros. Desta forma, o objetivo geral desta tese foi avaliar in
vitro a eficácia de um diluente à base de água de coco em pó (ACP-106®) na
manutenção da qualidade do sêmen canino pós-descongelação. Por isso, o estudo foi
dividido em quatro etapas. Na primeira etapa, foi realizada uma comparação entre o
método de diluição fixa do sêmen com o de concentração fixa utilizando os diluentes à
base de água de coco in natura (ACIN) e ACP-106®. Na segunda etapa, foi observado
o efeito do armazenamento a -10°C sobre a eficiência do ACP-106® e o efeito da
diluição pós-descongelação. Na terceira e quarta etapas, o sêmen congelado foi
avaliado pelo teste de interação espermatozóide-oócito, análise computadorizada da
motilidade , integridade de membrana e avaliação morfológica pela microscopia
eletrônica de transmissão. O ACP-106® mostrou-se eficiente em comparação com o
ACIN, podendo ser utilizada a diluição 1:1 ou a uma concentração espermática de 200
x 106 espermatozóides/mL. Não houve influência do armazenamento a -10°C sobre a
eficiência do ACP-106® e a diluição pós-descongelação sobre a longevidade
espermática pós-descongelação. O procedimento de congelação-descongelação
utilizando ACP-106® foi eficiente na manutenção do potencial fertilizante do
espermatozóide canino in vitro, mantendo não somente a sua capacidade de de se ligar,
mas também de penetrar na zona pelúcida.
10
SUMÁRIO
Pág.
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS...................................................11
LISTA DE FIGURAS...................................................................................... 15
LISTA DE TABELAS........................................................................................ 18
1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 20
2. REVISÃO DE LITERATURA....................................................................... 22
3. JUSTIFICATIVA......................................................................................... 49
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS.......................................................................... 52
5. OBJETIVOS.................................................................................................. 53
6. CAPÍTULO 1................................................................................................ 55
7. CAPÍTULO 2................................................................................................ 91
8. CAPÍTULO 3................................................................................................ 108
9. CAPÍTULO 4................................................................................................. 130
10. DISCUSSÃO GERAL................................................................................. 145
11. CONCLUSÕES.............................................................................................160
12. PERSPECTIVAS ......................................................................................... 161
13. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................... 162
14. ANEXOS .................................................................................................... 188
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Abreviatura Significado
% Porcentagem
A Acrossoma
ACIN Água de coco in natura
ACP® Água de coco em pó
ACP-106® Diluente para sêmen de carnívoros à base de água
de coco em pó
ALH Amplitude lateral head
BCF Beat cross frequency
BSA Bovine serum albumine (Albumina sérica bovina )
º C Graus Celsius
C1 Concentração inicial
C2 Concentração final
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior
CASA Computer Aidded Semen Analysis
CBRA Colégio Brasileiro de Reprodução Animal
C-FDA Diacetato de carboxi-fluoresceína
CLONE Cryogenics Laboratory of New England
cm Centímetros
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico
Cool Cooled semen
CTC Clortetraciclina
DMSO Dimetil-sulfóxido
DVM Doctor em Veterinary Medicine
12
E Equatorial region
Ext Extended semen
FAVET Faculdade de Veterinária
FIG Figura
FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
Fr Fresh semen
G Gravidade
GLM General Linear Model
Glyc Glycerolizated semen
HOST Hypoosmotic swelling test (teste hipo-osmótico)
HTR Hamilton Thorne Researcher
IA Inseminação artificial
IAA Ácido 3-indol acético
Km Kilometer
L Litro
Lin Linearity
LRC Laboratório de Reprodução de Carnívoros
LVV Low VAP cutoff
MVV Medium VAP cutoff
min Minutos
mL Mililitros
M.Sc. Master of Science
mOsm Miliosmol
MP Midpiece
NCW In natura coconut water
N Nucleus
OM Outer acrosome membrane
P Probabilidade
PBS Phosphate buffer saline
pH Potencial hidrogeniônico
PI Iodeto de propídio
13
PCW Powder coconut water
PM Plasma membrane
PNA Peanut Agglutinin
PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias
PSA Pisum Sativum Agglutinin
r Coeficiente de relação
RA Reação acrossômica
REPAS Laboratório de Reprodução de Pequenos Animais e
Silvestres
ROS Reactive oxigen species (espécies oxigênio
reativas)
s Segundos
SAS Statistical Analysis System
SD Standard deviation
SDS Duodecil sulfato de sódio
SOD Superoxide dismutase
SQA Semen quality analyzer
STR Straightness
SEM Scanning Electronic Microscopy
SOIA Sperm-oocyte interaction assay
TAB Tabela
TEM Transmission Electronic Microscopy
Thaw Frozen/thawed semen
THOS Teste hiposmótico
TTR Teste de termorresistência
UECE Universidade Estadual do Ceará
UNESP Universidade Estadual Paulista
USA United States of America
V/V Volume / Volume
VV Volume:Volume
14
V1 Volume inicial
V2 Volume final
VAP Velocity average pathway
VCL Velocity curvilinear
VSL Velocity straight line
µm Micrômetros
ZP Zona pelúcida
15
LISTA DE FIGURAS
Pág.
CAPÍTULO 1
ARTIGO: Efeito da diluição espermática na congelação de sêmen canino
utilizando-se a água de coco em pó como diluidor (ACP-106®)
FIGURA 1 Percentual de alterações morfológicas do sêmen canino congelado
em ACP-106® a uma concentração de 200 x 106
espermatozóides/mL (ACP CONCENTRAÇÃO) e a uma diluição
constante de 1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras diferentes implicam
em diferença significativa (P< 0,05) entre os métodos de diluição.
78
FIGURA 2 Percentual de alterações morfológicas primárias e secundárias do
do sêmen canino congelado em ACP-106® a uma concentração de
200 x 106 espermatozóides/mL (ACP CONCENTRAÇÃO) e a
uma diluição constante de 1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras
diferentes implicam em diferença significativa (P< 0,05) entre os
métodos de diluição.
78
ARTIGO: Use of the powder coconut water (ACP-106®) as an alternative extender
for canine semen freezing
FIGURA 1 Sperm motility of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool),
glycerol-supplemented (Glyc) and frozen/thawed (Thaw) semen
extended with fresh/in natura (NCW) or powder coconut water
(ACP-106® - P > 0.05; Student’s t test).
90
16
FIGURA 2 Sperm vigor of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool), glycerol-
supplemented (Glyc) and frozen/thawed (thaw) semen extended
with fresh/in natura (NCW) or powder coconut water (ACP-106® -
P > 0.05; Mann-Whitney test).
90
CAPÍTULO 3
FIGURA 1 Percentage of oocytes bound, penetrated and interacted (bound
and/or penetrated) by canine spermatozoa after freezing/thawing
using ACP-106® (10 replicates).
127
FIGURA 2 Number of canine spermatozoa per oocyte bound, penetrated and
interacted (bound and/or penetrated) to the zona pellucida after
freezing/thawing using ACP-106® (10 replicates).
128
CAPÍTULO 4
FIGURA 1 Transmission electron micrographs of fresh dog spermatozoa. N:
nucleus; A: acrosoma. (a) Fresh spermatozoa presenting an intact
acrosome and a plasmalemma in close apposition with the
acrosome (arrow). Magnification 1950X. (b) Spermatozoon
presenting a swollen plasmalemma but with an intact acrosoma.
Magnification 8400X.
142
FIGURA 2 Transmission electron micrograph of dog spermatozoa after
cryopreservation with ACP-106®. A: acrosoma; N: nucleus; E:
equatorial region. (a) Spermatozoon with a swollen intact plasma
membrane with plicae (arrows). The acrosoma is swollen with an
undulated contour (white arrow head) and vesiculation (black
arrow head). The equatorial region is swollen. Magnification
8400X. (b) Vesiculated plasma membrane (arrows) and releasing
143
17
of acrosomal contents (arrow heads). Magnification 11500X. (c)
Swollen plasma membrane (black arrow) with areas of
vesiculation (white arrow). Outer acrosoma membrane presents
areas of vesiculation (arrow heads). Equatorial region is intact.
Magnification 8400X.
FIGURA 3 Transmission electron micrograph of dog spermatozoa after
cryopreservation with ACP-106®. A: acrosoma; N: nucleus; E:
equatorial region; PM: plasma membrane; OM: outer acrosome
membrane, MP: midpiece. (a) Swollen and intact plasma
membrane (arrow). The acrosome is disrupted and the contents
are released (arrow heads). Mid-piece presents a plasmalemma
swelling and damages in mitochondrial sheath like content
disorganization. Magnification 6300X. (b) Plasma membrane,
outer (arrow) and inner (arrow heads) acrosome membrane are
swollen and with plicae. Equatorial region is intact.
Magnification 8400X.
144
18
LISTA DE TABELAS
Pág.
TABELA 1 Classificação morfológica do espermatozóide canino 34
CAPÍTULO 1
ARTIGO: Comparison of two dilution rates on canine semen quality after
cryopreservation in a coconut water extender
TABELA 1 Characteristics of fresh semen collected from six stud dogs
(n=12 ejaculates)
60
TABELA 2 Sperm motility and vigor during steps of freezing and after
thawing using coconut water extender with two different
dilution rates
61
TABELA 3 Post-thaw morphology using coconut water extender with two
different dilution rates
61
ARTIGO Efeito da diluição espermática na congelação de sêmen canino
utilizando-se a água de coco em pó (ACP-106®) como
diluidor
TABELA 1 Média e desvio padrão das características físicas e
morfológicas da fração espermática dos ejaculados caninos
(n=12)
77
TABELA 2 Média e desvio padrão da motilidade e vigor do sêmen canino
congelado com um diluidor à base de água de coco em pó
(ACP-106®) em dois métodos diferentes de diluição.
77
ARTIGO Use of the powder coconut water (ACP-106®) as an
alternative extender for canine semen freezing
19
TABELA 1 Sperm morphology observed in canine fresh and frozen-thawed
semen submitted to extension with fresh/in natura coconut water
(NCW) or powder coconut water (ACP-106®)
89
CAPÍTULO 2
ARTIGO Effect of storage at –10 °C of the ACP-106® extender and
post-thaw dilution on the quality of frozen canine semen
TABELA 1 Sperm motility (%) of non-stored and frozen-thawed canine
semen using non-stored or stored ACP-106® during
incubation at 37 °C for 120 minutes
105
TABELA 2 Sperm morphology (%) of fresh and frozen-thawed canine
semen using non-stored or stored ACP-106® during
incubation at 37 °C for 60 minutes
106
TABELA 3 Acrosomal status (%) of frozen-thawed canine semen using
non-stored or frozen-rewarmed ACP-106®, under dilution of
one part semen to four parts extender (1:4)
107
CAPÍTULO 3
TABELA 1 Mean ± SD for the sperm quality parameters determined after
freezing/thawing using ACP-106®
126
TABELA 2 Relationships between (Simple regression model) data for
sperm-oocyte interaction assay and results from different
sperm parameters (independent variables)
129
20
1. INTRODUÇÃO
O aumento do interesse por parte dos criadores em incrementar a eficiência
reprodutiva de seus animais tem levado a um maior desenvolvimento na criação de cães.
Neste sentido, a preservação de gametas masculinos é uma valiosa ferramenta, uma vez que a
biotécnica de criopreservação oferece a possibilidade de transportar o sêmen para vários
países, bem como de armazená-lo por um tempo prolongado (Ström, 1999).
O conceito de preservação de sêmen implica na manutenção de sua capacidade
funcional, isto é, na habilidade para produzir ninhadas, o que, necessariamente, envolve a
manutenção da integridade celular espermática, a habilidade em penetrar o oócito e a
competência para suportar o desenvolvimento embrionário (Harrison et al., 1996). Para obter
tal sucesso, é essencial um protocolo de criopreservação que seja eficiente, devendo-se
considerar aspectos relacionados à taxa de resfriamento, método de congelação (vapor de
nitrogênio ou congeladores programáveis), método de estocagem (palhetas ou pellets), taxa de
descongelação bem como diluentes e agentes crioprotetores.
Pela avaliação do sêmen criopreservado tenta-se aperfeiçoar os métodos a fim de
torná- los mais práticos, bem como obter melhores resultados. Foi objetivando não somente
tornar a metodologia mais prática como também criar um produto para ser comercializado,
que foi criada a água de coco em pó, denominada de ACP®. O diluente padrão à base de água
de coco in natura já se mostrou eficiente para a diluição do sêmen de diversas espécies como
caprinos (Nunes e Salgueiro, 1999), suínos (Toniolli e Mesquita, 1990) e caninos (Cardoso et
al., 2003b). No entanto, esta solução não poderia ser armazenada por um longo período.
Para a comercialização de tal diluente, é preciso a comprovação de sua eficiência
para a conservação do sêmen. Infelizmente, não há um único teste in vitro que seja capaz de
mensurar todas essas funções numa amostra de sêmen. Contudo, uma quantificação fidedigna
do total de espermatozóides que possuem estas características, separadamente, pode ser um
importante indicador da capacidade funcional espermática (Amann & Hammerstedt, 1993).
21
A avaliação padrão do sêmen é, primariamente, baseada em parâmetros físicos.
Contudo, há evidências de que tais parâmetros sozinhos não são suficientes para determinar
um padrão de fertilidade de um ejaculado (Jeyendran et al., 1984). Este tipo de avaliação
também não é suficiente para uma análise do espermatozóide congelado-descongelado, visto
que, os mesmos apresentam uma série de danos que não podem ser detectados nesta análise
convencional. O processo de fertilização envolve uma complexidade de eventos físicos e
bioquímicos que não são mensurados pelos indicadores físicos usados, rotineiramente, nas
avaliações do sêmen (Jeyendran et al., 1984). Neste sentido, uma avaliação mais completa in
vitro e associada com o teste in vivo é de grande importância para se evidenciar o efeito da
criopreservação sobre a qualidade espermática.
22
2. REVISÃO DE LITERATURA
Histórico da tecnologia da reprodução assistida na espécie canina
A tecnologia da reprodução assistida em cães teve início no século XVIII.
Spallanzani, em 1776 (Watson, 1979), foi o primeiro a registrar que uma diminuição
na temperatura proporcionava uma redução, de forma reversível, na atividade
metabólica do espermatozóide, permitindo assim o seu armazenamento. A primeira
inseminação artificial (IA), cientificamente registrada, foi realizada na espécie canina e
descrita por Spallanzani em 1780 (Seager, 1969).
Foi a partir da descoberta da ação crioprotetora do glicerol por Polge et al.
(1949) que houve um impacto significativo na metodologia de criopreservação de
sêmen. Entretanto, as pesquisas direcionadas para a espécie canina eram raras até bem
pouco tempo, situação esta que vem sendo revertida devido a um interesse cada vez
maior sobre os animais de companhia, com as pesquisas voltadas para os mesmos
aumentando significativamente nos últimos anos (Farstad, 1984; Linde-Forsberg &
Forsberg, 1989).
O primeiro êxito na congelação de sêmen canino foi citado por Rowson
(1954), enquanto Seager (1969) relatou a primeira prenhez resultante de IA com a
utilização de sêmen canino congelado. Desde essa época, diversos foram os estudos
que se investigaram métodos de preservação de espermatozóides caninos pela
congelação, sendo, um dos mais comuns, o descrito por Andersen em 1972. No
entanto, os resultados obtidos após IA com sêmen canino congelado ainda são bastante
heterogêneos (Linde-Forsberg & Forsberg, 1989; England, 1993).
23
No Brasil, a primeira notificação de sucesso em inseminação artificial (IA)
com sêmen canino congelado foi realizada há pouco mais de 20 anos (Vaske et al.,
1981). Uma segunda gestação oriunda de IA com sêmen canino congelado foi
confirmada por ultra-sonografia em 2000 em um trabalho realizado pelo LRC – UECE
(Silva et al., 2001a), mas os resultados obtidos não foram satisfatórios, uma vez que a
cadela abortou, sendo constatada infecção por Erlichia canis e Leishmania chagasi.
O diluente e seus componentes
Para o sucesso da criopreservação, o diluente é de fundamental importância
a fim de minimizar os danos espermáticos que impliquem na redução da qualidade do
sêmen. Um bom diluente deve proteger os espermatozóides de todos os efeitos críticos
do processo de refrigeração, congelação e descongelação. Este deve conter nutrientes
para o metabolismo espermático, servir como tampão, ajustando as alterações de pH,
promover pressão osmótica compatível com o plasma seminal e conter eletrólitos
dentro dos padrões fisiológicos, além de prevenir o crescimento de bactérias
(Concannon & Battista, 1989).
Existem diferenças na composição lipídica da membrana plasmática do
espermatozóide entre as espécies, raças e ainda entre indivíduos da mesma espécie, o
que pode explicar o maior ou menor efeito protetor de um diluente aos
espermatozóides de um determinado indivíduo (Holt, 2000a).
A composição do diluente é de vital importância para criopreservação do
sêmen e deve ser específica para cada espécie. Foote (1964) foi um dos primeiros
pesquisadores a investigar, sistematicamente, a combinação e a quantidade de vários
componentes dos diluentes para a preservação do sêmen de cão. Diversas substâncias
podem ser adicionadas ao meio diluente a fim de garantir uma maior eficiência. As
mesmas serão descritas a seguir.
24
Tampões
A atividade metabólica do espermatozóide resulta num acúmulo de íons de
hidrogênio, assim a utilização de um tampão no diluidor é necessária para neutralizar o
pH ácido do meio, evitando a diminuição da motilidade espermática progressiva. Além
disso, o contínuo metabolismo espermático, produzindo como resultado grandes
quantidades de catabólitos tóxicos, acarreta num aumento do ácido lático no meio
extracelular (Pérez & Pérez, 1994 apud Cunha, 2002; Farstad, 1996; Holt, 2000b). O
pH ótimo para o espermatozóide canino varia de 6,5 a 7,0 e a maioria dos diluentes
encontra-se na faixa de 6,9 a 7,1 (England, 1993).
Substâncias de poder tampão tais como o Tris (Tris-hidroximetil
aminometano) e o Tes (N-Tris (hidroximetil) metil 2-amonoetanosulfônico), citrato e
fosfato de sódio têm sido utilizadas na composição de diversos meios diluentes para a
criopreservação de sêmen canino (Silva e Verstegen, 1995; Santos, 1997; Rota et al.,
1998; Cardoso, 2001; Silva, 2001).
Agentes crioprotetores
Os crioprotetores devem ser adicionados ao meio para que haja uma
proteção do espermatozóide durante o equilíbrio, congelação e a descongelação
(Squires et. al., 1999), e esses elementos são importantes para evitar a formação de
grandes cristais de gelo intracelulares (Medeiros et al., 2002). Esses agentes pertencem
a dois grupos: aqueles que penetram nas células como o glicerol, o dimetil sulfóxido
(DMSO) e o metanol; e aqueles que permanecem no meio extracelular como as
proteínas, os açúcares e a polivinil pirrolidona (England, 1993).
25
O glicerol (CH3H8O3; propanotriol - (1, 2 ,3); a , ß, ?, Trioxipropano), um
álcool polihídrico, altamente permeável, é o crioprotetor mais empregado na
congelação do sêmen de diferentes espécies (Storey et al., 1996). A sua habilidade em
transpor a membrana celular permite a desidratação da célula pela saída de água por
osmose (Hammerstedt et al ., 1990).
A concentração ótima de de qualquer agente crioprotetor depende de
diversos fatores como diluente, espécie animal e, ainda, a velocidade de congelação,
onde velocidades de congelação mais rápidas requerem baixas concentrações do
crioprotetor (England, 1993). Para a congelação do sêmen do cão, as concentrações
têm variado de 4 a 11% (v/v), dependendo da composição do diluente e do tampão
utilizado. A concentração ótima de glicerol deve permitir uma superioridade dos seus
efeitos protetores sobre os seus efeitos tóxicos (Watson, 1979). Terhaer (1993) afirma
que o espermatozóide canino é bastante tolerante ao glicerol (apud Rodrigues, 1997).
Contudo, altas concentrações podem afetar sua capacidade fertilizante (Neville et al.,
1970).
Gema de ovo
A adição de protetores de resfriamento é necessária para a preservação dos
espermatozóides durante o choque térmico, bem como durante a congelação e
descongelação (Farstad, 1996). A gema de ovo é o componente de origem biológica
mais, largamente, utilizado na composição de diluentes para o sêmen e tem sido
utilizada, rotineiramente, como protetor de resfriamento do espermatozóide canino
(Oliveira, 2003).
A interação entre os fosfolipídeos presentes no sêmen e os componentes
lipoprotéicos da gema possibilita a aderência das lipoproteínas à membrana plasmática
do espermatozóide, conferindo-lhe proteção durante a criopreservação. Além disso, a
26
gema de ovo previne a rotação da cauda do espermatozóide, favorecendo sua
motilidade (Holt, 2000b). A sua concentração requerida pode diferir de acordo com a
espécie, sendo empregada em concentrações que variam de 3 a 25% (v/v - Watson,
1979).
Açúcares
Os açúcares são incluídos nos diluentes seminais como substratos
energéticos exógenos, como componentes osmóticos e como agentes crioprotetores
(Watson, 1979). A maioria dos diluentes utilizados na criopreservação do sêmen
canino contém glicose e/ou frutose (Silva et al., 1996; Hay et al., 1997; Rota, 1998;
Chirinéa et al. 2003).
Investigações iniciais sobre o metabolismo energético do sêmen fresco de
cães incubados em glicose ou frutose, indicaram que a frutose é mais eficiente que a
glicose na obtenção de níveis energéticos (Rigau et al., 2000 apud Chirinéa, 2004 )
Aditivos
Atualmente, componentes aditivos como detergentes, antioxidantes e
aminoácidos, têm sido adicionados ao meio diluente (Oliveira, 2003). A adição de
diferentes compostos detergentes, como o Equex STM paste ou Orvus ES paste, em
diluentes de congelação parece ser benéfica para várias espécies, incluindo a canina
(Rota et al., 1997; 1999a; Holt 2000a; Peña & Linde-Forsberg, 2000a).
Espécies reativas ao oxigênio (H2O2; O2-, - OH, ROOH) e os antioxidantes
têm demonstrado um importante papel na fertilidade e na infertilidade. Algumas
27
evidências diretas ou indiretas levam a crer que em vários momentos da
criopreservação do sêmen estas espécies são formadas. O controle do nível das
espécies reativas de oxigênio pela inclusão de antioxidantes ou pelo uso de condições
que reduzam a oxidação durante a congelação tem sido descrito (Bilodeau et al.,
2001). Vários aminoácidos, entre eles a glicina, têm sido incluídos na preservação do
sêmen (Bilodeau et al., 2001). De acordo com Papa et al. (1993 apud Cunha, 2002) a
ação da glicina ainda não está totalmente esclarecida, mas sabe-se, que esse
aminoácido participa na síntese de enzimas antioxidantes (Gluthation Peroxidase),
inibindo a formação de radicais livres e, conseqüentemente, protegendo a membrana
celular da oxidação.
Antibióticos
A contaminação bacteriana pode afetar negativamente a fertilidade, pela
própria presença das bactérias, pela produção de toxinas, por degradação dos
componentes do meio, ou ainda, pela utilização de substratos metabólicos. Essa
situação determina a necessidade de incorporar aos diluentes substâncias de efeito
antimicrobiano (Watson, 1990).
A maioria dos pesquisadores da atualidade emprega a benzilpenicilina
associada à diidroestreptomicina ou estreptomicina na composição dos diluentes do
sêmen canino (Rota et al., 1999a; Peña & Linde-Forsberg, 2000b; Iguer-Ouada &
Verstegen, 2001a). Entretanto, outros antibióticos já foram utilizados, com sucesso,
como a amicacina (Chirinéa, 2004).
28
Diluentes utilizados na criopreservação de sêmen canino
A adaptação dos diluentes na preservação de espermatozóides do cão
ocorreu de forma empírica, baseando-se naqueles empregados no resfriamento e
congelação do sêmen de outras espécies (Farstad, 1996). Pesquisas foram realizadas
utilizando leite desnatado (Santos, 1997), glicina-gema (Santos, 1997; Cunha & Lopes,
2001), lactose-gema (Olar et al., 1989) e o tampão TRIS (Ström et al., 1997; Silva et
al., 2003, Silva et al., 2006).
Além disso, outros diluentes têm sido desenvolvidos por empresas. Estão
disponíveis comercialmente: o Triladyl (Minitub, Tyefenbach, Alemanha) o qual foi
testado por Nothling et al.. (1995); Laiciphos 478 e Biociphos W482 (IMV, França),
testado por Silva & Verstegen (1995); e o CLONE (Cryogenic Laboratories of New
England, Inc), utilizado por Ström et al. (1997). No estado do Ceará, já foi testado um
diluente à base de água de coco para a congelação de sêmen canino, que foi
originariamente desenvolvido para a conservação de sêmen de caprinos (Salles &
Nunes, 1992) e se mostrou eficiente para a conservação de sêmen canino (Cardoso et
al., 2003b, 2005).
A água de coco
A água proveniente do fruto do coqueiro Cocos nucifera L. (membro da
família Palmae) é uma solução estéril, ligeiramente ácida, contendo proteínas, sais,
açúcares, vitaminas, fatores de crescimento (fitormônios) e muito pouco fosfolipídeo
(Laguna, 1996). O coco verde apresenta cerca de 400 mL de água que contém
propriedades nutritivas, sendo considerada como um repositor de sais e algumas de
suas aplicações terapêuticas, é a utilização, na forma de soro oral ou intravenoso, em
29
casos de cólera, problemas intestinais e estomacais (Jayalekshmy et al., 1984, Maciel
et al., 1992 - apud Magalhães et al., 2005).
A água de coco contém ainda outros compostos que mostram atividades
semelhantes àquelas das citocininas e que são derivados das purinas (difeniluréia),
possuindo atividades biológicas consideradas excelentes para as células (Nunes &
Salgueiro, 1999). O isolamento da citocinina na água de coco foi realizado por Letham
(1974 apud Nunes & Combarnous, 1995). Depois de várias pesquisas, verificou-se que
a auxina principal era o ácido 3-indol-acético (Letham, 1974 apud Nunes
&Combarnous, 1995). Nunes & Combarnous (1995) também isolaram essa substância
na água de coco, verificando que a mesma apresentava uma ação benéfica sobre a
motilidade do sêmen de caprinos e ovinos incubado a 37 ?C.
A água de coco sofre mudanças na sua composição durante o
desenvolvimento do fruto. Além do grau de maturação, outros fatores como variedade,
região e época do ano também têm influência sobre as suas características físico-
químicas (Jayalekshmy et al., 1984, Maciel et al., 1992 - apud Magalhães et al., 2005).
Os açúcares, no início da maturação, encontram-se sob a forma de redutores (glicose e
frutose), próximo ao 6° e 7° mês, alcançando níveis máximos de 5%. Com a
maturação do fruto, a concentração de açúcares redutores diminui em até 1%, porém
são formados os não redutores (sacarose), sendo, ao final da maturação, o teor de
açúcares totais de, aproximadamente, 2% (Campos et al., 1996, Jayalekshmy et al.,
1984 - apud Magalhães et al., 2005).
A água de coco in natura proveniente de frutos com idade de seis meses
(variedade verde da praia) apresenta uma osmolaridade em torno de 500 mOsmol/L e
um pH de 4,5 a 5,0 (Nunes & Combarnous, 1995). Para uma perfeita compatibilização
da água de coco in natura como diluente para o sêmen canino, deve ser feita uma
correção da osmolaridade para 300-310 mOsmol/L e do pH para 6,2 a 6,6 (Silva,
1999). Para tal correção, após filtrar a água de coco, adiciona-se água destilada e uma
solução de citrato de sódio a 5% (Nunes, 1995).
30
A solução citada anteriormente já foi utilizada com eficiência na congelação
de sêmen canino (Cardoso et al., 2003b). Testando-se alguns outros protocolos,
observaram-se melhores resultados (aproximadamente 50% de espermatozóides
móveis) utilizando a solução citada anteriormente contendo 20% de gema de ovo e 6%
de glicerol.
Apesar da água de coco ser um diluente eficiente na conservação do sêmen
de diversas espécies, era necessário preparar a solução para cada utilização. Foi
observado que acima de dois dias, havia um aumento de osmolaridade e diminuição do
pH (dados não publicados) no diluente à base de água de coco, o que prejudicava a sua
utilização para a congelação de sêmen canino, não estando dentro dos padrões
fisiológicos para a espécie.
Devido aos excelentes resultados obtidos com os primeiros estudos com a
água de coco in natura na conservação, principalmente, de células espermáticas
realizados pelo pesquisador José Ferreira Nunes durante as décadas de 80 e 90, levou
à elaboração de um produto genuinamente nordestino, o meio de conservação à base
de água de coco em pó (ACP®). Para a produção do ACP®, inicialmente, obtém-se o
fruto (coco) numa sequência de procedimentos iniciada pela rigorosa seleção e
higienização do produto, seguida de colheita do líquido endospérmico do coco (água
de coco) sob forma asséptica. Então dese ser realizada a filtração e o líquido é
bombeado sem intermitência e de forma contínua para o sistema de secagem. A
amostra seca é transformada em pó fino e uniforme, amorfo, destituído de água livre,
com alta solubilidade (Nunes et al., 2005). A uniformidade do produto, obtida
mediante rigoroso controle de processamento, em condições específicas, leva à
manutenção dos valores agregados do endosperma líquido do coco (Nunes et al.,
2005).
Tal produto foi registrado como ACP ® (ACP Biotecnologia ®, Fortaleza -
Ceará, Brasil). A água de coco em pó, após reconstituição, foi testada para a
refrigeração do sêmen de eqüinos (Sampaio-Neto et al., 2002), e diluição para
31
inseminação artificial em caprinos (Salgueiro et al., 2002). No entanto, outras
utilizações para o ACP® estão em fase experimental como: meio diluente para vacinas
virais animais, meio de conservação e criopreservação de órgãos para transplante,
meios de cultivo de microrganismos (fungos, bactérias, vírus), protozoários e insetos,
bebidas isotônicas, repositores energéticos, alimentos funcionais, produtos nutricionais
para pacientes hospitalares, dentre outros (Nunes et al., 2005).
Métodos de avaliação da qualidade espermática
Métodos in vitro mais utilizados
A alta taxa de fertilidade é o objetivo principal quando se trabalha com
criopreservação de sêmen. Contudo, testes de fertilidade, além de apresentarem um
alto custo, têm a desvantagem de mostrar baixa confiabilidade se poucos animais são
usados (Woelders, 1991; Rota et al., 1999a). As análises in vitro têm a vantagem de
mostrar quais aspectos da função espermática estão prejudicados ou intactos, sendo
isso de especial interesse ao se trabalhar com o aprimoramento de técnicas de
preservação de sêmen, bem como para a pesquisa fundamental. Várias técnicas in vitro
têm sido descritas para a avaliação de sêmen. A combinação de diferentes métodos de
avaliação fornece um resultado mais confiável do que um único teste quando se deseja
prever a fertilidade in vivo (Ström, 1999). Entretanto, rotineiramente, usa-se o método
de avaliação clássica que inclui basicamente a análise da motilidade, vigor e
morfologia espermáticos. A seguir, serão descritos alguns dos diversos métodos que
podem ser usados para se avaliar o sucesso da criopreservação de sêmen canino.
32
Motilidade espermática
Há muito tempo, o parâmetro mais, rotineiramente, utilizado para a
avaliação do sêmen é a motilidade espermática. A proporção de espermatozóides
exibindo uma motilidade progressiva é, geralmente, estimada subjetivamente em
microscópio óptico (Cardoso et al., 2003), de contraste de fase (Peña & Linde-
Forsberg, 2000a) ou, mais objetivamente, utilizando-se a análise computadorizada
(Iguer-Ouada & Verstegen, 2001). Este parâmetro é utilizado na avaliação do sêmen
congelado-descongelado, para a verificação da proporção de espermatozóides que
mantiveram a motilidade após o processo de criopreservação (Ström, 1999). Seager &
Fletcher (1972) ressaltam que a avaliação da motilidade espermática é a observação da
porcentagem de espermatozóides móveis da amostra, a qual deve ser avaliada
imediatamente após a colheita ou descongelação do sêmen. Em seguida, pode-se
avaliar o vigor espermático, que é a qualidade da motilidade exibida pelos
espermatozóides móveis. Para tanto, faz-se uso de uma escala compreendida numa
faixa de 0 a 5, cujas classificações variam de autor para autor (Platz & Seager, 1977;
Christiansen, 1988; Johnston et al., 2001)
A avaliação da motilidade pode ser prejudicada pela concentração
espermática, fato relatado por Cardoso et al. (2005) e Garner et al. (2001), onde estes
últimos autores descrevem a dificuldade na avaliação em amostras com baixas
concentrações espermáticas. Além disso, a viscosidade nos meios de criopreservação,
principalmente, devido à gema de ovo, também prejudica a motilidade (Hirai et al.,
1997), o que pode levar a subestimar este parâmetro.
Já foi demonstrado que tanto nos ejaculados a fresco (Casey et al., 1993),
como nos congelados (Januskauskas et al., 1996), há uma proporção de
espermatozóides que são vi áveis mesmo estando imóveis, podendo adquirir motilidade
após estimulação com cafeína (Larsson et al., 1976). Portanto, a avaliação da
motilidade não pode ser usada como uma mensuração dos espermatozóides vivos e
33
mortos, mas fornece a informação de um fator que é necessário para a capacidade
fertilizante do espermatozóide, pois é a manifestação da sua competência estrutural e
funcional (Peña Martinez, 2004). Embora a motilidade esteja, geralmente,
correlacionada com integridade de membrana plasmática (Kumi-Diaka, 1993) e com a
morfologia (Ellington et al., 1993), relatos de correlações entre motilidade espermática
e fertilidade ainda são conflitantes (Kjaestad et al., 1993; Sanchez-Partida et al., 1999).
Morfologia espermática
A morfologia espermática é um parâmetro indispensável na avaliação
seminal, pois está intrínsecamente implicada a problemas na fertilidade tanto na
espécie canina como em outras espécies animais (Oettlé, 1993). No entanto, até o
momento, ainda não foi descrita a evidência de uma relação entre a morfologia
espermática e a fertilidade no cão. Os poucos trabalhos que evidenciam uma possível
relação ainda são conflitantes (Oettlé & Soley, 1985; Renton et al., 1986; Oettlé,
1993). Oettlé (1993) relata que à medida que se aumenta o percentual de
espermatozóides anormais, a fertilidade é reduzida, sendo que quando a proporção de
espermatozóides morfologicamente normais está abaixo de 60%, a fertilidade é
adversamente afetada.
Vários métodos têm sido desenvolvidos para avaliar a morfologia da célula
espermática. Esfregaços úmidos de sêmen podem ser examinados por microscopia de
contraste de fase após fixação com glutaraldeído ou tampão salina formolizada para
proteger a célula e realizar observação futura (CBRA, 1998). A morfologia também
pode ser avaliada, microscopicamente, após coloração com os corantes Wright, Rosa
de Bengala, Diff-Quik e Spermac ® (Purswell et al., 1992; Oettlé & Soley, 1985),
Giemsa (Cardoso et al., 2003b), Hematoxilina-eosina (Silva et al., 2003) e eosina-
nigrosina (Peña, 2000). Após a coloração, as células espermáticas devem ser
examinadas, preferencialmente, a uma magnificação de 1000X, sob óleo de imersão e,
34
geralmente, um mínimo de 100 células é avaliado. Existem alguns métodos de
classificação das alterações morfológicas, nos quais um deles consiste na divisão em
alterações primárias e secundárias (Johnston et al., 2001). As alterações primárias
resultam da espermatogênese anormal, causando anormalidades na cabeça
(microcefalia, macrocefalia), peça intermediária (espessa, dupla, enrugada) e cauda
(dupla). As alterações secundárias podem resultar tanto de problemas na maturação
espermática ou no manuseio da amostra seminal (temperatura inadequada, esfregaço
mal confeccionado). Da mesma forma que para as primárias, as secundárias podem
estar presentes na cabeça (destacada), peça intermediária (quebrada) e cauda (enrolada,
quebrada) (Feldman & Nelson, 1996). As alterações secundárias podem representar
uma resposta transitória ao estresse e são consideradas menos prejudiciais à fertilidade
do que as primárias. Entretanto, uma alta proporção de espermatozóides apresentando
peça-intermediária reversa ou mesmo cauda enrolada ou quebrada, irá comprometer a
motilidade e a fertilidade (Peña Martinez, 2004). Existem outros métodos de
classificação das alterações, como por exemplo, a divisão em defeitos maiores e
menores e ainda a divisão quanto à região do espermatozóide em que está situada a
alteração, ou seja, cabeça, peça intermediária e cauda. Os defeitos maiores são àqueles
que podem ter um efeito negativo maior na fertilidade, diferentemente dos menores.
Oettlé (1993) descreve a união dessas duas últimas categorias, nas quais para cada
região da célula espermática, os defeitos são agrupados em maiores e menores como
mostrados na tabela 1.
35
Tabela 1. Classificação morfológica do espermatozóide canino *
CABEÇA PEÇA
INTERMEDIÁRIA
CAUDA ACROSSSOMA
MAIORES Macrocefalia
Microcefalia
Piriforme
Cabeça dupla
Gota citoplasmática
Quebrada
Cauda dupla
Vacúolos
Distribuição
anormal
MENORES Cabeça destacada
Descondensação
nuclear
Gota citoplasmática
distal
Enrolada
Quebrada
Reação
acrossômica
Edema
* Adaptado de Oettlé (1993)
Ao se desenvolver novos protocolos para a criopreservação, uma avaliação
ultraestrutural das células espermáticas deve ser realizada para assegurar que os
ejaculados com uma alta proporção de espermatozóides morfologicamente normais
seja usada. Contudo, certas alterações estruturais não são geralmente causadas pela
preservação (Watson, 1979); dessa forma, outras análises devem ser realizadas para se
avaliar o processo de criopreservação.
Capacitação
O espermatozóide necessita sofrer uma série de reações na membrana
plasmática durante a permanência no trato genital feminino, conhecida como
capacitação, para ser capaz de fertilizar o oócito (Petrunkina et al., 2003).
Em cães, algumas substâncias têm sido descritas para a avaliação do status
de capacitação como, por exemplo, a clortetraciclina (CTC), lectinas e ainda, a
36
mensuração das características de motilidade pela análise computadorizada, sendo
indicativo de capacitação ou hiperativação (Rota et al ., 1999b).
Recentemente, o termo criocapacitação tem sido introduzido para explicar o
fato de que os procedimentos de criporeservação induzem alterações similares a da
capacitação no espermatozóide (Cormier & Bailey, 2003). Estas similaridades entre o
espermatozóide capacitado e o criopreservado consistem em alterações na
reorganização, fluidez e influxo de cálcio através da membrana plasmática (Green &
Watson, 2001). Esta criocapacitação é, em parte, responsável pela redução na
longevidade e fertilidade do espermatozóide congelado-descongelado (Peña Martínez,
2004).
Morfologia acrossomal
O acrossoma é uma vesícula contendo várias enzimas hidrolíticas incluindo
pró-acrosina, hialuronidase, esterases e hidrolases ácidas, envolvidas no processo de
fecundação (Garner & Hafez, 1995), desempenhando um papel crucial na função
espermática. Após o espermatozóide ter sofrido reação acrossômica (RA), que consiste
na fusão da membrana plasmática com a membrana acrossomal externa, ocorre a
vesiculação e liberação de enzimas acrossomais que auxiliam na penetração da zona
pelúcida (Eilts, 2005). As mudanças físicas da RA após criopreservação são
indicativas de que o espermatozóide não pode mais fertilizar, embora ainda possa estar
móvel (Eilts, 2005).
O acrossoma do espermatozóide congelado-descongelado, frequëntemente,
apresenta alterações morfológicas (Watson, 1990). Portanto, a análise acrossomal pode
ser considerada um parâmetro de grande utilidade ao se avaliar os métodos de
criopreservação.
37
A microscopia eletrônica de transmissão permite um exame detalhado do
acrossoma, mas é laboriosa e consome muito tempo. O acrossoma do espermatozóide
canino pode ser avaliado mais rapidamente e, facilmente, utilizando-se a microscopia
óptica em esfregaços corados com eosina nigrosina (Oettlé, 1986, Peña et al., 1998a),
Giemsa (Dahlbom et al., 1997) Rosa de bengala/Azul de Tripan/Marrom de Bismarck
(Talbot & Chacon, 1981) e Spermac® (Oéttle, 1993, Ström et al., 1997).
Recentemente, dois métodos têm sido desenvolvidos para avaliação
acrossomal utilizando-se microscopia de fluorescência (Peña, 1997, Hewitt &
England, 1998; Rota et al., 1999b). No primeiro método, detecta-se o material
intracelular associado ao acrossoma e, conseqüentemente, requer a permeabilização
das células antes de marcá-las. No segundo método, as células não precisam ser
permeabilizadas. Na primeira categoria, utiliza-se lectinas marcadoras, anticorpos
intracelulares, antígenos intracelulares e antígenos acrossomais. Na segunda, utiliza-se
as clortetraciclinas (CTC) e os anticorpos externos (Peña, 1997, Peña Martínez, 2004).
As lectinas mais utilizadas são: Pisum Sativum Agglutinin (PSA) e Peanut Agglutinin
(aglutinina do amendoim) (PNA), que se ligam ao conteúdo acrossomal (Rijsselaere et
al., 2005). Estas aglutininas podem ser usadas em associação com corantes
fluorescentes como Hoechst 33258 e carboxifluoresceína/iodeto de propídio
(Rijsselaere et al., 2005). A vantagem dos corantes fluorescentes consiste no fato de
não ser preciso a remoção do meio de criopreservação uma vez que não há a
interferência de glóbulos de gordura ou de outro material não corado (Peña et al.,
1998b).
Outro método já descrito para a avaliação acrossomal é a quantificação da
liberação de enzimas acrossomais, como por exemplo, a acrosina, para avaliar,
indiretamente, a integridade acrossomal do espermatozóide canino (Froman et al.,
1984). A imunoflorescência indireta usando anticorpos monoclonais e policlonais e
CTC também foi utilizada para a avaliação do status acrossomal (Brewis et al., 2001).
38
Citometria de fluxo
O uso do método de citometria de fluxo para avaliação da integridade da
membrana espermática e do acrossoma do espermatozóide canino pode facilitar o
aperfeiçoamento e desenvolvimento de novos protocolos de criopreservação e permitir
uma comparação precisa entre diferentes métodos de criopreservação, uma vez que a
citometria de fluxo permite uma análise mais acurada do que as convencionais (Peña,
2000).
A citometria de fluxo é um método objetivo e acurado para a análise de
células espermáticas utilizando corantes fluorescentes e não utilizando fixadores. Esse
método permite uma avaliação de múltiplas características, simultaneamente, na
mesma amostra por um sistema de coloração dupla ou tripla. Além disso, dados de
milhares de células podem ser obtidos num curto espaço de tempo, no qual não
somente a morfologia geral do espermatozóide canino, bem como a integridade de
organelas específicas pode ser analisada (Peña et al., 1998b). Peña et al. (2001)
observaram uma correlação alta (90%) e significativa (P< 0,001) entre a análise por
fluxo citométrico e a microscopia de fluorescência para avaliar a integridade da
membrana. Além disso, o primeiro método mostrou-se superior em determinar o
percentual de espermatozóides com acrossoma danificado, provavelmente, por analisar
um número maior de células.
A base da citometria de fluxo depende da excitação e emissão de
fluorescência das células que foram coradas com corantes fluorescentes. As células
espermáticas são carreadas num fluxo de circulação rápida por meio de raios laser que
estimulam o corante (Garner et al., 1986). A luz emitida pelas células pode ser
refletida por espelhos e as cores vermelha e verde podem ser mensuradas,
individualmente, nas células (Garner et al., 1986).
39
A citometria de fluxo aplicada ao estudo do espermatozóide canino oferece
uma vantagem significativa para a pesquisa, já que fornece informações sobre a
viabilidade e outras características celulares de forma rápida para um grande número
de células. As técnicas microscópicas para repetidas avaliações são mais laboriosas e
consomem mais tempo e, geralmente, não mais do que 200 espermatozóides são
contados (Peña et al ., 1998b).
Termorresistência (TTR)
A avaliação da longevidade dos espermatozóides in vitro pode ser realizada
pelo teste de termorresistência (TTR). A manutenção do sêmen à temperatura
semelhante à corporal mimetiza, parcialmente, a situação in vivo e, repetidas
observações da viabilidade e integridade acrossômica, durante a incubação, têm sido
realizadas para avaliar a longevidade espermática (Ström, 1999).
Uchoa et al. (2002) observaram que o sêmen canino a fresco apresenta uma
boa termorresistência, uma vez que o mesmo pode ser conservado por 180 minutos a
37?C após diluição em solução à base de água de coco. No entanto, Ström et al. (1997)
acreditam que a termorresistência pós-descongelação pode ser mais baixa para o
espermatozóide canino do que para outras espécies. Concannon e Battista (1989)
sugerem que o TTR deve ser usado mais, freqüentemente, para avaliar as técnicas de
congelação. Por outro lado, também tem sido questionado se ao avaliar-se a
capacidade fecundante do espermatozóide canino, a motilidade imediatamente após a
descongelação pode ser mais importante do que sua sobrevivência após incubação
(Olar, 1984).
Ström et al . (1997) observaram que o espermatozóide canino mesmo com
uma baixa termorresistência não tem, necessariamente, um baixo potencial fertilizante,
visto que o sêmen congelado com o método CLONE apresentou uma baixa
40
termorresistência e mostrou altos índices de fertilidade após inseminação vaginal
(59,3%) e intra-uterina (86,4%) (Govette et al., 1996). Portanto, devido aos resultados
divergentes a respeito de uma possível correlação entre o TTR e a fertilidade na
espécie canina, ainda não é possível sugerir a aplicação desse teste como um
parâmetro confiável na avaliação do sêmen canino.
Teste hiposmótico
O teste hiposmótico (THOS) avalia a integridade funcional da membrana
espermática (Spittaler & Tyler, 1985), sendo essa importante para o metabolismo
espermático. Essa análise é um teste de endosmose que determina as mudanças na
membrana espermática, onde o transporte através dessa é um processo bioquímico
importante para a viabilidade espermática e capacidade fertilizante (Jeyendran et al.,
1984).
No espermatozóide canino, o choque hiposmótico induz um progressivo
destacamento do acrossoma, cuja membrana é uma estrutura muito lábil que pode ser
alterada por processos como a congelação, descongelação, resfriamento e diluição para
inseminação artificial (Oettlé, 1986). England & Plummer (1993) verificaram existir
uma correlação negativa entre a osmolaridade e a porcentagem de espermatozóides
caninos edemaciados em soluções aquosas hiposmóticas à base de sacarose, frutose e
citrato de sódio. Além disso, esses pesquisadores demonstraram não existir correlação
entre a porcentagem de espermatozóides edemaciados e outros parâmetros seminais,
tais como a motilidade, morfologia e porcentagem entre vivos e mortos. Inamassu et
al. (1999) observaram existir no sêmen canino fresco uma correlação positiva entre a
turgidez espermática em resposta ao teste hiposmótico e a morfologia espermática. A
edemaciação em resposta ao HOST já foi positivamente correlacionada com a
motilidade espermática (Kumi-Diaka, 1993), com a motilidade e a viabilidade
(Rodríguez-Gil et al., 1994), mas não foi encontrada correlação alguma com
41
motilidade, morfologia e viabilidade por England e Plummer (1993). Uma relação
entre o HOST e a capacidade fertilizante do espermatozóide canino ainda não foi
observada.
Avaliação ultra-estrutural por microscopia eletrônica
Uma membrana plasmática intacta é um pré-requisito para a função
espermática normal, incluindo a fertilização (Ström, 1999). Durante o processo de
criopreservação, a membrana plasmática pode ser destruída pela transição de lipídios,
saída de água, estresse mecânico, soluções hipertônicas e, possivelmente, cristais de
gelo (Woelders, 1991). Entretanto, todos esses danos que o espermatozóide sofre ainda
não são bem descritos para os cães (Rodriguez-Martinez et al ., 1993).
É muito difícil detectar os danos celulares associados com a criopreservação
(Hammerstedt et al., 1990). Microanálises pelo raio-X permitem a localização
quantitativa dos elementos celulares na microscopia eletrônica (Rodriguez-Martinez &
Ekwall, 1989). A integridade da membrana plasmática e acrossoma do espermatozóide
humano congelado, avaliado pela microscopia eletrônica, tem mostrado ser
positivamente correlacionada com a fertilidade, utilizando-se a inseminação artificial
(Mahadevan & Trounson, 1984).
Utilizando esse método, Rodriguez-Martinez et al. (1993) observaram que o
espermatozóide canino descongelado apresenta um alto grau de danos acrossômicos,
incluindo perda do conteúdo, rarefação e edemaciação do acrossoma, perda de
material acrossômico eletro-denso e vesiculação da membrana acrossomal. Porém,
verificaram que o plasmalema, aparentemente, permanecia intacto na maioria dos
casos. Esses autores sugeriram que tal fato poderia ser a razão para a baixa
porcentagem de anormalidades acrossômicas normalmente notificadas quando se
utilizava a microscopia de contraste de fase.
42
Análise espermática computadorizada (CASA)
A análise espermática computadorizada (CASA) tem sido desenvolvida e
está continuamente sendo aperfeiçoada desde que foi introduzida no início dos anos 80
(Amann & Hammerstedt, 1980). Günzel-Apel et al. (1993) foram os primeiros a
descrever a análise do sêmen canino com a CASA. Posteriormente, outros autores (Ohl
et al., 1994; Rawlings et al., 1994) relataram o uso de sistemas de CASA nesta espécie.
Atualmente, a análise computadorizada é largamente utilizada em humanos e seu uso
já está sendo proposto para as espécies animais (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b) na
prática clínica e em atividades de pesquisa.
A CASA permite uma avaliação objetiva e precisa não somente sobre a
proporção de células móveis em uma amostra de sêmen, mas também sobre a
qualidade do movimento das mesmas. As trajetórias do espermatozóide são
individualmente determinadas pela função flagelar, nos quais características como
velocidade, freqüência de batimento flagelar e amplitude irão, corretamente, refletir a
condição fisiológica de cada célula (Peña, 2000). Os dados obtidos através desse
método correspondem a centenas de mensurações espermáticas individuais,
fornecendo informações sobre a qualidade média da motilidade em uma amostra de
sêmen (Günzel-apel et al., 1993) e também sobre diferentes subpopulações
espermáticas coexistindo na amostra (Peña Martínez, 2004). Foi observado que
algumas características do movimento espermático avaliadas pela CASA podem
estimar a fertilidade in vivo e in vitro em humanos e touros (Tardif et al., 1998, Larsen
et al., 2000). Contudo, estudos similares objetivando estimar a fertilidade em cães não
foram realizados.
A CASA também foi descrita para a determinação da morfometria e tem
mostrado acurácia quando a técnica é padronizada (Rijsselaere et al., 2004). Contudo,
não há informação sobre a análise morfométrica do espermatozóide canino congelado-
descongelado (Eilts, 2005).
43
Utilizando o sistema de videomicrografia Cellsoft e analisador de
movimento celular Strömberg-Mika, Günzel-Apel et al. (1993) encontraram uma
significativa correlação entre os parâmetros mensurados subjetivamente e aqueles
obtidos com o uso da CASA. O Hamilton Thorne analyzer Ivos.10 (HTR-IVOS10) é
um recente sistema de análise computadorizada proposto para avaliação de sêmen
humano ( Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b) e também está sendo utilizado em algumas
espécies animais ao redor do mundo (Farrell et al., 1995; Abaigar et al., 1999). Na
espécie canina, o HTR foi utilizado para a descrição da motilidade em ejaculados de
cães da raça Beagle (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b), mostrando uma variabilidade
abaixo de 10%. O HTR, que já foi validado para a espécie canina, representa uma
importante ferramenta para futuros estudos andrológicos. Embora todos estes
equipamentos para análise computadorizada também já tenham sido validados para a
espécie canina, ainda estão muito longe de se tornar comum na prática veterinária
devido ao alto custo dos mesmos bem como a necessidade de padronização das
técnicas (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b). No entanto, há disponível um
equipamento com um preço mais acessível, é o Analisador de qualidade espermática
(SQA), que já foi validado para a avaliação do sêmen canino criopreservado (Iguer-
Ouada ¨& Verstegen, 2001b). Este equipamento registra variações na densidade
óptica, convertendo esta informação, por cálculos matemáticos, num índice de
motilidade espermática (SMI). Este equipamento mostrou uma boa repetibilidade de
resultados em amostras seminais de boa e ótima qualidade, observando altas
correlações entre vários parâmetros seminais (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b). No
entanto, ainda não foi determinada uma correlação entre o SMI e a fertilidade in vivo
(Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b).
Testes de interação espermatozóide-oócito
Além dos testes já mencionados para a avaliação de um único parâmetro da
função espermática, há aqueles testes que avaliam múltiplos parâmetros, tais como a
44
interação oócito-espermatozóide (ligação e penetração na zona pelúcida - ZP) e a
fertilização in vitro. A ligação do espermatozóide à ZP é um evento crítico na
interação gametogênica que culmina com a fertilização do oócito (Mayenco-Aguirre &
Pérez-Cortez, 1998). Essa ligação é mediada por receptores na membrana plasmática
espermática e uma ou mais glicoproteínas da ZP (Hoodbhoy & Dean, 2004) A
habilidade de um espermatozóide de interagir corretamente com o oócito é crucial e,
dependente de vários fatores, incluindo a motilidade espermática e a fluidez da
membrana.
As análises da interação oócito–espermatozóide avaliam indiretamente
danos moleculares, que são impossíveis de serem avaliados em análises convencionais.
(Ström, 1999). Portanto, a habilidade do espermatozóide em se ligar à ZP é um teste
potencialmente valioso ao se avaliar técnicas para resfriamento e congelação-
descongelação de sêmen. Testes avaliando essa habilidade têm sido desenvolvidos
para bovinos (Fazelli et al., 1993a), eqüinos (Fazelli et al., 1993b) e suínos (Fazelli et
al., 1995).
Os testes de ligação do espermatozóide canino com a ZP podem ser
realizados utilizando-se oócitos homólogos intactos (Ström Holst et al., 2001b) ou,
ainda, bisseccionados (hemi-zona) (Mayenco-Aguirre & Pérez-Cortez, 1998). Segundo
Olar (1984), a avaliação da capacidade fecundante do espermatozóide canino
imediatamente após a descongelação seria um parâmetro mais importante do que a
simples observação da manutenção da motilidade após um período de incubação. Em
um trabalho pioneiro, Froman et al. (1984) verificaram a capacidade fecundante in
vitro de espermatozóides caninos frescos e congelados e observaram que o processo de
congelação afeta bastante a taxa de penetração em oócitos de camundongas, sendo este
talvez o motivo para as baixas taxas de fertilidade in vivo obtidas com o sêmen
congelado.
A interação espermatozóide-ooócito pode ser avaliada pela fluorescência ou
pela microscopia óptica (aceto-orceína), onde se observa a presença de cabeças
45
espermáticas ligadas à ZP ou no espaço perivitelínico e ooplasma do oócito (Hewitt &
England, 1997).
Para a realização deste teste, Hay et al. (1997) relatam que podem ser
utilizados oócitos caninos colhidos de ovários após a ovariosalpingohisterectomia, os
quais podem ser utilizados, tanto imediatamente após a cirurgia, quanto após
congelação a -18 °C, para a avaliação do sêmen congelado de cães domésticos, lobos
cinzentos (Canis lupus) e lobos vermelhos (Canis rufus). Esses autores sugerem ainda
que as amostras de sêmen que retêm a motilidade após a descongelação também retêm
o movimento progressivo, indicando que se elas sobreviverem a congelação serão
capazes de progredir. Verificaram ainda que a baixa motilidade e aumento nos danos
acrossômicos nas células espermáticas caninas após a descongelação estão
correlacionados com penetração reduzida em oócitos homólogos.
Mayenco-Aguirre & Pérez-Cortez (1998) relataram que na espécie canina, a
ligação à zona pelúcida de oócitos homólogos é, significativamente, afetada pela
concentração espermática, sendo sugestivo o uso de concentrações superiores a 1 x 106
espermatozóides capacitados e móveis/mL. Segundo esses autores, a partir dessa
concentração espermática sugerida, foi obtida uma taxa de ligação de 86%. Em adição,
Ivanova et al . (1999) observaram que diferentes cães apresentam uma variação
individual quanto à possibilidade de terem seu sêmen congelado, com conseqüente
variação na porcentagem de espermatozóides ligados à zona pelúcida. Além disso,
Ström-Holst et al. (2000) mostraram que a adição da pasta Equex STM ao diluente tem
um efeito benéfico sobre a capacidade de espermatozóides caninos descongelados em
se ligarem à zona pelúcida de oócitos homólogos.
O teste de penetração oocitária consome menos tempo do que fertilização in
vitro, visto que, não há a necessidade de maturar o oócito e somente a penetração é
avaliada e não o seu desenvolvimento (Hewitt & England, 1997). A penetração do
espermatozóide na zona e/ou ooplasma mostrou-se intimamente associada à
46
motilidade espermática (Hay et al., 1997), mas não se correlacionou com o status
acrossomal (Rodrigues et al., 2004).
Outros métodos de avaliação in vitro
No cão, assim como em outras espécies, uma avaliação objetiva do
espermatozóide pode ser realizada em muitas situações clínicas ou atividades de
pesquisa. A avaliação da motilidade é, essencialmente, subjetiva, podendo causar uma
alta variabilidade entre laboratórios ou observadores. Para controlar esta variabilidade,
várias tentativas têm sido realizadas para padronizar a análise da motilidade
espermática (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b).
Várias técnicas têm sido propostas para superar essa subjetividade e fazer
com que a análise da motilidade seja mais confiável. A turbidimetria é uma técnica
baseada na avaliação espermática pelo “swim-up”, no qual a turbidez é registrada pela
espectroscopia (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b). A espectroscopia a laser consiste
na análise do movimento espermático induzido por variações no comprimento da
onda. Contudo, se esses métodos físicos são interessantes, eles somente dão a
informação sobre as características dos espermatozóides como um todo sem descrever
os parâmetros individuais. Além disso, esses testes são de difícil realização na prática
clínica, bem como necessitam de um equipamento de alto custo (Iguer-Ouada &
Verstegen, 2001b).
Para a avaliação espermática individual, bem como da velocidade, técnicas
envolvendo o filtro de acetato/nitrato (England & Allen, 1990) e progressão no muco
cervical (Mole & Fitzgerald, 1990) têm sido propostas. No entanto, tais técnicas
consomem muito tempo e os resultados são pouco confiáveis.
47
O armazenamento de espermatozóides em um reservatório é necessário para
que ele se mantenha funcional até o momento da fertilização (England e Pacey, 1998).
Vários estudos in vivo relataram que as principais reservas espermáticas do cão estão
localizadas nas criptas uterinas e na junção útero-tubárica (Rijsselaere et al., 2004).
Testes in vitro que investiguem a interação do espermatozóide com fragmentos do
oviduto podem fornecer informações não somente sobre a fisiologia e os mecanismos
dessa ligação como também comparar a capacidade de ligação dos ejaculados
(Petrunkina et al., 2004). Apesar de vários aspectos dessa ligação já terem sido
estudados como o efeito do estágio do ciclo estral e da região do oviduto, a capacidade
de ligação do espermatozóide com explants de oviduto ainda não foi correlacionado
com a fertilidade (Petrunkina et al., 2003, 2004).
Avaliação da função espermática in vivo
Apesar de inúmeros testes in vitro, a forma mais segura de avaliar-se o
sucesso da congelação de sêmen é pelos resultados obtidos após inseminação artificial
(IA) com o sêmen descongelado. Quando novos métodos para criopreservação de
sêmen são desenvolvidos, testes de fertilidade são necessários para confirmar os
resultados das avaliações in vitro. É importante ressaltar que a fertilidade de um
ejaculado é dependente da fertilidade da fêmea (Eilts, 2005). Amann (2005) relata que
a fertilidade de um garanhão pode ser tão alta quanto 95% se a fertilidade da fêmea é
de 90% e tão baixa quanto 24% se a fertilidade da fêmea é de 25%. Para o cão, mesmo
que sua fertilidade já houvesse sido testada num grande grupo de fêmeas férteis, a sua
fertilidade não poderia ser prevista ao se utilizar um outro grupo de cadelas que
tivessem uma fertilidade diferente (Eilts, 2005).
Há outros fatores que podem influenciar o resultado das inseminações
artificiais com sêmen congelado-descongelado, tais como diferenças na qualidade e
congelabilidade dos ejaculados de diferentes cães, o número de espermatozóides
48
inseminados, momento da inseminação e o local de deposição do sêmen. Portanto, é
necessário controlar esses fatores para poder avaliar os efeitos dos diferentes métodos
de criopreservação (Eilts, 2005).
As taxas de gestação obtidas com o sêmen canino congelado têm variado
consideravelmente e são, geralmente, mais altas quando o sêmen é depositado no
útero, comparado à deposição vaginal (Concannon & Battista, 1989; Olar et al., 1989).
Entretanto, Silva (1995) descreve resultados semelhantes para a IA intrauterina e a IA
intravaginal utilizando-se a sonda de Osíris com o sêmen congelado, o que implica que
a própria metodologia de inseminação pode influenciar os resultados.
Uma vez que muitos dos parâmetros avaliados in vitro não são
correlacionados com a fertilidade, a inseminação artificial de um grande número de
fêmeas é ainda o teste mais confiável ao se comparar os métodos de preservação de
sêmen (Amann & Hammerstedt, 1993). Em cães, testes de fertilidade são difíceis de
serem realizados devido ao número limitado de cadelas disponíveis e a longa duração
do seu ciclo estral. Eilts (2005) relata que para se ter uma significância estatística, na
qual a diferença na taxa de fertilidade entre dois grupos seja de 30%, são necessárias
37 cadelas por grupo.
49
3. JUSTIFICATIVA
O interesse pela IA com sêmen congelado de cães aumentou muitos anos
depois do uso dessa biotécnica na pecuária. Tradicionalmente, o interesse dos
proprietários de cães consistia mais em evitar a reprodução do que em incrementá-la.
Entretanto, nas duas últimas décadas, a situação tem, substancialmente, mudado e a IA
com sêmen congelado tem sido um assunto de interesse mundial. Esse interesse pode
ser explicado pelo crescente valor dos cães de raça pura, bem como pelo fato da
criação de cães ter se tornado um “hobby” bastante difundido (Peña, 2000).
Apesar do crescente interesse pelo uso da IA com sêmen congelado de cães,
tal biotécnica ainda não é tão usada no manejo reprodutivo da criação de cães no
Brasil. Uma razão para o ceticismo dos criadores são os resultados insatisfatórios de
fertilidade, bem como as ninhadas pequenas. Portanto, são necessárias investigações
objetivando a melhora do potencial fertilizante do espermatozóide canino congelado
(Peña, 2000).
O sêmen canino já foi criopreservado por diversos métodos e com diferentes
diluentes. Mais recentemente, o diluente à base de água de coco foi utilizado para a
criopreservação do sêmen desta espécie (Cardoso et al., 2000, 2003b, Cardoso, 2001).
A água de coco mostra toda uma riqueza de substâncias que participam inclusive no
metabolismo de espermatozóides; sendo desenvolvido, no Nordeste do Brasil, um
diluente à base de água de coco para a conservação de sêmen de caprinos (Salles &
Nunes, 1992) e que foi adaptado para a espécie canina (Cardoso et al., 2000). Apesar
de sua eficiência como diluente, era necessário preparar uma nova solução para cada
uso. A difusão do uso da água de coco está limitada, em primeiro lugar, a inexistência
da padronização de um insumo tão importante (Nunes et al., 2005). Uma série de
fatores como variedade, tipo de cultivar, idade, sanidade e fatores ambientais
50
influenciam, substancialmente, sua composição (Nunes et al., 2005). Sua labilidade
tem dificultado os esforços de inúmeros pesquisadores, muitos deles ligados à
industrialização, de obter na prateleira, a água de coco in natura, sob forma estável e
duradoura (Nunes et al., 2005). Portanto era preciso o desenvolvimento de um método
de armazenagem da água de coco que mantivesse as mesmas características
bioquímicas que a qualificam como um bom diluente. Objetivando ainda a
comercialização do referido diluente, pesquisadores do Ceará desenvolveram a água
de coco em pó que já foi testado em outras espécies (Salgueiro et al., 2002, Sampaio
Neto et al., 2002)), mas não ainda na espécie canina.
Embora o diluente à base de água de coco padrão (ACIN) já tivesse sido
eficaz para a congelação de sêmen canino, não se conhecia a eficiência da água de
coco em pó, na qual na espécie canina recebe o nome de ACP-106®. Para verificar a
eficiência deste diluente, é necessária uma avaliação mais precisa do espermatozóide,
podendo-se ter um maior conhecimento do tipo e da extensão dos danos causados à
célula espermática pelo processo de criopreservação com ACP-106®.
Um dos principais danos causados à célula espermática são as mudanças
semelhantes à capacitação resultantes da desestabilização de membrana, tendo sido
sugerido que a prevenção ou a diminuição dessas alterações podem aumentar as taxas
de concepção (Watson, 1995). Portanto diferentes testes in vitro podem fornecer
informações importantes a respeito dessas alterações, sendo útil para o
aperfeiçoamento ou mesmo o desenvolvimento de novos métodos de criopreservação
(Watson, 1995).
Mesmo com as inúmeras vantagens das avaliações in vitro, é pela taxa de
fertilidade que se pode avaliar, definitivamente, o sucesso da criopreservação. As
análises in vitro fornecem informações das características do espermatozóide
congelado e, consequëntemente, facilitam o aperfeiçoamento das técnicas existentes,
bem como o desenvolvimento de novas. Além disso, os resultados dessas análises
podem ser utilizados para as comparações e correlações entre características in vitro e
51
teste de fertilidade, determinando quais parâmetros das avaliações in vitro podem
melhor prever os resultados in vivo (Ström, 1999).
Dessa forma, uma avaliação detalhada dos danos que o espermatozóide
sofre com a criopreservação utilizando o ACP-106® poderá ajudar no aperfeiçoamento
dessa técnica, podendo a mesma ser utilizada em escala comercial, permitindo o
armazenamento e subseqüente difusão de material genético. Além disso, esse método
de preservação de sêmen poderá, futuramente, ser estudado em espécies canídeas
ameaçadas de extinção (Wildt et al., 1995) e o conhecimento dos fatores que
interferem no sucesso da congelação de sêmen canino com um diluente à base de água
de coco poderá acelerar a adaptação dessa biotécnica para as espécies selvagens.
É importante ressaltar que o mercado pet é um dos maiores setores
financeiros da atualidade, dando-se destaque para a criação comercial de cães. Além
disso, estudos da criopreservação do sêmen proporcionam o crescimento científico da
Medicina Veterinária, levando à formação de recursos humanos. E ainda, o
desenvolvimento de um novo produto, disponível comercialmente, promoverá uma
maior geração de empregos.
52
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS
O diluente para sêmen de cães à base de água de coco em pó (ACP-106®) é
eficiente para a criopreservação de sêmen.
A concentração espermática influencia na qualidade seminal canina pós-
descongelação utilizando ACP-106®.
O armazenamento do ACP-106® a -10 °C não altera a sua eficiência como
diluente.
Utilizando diferentes análises in vitro, é possível estabelecer quais parâmetros
seminais serão mais correlacionados com os resultados das interações
espermatozóides-oócitos.
53
5. OBJETIVOS
Geral
Avaliar a eficácia de um diluente à base de água de coco em pó (ACP-106®)
na criopreservação de sêmen canino.
Específicos
Comparar a eficiência dos diluentes à base de água de coco in natura (ACIN)
e em pó (ACP-106®) na criopreservação de sêmen canino;
Comparar dois métodos de diluição na criopreservação de sêmen canino
utilizando os diluentes ACIN e ACP-106®;
Verificar o efeito do armazenamento a – 10 °C sobre a eficiência do ACP-
106®;
Investigar a influência da diluição pós-descongelação na longevidade do
sêmen canino criopreservado com ACP-106®;
Verificar a eficiência do processo de criopreservação com o ACP-106® pela
análise computadorizada, integridade de membrana e i nteração oócito-espermatozóide;
Verificar a possibilidade de se estabelecer quais parâmetros seminais são os
melhores representantes dos resultados das interações espermatozóides-oócitos;
54
Caracterizar as alterações ultra-estruturais do espermatozóide canino
criopreservado em ACP-106® pela microscopia eletrônica de transmissão.
55
6. CAPÍTULO 1
COMPARAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE DOIS MÉTODOS DE
DILUIÇÃO NA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN CANINO
UTILIZANDO OS DILUENTES À BASE DE ÁGUA DE COCO IN
NATURA (ACIN) OU EM PÓ (ACP-106®)
56
Comparison of two dilution rates on canine semen quality after
cryopreservation in a coconut water extender
Anmal Reproduction Science, artigo aceito para publicação (in press)
Efeito da diluição espermática na congelação de sêmen canino
utilizando-se a água de coco em pó (ACP-106®)
Ciência Animal, artigo submetido para publicação
Use of the powder coconut water (ACP-106®) as an alternative
extender for canine semen freezing
Animal Reproduction, artigo submetido para publicação
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Efeito da diluição espermática na congelação de sêmen canino utilizando-se a água de coco
em pó (ACP-106®) como diluidor
Effect of sperm dilution on canine semen freezing using powder coconut water (ACP-106®)
Rita de Cássia Soares Cardoso 1, Alexandre Rodrigues Silva 1, Lúcia Daniel Machado da
Silva 2
1. Doutorando (a) PPGCV/FAVET-UECE /Bolsista CAPES
2. Professor Adjunto FAVET-UECE/ Bolsista CNPq.
Laboratório de Reprodução de Carnívoros-FAVET/UECE
66
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da diluição seminal sobre a qualidade espermática
após a descongelação de sêmen canino usando a água de coco em pó (ACP® 106). Foram
coletados doze ejaculados e o sêmen foi dividido em duas alíquotas, uma para diluição 1:1 e
outra para a concentração de 200x106 espermatozóides/mL. O sêmen foi inicialmente diluído
em ACP® 106 contendo 20% de gema de ovo. Após a diluição, o sêmen foi submetido ao
resfriamento por 40 minutos em caixa térmica (15°C) e 30 minutos em refrigerador (4°C).
Posteriormente o ACP® acrescido de gema de ovo e glicerol (concentração final de 6%) foi
adicionado ao sêmen. Os ejaculados foram congelados em vapores de nitrogênio líquido e
armazenados a -196 °C. Após uma semana, o sêmen foi descongelado a 37 °C por 1 minuto e
os parâmetros microscópicos foram avaliados. Não houve efeito do método de diluição sobre
a motilidade e vigor. Após a descongelação as médias destes parâmetros foram 45,39 ±
13,91% e 3,08 ± 0,67 para o grupo diluído 1:1 e 55,0 ± 18,34% e 3,58 ± 0,47 para o grupo
diluído a uma concentração de 200x106 espermatozóides/mL, respectivamente. Também não
foi observado efeito dos métodos de diluição sobre a morfologia espermática (P>0,05)
enquanto os defeitos de cauda foram os mais observados (P<0,05). O percentual de alterações
morfológicas após a descongelação para os dois grupos foram 36,06% para a diluição 1:1 e
29,28% para a concentração fixa. Conclui-se que o ACP® 106 é eficiente para a
criopreservação de sêmen canino utilizando-se uma concentração espermática de 200 x 106
espermatozóides/mL ou a uma diluição constante (1:1) com o método de congelação e
descongelação descrito neste trabalho.
67
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the effect of sperm dilution using powder coconut water
(ACP® 106) extender on the post-thaw sperm quality. Twelve ejaculates were collected from
six dogs. Semen was divided into 2 aliquots, one for dilution 1:1 and another for
concentration of 200x106 spermatozoa/mL. Semen was initially extended with ACP® 106
containing 20% egg yolk. After dilution, semen was submitted to cooling for 70 minutes.
After this step, extender added by egg yolk and glycerol at a final concentration of 6% was
added to semen. Ejaculates were frozen in nitrogen vapors and stored at -196?C. After one
week, straws were thawed at 37?C for 1 minute and the microscopic criteria were evaluated.
The method of sperm dilution had not a significant effect on post-thaw motility and vigor.
After thawing, motility and vigor values were 55.0 ± 18.34% and 3.58 ± 0.47 for semen
diluted 1:1 and 45.39 ± 13.91% and 3.08 ± 0.67 for semen diluted at 200 x 106
spermatozoa/mL. The method of sperm dilution didn’t affect sperm morphology either
(P>0.05) and tail defects were the most observed (P<0.05). The percentage of post-thaw
sperm abnormalities was 29.2 ± 9.04 % for dilution 1:1 36.06 ± 10.82% for dilution at
200x106 spermatozoa/mL. The ACP® 106 is efficient for canine semen cryopreservation at a
constant dilution rate (1:1) or at 200x106 spermatozoa/mL using the freezing/thawing
processes described here.
Palavras-chave: ACP®, água de coco, sêmen, cão, congelação
Keywords: PCW, coconut water, sperm, dog, freezing
68
Introdução
Diversas pesquisas têm sido desenvolvidas objetivando aperfeiçoar os protocolos já existentes
para a congelação de sêmen canino através do uso de diferentes crioprotetores, processos de
congelação/descongelação e uma variedade de diluidores como o lactose, Pipes, Tes e Tris,
que é o mais utilizado para a conservação de sêmen canino (England, 1993).
Vários pesquisadores tentaram desenvolver um bom diluidor, ou seja, que apresente as
seguintes características: atoxicidade, isotonicidade, boa capacidade tamponante, bem como
praticidade, baixo custo e eficiência (Mies Filho, 1987; Fontbonne, 1993). Recentemente, foi
desenvolvida a água de coco em pó (ACP®) que já foi testada com sucesso em diferentes
espécies tais como eqüinos (Sampaio Neto et al., 2002), caprinos (Salgueiro et al., 2002) e
caninos (Cardoso et al., 2004). O ACP® foi desenvolvido devido à impossibilidade de
armazenamento da água de coco e ainda objetivando a padronização e comercialização do
referido diluidor, mesmo naquelas regiões onde o fruto não existe.
Embora a água de coco em pó já tenha sido testada com sucesso para a congelação de sêmen
canino, onde se obteve aproximadamente 60% de espermatozóides móveis após a
descongelação (Cardoso et al., 2004), ainda faz-se necessário o aperfeiçoamento deste
protocolo de congelação. Vale ressaltar que, para a espécie canina, o diluidor recebe a
denominação de ACP® 106. Utilizando-se a solução à base de água de coco (50% água de
coco in natura + 25% água destilada + 25% citrato de sódio a 5%), o sêmen canino é
comumente congelado na proporção de uma parte de sêmen para uma parte de diluidor (1:1),
não se levando em conta a concentração espermática (Cardoso et al., 2003b, Cardoso et al.,
2004). Utilizando outros diluidores, o sêmen canino já foi congelado em diferentes
concentrações espermáticas como 40 (Olar et al., 1989), 44 (Dobrinski et al., 1993), 50 (Rota
et al., 1997a), 66 (Fontbonne e Badinand, 1993), 100 (Thomas et al., 1993, Wilson, 1993,
Ström et al., 1997), 150 (Farstad e Andersen-Berg, 1989) e 200 x 106 espermatozóides/mL
(Silva e Verstegen, 1995, Silva et al., 1996). Contudo ainda há pouca informação sobre o
efeito da concentração espermática sobre a qualidade do sêmen canino pós-descongelação.
Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do ACP® 106, comparando-se um
método de diluição fixa (uma parte de sêmen:uma parte de diluidor ou 1:1) com um método
de concentração fixa (200 x106 espermatozóides/mL) na congelação de sêmen canino.
69
Material e Método
Animais experimentais
Foram utilizados seis cães: 1 American Sttafordshire Terrier, 2 Boxers, 1 Brazilian Mastiff, 1
Dobermann e 1 Rottweiler, com idade variando de 1 a 5 anos. Os animais pertenciam a canis
particulares e foram mantidos em boxes individuais. Os cães foram alimentados com ração
comercial e tinham livre acesso à água.
Coleta e avaliação de sêmen
Foram coletados dois ejaculados de cada cão através da técnica de manipulação digital
(Christiansen, 1986), utilizando-se tubos de vidro graduados acoplados a um funil e sendo
coletado o sêmen na sua forma fracionada. Os parâmetros macroscópicos (cor e volume)
foram avaliados no sêmen a fresco (fração espermática). A motilidade e o vigor (em escala de
0 a 5) foram avaliados no sêmen a fresco e após a diluição inicial, o resfriamento, a adição de
glicerol e a descongelação, utilizando-se um microscópio óptico (x100). A morfologia
espermática foi avaliada através da contagem de 200 células após coloração de um esfregaço
com eosina-nigrosina. As células foram classificadas como normal ou apresentando alterações
primárias ou secundárias. As alterações foram apresentadas de acordo com a sua localização
(cabeça, peça intermediária e cauda). Esta avaliação também foi realizada através da
microscopia óptica, em aumento de 1200x, no sêmen a fresco e congelado/descongelado. A
concentração espermática foi mensurada através de contagem em câmara de Neubauer
(Cardoso et al., 2003a).
Diluição do sêmen
Para a congelação do sêmen, foi utilizada a água de coco em pó (ACP® 106, ACP
Biotecnologia ® , Fortaleza-Ceará, Brasil), onde era composta por 1,2g de ACP® em 5,0 mL
de água ultra-pura autoclavada e 5,0 mL de solução de citrato de sódio a 1%. O diluidor
continha 20% de gema de ovo e 6% de glicerol (concentração final no diluidor).
Foram testadas duas taxas de diluição: uma parte de sêmen para uma parte de diluidor
(DILUIÇÃO) e outra a uma concentração de 200 x 106 espermatozóides/mL
(CONCENTRAÇÃO).
Após a mensuração da concentração espermática, o sêmen foi dividido em duas alíquotas. No
primeiro grupo, foi utilizada a diluição de uma parte de sêmen para uma parte de diluidor.
Para o segundo grupo, foi calculado o volume total de diluidor necessário para uma
70
concentração de 200 x 106 espermatozóides/mL . O volume total de diluidor para cada
protocolo foi dividido em duas partes (A e B). A parte “A” continha apenas o ACP® acrescido
de gema de ovo e a Parte “B”, similar a anterior, mas contendo 12% de glicerol. Após
diluição inicial e a adição de glicerol, a concentração final de glicerol no diluidor foi de 6%.
Processamento do sêmen
Após a divisão do sêmen em duas alíquotas, uma para cada protocolo a ser testado, a diluição
fixa (1:1) foi processada inicialmente na diluição de uma parte de sêmen para meia parte de
diluidor. Para o grupo com concentração espermática, o sêmen foi diluído inicialmente com
metade do volume de diluidor necessário para a concentração de 200 x 106
espermatozóides/mL. Nesta etapa, foi utilizada somente a parte A do diluidor. Após esta
diluição inicial com a parte A em temperatura ambiente (aproximadamente 27°C), as
amostras foram armazenadas em tubos de vidro e estes colocados em um recipiente com água
e acondicionados em caixa térmica com gelo reciclável (15?C) por 40 minutos. Após este
período, o sêmen foi transferido para um refrigerador até atingir 4°C (30 minutos) e a parte B
foi dividida em três partes iguais e adicionada ao sêmen em três etapas, com intervalos de
cinco minutos (Cardoso et al., 2003b).
O sêmen foi envasado em palhetas de 0,25mL, e depois dispostas horizontalmente em rampa
de congelação a uma altura de 5 cm do nível de nitrogênio líquido por cinco minutos e,
finalmente, armazenadas em nitrogênio líquido (-196 ?C). Após uma semana, as amostras
foram descongeladas em banho-maria (37?C) por um minuto e avaliadas microscopicamente
(Cardoso et al., 2003b). Foram obtidas vinte e quatro palhetas para cada método de diluição,
correspondendo a duas palhetas por réplica (n=12).
Análise estatística
Com exceção da cor, os demais parâmetros foram expressos na forma de média e desvio
padrão. Os dados de motilidade e alterações morfológicas foram transformados em arco seno.
Para avaliar o efeito da diluição espermática sobre estes parâmetros, utilizou-se o teste “t” de
Student e para o vigor, utilizou-se o teste de Mann-Whitnney. Estes mesmos testes foram
utilizados para avaliar o efeito das etapas do processo de congelação sobre os parâmetros
avaliados (P<0,05).
71
Resultados e Discussão
O sêmen a fresco (n=12) apresentou coloração branca opalescente. As características físicas
estão detalhadas na TAB. 1. Observa-se que as características físicas dos ejaculados frescos
estão de acordo com os valores considerados normais para a espécie canina (Jonhston et al.,
2001).
Foi observado um declínio significativo da motilidade e do vigor a partir do resfriamento
(TAB. 2) até a descongelação para os dois grupos, com exceção do vigor para o grupo que
utilizou a diluição 1:1, onde não se obsevou diferença entre as etapas de adição de glicerol e
descongelação. Cardoso et al. (2002) e Silva et al. (2001) também observaram este declínio
em ambos os parâmetros a partir do resfriamento e até a descongelação, utilizando diluidores
à base de água de coco e Tris, respectivamente. Além disso, não houve efeito do método de
diluição sobre a motilidade e vigor. Este resultado difere do encontrado por Peña e Linde-
Forsberg (2000) que, testando a diluição em concentrações espermáticas de 50, 100, 200 e
400 x 106 espermatozóides/mL, observou efeito da concentração espermática, encontrando
melhores resultados de motilidade progressiva imediatamente após a descongelação com 200x
106 espermatozóides/mL.
Neste trabalho somente foi testado uma diluição para uma concentração fixa de 200x 106
espermatozóides/mL e uma outra diluição a uma relação constante de 1:1 (sêmen:diluidor),
sem levar em conta a concentração espermática. Uma vez que a concentração espermática
média dos ejaculados foi de 1,6 x 109 espermatozóides/mL, para a diluição a uma
concentração de 200x 106 espermatozóides/mL foi necessário utilizar um grande volume de
diluidor. De acordo com Mann (1964), o espermatozóide dos mamíferos responde à diluição
excessiva exibindo perda de motilidade e aumento no número de espermatozóides mortos. Por
outro lado, a diluição a uma taxa cons tante, não leva em consideração a concentração
espermática, consequentemente havendo variação na quantidade de glicerol/célula. Como a
concentração espermática média foi de 1,6 x 109 espermatozóides/mL, após a diluição (1:1),
esta concentração foi de 800 x 106 espermatozóides/mL. Entretanto, é importante lembrar que
a concentração espermática variou de 530 a 2760 x 106 espermatozóides/mL. Então, após a
diluição, este parâmetro variou de 265 a 1370 x 106 espermatozóides/mL. Dessa forma, a
diluição a uma taxa constante pode levar a uma grande variação de resultados, mas esta
diluição foi escolhida, pois é comumente utilizada para a diluição não somente com a solução
72
à base de água de coco (Cardoso et al., 2003) como em outros diluidores (Silva et al., 1998;
2003) para a congelação de sêmen canino.
Colas (1975) relata que obteve melhores resultados de fertilidade com sêmen ovino, quando
este foi diluído a uma concentração constante de 900 x 106 espermatozóides/mL do que a uma
taxa constante de 1:4. Isto sugere que o nível ótimo de glicerol no sêmen diluído pode estar
relacionado à sua concentração final em relação ao espermatozóide (Colas, 1975).
Da mesma forma que para a motilidade e o vigor, não foi observado efeito do método de
diluição sobre a morfologia espermática (P>0,05), sendo os grupos similares quanto às
alterações de cabeça, peça intermediária e cauda e, ainda, quanto às alterações secundárias
(FIG. 1 e 2) e totais. Para os dois métodos de diluição, os defeitos de cauda (FIG. 1) foram os
mais observados (P<0,05). O percentual de alterações morfológicas após a descongelação
para os dois grupos (36,06% vs 29,28%) é similar aos encontrados por Cardoso et al. (2003) e
Silva et al. (2003) utilizando uma solução à base de água de coco e Tris, respectivamente.
Para a avaliação da morfologia espermática, foi realizada a coloração de eosina-nigrosina, que
não se mostrou tão eficiente. Embora ela seja classificada como uma coloração vital é difícil a
avaliação do percentual de células vivas após a descongelação, visto que se observa uma
população espermática que não se cora adequadamente, dificultando a interpretação, por isso
este parâmetro não foi mensurado. Este fato já foi observado por Peña (2004), relatando que
essa população de espermatozóides que não se cora adequadamente, poderia apresentar lesão
de membrana, mas talvez ainda fosse viável. Além disso, como não há fixação no processo de
coloração, observou-se que a vida útil da lâmina torna-se mais curta, podendo ocasionar
defeitos aos espermatozóides (principalmente de cauda) que não existiam no momento da
coloração. È importante ressaltar que só foi realizada a avaliação clássica da morfologia
espermática, sendo importante a realização de outras avaliações como, por exemplo, a do
status acrossomal.
Há ainda pouca informação a respeito do efeito da concentração espermática sobre a
congelação de sêmen canino. Estudos em outras espécies, especialmente a eqüina, sugerem
que este fator pode influenciar sobre a sobrevivência espermática pós-descongelação (Peña e
Linde-Forsberg, 2000). Palácios et al. (1992) relataram melhores resultados de motilidade
pós-descongelação quando o espermatozóide eqüino foi congelado a uma concentração de
800 x 106 espermatozóides/mL do que a 100 x106 espermatozóides/mL.
73
Usando o diluidor Tris para a congelação de sêmen canino a uma concentração de 50 x106
espermatozóides/mL, Rota et al. (1997b) obtiveram resultados similares de motilidade após a
descongelação (56,4%). Além disso, 56,5% dos espermatozóides mostraram uma membrana
intacta. Ström et al. (1997) obtiveram uma melhor motilidade após a descongelação utilizando
o diluidor Tris e o CLONE. Nesse experimento, o sêmen foi congelado a uma concentração
de 100x106 espermatozóides/mL e foi observado aproximadamente 70% de espermatozóides
móveis e 50% apresentando acrossoma normal. Silva et al (1996) utilizaram sêmen congelado
a uma concentração de 200 x 106 espermatozóides/mL e obtiveram 60% de cadelas prenhes
após inseminação intravaginal e intrauterina.
É relatado que para altas concentrações espermáticas (1000 x 106 espermatozoides/mL), a
motilidade pós-descongelação foi melhor quando uma rápida taxa de resfriamento foi
utilizada durante a congelação, ao passo que para baixas concentrações (200 x 106
espermatozóides/mL), a motilidade foi melhor quando se utilizou uma lenta taxa de
resfriamento (Parlevilet et al., 1992). Em nosso trabalho, foi utilizada uma taxa de
resfriamento moderada, explicando-se talvez o fato dela ter sido eficiente para as duas
diluições. Outros pesquisadores também utilizaram uma taxa similar a deste trabalho, mas em
concentrações espermáticas diferentes como 100 x 106 (Bueno et al., 2001), 200 x 106 (Eilts,
2003) e para uma diluição de 1:2 (Oliveira, 2003).
Conclusão
Com base nos resultados, conclui-se que o ACP® 106 foi capaz de preservar a motilidade,
vigor e morfologia espermática pós-descongelação em índices aceitáveis para a realização de
inseminação artificial, sendo efeiciente para a criopreservação de sêmen canino diluído a uma
concentração espermática final de 200 x 106 espermatozóides/mL ou a uma diluição constante
(1:1).
Embora o método de diluição a uma taxa constante seja mais prático, a utilização de uma
concentração fixa tem como vantagens a simplificação do cálculo do número de
espermatozóides por palheta e o melhor aproveitamento do ejaculado.
É importante ressaltar que o resultado deste trabalho é o primeiro passo para a padronização
de um protocolo de congelação de sêmen canino com o diluidor ACP® 106, facilitando a
futura comercialização deste diluidor para a referida espécie.
74
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Laboratório de Tecnologia de Sêmen caprino, em nome dos
Doutores José Ferreira Nunes e Cristiane Clemente de Mello Salgueiro pela concessão da
água de coco em pó (ACP® 106) e à Intervet pela água ultra-pura utilizada no preparo do
diluidor. Além disso, agradecemos ao Médico Veterinário M.Sc. Daniel Couto Uchoa (Canil
Grande Canafístula) pela utilização dos animais para a coleta de sêmen.
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77
Tabela 1. Média e desvio padrão das características físicas e morfológicas da fração
espermática dos ejaculados caninos (n=12)
Parâmetros Média ± desvio padrão
Motilidade (%) 95,25 ? 0,79
Vigor (0-5) 5,00 ? 0,00
Volume (mL) 1,18 ± 0,49
Concentração espermática
(x 106 espermatozóides/mL)
1607,50 ± 727,70
Alterações de cabeça (%) 14,56 ± 4,50
primárias 1,05 ± 1,24
secundárias 13,51 ± 4,82
Alterações de peça intermediária (%) 1,53 ± 0,94
primárias 0,40 ± 0,52
secundárias 1,13 ± 0,91
Alterações de cauda (%) 6,43± 2,95
primárias 0,10 ± 0,32
secundárias 6,33 ± 2,98
Alterações totais (%) 22,24 ± 8,54
Tabela 2. Média e desvio padrão da motilidade e vigor do sêmen canino congelado com um diluidor á base de água de coco em pó (ACP 106®) em dois métodos diferentes de diluição. Motilidade (%) Vigor (0-5)
ACP
DILUIÇÃO
ACP
CONCENT
ACP
DILUIÇÃO
ACP
CONCENT
Fresco 95,23 ± 3,63ªA 95,23 ± 3,63ªA 5,0 ± 0,0aA 5,0 ± 0,0aA
Diluição inicial 95,67 ± 4,03ªA 94,85 ± 3,91ªA 4,96 ± 0,14ªA 4,71 ± 0,40ªA
Resfriamento 91,25 ± 4,33bA 89,62 ± 4,77bA 4,58 ± 0,36bA 4,29 ± 0,45bA
Adição de glicerol 79,17 ± 10,62cA 81,15± 8,70cA 4,0 ± 0,60cA 3,75 ± 0,45cA
Descongelação 55,0 ± 18,34dA 45,39± 13,91dA 3,58 ± 0,47cA 3,08 ± 0,67dA
ACP CONCENT = ACP CONCENTRAÇÃO (concentração de 200 x 106 espermatozóides/mL);
ACP DILUIÇÃO (diluição constante de uma parte de sêmen:uma parte de diluidor ). a,b,c,d Letras
minúsculas diferentes na mesma coluna implicam em diferença significativa (P<0,05). Letras
maiúsculas diferentes na mesma linha implicam em diferença significativa entre os tratamentos.
78
0
5
10
15
20
25
Perc
entu
al (%
)
Cabeça Peçaintermediária
Cauda
ConcentraçãoDiluição
aa
aa
aa
Figura 1. Percentual de alterações morfológicas do sêmen canino congelado em
ACP-106® a uma concentração de 200 x 106 espermatozóides/mL (ACP
CONCENTRAÇÃO) e a uma diluição constante de 1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras
diferentes implicam em diferença significativa (P< 0,05) entre os métodos de
diluição.
0
10
20
30
40
Perc
entu
al (%
)
Primárias Secundárias
ConcentraçãoDiluição
a a
aa
Figura 2. Percentual de alterações morfológicas primárias e secundárias do do
sêmen canino congelado em ACP-106® a uma concentração de 200 x 106
espermatozóides/mL (ACP CONCENTRAÇÃO) e a uma diluição constante de
1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras diferentes implicam em diferença significativa (P<
0,05) entre os métodos de diluição.
79
Use of the powder coconut water (ACP-106®) as an alternative extender for canine
semen freezing
R. C. S. Cardoso1; A. R. Silva1, L. D. M. Silva1
1Laboratory of Carnivore Reproduction – PPGCV/UECE, Paranjana 1700, Itaperi, Fortaleza-
Ceará, 60740-000, Brazil.
Corresponding author: R. C. S. Cardoso: Major Weyne 662 Jardim América, 60415-730,
Fortaleza – Ceará, Brazil. Phone: + 55 85 34940856, Fax: + 55 85 31019840; E-mail address:
Article type: Biotechnology
Running title: Use of ACP-106® for canine semen freezing
80
Abstract
This study aimed to test the efficiency of powdered coconut water (ACP®) as an alternative
extender for canine semen freezing. Ejaculates from six dogs were collected by manual
stimulation and evaluated grossly and microscopically. Semen was divided into two aliquots,
one for in natura coconut water (NCW) and another for powder coconut water (ACP-106®).
Semen was initially extended with A-fraction (room temperature/27°C) at a proportion of one
part semen:half part extender (1: ½). Extenders containing 20% egg yolk was used for this
initial dilution in both groups. After dilution, the semen was cooled for 40 minutes in a
thermal box (15°C) and for 30 minutes in a refrigerator (4°C). The other half of the extender
(B-fraction) containing egg yolk and glycerol (12%) was added to semen in both groups.
Subsequently, the final concentration of glycerol in the extender was 6%. Ejaculates were
frozen in 0.25 mL straws 5 cm above the surface of liquid nitrogen and stored at -196°C.
After one week, straws were thawed at 37 °C for 1 minute and the microscopic criteria were
evaluated. Both extenders were efficient in conserving sperm motility, vigor and morphology
after freezing/thawing processes. Results showed that ACP-106® can be used as a new option
for canine semen freezing. However, further in vivo studies must be conducted to test its
efficiency.
Keywords: canine, semen, freezing, coconut water, ACP®.
81
1. Introduction
The goal of using extenders when freezing semen is to minimize the damages resulting from
the process, maximizing the recovery of viable spermatozoa. For this reason, scientific
research has been carried out in an attempt to improve different protocols for this procedure
by using different cryoprotective agents, freezing/thawing processes, and a large number of
extenders, such as lactose, Pipes, Tes and Tris, which is the most extensively used extender
for canine semen conservation (England, 1993; Silva et al., 2002,2003).
Other authors have been trying to develop alternative non-toxic, isotonic, buffering, low cost,
practical and effective extenders. Recently, it has been shown that fresh coconut water (in
natura) is an effective extender for freezing canine semen (Cardoso et al., 2003). However,
the use of this extender presents some disadvantages such as the impossibility to store the
coconut water for long periods of time and limited availability of fruits around the world.
Furthermore, biochemical constitution of one coconut can be very different from another, and
this can directly affect the ability of the solution to preserve spermatozoa. Thus, studies were
conducted aiming at developing the powdered coconut water, registered under the brand name
ACP®, and that has already been tested for goat (Salgueiro et al., 2002), stallion (Sampaio
Neto et al., 2002) and canine semen (Cardoso et al., 2004).
After reconstitution, the biochemical characteristics of ACP® are very similar to those of fresh
coconut water. The product is easily stored before use, and the powder can be readily sent to
regions where fresh coconuts are not available. In addition, the composition of this extender is
standardized, since it is obtained from fruits of the same plantation. ACP® has been approved
for different animal species, and it is registered under the number ACP-106® for dogs.
This study was conducted to compare powdered coconut water (ACP®) with fresh coconut
water-based extender, known to be effective for freezing canine semen.
82
2. Materials and methods
2.1 Animals
Six proven stud dogs from private kennels were selected for this experiment: one Brazilian
Mastiff, one Doberman, one American Staffordshire Terrier, one Rottweiler and two Boxers,
aged 1 to 6 years. The animals were kept in individual boxes and fed with dry food once
daily, with free access to water.
2.2 Semen collection and evaluation
Each dog was submitted to two seminal collections by manual stimulation. Ejaculates were
collected into a sterile glass tube connected to a funnel and fractions were separated by color
modification (Johnston et al., 2001). The sperm-rich fraction was evaluated and later
individually frozen. Semen volume and color were grossly evaluated. Sperm motility
(percentage of mobile spermatozoa) and vigor (sperm motility status), scored on a scale from
0 (without movement) to 5 (fast progressive movement), were evaluated by light microscopy
(100x) (Johnston et al., 2001). Sperm morphology was evaluated by microscopic analysis
(1000x) of a slide stained with eosin-nigrosin, counting 200 cells per slide (Johnston et al.;
2001). Sperm concentration was determined by Neubauer counting chamber (Johnston et al.,
2001). Only samples that presented a volume > 0.6 mL, concentration > 200 x 106
spermatozoa/mL, sperm motility > 80% and vigor > 4 were used in the study.
2.3. Semen extension
Semen samples were submitted to a volume:volume extension based on a proportion of one
part semen to one part extender (1:1). Initially, samples were divided into two aliquots, which
were diluted in one of the two different media to be tested. The first one was a solution based
83
on in natura coconut water (NCW – Cardoso et al., 2003), constituted by 50% coconut water,
25% ultra-pure water and 25% anhydrous monosodium citrate solution (5%). The second one
was powder coconut water (ACP® Biotecnologia, Fortaleza-Ceará, Brazil) that was prepared
according to the manufacturer's recommendation. ACP® was obtained by an atomization
process in a Spray Dryer (Salgueiro et al., 2002).
2.4. Semen freezing
Semen was frozen by adding the A-fraction of the extender to the semen at room temperature
immediately after the initial analysis. The final dilution was, therefore, one part semen: one
part extender dilution, the A-fraction was added to semen at a one part semen to a half part
extender ratio (1:0.5). A cooling period was then allowed when the semen was stored in a
sealed tube and placed in a beaker of water in a thermal box (15 °C) for 40 minutes. The
semen was then transferred to a refrigerator for a further 30 min, where it reached 4 °C. At the
end of this time period, another half part of extender containing glycerol (B-fraction) was
divided into three equal parts and added to the sample three times at 5 minutes intervals. After
this dilution, the final glycerol concentration in the extender was 6%. Sperm was packaged in
0.25 mL plastic straws and frozen in nitrogen vapor (5 cm above surface of liquid nitrogen)
before being plunged into the liquid nitrogen (-196 °C). After one week, samples were thawed
in a water bath for 1 minute at 37 °C for microscopic evaluation. Twenty four straws were
obtained for each dilution method, that is, two straws for replicate (n = 12).
2.5 Statistical analysis
The results were expressed as means and standard deviations and were analyzed using the
Statview 5.0 software (SAS Institute Inc., Cary, NY, USA). Differences among the seminal
parameters of dogs were analyzed by the Kruskal-Wallis test. Sperm motility (%) and
84
morphology (%) were transformed to arcsine. The effects of extenders on sperm motility and
morphology, as well as the effects of the incubation period on motility were evaluated by the
Student t test (P<0.05). The same effects on vigor were analyzed by the Mann-Whitney test
(P<0.05).
3. Results
Fresh canine semen has a white milky appearance. The volume of the sperm-rich fraction was
1.20 ± 0.50mL, with a sperm concentration of 1.60 ± 0.7 x 109 spermatozoa/mL. Sperm
motility was 95.25 ± 0.85%, and vigor was 5.0 ± 0.6. Morphologically normal spermatozoa
rate was 77.48 ± 5.07 %. Statistical analysis demonstrated the population of dogs was
homogeneous, since no differences were detected among the samples (P > 0.05).
Fig. 1 and 2 show similar patterns of sperm motility and vigor for the use of NCW and ACP -
106® throughout each of the evaluation stages. After thawing, a reduction in the seminal
parameters was seen for both treatments, with significant differences at each evaluation stage
(P < 0.05), except for initial dilution. Table 1 shows the evaluation of sperm morphology prior
and after freezing/thawing. A significant reduction in the proportion of morphologically
normal spermatozoa was seen after thawing for both extenders (P<0.05), but there was no
difference between them. Tail defects were the most frequently observed (P<0.05).
4. Discussion
Several protocols have been developed for canine semen freezing and researchers are always
trying to develop more practical and less expensive methods. The fresh coconut water
extender (Nunes, 1995) was proven to be effective for freezing canine semen (Cardoso et al.,
2003), but the solution could not be stored for more than two days (data not published).
85
Therefore, a powdered form of coconut water (ACP®) was developed, and has already been
tested for goat (Salgueiro et al., 2002), and stallion semen (Sampaio Neto et al., 2002). Other
studies on cryopreservation of dog semen using ACP® (Cardoso et al., 2004, Silva et al.,
2004) have also been published.
A reduction in motility and vigor was seen in both groups from cooling up to thawing, except
for vigor (P>0.05), when it was compared glycerol addition and thawing stages. Silva et al.
(2001) and Cardoso et al. (2002) reported a similar reduction in seminal parameters during
freezing the stages. Our findings agree with those of Zalewski and Andersen Berg (1983),
who found that no damage occurred during dilution.
The post-thaw sperm motility and vigor observed for both extenders were within the optimum
range for insemination (Concannon & Battista, 1989), and were similar to those reported in
previous studies using coconut water extender (Cardoso et al., 2003) and Tris (Silva et al,
2002, 2003). In addition, the percentage of normal spermatozoa after thawing was different
from fresh semen for both extenders, but the frozen-thawed semen was considered as being of
good quality (Jonhston et al., 2001). The reduction in sperm motility and vigor observed with
all extenders after thawing may also be associated to a greater incidence of detached heads
and coiled tails, because the larger the number of sperm abnormalities, the lower the sperm
motility (Morton e Bruce, 1989). Oéttle (1993) reported that normal morphology values
below 60% adversely affect fertility rates.
Burgess et al. (2001) reported decreased numbers of live spermatozoa after freeze-thawing,
with more marked significant increases in acrosomal defects after freeze-thawing than after
cooling. This finding suggests that freeze-thawing either causes immediate damage or
exacerbates the damage already caused by cooling (Burgess et al., 2001). These findings are
in agreement with those of Rodrigues-Martinez et al. (1993) and Ström Holst et al. (1998),
86
who reported that freeze-thawing changed the morphology of sperm, including swelling of the
acrosome.
Although there was no difference between ejaculates, an effect of the dog was correlated to
post-thaw sperm motility, and there was an interaction between dog and extender. The
significant effect of the dog on post-thaw sperm motility confirms the suitability of using
ejaculates from different dogs in a repeated measurement experimental design (Steel e Torrie,
1980).
A spray drier was used to produce the powdered form of coconut water. After spray-drying,
coconut water retains its functional properties and can still be used as an extender. The
product was standardized for a pH 6.6 and 300-310 mOsmol/L, ideal for canine semen
(Johnston et al., 2001). However, ACP® has the disadvantage of not allowing complete
dissolution of egg yolk in the solution, resulting in higher content of debris that could possibly
affect sperm motility (Hirai et al., 1997).
In conclusion, ACP-106® can be successfully used for freezing canine semen as an alternative
extender in locations where coconuts are not readily available. ACP® 106 is more practical to
be used for freezing canine semen when compared to NCW. In addition, further in vitro and
mainly in vivo studies are needed to prove the efficiency of ACP® 106 for the canine species.
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89
5. Acknowledgements
The authors thank Dr. José Ferreira Nunes and Dr. Cristiane Clemente de Melo Salgueiro for
providing ACP-106®, DVM DC Uchoa for providing the animals and Intervet for providing
ultra-pure water for extenders prepare. This research was supported by CNPq (Research
Nacional Council/Conselho Nacional de Pesquisa). RCS Cardoso and AR Silva are supported
by grants from CAPES, and LDM Silva by grant from CNPq.
6. List of abbreviations
ACP ® - powdered coconut water
NCW - in natura coconut water
Table 1: Sperm morphology observed in canine fresh and frozen-thawed semen
submitted to extension with fresh/ in natura coconut water (NCW) or powder coconut
water (ACP-106®)
Extenders Sperm morphology (%)
Fresh Semen NCW ACP® 106
Normal sperm 77.5 ± 5.1a 71.4 ± 6.4 b 70.7 ± 9.0 b
Head abnormalities 13.5 ± 5.3 a 10.7 ± 5.1 a 9.0 ± 5.5 a
Midpiece abnormalities 1.9 ± 1.4 a 2.8 ± 1.6 a 2.4 ± 1.9 a
Tail abnormalities 8.9 ± 4.7 a 15.2 ± 3.8 a 17.9 ± 5.7 a
Values in the same column followed by different superscripts are significantly different (P < 0.05;
Student’s t test)
90
Figure 1: Sperm motility of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool), glycerol-supplemented
(Glyc) and frozen/thawed (Thaw) semen extended with fresh/in natura (NCW) or powder
coconut water (ACP-106® - P > 0.05; Student’s t test).
Figure 2: Sperm vigor of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool), glycerol-supplemented
(Glyc) and frozen/thawed (thaw) semen extended with fresh/in natura (NCW) or powder
coconut water (ACP-106® - P > 0.05; Mann-Whitney test).
50
60
70
80
90
100
Fr Ext Cool Glyc Thaw
Evaluation stages
Sper
m m
otili
ty (%
)
NCW
ACP 106®
3
3,5
4
4,5
5
Fr Ext Cool Glyc Thaw
Evaluation stages
Sper
m v
igor
(0-
5)
NCW
ACP 106®
91
7. CAPÍTULO 2
EFEITO DO ARMAZENAMENTO A -10 °C DO DILUIDOR ACP-
106® E DA DILUIÇÃO PÓS-DESCONGELAÇÃO SOBRE A
QUALIDADE DO SÊMEN CANINO CONGELADO
(Effect of storage at –10 °C of the ACP-106® extender and post-thaw
dilution on the quality of frozen canine semen)
Ciência Rural, submetido para publicação
92
Efeito do armazenamento a –10 °C do diluidor ACP® 106 e da diluição pós-descongelação
sobre a qualidade do sêmen canino congelado
(Effect of storage at –10 °C of the ACP® 106 extender and post-thaw dilution on quality of
frozen canine semen)
Rita de Cássia Soares Cardoso1*, Alexandre Rodrigues Silva1 and Lúcia Daniel Machado da
Silva1
Resumo
O objetivo do presente estudo foi comparar a eficiência da água de coco na forma de pó (ACP
® 106) preparado no momento da congelação (grupo-não armazenado) e àquele armazenado
na forma congelada (grupo-armazenado). Além disso, objetivou-se avaliar o efeito da diluição
pós-descongelação (taxas de 1:0 e 1:4) sobre a longevidade espermática. Foram coletados dez
ejaculados oriundos de cinco animais através da manipulação digital. A fração espermática foi
inicialmente diluída à temperatura ambiente (27°C) utilizando as soluções fresca e congelada,
ambas contendo 20% de gema de ovo. Após a diluição, o sêmen foi submetido ao
resfriamento, diluído em ACP ® 106-gema de ovo-glicerol, congelado em vapores de
nitrogênio e armazenado em nitrogênio líquido (-196 °C). Após uma semana, as amostras
foram descongeladas e submetidas às avaliações de motilidade espermática progressiva,
morfologia, status acrossomal, integridade funcional de membrana (Teste hipoosmótico-
HOST) e termorresistência. Com relação à motilidadeespermática pós-descongelação, não foi
observada diferença entre os diluidores nem entre as taxas de diluição pós-descongelação,
exceto por uma maior motilidade aos 90 minutos no grupo usando ACP ® 106 armazenado e a
uma taxa de diluição 1:4. A taxa de espermatozóides e acrossomas normais (sêmen fresco e
congelado-descongelado) durante 60 minutos de incubação foi similar para os grupos não
1. Laboratory of Carnivore Reproduction, State University of Ceará, Fortaleza-Ceará, Brazil * Corresponding author: Major Weyne 662 Jardim América, 60415-730, Fortaleza – Ceará, Brazil.
93
armazenado e armazenado. Uma redução significativa (P < 0.05) na funcionalidade de
membrana espermática foi observada após a descongelação para o grupo com ACP ® 106 não
armazenado (53.6 ± 9.3%) e armazenado (53.1 ± 17.1%), mas não houve diferenças entre
eles. O armazenamento a -10 °C não diminuiu a eficiência do ACP ® 106 para a
criopreservação de sêmen canino. A diluição pós-descongelação não influencia a
sobrevivência espermática pós-descongelação, mas este procedimento melhora a avaliação da
motilidade por diminuir a viscosidade no diluidor.
Abstract
The aim of present study was to compare the efficiency of powder coconut water (ACP ® 106)
prepared at the moment of freezing (non stored group) and the one stored in a frozen form
(stored group). Moreover, this study aimed to evaluate the effect of post-thaw sperm dilution
(1:0 and 1:4 rates) on the sperm longevity. Ten ejaculates were collected from five dogs by
digital manipulation. The sperm-rich fraction was initially extended at room temperature
(27°C) using a non stored and stored solution containing 20% egg yolk. After dilution, the
semen was submitted to cooling, diluted in ACP ® 106-egg yolk-glycerol, frozen in nitrogen
vapor and stored in liquid nitrogen (-196 °C). After one week, samples were thawed and
submitted to evaluations of progressive sperm motility, morphology, acrosomal status,
functional integrity of membrane (hypoosmotic test-HOST) and thermoresistance tests.
Regarding post-thaw motility, there was no difference between extenders either post-thaw
dilution rates, except for group using stored ACP ® 106; where it was observed a higher
motility for 1:4 dilution rate at 90 minutes. Normal sperm and acrosome rates (fresh and
frozen-thawed semen) during 60 minutes incubation were similar for non-stored and stored
ACP ®106. A significant reduction (P < 0.05) in sperm membrane func tionality was found
after thawing for non-stored (53.6 ± 9.3%) and stored (53.1 ± 17.1%) ACP ®106 but no
Tel. + 55 34940856; E-mail address: [email protected]
94
differences were observed between them. The storage at –10°C did not decrease the efficiency
of ACP ®106 for canine semen cryopreservation. Post-thaw dilution did not influence the pos-
thaw survival, but this procedure improves the evaluation of sperm motility for decrease
viscosity in the extender.
Introduction
The cryopreservation of canine semen has been significantly increased since SEAGER
(1969) reported the first pregnancy using frozen dog semen. Since then, researchers tried to
develop new extenders and methods or more commonly improve the protocols used for other
species. Lactose, pipes and Tris had been used for other species and methods using this
extenders were efficient for canine semen freezing (ENGLAND, 1993; SILVA et al., 2002,
2003).
Coconut water extender had been developed for goat semen (NUNES, 1995) and it was
adapted for canine semen (CARDOSO et al., 2003, 2005). Recently, coconut water in a
powder form (ACP ®) was developed since it was impossible to storage it for more than two
days (data not published). For canine semen, powder coconut water is named ACP® 106 and
resulted in good values for post-thaw sperm motility (CARDOSO et al., 2004). However, it is
necessary to improve the protocol for ACP ® 106 in some aspects to provide a method more
practical. One of these features consists in the extender storage method since most of
extenders are stored in a frozen form. Tris, witch is one of the most used extender for canine
semen can be stored in a frozen form, being warmed at the moment of freezing (PEÑA et al
1998). Regarding ACP ®, it is prepared a fresh solution to each freezing because it is not
known the effect of freezing on ACP® efficiency.
95
Moreover, it is important to check the effect of post-thaw dilution on canine semen. This
procedure can reduce the toxic effects of glycerol and egg yolk since the thaw medium
contains additional metabolizable substrate and buffering capacity (ROTA et al., 1997, 1998).
Moreover this is a lack of information about this effect on canine semen (PEÑA AND
LINDE-FORSBERG, 2000). These authors reported that the highest post-thaw dilution rate
evaluated (1:4) resulted in a higher sperm longevity.
The aim of the present work was to compare powder coconut water (ACP ® 106)
prepared at the moment of freezing and the one stored in a frozen form. Moreover, this study
aimed to evaluate the effect of post-thaw sperm dilution at two different rates (1:0, 1:4) on the
post-thaw sperm longevity.
Material and Methods
Animals
Five proven stud Boxer dogs, aged from one to six years, from a private kennel were
selected for this experiment. The animals were maintained in individual boxes and fed dry
food once daily, with free access to water.
Extenders
ACP® 106 (ACP Biotecnologia ®, Fortaleza-Ceará, Brazil) was prepared according to
the manufacturer's recommendation. This solution was stored at -10 °C. At the moment of
freezing, it was rewarmed and for the other group, a fresh solution was prepared for each
freezing process. For both groups, the ACP® 106 solution was divided into two fractions. The
A-fraction extender consisted of stock solution containing 20% egg yolk. The B-fraction was
96
prepared from “A” but containing 12% glycerol (v/v). The pH and osmolarity of ACP®
without egg yolk and glycerol was standardized for pH 6.6 and 300mOsm/L respectively.
Semen collection and processing
Each dog was submitted to two seminal collections by manual stimulation. Ejaculates
(N=10 replicates) were frozen at a 1:1 dilution rate. After the initial analysis, the A-fraction
was added to semen at one part semen to a half part extender ratio (1:0.5) at room temperature
(27°C). A cooling period was then allowed when the semen was stored in a sealed tube and
placed in a beaker of water in a thermal box (15° C) for 40 min. The semen was then
transferred to a refrigerator for a further 30 min, where it reached 4 °C. At the end of this time
period, another half part of extender containing glycerol (B-fraction) was divided into three
equal parts and added to the sample three times at 5 min intervals. After this dilution, the final
glycerol concentration in the extender was 6%. Sperm was packaged in 0.25 mL plastic
straws and frozen in nitrogen vapor (5 cm above surface of liquid nitrogen) before being
plunged into the liquid nitrogen (-196 °C). After 1 week, samples were thawed in a water bath
for 1 min at 37 °C. Twenty straws were obtained for each group, that is, two straws for
replicate (n= 10).
Sperm dilution
After collection, two aliquots of fresh semen were diluted in non-stored and stored
ACP® 106 at a 1:4 dilution rate and kept at 37 °C in water bath for evaluation. Frozen-thawed
semen was diluted at a 1:0 and 1:4 dilution rate. For group using non-stored ACP® 106, it was
prepared a new extender and for group using the one frozen stored, it was used a rewarmed
(37°C) solution for post-thaw dilution.
97
Semen evaluation
Sperm concentration
Sperm concentration was measured by counting in a Neubauer chamber.
Sperm motility
Sperm motility (%) was assessed using light microscopy (100x magnification).
Spermatozoal longevity (thermoresistance test) was verified in fresh and frozen-thawed
semen. Semen was kept at 37 °C in water bath and motility was evaluated at 0, 30, 60, 90 e
120 minutes after dilution.
Sperm morphology and acrosomal status
Sperm cell morphology and acrosomal status were evaluated by phase-contrast microscopy
(1000x) analyzing a slide stained with Bengal Rose (RODRIGUES, 1997), counting 200 cells
per slide. Acrosome was classified as normal, detached, lost or presenting cysts, swelling or
abnormal distribution (OETTLÉ, 1993). Normal sperm rate and acrosomal status were
evaluated immediately after collection and 60 minutes pos-dilution. In frozen thawed semen,
analysis was performed immediately after thaw and after 60 min only in 1:4 diluted samples.
Hypo-osmotic swelling test (HOST)
For the evaluation of sperm membrane function, a HOST (England and Plummer,
1993) was performed for fresh and frozen-thawed semen. A hypo-osmotic solution at 150
mOsm/L, constituted by 7.35g sodium citrate plus 13.51g fructose dissolved in 1000mL
distilled water was used. After collection and immediately after thawing, 0.01mL semen was
diluted in 0.09mL hypo-osmotic solution and kept in a water bath at 37ºC. After 45 min, 200
98
spermatozoa were counted and the ones presenting swollen coiled tails were considered as
presenting a functional sperm membrane (ENGLAND AND PLUMMER, 1993).
Statistical analysis
The data were expressed as mean and standard deviation and were analyzed by the
Statview 5.0 software (SAS Institute Inc., 1998). Percentage data were subjected to arcsine
transformation.
The effects of the extender storage on progressive sperm motility, morphology,
acrosome integrity and HOST as well as the effects of post thawing dilutions and incubation
period on sperm motility and morphology were evaluated by the Student’s t test (P < 0.05).
To evaluate dog effect and their interactions with effects of the storage and post thawing
dilutions on the variables considered in the study, data were subjected to analysis of variance
followed by Fisher’s PSLD test (P < 0.05).
Presence of correlations among post thaw sperm motility and morphologically normal
spermatozoa, normal acrosomes, HOST and sperm motility at 60 and 120 min were analyzed
by Spearman’s Correlation Test (P < 0.05) only for 1:4 diluted samples using non-stored and
stored ACP ® 106.
Results
During incubation at 37 °C, motility for fresh semen was similar for both extenders (Table 1).
After thawing, there was no difference between extenders either post-thaw dilution rates,
except for group using stored ACP ® 106; where it was observed a higher motility for 1:4
dilution rate at 90 minutes (Table 1). Moreover there was a significant decline on motility
after thawing (Table 1).
99
Normal sperm and acrosome rates (fresh and frozen-thawed semen) during 60 minutes
incubation were similar for non-stored and stored ACP ®106 (Table 2 and 3). In both
extenders, there was not a significant decrease on these parameters immediately after thawing.
During post-thaw incubation at 37 °C , a significant reduction on normal sperm and acrosome
rates at 60 minutes was observed only in the group using stored ACP ® 106 (Table 2 and 3).
Moreover, there was no difference between post-thaw acrosome abnormalities rate, except for
a significant increase on absent acrosomes at 60 minutes using stored ACP ® 106 (Table 3).
Regarding HOST, 95.3 ± 2.8% sperm with functional membrane were observed in
fresh semen. A significant reduction (P < 0.05) in sperm membrane functionality was found
after thawing for both treatments, although no differences were observed between extenders.
Values of 53.6 ± 9.3% and 53.1 ± 17.1% normal functional spermatozoa were observed after
thawing for non-stored and stored ACP ® 106, respectively.
The effect of the dog was significant on post-thaw sperm normal rate but not on
normal acrosome rate. Moreover, this effect was observed on post-thaw sperm motility at 30
and 90 minutes during incubation at 37 °C. Regarding post-thaw sperm motility, there was an
interaction between dog and kind of extender (stored or non-stored) at 30 and 90 min
incubation and an interaction between the extender and dilution rate at 90 min.
Using non-stored ACP ® 106, there was a significant correlation (P<0.05) between
HOST after thawing and post-thaw normal sperm rate at 60 minutes incubation (r2=73.6%).
Furthermore, it was found a significant correlation between motility (post-thaw) at 60 min and
at 120 min for non-stored (r2=73.9%). and stored ACP ® 106 (r2=67.9%).
Discussion
This work aimed to test the effect of storage at –10 °C on efficiency of ACP ® 106 for canine
semen freezing. There was no difference between stored and non-stored extender regarding
100
post-thaw motility and morphology. However it would be of great value to make a
biochemical analysis to evaluate the effect of freezing on biochemical constitution. Moreover,
it was observed that ACP ® has the disadvantage to no permit a complete dissolution of egg
yolk in the solution, increasing the amount of debris which can affect the sperm motility
(HIRAI et al., 1997). Further studies are necessary to check the ideal concentration of egg
yolk in this extender. Nevertheless, post-thaw dilution improved the evaluation of sperm
motility.
Immediately after thaw, motility observed in this study was similar to that reported by Peña
and LINDE-FORSBERG (2000) using 1:0 and 1:4 post-thaw dilution rates but these authors
found a significant effect of this feature on progressive sperm motility immediately after
thaw. Like in the present work, these authors didn’t find differences between post-thaw
dilutions during 120 minutes incubation.
After 60 min incubation, motility in the present work was a little lower than the values
reported by ROTA et al., (1997) using a Tris-egg yolk extender. However, PEÑA AND
LINDE-FORSBERG (2000) and ROTA et al. (1997) using a Tris-egg yolk extender plus
Equex STM paste found a much better longevity post-thawing. Probably, these better results
can be influenced by use of Equex STM paste, where these authors reported that both viability
and longevity were enhanced by using this substance. The active compound in Equex STM
paste is thought to be the detergent SDS, which probably exerts its action through the
alteration of the egg yolk contained in the extender (PURSEL et al., 1978).
Post-thaw injury to spermatozoa and to other viable cells due to the abrupt removal of
glycerol is usually attributed to the occurrence of osmotic shock (FRIM AND MAZUR, 1983,
SCHNEIDER and MAZUR, 1984).This osmotic stress would be more pronounced when
thawed spermatozoa are further diluted in a glycerol- free medium because it induces an
abrupt removal of glycerol from the spermatozoa to reach the equilibrium on both sides of the
101
plasma membrane, and, therefore, cells have to accommodate new volumes changes in
addition to those suffered during the thawing. However, in this work, it was not observed a
significant effect of post-thaw dilution on sperm motility.
Although values for post-thaw motility were low after 60 minutes incubation, sperm
and acrosome normal rate were still high for stored and non-stored ACP® 106 (Table 2 and 3).
PEÑA and LINDE-FORSBERG (2000) reported that the osmotic stress after thawing can
impair the straight movement of spermatozoa but maintaining intact sperm membranes.
Probably the high acrosoma normal rate could be, in part, caused by an inefficacy of Bengal
Rose stain to evaluate acrosomal damage.
The type of injury to frozen-thawed spermatozoa is characterized by swelling and
coiling of the distal end of the sperm tail. The osmotic shock phenomenon can be used as a
measurement of sperm behavior to osmotic conditions (CORREA and ZAVOS, 1995). Since
osmotic shock involves structural changes on the sperm membrane, its functional status must
be evaluated (CORREA and ZAVOS, 1995). For data pooled across extenders (stored and
non-stored ACP® 106), the tail defects were the most observed.
In this experiment, it was evaluated the functional integrity of sperm membrane by
hypoosmotic test (HOST). During the HOS test, the biochemically active spermatozoa, when
exposed to hypoosmotic stress due to the influx of water, undergoes swelling and
subsequently increases in volume to establish an equilibrium between the fluid compartment
within the spermatozoon and the extracellular environment (JEYENDRAN et al., 1984). The
percentage of functional sperm membrane was approximately 53% for both extenders and
these values are close to values for motility immediately after thawing. Maybe, almost all of
mobile spermatozoa maintained a functional membrane after freezing- thawing process.
The present work found a correlation only between HOST after thawing and post-thaw
normal sperm rate at 60 minutes incubation using non-stored ACP® and motility (post-thaw)
102
at 60 min and at 120 min for non-stored and stored ACP ® 106. OETTLÉ (1986) observed
that motility of dog spermatozoa during cooling and after freezing does not correlate well
with acrosomal integrity.
The significant effects of dog upon the post-thaw sperm motility (30 and 90 min incubation)
and sperm normal rate confirm the suitability of using ejaculates from different dogs as
subjects in a repeated measurement experimental design (STEEL E TORRIE, 1980).
Conclusion
The storage at –10°C did not decrease the efficiency of ACP ®106 for canine semen
cryopreservation. The ACP® 106 storage in a frozen form would provide a more practical
freezing protocol. Post-thaw dilution did not influence the pos-thaw survival during
incubation at 37 °C, but this procedure improves the evaluation of sperm motility for decrease
viscosity in the extender.
Acknowledgments
The authors thank Dr. José Ferreira Nunes and Dr. Cristiane Clemente de Melo Salgueiro for
providing ACP® 106, DVM DC Uchoa for providing the animals and Intervet for providing
ultra-pure water for extenders prepare. This research was supported by CNPq (Research
Nacional Council/Conselho Nacional de Pesquisa). RCS Cardoso and AR Silva are supported
by grants from CAPES, and LDM Silva by grant from CNPq.
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105
Table 1. Sperm motility (%) of non-stored and frozen-thawed canine semen using non-stored or stored ACP ® 106 during incubation at 37 °C for
120 minutes
Fresh semen Frozen-thawed semen
Non-stored ACP ® 106 Stored ACP ® 106
Time Non-stored *
ACP ® 106
Stored *
ACP ® 106 1:0 1:4 1:0 1:4
0 94.2 ± 2.9Aa 94.2 ± 2.9Aa 59.0 ± 12.9Ba 63.0 ± 11.6Ba 58.0 ± 17,5Ba 58.5 ± 17.3Ba
30 84 ± 4.6Ab 82.0 ± 10.1Ab 37.0 ± 17.7Ba 34.0 ± 14.3Bb 37.0 ± 20,6Bb 39.6 ± 21.7Ba
60 62.0 ± 21.4Ac 64.5 ± 25.9Abc 15.0 ± 17.6Bb 13.0 ± 10.3Bc 8.7 ± 13.6Bc 18.6 ± 17.5Bb
90 30.8 ± 23.3Ad 33.3 ± 23.4Acd 6.0 ± 10.8Bc 5.5 ± 12.6Bd 0.1 ± 0.3Bd 11.1 ± 15.2ABc
120 40 ± 31.4Ad 39.0 ± 30.4Ad 1.0 ± 3.2Bc 2.6 ± 6.3Bd 0.0 ± 0.0Bd 2.0 ± 3.5Bd
* Diluted one part semen to four parts extender (1:4)
A,B Values followed by different capital letters differ between columns (P < 0.05 - Student’s t test);
a,b,c,d Values followed by different lower case letters differ between rows (P < 0.05 - Student’s t test);
106
Table 2. Sperm morphology (%) of fresh and frozen-thawed canine semen using non-stored or stored ACP ® 106 during incubation at 37 °C for 60
minutes
Fresh semen Frozen-thawed semen
Non-stored
ACP ® 106 *
Stored
ACP ® 106 *
Non-stored
ACP ® 106 *
Stored
ACP ® 106 *
0 ' 60 ' 0 ' 60 ' 0 ' 60 ' 0 ' 60 '
Normal sperm 95.0 ± 4.9 A 83.7 ± 19.4 AB 95.0 ± 4.9 A 92.1 ± 4.3 A 92.0 ± 2.9 AB 87.6 ± 6.5 B 93.7 ± 2.2 A 90.6 ± 3.4 B
Abnormalities
Head 3.0 ± 3.9 AB 2.4 ± 2.1 AB 3.0 ± 3.9 AB 3.4 ± 2.7 AB 2.0 ± 2.0 A 3.6 ± 2.2 AB 1.9 ± 1.4 A 2.4 ± 2.1 B
Midpiece 0.3 ± 0.4 A 0.6 ± 0.7 A 0.3 ± 0.4 A 0.5 ± 0.5 A 0.6 ± 0.6 A 0.2 ± 0.4 A 0.3 ± 0.3 A 0.4 ± 0.4 A
Tail 1.6 ± 1.1 A 13.0 ± 18.2 BC 1.6 ± 1.1 A 3.9 ± 2.2 B 4.9 ± 2.2 BC 8.1 ± 4.8 C 4.0 ± 2.8 B 4.5 ± 3.1BC
Total 5.0 ± 4.9 A 16.3 ± 19.4 AB 5.0 ± 4.9 A 7.9 ± 4.4 AB 8.0 ± 2.9 AB 12.4 ± 6.5 B 6.3 ± 2.2 A 9.4 ± 3.4 B
* Diluted one part semen to four parts extender (1:4)
A,B C Values followed by different capital letters differ between columns (P < 0.05 - Student’s t test).
107
Table 3. Acrosomal status (%) of frozen-thawed canine semen using non-stored or frozen-rewarmed ACP ® 106, under dilution of one part semen
to four parts extender (1:4).
Fresh semen Frozen-thawed semen
Non-stored *
ACP ® 106
Stored *
ACP ® 106
Non-stored ACP ® 106 Stored ACP ® 106
Acrosome
0 ' 60 ' 0 ' 60 ' 0 ' 60 ' 0 ' 60 '
Normal 99.7 ± 0.6 A 98.9 ± 1.8 A 99.7 ± 0.6 A 98.8 ± 1.8 A 98.77 ± 1.87A 97.50 ± 2.06AB 98.81 ± 1.09A 96.87 ± 2.28B
Absent 0.0 ± 0.0 A 0.0 ± 0.0 A 0.0 ± 0.0 A 0.1 ± 0.2 A 0.00 ± 0.00A 0.47 ± 1.31A 0.09 ± 0.18A 0.65 ± 0.54B
Swollen 0.1 ± 0.2A 0.4 ± 0.7AB 0.1 ± 0.2A 0.4 ± 0.7AB 0.20 ± 0.26AB 0.41 ± 0.32B 0.42 ± 0.59AB 0.52 ± 0.52AB
Breakaged 0.2 ± 0.6A 0.5 ± 0.9AB 0.2 ± 0.6A 0.7 ± 1.8AB 0.71 ± 1.75AB 1.19 ± 1.37B 0.54 ± 0.76AB 1.40 ± 1.68B
Cystic 0.0 ± 0.0A 0.2 ± 0.4AB 0.0 ± 0.0A 0.1 ± 0.3AB 0.33 ± 0.88AB 0.45 ± 0.79AB 0.15 ± 0.24AB 0.46 ± 0.59B
Abnormal 0.1 ± 0.3 A 0.2 ± 0.7AB 0.1 ± 0.3A 0.0 ± 0.0AB 0.00 ± 0.00AB 0.00 ± 0.00B 0.00 ± 0.00AB 0.10 ± 0.30AB
* Diluted one part semen to four parts extender (1:4)
A,B Values followed by different capital letters differ between columns (P < 0.05 - Student’s t test);
108
8. CAPÍTULO 3
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL FERTILIZANTE DE
ESPERMATOZÓIDES CANINOS CONGELADOS-
DESCONGELADOS COM ACP-106® UTILIZANDO O TESTE IN
VITRO DE INTERAÇÃO ESPERMATOZÓIDE-OÓCITO
(Evaluation of in vitro fertilizing potential of frozen-thawed dog spermatozoa
diluted in ACP-106® using an in vitro sperm-oocyte interaction assay)
Reproduction in Domestic Animals, artigo submetido para publicação
109
Evaluation of fertilizing potential of frozen-thawed dog spermatozoa diluted in
ACP® 106 using an in vitro sperm-oocyte interaction assay
Rita de Cássia S. Cardosoa, Alexandre R. Silvaa, Lúcia D. M. Silvaa, Viviane H. Chirinéab,
Fabiana F. Sousac, Maria D. Lopesb
aLaboratory of Carnivore Reproduc tion – FAVET, UECE, Paranjana 1700, Itaperi, 60740-
000, Fortaleza, Ceará, Brazil
bLaboratory of Reproduction of Small and Wild Animals – Department of Animal
Reproduction and Veterinary Radiology, FMVZ, UNESP, Distrito de Rubião Júnior, 18618-
000, Botucatu, São Paulo, Brazil.
cLaboratory of Animal Reproduction - UNIRP, Rod. BR 153, Km 69, São José do Rio Preto,
São Paulo, Brazil
Abridged title: Evaluation of frozen dog semen using a gametes interaction assay
110
Contents
The aim of present study was to evaluate frozen canine semen with ACP® 106 using
an in vitro sperm-oocyte interaction assay (SOIA). Ten ejaculates from five stud dogs were
diluted in ACP® 106 containing 20% egg yolk, submitted to cooling in a thermal box for 40
minutes and in a refrigerator for 30 minutes. After this period, a second dilution was
performed using ACP® 106 containing 20% egg yolk and 12% glycerol. Samples were thawed
at 38 °C for 1 minute. Post-thaw motility was evaluated by light microscopy and by using a
computer aided semen analysis (CASA). Plasma membrane integrity and sperm
morphology/acrosomal status were evaluated by fluorescent probes (C-FDA/PI) and Bengal
Rose, respectively. Moreover, frozen-thawed semen was analyzed by a sperm-oocyte
interaction assay. Subjective post-thaw motility was 52.0 ± 14.8% and it was significant
higher than the total motility estimated by CASA (23.0 ± 14.8%) because this system
considered the egg yolk debris as immotile spermatozoa. Although normal sperm rate and
acrosomal integrity evaluated by Bengal Rose stain was 89.6 ± 3.1 and 94.3 ± 3.1%,
respectively, post-thaw percentage of intact plasma membrane was only 35.1 ± 14.3%.
Regarding SOIA, the percentage of interacted oocytes (bound, penetrated and bound and/or
penetrated) was 75.3%. Using regression analysis, it was found significant relations between
some CASA patterns and data for SOIA. In conclusion, the freezing-thawing procedure using
ACP® 106 was efficient for maintain the in vitro fertility potential of dog spermatozoa.
111
Introduction
Despite the widespread use of conventional semen analysis under light microscopy in
which semen samples are analyzed for characteristics of motility, morphology and
concentration, the method is subjective and may be unreliable (Linford et al. 1976). The
ultimate functional test is the ability of the spermatozoon to fertilize the oocyte.
The oocyte penetration assay is a more rapid test of spermatozoal function than in
vitro fertilization since simply assesses the presence of decondensing spermatozoal heads
within the oocyte (Hewitt and England, 1997). Tests to determine the capacity of spermatozoa
to bind and penetrate intact zona pellucida or hemizonae have been applied in the canine
species (Hay et al. 1997; Mayenco-Aguirre and Pérez Cortés, 1998, Ström-Holst et al. 2001).
The results suggest that these tests are useful for evaluating canine sperm function (Ström-
Holst et al. 2001).
In vitro methods for the prediction of the fertilizing potential of a semen sample are
important both when deve loping new methods for cool storage or deep freezing of semen and
when evaluating the fertility of an individual male. Protocols for canine semen freezing had
been evaluated by sperm-oocyte interactions test (Ivanova et al. 1999, Ström Holst et al.
2000a).
Cryopreservation of canine semen using powder coconut water (ACP® 106) extender
had only been evaluated by gross evaluation and the post-thaw values for these characteristics
were acceptable for artificial insemination (Cardoso et al. 2004). ACP® 106 can be another
alternative for canine semen freezing as it presents good extender characteristics such as
atoxicity, isotonicity, buffering system and elements necessary for sperm metabolism.
However, other more accurate methods are necessary to check the efficiency of ACP® 106,
112
since a combination of tests measuring different aspects of sperm function provides
information about several different sperm characteristics required for fertilization. The
commercialization of ACP® 106 will take place earlier if its efficiency is confirmed.
The aim of present study was to evaluate the functional status of cryopreserved dog
spermatozoa that had been frozen in ACP® 106 extender by means of sperm-oocyte
interaction assay.
Material and Methods
Semen collection and evaluation of ejaculates
Semen was collected by manual stimulation twice from five dogs of different breeds (one
Brazilian Mastiff and four Boxers), aged one to six years, from a private kennel. Each dog
selected for experiment presented sperm motility of = 80%, = 20% of sperm defects, as
estimated subjectively using light microscopy (100x). Sperm concentration was measured
using a Neubauer counting chamber and should be > 200 x 106 spermatozoa/mL.
Sperm freezing
ACP® 106 (ACP Produtos Biotecnológicos®, Fortaleza-Ceará, Brazil) was prepared
according to the manufacturer's recommendation. This solution was stored at -10 °C and at
the moment of freezing, it was rewarmed. The ACP® 106 solution was divided into two
fractions. The A-fraction extender consisted of stock solution containing 20% egg yolk. The
B-fraction was prepared from “A” but containing 12% glycerol (v/v). The pH and osmolarity
of ACP® without egg yolk and glycerol was standardized for pH 6.6 and 300mOsm/L
respectively.
113
After the initial analysis, semen was initially extended in ACP® 106 (A-fraction) at
room temperature (27ºC). A cooling period was then allowed when the semen was stored in a
sealed tube and placed in a beaker full of water in a thermal box (15° C) for 40 min. The
semen was then transferred to a refrigerator for a further 30 min, where it reached 4 °C. At the
end of this time period, another part of extender containing glycerol (B-fraction) was divided
into three equal parts and added to the sample three times at 5 min intervals. After this
dilution, the final glycerol concentration in the extender was 6% and the final dilution
provided a sperm concentration of 200 x 106 spermatozoa/mL. Sperm was packaged in 0.25
mL plastic straws and frozen in nitrogen vapor (5 cm above surface of liquid nitrogen) before
being plunged into the liquid nitrogen (-196 °C). After 15 days, samples were transferred to a
dry-shipper and transported to another laboratory for further analyses. Immediately before
evaluations, samples were thawed in a water bath at 38 ºC for 1 minute.
Computer aided semen analysis (CASA)
The Hamilton-Thorne computer-aided semen analyzer, version 10 Ivos (HTR
analyzer, Hamilton-Thorne Research, Beverly, MA, USA), validated for dog semen analysis
(Iguer-Ouada and Verstegen, 2001), was used to objectively assess motility parameters. After
thawing, semen samples (10µL) were mounted on a Makler chamber and allowed to settle 1
min before the analysis at 38ºC by a phase-contrast microcopy system with stroboscopic
illumination, which was a compound of the HTR analyzer. Three different, non-consecutive,
randomly selected microscopic fields were scanned by the Ivos 10. The data were
computerized and mean ± SD values generated.
The following parameters were measured for each sample: the number of counted
cells; the percentage of total motile spermatozoa; the percentage of progressive motile
spermatozoa; velocity average pathway (VAP) - the average velocity of smoothed cell path in
114
µm/sec; the velocity straight line (VSL) - the average velocity measured in a straight line from
the beginning to the end of track in µm/sec; the curvilinear velocity (VCL) – the average
velocity measured over the actual point-to-point track followed by the cell in µm/sec; the
amplitude lateral head (ALH) – amplitude of lateral head displacement in µm; the beat cross
frequency (BCF) – frequency of sperm head crossing the sperm average path in Hertz; the
straightness (STR) – the average value of the ratio VSL/VAP in percentage (straightness
estimates the proximity of the cell path to a straight line, with 100% corresponding to the
optimal straightness); and the linearity (LIN) – the average value of the ratio VSL/VCL in
percentage (linearity estimates the proximity of the cell track to a straight line). According to
low VAP cut-off (LVV) and medium VAP cut-off (MVV), the overall sperm population was
subdivided in 4 categories: Rapid, with VAP > MVV; Medium, with (LVV < VAP < MVV);
Slow, with VAP < LVV; and Static, constituted by the fraction of all cells which are not
moving during the analysis.
Plasma membrane integrity
Sperm membrane integrity was assessed using 6-carboxy-fluorescein diacetate (C-
FDA) and propidium iodide (PI), as described by Rota et al. (1997). Thawed semen (10µL)
was diluted with staining medium (40 µL) and incubated for ten minutes. A 5 µL of stained
suspension was placed on a slide and covered with a coverslip and the fields were observed
with epifluorescence microscopy (LEICA – Episcopic Fluorescent Attachment “EFA”
Halogen Lamp Set, Sweden). For each sample stained with C-FDA/PI, 200 sperm cells were
counted and classified as having (stained in green with C-FDA and unstained with PI ) or not
(stained partial or totally in red with PI) an intact plasmalemma.
Sperm morphology
115
Sperm morphology was evaluated by phase-contrast microscopy (1000x) analyzing a
slide stained with Bengal Rose, counting 200 cells per slide. Sperm morphologic
abnormalities were classified as primary and secondary (Silva et al. in press).
Sperm-oocyte interaction assay (SOIA)
Oocyte preparation
Ovaries were obtained from 22 bitches of unknown age or cycle stage and collected
after ovariohysterectomies and transported to the laboratory in warm saline (38°C) within 2 h
of surgery. Ovaries (n=44) were dissected from the tracts in sterile saline plus gentamicine,
washed and placed in sterile 35mm gridded dishes with 10 ml Phosphate Buffer Saline (PBS)
containing 0.4% w/v bovine serum albumin (BSA). Oocytes were recovered from the ovarian
cortex by slicing finely the ovary with a scapel (#22 blade). After removal of debris, the dish
was analyzed under a stereomicroscope and Cumulus-oocyte complexes with a uniformly
dark ooplasm, an intact zona pellucida and a multilayered cumulus cell mass (Grade 1) were
selected for experiment. Selected oocytes were washed five times in PBS and transferred to
95µL droplets (10ova/droplet) of TALP containing 0.3% w/v BSA. Droplets (n=3) were
overlaid with mineral oil equilibrated with sterile saline and maintained at 38 °C for 30
minutes under humidified atmosphere containing 5% CO2 before co- incubation with sperm
(Hay et al. 1997).
Sperm preparation
Semen samples were thawed (38 °C) and evaluated for sperm motility. Spermatozoa
were washed at room temperature, suspended in TALP (1:1) and centrifuged at 700G/5min.
The supernatant was discarded and sperm pellet was adjusted at 40 x 106 motile cells/ml by
dilution in Sperm-TALP.
116
Sperm–oocyte binding and penetration assay
Sperm suspension (5µL) was added to the oocytes in each droplet of TALP to create a
final volume of 100µL, resulting in a final concentration of 2 x 106 motile sperm/ml. A
minimum of 30 oocytes (3 droplets) was used per replicate. The droplets with spermatozoa
and oocytes were incubated for 18h at 38ºC under humidified atmosphere containing 5%CO2
and 95% air. After incubation, the oocytes were washed in PBS plus BSA and transferred to
1% sodium citrate solution for 10 min at room temperature to expand cumulus cell and then
vortexed for 3 min to detach cumulus cells, aiming to facilitate the observation of
spermatozoa that had firmly bound to the zona pellucida or had penetrate the ooplasm. For
staining both bound and penetrated sperm heads, oocytes were transferred to Hoechst 33258
in 2.3% Na-citrate (100µL/mL) for 20 minutes. Stained oocytes were placed on a clean slide
and sandwiched with a coverslip supported by silicon to prevent damage to the oocytes (Hay
et al. 1997). The counts were made under fluorescent examination (LEIKA – Episcopic
Fluorescent Attachment “EFA” Halogen Lamp Set /400x, Sweden) to identify the percentage
of oocyte with spermatozoa bound to the zona pelucida, oocyte penetrated by spermatozoa
into the perivitelline space or ooplasm, and the number of spermatozoa bound plus penetrated
to the oocytes. From these data, it was calculated the percentage of oocytes bound or
penetrated by spermatozoa and the percentage of oocytes interacted to spermatozoa (bound
and/or penetrated).
Statistical analysis
Ten replicates were used in this study. Sperm cell characteristics and data for zona
pellucida binding assay were reported as means ± SD and analyzed by the Statview 5.0
software (SAS Institute Inc., Cary, 1998). A simple linear regression model was applied to
identify the correlations between sperm-oocyte interactions and sperm parameters, which
117
were considered as independent variables. A Spearman correlation test was applied to verify
correlations among results of sperm motility evaluated by light microscopy and CASA.
Probabilities < 0.05 were considered significant.
Percentage data were Arcsine transformed. Differences regarding sperm populations
and plasma membrane integrity were verified by Student’s t test (P<0.05). The existence of a
dog effect on all the parameters studied was verified by analysis of variance followed by
Fisher’s PLSD test (P<0.05).
Results
The overall characteristics of fresh semen were: 1030.3 ± 600.2 x 106 spermatozoa/mL
concentration, percentage of sperm motility ranged from 90 to 100% (97.5 ± 3.5) and the
proportion of morphologically normal spermatozoa was 92.5 ± 3.4%. There was no difference
among dogs in sperm characteristics before freezing.
Post-thaw sperm quality patterns are shown in Table 1. Sperm motility patterns were
subjectively evaluated by light microscopy (400x) and by CASA (Hamilton Thorne Analyzer
IVOS 10). Unfortunately, CASA was not so accurate for the analysis of frozen-thawed canine
semen using ACP® 106. Although the subjective motility was correlated with total motility
determined by CASA, the latter was significant lower than the first (Student’s t test, P< 0.05).
Moreover, a significant higher percentage of static sperm population was observed and this
had not observed on subjective evaluation. It was sometimes necessary to dilute the sample
with saline (1:1) because viscosity was too high and the CASA could not perform the
analysis.
Regarding plasma membrane integrity (Table 1), the percentage of non- intact
spermatozoa was significant higher than the intact ones (P = 0.01). The group of non- intact
spermatozoa included those with a damaged plasmalemma but intact acrosoma, when the
118
acrosome stained green with C-FDA but the post-acrosomal region stained red with PI, and
those that had both a damaged plasmalemma and a damaged acrosomal membrane, when the
cells remained unstained with C-FDA but stained red with PI (Rota et al. 1997). Sperm
abnormalities were represented mainly by secondary defects (damaged acrosomes and coiled
tails).
For sperm-oocyte interaction assay, 5.71 ± 2.21 ovaries were used for each replicate.
The number of oocytes obtained from each ovary ranged from 0 to 103. A total of 1247
oocytes were evaluated, from those 710 of them were Grade 1 and 30 Grade 1 oocytes were
used for each frozen-thawed semen sample. The data for SOIA are shown in figures 1 and 2.
We found significant relationships between sperm parameters and SOIA data, as
shown in Table 2. Moreover, an effect of the individual dog was observed on VAP values
(P=0.04).
Discussion
Evaluation of frozen-thawed semen with ACP® 106 by CASA presented some
problems. We believed that total and progressive motility were underestimated since we
observed a higher motility by subjective analysis. This fact can be explained in the following
way. It was observed that egg yolk is not totally dissolved when ACP® is used, increasing the
amount of debris that can be recognized by CASA as immotile spermatozoa. Hirai et al.
(1997) described the effect of the egg yolk percentage on the viscosity of extenders and
motility of spermatozoa evaluated by using a computer-assisted system. These authors
reported that any factor that changes the pattern of sperm motion could affect parameters like
the percentage of progressively motile spermatozoa. It is well established that the viscosity in
the medium surrounding the spermatozoa affects the pattern of sperm motion (Amman and
Hammerstedt, 1980). Hirai et al. (1997) demonstrated that the addition of egg yolk could alter
119
the movement pattern of spermatozoa, and increasing amounts of egg yolk in the extender
decrease the velocity of progressively motile spermatozoa in frozen-thawed bull semen.
Moreover, they reported that this increase in the amount of egg yolk did not improve the
accuracy of computer-detected false spermatozoa, which were actually egg yolk particles or
debris. Verstegen et al. (2002) suggested that the extender used to dilute semen must not
contain particles of a size similar to sperm cells’ heads (e.g., non-clarified egg yolk and whole
milk extenders), because they will not be differentiated from non-motile sperm. Others
authors, however, reported that this problem can be solved by a solved by a special software
feature that can make an identification of tail-structures in immotile spermatozoa, reducing
the number of false sperms (Hirai et al. 1997). Nevertheless, Hirai et al. (1997) used an
analysis system that is different from the one used in our study. Further studies are necessary
to determine the ideal concentration of egg yolk in ACP® 106 extender or to test methods that
can reduce or minimize the amount of egg yolk debris in the extender.
Regarding other motion patterns evaluated by CASA, we observed a high mean ALH,
which could suggest that the motile spermatozoa exhibited a hyperactivation movement, as
reported by Peña and Linde-Forsberg (2000a). VAP, VCL and VSL values were lower than
the one reported by Peña and Linde-Forsberg (2000a), possibly due the low number of motile
cells that were counted.
Our results of plasma membrane integrity after thawing (35.1%) were lower than the
one reported by Ström et al. (1997), Rota et al. (1997) and Peña and Linde-Forsberg (2000b).
Using the same fluorescent probes (C-FDA and PI), these authors found approximately 74%,
56% and 64%, respectively, of intact plasma membranes immediately post-thawing. The
plasma membrane integrity reflects sperm viability and the cryopreservation process damages
this membrane (Cormier et al. 1996, Correa et al. 1996). Cryopreservation can causes
irreversible damages to the plasma membrane and lead to cell death (Holt, 2000) or to
120
changes similar to those seen during sperm capacitation in the surviving spermatozoa,
shortening their lifetime (Pérez et al. 1996, Watson, 2000). These changes are caused by a
process named cryocapacitation (Cormier and Baley, 2003). Similarities between capacitated
and cryopreserved spermatozoa have been demonstrated regarding plasma membrane
reorganization and fluidization and calcium influx (Green and Watson, 2001). Plasma
membrane integrity and function are essential for cell viability, as the selective permeability
of the plasma membrane maintains intracellular metabolic activities, pH and ionic
composition. In the sperm cell, a functional plasma membrane is also essential for the events
leading to fusion with the oocyte (Curry and Watson, 1996). It is important to determine the
possible causes for a low percentage of intact plasma membrane. We found a high ALH that
could indicate a hyperactivation movement and this is a sperm feature indicative of
capacitation (Peña, 2004). Evidence about the involvement of reactive oxygen species (ROS)
on sperm capacitation has accumulated (Medeiros et al. 2002). An increased generation of
ROS may be a component of capacitation- like alterations observed in cryopreserved semen
(Medeiros et al. 2002). There is a substance named indol-3-acetic acid (IAA) on coconut
water (Nunes, 1995). Although its toxic effects are unknown, reactive oxygen species can be
formed after peroxidation and produce citotoxic substances (Pires de Melo et al. 1997). The
effects of ROS are prevented or diminished by the detoxifying enzymes superoxide dismutase
(SOD), catalase, peroxidases (GPx and PHGPx), and by reducing agents, such as glutathione,
ascorbic acid, taurine and hypotaurine, present in the sperm cell and sperm environment
(Hinton et al. 1995, Lapoint et al. 2000).
Regarding sperm morphology, secondary defects were observed most often, and are
considered to be less harmful to fertility than primary defects, although they represent
transient response to stress. It is obvious that a large proportion of spermatozoa with reflexed
mid-piece or coiled and bent tails will compromise motility and fertility (Peña, 2004).
121
Although the percentage of sperm membrane integrity was low (35.1%), the normal sperm
rate evaluated by Rose Bengal stain was high (89.6%), meaning that this evaluation should
not be used alone. Conventional staining methods for light microscopy are not suitable for the
assessment of cryopreserved spermatozoa because glycerol and egg yolk, essential ingredients
in most cryopreservation media for dog spermatozoa, interfere with most fixatives used in
differential staining. The use of fluorescent dyes has overcome this problem, as fluorescent
stained sperm can be used in assessing functional and morphological aspects without
interference of the extracelullar media (Peña, 2004).
The zona pellucida binding assay has been used for dog sperm evaluation (Hay et al.
1997, Ström Holst et al. 2000a,b). We used a methodology similar to Hay et al. (1997), but
we found approximately 15% of penetrated oocytes while their values were approximately
70%. However, these authors considered penetrated oocytes when spermatozoa were bound to
zona pellucida and or entered the ooplasm. When we put together the two categories in what
we called “interacted”, our results were similar to them. Ström Holst et al. (2000a) obtained
84 and 89% for oocytes with spermatozoa bound to zona pellucida after gentle and tough
washing of the sperm–oocyte complexes, respectively.
We found some significant relationships between CASA patterns and data for SOIA.
However, it is important to emphasize that total and progressive motility was underestimated
by CASA as previous reported. Thus, the use of CASA patterns (total and progressive
motility) as a predictor of sperm-oocyte interactions using frozen-thawed semen with ACP®
106 is not suitable. Nevertheless, we can consider the normal acrossome rate as a prognostic
value for the number of spermatozoa that penetrate the ZP in vitro.
Canine semen freezing using ACP® 106 was previously evaluated using only
subjective motility and gross morphology (Cardoso et al. 2004). These analyses showed that
ACP® 106 is efficient for canine semen freezing. However, damage to associated molecular
122
binding structures cannot be detected using routine morphological techniques (Ström Holst et
al. 2000a). Therefore, the ability of the spermatozoon to bind to the zona pellucida is a
potentially valuable test when evaluating techniques for chilling and freeze–thawing semen
(Ström Holst et al. 2000a). In spite of the low percentage of intact plasma membrane, good
results were obtained in the present work (75%) for sperm-oocyte interactions (oocytes
bound, penetrated and bound and/or penetrated by spermatozoa). It has been suggested that
both acrosome-intact and acrosome-reacted spermatozoa are capable of binding to the ZP in
the canine species (Kawakami et al. 1993).
In conclusion, the freezing-thawing procedure using ACP® 106 was efficient in
maintaining the in vitro fertility potential of dog spermatozoa.
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126
Table 1. Mean ± SD for the sperm quality parameters determined after freezing/thawing using
ACP® 106
Sperm quality patterns Mean ± SD Range
Subjective motility (%) 52.0 ± 14.8 30 - 70
CASA patterns
Number of counted cells (%) 1076.5 ± 442.6 516.0 – 1793.0
Total of motile sperm (%) 23.0 ± 14.8 1.0 – 43.0
Progressive motility 18.0 ± 12.2 1.0 – 37.0
VAP (µm/sec) 85.3 ± 13.1 70.1 – 107.8
VSL (µm/sec) 76.9 ± 13.6 62.3 – 100.6
VCL (µm/sec) 111.5 ± 18.5 92.6 ± 146.3
ALH (µm) 4.8 ± 0.6 3.5 – 5.7
BCF (Hertz) 20.5 ± 5.1 15.3 – 29.3
Straightness (%) 89.6 ± 2.5 86.0 – 93.0
Linearity (%) 69.8 ± 4.5 65 – 77
Fast (%) 19.3 ± 12.6 1.0 – 38.0
Medium (%) 3.7 ± 2.4 0.0 – 8.0
Slow (%) 24.3 ± 13.5 3.0 - 48.0
Static (%) 52.6 ± 27.0 11.0 – 96.0
Intact membrane rate (%) * 35.1 ± 14.3 13.0 - 60.0
Normal sperm rate (%) 89.6 ± 3.1 83.6 – 92.0
Acrosomal integrity (%) 94.3 ± 3.1 91.3 – 99.3
VAP: velocity average pathway; VSL: velocity straight line; VCL: curvilinear velocity; ALH:
amplitude lateral head; BCF: beat cross frequency; * Evaluation by epifluorescency
microscopy.
127
65.6
15.5
75.3
0102030405060708090
100
Bound Penetrated Interacted
Ooc
ytes
(%)
Figure 1. Percentage of oocytes bound, penetrated and interacted (bound and/or penetrated)
by canine spermatozoa after freezing/thawing using ACP 106® (10 replicates).
128
1.96
1.51
2.04
0
1
2
3
Bound Penetrated Interacted
Sper
mat
ozoa
per
ooc
yte
Figure 2. Number of canine spermatozoa per oocyte bound, penetrated and interacted (bound
and/or penetrated) to the zona pellucida after freezing/thawing using ACP 106® (10
replicates).
129
Table 2. Relationships between (Simple regression model) data for sperm-oocyte interaction
assay and results from different sperm parameters (independent variables)
Relations P value R value
Percentage of bound oocyte vs VCL 0.040 0.638
Percentage of penetrated oocyte vs total motility (CASA) 0.040 0.649
Percentage of penetrated oocyte vs progressive motility
(CASA)
0.048 0.636
Percentage of penetrated oocyte vs percentage of rapid
(CASA)
0.047 0.639
Number of bound spermatozoa vs VAP 0.005 0.811
Number of bound spermatozoa vs VSL 0.001 0.863
Number of bound spermatozoa vs VCL 0.004 0.817
Number of bound spermatozoa vs normal sperm rate 0.029 0.857
Number of penetrated spermatozoa vs VAP <0.001 0.911
Number of penetrated spermatozoa vs VSL 0.002 0.882
Number of penetrated spermatozoa vs VCL 0.003 0.865
Number of penetrated spermatozoa vs normal acrosome
rate
0.004 0.976
Number of interacted spermatozoa vs VAP <0.001 0.865
Number of interacted spermatozoa vs VSL <0.001 0.917
Number of interacted spermatozoa vs VCL 0.027 0.834
130
9. CAPÍTULO 4
INTEGRIDADE E MUDANÇAS ULTRA-ESTRUTURAIS NO
ESPERMATOZÓIDE CANINO FRESCO E APÓS
CRIOPRESERVAÇÃO COM ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP-
106®)
(Integrity and ultrastructural changes in fresh dog spermatozoa and after
cryopreservation with powder coconut water – ACP-106®)
131
Integrity and ultrastructural changes in dog spermatozoa after cryopreservation with powder
coconut water (ACP® 106)
Running title: Ultrastructural changes of frozen dog spermatozoa
Rita de Cássia Soares Cardoso1*, Alexandre Rodrigues Silva1, Viviane Helena Chirinéa2,
Lúcia Daniel Machado da Silva1, Maria Denise Lopes2
1Laboratory of Carnivore Reproduction – FAVET-UECE, Paranjana 1700, Itaperi, 60740-
000, Fortaleza, Ceará, Brazil
2Laboratory of Reproduction of Small and Wild Animals – Department of Animal
Reproduction and Veterinary Radiology, FMVZ, UNESP, Distrito de Rubião Júnior, 18618-
000, Botucatu, São Paulo, Brazil.
* Corresponding author: Major Weyne 662 Jardim América, 60415-730, Fortaleza – Ceará, Brazil. Tel. + 55 34940856; E-mail address: cardosorcs @yahoo.com.br
132
Abstract
The structural details of any sperm morphoanomaly or the extent of membrane damage are
best evaluated using the high resolution of transmission electron microscopy. Dog
spermatozoa has been cryopreserved with a new extender that is powder coconut water
(ACP® 106) but the fine appearance of canine spermatozoa after freezing- thawing using this
method has not been described. So, this work was aimed to characterize the ultrastructural
changes in canine spermatozoa after freezing-thawing using ACP® 106 extender. Semen from
three dogs was collected by digital manipulation. Samples were extended in ACP® 106-egg
yolk-glycerol, frozen and stored in liquid nitrogen (-196 °C). After thawing (37 °C), semen
was submitted to evaluation of acrosomal status by Bengal Rose stain, plasma membrane
integrity by fluorescent probes (C-FDA/PI) and sperm fine-structural appearance by
transmission electronic microscopy (TEM). Evaluation of acrosomal status by light
microscopy showed 7.8 % of abnormalities and the fluorescent probes revealed 67.3 % of
spermatozoa presented a non-intact plasma membrane. Regarding TEM results, the most post-
thawing changes observed on plasmalemma were swelling with plicae formation. The
ultrastructural acrosoma changes were swelling, vesiculation and loss of contents. The post-
thawing ultrastructural changes in frozen-thawed dog spermatozoa using ACP® 106 extender
were similar to previous reports where the methods presented a high fertility rate. We can
suggest that ACP® 106 might be efficient for freezing of canine semen like other extenders.
Key words: spermatozoa, dog, freezing, electronic microscopy.
133
Introduction
Automated sperm morphometric evaluation has the potential to eliminate several drawbacks
inherent to the current methods of sperm morphology evaluation, and allows for the
identification of subtle sperm characteristics that cannot be detected by visual light
microscopic evaluation. Canine sperm morphology assessment has been previously attempted
by means of scanning (SEM) and transmission electron microscopic (TEM) images [1-4].
These studies evaluated mainly the membrane and acrosomal damage that occurred following
cryopreservation, elucidating major changes in the acrosomal region after freezing and
thawing. The structural details of any sperm morphological anomaly or the extent of
membrane damage are best evaluated using the high resolution of transmission electron
microscopy [5,2].
The cryopreservation procedures currently used are known to induce a series of osmotic,
chemical and mechanical stresses to the sperm cells [6], causing not only the death of some
spermatozoa but severe latent damages in the sperm population that survives
cryopreservation, compromising the life span and fertilizing capacity of frozen-thawed
spermatozoa [7].
Dog spermatozoa have been cryopreserved with a new extender that is powder coconut water
(ACP® 106) and evaluated for motility, morphology, acrosomal status and oocyte-sperm
interaction assay (unpublished data). The protocol for this extender has been improved after
new tests were performed. Before improving the cryopreservation method, however, it is
important to understand the effects of cryoinjury on the reduction of sperm longevity after
thawing. [4].
This study was carried out in order to characterize the type and extent of ultrastructural
changes present in canine spermatozoa after freezing-thawing using ACP® 106 extender.
134
Material and Methods
Animals
Three proven stud dogs of different breeds, one Brazilian Mastiff and three Boxers,
from a private kennel were selected for this experiment. The dogs were aged from one to six
years. The animals were maintained in individual boxes and fed dry food once daily, with free
access to water.
Semen collection and freezing
Each dog was submitted to one seminal collection by manual stimulation, and the
sperm-rich fraction was used for the experiment. For sperm freezing, it was used ACP® 106
extender (ACP Biotecnologia ®, Fortaleza-Ceará, Brazil) that was prepared according to the
manufacturer's recommendation. This solution was stored at -10 °C and at the moment of
freezing, it was rewarmed. The ACP® 106 solution was divided into two fractions. The A-
fraction extender consisted of stock solution containing 20% egg yolk. The B-fraction was
prepared from “A” but containing 12% glycerol (v/v). The pH and osmolarity of ACP®
without egg yolk and glycerol was standardized for pH 6.6 and 300mOsm/L respectively.
After the initial analysis, semen was initially extended in ACP® 106 (A-fraction) at room
temperature (27ºC). A cooling period was then allowed when the semen was stored in a
sealed tube and placed in a beaker full of water in a thermal box (15° C) for 40 min. The
semen was then transferred to a refrigerator for a further 30 min, where it reached 4 °C. At the
end of this time period, another part of extender containing glycerol (B-fraction) was divided
into three equal parts and added to the sample three times at 5 min intervals. After this
dilution, the final glycerol concentration in the extender was 6% and the final dilution
provided a sperm concentration of 200 x 106 spermatozoa/mL.Sperm was packaged in 0.25
135
mL plastic straws and frozen in nitrogen vapor (5 cm above surface of liquid nitrogen) before
being plunged into the liquid nitrogen (-196 °C). After 15 days, samples were transferred to a
dry-shipper and transported to another laboratory for further analyses. Immediately before
evaluations, samples were thawed in a water bath at 37ºC/1 min.
Acrosomal status
Post-thawing acrosomal status was evaluated by phase-contrast microscopy (1000x) analyzing
a slide stained with Bengal Rose, counting 200 cells per slide. Acrosome was classified as
normal, detached, lost, presenting cysts, swelling or abnormal distribution [1].
Plasma membrane integrity
Sperm membrane integrity was assessed using 6-carboxy-fluorescein diacetate (C-FDA) and
propidium iodide (PI), as described by Rota et al.[8]. Thawed semen (10µL) was diluted with
staining medium (40 µL) and incubated for ten minutes at room temperature (23°C). A 5 µL
of stained suspension was placed on a slide and covered with a coverslip and the fields were
observed with epifluorescence microscopy (LEICA – Episcopic Fluorescent Attachment
“EFA” Halogen Lamp Set, Sweden). For each sample stained with C-FDA/PI, 200 sperm
cells were counted and classified as having (stained in green with C-FDA and unstained with
PI ) or not (stained partial or totally in red with PI) an intact plasmalemma.
Semen processing for transmission electron microscopy
Semen samples from three dogs (both fresh and frozen-thawed semen) were individually
centrifuged at 720G / 5 min. Pellets were extended with 3% glutaraldehyde in phosphate
buffer and kept at 5ºC prior to procedure. For transmission electron microscopy, fixed
samples were pooled individually for each category (fresh and frozen-thawed semen), post-
136
fixed in phosphate buffer plus osmium tetroxide (1%), in acetone solutions and embedded in
Araldite. Ultra fine sections (50nm) were obtained and stained with uranyl acetate and lead
citrate before examination by a transmission electronic microscope (Philips CM 100,
German). Spermatozoa were documented by micrographs and results were subjectively
described.
Results
In fresh samples, most spermatozoa presented a normal appearance (Fig. 1a) but the plasma
membrane was often ballooning and had plicae (Fig. 1b). The electron-microscopic
examination showed that the spermatozoa subjected to freezing- thawing with ACP® 106
presented great changes in their morphology, when compared to fresh semen.
After freezing-thawing, the changes observed most often on plasmalemma were swelling with
plicae formation (Fig 2.a) and, in most cases, remained apparently intact. Other changes
observed were vesiculation (Fig. 2 b-c) and disruption. Regarding the morphological changes
in the acrosome, TEM showed swelling (Fig. 2a, 3b), vesiculation (Fig. 2a) and loss of
electron-dense acrosomal material (Fig. 3a-b). An acrosomal defect commonly observed was
undulated contour (Fig. 2c).
Regarding plasma membrane integrity, it was observed a high rate of non- intact sperm plasma
membrane (67.3 %). Evaluation by Bengal Rose stain revealed 7.8% of acrossomal
abnormalities.
Discussion
An intact plasma membrane (PM) is a prerequisite for normal sperm function
including fertilization [9]. During the cryopreservation process, sperm membranes are
137
considered as the principal sites of damage associated with temperature changes [6,7]. The
integrity of sperm plasma membrane can be evaluated by hyposmotic test [10], fluorescent
probes [11], and scanning and transmission electron microscopy [3]. Although the
transmission electron microscopy (TEM) is labor intensive and time consuming, it can also
allow detailed examination of the acrosomal status. Bacetti et al. [12] reported that the study
of spermatozoon alterations in cases of human infertility has demonstrated that electron
microscopy can be a valuable tool in understanding not only the presence but also the nature
of the defects.
With regards to the integrity of the plasma membrane, most spermatozoa appeared to
have an intact membrane in spite of the swelling. According to Hurtgen and Johnson [13],
undulating plasma membranes and undulant acrosomes were also a regular acrosomal pattern
in fertile stallions, suggesting that these deviations are more due to fixation procedures than to
freezing procedures. Chirinéa et al. [14] reported the occurrence of slightly swollen
plasmalemma above the acrosomal region observed in fresh canine spermatozoa, and
explained that this is a consequence of the semen sample being exposed to glutaraldehyde
during fixation procedure for TEM. Moreover, canine spermatozoa suffer several alterations
in head region after cryopreservation, but plasmalemma seems to be intact
The most important changes after freezing-thawing are related to acrosomal status.
Although this experiment did not quantify the abnormalities, the main acrosomal defects were
swelling, vesiculation and loss of acrosomal contents. These defects are called capacitation-
like changes [15] and could be a result of acrosome reaction [16]. In fact, Rodriguez-Martinez
et al. [2] suggested that the alterations found in the fine structural appearance of canine frozen
semen could be interpreted as a false acrosomal reaction. The physical change of the
acrosome reaction after cryopreservation is an indication that the cell cannot fertilize, even
though it may be motile [16]. Similarities between capacitated and cryopreserved
138
spermatozoa have been demonstrated regarding plasma membrane reorganization and
fluidization and calcium influx [17].
Physiologically, some features can induce acrosome reaction such as intracellular
calcium [18], pH [19], inositol triphosphate [20] and dyacilglycerol [21]. Thus, glycerol might
be an important feature of the cryopreservation procedures leading to changes in acrosome.
Such changes were previously reported for frozen dog spermatozoa [2, 3]. Ström Holst
et al. [3] found 89% of swollen acrosomes after freezing- thawing using the CLONE method.
Since insemination with spermatozoa that was cryopreserved by this method resulted in high
whelping rates, it was suggested that swelling of the acrosoma does not impair fertilization.
For frozen-thawed spermatozoa with ACP® 106, we can suggest the same explanation since
the defects were similar. Moreover, evaluation of frozen-thawed spermatozoa with ACP® 106
by oocyte-sperm interaction assay (unpublished data) showed 75% of oocyte-sperm
interactions (oocyte bound, penetrated and bound plus penetrated by spermatozoa These
acrosomal defects do not impair fertilization, at least in vitro. Since acrosomal swelling might
short the cells life span, it is important to detect the ideal moment to perform artificial
insemination [22].
Although most of frozen-thawed spermatozoa presented acrosomal defects, evaluation
by phase contrast microscopy showed only 7.8 % of acrosomal defects, which has been
discussed by Rodriguez-Martinez et al. [2]. The intact membrane might account for low
percentages of acrosomal abnormalities usually reported when using phase contrast
microscopy alone. Nevertheless, evaluation by fluorescent probes (C-FDA/PI) was more
efficient and showed 67.3 % of non- intact membranes.
In addition, changes in mid-piece were still observed, as plasmalemma swelling and
damages in mitochondrial sheath like content disorganization. Burgess et al. [4] reported a
139
slight but not significant increase in the number of spermatozoa with damaged mid-piece
membranes after 4 h post-thaw incubation.
As reported previously, TEM was a valuable tool in performing a deep analysis of
spermatozoa since evaluation by phase contrast was not efficient in making a reliable analysis
of the acrosoma. Other authors reported a series of changes after freezing-thawing procedures
using different extenders. It was not different for ACP® 106 and the changes found were
similar to those reported in previous studies. Thus, we can suggest that ACP® 106 might be
efficient for freezing canine semen like other extenders. However, further in vivo studies are
necessary to confirm this hypothesis. Since many spermatozoa presenting acrosomal defects
were found, investigations have to be carried out to further improve this protocol.
Acknowledgements
The authors thank Dr. José Ferreira Nunes and Dr. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro for
providing ACP® 106, DVM DC Uchoa for providing the animals and Intervet for providing
ultra-pure water for extenders prepare. This research was supported by CNPq (Research
Nacional Council/Conselho Nacional de Pesquisa). RCS Cardoso and AR Silva are supported
by grants from CAPES, and LDM Silva by grant from CNPq.
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142
Figure 1. Transmission electron micrographs of fresh dog spermatozoa. N: nucleus; A:
acrosoma. (a) Fresh spermatozoa presenting an intact acrosome and a plasmalemma in close
apposition with the acrosome (arrow). Magnification 1950X. (b) Spermatozoon presenting a
swollen plasmalemma but with an intact acrosoma. Magnification 8400X.
(a) (b) A
N
143
Figure 2. Transmission electron micrograph of dog spermatozoa after cryopreservation with
ACP® 106. A: acrosoma; N: nucleus; E: equatorial region. (a) Spermatozoon with a swollen
intact plasma membrane with plicae (arrows). The acrosoma is swollen with an undulated
contour (white arrow head) and vesiculation (black arrow head). The equatorial region is
swollen. Magnification 8400X. (b) Vesiculated plasma membrane (arrows) and releasing of
acrosomal contents (arrow heads). Magnification 11500X. (c) Swollen plasma membrane
(black arrow) with areas of vesiculation (white arrow). Outer acrosoma membrane presents
areas of vesiculation (arrow heads). Equatorial region is intact. Magnification 8400X.
(a) (b)
(c)
E
A A
N
N N
A
E
E
144
Figure 3. Transmission electron micrograph of dog spermatozoa after cryopreservation with
ACP® 106. A: acrosoma; N: nucleus; E: equatorial region; PM: plasma membrane; OM: outer
acrosome membrane, MP: midpiece. (a) Swollen and intact plasma membrane (arrow). The
acrosome is disrupted and the contents are released (arrow heads). Mid-piece presents a
plasmalemma swelling and damages in mitochondrial sheath like content disorganization.
Magnification 6300X. (b) Plasma membrane, outer (arrow) and inner (arrow heads) acrosome
membrane are swollen and with plicae. Equatorial region is intact. Magnification 8400X.
A
N
N
A
PM
E
OM
(a) (b)
MP
145
10. DISCUSSÃO GERAL
Capítulo I: Comparação da eficiência de dois métodos de diluição na
criopreservação do sêmen canino utilizando os diluentes à base de água de coco in
natura (ACIN) ou em pó (ACP-106®)
Vários protocolos têm sido desenvolvidos para a congelação de sêmen
canino e os pesquisadores estão sempre tentando desenvolver métodos mais práticos e
com um menor custo. Uma solução fresca à base de água de coco in natura foi eficaz
para a congelação de sêmen da referida espécie (Cardoso et al., 2003), mas esta
solução não pode ser armazenada por mais que dois dias (dados não publicados).
Portanto, a água de coco em pó (ACP®) foi desenvolvida e já foi testada para o sêmen
de caprinos (Salgueiro et al., 2002) e equinos (Sampaio Neto et al., 2002). Para a
espécie canina, nenhum trabalho desenvolvido.
Como a solução à base de água de coco in natura já era eficiente para a
congelação de sêmen canino (Cardoso et al., 2003), era preciso realizar uma
comparação entre esta e a água de coco em pó para poder ser, futuramente, usada para
a congelação do sêmen da referida espécie. Além disso, há carência de informações
sobre alguns aspectos na criopreservação de sêmen canino. Um destes é o efeito da
diluição espermática. Os grupos de pesquisa trabalham com o sêmen congelado em
diversas concentrações, não se levando em conta que possa haver um efeito da mesma.
Este efeito consiste, principalmente, no fato de não se observar a quantidade de
glicerol por célula criopreservada. Portanto,objetivou-se comparar uma concentração
fixa de 200 x 106/espermatozóides/mL com uma fixa de uma parte de sêmen: uma
parte de diluente nos meios à base de água de coco in natura ou em pó (ACP-106®).
146
O método de diluição não afetou a motilidade e o vigor espermático pós-
descongelação em ambos os diluentes, mas foi observado que a concentração
espermática pode prejudicar a avaliação da motilidade. Foi observado em nosso
trabalho que na concentração fixa de 200 x 106/espermatozóides/mL há uma tendência
em subestimar a motilidade. Este fato já foi relatado por Garner et al. (2001) que
encontraram que a maior parte da dificuldade em avaliar tal parâmetro foi devido a
uma considerável variabilidade quando concentrações espermáticas menores foram
examinadas.
Os resultados deste experimento diferem do encontrado por Peña e Linde-
Forsberg (2000b) que, testando a diluição em concentrações espermáticas de 50, 100,
200 e 400 x 106 espermatozóides/mL, observou efeito da concentração espermática,
encontrando melhores resultados de motilidade progressiva imediatamente após a
descongelação com 200x 106 espermatozóides/mL.
Em nosso trabalho, não testamos diferentes concentrações espermáticas e
sim uma concentração fixa de 200x 106 espermatozóides/mL e uma diluição a uma
taxa constante de 1:1 (sêmen:diluente), sem levar em conta a concentração
espermática. Uma vez que a concentração espermática média dos ejaculados foi de 1,6
x 109 espermatozóides/mL, para a diluição a uma concentração de 200x 106
espermatozóides/mL, foi necessário utilizar um grande volume de diluente. De acordo
com Mann (1964), o espermatozóide dos mamíferos responde à diluição excessiva
exibindo perda de motilidade e aumento no número de espermatozóides mortos. Por
outro lado, a diluição a uma taxa constante, não leva em consideração a concentração
espermática, consequentemente havendo variação na quantidade de glicerol/célula.
Como a concentração espermática média foi de 1,6 x 109 espermatozóides/mL, após a
diluição (1:1), esta concentração foi de 800 x 106 espermatozóides/mL. Entretanto, é
importante lembrar que a concentração espermática variou de 530 a 2760 x 106
espermatozóides/mL. Então, após a diluição, este parâmetro variou de 265 a 1370 x
106 espermatozóides/mL. Dessa forma, a diluição a uma taxa constante pode levar a
uma grande variedade de resultados, mas esta diluição foi escolhida, pois é comumente
147
utilizada para a diluição não somente com a solução à base de água de coco (Cardoso
et al., 2003b) como em outros diluentes (Silva et al., 2003) para a congelação de
sêmen canino.
O método de diluição também não afetou o percentual de espermatozóides
normais após a descongelação. É provável que uma diluição excessiva altere o
metabolismo e até afete a motilidade, mas estas não sejam suficientes para causar
tantas anormalidades morfológicas. É importante notar que, em ambos os grupos, o
sêmen era de boa qualidade, estando em uma faixa ideal para realização de
inseminação artificial (Concannon & Battista, 1989).
Ainda há uma carência de informações sobre o efeito da concentração sobre
a congelação de sêmen canino. Peña & Linde-Forsberg (2000b) avaliaram os efeitos e
interações na congelação de sêmen canino com Tris e utilizando quatro diferentes
concentrações espermáticas (50 x 106, 100 x 106, 200 x 106 e 400x 106
espermatozóides/mL). No experimento citado, a motilidade espermática variou de 49,7
a 65,0% e o percentual de espermatozóides vivos variou de 55,0 a 63,7%. Estes
autores sugerem que espermatozóides caninos congelados em concentrações de 200 x
106 espermatozóides/mL e diluídos imediatamente após a descongelação com tampão
Tris em taxas de 1:2 ou 1:4 tem uma melhor sobrevivência do que quando congelados
em concentrações maiores ou menores.
Estudos em outras espécies, especialmente eqüinos, sugerem que a diluição
pode ter influência na sobrevivê ncia espermática (Peña & Linde-Forsberg, 2000b).
Palacios et al. (1992) relatam uma melhor motilidade pós-descongelação quando
espermatozóides eqüinos foram congelados a uma concentração de 800 x 106
espermatozóides/mL quando comparados com 100 x 106 espermatozóides/mL. Para o
sêmen ovino, uma melhor sobrevivência espermática foi observada quando o sêmen
foi diluído a uma concentração constante de 900 x 106 espermatozóides/mL, onde a
quantidade de glicerol permanece constante, do que a uma taxa constante (1:4) quando
a quantidade de glicerol poderia ser variável. Isto sugere que o nível ótimo de glicerol
148
no sêmen diluído é provavelmente associado a uma concentração final em relação ao
espermatozóide (Colas, 1975). No tocante ao sêmen bovino, Garner et al. (2001)
relataram que altas diluições são mais prejudiciais à função mitocondrial.
Não foi observado um efeito do cão, bem como ejaculado (em cada cão)
sobre a qualidade seminal após diluição inicial, resfriamento, adição de glicerol e
descongelação. Além disso, não houve uma interação cão x tratamento.
Da mesma forma que para a motilidade e o vigor, não foi observado efeito
do método de diluição sobre a morfologia espermática (P>0,05). Os grupos foram
similares quanto ao total de alterações de cabeça, peça intermediária e cauda e, ainda,
quanto ao total de alterações secundárias e totais, exceto por um maior percentual de
alterações totais de cauda no grupo ACP-106® (concentração fixa) quando comparado
ao grupo ACIN (diluição fixa ou 1:1).
Para a avaliação da morfologia espermática, foi realizada a coloração de
eosina-nigrosina, onde esta não se mostrou tão eficiente. Embora ela seja classificada
como uma coloração vital é difícil a avaliação do percentual de vivos após a
descongelação, visto que se observa uma população espermática que não se cora
adequadamente, dificultando a interpretação, por isso este parâmetro não foi
mensurado. Este fato já foi observado por Peña-Martinez (2004), relatando que esta
população de espermatozóides que não se cora adequadamente, poderia apresentar
lesão de membrana, mas talvez ainda fosse viável. Além disso, como não há fixação
no processo de coloração, a vida útil da lâmina torna-se mais curta, ocasionando
defeitos aos espermatozóides (principalmente de cauda) que não existiam no momento
da coloração. É importante ressaltar que só foi realizada a avaliação clássica da
morfologia espermática, sendo importante a realização de outras avaliações como, por
exemplo, a do status acrossomal.
Comparando-se todos os tratamentos, foi observada uma superioridade do
diluente ACIN (diluição 1:1) sobre o ACP-106® (concentração fixa). Essa
149
superioridade pode ser devido à dificuldade na avaliação quando uma concentração
mais baixa foi utilizada (ACP-106®/concentração de 200 x 106 espermatozóides/mL),
onde esse fato foi observado também no ACIN. Apesar dessa inferioridade, os
resultados com ACP-106®/concentração de 200 x 106 espermatozóides/mL foram bons
e estes não diferiram do método de diluição 1:1. Em outra fase do experimento, esse
protocolo foi usado e os resultados foram melhores. Estes resultados serão descritos
posteriormente.
Capítulo II: Efeito do armazenamento a – 10 °C do diluente ACP-106® e da
diluição pós-descongelação sobre a qualidade do sêmen canino congelado.
No primeiro capítulo foi observado que o ACP-106® foi eficiente para a
criopreservação de sêmen canino, podendo o mesmo ser congelado tanto a uma
concentração fixa como a uma diluição fixa. Nesta segunda fase do trabalho, o método
de diluição fixa (1:1) foi escolhido por conferir uma maior praticidade ao trabalho,
podendo-se determinar a concentração espermática posteriormente.
Os resultados com ACP-106®, descritos no capítulo anterior, foram
satisfatórios. No entanto, é necessário aperfeiçoar este protocolo para que o mesmo se
torne mais prático. Um ponto que precisa ser investigado é o armazenamento do
diluente visto que a maioria dos diluentes é armazenada na forma congelada e, para o
ACP-106®, é preparada uma nova solução para cada congelação por este efeito ainda
não ser conhecido. Um outro fator importante a ser estudado é o efeito da diluição pós-
descongelação. Tal procedimento reduz os efeitos tóxicos do glicerol e gema de ovo
visto que o meio de descongelação contém substratos metabolizáveis adicionais, bem
como, capacidade tamponante. Há pouca informação sobre este efeito no sêmen
canino. É de nosso conhecimento apenas o trabalho desenvolvido por Pena & Linde-
Forsberg (2000b) que observaram que a mais alta taxa de diluição avaliada (1:4)
resultou em maior longevidade espermática. Portanto, foi realizada uma comparação
150
com o ACP-106® preparado no momento da congelação com o armazenado na forma
congelada (-10°C). Além disso, foi investigado o efeito da diluição pós-descongelação.
Não foi observada diferença entre o diluente preparado no momento da
congelação e o armazenado na forma congelada quanto à motilidade, vigor,
morfologia espermática e acrossomal. No entanto, seria de grande valor investigar o
efeito da congelação sobre a composição bioquímica do ACP-106®.
Foi observado que não há uma completa dissolução da gema de ovo no
diluente, aumentando a quantidade de debris e isto pode afetar o movimento
espermático (Hirai et al., 1997). Além disso, os debris prejudicam na avaliação da
motilidade. Esta dissolução incompleta da gema de ovo leva a uma variação na
concentração deste protetor de resfriamento, o que pode levar a uma variação nos
resultados.
Com relação ao efeito da diluição pós-descongelação, não foi observada
influência deste fator nem imediatamente após a descongelação e nem durante a
incubação por 120 minutos. Esses resultados diferem, em parte, daqueles encontrados
por Peña e Linde-Forsberg (2000b) que observaram um efeito, imediatamente, após a
descongelação, mas não durante a incubação por 120 minutos. Estes autores
observaram ainda este efeito após 5 horas de incubação, onde amostras não diluídas
apresentaram menores valores de motilidade.
A motilidade no presente trabalho aos 60 minutos de incubação foi apenas
um pouco menor que a encontrada por Rota et al. (1997), usando um diluente à base de
Tris. No entanto, melhores resultados de longevidade foram encontrados por Peña &
Linde-Forsberg (2000b) e Rota et al. (1997) também usando Tris, mas adicionado de
Equex STM. Provavelmente, estes últimos resultados foram influenciados pelo Equex
STM, onde foi observado que a viabilidade e longevidade são melhoradas com a
adição dessa substância.
A injúria pós-descongelação sofrida pelo espermatozóide e outras células
viáveis ocasionada pela retirada brusca do glicerol é geralmente atribuída ao choque
151
osmótico (Frim & Mazur, 1983, Schneider & Mazur, 1984). Este choque deverá ser
mais pronunciado quando os espermatozóides são diluídos em meio livre de glicerol
porque isto induz a uma retirada abrupta do glicerol do espermatozóide com o objetivo
de alcançar um equilíbrio em ambos os lados da membrana. Dessa forma, as células
tentam se acomodar a novas mudanças de volume em adição àquelas mudanças já
sofridas durante a descongelação (Peña & Linde-Forsberg, 2000b).
Embora os valores de motilidade fossem baixos após 60 minutos de
incubação, a taxa de espermatozóides e acrossomas normais foram altas para o ACP-
106® fresco (87,6 ± 6,5%/97,50 ± 2,06%) e congelado (90,6 ± 3,4%/96,87 ± 2,28).
Peña & Linde-Forsberg (2000b) relatam que o estresse osmótico pós-descongelação
pode ser capaz de prejudicar o movimento espermático retilíneo, mas mantendo as
membranas espermáticas intactas. Essa alta taxa de acrossomas normais pode ser, em
parte, devido a ineficiência da coloração de Rosa de Bengala em avaliar danos
acrossomais.
A injúria do espermatozóide congelado-descongelado é caracterizada por
edemaciamento e enrolamento da parte final da cauda espermática (Correa & Zavos,
1995). Para os dados agrupados dos diluentes (fresco e congelado), os defeitos de
cauda foram os mais observados.
Foi realizada a avaliação da integridade funcional das células espermáticas
através do teste hipoosmótico (HOST). Durante o HOST, os espermatozóides
bioquimicamente ativos, quando expostos a um estresse osmótico devido ao influxo de
água, sofrem edemaciamento, aumentando em volume a fim de estabelecer um
equilíbrio entre o compartimento fluido (dentro do espermatozóide) e o meio
extracelular (Jeyendran et al., 1984). O percentual de membranas funcionais foi para
ambos diluentes aproximadamente 53%, sendo estes valores próximos aos resultados
de motilidade pós-descongelação. Talvez a maioria dos espermatozóides móveis tenha
mantido uma membrana funcional após o processo de congelação-descongelação.
152
Nesta segunda etapa do experimento, foi observado um efeito significativo
do cão sobre a motilidade espermática pós-descongelação (30 e 60 minutos de
incubação), bem como sobre a taxa de espermatozóides normais imediatamente após a
descongelação. Este efeito do cão confirma o fato de se considerar o uso de ejaculados
de diferentes cães no delineamento experimental (Steel & Torrie, 1980).
Capítulo III: Avaliação do potencial fertilizante de espermatozóides caninos
congelados-descongelados com ACP-106® utilizando o teste in vitro de interação
espermatozóide - oócito
Apesar do largo uso de análises convencionais através da microscopia
óptica em que o sêmen é avaliado quanto à motilidade, morfologia e concentração,
estes métodos são subjetivos e imprecisos (Linford et al., 1976).
Métodos in vitro para predição do potencial fertilizante de uma amostra de
sêmen são importantes tanto ao se desenvolver novos métodos de resfriamento e
congelação de sêmen ou avaliar a fertilidade de um reprodutor. Como a realização de
inseminações artificiais na espécie canina apresenta algumas dificuldades como:
disponibilidade de animais e infra-estrutura para mantê-los e, ainda o longo intervalo
interestral da cadela, os testes de interação entre oócito e espermatozóides têm se
tornado uma valiosa ferramenta na avaliação da função espermática canina (Ström-
Holst et al., 2001).
A criopreservação de sêmen canino utilizando ACP-106® foi avaliada
somente através de métodos convencionais como motilidade, morfologia e status
acrossomal e estes resultados foram bons (Cardoso et al., 2004, 2005-dados não
publicados). Dessa forma, outros métodos mais acurados são necessários a fim de
investigar a eficiência do referido diluente, uma vez que uma combinação de testes
pode fornecer informações sobre várias características espermáticas necessárias para a
153
fertilização. Portanto, resolveu-se avaliar a funcionalidade espermática através do teste
de interação espermatozóide-oócito. Durante este fase do experimento, mas antes do
referido teste, as amostras de sêmen foram avaliadas pela análise espermática
computadorizada (CASA) e quanto à integridade de membrana com provas
fluorescentes.
1. Avaliação através de sistema de análise computadorizada (CASA)
A avaliação do sêmen canino congelado-descongelado através da CASA
apresentou alguns problemas. Acreditamos que a motilidade total e progressiva foram
subestimadas uma vez que foi observada uma motilidade mais alta, na mesma amostra,
através da análise subjetiva. Este fato pode ser explicado da seguinte forma. Foi
observado em estudos prévios que o ACP-106® tem a desvantagem de não permitir a
completa dissolução da gema de ovo na solução, aumentando a quantidade de debris
que podem ser reconhecidos como espermatozóides imóveis. Hirai et al. (1997)
descreveu o efeito da percentagem de gema de ovo na viscosidade dos diluentes e na
motilidade espermática avaliada através de CASA. Estes autores relataram que
qualquer fator que altere o padrão de movimento espermático pode alterar a motilidade
progressiva e, já é bem estabelecido que a viscosidade no meio altera este padrão
(Amman & Hammerstedt, 1980). Hirai et al. (1997) também observaram que um
aumento na quantidade de gema de ovo prejudica o reconhecimento de falsos
espermatozóides bovinos, onde estes eram partículas de gema de ovo ou outros debris.
Verstegen et al. (2002) sugeriram que o diluente não deve conter partículas de
tamanho similar à cabeça espermática (gema de ovo e leite) porque elas não serão
diferenciadas de espermatozóides imóveis. No ent anto, é relatado que este problema
pode ser resolvido através de softwares que identifiquem estruturas de cauda em
espermatozóides imóveis (Hirai et al., 1997). Estudos adicionais seriam necessários a
fim de investigar a concentração ideal de gema de ovo no diluente ACP-106® ou
mesmo métodos que possam reduzir a quantidade de debris no diluente.
154
Com relação às outras características do movimento espermático avaliadas
pelo CASA, foi observado um valor alto de ALH (amplitude lateral de cabeça) o que
poderia sugerir que os espermatozóides exibiram um movimento de hiperativação.
Este fato já foi observado por Peña & Linde-Forsberg (2000a). A motilidade
hiperativada é essencial para a fertilização de oócitos in vitro e in vivo (Fahrig, 2003).
Já foi observada uma correlação entre ALH e fertilidade em ratos e no homem (Moore
& Akhondi, 1996, Peedicayil et al., 1997). Os valores de VAP, VCL e VSL foram
mais baixos que o relatado por Peña & Linde-Forsberg (2000b).
Há evidências do envolvimento de espécies oxigênio reativas na capacitação
(Medeiros et al., 2002). Um aumento na quantidade destes compostos pode ser um
fator envolvido nas alterações similares à capacitação que ocorrem no espermatozóide
criopreservado (Medeiros et al., 2002). Existe uma substância chamada ácido 3-indol
acético (IAA), presente na água de coco (Nunes, 1995). Embora seus efeitos tóxicos
não sejam conhecidos, espécies oxigênio reativas podem ser formadas após
peroxidação e com isso produzir substâncias tóxicas (Pires de Melo et al., 1997). O
efeito destas substâncias podem ser diminuídos através de peroxidases, catalases, bem
como agente redutores (glutationa, ácido ascórbico, taurina e hipotaurina) presente nas
células espermáticas e ambiente espermático (Hinton et al. 1995, Lapoint et al. 2000).
2. Avaliação pela microscopia de epifluorescência
Os resultados da integridade da membrana plasmática pós-descongelação
(35,1%) foram mais baixos que os de Ström et al. (1997), Rota et al. (1997) e Peña e
Linde-Forsberg (2000a), utilizando as mesmas provas fluorescentes, sendo observado
74%, 56% e 64% de membranas intactas. A integridade da membrana plasmática
reflete a viabilidade espermática e o processo de criopreservação danifica esta
membrana (Cormier et al., 1996, Correa et al., 1996). O processo de criopreservação
causa danos irreversíveis à membrana plasmática e conduz a morte celular (Holt,
155
2000b) ou, nos espermatozóides sobreviventes, causar alterações similares a dos
espermatozóides capacitados, encurtando a sua vida útil (Pérez et al., 1996, Watson,
2000). Apesar da percentagem de membranas espermáticas intactas ter sido baixa, a
taxa de espermatozóides normais avaliada pela coloração de Rosa de Bengala foi alta
(89,6%), significando que esta avaliação não pode ser usada sozinha. Os métodos
convencionais de coloração para uso em microscopia óptica não são desejáveis para a
avaliação do espermatozóide criopreservado, pois o glicerol e a gema de ovo,
ingredientes necessários na maioria dos meios de congelação de sêmen canino,
interferem com os fixadores utilizados nas colorações. O uso de provas fluorescentes
tem superado este problema, pois não há interferência do meio extracelular na
avaliação (Peña-Martinez, 2004).
3. Avaliação pelo teste de interação espermatozóide-oócito
Utilizamos uma metodologia para o teste de interação oócito-
espermatozóide similar à descrita por Hay et al. (1997) e a mesma mostrou-se fácil de
ser realizada apesar de minuciosa. No presente trabalho, foi encontrado,
aproximadamente, 15% de oócitos penetrados sendo diferente de Hay et al. (1997) que
encontraram uma taxa de 70%. No entanto, estes autores agruparam em uma única
categoria a taxa de oócitos que se ligaram à zona pelúcida ou penetraram no ooplasma,
chamando-a de penetrados. Quando agrupamos também as duas categorias (ligados e
penetrados) a qual chamamos de interagidos, nossos resultados foram similares aos
destes autores. Melhores resultados foram obtidos por Ström Holst et al. (2000) que
obtiveram 84 e 89% de oócitos que se ligaram à zona pelúcida após lavagem suave e
forte dos complexos oócito-espermatozóide, respectivamente.
Encontramos algumas correlações entre os dados do CASA e os do teste de
interação espermatozóide-oócito. Contudo, é importante lembrar que a motilidade total
e progressiva avaliada pelo CASA pode ter sido subestimada. Então, talvez não seja
156
confiável estabelecer um valor preditivo para o CASA, com relação a estes
parâmetros, sobre a fertilidade in vitro utilizando sêmen canino congelado-
descongelado com ACP-106®. Vale ressaltar que as correlações entre a motilidade
total e progressiva e o percentual de oócitos penetrados foram as mais baixas quando
comparadas a outras observadas neste trabalho. Por outro lado, as velocidades
espermáticas, avaliadas pelo CASA, como VCL (velocidade curvilínea), VAP
(velocidade média da trajetória) e VSL (velocidade progressiva) apresentaram uma
alta e positiva correlação com o número de espermatozóides ligados e penetrados no
oócito. Portanto podemos considerar tais parâmetros do CASA como preditivos para o
número de espermatozóides que interagem com o oócito, seja por ligação ou
penetração, ou ambos. Além disso, também podemos considerar a taxa de
espermatozóides e acrossomas normais avaliados através da coloração de Rosa de
bengala como um valor prognóstico para o número de espermatozóides que ligaram e
penetraram no oócito, respectivamente.
No presente trabalho, mesmo com um baixo percentual de espermatozóides
com membrana intacta, a taxa de oócitos interagidos (ligados, penetrados e ligados
mais penetrados) foi satisfatória. Na espécie canina, tem sido sugerido que
espermatozóides tanto com acrossoma intacto e acrossoma reagido são capazes de se
ligar à zona pelúcida (Kawakami et al. 1993). No entanto, Hoodbhoy & Dean (2004)
relatam que somente espermatozóides móveis e com acrossomas intactos podem
penetrar o cumulus oophorus e se ligar à zona pelúcida. Diversos aspectos do
mecanismo de interação do espermatozóide com o oócito precisam ser elucidados.
Acredita-se que a fusão do da célula espermática com o gameta feminino inicia-se na
região equatorial do espermatozóide (Kaji & Kudo, 2004) e esta região permanece
intacta após o espermatozóide ter sofrido reação do acrossoma (Fahrig, 2003). Dessa
forma, pode ser que o espermatozóide com acrossoma reagido possa ser capaz de se
ligar à zona pelúcida, mas não capaz de penetrar o oócito visto que o acrossoma
contém enzimas que são necessárias neste processo (Kaji & Kudo, 2004). Kawakami
et al. (1993) observou a ligação do espermatozóide com acrossoma reagido na zona
pelúcida após um minuto de incubação. Os testes de interação do espermatozóide com
157
oócitos requerem, normalmente, dezoito horas de incubação (Hay et al., 1997). Dessa
forma, é importante investigar se a ligação de um espermatozóide com acrossoma
reagido é verdadeira e, se o mesmo é capaz de penetrar no ooplasma.
Capítulo IV: Integridade e mudanças ultra-estruturais no espermatozóide canino
fresco e após criopreservação com diluente para sêmen de carnívoros à base de
água de coco em pó (ACP-106®)
Avaliou-se o sêmen canino através de diversos métodos como motilidade,
morfologia espermática e acrossomal, integridade funcional, microscopia de
fluorescência, análise computadorizada e, ainda, através de interações
espermatozóides-oócitos. Embora a criopreservação de sêmen canino com ACP-106®
tenha sido eficiente, com base nos métodos que avaliamos, algumas mudanças na
metodologia precisam ser realizadas objetivando não só incrementar a eficiência como
também tornar o método mais prático. No entanto, antes que este protocolo seja
aperfeiçoado, é importante entender as crioinjúrias que causa uma redução na
longevidade espermática (Burgess et al., 2001). Estas crioinjúrias podem ser mais bem
caracterizadas através de uma avaliação ultra-estrutural (Oettlé & Soley, 1988;
Rodríguez-Martínez et al., 1993). A avaliação ultra-estrutural do espermatozóide
canino neste estudo caracterizou principalmente as alterações na membrana plasmática
e no acrossoma.
Com relação à membrana plasmática, é sabido que integridade da mesma é
um pré-requisito fundamental para a função espermática normal (Ström, 1999).
Durante o processo de criopreservação, as membranas espermáticas são consideradas
os principais locais de danos associados com mudanças de temperatura (Hammerstedt
et al., 1990, Watson, 1995). A integridade da membrana plasmática pode ser avaliada
através do teste hipoosmótico (England & Plummer, 1993), provas fluorescentes (Peña
& Linde-Forsberg, 2000) e microscopia eletrônica de varredura e de transmissão
158
(Ström Holst et al., 1998). Bacetti et al. (2002) relatam que o estudo das alterações do
espermatozóide, em casos de infertilidade humana, tem demonstrado que a
microscopia eletrônica pode ser uma valiosa ferramenta para o entendimento não
somente da presença, mas também da natureza dos defeitos.
A maioria dos espermatozóides parecia apresentar uma membrana intacta
mesmo apresentando edemaciamento da mesma. De acordo com Hurtgen & Johnson
(1982), membranas plasmáticas e acrossomais ondulantes, observadas no
edemaciamento, consistem num padrão regular em garanhões férteis, sugerindo que
estas alterações são mais devido ao procedimento de fixação do que aos de
congelação. Chirinéa et al. (2005) relataram a ocorrência de um leve edemaciamento
da membrana plasmática acima da região acrossomal observadas em espermatozóides
frescos caninos, explicando que isto seria uma conseqüência da exposição das
amostras de sêmen ao glutaraldeído durante a fixação.
As principais alterações pós-descongelação estão relacionadas ao
acrossoma. Embora este experimento não tenha quantificado estas alterações ultra-
estruturais, as mais observadas foram: edemaciamento, vesiculação e perda do
conteúdo acrossomal. Tais defeitos são denominados mudanças tipo capacitação
(Bailey et al., 2000) e podem ser resultantes de reação do acrossoma (Eilts, 2005). De
fato, Rodriguez-Martinez et al. (1993) sugeriram que as alterações ultra-estruturais
observadas no sêmen canino congelado podem ser interpretadas como uma falsa
reação do acrossoma. As mudanças físicas ocorridas nesta reação após a
criopreservação são indicativas de que o espermatozóide não pode fertilizar mesmo
que estejam móveis (Eilts, 2005). Similaridades entre o espermatozóide capacitado e
criopreservado têm sido demonstradas em relação à reorgani zação, fluidez e influxo de
cálcio na membrana plasmática (Green & Watson, 2001).
Fisiologicamente, alguns fatores podem induzir reação do acrossoma como
o cálcio intracelular (Dragileva et al., 1999), pH (Florman et al., 1989), inositol
trifosfato (Walensky & Snyder, 1995), e diacilglicerol (Roldan, 1998). Então, um
159
importante ponto a ser considerado nos procedimentos de criopreservação e que pode
induzir reação do acrossoma é o glicerol.
As alterações aqui descritas já foram previamente relatadas para o
espermatozóide canino (Rodriguez-Martinez et al., 1993, Ström et al., 1998). Ström et
al. (1998) encontraram 89% de acrossomas edemaciados após congelação-
descongelação utilizando o método CLONE. As inseminações artificiais utilizando o
sêmen criopreservado com este método em altas taxas de concepção, sendo sugerido
que o edemaciamento de acrossoma não prejudica a fertilização. Para o
espermatozóide criopreservado com ACP-106®, pode-se sugerir a mesma afirmativa
uma vez que os defeitos foram similares. Além disso, a avaliação do espermatozóide
congelado-descongelado com ACP-106® pelo teste de interação oócito-
espermatozóide (dados não publicados) mostrou um total de 75% de interações
(oócitos somente ligados, somente penetrados e ligados mais penetrados). Ao menos in
vitro, tais defeitos não prejudicaram a função espermática, permitindo não somente a
ligação, mas também a penetração no oócito. Para a inseminação artificial, é
importante determinar o momento de realizá-la, pois o edemaciamento de acrossoma
diminui a vida útil do espermatozóide (Jones & Stewart, 1979).
Alterações na peça intermediária também foram observadas na avaliação
ultra-estrutural. Tais defeitos incluíram edemaciamento da membrana plasmática e
danos na área mitocondrial tais como desorganização do conteúdo. Burgess et al.
(2001) relatou um leve , mas não significante aumento no número de espermatozóides
com peça intermediária apresentando membrana plasmática não intacta após 4 horas
de incubação pós-descongelação.
As mudanças aqui descritas para os espermatozóides caninos após
criopreservação com ACP-106® não foram diferentes das já relatadas por outros
autores utilizando diluentes diferentes.
160
11. CONCLUSÕES
O sêmen canino pode ser, eficientemente, congelado com o diluente à base
de água de coco in natura (ACIN) ou em pó (ACP-106®) após diluição 1:1 ou a uma
concentração de 200 x 106 espermatozóides/mL. Embora o método de diluição a uma
taxa constante seja mais prático, a utilização de uma concentração fixa tem a vantagem
de simplificar o cálculo do número de espermatozóides por palheta.
O armazenamento do a -10 °C não diminui a eficiência do ACP-106® para a
criopreservação de sêmen canino. Além disso, proporciona uma maior praticidade ao
protocolo de congelação.
A diluição pós-descongelação não influencia a sobrevivência espermática
pós-descongelação durante incubação a 37 °C, mas este procedimento melhora a
avaliação da motilidade por diminuir a viscosidade no meio.
O procedimento de congelação-descongelação utilizando ACP-106® foi
eficiente na manutenção do potencial fertilizante do espermatozóide canino in vitro,
mantendo a sua capacidade de não somente de se ligar, mas também de penetrar a zona
pelúcida.
A microscopia eletrônica de transmissão foi uma valiosa ferramenta na
caracterização dos danos espermáticos sofridos no processo de criopreservação,
refirmando que as membranas são os principais locais que sofrem danos, onde as
membranas acrossomais são as mais afetadas.
O percentual de espermatozóides e acrossomas normais são preditivos do
número de espermatozóides ligados e penetrados no oócito, respectivamente.
161
12. PERSPECTIVAS
Com a comprovação da eficiência ACP-106® para a criopreservação de sêmen
canino, baseada na análise da motilidade, morfologia, integridade funcional e interação
oócito-espermatozóide, podemos sugeri-lo como uma nova opção de diluente para a
referida biotécnica.
No entanto, objetivando um maior embasamento científico para esta sugestão,
seria de relevante importância a comprovação da fertilidade in vivo utilizando sêmen
congelado com ACP-106®.
162
13. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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188
12. ANEXOS
189
Anexo I. Água de coco em pó (ACP®).
190
Anexo II. Esquema de congelação para o sêmen canino utilizando ACP-106® Etapa 1: Diluição a temperatura ambiente com ACP ®-gema de ovo; Etapa 2: Resfriamento em caixa térmica por 40 minutos; Etapa 3: Resfriamento em refrigerador por 30 minutos; Etapa 4: Diluição com ACP®-gema de ovo-glicerol; Congelação em vapores de nitrogênnio por 5 minutos; Etapa 5: Armazenamento em nitrogênio líquido.
4°C
+ Etapa 3
- 60
°C
- 60 °C
5 cm N2 Líquido
Etapa 2 Etapa 1
- 196° C Etapa 4 Etapa 6
15°C
Etapa 5
27 °C
191
Anexo III. Composição dos corantes para avaliação da morfologia espermática
1. Solução de eosina-nigrosina
Eosina amarealada – 1g
Nigrosina – 2g
Tricitrato de sódio 2H2O – 2,941g
100 mL de água destilada
OBS: Após preparo, a solução fica em repouso por 24h, filtrada e conservada a 4 °C.
2. Solução Rosa de Bengala
20 mL de água destilada
0,58g de citrato de sódio
0,8 mL de formaldeído
0,3g de Rosa de Bengala
OBS: Após a mistura dos três primeiros componentes, a solução é homogeneizada e
acrescenta-se a Rosa de Bengala
Anexo IV. Composição da solução trabalho para verificação da integridade de
membrana por microscopia de fluorescência
1. Solução estoque de fluoresceína
6-Diacetato de carboxifluoresceína - 9,2 mg
DMSO - 20 mL
192
2. Solução estoque de iodeto de propídio
Iodeto de propídio - 10 mg
Solução fisológica 20 mL
3. Solução de formaldeído
Solução 1:80 de formalina 40%, em solução fisiológica
4. Solução trabalho
Solução estoque de fluoresceína - 20 µL
Solução estoque de iodeto de propídio - 10 µL
Citrato de sódio 3% - 0,96 mL
Anexo V. Composição dos meios usados para o teste de interação oócito
espermatozóide
1. Solução estoque de íons
Cloreto de sódio (NaCl) - 2,28 M (6,665g / 50mL)
Cloreto de potássio (KCl) – 158mM (0,88g / 50mL)
Bicarbonato de sódio (NaHCO3) - 250 mM (1,05g / 50mL)
Fosfato de sódio (NaH2PO4H2O) – 35mM (0,235g / 50mL)
Cloreto de cálcio (CaCL2.2H2O) – 16,46 mM (1,47g / 50mL)
Cloreto de magnésio (MgCl2.6H2O) – 10mM (1,015g / 50mL)
Hepes - 1M (1,19g / 5mL)
193
2. Solução de estoque TL
2.1. Espermatozóide TL – Osmolaridade 295 mOsm/L
19,81 mL de H2O
1,085mL de NaCl
0,49mL de KCl
2,50mL de NaHCO3
0,25mL de NaH2PO4H2O
0,09mL de Lactato de sódio
0,25mL de Hepes
0,25mL de CaCL2.2H2O
0,275mL de MgCL2.6H2O
2.2. FIV TL – Osmolaridade 295 mOsm/L
44,125mL de H2O
1,25mL de NaCl
0,50mL de KCl
2,50mL de NaHCO3
2,50mL de NaH2PO4H2O
0,045mL de Lactato de sódio
0,25mL de CaCL2.2H2O
0,125mL de MgCL2.6H2O
194
3. Solução TALP
3.1. TALP-SPERM (pH 7,4)
9,5mL Espermatozóide TL
60mg de BSA (Fração V)
100µL de Piruvato de Sódio (2,2 mg/mL)
83,5µL de Gentamicina (50mg/mL)
10µL de Vermelho Fenol (1mg/100mL)
3.2. TAP-FIV (pH 7,4)
9,5mL de FIV TL
30,0mg de BSA (Fração V)
10µL de Piruvato de Sódio (2,2mg/mL)
83,5µL de Gentamicina (50mg/mL)
10µL de Heparina (2,0mg/mL)
10µL de Vermelho Fenol (1mg/100mL)
OBS. Todas as solução são preparadas com água MiliQ.
195
Anexo VI .Espermatozóides caninos criopreservados em ACP-106®. (a) Apresentando
cauda reflexa e corado com eosina-nigrosina; (b) Apresentando cauda enrolada (seta
preta), acrossoma normal (seta branca) e corado com Rosa de Bengala.
(a) (b)
196
Anexo VII. Espermatozóides caninos criopreservados em ACP-106® e corados com 6-
Diacetato de carboxi-fluoresceína/iodeto de propídio. (a) Espermatozóide com
membrana plasmática não intacta (corado totalmente em vermelho com iodeto de
propídio - seta branca); Espermatozóide com membrana plasmática não intacta na
região equatorial (corado em vermelho) e região acrossomal intacta (corado em verde
com 6-Diacetato de carboxi-fluoresceína – ponta de seta branca). (b) Espermatozóides
com membrana plasmática intacta (corado em verde com 6-Diacetato de carboxi-
fluoresceína – seta branca).
(a) (b)
197
Anexo XIII. Oócitos (n=2) de cadelas apresentando espermatozóides caninos
criopreservados em ACP-106® ligados à zona pelúcida (seta branca e ponta de seta
branca) e penetrados no ooplasma (seta preta).