caracterizaÇÃo molecular e enzimÁtica de fungos...
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Universidade Federal do Tocantins
Campus Universitário de Gurupi Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
GLEICIANE PINHEIRO DE SOUSA
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E ENZIMÁTICA DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE CANA-DE-AÇÚCAR E SEU POTECIAL PARA
DESCONSTRUÇÃO DE BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
GURUPI - TO 2017
Universidade Federal do Tocantins
Campus Universitário de Gurupi Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
GLEICIANE PINHEIRO DE SOUSA
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E ENZIMÁTICA DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE CANA-DE-AÇÚCAR E SEU POTECIAL PARA
DESCONSTRUÇÃO DE BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação da Universidade Federal do Tocantins como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Raimundo Wagner de Souza Aguiar – Universidade Federal do Tocantins.
Coorientadora: Dra. Léia Cecília de Lima Fávaro – Embrapa Agroenergia/Brasília - DF.
GURUPI - TO 2017
DEDICATÓRIA E AGRADECIMENTOS
Entender que na vida existem saberes diferentes já é uma grande lição.
Reconheço com carinho quem um dia me estendeu a mão. Dedico este trabalho a
TODOS que comigo tiveram compreensão.
Se eu consegui chegar até aqui, agradeço a Deus pela sua bondade infinita
permitindo que tudo acontecesse colocando no meu caminho pessoas que
transformaram minha vida e mudaram minha história.
À minha coorientadora Dra. Léia C. L. Fávaro, pela paciência e dedicação na
orientação, por ser professora, amiga, conselheira e ter aguentado todos os meus
ataques de nervosismo de desistência. Obrigada por não desistir de mim e por me
ensinar tudo que aprendi até aqui, com você aprendi a despertar o melhor em mim.
Ao meu orientador Prof. Dr. Raimundo W. S. Aguiar, por ter me apresentado
à pesquisadora Léia e com essa parceria pude desfrutar dessa experiência que me
proporcionou muito conhecimento.
Ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da Universidade Federal
do Tocantins (PPGBIOTEC) em especial a todos os professores que colaboraram e
enriqueceram meu conhecimento.
À Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária pelo custeio do estágio de
pós-graduação com vigência de 24 meses.
À Professora Dra. Maria Carolina Quecine e ao Professor Dr. Welington Luiz
de Araújo (Universidade de São Paulo) pelas linhagens de fungos isoladas de cana-
de-açúcar utilizadas neste trabalho.
A equipe dos laboratórios, os analistas em geral, em especial a Paula F.
Franco, a Dra. Ana Paula Ribeiro e a Dra. Polyana Martins pela paciência e
ensinamentos.
Aos colaboradores da bancada 3 do Laboratório de Genética e Biotecnologia
da Embrapa Agroenergia, em especial a Mariana S. Tamietti e Jessyca S. Alencar
que foram meu braço direito durante o trabalho.
A Dra. Paula M. D. Jaramillo, que doou seu precioso tempo e com todo seu
profissionalismo, paciência, atenção e dedicação me auxiliou nos experimentos de
produção de enzimas e hidrólise enzimática de biomassa.
A Dra. Fabiane S. D. Brito, que com seu jeitinho meigo me passou dicas e
sugestões valiosas para conduzir meus experimentos.
A Jéssica S. G. Peixoto, Taís A. Ishizawa, Tallyta Teixeira e Fernanda P.
Santos, pela força, por me escutarem nos meus momentos mais difíceis. Agradeço
por cada palavra, cada risada e todos os bons momentos compartilhados que
ficaram na lembrança.
Ao pesquisador Dr. Félix G. Siqueira, por suas sábias palavras.
A professora Dra. Eliane Noronha (UnB), por ter me recebido como aluna
especial na disciplina de Enzimologia e ter me proporcionado conhecimento incrível
com suas aulas maravilhosas.
Aos meus pais, minha mãe Francisca, por toda sua coragem em me ver tão
longe dela e mesmo de longe sempre foi meu porto seguro, que me fortalecia com o
seu amor, suas orações nos meus momentos mais difíceis de ausências, tristezas,
saudade, desânimo, cansaço e a maldade do tempo. Meu padrasto Aldemir, pelo
apoio e por trabalhar duro para me ajudar nos estudos. Vocês me ensinaram a lutar
pelos meus objetivos e ultrapassar as barreiras que me cercavam.
À minha tia do coração Rose Mary B. Silva, porque sem ela não existiria
dissertação, não existiria metas nem objetivos. Com seu amor me orientou nos
caminhos para os estudos.
Ao meu irmão Alexandre e as minhas irmãs Ariadyna, Neuza Maíra e
Maiane, minha cunhada Priscilla, pela força, palavras de incentivo e motivação.
Ao meu namorido Auricelio e sua família por me acolher tão bem em
Brasília.
Aos meus amigos Dra. Anne Cardoso, professor André Felipe e Mayara
Vieira, pelas palavras de incentivo para que eu pudesse alcançar meus objetivos.
“A teoria sem a prática vira ‘verbalismo’,
assim como a prática sem teoria, vira
‘ativismo’. No entanto, quando se une a
prática com a teoria tem-se a práxis, a
ação criadora e modificadora da
realidade”.
(Paulo Freire)
RESUMO
A cana-de-açúcar é uma das principais culturas do Brasil, principalmente devido à produção de etanol para uso como biocombustível. A conversão de biomassa lignocelulósica em etanol e químicos renováveis pode ser obtida por meio da utilização de microrganismos capazes de produzir enzimas lignocelulolíticas em concentrações elevadas e serem cultivados em substratos de baixo custo. Microrganismos endofíticos habitam o interior das plantas sem induzir sintomas de doença e sem produzir estruturas externas. O potencial biotecnológico de microrganismos endofíticos de cana-de-açúcar tem sido pouco explorado, especialmente quanto à capacidade de produção de enzimas para desconstrução de biomassa lignocelulósica. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular e enzimática de uma coleção de fungos isolados de cana-de-açúcar, bem como selecionar linhagens promissoras para a hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor. Para tanto, 409 linhagens foram caracterizadas quanto à capacidade de hidrolisar polissacarídeos (Avicel; carboximetilcelulose - CMC; xilana; pectina e amido) em meio de cultura sólido. A caracterização molecular foi realizada por meio de análise da sequência da região ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossômico. Linhagens promissoras foram selecionadas para avaliação do potencial de sacarificação (produção de celulases por meio de determinação de FPase - Filter Paper Activity) e hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar. O fungo Trichoderma reesei RUT C-30 (ATCC 56765) foi utilizado como controle positivo. De 409 linhagens, 63,57% hidrolisaram CMC, 79,21% xilana, 77,50% pectina e 41,07% amido. O crescimento em Avicel foi observado para 84,60% das linhagens. Os maiores valores de índice enzimático
foram (3,150,12) em CMC; (5,301,06) em xilana; (5,000,00) em pectina e
(2,830,23) em amido. Sequências de qualidade da região ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossômico foram obtidas para 296 das 409 linhagens avaliadas. A análise filogenética permitiu classificar as linhagens ao nível de espécie. Dos 409 fungos, 20 foram cultivados em meio líquido contendo bagaço de cana-de-açúcar (pré-tratado por explosão a vapor, seco e triturado) como fonte de carbono para determinação do potencial de sacarificação (FPase) e de proteína total. Treze extratos foram escolhidos para realização de experimentos de hidrólise enzimática. Os resultados mostraram que nas condições utilizadas (5% de sólidos, 50 mg de proteína/g de glicanas, 200 rpm, 50°C por 32 horas), a capacidade hidrolítica do extrato avaliada pela produção de açúcares redutores totais (ART) foi destacada para as linhagens Omnidenptus affinis (94), Talaromyces pinophilus (AR156) e Talaromyces assiutensis (AR264) (ART = 11,77 g/L, 11,53 g/L e 10,11 g/L, respectivamente), quando comparada com a linhagem controle T. reesei RUT C-30 (ART = 11,04 g/L). A quantidade de glicose liberada analisada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) foi de 9,33 g/L para a linhagem O. affinis (94), 8,94 g/L para T. pinophilus (AR156) e 7,69 g/L para T. assiutensis (AR264), quando comparada com o extrato de T. reesei RUT C-30 (2,29 g/L). Estes resultados revelam que fungos endofíticos de cana-de-açúcar constituem uma fonte promissora de novas linhagens produtoras de enzimas lignocelulolíticas para conversão de bagaço de cana-de-açúcar em açúcares fermentescíveis, no contexto de biorrefinarias. Palavras-chave: fungos endofíticos; Saccharum officinarum; enzimas lignocelulolíticas; bagaço de cana-de-açúcar.
ABSTRACT
Sugarcane is one of the main crops in Brazil, mainly due to the production of ethanol for use as biofuel. The conversion of lignocellulosic biomass to ethanol and renewable chemicals can be achieved by using microorganisms capable of producing lignocellulolytic enzymes in high concentrations and grown on low cost substrates. Endophytic microorganisms inhabit the interior of plants without inducing symptoms of disease and without producing external structures. The biotechnological potential of sugarcane endophytic microorganisms has been little explored, especially regarding the production capacity of enzymes for the deconstruction of lignocellulosic biomass. In this context, the objective of this work was to perform the molecular and enzymatic characterization of a collection of fungi isolated from sugarcane, as well as to select promising strains for the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated by explosion at steam. For this purpose, 409 strains were characterized for the ability to hydrolyze polysaccharides (Avicel; carboxymethylcellulose - CMC; xylan; pectin and starch) in solid culture medium. Molecular characterization was performed by means of sequence analysis of the ITS1-5.8S-ITS2 region of ribosomal DNA. Promising strains were selected for evaluation of saccharification potential (production of cellulases by means of determination of FPase - Filter Paper Activity) and enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse. The fungus Trichoderma reesei RUT C-30 (ATCC 56765) was used as a positive control. In 409 strains, 63,57% hydrolyzed CMC, 79,21% xylan, 77,50% pectin and 41,07% starch. Avicel growth was observed for 84,60% of the strains. The highest values of enzymatic index were (3,15 ± 0,12) in CMC; (5,30 ± 1,06) in xylan; (5,00±0,00) in pectin and (2,83±0,23) in starch. Quality sequences of the ITS1-5.8S-ITS2 region of ribosomal DNA were obtained for 296 of the 409 strains evaluated. The phylogenetic analysis allowed to classify the strains at the species level. Of the 409 fungi, 20 were cultivated in liquid medium containing sugarcane bagasse (pretreated by steam explosion, dry and crushed) as carbon source to determine the potential of saccharification (FPase) and total protein. Thirteen extracts were selected for enzymatic hydrolysis experiments. The results showed that under the conditions used (5% solids, 50 mg protein/g glycans, 200 rpm, 50 °C for 32 hours), the hydrolytic capacity of the extract evaluated by the production of total reducing sugars (ART) was highlighted for the strains Omnidenptus affinis (94), Talaromyces pinophilus (AR156) and Talaromyces assiutensis (AR264) (ART = 11,77 g/L, 11,53 g/L and 10,11 g/L, respectively), when compared to the control strain T. reesei RUT C-30 (ART = 11,04 g/L). The amount of released glucose analyzed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) was 9,33 g/L for the strain O. affinis (94), 8,94 g/L for T. pinophilus (AR156) and 7,69 g/L for T. assiutensis (AR264) when compared to T. reesei extract RUT C-30 2.29 g/L. These results reveal that endophytic fungi of sugarcane constitute a promising source of new lignocellulolytic enzyme producing strains for the conversion of sugarcane bagasse to fermentable sugars in the context of biorefineries. Keywords: endophytic fungi; Saccharum officinarum; lignocellulolytic enzymes; sugarcane bagasse.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 11
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 13
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................ 13 2.2 Objetivos específicos .................................................................................... 13
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 14
3.1 Fungos endofíticos ........................................................................................ 14 3.1.1 Fungos endofíticos e seu potencial para produção de enzimas para desconstrução de biomassa lignocelulósica ...................................................... 16 3.1.2 Fungos endofíticos associados à cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) ........................................................................................................................... 19 3.1.3 Identificação taxonômica de fungos .......................................................... 20
3.2 Biomassa lignocelulósica ............................................................................. 21 3.2.1 Aspectos gerais ......................................................................................... 21 3.2.2 Polissacarídeos da parede celular das plantas ......................................... 23 3.2.3 Importância da cultura de cana-de-açúcar ................................................ 25 3.2.4 Bagaço de cana-de-açúcar ....................................................................... 26
3.3 Enzimas envolvidas na desconstrução de biomassa lignocelulósica ...... 27
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 31
4.1 Linhagens utilizadas ........................................................................................ 31 4.2 Caracterização molecular de fungos endofíticos de cana-de-açúcar .............. 32
4.2.1 Extração e manipulação de ácidos nucléicos ............................................ 32 4.2.2 Amplificação da região ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossômico, purificação dos produtos de PCR e sequenciamento ........................................................... 32 4.2.3 Análise de sequências de ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossômico contra diferentes bases de dados e análise filogenética para classificação taxonômica ........................................................................................................................... 33
4.3 Avaliação da capacidade de produção de enzimas para desconstrução de biomassa lignocelulósica ....................................................................................... 34
4.3.1 Avaliação de produção de enzimas em meio de cultura sólido ................. 34 4.3.1.1 Hidrólise de carboximetilcelulose, xilana, pectina e amido ..................... 34 4.3.1.2 Análise de crescimento em celulose microcristalina (Avicel) ................. 35 4.3.1.3 Seleção de linhagens promissoras para desconstrução de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor ............................................. 36 4.3.2 Hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor utilizando extrato enzimático de fungos selecionados ........... 36 4.3.2.1 Cultivo e obtenção do extrato enzimático ............................................... 36 4.3.2.2 Determinação do potencial de sacarificação do extrato enzimático ....... 37 4.3.2.3 Determinação de proteína total do extrato enzimático ........................... 38 4.3.2.4 Hidrólise enzimática de biomassa de cana-de-açúcar pré-tratada por explosão a vapor ................................................................................................ 39 4.3.2.5 Determinação de açúcares redutores totais (ART) e de glicose ............ 39
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 41
5.1 Classificação taxonômica de fungos endofíticos de cana-de-açúcar baseada em análise de sequência de DNA ribossômico...................................................... 41 5.2 Produção de enzimas lignocelulolíticas em meio de cultura sólido e seleção de linhagens promissoras ........................................................................................... 47 5.4 Hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado utilizando extrato enzimático de fungos endofíticos selecionados ......................................... 59
6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 68
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 69
ANEXOS ................................................................................................................... 81
Anexo A ................................................................................................................. 81 Anexo B. ................................................................................................................ 83 Anexo C. .............................................................................................................. 104
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Estudos de fungos endofíticos e seu potencial para produção de enzimas para desconstrução de polissacarídeos da biomassa lignoceclulósica. ............. 17
Tabela 2: Perfil de degradação (exclusiva/simultânea) dos polissacarídeos carboximetilcelulose (CMC), xilana, pectina e amido de 409 fungos endofíticos de cana-de-açúcar. ............................................................................................ 50
Tabela 3: Códigos e origem das 409 linhagens de fungos endofíticos de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) utilizadas neste trabalho. ................................ 81
Tabela 4: Classificação taxonômica de 296 fungos endofíticos de cana-de-açúcar baseada em análise filogenética da região ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossômico. ........................................................................................................................... 83
Tabela 5: Determinação da capacidade de 409 fungos endofíticos de cana-de-açúcar em hidrolisar os polissacarídeos carboximetilcelulose (CMC), xilana, pectina, amido e Avicel em meio de cultura sólido. .......................................... 104
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Esquema das fontes de biomassa. ............................................................ 22 Figura 2: Representação dos polissacarídeos presentes na parede celular das
plantas. ............................................................................................................... 24 Figura 3: Esquema da repartição da oferta de energia no Brasil. ............................. 26 Figura 4: Representação dos sistemas fúngicos para hidrolisar a celulose. As endo-
1,4-β-D-glicanases hidrolizam as ligações de celulose internamente, enquanto as endo-1,4-β-D-glicanase clivam unidades de celobiose das extremidades das cadeias de polissacarídeos. As unidades de celobiose liberadas (dissacarídeo) são finalmente hidrolisadas por β-glicosidases, liberando a molécula de glicose. ........................................................................................................................... 28
Figura 5: Atividade de exoglucanase Cel 7A de T. reesei no substrato celulose. A enzima tem um pequeno domínio de ligação a carboidratos (CDB) de 36 aminoácidos, um ligante flexível longo com O-glicano (azul escuro) e um grande domínio catalítico (CD) N-ligado com glicano (rosa) que pode enrolar uma única celulose no túnel catalítico. a) Cel 7A ligando-se à celulose, b) Reconhecimento da extremidade redutora de uma cadeia de celulose, c) Início da cadeia de celulose no túnel catalítico, d) O enroscamento e a formação de complexo catalíticamente ativo, e) Hidrólise em um ciclo de processo e f) Expulsão do produto e rosqueamento de outra celobiose (mostrada em amarelo em e e f). . 29
Figura 6: Produtos purificados de amplificação da região ITS do rDNA de fungos endofíticos de cana-de-açúcar obtidos com os primers ITS1-F e ITS4 (gel de agarose 2%). O marcador de peso molecular Low Mass DNA Ladder (Invitrogen) está representado na lateral esquerda da figura. ............................ 41
Figura 7: Filogenia de espécies da família Magnaporthaceae com base na sequência de ITS rDNA. A linhagem 94 é destacada em negrito (semelhante à Omnidenptus affinis ATCC 200212, linhagem tipo). Os ramos da árvore filogenética (Maximum likelihood - ML) são mostrados em círculos e as cores representam o suporte dos ramos, de acordo com o teste de Shimodaira-Hasegawa (SH test). .......................................................................................... 44
Figura 8: Filogenia de espécies de Aspergillus (ITS rDNA). As linhagens endofíticas de cana-de-açúcar são mostradas em negrito. Os ramos da árvore filogenética (Maximum likelihood - ML) são mostrados em círculos e as cores representam o suporte dos ramos (teste de Shimodaira-Hasegawa, SH test). .......................... 46
Figura 9: Representação gráfica (heatmap) dos valores de índice enzimático (médias) obtidos para diferentes polissacarídeos (CMC, xilana, pectina e amido) a partir da análise de 81 linhagens endofíticas de Aspergillus isoladas de cana-de-açúcar. .......................................................................................................... 53
Figura 10: Representação gráfica (heatmap) dos valores de índice enzimático (médias) obtidos para diferentes polissacarídeos (CMC, xilana, pectina e amido) a partir da análise de 100 linhagens endofíticas de Fusarium isoladas de cana-de-açúcar. .......................................................................................................... 54
Figura 11: Representação gráfica (heatmap) dos valores de índice enzimático (médias) obtidos para diferentes polissacarídeos (CMC, xilana, pectina e amido) a partir da análise de 40 linhagens endofíticas de Talaromyces isoladas de cana-de-açúcar. ................................................................................................. 55
Figura 12: Representação gráfica (heatmap) dos valores de índice enzimático (médias) e de crescimento em Avicel (mm/dia) de 20 linhagens de fungos
endofíticos de cana-de-açúcar selecionadas para cultivo e determinação do potencial de sacarificação. As linhagens em negrito foram avaliadas em testes de hidrólise enzimática de bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor. .. 58
Figura 13: Potencial de sacarificação (atividade de FPase) do extrato bruto de 20 fungos endofíticos de cana-de-açúcar após 7 dias de cultivo em meio contendo bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado (seco e triturado) como fonte de carbono. Os dados são comparados com os resultados do fungo celulolítico T. reesei RUT C-30. Os valores representam a média de duas repetições. ..................... 60
Figura 14: Concentração de proteína total do extrato bruto de 20 fungos endofíticos de cana-de-açúcar após 7 dias de cultivo em meio contendo bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado (seco e triturado) como fonte de carbono. Os dados são comparados com os resultados do fungo celulolítico T. reesei RUT C-30. Os valores representam a média de duas repetições. ............................................. 60
Figura 15: Fungos endofíticos de cana-de-açúcar selecionados para aplicação na hidrólise de bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor. Os fungos foram cultivados em meio de cultura PDA durante 6 dias a 28°C. As linhagens estão marcadas com números de 1 a 12. Sendo 1 Aspergillus terreus (48), 2 Omnidenptus affinis (94), 3 Neurospora calospora (146), 4 Fusarium brachygibbosum (158), 5 Aspergillus brasiliensis (170), 6 Talaromyces pinophilus (186), 7 Fusarium brachygibbosum (AR32), 8 Aspergillus sp. (AR127), 9 Talaromyces pinophilus (AR156), 10 Trichoderma asperelloides (AR226), 11 Talaromyces assiutensis (AR264), 12 Talaromyces trachyspermus (AR281). ............................................................................................................. 61
Figura 16: Concetração de açúcares redutores totais – ART (g/L) obtidos após 32 horas de reação de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor. O extrato bruto de 13 linhagens selecionadas é comparado com extrato bruto do fungo celulolítico T. reesei RUT C-30. Os valores representam a média de duas repetições. ......................................................... 62
Figura 17: Concentração de glicose (g/L) obtida após 32 horas de reação de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor. O extrato bruto de 13 linhagens selecionadas é comparado com o extrato bruto do fungo celulolítico T. reesei RUT C-30. Os valores representam a média de duas repetições. .......................................................................................................... 62
11
1 INTRODUÇÃO
A bioconversão de polissacarídeos da biomassa lignocelulósica
(celulose e hemicelulose) em biocombustíveis e químicos renováveis depende
do desenvolvimento de tecnologias para exploração eficiente dos componentes
da parede celular vegetal, de modo a garantir a viabilidade econômica deste
processo. Por exemplo, embora existam plantas de produção de etanol
lignocelulósico em operação em diferentes países e no Brasil, a utilização de
biomassa para a produção deste combustível tem despertado a atenção da
comunidade científica para os desafios técnicos que ainda precisam ser
vencidos. Entre estes destaca-se a sacarificação enzimática, devido ao alto
custo das enzimas para desconstrução de polissacarídeos.
Uma etapa crítica do processo de bioconversão é a hidrólise para
obtenção de açúcares fermentescíveis. Esta etapa de hidrólise geralmente é
realizada pela ação de enzimas de fungos. Diferentes abordagens têm sido
utilizadas para sobrepor o desafio da etapa de sacarificação: desenvolvimento
de enzimas com maior atividade catalítica e estabilidade por meio de
engenharia de enzimas; bioprospecção a partir da biodiversidade por meio de
estratégias dependentes e independentes de cultivo microbiano, tais como a
metagenômica; mineração de genomas microbianos; e melhoramento genético
de fungos produtores de enzimas e seu cultivo em substratos de baixo custo.
Alguns coquetéis enzimáticos foram desenvolvidos por empresas como
Novozymes, DSM-Poet, Dupont-Genencor, BP e Abengoa. No entanto, estes
coquetéis foram formulados para atender diferentes tipos de biomassa. Esta
falta de especificidade geralmente leva a uma perda de eficiência do processo
de hidrólise. Uma estratégia que tem recebido atenção é a customização de
coquetéis para cada tipo de biomassa e pré-tratamento. Um aspecto importante
da customização é a possibilidade de incrementar os coquetéis com a adição
de proteínas que atuam como estimuladoras da ação de celulases e outras
proteínas que atuam na hidrólise dos demais componentes da biomassa pré-
tratada, como as hemicelulases e as oxidases.
Neste cenário, a prospecção de fungos lignocelulolíticos pode facilitar o
desenvolvimento de coquetéis enzimáticos customizados para cada tipo de
12
biomassa e pré-tratamento disponíveis. A customização de coquetéis
enzimáticos para cada combinação de biomassa e pré-tratamento, bem como o
cultivo de fungos em substratos de baixo custo (p. ex: biomassa pré-tratada
como fonte de carbono) são consideradas estratégias promissoras para
diminuição dos custos do processo de sacarificação da biomassa.
Fungos endofíticos são definidos como os que habitam, pelo menos um
período de seu ciclo de vida, o interior da planta sem induzir sintomas de
doenças ou produzir estruturas externas. O interior das plantas é reconhecido
como um nicho promissor para a descoberta de fungos com novas atividades
biológicas, com especial aplicação na área médica (metabólitos com potencial
farmacêutico) e agrícola (controle biológico; promoção de crescimento vegetal).
No entanto, o potencial de fungos endofíticos para a produção de enzimas de
interesse industrial não tem sido totalmente explorado. O fato de que os
endófitos são simbiontes das plantas sugere que eles são capazes de produzir
enzimas, tornando-os capazes de desconstruir a lignocelulose e de convertê-la
em açúcares fermentescíveis.
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) é uma das principais culturas
do Brasil, principalmente devido à produção de etanol para uso como
biocombustível e também para produção de açúcar. As comunidades
microbianas associadas à esta cultura têm sido estudadas com diferentes
objetivos, em especial bactérias fixadoras de nitrogênio e bactérias endofíticas
promotoras de crescimento vegetal. No entanto, poucos têm sido os estudos
sobre as comunidades de fungos associados à cana-de-açúcar, em especial os
fungos endofíticos. Tais relatos têm focado o estudo da biodiversidade de
espécies de fungos endofíticos cultiváveis, sendo raros os relatos sobre a
aplicação biotecnológica de fungos associados à esta cultura.
Neste contexto, a hipótese deste trabalho foi que a prospecção de
fungos naturalmente associados à plantas de cana-de-açúcar (endofíticos)
pode ser uma estratégia promissora para seleção de novas linhagens
produtoras de enzimas lignocelulolíticas. Para testar esta hipótese, uma
coleção de fungos endofíticos foi caracterizada por métodos moleculares e
enzimáticos, visando a seleção de linhagens produtoras de extrato enzimático
eficiente para conversão de biomassa de cana-de-açúcar pré-tratada por
explosão a vapor.
13
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o potencial de fungos endofíticos de cana-de-açúcar quanto à
capacidade de produzir enzimas lignocelulolíticas para aplicação na conversão
de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado em açúcares fermentescíveis.
2.2 Objetivos específicos
Analisar a viabilidade e pureza, bem como preservar uma coleção
previamente obtida de fungos endofíticos de cana-de-açúcar;
Prospectar fungos endofíticos de cana-de-açúcar quanto à capacidade
de hidrolisar diferentes polissacarídeos em meio de cultura sólido
(Avicel; carboximetilcelulose; xilana; amido e pectina);
Identificar à taxonomia, ao nível de gênero e/ou espécie, de fungos
endofíticos de cana-de-açúcar por meio de análise da sequência da
região ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossômico;
Avaliar o extrato enzimático de linhagens selecionadas quanto à
capacidade de conversão de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por
explosão a vapor em açúcares fermentescíveis, em comparação com
extrato enzimático de linhagem mutante celulolítica Trichoderma reesei
RUT C-30 (ATCC 56765).
14
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Fungos endofíticos
As plantas são consideradas um microecossistema complexo no qual
diferentes nichos são explorados por uma variedade de microrganismos
procarióticos e eucarióticos. Estes nichos incluem as superfícies externa e
interna das plantas, onde podem coexistir fungos, bactérias, arquéias, vírus,
entre outros microrganismos (FÁVARO, 2009).
Existem algumas definições de fungos endofíticos mas em geral eles
são definidos como aqueles que podem ou não crescer in vitro e que habitam o
interior da planta sem causar prejuízos e sem produzir estruturas externas
(AZEVEDO; ARAÚJO, 2007; ALY et al., 2011), sendo a distinção entre
endófitos, epífitos e patógenos meramente didática. A relação endófito-planta é
definida como um antagonismo balanceado que é regulado e dependente das
respostas de defesa da planta, da demanda por nutrientes do fungo, e das
condições ambientais que permeiam a interação (SCHULZ; BOYLE, 2005).
Este gradiente de interações (parasitismo-comensalismo-mutualismo) está
sendo estudado por meio de técnicas de biologia molecular a fim de entender
os mecanismos genéticos, moleculares e ambientais envolvidos na regulação
desta interação planta-microrganismo (ARAÚJO et al., 2014).
Os fungos endofíticos são componentes importantes da biodiversidade
microbiana devido ao vasto número de espécies de plantas existentes
(BHAGOBATY; JOSHI, 2012). Teoricamente, qualquer planta pode ser
selecionada para o isolamento de fungos (AYOB; SIMARANI, 2016). Os fungos
endofíticos vivem em diferentes órgãos (raíz, caule, folha, flor, fruto e semente)
de plantas hospedeiras (ZHENG et al., 2016). A quantidade e os tipos de
fungos que são isolados são dependentes das condições utilizadas para seu
isolamento. O isolamento representa o passo mais importante para a obtenção
de culturas puras (ZHENG et al., 2016). De acordo com MENDES (2008), o
isolamento dos endófitos do interior dos tecidos vegetais é feito a partir de
plantas sadias para que patógenos não sejam preferencialmente isolados.
15
Para o isolamento, de modo geral é efetuada uma desinfecção da
superfície dos órgãos e tecidos da planta hospedeira a fim de se eliminar os
microrganismos epifíticos. Em geral, fragmentos de folhas, caule, flores ou
raízes são superficialmente tratados por uma sequência de lavagens utilizando
água, etanol, hipoclorito de sódio ou outros agentes de desinfecção. Após a
desinfecção superficial, fragmentos menores são inoculados em placas de Petri
contendo meios de cultura apropriados, aos quais são adicionados um ou mais
inibidores de contaminação, por exemplo, antibióticos para inibir o crescimento
de bactérias (ARAÚJO et al., 2014). Uma vez isolado na forma de cultura pura,
cada fungo pode ser examinado para uma propriedade desejada, como por
exemplo, produção de uma enzima específica (WAITES et al., 2001).
As pesquisas sobre fungos endofíticos têm sido realizadas com o
intuito de aumentar o entendimento da ecologia e evolução desses organismos
e seu impacto na composição do ecossistema e comunidades de plantas (ALY
et al., 2011). Embora a diversidade de endófitos seja maior em regiões tropicais
e plantas destas regiões sejam consideradas verdadeiros reservatórios dessa
diversidade, a interação endófito-planta nessas condições ainda é pouco
compreendida (ARNOLD, 2007; FÁVARO et al., 2012).
Além da pesquisa básica, a qual abrange principalmente a descrição
de novas espécies, do ponto de vista aplicado, são cada vez mais frequentes
os estudos sobre o potencial biotecnológico de fungos endofíticos. Estes
organismos têm sido bastante estudados quanto ao seu potencial para
aplicação na área médica e na agricultura. A descoberta de novos metabólitos
secundários bioativos em fungos endofíticos tem sido extensivamente revisada
e constitui uma área de estudo em plena expansão (STROBEL et al., 2003;
SURYANARAYANAN et al., 2009; ALY et al., 2011; ZHENG et al., 2016). Na
agricultura, são aplicados especialmente no controle biológico de fitopatógenos
e de insetos praga, promoção de crescimento vegetal, aumento da produção e
captação de nutrientes, tolerância a estresses abióticos, entre outras
aplicações (ARNOLD et al., 2003; KULDAO et al., 2008; BACKMAN et al.,
2008; ZHENG et al., 2016).
16
3.1.1 Fungos endofíticos e seu potencial para produção de enzimas para
desconstrução de biomassa lignocelulósica
Apesar dos avanços nas pesquisas sobre a aplicação biotecnológica,
os fungos endofíticos não têm sido totalmente explorados quanto à produção
de enzimas com aplicação industrial. O fato de que os fungos endofíticos são
simbiontes das plantas sugere que eles são capazes de produzir enzimas (WU
et al., 2017), tornando-os capazes de desconstruir a lignocelulose e de
convertê-la em açúcares fermentescíveis.
Fato é que os endófitos sintetizam enzimas para a penetração e
colonização da planta hospedeira, como proteases, amilases, oxidases,
celulases, lipases, xilanases, pectinases, entre outras (SCHULZ; BOYLE,
2005). Além disso, há evidências do envolvimento dos endófitos na
decomposição de material vegetal e ciclagem de nutrientes após a senescência
das plantas (PROMPUTTHA et al., 2010).
De modo geral a produção de enzimas por fungos endofíticos tem sido
investigada principalmente por meio de testes em meio de cultura sólido
contendo polissacarídeos (CORREA et al., 2014). Além disso, poucos estudos
avaliaram a produção quantitativa de enzimas por fermentação no estado
sólido ou por fermentação submersa, e mais raros ainda são os estudos que
avaliaram os extratos enzimáticos de fungos endofíticos na bioconversão ou
hidrólise de biomassa lignocelulósica. Correa et al., (2014) revisaram a
produção de amilases, proteases e lipases em fungos endofíticos. A Tabela 1
resume os estudos mais recentes sobre a produção de enzimas
lignocelulolíticas (celulases, hemicelulases, oxidases) por fungos endofíticos.
17
Tabela 1: Estudos de fungos endofíticos e seu potencial para produção de enzimas para desconstrução de polissacarídeos da biomassa lignoceclulósica.
Plantas Prospecção em
ágar sólido Cultivo em FS ou FES* Hidrólise de biomassa Referência
Cedrus deodara, Pinus roxburgii, Abies pindrow, Chlorophytum comosum
celulase celulase, xilanase, beta-
glicosidase Biomassa de cana pré-
tratada por explosão a vapor SYED et al., (2013)
Eucalyptus sp. - lacase Biomassa de Eucalyptus globulus pré-tratada por
autohidrólise FILLAT et al., (2017)
Cynodon dactylon - lacase - WANG et al., (2006)
Bischofia polycarpa - celulase, lacase,
peroxidase - DAI et al., (2010)
Eucalyptus benthamii, Platanus orientalis, Glycine max, Solanum
tuberosum, Saccharum officinarum
xilanase, beta-glicosidase
fpase, endoglicanase, beta-glicosidase,
pectinase, xilanase - ROBL et al., (2013)
Canavalia rosea, Ipomea pescaprae, Spinifex sp.
lacase lacase - MUTHEZHILAN et al.,
(2014) Azadirachta indica, Citrus limon, Gossypium
hirsutum, Magnolia champaca, Datura stramonium, Piper betle, Phyllanthus
emblica
celulase, amilase, protease
celulase, amilase, protease
- PATIL et al., (2015)
Boswellia sacra - celulases, fosfatases,
glicosidases - KHAN et al., (2016)
Eucalyptus sp. lacase lacase - FILLAT et al., (2016)
Catharanthus roseus celulase, amilase,
protease - - AYOB; SIMARANI (2016)
Camelia, Cinnamomum, Garcinia, Litsea, Manglietia, Trichilla
celulase, xilanase, protease
- - LUMYONG et al., (2002)
Annona spp. celulase, amilase,
protease - - SILVA et al., (2006)
Opuntia fícus-indica celulase, xilanase,
pectinase, protease - - BEZERRA et al., (2012)
Alpinia calcarata, Bixa orellana, Calophyllum inophyllum, Catharanthus roseus
amilase, celulase, lacase, pectinase,
protease - - SUNITHA et al., (2013)
18
Plantas Prospecção em
ágar sólido Cultivo em FS ou FES* Hidrólise de biomassa Referência
Adhathoda beddomei celulase, amilase,
protease - -
PRABAVATHY et al., (2012)
Brucea javanica celulase, amilase,
pectinase, xilanase, ligninase,
- - CHOI et al., (2005)
Hedychium flavescens, Hedychium coronarium
celulase, amilase, pectinase,
asparaginase, lacase - - UZMA et al., (2016)
Cananga odorata, Terminalia catappa, Terminalia mantaly
celulase, amilase, lacase
- - TOGHUEO et al., (2017)
Centella asiatica celulase, amilase, protease, lacase
- - GUPTA et al., (2015)
Luehea divaricata, Trichilia elegans, Sapindus saponaria, Saccharum spp.
celulase, amilase, pectinase, protease
- - ALBERTO et al., (2016)
Ocimum sanctum, Aloe vera amilase, celulase,
quitinase, pectinase, lacase, urease
- - YADAV et al., (2015)
Butea monosperma celulase, pectinase,
amilase - - TUPPAD et al., (2014)
Lantana camara amilase, lacase - - DESIRE et al., (2014)
Asclepias sinaica amilase, pectinase, celulase, gelatinase, xilanase, tirosinase
- - FOUDA et al., (2015)
Centella asiatica amilase, celulase, protease, lacase
- - DEVI et al., (2012)
*FS: Fermentação submersa. FES: Fermentação no estado sólido.
19
3.1.2 Fungos endofíticos associados à cana-de-açúcar (Saccharum
officinarum)
A cana-de-açúcar é uma das principais culturas do Brasil principalmente
devido à sua utilização para a produção de biocombustível. Avanços no estudo
sobre as comunidades microbianas endofíticas de cana-de-açúcar têm sido
alcançados, especialmente relacionados à bactérias fixadoras de nitrogênio
atmosférico e bactérias promotoras de crescimento vegetal (BODDEY et al.,
2003; LUVIZOTTO et al., 2010). No entanto, poucos têm sido os estudos sobre
as comunidades de fungos endofíticos associadas à esta cultura.
A maioria dos trabalhos realizados com fungos associados à cana-de-
açúcar investigou fungos fitopatogênicos, já que estes podem trazer grandes
perdas de produção (ROMÃO, 2010). Alguns estudos investigaram a
biodiversidade de leveduras associadas à cana-de-açúcar (AZEREDO et al.,
1998). Em outros casos, a dinâmica de comunidades de fungos micorrízicos foi
avaliada em plantas com sintomas de doença causada por Colletotrichum
falcatum (NASIM et al., 2008).
Com relação à fungos saprófitas naturalmente associados à cana-de-
açúcar, Shrestha et al., (2011; 2015) isolaram fungos de folhas e colmos de
Miscanthus e de cana-de-açúcar em decomposição em campos cultivados nos
EUA. Os autores avaliaram estes fungos com relação à capacidade de
bioconversão de biomassa de Miscanthus pré-tratada por diferentes pré-
tratamentos e identificaram linhagens promissoras quando comparadas com os
fungos controles utilizados industrialmente. Outro estudo de bioprospecção
isolou fungos de bagaço de cana-de-açúcar com atividade de endoglicanase
comparável à linhagens industriais de Trichoderma reesei (BASSO et al.,
2010). Estes estudos exemplificam que fungos saprófitas associados à culturas
energéticas são alternativas para produção de enzimas para conversão da
biomassa destas culturas.
As pesquisas sobre as comunidades de fungos endofíticos associados à
cana-de-açúcar têm sido voltadas para a descrição da biodiversidade
associada. Exemplos deste tipo de estudo são os trabalhos de Stuart (2006) e
Stuart et al., (2010), os quais investigaram a diversidade de fungos endofíticos
de folhas e colmos de plantas sadias de cana-de-açúcar transgênica e
20
convencional. Do mesmo modo, Romão (2010) e Romão-Dumaresq et al.,
(2016) avaliaram a diversidade de fungos endofíticos de raízes e da rizosfera
de plantas transgênicas e não-transgênicas de cana-de-açúcar. Mendes (2008)
utilizou abordagens dependentes e independentes de cultivo para estudo da
diversidade de fungos endofíticos de cana-de-açúcar transgênica e
convencional, e observou que Fusarium moniliforme é frequentemente isolado
como endófito desta planta.
Os poucos estudos sobre aplicação biotecnológica de fungos endofíticos
de cana-de-açúcar têm sido voltados para a descoberta de linhagens
produtoras de metabólitos bioativos (FÁVARO et al., 2012; DA SILVA ARAÚJO
et al., 2012; ROJAS et al., 2012). Com relação à produção de enzimas, Fávaro
et al., (2011) caracterizaram 112 linhagens endofíticas do fungo Epicoccum
nigrum quanto à produção de endoglicanases, pectinases e lipases por testes
de difusão em meio sólido. Magalhães et al., (2015) avaliaram 205 fungos
endofíticos de cana-de-açúcar quanto à produção de lipases em meio de
cultura sólido. Robl et al., (2013) e Robl (2015) avaliaram 11 linhagens de
fungos endofíticos de cana-de-açúcar quanto à produção de xilanases, também
em meio de cultura sólido. Tais estudos revelam a necessidade de mais
pesquisas sobre o potencial biotecnológico de fungos endofíticos de cana-de-
açúcar para produção de enzimas e sua aplicação na conversão de biomassa
lignocelulósica.
3.1.3 Identificação taxonômica de fungos
A identidade dos fungos pode ser determinada pela sequência do
material genético com base em métodos moleculares através das técnicas de
Polymerase Chain Reaction - PCR e sequenciamento do DNA utilizando a
região ITS do rDNA (GARGAS; TAYLOR, 1992; CHEN et al., 2004; SCHOCH
et al., 2012).
O conjunto gênico ITS1-5.8S-ITS2 tem dois espaçadores internos
transcritos (ITS1 e ITS2), separando os genes 18S, 5.8S e 28S, e um
espaçador externo transcrito (ETS) localizado próximo ao gene 18S (CHEN et
al., 2004). Os espaçadores transcritos contêm sinais para o processamento do
21
rRNA transcrito e cópias adjacentes da unidade de repetição do rDNA e são
separados por um espaçador não transcrito (NTS). Esta região contém
elementos sub repetidos que servem como estimuladores da transcrição
(HILLIS; DIXON, 1991). O conjunto gênico que codifica para rRNA aparece
repetido centena de vezes no genoma fúngico. Como esse conjunto gênico
apresenta algumas regiões altamente conservadas e outras variáveis, ele tem
permitido a análise de variação de diferentes níveis taxonômicos sendo
apropriado para discriminar espécies relacionadas ou até mesmo variedades
da mesma espécie.
A região ITS é relativamente curta com aproximadamente 600-800
pares de bases (WHITE et al., 1990; GARDES; BRUNS, 1993) e aparece em
grande número de cópias no genoma permitindo que sejam amplificadas e
sequenciadas com facilidade. Como consequência disso, é grande o número
de sequências ITS de diferentes fungos armazenados nos bancos de dados de
sequências de nucleotídeos (FUNGARO, 2000). Isso permite a utilização do
basic local alignment search tool (BLAST), o qual compara a sequência
amplificada e sequenciada com as sequências armazenadas no banco de
dados no NCBI (National Center for Biotechnology Information) resultando na
identificação do organismo em nível de identidade conhecido.
3.2 Biomassa lignocelulósica
3.2.1 Aspectos gerais
A biomassa pode ser obtida de vegetais não lenhosos, de vegetais
lenhosos, como é o caso da madeira e seus resíduos, e também de resíduos
orgânicos, tais como resíduos agrícolas, urbanos e industriais (CORTEZ et al.,
2008), como mostrado na Figura 1. A biomassa lignocelulósica, a qual é
constituída principalmente de celulose, hemicelulose e lignina, é reconhecida
como uma fonte de energia, de combustíveis e de outros compostos químicos
renováveis (CHANDEL et al., 2013).
A biomassa vegetal desenvolveu ao longo da evolução mecanismos
estruturais e químicos complexos para resistir ao ataque de microrganismos e
animais aos seus açúcares estruturais (HIMMEL et al., 2007). O desafio
22
inerente da bioconversão de biomassa lignocelulósica reside na recalcitrância
das paredes celulares das plantas, que compreendem uma estrutura altamente
heterogênea e estável de celulose, hemicelulose e lignina (HATAKKA; VIIKARI,
2014). A busca por soluções para sobrepor a recalcitrância da biomassa
ligocelulósica deve manter uma visão integrada do processo, levando-se em
conta as diferentes rotas tecnológicas que podem ser utilizadas para conversão
dos polissacarídeos da biomassa em biocombustíveis e químicos renováveis.
Embora existam diferentes configurações de processamento de
biomassa lignocelulósica para obtenção de açúcares, algumas etapas são
comuns, tais como o pré-tratamento e a hidrólise enzimática. O pré-tratamento
reduz a recalcitrância da biomassa e facilita a ação de enzimas e o processo
de hidrólise. Na hidrólise, a celulose e hemicelulose (dependendo do pré-
tratamento) são degradadas por enzimas a seus monômeros.
Figura 1: Esquema das fontes de biomassa.
Fonte: CORTEZ et al., 2008.
23
Neste contexto, a sacarificação da biomassa lignocelulósica continua a
ser um desafio devido ao alto custo de enzimas para a hidrólise enzimática. A
recalcitrância da celulose é um dos fatores limitantes para a hidrólise
enzimática. A celulose é um polímero constituído de resíduos de D-glicose
unidos por ligações glicosídicas β-1,4. A cristalinidade da celulose é devida à
uniformidade química das unidades de glicose e à formação de pontes de
hidrogênio entre microfibrilas, resultando na formação de estruturas fibrosas
inacessíveis às enzimas hidrolíticas (HIMMEL et al., 2007). É bem conhecido
que a degradação microbiana da celulose depende da ação sinérgica de
endoglicanases, exoglicanases e β-glicosidases, bem como de enzimas
acessórias, que atuam na degradação dos demais componentes da parede
vegetal, como hemicelulose, pectina e lignina (SWEENEY et al., 2012).
3.2.2 Polissacarídeos da parede celular das plantas
Os polissacarídeos de parede celular das plantas são os compostos
orgânicos mais abundantes encontrados na natureza. Estes compostos
consistem principalmente em celulose, hemicelulose e pectina, como
representado na Figura 2, bem como a lignina, que é um polímero fenólico (DE
SOUZA, 2013; HIMMEL et al., 2007). Juntos, os polissacarídeos e a lignina
proporcionam alta complexidade e rigidez à parede celular das plantas.
A celulose é o principal polissacarídeo de parede celular das plantas. É
um homopolímero que comporta até 8000-15000 unidades de D-glicose unidas
por ligações glicosídicas β-1,4 (JUTURU; WU, 2014). As cadeias de celulose
são empacotadas juntas numa orientação paralela e os grupos hidroxila (OH)
nas moléculas de glicose dão origem a uma rede de ligações de hidrogênio
intra e inter cadeias, estabelecendo uma estrutura de microfibrila (fibrila
elementar), como mostrado na Figura 2 C. As fibrilas apresentam regiões com
elevado grau de cristalinidade, nas quais as cadeias de glicana estão
firmemente ligadas em paralelo, até regiões com menor grau de ordenação,
chamadas regiões amorfas (HATAKKA; VIIKARI, 2014).
24
Figura 2: Representação dos polissacarídeos presentes na parede celular das plantas.
Fonte: Adaptado de HIMMEL et al., 2007.
As pectinas são formadas por estruturas de heteropolissacarídeos
complexos unidos por ligações glicosídicas. As substâncias pécticas consistem
principalmente em galacturonanos e ramnogalacturomanos. A cadeia primária
consiste em unidades de ácido D-galacturônico unidos por ligações α-1,4 com
2-4% de unidades L-ramnose unidas por ligações β-1,2 e β-1,4 às unidades de
gacturonato. As cadeias laterais de arabinano, galactano, arabinogalactano,
fucose e xilose estão ligadas à cadeia principal através dos seus átomos de C1
e C2 (ALKORTA et al., 1998; JAYANY et al., 2005).
As hemiceluloses são formadas por estruturas de heteropolissacarídeos,
que apresentam açúcares com 6 carbonos (D-glicose, D-galactose, D-manose),
e com 5 carbonos (D-xilose, L-arabinose), assim como os açúcares ácidos D-
glucurônico, D-galacturônico, 4-O-metil-D-galacturônico (SUN et al., 2004).
A lignina é o principal polímero não carboidrato nas matérias-primas
lignocelulósicas e representa cerca de 20-30% (dependendo da origem
botânica da matéria-prima e condições de crescimento) em peso das matérias-
primas lignocelulósicas (ZHANG et al., 2007).
25
3.2.3 Importância da cultura de cana-de-açúcar
A cana-de-açúcar é uma espécie vegetal de grande importância para a
agricultura brasileira e mundial, sendo cultivada principalmente em regiões de
clima tropical e subtropical (GOLDEMBERG, 2007). A produção desta cultura
em 2016 alcançou 721,4 milhões de toneladas (IBGE, 2016). Seus principais
produtos são o açúcar e o etanol, sendo que o último apresenta elevado
interesse econômico-ambiental, pois trata-se de uma fonte renovável de
energia competitiva em relação aos derivados do petróleo (SOCCOL et al.,
2010; LOPES et al., 2016).
A cana-de-açúcar é uma planta semiperene, é considerada uma
espécie alógama, da família Poaceae, gênero Saccharum, no qual há seis
espécies: S. officinarum L., S. robustum Brandes e Jeswiet ex Grassl, S.
barberi Jeswiet, S. sinense Roxb, S. spontaneum L. e S. edule Hassk
(LANDELL; BRESSIANI, 2008). A espécie S. officinarum L. destaca-se das
demais devido à suas boas propriedades de industrialização e altos teores de
sacarose, sendo denominada como “cana nobre” (MATSUAKA et al., 1999;
LANDELL; BRESSIANI, 2008).
De acordo com o relatório do BALANÇO ENERGÉTICO NACIONAL
(BEN, 2016)(Figura 3), pode-se afirmar que 41,2% da eletricidade no Brasil são
originados de fontes renováveis e que a biomassa da cana-de-açúcar
representa 16,9% dessa energia. A implantação da tecnologia de produção de
etanol utilizando o bagaço de cana-de-açúcar no Brasil é favorecida porque o
processo de produção pode ser anexado às unidades de açúcar/etanol já
existentes e que exigem investimentos menores devido à infraestrutura,
logística e fornecimento de energia (SOCCOL et al., 2010). Os investimentos
em pesquisa sobre etanol celulósico têm estimulado a participação de algumas
empresas e vários grupos de pesquisa em todo o mundo para produzir não
apenas etanol, mas também outras moléculas para biocombustíveis, tais como
butanol e isobutanol (LOPES et al., 2016).
26
Figura 3: Esquema da repartição da oferta de energia no Brasil.
Fonte: BEN, 2016.
3.2.4 Bagaço de cana-de-açúcar
O bagaço é o resíduo que sobra após o esmagamento para extrair o
caldo de cana-de-açúcar e representa um terço da biomassa da cana-de-
açúcar, enquanto que outro terço é formado pelas folhas e pelo ponteiro, que
ficam no campo após a colheita (PANDEY et al., 2000). O bagaço de cana-de-
açúcar é composto de 38,1% glicose, 1,1% galactose, 23,3% xilose, 2,5%
arabinose, 18,4% lignina, 2,8% cinzas e 3,0% de proteína (BON et al., 2008).
O bagaço de cana-de-açúcar é considerado matéria-prima para
produção de etanol no Brasil (RABELO et al., 2011). A conversão da biomassa
do bagaço (celulose, hemicelulose e lignina) em etanol apresenta quatro
etapas principais: pré-tratamento, para tornar a celulose acessível; hidrólise
com a adição de enzimas ou um catalisador ácido para libertar os açúcares
monoméricos, fermetação para converter açúcares em etanol e destilação para
a recuperação do produto (ACHIVAS; EUVERINK, 2016). A desconstrução de
bagaço de cana-de-açúcar ainda tem desafios tecnológicos a serem superados
em escala industrial e novas tecnologias para a desmontagem da fibra de
cana-de-açúcar, bem como a utilização de enzimas, irão melhorar a eficiência
da hidrólise do bagaço (LOPES et al., 2016). A clivagem da celulose é realizada
27
por um coquetel enzimático contendo diferentes enzimas que atuam em
sinergismo para degradar as ligações glicosídicas da celulose.
3.3 Enzimas envolvidas na desconstrução de biomassa lignocelulósica
Diferentes microrganismos cooperam na degradação da lignocelulose e
o entendimento de como este processo ocorre na natureza pode contribuir para
o desenvolvimento de insumos para bioconversão de biomassa lignocelulósica.
De acordo com o conceito clássico, a degradação microbiana da
celulose depende da ação de diferentes hidrolases, como endoglicanases,
celobiohidrolases e β-glicosidases, e de enzimas acessórias, que atuam na
degradação dos demais componentes, como hemicelulose, pectina e lignina
(SWEENEY et al., 2012). O conceito clássico de que a degradação da celulose
é um processo hidrolítico foi revolucionado nos últimos anos. Isto se deve à
descoberta das monoxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs). Estas
enzimas realizam clivagem oxidativa da celulose (e também de hemicelulose,
amido e quitina) e atualmente a degradação destes polissacarídeos é
considerada um processo hidrolítico e oxidativo (AGGER et al., 2014).
As celulases são alvo de pesquisas desde 1950, quando Elwin Reese
publicou diversos trabalhos utilizando o fungo Trichoderma viride, que foi
reclassificado como Trichoderma reesei, em sua homenagem (BON et al.,
2008). Os fungos em geral produzem endoglicanases extracelulares e
exocelobiohidrolases que atuam em conjunto para hidrolisar a celulose
cristalina, sendo a glicose o principal produto (COUGHLAN, 1989). Os sistemas
fúngicos que podem degradar a celulose cristalina contém enzimas definidas
como exo-1,4-β-D-glicanases (normalmente celobiohidrolases, por exemplo,
1,4-β-D-glicano celobiohidrolase), endo-1,4-β-D-glicanases (endo-1,4-β-D-
glicano 4-glicano-hidrolase) e β-glicosidases como representado na Figura 4
(COUGHLAN, 1989).
As celulases fúngicas geralmente apresentam um módulo de ligação de
carboidratos (CBM), que promove a associação da enzima com o substrato
(DE SOUZA, 2013). As enzimas podem ser compostas por um único módulo
catalítico ou por múltiplos domínios.
28
Figura 4: Representação dos sistemas fúngicos para hidrolisar a celulose. As endo-1,4-β-D-glicanases hidrolizam as ligações de celulose internamente, enquanto as endo-1,4-β-D-glicanase clivam unidades de celobiose das extremidades das cadeias de polissacarídeos. As unidades de celobiose liberadas (dissacarídeo) são finalmente hidrolisadas por β-glicosidases, liberando a molécula de glicose.
Fonte: DE SOUZA, 2013.
As celulases fúngicas mais extensamente estudadas contêm um módulo
catalítico ligado a um CBM através de um ligante peptídico altamente
glicosilado e flexível. A Figura 5 mostra a atividade de uma exoglicanase (Cel
7A) de T. reesei no substrato celulose.
Devido à sua complexa estrutura, é necessário um conjunto de enzimas
para a despolimerização completa dos carboidratos da lignocelulose.
Dependendo do tipo de biomassa e pré-tratamento utilizados, além das
celulases, as hemicelulases e outras enzimas são necessárias para a
conversão eficiente da biomassa (HATAKKA; VIIKARI, 2014). A eficiência de
um coquetel enzimático para bioconversão de biomassa pode ser aumentada
por meio da adição de enzimas que atuam sobre outros componentes ou de
proteínas com ação sinérgica às celulases, de modo a obter misturas
adequadas para a biomassa de interesse (FÁVARO; POLETTO, 2013).
29
Figura 5: Atividade de exoglucanase Cel 7A de T. reesei no substrato celulose. A enzima tem um pequeno domínio de ligação a carboidratos (CDB) de 36 aminoácidos, um ligante flexível longo com O-glicano (azul escuro) e um grande domínio catalítico (CD) N-ligado com glicano (rosa) que pode enrolar uma única celulose no túnel catalítico. a) Cel 7A ligando-se à celulose, b) Reconhecimento da extremidade redutora de uma cadeia de celulose, c) Início da cadeia de celulose no túnel catalítico, d) O enroscamento e a formação de complexo catalíticamente ativo, e) Hidrólise em um ciclo de processo e f) Expulsão do produto e rosqueamento de outra celobiose (mostrada em amarelo em e e f).
Fonte: Adaptado de QUIROZ-CASTAÑEDA; FOLCH-MALLOL, 2013.
De modo semelhante à degradação da celulose, a despolimerização da
hemicelulose também requer a ação sinérgica de diferentes enzimas. Por
exemplo, para a completa degradação de xilana são necessárias endo-1,4-β-
xilanases e também α-glucuronidase, α-L-arabinofuranosidase, acetilxilana
esterase e β-xilosidases (YANG et al., 2011; HATAKKA; VIIKARI, 2014). Para a
degradação de galactoclucomananas são requeridas endo-1,4-β-glicanases,
endo-1,4-β-mananases, α-galactosidases, acetilmanana esterases, β-
manosidases e β-glicosidases. Outras enzimas que atuam nas ligações entre
carboidratos e lignina também são importantes para desconstrução da
biomassa, tais como feruloil esterase (HATAKKA; VIIKARI, 2014).
A função das hemicelulases tem sido estudada a fim de aumentar a
quantidade de açúcares liberados e para customizar ou otimizar misturas de
enzimas para conversão eficiente da biomassa a seus monômeros (HATAKKA;
VIIKARI, 2014). A combinação de sistemas hidrolíticos e oxidativos tem sido
avaliada para aumentar a hidrólise de substratos (biomassas pré-tratadas)
30
contendo lignina (HORN et al., 2012). Neste caso, são inúmeros os exemplos
de aumento de eficiência de conversão com a adição das monoxigenases
líticas de polissacarídeos (LPMOs) em misturas de celulases (BEESON et al.,
2015), mostrando a importância dessas oxidases para aplicações em
biorrefinarias.
Outros componentes não hidrolíticos ou oxidativos também têm sido
estudados como aditivos do processo de sacarificação. Neste aspecto, tem
sido proposto que o afrouxamento de microfibrilas de celulose por meio da
ação de proteínas não-hidrolíticas pode facilitar o acesso das enzimas
hidrolíticas à porção interior das fibras, aumentando a área superficial
disponível e tornando a sacarificação mais eficiente (ARANTES et al., 2010).
Entre as proteínas não-hidrolíticas conhecidas como indutoras de
afrouxamento de celulose, diminuidoras da cristalinidade e/ou estimuladoras da
ação de celulases estão as expansinas (SAMPEDRO et al., 2005). Estas
proteínas são encontradas em diferentes organismos, incluindo fungos, e uma
característica comum é a capacidade de ligação a carboidratos e a ausência de
atividade hidrolítica: as expansinas rompem pontes de hidrogênio entre as
microfibrilas de celulose. Tais proteínas teriam a vantagem de permitir a
diminuição da quantidade de celulases que deve ser adicionada (ARANTES et
al., 2010), diminuindo os custos de bioconversão de biomassa.
Os fungos são os principais degradadores de lignocelulose na natureza,
e de fato, todas as enzimas descritas como importantes para desconstrução da
biomassa têm sido encontradas ou descobertas a partir do estudo destes
organismos. Dessa forma, pesquisas que visam agregar valor à imensa
biodiversidade dos fungos são necessárias e podem levar à descoberta de
ativos biotecnológicos importantes para uso em biorrefinarias baseadas em
lignocelulose.
31
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Linhagens utilizadas
Os fungos avaliados (409 linhagens) foram previamente isolados de
raízes e folhas sadias de cana-de-açúcar (Piracicaba-SP), por meio de
metodologia de desinfecção superficial (STUART, 2006; MENDES, 2008;
ROMÃO, 2010; STUART et al., 2010; ROMÃO-DUMARESQ et al., 2016). A
autorização de acesso ao patrimônio genético concedida pelo Conselho de
Gestão do Patrimônio Genético (CGEN) para pesquisa com estes fungos é
02001.008898/2012-21.
As linhagens foram avaliadas quanto à viabilidade e pureza. Para tanto,
os fungos foram transferidos do estoque original para meio de cultura PDA
(Potato Dextrose Agar) acrescido do antibiótico estreptomicina (50 µg.mL-1). As
placas foram incubadas a 25°C por até 10 dias em câmara de crescimento com
fotoperíodo. Após o crescimento, os fungos foram avaliados quanto à
viabilidade e presença de contaminantes. As linhagens contaminadas com
bactérias ou outros fungos foram repicadas para novo meio de cultura até sua
completa purificação. As linhagens que não apresentaram crescimento após
sucessivas tentativas de cultivo foram descartadas da coleção. Os fungos
foram preservados (em triplicata) pelo método Castellani (CASTELLANI, 1967).
Para tanto, entre 10-20 discos de 8 mm de diâmetro com micélio foram
transferidos de culturas jovens para tubos com tampa de rosca de 5 mL,
contendo 2,8 mL de água destilada esterilizada. Os 409 fungos purificados
encontram-se na coleção de “Microrganismos e Microalgas Aplicados a
Agroenergia e Biorrefinarias” da Embrapa Agroenergia/Brasília-DF como
mostrado na Tabela 2 (Anexo A).
O fungo mutante melhorado Trichoderma reesei RUT C-30 (ATCC 56765)
foi utilizado nos experimentos de produção de enzimas. Esta linhagem é
considerada padrão para estudos de produção de celulases, sendo
reconhecida pela produção de exo e endoglicanases. A linhagem foi
preservada pelo método Castellani (CASTELLANI, 1967).
32
4.2 Caracterização molecular de fungos endofíticos de cana-de-açúcar
4.2.1 Extração e manipulação de ácidos nucléicos
Fragmentos de micélio dos fungos crescidos em PDA (com 50 µg.mL-1 de
estreptomicina) foram inoculados em tubos do tipo Falcon de 50 mL, contendo
15 mL de meio de cultura PDB (Potato Dextrose Broth). Os fungos foram
incubados por até 15 dias a 28°C e 200 rpm. Após o cultivo, o micélio foi
coletado por filtração, seco em papel filtro esterilizado, embrulhado em folha de
alumínio esterilizada e armazenado em freezer (-20°C).
O micélio congelado foi triturado em nitrogênio líquido até a formação de
um pó fino e a extração de ácidos nucléicos foi realizada de acordo com
metodologia de Raeder e Broda (1985), com modificações. As modificações
consistiram no aumento dos tempos de incubação e centrifugação, bem como
aumento do número de etapas de lavagens com solventes, e no tratamento
com RNAse, para clivagem do RNA. A qualidade/integridade e a quantificação
dos ácidos nucléicos foram avaliadas tanto por espectrofotômetro NanoDrop
ND-1000 (NanoDrop Technologies) quanto por eletroforese em gel de agarose
1% utilizando o DNA de bacteriófago lambda com concentração conhecida. O
gel de agarose foi corado com brometo de etídio e fotodocumentado sob luz
UV. O DNA genômico foi preservado a -20°C.
4.2.2 Amplificação da região ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossômico, purificação
dos produtos de PCR e sequenciamento
A região ITS1-5.8S-ITS2 do rDNA foi amplificada com os primers ITS1-F
(5’CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA3’) (GARDES; BRUNS, 1993) e ITS4
(5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’) (WHITE et al., 1990), os quais amplificam
uma região de aproximadamente 600 pares de bases. As reações foram
preparadas (triplicata) em volume de 50 µL, contendo 0,2 mM de dNTP; 3,7
mM de MgCl2; tampão 1X (200mM Tris-HCL pH 8,4, 500 mM KCl) (Invitrogen);
1,5 U.µL-1 de Taq DNA Polymerase (Invitrogen); 0,8 µM de cada iniciador e 20
ng de DNA genômico. A amplificação foi realizada em termociclador (Applied
Biosystems Foster City, CA) programado para desnaturação inicial a 94°C por
33
4 min, seguido de 30 ciclos. Cada ciclo consistiu de 30 s a 94°C, 30 s a 55°C e
30 s a 72°C, seguido de extensão a 72°C por 10 min.
Os produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose 1%
corado com brometo de etídio e fotodocumentado sob luz UV. Os produtos de
amplificação (150 µL para cada linhagem) foram purificados utilizando Quick
Gel Extraction & PCR Purification Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). As
amostras foram sequenciadas pela empresa Eurofins do Brasil LTDA. O
sequenciamento foi realizado com ambos os iniciadores ITS1-F e ITS4.
4.2.3 Análise de sequências de ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossômico contra
diferentes bases de dados e análise filogenética para classificação taxonômica
As sequências de ITS foram analisadas com auxílio do software
Geneious versão 9.1 (Biomatters Ltd., Auckland, New Zealand) para checagem
da qualidade e obtenção da sequência consenso. As sequências foram
comparadas com o auxílio da ferramenta BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool) contra a base de dados do GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Além do GenBank, bases de dados de
fungos filamentosos foram utilizadas por conterem sequências de DNA
ribossômico curadas de linhagens-tipo (type strains): Centraalbureau voor
Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre (http://www.cbs.knaw.nl/),
MycoBank (http://www.mycobank.org/), Ribosomal Database Project (RDP)
(http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp). Para linhagens pertencentes
ao filo Basidiomycota e aos gêneros Trichoderma e Fusarium, além das bases
de dados citadas, também foram utilizadas as bases de dados AFTOL –
Assembling the Fungal Tree of Life (http://www.aftol.org/index.php), TrichOKEY
(http://www.isth.info/tools/molkey/index.php) e Fusarium-ID
(http://isolate.fusariumdb.org/index.php), respectivamente.
A análise filogenética foi realizada de modo a confirmar a identificação
e obter maior acurácia na classificação taxonômica. Para tanto, datasets foram
construídos incluindo as sequências de interesse bem como sequências de
linhagens tipo (type strains) disponíveis em bancos de dados. Um dataset foi
construído para cada gênero e seu conjunto de prováveis espécies. Os
alinhamentos das sequências de ITS de cada dataset e a análise filogenética
34
foram realizados com os algoritmos MAFFT (KATOH et al., 2002) e PhyML
(GUINDON et al., 2010), respectivamente, ambos implementados no programa
Geneious versão 9.1 (Biomatters Ltd., Auckland, New Zealand). As árvores
filogenéticas foram visualizadas com o auxílio do programa FigTree
(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) e o suporte dos ramos foi calculado
pelo teste de Shimodaira-Hasegawa (SH test) (SHIMODAIRA et al., 1999).
Após a análise, os dados de classificação obtidos foram plotados em tabela.
4.3 Avaliação da capacidade de produção de enzimas para desconstrução
de biomassa lignocelulósica
4.3.1 Avaliação de produção de enzimas em meio de cultura sólido
Os fungos foram caracterizados quanto à produção de enzimas por testes
em meio de cultura sólido (difusão em ágar). Discos de 8 mm de diâmetro
contendo micélio dos fungos crescidos em PDA a 25°C durante 7 dias foram
transferidos para placas de Petri (90 x 15 mm) contendo 20 mL de meio de
cultura acrescido de diferentes fontes de carbono, conforme descrito a seguir.
4.3.1.1 Hidrólise de carboximetilcelulose, xilana, pectina e amido
A capacidade de hidrolisar carboximetilcelulose (CMC), xilana e amido
(produção de endoglicanase, xilanase e amilase, respectivamente) foi avaliada
em meio mínimo de sais de Aspergillus nidulans (PONTECORVO et al., 1953)
contendo (em g/L): NaNO3 6,0; KCl 0,5; KH2PO4 1,5; MgSO4 0,5; ZnSO4 0,001;
FeSO4 0,001; ágar 15; suplementado com 1% de CMC, 1% de xilana ou 1% de
amido solúvel (Sigma-Aldrich) como fonte de carbono. O pH foi corrigido para
6,8 e após a esterilização 0,1% de Triton X-100 foi adicionado ao meio de
cultura. Este tem a função de restringir o crescimento dos fungos, o que facilita
a visualização de halo de degradação na placa de Petri.
A capacidade de hidrolisar pectina (produção de poligalacturonase) foi
avaliada conforme Hankin e Anagnostakis (1975). A composição do meio de
cultura foi: 1 g/L de extrato de levedura; 5 g/L de pectina cítrica (Sigma-Aldrich);
20 g/L de ágar; 50 mL de solução de sais 10X concentrada. A composição da
solução de sais 10X concentrada foi a seguinte: 20 g/L de (NH4)2SO4; 40 g/L de
35
KH2PO4; 60 g/L de Na2HPO4; 2 g/L de FeSO4; 0,01 g/L de CaCl2; 0,0001 g/L de
H3BO3; 0,0001 g/L de MnSO4; 0,0001 g/L de ZnSO4; 0,0005 g/L de CuSO4.
Após dissolução total de todos os reagentes, o pH foi corrigido para 5,0. Após
esterilização, 0,1% de Triton X-100 foi adicionado ao meio de cultura.
A degradação de xilana, pectina e amido foi detectada após adição de 10
mL de solução de iodo (iodeto de potássio: 3g; iodo ressublimado: 1g; água
destilada: 100 mL) sobre cada colônia. Em seguida, a solução de iodo foi
descartada e a degradação do substrato foi revelada pela adição de 20 mL de
água destilada. A degradação de CMC foi verificada após adição de 10 mL de
solução de vermelho congo (0,1%) sobre cada colônia e incubação das placas
a temperatura ambiente por 30 minutos. A solução de corante foi descartada e
as placas foram reveladas com solução de NaCl 1M por alguns minutos.
Para a análise da degradação de CMC, xilana, pectina e amido, o
delineamento experimental foi do tipo inteiramente casualizado com 3
repetições. As linhagens foram incubadas a 25°C por 96 horas. A medição do
diâmetro da colônia e do halo de degradação foi realizada em dois sentidos
perpendiculares com o auxílio de paquímetro digital. O diâmetro da colônia foi
mensurado antes de efetuar a revelação das placas com os corantes. O
diâmetro do halo foi mensurado imediatamente após a revelação com os
corantes. Os dados foram utilizados para determinar o índice enzimático (IE),
expresso pela razão entre a média do diâmetro do halo e a média do diâmetro
da colônia (IE = diâmetro do halo / diâmetro da colônia). Os dados de IE foram
analisados com o software R versão 3.2.3 (Wooden Christmas-Tree) (R
Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria), onde foi realizada
análise de variância seguida de comparação das médias por meio do teste de
Scott-Knott (1974) com o objetivo de separar as médias de cada fonte de
carbono em grupos homogêneos, ao nível de 5% de significância.
4.3.1.2 Análise de crescimento em celulose microcristalina (Avicel)
Para avaliar a capacidade de crescimento em celulose microcristalina
(produção de celulases), utilizou-se o meio mínimo de sais de A. nidulans
(PONTECORVO et al., 1953) contendo 10 g/L de Avicel pH-101 (Sigma-
Aldrich) como única fonte de carbono e pH ajustado para 6,8. A incubação foi
realizada por 96 horas a 25°C e após este período os diâmetros das colônias
36
foram medidos com auxílio de paquímetro digital. O delineamento experimental
foi do tipo inteiramente casualizado com três repetições. Os dados foram
analisados com o software R versão 3.2.3 (Wooden Christmas-Tree) (R
Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria), onde foi realizada
análise de variância seguida de comparação das médias por meio do teste de
Scott-Knott (1974) com o objetivo de separar as médias em grupos
homogêneos, ao nível de 5% de significância.
4.3.1.3 Seleção de linhagens promissoras para desconstrução de bagaço de
cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor
Alguns critérios foram definidos para a seleção de linhagens produtoras
de enzimas: perfil de degradação de polissacarídeos, valores elevados de
índice enzimático, valores elevados do diâmetro das colônias (no caso de
crescimento em Avicel), classificação taxonômica e análise de literatura.
Para determinar o perfil de degradação de polissacarídeos (CMC, xilana,
pectina e amido), considerou-se valores estatísticos de índice enzimático
superiores a 1. Dessa forma, as 409 linhagens foram categorizadas em classes
de acordo com a capacidade de degradar cada substrato (degradação
exclusiva ou simultânea dos polissacarídeos). Para visualização do perfil de
degradação, os dados de índice enzimático (médias) foram utilizados para a
construção de gráficos do tipo heatmap, com o auxílio da ferramenta ClustVis
(http://biit.cs.ut.ee/clustvis/), que implementa diversos pacotes do software R
para clusterização e visualização de dados (METSALU et al., 2015). A
representação gráfica dos dados na forma de heatmap também foi realizada
para os resultados de crescimento (médias) em Avicel.
4.3.2 Hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por
explosão a vapor utilizando extrato enzimático de fungos selecionados
4.3.2.1 Cultivo e obtenção do extrato enzimático
Com base nos critérios descritos no item 4.3.1.3, linhagens foram
selecionadas para testes de hidrólise enzimática de bagaço de cana pré-
tratado. Os fungos foram cultivados em meio de cultura contendo tributirina (10
37
g/L de triptona; 5 g/L de NaCl; 5 g/L de extrato de levedura; 5 mL de tributirina;
20 g/L de ágar; pH 6,8). Este meio de cultura favorece o crescimento micelial e
reduz a esporulação dos fungos. O cultivo foi realizado a 25° C durante 7 dias.
O meio de cultura utilizado para produção do extrato enzimático foi
preparado conforme descrito a seguir: o bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado
por explosão a vapor, lavado e úmido (doação de instituição parceira da
Embrapa Agroenergia) foi seco a 65°C por 72 horas, moído em moinho de
facas tipo Willye (Tecnal, Brasil) e peneirado em peneira de 10 mesh, para
obter um pó fino usado como fonte de carbono no meio de cultura.
Em frascos Erlenmeyer de 250 mL adicionou-se 1 g de bagaço de cana-
de-açúcar seco e moído e 250 mg de farelo de trigo destinado ao mercado da
indústria de rações (Bunge Alimentos S/A, Esteio – Brasil). Em seguida, 50 mL
de meio de cultura de sais de Mandels e Weber (1969) (0,3 g/L de uréia; 1,4
g/L de (NH4)2SO4; 2 g/L de K2HPO4; 0,4 g/L de CaCl2.2H2O; 0,3 g/L de
MgSO4.7H2O; 0,75 g/L de peptona; 0,25 g/L extrato de levedura; 5 mg/L de
FeSO4.7H2O; 1,04 mg/L de MnSO4.7H2O; 2 mg/L CoCl2.6H2O), acrescido de
0,1% de PEG 6000 foram distribuídos nos frascos Erlenmeyer. Cada frasco foi
inoculado com 5 discos de 8 mm de diâmetro de micélio dos fungos
previamente crescidos no meio de cultura de tributirina.
O cultivo foi realizado em duplicata. Como controle positivo, foi utilizada
a linhagem mutante celulolítica Trichoderma reesei RUT C-30 (ATCC 56765).
O cultivo foi realizado por 7 dias (30°C; 200 rpm). Após o cultivo, o conteúdo
total de cada frasco foi vertido em tubo de 50 mL e centrifugado a 4000 rpm por
30 minutos a 4°C. Após a centrifugação, o sobrenadante foi transferido para um
novo tubo de 50 mL e centrifugado novamente nas mesmas condições, com o
objetivo de obter um sobrenadante limpo (sem células vivas). Após a
centrifugação, azida sódica (0,02 % m/v) foi adicionada ao sobrenadante e a
amostra foi preservada em geladeira até a avaliação enzimática.
4.3.2.2 Determinação do potencial de sacarificação do extrato enzimático
Para determinar o potencial de sacarificação do extrato enzimático de
cada fungo, foi avaliada a atividade total de celulases - FPase, utilizando o
papel Whatman n°1 como substrato. Para tanto, foi realizado ensaio
38
miniaturizado em microplaca de 96 poços, com discos de 6 mm de diâmetro do
papel filtro Whatman n°1 (GE Healthcare, UK) (XIAO et al., 2004).
Com o auxílio de uma pinça, um disco de papel filtro foi colocado em um
poço da microplaca e 40 µL de tampão citrato de sódio/ácido cítrico 0,1mol/L
pH 5,0 foram adicionados, juntamente com 20 µL do extrato enzimático. Após
incubação por 60 minutos a 50°C, 120 µL de solução de ácido 3,5-dinitro-
salicílico (MILLER, 1959) foram adicionados e a mistura foi novamente
incubada por 10 minutos a 97°C. Após a incubação, uma alíquota de 36 µL foi
retirada de cada um dos poços e transferida para uma microplaca do tipo Elisa
contendo 160 µL de água deionizada em cada poço. Após leitura da
absorbância a 540 nm (SpectraMax M2e, Molecular Devices Co., Sunnyvale,
CA, EUA), a quantidade de açúcares redutores foi avaliada. Os controles
correspondentes foram realizados para todas as etapas descritas.
Para determinar a quantidade de açúcar redutor liberado durante o
ensaio enzimático foi construída uma curva de calibração com D-glicose com
uma solução estoque de 10 mg/mL variando a concentração do açúcar entre
2,0 – 6,7 mg/mL com tampão citrato de sódio/ácido cítrico 0,1mol/L pH 5,0. A
atividade enzimática foi expressa em U/mL, sendo definida como a quantidade
de açúcares redutores liberados na unidade de tempo por mililitro de enzima
(μmol de açúcar redutor/min/mL).
4.3.2.3 Determinação de proteína total do extrato enzimático
A quantificação de proteínas totais dos extratos enzimáticos foi
determinada pelo método do ácido bicinconínico. Em uma microplaca do tipo
Elisa, foram adicionados 25 µL do extrato bruto separadamente em cada poço,
em triplicata, e 200 µL do reagente BCA (Bicinchoninic acid kit for protein
determination, Sigma-Aldrich). A microplaca foi incubada por 30 minutos a 37°C
e em seguida a leitura no comprimento de onda 562 nm foi realizada em
espectrofotômetro (SpectraMax M2e, Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA,
EUA). Uma solução de BSA (albumina sérica bovina) (2 mg/mL) foi usada para
construção da curva padrão, variando a concentração de proteína entre 0,05 –
2 mg/mL com tampão citrato de sódio/ácido cítrico 0,1 mol/L pH 5,0.
39
4.3.2.4 Hidrólise enzimática de biomassa de cana-de-açúcar pré-tratada por
explosão a vapor
O extrato enzimático de cada linhagem selecionada foi avaliado quanto à
capacidade de hidrolisar biomassa de cana-de-açúcar pré-tratada por explosão
a vapor. A biomassa pré-tratada foi doada por instituição parceira da Embrapa
Agroenergia. Os resultados obtidos neste processo foram comparados com os
resultados obtidos com a linhagem mutante celulolítica T. reesei RUT C-30.
A hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado foi realizada em placas de
24 poços de 10 mL (Axygen Biosciences) com 5% de carga de sólidos e com
50 mg de proteínas do extrato enzimático por grama de glicana presente no
bagaço pré-tratado. Em cada poço da placa foram adicionados diferentes
volumes do extrato enzimático bruto e do tampão citrato de sódio/ácido cítrico
0,1mol/L pH 5,0, visando a padronização da concentração das proteínas com a
concentração da biomassa a ser hidrolisada. Uma vez que o cultivo dos fungos
foi realizado em duplicata, a hidrólise também foi feita da mesma maneira,
mantendo separadas as duplicatas do cultivo. A hidrólise enzimática foi
realizada a 200 rpm a 50 °C até 32 horas de incubação com avaliações nos
tempos 0h, 8h, 24h e 32h. Em cada tempo, 1 mL do hidrolisado foi coletado,
centrifugado a 14.000 rpm por 10 minutos a 4°C e posteriormente avaliado para
determinação de glicose e de açúcares redutores totais (ART).
4.3.2.5 Determinação de açúcares redutores totais (ART) e de glicose
A hidrólise enzimática foi avaliada por quantificação de açúcares
redutores totais (ART) pelo método de DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico)
(MILLER, 1959) e quantificação de glicose por cromatografia líquida (CLAE). A
determinação de ART foi realizada em microplacas de 96 poços. As placas
foram vedadas e incubadas em termociclador (Applied Biosystems) a 95°C por
10 minutos. Após a incubação, uma alíquota de 36 µL foi retirada de cada um
dos poços e transferida para uma microplaca de Elisa contendo 160 µL de
água deionizada. A quantidade de açúcares redutores foi determinada após
leitura da absorbância a 540 nm (SpectraMax M2e, Molecular Devices Co.).
Para determinar a quantidade de açúcar redutor liberado durante o
processo de hidrólise foi construída uma curva de calibração com D-glicose
40
com uma solução de 10 mg/mL variando a concentração do açúcar entre 1,0 –
6,7 mg/mL com tampão citrato de sódio/ácido cítrico 0,1mol/L pH 5,0. A
concentração de glicose liberada na hidrólise enzimáica em todos os tempos
de avaliação (tempos 0h, 8h, 24h e 32h) foi quantificada por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE) utilizando uma coluna cromatográfica Aminex
HPX-87H (BioRad; Richmond, CA) com ácido sulfúrico (0,005 M) como fase
móvel a 45 °C e uma vazão de 0,6 mL/minuto e detector de índice de refração
(RID). O tempo de corrida para cada amostra foi de 11 minutos.
41
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Classificação taxonômica de fungos endofíticos de cana-de-açúcar
baseada em análise de sequência de DNA ribossômico
Produtos de amplificação únicos da região ITS1-5.8S-ITS2 do DNA
ribossômico (600 pares de bases, aproximadamente) foram obtidos para 354
linhagens. A Figura 6 representa o perfil de amplificação obtido para algumas
linhagens com os primers ITS1-F e ITS4. Para 55 das 409 linhagens, apesar da
boa qualidade do DNA genômico extraído, não foi possível obter produtos de
amplificação da região ITS1-5.8S-ITS2.
Figura 6: Produtos purificados de amplificação da região ITS do rDNA de fungos endofíticos de cana-de-açúcar obtidos com os primers ITS1-F e ITS4 (gel de agarose 2%). O marcador de peso molecular Low Mass DNA Ladder (Invitrogen) está representado na lateral esquerda da figura.
De 354 linhagens sequenciadas, 296 apresentaram sequências com
qualidade para análise. Os fungos foram classificados como pertencentes ao
filo Ascomycota (total de 290 linhagens, sendo 145 linhagens da classe
Sordariomycetes, 123 linhagens da classe Eurotiomycetes, 19 linhagens da
classe Dothideomycetes, e 3 linhagens da classe Leotiomycetes). Seis (6)
linhagens foram classificadas como pertencentes ao filo Basidiomycota
(Agaricomycotina). Ao todo, 31 gêneros diferentes foram identificados. A
Tabela 3 (Anexo B) resume os dados de classificação.
Linhagens de Beauveria, Dokmaia, Exserohilum, Myrmecridium,
Schizophyllum e Thielavia apresentaram 100% de identidade com sequências
42
de espécies tipo depositadas em bancos curados de sequências de fungos
(Mycobank, CBS e RDP) Tabela 3 (Anexo B). Para algumas linhagens (p. ex:
21, 94, AR148, AR221, AR294A) a classificação foi inconclusiva quando as
sequências foram avaliadas nas bases de dados GenBank, Mycobank, CBS e
RDP (Tabela 3 - Anexo B). O mesmo foi observado para algumas linhagens
pertencentes a gêneros com taxonomia complexa (Aspergilus, Fusarium,
Talaromyces e Trichoderma). Para melhor acurácia na identificação, a análise
filogenética foi realizada.
Árvores filogenéticas foram construídas (dados não mostrados) para 25
gêneros (Aspergillus, Bipolaris, Chaetomium, Clonostachys, Diaporthe,
Epicoccum, Eutypella, Exophiala, Fusarium, Mariannaea, Neurospora,
Omnidenptus, Paraphaeosphaeria, Penicillium, Peniophora, Phaeocytostroma,
Phialocephala, Resinicium, Saccharicola, Scytalidium, Talaromyces, Thozetella,
Trichoderma, Xenoacremonium, Xylaria), bem como para as linhagens AR221
(Ordem Pleosporales), AR261B (Família Stachybotriaceae) e 21 (Subfilo
Agaricomycotina).
O resultado da análise filogenética é apresentado na Tabela 3 (Anexo B,
última coluna). Com esta análise foi possível classificar 251 linhagens entre as
296 avaliadas. Das 45 linhagens que não puderam ser classificadas, 42
apresentaram identidade próxima a espécies conhecidas (Tabela 3 - Anexo B).
Três linhagens não puderam ser classificadas mesmo após a análise
filogenética e foram denominadas com o nome do grupo a que pertencem: 21
(Agaricomycotina), AR221 (Pleosporales) e AR261B (Stachybotriaceae).
Como exemplo da utilidade da análise filogenética da região ITS para
classificação dos fungos são apresentados os resultados da linhagem 94.
Quando sua sequência foi avaliada nas bases de dados GenBank, Mycobank,
CBS e RDP, a classificação foi inconclusiva, sendo classificada como membro
da família Magnaporthaceae, com apenas 68% de identidade com fungos do
gênero Gaeumannomyces (Tabela 3 - Anexo B). Sequências de ITS de
linhagens tipo de todas as espécies de fungos desta família foram buscadas na
literatura e no GenBank e utilizadas para a análise filogenética. Desta forma, foi
possível classificar a linhagem 94 como pertencente ao gênero Omnidemptus,
com elevada identidade com a espécie Omnidemptus affinis (Figura 7).
43
A maioria das linhagens identificadas pertencem aos gêneros
Aspergillus, Fusarium, Talaromyces e Trichoderma. Estes gêneros são
complexos quanto à taxonomia, com “seções” ou “agregados” de espécies
estreitamente relacionadas. Os resultados de classificação destas linhagens
são apresentados a seguir, sendo que os resultados de filogenia de Aspergillus
são mostrados com maior detalhe. Conforme mostrado na Tabela 3 (Anexo B),
a análise filogenética da região ITS permitiu confirmar a identidade da maioria
das linhagens destes gêneros.
Com relação a Fusarium, as 100 linhagens foram classificadas em sete
(7) espécies diferentes (F. begoniae, F. brachygibbosum, F. dlaminii, F. lactis,
F. oxysporum, F. sacchari, F. solani). As espécies mais frequentes foram F.
brachygibbosum (59%) e F. oxysporum (18%). Oito (8) linhagens do “complexo
fujikuroi” (F. fujikuroi complex) e uma (1) linhagem do “complexo oxysporum”
(F. oxysporum complex) não puderam ser identificadas com exatidão (Tabela 3
- Anexo B). De acordo com a base de dados Fusarium-ID, além da região ITS,
outros genes são indicados para separar espécies pertencentes a estes
complexos (tef1 - translation elongation fator 1-alpha; β-tubulina, calmodulina).
Entre as 40 linhagens de Talaromyces foi possível delimitar nove (9)
espécies (T. angelicus, T. assiutensis, T. diversus, T. funiculosus, T.
minioluteus, T. pinophilus, T. rubicundus, T. trachyspermus, T. wortmannii),
sendo T. pinophilus a espécie mais frequente (32,5%). A linhagem AR218 não
foi classificada, porém apresenta identidade com espécies da “seção
Talaromyces” (Tabela 3 - Anexo B). A análise filogenética de Penicillium foi
realizada junto com Talaromyces, devido à proximidade filogenética destes
gêneros. Como visto, duas linhagens (150 e AR122) foram identificadas como
P. citrinum (seção Citrina) (Tabela 3 - Anexo B).
44
Figura 7: Filogenia de espécies da família Magnaporthaceae com base na sequência de ITS rDNA. A linhagem 94 é destacada em negrito (semelhante à Omnidenptus affinis ATCC 200212, linhagem tipo). Os ramos da árvore filogenética (Maximum likelihood - ML) são mostrados em círculos e as cores representam o suporte dos ramos, de acordo com o teste de Shimodaira-Hasegawa (SH test).
45
As 10 linhagens de Trichoderma foram classificadas em quatro (4)
espécies (T. afroharzianum, T. asperelloides, T. lentiforme, T. virens). Duas
linhagens (AR41 e AR273) apresentaram identidade próxima a algumas
espécies do “complexo koningii” (T. koningii aggregate species) (Anexo B -
Tabela 3). Devido à proximidade filogenética de espécies do “agregado T.
koningii” outros genes são indicados (além de ITS rDNA) para resolução da
classificação, tais como tef1 (translation elongation fator 1-alpha), actina e
calmodulina (SAMUELS et al., 2006).
Entre as 81 linhagens de Aspergillus foram reconhecidas nove (9)
espécies (A. alabamensis, A. brasiliensis, A. flavus, A. fumigatus, A. hortai, A.
parasiticus, A. pseudoterreus, A. terreus, A. tubingensis). A. terreus e A.
fumigatus foram as mais frequentes (46,91% e 19,75%, respectivamente).
Apenas oito (8) linhagens não puderam ser classificadas, mas foram agrupadas
com outras espécies da “seção Terrei”, diferentes de A. terreus, conforme
filogenia apresentada na Figura 8. Para algumas espécies estreitamente
relacionadas da “seção Terrei”, a análise da região ITS não é suficiente para
delimitação de espécies, conforme mostrado na Figura 8, sendo necessária
também a análise dos genes β-tubulina e calmodulina (SAMSON et al., 2011).
46
Figura 8: Filogenia de espécies de Aspergillus (ITS rDNA). As linhagens endofíticas de cana-de-açúcar são mostradas em negrito. Os ramos da árvore filogenética (Maximum likelihood - ML) são mostrados em círculos e as cores representam o suporte dos ramos (teste de Shimodaira-Hasegawa, SH test).
47
A caracterização molecular por meio de análise da região ITS do rDNA
permitiu classificar a maioria dos fungos. A região ITS é indicada como
marcador para estudos taxonômicos (SCHOCH et al., 2012). Diferentes bases
de dados podem ser utilizadas para classificação (Mycobank, CBS, RDP) por
conterem sequências de ITS de linhagens tipo (HIBBETT et al., 2016). No
entanto, estas bases de dados não possuem sequências de todas as espécies
de fungos (HIBBETT et al., 2016) e dessa forma análises filogenéticas são
necessárias para evitar classificação inconclusiva.
Além disso, para alguns grupos com taxonomia complexa, a região ITS
apresenta limitações para delimitar espécies e outros genes devem ser
utilizados para garantir acurácia na identificação (CHAVERRI et al., 2015). Isto
foi observado no presente trabalho para algumas linhagens de Aspergillus,
Fusarium, Talaromyces e Trichoderma, as quais não puderam ser identificadas
mesmo após análise filogenética. Isso demonstra a necessidade de utilização
de outros marcadores para classificação destas linhagens.
A classificação taxonômica é uma etapa importante durante a
prospecção de linhagens para fins biotecnológicos, pois pode ser utilizada
como um dos critérios para seleção de linhagens de interesse. De acordo com
Fávaro e Poletto (2013) a correta identificação é necessária em diferentes
etapas do desenvolvimento de linhagens para uso em bioprocessos. Além
disso, a classificação taxonômica é essencial para agregar valor aos recursos
genéticos microbianos mantidos em diferentes coleções biológicas (SMITH et
al., 2014). De fato, a coleção estabelecida e organizada neste trabalho constitui
uma das maiores coleções de fungos endofíticos de S. officinarum já
reportadas e tem sido caracterizada para outras aplicações de interesse
biotecnológico (CARNEIRO et al., 2016; MAGALHÃES et al., 2015).
5.2 Produção de enzimas lignocelulolíticas em meio de cultura sólido e
seleção de linhagens promissoras
Os resultados mostraram que a maioria dos fungos apresentou
crescimento nos substratos avaliados (Tabela 4 - Anexo C). Das 409 linhagens,
89,98% cresceram em carboximetilcelulose, 97,56% cresceram em xilana,
96,34% cresceram em pectina e 90,96% cresceram em amido. As linhagens
48
que apresentaram valores estatísticos de índice enzimático superiores a 1,0
(um) (o que corresponde à formação de zona de degradação visível)
corresponderam a 63,57% em carboximetilcelulose, 79,21% em xilana, 77,50%
em pectina e 41,07% em amido.
A caracterização enzimática revelou o potencial de diferentes espécies
para degradação de polissacarídeos. As 20 melhores linhagens em cada
substrato (aproximadamente 5% do total de linhagens) foram destacadas na
Tabela 4 (Anexo C). Por exemplo, em relação a produção de xilanases, os
maiores valores de índice enzimático (IE > 3,0) foram observados para
linhagens de D. lusitanicae, F. brachygibbosum, P. bamuru, S. commune,
Scytalidium sp., T. assiutensis, T. pinophilus e Thozetella sp., com destaque
para a linhagem AR155 não identificada IE (5,301,06).
Em pectina, valores elevados de índice enzimático (IE > 3,0) foram
observados para linhagens de A. terreus, F. brachygibbosum, Peniophora sp.,
T. assiutensis, T. pinophilus, T. trachyspermus, Thozetella sp. e X. arbuscula,
com destaque para S. commune AR257 IE (5,000,00). Com relação a
produção de amilases, os maiores valores de índice enzimático (IE > 2,0) foram
observados para A. terreus, E. sorghinum, F. brachygibbosum, T.
trachyspermus e X. arbuscula, com destaque para T. pinophilus AR192 IE
(2,830,23).
Com relação a produção de celulases (endoglicanases), os maiores
valores de índice enzimático (IE > 2,5) foram observados para linhagens de A.
terreus, D. phoenicicola, E. sorghinum, F. brachygibbosum e T. pinophilus, com
destaque para O. affinis 94 IE (3,150,12). A capacidade de crescimento em
celulose microcristalina (Avicel) foi avaliada para detecção de atividade de
celulases totais (exoglicanases e endoglicanases). Como visto, 84,6% das
linhagens foram capazes de crescer neste substrato após 4 dias de incubação
a 25°C, com crescimento variando de 8,60 a 85,0 mm. No entanto, apenas 26
linhagens (6,35%) apresentaram crescimento máximo neste substrato (> 75,0
mm) nas condições avaliadas. Entre os fungos com melhor crescimento em
Avicel (> 75,0 mm) estão linhagens de A. terreus, Diaporthe sp., E. rostratum,
F. dlaminii, F. brachygibbosum, N. calospora, T. pinophilus, T. funiculosus, T.
afroharzianum, T. asperelloides, T. lentiforme e T. virens.
49
De modo geral não foi observada correlação entre as linhagens com
índice enzimático elevado em carboximetilcelulose (IE > 2,5) e aquelas com
maior crescimento em celulose microcristalina (> 75,0 mm) (Anexo C - Tabela
4). Isso revela a importância de avaliar estes dois tipos de celulose (solúvel e
insolúvel) em programas de bioprospecção de fungos.
A análise de variância revelou diferenças significativas quanto à
capacidade de produção de enzimas em meio de cultura sólido. Esta diferença
foi observada entre linhagens de espécies diferentes (variação interespecífica)
e entre linhagens da mesma espécie (variação intraespecífica), para todos os
substratos avaliados, inclusive quanto ao crescimento em Avicel (Tabela 4 -
Anexo C). Além disso, a caracterização por meio da determinação do índice
enzimático permitiu agrupar as 409 linhagens em 15 perfis distintos (classes
fenotípicas), de acordo com o padrão de degradação (simultânea ou exclusiva)
dos polissacarídeos avaliados (Tabela 5).
De maneira geral, as diferenças observadas quanto à produção de
enzimas parecem estar relacionadas muito mais com a espécie do fungo (e
com a variabilidade genética intraespecífica, no caso das espécies com maior
número de isolados, p. ex. A. terreus, F. brachyggibosum e T. pinophilus) do
que com o local de isolamento dos endófitos (folhas ou raízes). Entretanto,
quando o conjunto das melhores linhagens em cada substrato foi avaliado (20
melhores linhagens), verificou-se que a maior produção de celulases
(endoglicanases e exoglicanases) foi observada para isolados provenientes de
folhas de cana-de-açúcar.
Por exemplo, das 20 melhores linhagens produtoras de endoglicanase
(CMCase), 14 são provenientes de folhas e 6 são provenientes de raízes. Das
20 melhores linhagens produtoras de avicelase (celulase total), 13 são
provenientes de folhas e 7 de raízes. Com relação à xilanase, das 20 melhores
linhagens, 17 são provenientes de raízes e 3 de folhas. Relativo à
poligalacturonase, das 20 melhores linhagens, 15 são de raízes e 5 de folhas.
Com relação à amilase, das 20 melhores, 12 são de raízes e 8 de folhas.
50
Tabela 2: Perfil de degradação (exclusiva/simultânea) dos polissacarídeos carboximetilcelulose (CMC), xilana, pectina e amido de 409 fungos endofíticos de cana-de-açúcar.
Perfil de degradação Número de linhagens
Número de isolados de cada gênero (entre parênteses)
Degradação de todos os substratos simultaneamente
104 Aspergillus (27); Basidiomycota (1); Bipolaris (1); Chaetomium (2); Diaporthe (1); Epicoccum (1); Fusarium (28); Penicillium (1); Peniophora (1); Saccharicola (2); Talaromyces (11); Xylaria (1); Não identificado (27)
Degradação de CMC, xilana e pectina
83 Aspergillus (16); Beauveria (1); Bipolaris (1); Diaporthe (5); Epicoccum (1); Exserohilum (1); Fusarium (21); Omnidenptus (1); Paraphaeosphaeria (1); Penicillium (1); Saccharicola (3); Schizophyllum (1); Talaromyces (4); Thielavia (1); Trichoderma (1); Não identificado (24)
Degradação de xilana e pectina 50 Aspergillus (8); Beauveria (1); Diaporthe (1); Fusarium (11); Mariannaea (1); Phialocephala (1); Pleosporales (1); Schizophyllum (1); Scytalidium (2); Talaromyces (6); Thozetella (1); Trichoderma (2); Xenoacremonium (1); Não identificado (13)
Degradação de xilana, pectina e amido
31 Aspergillus (7); Fusarium (7); Resinicium (1); Talaromyces (5); Xenoacremonium (1); Xylaria (1); Não identificado (9)
Degradação de pectina 30 Aspergillus (9); Beauveria (4); Fusarium (3); Mariannaea (1); Saccharicola (1); Talaromyces (3); Trichoderma (4); Não identificado (5)
Degradação de CMC e xilana 20 Aspergillus (1); Fusarium (7); Neurospora (1); Stachybotriaceae (1); Talaromyces (4); Xylaria (1); Não identificado (5)
Degradação de CMC, xilana e amido
20 Aspergillus (1); Epicoccum (1); Fusarium (13); Paraphaeosphaeria (1); Não identificado (4)
Degradação de xilana 18 Aspergillus (1); Beauveria (2); Dokmaia (1); Epicoccum (1); Eutypella (1); Fusarium (3); Phaeocytostroma (1); Talaromyces (1); Não identificado (7)
Degradação de CMC e pectina 14 Aspergillus (6); Diaporthe (1); Fusarium (1); Talaromyces (1); Não identificado (5) Degradação de CMC 13 Aspergillus (1); Fusarium (2); Talaromyces (2); Trichoderma (2); Não identificado (6) Degradação de CMC e amido 5 Fusarium (2); Talaromyces (1); Não identificado (2) Degradação de pectina e amido 3 Fusarium (1); Não identificado (2) Degradação de CMC, pectina e amido
2 Clonostachys (1); Não identificado (1)
Degradação de xilana e amido 1 Aspergillus (1) Ausência de degradação dos substratos
15 Aspergillus (2); Clonostachys (1); Epicoccum (1); Exophiala (1); Fusarium (1); Myrmecridium (1); Peniophora (1); Saccharicola (1); Talaromyces (2); Trichoderma (1); Não identificado (3)
51
A variação na capacidade de produção de enzimas foi observada
especialmente para linhagens de Aspergillus, Fusarium e Talaromyces. Estas
diferenças podem ser visualizadas pela representação gráfica dos dados na
forma de heatmap (Figuras 9, 10 e 11). De fato, para as espécies que
apresentaram ampla variação intraespecífica (p. ex. A. terreus, F.
brachygibbosum, T. pinophilus) a estratégia utilizada para triagem permitiu
identificar os genótipos mais promissores. Isso demonstra a importância de
considerar a variabilidade genética intraespecífica em programas de
bioprospecção de fungos produtores de enzimas, como tem sido relatado para
outras atividades biológicas (FÁVARO; POLETTO, 2013).
Entre as 9 (nove) espécies de Aspergillus, os maiores valores de índice
enzimático (em CMC, xilana, pectina e amido) foram observados para
linhagens de A. terreus (Figura 9). Diferenças no perfil de degradação foram
observadas, por exemplo, linhagens de A. fumigatus não degradaram amido
nas condições utilizadas, em comparação com as outras espécies de
Aspergillus (Tabela 4 - Anexo C; Figura 9). O crescimento em Avicel variou de
14,07 a 85,0 mm, sendo que das 81 linhagens de Aspergillus, apenas quatro
não cresceram neste substrato. De modo geral, a maioria das 81 linhagens de
Aspergillus apresentou perfil de degradação de polissacarídeos do tipo
completo, ou seja, foram capazes de degradar 3 a 4 polissacarídeos
simultaneamente (Tabela 5).
Com relação à Fusarium, das sete espécies identificadas, F.
brachygibbosum está entre as que apresentaram os maiores valores de índice
enzimático nos quatro substratos avaliados (Tabela 4 – Anexo C; Figura 10). O
crescimento em Avicel variou de 11,5 a 85,0 mm, sendo que 71 das 100
linhagens de Fusarium foram capazes de crescer neste substrato (Tabela 4 –
Anexo C; Figura 10). De modo geral, a maioria das 100 linhagens de Fusarium
apresentou perfil completo de degradação de polissacarídeos, sendo capazes
de degradar 3 a 4 substratos simultaneamente (Tabela 5).
Entre as nove espécies de Talaromyces, T. pinophilus apresentou os
maiores valores de índice enzimático, especialmente em CMC, xilana e
pectina. O perfil de degradação da maioria das linhagens deste gênero também
foi do tipo completo (Tabela 5). O crescimento em Avicel variou de 10,0 a 85,0
52
mm, sendo que a maioria das 40 linhagens (87,5%) do gênero Talaromyces foi
capaz de crescer neste substrato. Entre as diferentes espécies de
Talaromyces, foi possível observar diferenças quanto ao perfil de degradação
de polissacarídeos, por exemplo, nenhum dos isolados de T. funiculosus
degradou amido nas condições avaliadas em comparação com as outras
espécies do gênero. Destaque também para a espécie T. assiutensis, que
mostrou um dos maiores valores de índice enzimático em xilana e pectina
(Tabela 4 – Anexo C; Figura 11).
53
Figura 9: Representação gráfica (heatmap) dos valores de índice enzimático (médias) obtidos para diferentes polissacarídeos (CMC, xilana, pectina e amido) a partir da análise de 81 linhagens endofíticas de Aspergillus isoladas de cana-de-açúcar.
54
Figura 10: Representação gráfica (heatmap) dos valores de índice enzimático (médias) obtidos para diferentes polissacarídeos (CMC, xilana, pectina e amido) a partir da análise de 100 linhagens endofíticas de Fusarium isoladas de cana-de-açúcar.
55
Figura 11: Representação gráfica (heatmap) dos valores de índice enzimático (médias) obtidos para diferentes polissacarídeos (CMC, xilana, pectina e amido) a partir da análise de 40 linhagens endofíticas de Talaromyces isoladas de cana-de-açúcar.
56
A produção de zonas de clareamento do substrato ao redor da colônia
em meio sólido é um modo simples e rápido de avaliar a secreção de enzimas
por fungos (POINTING, 1999), sendo por isso a abordagem utilizada no
presente trabalho. Esta estratégia é comumente utilizada para bioprospecção
de fungos lignocelulolíticos especialmente devido à dificuldade de avaliar um
grande número de linhagens em experimentos de hidrólise de biomassa em
frascos Erlenmeyer. Alguns trabalhos têm demonstrado uma correlação
positiva entre as linhagens selecionadas em testes de difusão em meio sólido e
as linhagens selecionadas por meio de testes de hidrólise de biomassa
lignocelulósica (FLORENCIO et al., 2012; CIANCHETTA et al., 2010).
Para a detecção de celulases em placas de meio sólido, dois tipos de
substratos são comumente utilizados: carboximetilcelulose (solúvel) e celulose
microcristalina (insolúvel, Avicel) (ZHANG et al., 2006). A carboximetilcelulose
é indicada para detecção de endoglicanases (CMCase), enquanto que a
celulose microcristalina é indicada para detecção preferencialmente de
exoglicanases, no entanto, ela também pode ser clivada por endoglicanases.
Devido a isso, a atividade detectada em Avicel geralmente é denominada
celulase total, ou avicelase (exo e endoglicanases) (ZHANG et al., 2006).
Neste trabalho, estes dois substratos foram utilizados para avaliação de
produção de celulases. Por meio da análise simultânea do crescimento em
diferentes substratos foi possível traçar o perfil de degradação de
polissacarídeos, o que pode ser útil para a seleção de fungos em estudos de
bioprospecção. Esta estratégia permitiu selecionar não somente novas
linhagens produtoras de celulases (endo e exoglucanases), mas também de
hemicelulases (xilanases, pectinases). De fato, entre as linhagens identificadas
como promissoras para degradação de polissacarídeos estão espécies que
não têm sido exploradas industrialmente para a produção de enzimas ou para a
a conversão de biomassa lignocelulósica.
Como visto, os resultados mostraram que fungos endofíticos de cana-
de-açúcar são uma fonte prolífica de novas linhagens de fungos produtoras de
enzimas com aplicação industrial. Estudos têm demonstrado que os fungos
isolados como endófitos de diferentes espécies de plantas em geral têm a
capacidade de metabolizar in vitro a maioria dos componentes encontrados na
57
parede celular vegetal (SCHULZ; BOYLE, 2005), o que foi também observado
no presente trabalho.
Os endófitos sintetizam enzimas para a penetração e colonização do
hospedeiro, como proteases, amilases, oxidases, celulases, lipases, xilanases,
pectinases, entre outras (SCHULZ; BOYLE, 2005). Além disso, há evidências
do envolvimento dos endófitos na decomposição de material vegetal e ciclagem
de nutrientes após a senescência dos tecidos vegetais (PROMPUTTHA et al.,
2010). Neste trabalho, verificou-se que algumas linhagens não foram capazes
de degradar nenhum dos polissacarídeos avaliados. Resultados semelhantes
foram observados para fungos endofíticos de diferentes espécies de plantas
(CARROLL; PETRINI, 1981; LUMYONG et al., 2002; FÁVARO, 2009). De
acordo com Carroll e Petrini (1981), alguns fungos endofíticos requerem fontes
de carbono mais simples para o crescimento (mono ou oligossacarídeos), o
que é característico de fungos simbiontes.
Com base nos resultados de produção de enzimas em meio sólido,
foram selecionadas 20 linhagens para avaliação do extrato enzimático na
hidrólise de bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor. As
características das 20 linhagens selecionadas (índices enzimáticos e
crescimento em Avicel são apresentadas na Figura 12.
58
Figura 12: Representação gráfica (heatmap) dos valores de índice enzimático (médias) e de crescimento em Avicel (mm/dia) de 20 linhagens de fungos endofíticos de cana-de-açúcar selecionadas para cultivo e determinação do potencial de sacarificação. As linhagens em negrito foram avaliadas em testes de hidrólise enzimática de bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor.
59
5.4 Hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado
utilizando extrato enzimático de fungos endofíticos selecionados
Os 20 fungos selecionados foram cultivados em meio contendo bagaço
de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor (seco e triturado) como
fonte de carbono. O extrato bruto foi avaliado quanto ao potencial de
sacarificação, por meio de análise de atividade de FPase (celulases totais).
Esta análise foi denominada potencial de sacarificação, pois a atividade de
FPase foi determinada em condições não padronizadas do extrato bruto, ou
seja, não foi realizada a padronização requerida pelo método de Ghose (1987).
Para melhor caracterização dos fungos selecionados, os dados foram
comparados com o fungo mutante celulolítico T. reesei RUT C-30. Esta
linhagem foi escolhida por se tratar de um mutante melhorado para a produção
de celulases e considerado padrão para estudos de produção de enzimas.
Os resultados de atividade de FPase após 7 dias de cultivo são
apresentados na Figura 13 e a quantificação de proteínas totais é apresentada
na Figura 14. Entre os 20 fungos avaliados, três linhagens se destacaram por
apresentarem maiores valores (médias) de atividade de FPase: O. Affinis 94
(0,684 U/mL), F. Brachygibbosum 158 (0,652 U/mL) e T. pinophilus AR156
(0,664 U/mL)) quando comparadas com o fungo celulolítico T. reesei RUT C-30
(0,567 U/mL) utilizado como controle positivo. De modo semelhante ao que foi
observado nos testes enzimáticos em meio de cultura sólido também foi
possível observar variação intraespecífica quanto ao potencial de sacarificação.
Este é o caso das linhagens de F. brachygibbosum (AR32 e 158) e de T.
pinophilus (AR156, 184, 186) (Figura 13).
Com base nos valores de FPase, os extratos brutos de 13 linhagens
foram selecionados e aplicados na hidrólise de bagaço de cana pré-tratado por
explosão a vapor, em comparação com o extrato de T. reesei RUT C-30. A
Figura 15 mostra a morfologia das linhagens selecionadas para a hidrólise da
biomassa. Os resultados de hidrólise enzimática são apresentados nas Figuras
16 e 17.
60
Figura 13: Potencial de sacarificação (atividade de FPase) do extrato bruto de 20 fungos endofíticos de cana-de-açúcar após 7 dias de cultivo em meio contendo bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado (seco e triturado) como fonte de carbono. Os dados são comparados com os resultados do fungo celulolítico T. reesei RUT C-30. Os valores representam a média de duas repetições.
Figura 14: Concentração de proteína total do extrato bruto de 20 fungos endofíticos de cana-de-açúcar após 7 dias de cultivo em meio contendo bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado (seco e triturado) como fonte de carbono. Os dados são comparados com os resultados do fungo celulolítico T. reesei RUT C-30. Os valores representam a média de duas repetições.
61
Figura 15: Fungos endofíticos de cana-de-açúcar selecionados para aplicação na hidrólise de bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor. Os fungos foram cultivados em meio de cultura PDA durante 6 dias a 28°C. As linhagens estão marcadas com números de 1 a 12. Sendo 1 Aspergillus terreus (48), 2 Omnidenptus affinis (94), 3 Neurospora calospora (146), 4 Fusarium brachygibbosum (158), 5 Aspergillus brasiliensis (170), 6 Talaromyces pinophilus (186), 7 Fusarium brachygibbosum (AR32), 8 Aspergillus sp. (AR127), 9 Talaromyces pinophilus (AR156), 10 Trichoderma asperelloides (AR226), 11 Talaromyces assiutensis (AR264), 12 Talaromyces trachyspermus (AR281).
62
Figura 16: Concetração de açúcares redutores totais – ART (g/L) obtidos após 32 horas de reação de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor. O extrato bruto de 13 linhagens selecionadas é comparado com extrato bruto do fungo celulolítico T. reesei RUT C-30. Os valores representam a média de duas repetições.
Figura 17: Concentração de glicose (g/L) obtida após 32 horas de reação de hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor. O extrato bruto de 13 linhagens selecionadas é comparado com o extrato bruto do fungo celulolítico T. reesei RUT C-30. Os valores representam a média de duas repetições.
63
Os resultados mostraram que nas condições utilizadas (relatadas neste
trabalho), a capacidade hidrolítica do extrato enzimático avaliada pela produção
de açúcares redutores totais (ART) foi destacada para as linhagens O. affinis
(94), T. pinophilus (AR156) e T. assiutensis (AR264) (ART = 11,77 g/L, 11,53
g/L e 10,11 g/L, respectivamente), quando comparada com a linhagem T.
reesei RUT C-30 (ART = 11,04 g/L). A quantidade de glicose liberada foi de
9,33 g/L para a linhagem O. affinis (94), 8,94 g/L para T. pinophilus (AR156) e
7,69 g/L para T. assiutensis (AR264), quando comparada com o extrato de T.
reesei RUT C-30 (2,29 g/L).
As demais linhagens (exceto AR281, que foi mantida no experimento
como um controle negativo, devido à baixa atividade de FPase (0,032 U/mL))
apresentaram valores menores de ART após 32 horas em comparação com T.
reesei RUT C-30. Entretanto, a quantidade de glicose liberada após a reação
foi superior à quantidade de glicose liberada pelo extrato de T. reesei RUT C-
30 para todas as 13 linhagens avaliadas, nos tempos 8, 24 e 32 horas (Figura
17). Isto revela que nas condições de cultivo utilizadas, estas linhagens
produzem um extrato enzimático bruto significativo, que prescinde da adição de
-glicosidase, a qual é reconhecida como um fator limitante do extrato
enzimático de T. reesei RUT C-30.
Os resultados mostraram que a bioconversão de bagaço de cana pré-
tratado por explosão a vapor em níveis superiores aos obtidos com T. reesei
RUT C-30 foi observada com os extratos de A. terreus (48), F. brachygibbosum
(158), O. affinis (94), T. assiutensis (AR264), T. pinophilus (AR156) e T.
asperelloides (AR226). Os extratos destas linhagens selvagens foram mais
eficientes na bioconversão do que o extrato do fungo geneticamente melhorado
T. reesei RUT C-30, tanto com relação à quantidade de açúcares liberados da
biomassa (ART e glicose) quanto em relação à cinética da reação de hidrólise
(níveis superiores de açúcares observados nas primeiras horas de reação).
Embora não tenha sido realizada análise estatística de correlação entre
os dados de seleção de linhagens por testes de difusão em meio sólido e
seleção de linhagens por meio de testes de hidrólise enzimática, verificou-se
que as melhores linhagens obtidas estão entre as selecionadas durante a
execução destas duas estratégias de prospecção. Algumas das linhagens com
maior atividade de FPase e maior capacidade de hidrólise (ART e glicose)
64
também apresentaram os maiores valores de índice enzimático (p. ex. O. affinis
(94) e F. brachygibbosum (158) em CMC; T. assiutensis (AR264) em xilana e
pectina); os maiores valores de crescimento em Avicel (p. ex. T. asperelloides
(AR226)); ou a capacidade de degradar os 5 polissacarídeos simultaneamente
de forma mediana (p. ex. A. terreus (48) e T. pinophilus (AR156)).
A customização de coquetéis enzimáticos para cada combinação de
biomassa e pré-tratamento, bem como o cultivo de fungos em substratos de
baixo custo (p. ex: biomassa pré-tratada como fonte de carbono) são
consideradas estratégias promissoras para diminuir os custos do processo de
sacarificação (FÁVARO; POLETTO, 2013; ELLILÄ et al., 2017). Neste
contexto, uma coleção de 409 fungos endofíticos de cana-de-açúcar foi
caracterizada quanto à capacidade de produzir enzimas lignocelulolíticas. A
estratégia de prospecção consistiu na realização de testes em meio sólido,
seguidos de cultivo em meio contendo bagaço de cana pré-tratado e aplicação
do extrato bruto em testes de hidrólise. Esta abordagem permitiu a seleção de
linhagens promissoras para conversão de bagaço de cana-de-açúcar pré-
tratado por explosão a vapor.
O fungo T. pinophilus é reconhecido como um excelente produtor de
celulases (GUSAKOV, 2011). Linhagens desta espécie são utilizadas
industrialmente para produção de celulases e existem diversas patentes sobre
suas aplicações (FUJII et al., 2014). Este fungo tem sido indicado como
alternativa a T. reesei para a sacarificação de biomassa lignocelulósica, devido
ao fato de produzir maior quantidade de -glicosidase (GUSAKOV, 2011; FUJII
et al., 2014).
Os substratos Solka-Floc, Avicel, palha de cevada, farelo de trigo,
bagaço de cana-de-açúcar e capim elefante têm sido utilizados para cultivo e
produção de celulases de T. pinophilus (BROWN et al., 1987; JØRGENSEN et
al., 2005; VISSER et al., 2013). No entanto, não foram encontrados relatos de
cultivo em meio de cultura com bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por
explosão a vapor como indutor de produção de enzimas. Entre os poucos
trabalhos sobre hidrólise de biomassa de cana pré-tratada com enzimas desta
espécie, Visser et al. (2013) relataram a aplicação de misturas de extratos
enzimáticos de P. pinophilum (sinônimo de T. pinophilus) e Chrysoporthe
65
cubensis para conversão eficiente de bagaço de cana pré-tratado por método
alcalino.
Com relação à A. terreus, diversas enzimas lignocelulolíticas têm sido
caracterizadas a partir desta espécie, de acordo com a base de dados CAZy
(http://www.cazy.org/). A disponibilidade de sua sequência genômica tem
facilitado estudos moleculares desta espécie, que é conhecida por sua
produção de fármacos, tais como a lovastatina, bem como de ácidos orgânicos
com aplicação em biorrefinarias, tais como o ácido itacônico. O extrato
enzimático de A. terreus obtido após cultivo em fermentação no estado sólido
foi aplicado na hidrólise enzimática de palha de arroz (NARRA et al., 2012).
Outros trabalhos demonstraram elevada produção de enzimas por linhagens
termofílicas de A. terreus cultivadas em fermentação no estado sólido (GAO et
al., 2008; SHARMA et al., 2014) revelando que esta espécie pode ser uma boa
fonte de enzimas termofílicas. Uma linhagem de A. terreus isolada como
endofítica da planta nativa do Cerrado Memora peregrina produziu xilanase
termoestável quando cultivada em fermentação submersa em meio contendo
farelo de trigo (SORGATOO et al., 2012). No presente trabalho, mais de 80
linhagens endofíticas de A. terreus isoladas de folhas e raízes de cana-de-
açúcar foram avaliadas e foi possível selecionar genótipos superiores quanto à
capacidade de bioconversão de bagaço de cana pré-tratado por explosão a
vapor, tais como a linhagem A. terreus (48).
Trichoderma asperelloides é uma espécie filogeneticamente próxima a
T. asperellum. Entre os poucos relatos sobre a capacidade de produção de
enzimas para desconstrução de biomassa por T. asperelellum pode ser citado
o trabalho de Wang et al. (2015), onde o potencial desta espécie comumente
utilizada para controle biológico é comparado com T. reesei.
Fungos do gênero Fusarium são encontrados como endófitos de
diversas plantas e são conhecidos por serem fitopatógenos de diferentes
culturas. Neste trabalho, 100 linhagens endofíticas de Fusarium isoladas de
folhas e raízes de cana-de-açúcar foram identificadas e genótipos superiores
quanto à produção enzimática foram selecionados para a espécie F.
brachygibbosum. Esta espécie tem sido recentemente descrita como
fitopatogênica para a cultura do milho (SHAN et al., 2017). Diferentes espécies
fitopatogênicas de Fusarium têm sido investigadas quanto à produção de
66
enzimas para degradação de biomassa, por exemplo, F. verticillioides (DE
ALMEIDA et al., 2014; RAVALASON et al., 2012), F. oxysporum (XIROS et al.,
2009) e F. graminearum (PHALIP et al., 2009). De fato, a análise de fungos
fitopatogênicos como fonte de enzimas para elaboração de coquetéis
enzimáticos mais eficientes tem sido considerada uma estratégia promissora
(FÁVARO; POLETTO, 2013).
A análise genômica de fitopatógenos (muitos deles responsáveis por
doenças de plantas utilizadas como matéria-prima para produção de etanol)
tem revelado uma expansão no inventário de genes codificadores de proteínas
degradadoras de componentes da parede celular vegetal, comparada ao baixo
número de genes em fungos utilizados na indústria, tais como T. reesei
(GIBSON et al., 2011). Neste aspecto, diversos fungos fitopatogênicos têm sido
indicados como boas fontes de atividades enzimáticas complementares ou
sinérgicas às de T. reesei (KING et al., 2011).
Entre as espécies promissoras identificadas, O. affinis, isolada como
endofítica de folhas de cana-de-açúcar, produziu os maiores valores de
açúcares fermentescíveis na hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar explodido
em comparação com T. reesei RUT C-30. Esta linhagem apresentou o maior
valor de índice enzimático em CMC entre as 409 linhagens avaliadas, e valores
medianos em xilana e pectina, porém não apresentou crescimento em amido
nem em Avicel. Esta espécie pertence a família Magnaporthaceae (Ordem
Magnaporhales) cujos membros incluem importantes fitopatógenos de cereais
e de outras monocotiledôneas. O transcritoma de 21 espécies desta ordem foi
analisado recentemente (LUO et al., 2015), sendo observado que os
fitopatógenos Magnaporthe oryzae, Gaeumannomyces graminis var. tritici, e M.
poae possuem abundância de genes codificadores de glicosil hidrolases (GH)
em seus genomas e baixo número de polissacarídeo liases (PL) (OKAGAKI et
al., 2016).
Os dados obtidos no presente trabalho confirmam a hipótese de que
fungos endofíticos de cana-de-açúcar constituem uma fonte promissora de
novas linhagens com potencial de produção de enzimas para desconstrução de
biomassa lignocelulósica. Os resultados mostraram que os melhores fungos
selecionados pertencem a grupos taxonômicos que não têm sido explorados
para bioconversão de lignocelulose a nível industrial (p. ex. A. terreus, F.
67
brachygibbosum, O. affinis, T. assiutensis, T. asperelloides). Além disso, para
as espécies que apresentaram ampla variação na capacidade de produção das
enzimas (variação intraespecífica), a estratégia de triagem utilizada permitiu
identificar os genótipos mais promissores. Os fungos selecionados podem ser
considerados uma alternativa a T. reesei para produção de enzimas e são
candidatos para o desenvolvimento de bioprocesso customizado para
bioconversão de bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor.
68
6 CONCLUSÕES
A coleção de 409 fungos endofíticos de cana-de-açúcar foi purificada,
organizada, preservada e caracterizada (caracterização molecular e
enzimática). Os treze fungos selecionados produziram metabólitos de
importância biotecnológica, com aplicação no desenvolvimento de biorrefinarias
de biomassa lignocelulósica.
A utilização de diferentes critérios (taxonomia, valores de índice
enzimático, crescimento em Avicel, perfil de degradação de polissacarídeos) foi
adequada para identificar as linhagens mais promissoras.
Fungos endofíticos de folhas e raízes de cana-de-açúcar constituem
uma fonte importante de novas linhagens produtoras de celulases e
hemicelulases.
O bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor, lavado,
seco e triturado mostrou ser uma fonte de carbono adequada para o cultivo de
fungos endofíticos de cana-de-açúcar para produção de enzimas
lignocelulolíticas.
Os melhores fungos selecionados como eficientes para conversão de
bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor pertencem as
espécies que não têm sido utilizadas a nível industrial.
As linhagens selvagens selecionadas de A. terreus, F. brachygibbosum,
O. affinis, T. asperelloides, T. assiutensis e T. pinophilus produziram extrato
enzimático equivalente ou superior ao extrato do fungo mutante geneticamente
melhorado T. reesei RUT C-30 quando aplicado na hidrólise de bagaço de
cana-de-açúcar pré-tratado. Estas linhagens podem ser utilizadas para:
programas de melhoramento de linhagens; para análises ômicas e
caracterização de genes codificadores de enzimas; para complementar
coquetéis comerciais baseados em celulases de T. reesei; e para o
desenvolvimento de bioprocessos.
69
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ACHINAS, Spyridon; EUVERINK, Gerrit Jan Willem. Consolidated briefing of biochemical ethanol production from lignocellulosic biomass. Electronic Journal of Biotechnology, v. 23, p. 44-53, 2016.
AGGER, J. W. et al. Discovery of LPMO activity on hemicelluloses shows the importance of oxidative processes in plant cell wall degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 111, n. 17, p. 6287-6292, 2014.
ALBERTO, R. N. et al. Extracellular enzymatic profiles and taxonomic identification of endophytic fungi isolated from four plant species. Genetics and molecular research: GMR, v. 15, n. 4, 2016.
ALKORTA, I. et al. Industrial applications of pectic enzymes: a review. Process Biochemistry, v. 33, n. 1, p. 21-28, 1998.
ALY, A. H.; DEBBAB, A.; PROKSCH, P. Fungal endophytes: unique plant inhabitants with great promises. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 90, n. 6, p. 1829-1845, 2011.
ARANTES, V; SADDLER, J. N. Access to cellulose limits the efficiency of enzymatic hydrolysis: the role of amorphogenesis. Biotechnology for Biofuels, v. 3, n. 1, p. 4, 2010.
ARAÚJO, W. L.; QUECINE, M. C.; LACAVA, P. T.; AGUILAR-VILDOSO, C. I.; MARCON, J.; LIMA, A. O. de S.; SOBRAL, J. K.; PIZZIRANI-KLEINER, A. A.; AZEVEDO, J. L. Micro-organismos endofíticos: Aspectos teóricos e práticos de isolamento e caracterização. Ed. Santarém: UFOPA, p. 11-13. 2014.
ARNOLD, A. E. et al. Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 100, n. 26, p. 15649-15654, 2003.
AYOB, F. W.; SIMARANI, K. Endophytic filamentous fungi from a Catharanthus roseus: Identification and its hydrolytic enzymes. Saudi Pharmaceutical Journal, v. 24, n. 3, p. 273-278, 2016.
AZEREDO, L.A.; GOMES, E. A.; MENDONÇA-HAGLER, L.C.; HAGLER A.N. Yeast communities associated with sugarcane in Campos, Rio de Janeiro, Brazil. International microbiology, v. 1, n. 3, p. 205-208, 1998.
AZEVEDO, J.L.; ARAÚJO, W.L. (2007) Diversity and applications of endophytic fungi isolated from tropical plants. In: Ganguli BN, Deshmukh SK, editors. Fungi: multifaceted microbes. Boca Raton: CRC Press. pp. 189–207.
BACKMAN, P. A.; SIKORA, R. A. Endophytes: an emerging tool for biological control. Biological control, v. 46, n. 1, p. 1-3, 2008.
70
BASSO TP, GALLO CR, BASSO LC. Cellulolytic activitity of isolated fungi from sugarcane bagasse and decayed wood. Pesq Agrop Brasileira. 2010;45(11):1282–9.
BEESON, W. T. et al. Cellulose degradation by polysaccharide monooxygenases. Annual Review of Biochemistry, v. 84, p. 923-946, 2015.
BEN. Balanço Energético Nacional. 2016.
BEZERRA, J. D. P. et al. Richness of endophytic fungi isolated from Opuntia ficus-indica Mill. (Cactaceae) and preliminary screening for enzyme production. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 28, n. 5, p. 1989-1995, 2012.
BHAGOBATY, R. K.; JOSHI, S. R. Enzymatic activity of fungi endophytic on five medicinal plant species of the pristine sacred forests of Meghalaya, India. Biotechnology and Bioprocess Engineering, v. 17, n. 1, p. 33-40, 2012.
BODDEY, R. M. et al. Endophytic nitrogen fixation in sugarcane: present knowledge and future applications. Plant and Soil, v. 252, n. 1, p. 139-149, 2003.
BON, E. P. S.; GÍRIO, F.; PEREIRA JUNIOR, N. Enzimas na produção de etanol. Enzimas em Biotecnologia: Produção, Aplicações e Mercado. Rio de Janeiro: Interciência, p. 241-272, 2008.
BROWN, J. A.; COLLIN, S. A.; WOOD, T. M. Development of a medium for high cellulase, xylanase and β-glucosidase production by a mutant strain (NTG III/6) of the cellulolytic fungus Penicillium pinophilum. Enzyme and Microbial Technology, v. 9, n. 6, p. 355-360, 1987.
CARNEIRO, A. A. J.; SOUSA, G. P.; NAKAI, D. K.; PACHECO, T. F.; FAVARO, L. C. de L.; MENDONCA, S.; SOARES, I. P.; DAMASO, M. C. T. Seleção de fungos filamentosos capazes de crescer em diferentes glicerinas como única fonte de carbono. In: ENCONTRO DE PESQUISA E INOVAÇÃO DA EMBRAPA AGROENERGIA, 3, Brasília, DF. Anais Brasília, DF: Embrapa. p. 145-151. 2016.
CARROLL, G.; PETRINI, O. Patterns of Substrate Utilization by Some Fungal Endophytes from Coniferous Foliage. Mycologia Vol. 75, N. 1, p. 53-63, 1983.
CASTELLANI, A. Maintenance and cultivation of common pathogenic fungi in distilled water. The Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 42, p. 181-184, 1967.
CHANDEL, A. K.; DA SILVA, S. S. Sustainable Degradation of Lignocellulosic Biomass Techniques, Applications and Commercialization. 2013.
CHAVERRI, P. et al. Systematics of the Trichoderma harzianum species complex and the re-identification of commercial biocontrol strains. Mycologia, v. 107, n. 3, p. 558-590, 2015.
71
CHEN, C. A. et al. Secondary structure and phylogenetic utility of the ribosomal internal transcribed spacer 2 (ITS2) in scleractinian corals. Zool Stud, v. 43, n. 4, p. 759-71, 2004.
CHOI, Y. W.; HODGKISS, I. J.; HYDE, K. D. Enzyme production by endophytes of Brucea javanica. J Agric Technol, v. 1, p. 55-66, 2005.
CIANCHETTA, S. et al. A novel microplate‐based screening strategy to assess the cellulolytic potential of Trichoderma strains. Biotechnology and bioengineering, v. 107, n. 3, p. 461-468, 2010.
CORRÊA, R.C.G., RHODEN, S.A., MOTA, T.R., AZEVEDO, J.L., PAMPHILE, J.A., MARQUES-DE-SOUZA, M.C., et al. 2014. Endophytic fungi: expanding the arsenal of industrial enzyme producers. J Indus Microb Biotech. 41, 1467-1478.
CORTEZ, L. A. B.; LORA, E. S.; GÓMEZ. E. O. Biomassa para energia. Campinas, SP: Editora da Unicamp, 2008.
COUGHLAN, M. P.; COUGHLAN, M. P. (Ed.). Enzyme systems for lignocellulose degradation:[Proceedings of a workshop on production, characterization and application of cellulose-, hemicellulose-and lignin-degrading enzyme systems, held in Galway, Ireland from 12 to 14 April 1989]. Elsevier Applied Science, 1989.
DA SILVA ARAUJO, F. D. et al. Epicolactone–Natural Product Isolated from the Sugarcane Endophytic Fungus Epicoccum nigrum. European Journal of Organic Chemistry, v. 2012, n. 27, p. 5225-5230, 2012.
DAI, Chuan-chao et al. Correlation between invasion by endophytic fungus Phomopsis sp. and enzyme production. African Journal of Agricultural Research, v. 5, n. 11, p. 1324-1340, 2010.
DE ALMEIDA, M. N. et al. Optimization of endoglucanase and xylanase activities from Fusarium verticillioides for simultaneous saccharification and fermentation of sugarcane bagasse. Applied biochemistry and biotechnology, v. 172, n. 3, p. 1332-1346, 2014.
DE SOUZA, W. R. Microbial degradation of lignocellulosic biomass. Chandel A, Da Silva, S. Sustainable degradation of lignocellulosic biomass-techniques, applications and commercialization. Brazil: InTech, 2013.
DESIRE, M. H. et al. Enzymes and qualitative phytochemical screening of endophytic fungi isolated from Lantana camara Linn. Leaves. Journal of Applied Biology and Biotechnology Vol, v. 2, n. 06, p. 001-006, 2014.
DEVI, N. N.; PRABAKARAN, J. J.; WAHAB, F. Phytochemical analysis and enzyme analysis of endophytic fungi from Centella asiatica. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, v. 2, n. 3, p. S1280-S1284, 2012.
72
ELLILÄ, S. et al. Development of a low-cost cellulase production process using Trichoderma reesei for Brazilian biorefineries. Biotechnology for Biofuels, v. 10, n. 1, p. 30, 2017.
FÁVARO LCL, MELO FL, AGUILAR-VILDOSO CI, ARAÚJO WL (2011) Polyphasic Analysis of Intraspecific Diversity in Epicoccum nigrum Warrants Reclassification into Separate Species. PLoS ONE 6(8): e14828.
FÁVARO LCL, SEBASTIANES FLS, ARAÚJO WL (2012) Epicoccum nigrum P16, a Sugarcane Endophyte, Produces Antifungal Compounds and Induces Root Growth. PLoS ONE 7(6): e36826.
FÁVARO, L. C. L. Diversidade e interação de Epicoccum spp. com cana-de-açúcar (Saccharum officinarum, L.). 2009. Tese de Doutorado. São Paulo: Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz.
FÁVARO, L. C. L.; POLETTO, C. M. Bioprospecção e melhoramento genético de fungos para produção de enzimas aplicadas em biocombustíveis. In: MACHADO, C. M. M. (Ed.). Microrganismos na produção de biocombustíveis líquidos. Brasília, DF: Embrapa Agroenergia, p. 35-79, 2013.
FERREIRA, J. A. et al. Waste biorefineries using filamentous ascomycetes fungi: Present status and future prospects. Bioresource Technology, v. 215, p. 334-345, 2016.
FILLAT, Ú. et al. Potential of the new endophytic fungus Hormonema sp.
CECT‐13092 for improving processes in lignocellulosic biorefineries: biofuel production and cellulosic pulp manufacture. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2017.
FILLAT, Ú. et al. Screening of eucalyptus wood endophytes for laccase activity. Process Biochemistry, v. 51, n. 5, p. 589-598, 2016.
FLORENCIO, C.; COURI, S.; FARINAS, C. S. Correlation between agar plate screening and solid-state fermentation for the prediction of cellulase production by Trichoderma strains. Enzyme Research, v. 2012, 2012.
FOUDA, A. H. et al. Biotechnological applications of fungal endophytes associated with medicinal plant Asclepias sinaica (Bioss.). Annals of Agricultural Sciences, v. 60, n. 1, p. 95-104, 2015.
FUJII, T. et al. Taxonomic revision of the cellulose-degrading fungus Acremonium cellulolyticus to Talaromyces based on phylogenetic analysis. FEMS Microbiology Letters, v. 351, n. 1, p. 32-41, 2014.
FUNGARO, M. H. P. PCR na micologia. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, v. 14, p. 12-16, 2000.
GAO, J. et al. Production and characterization of cellulolytic enzymes from the thermoacidophilic fungal Aspergillus terreus M11 under solid-state cultivation of corn stover. Bioresource Technology, v. 99, n. 16, p. 7623-7629, 2008.
73
GARDES, M.; BRUNS, T. D. ITS primers with enhanced specificity for
basidiomycetes‐application to the identification of mycorrhizae and rusts. Molecular Ecology, v. 2, n. 2, p. 113-118, 1993.
GARGAS, A. TAYLOR, J. W. Iniciadores de reação em cadeia de polimerase (PCR) para amplificação e sequenciamento de rDNA 18S a partir de fungos liquenizados. Mycologia, 84: 589-592, 1992.
GHOSE, T. K. Measurement of cellulase activities. Pure and Applied Chemistry, v. 59, n. 2, p. 257-268, 1987.
GIBSON, D. M. et al. Plant pathogens as a source of diverse enzymes for lignocellulose digestion. Current Opinion in Microbiology, v. 14, n. 3, p. 264-270, 2011.
GOLDEMBERG, J. Ethanol for a sustainable energy future. Science, v. 315, n. 5813, p. 808-810, 2007.
GUINDON, S. et al. New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies: assessing the performance of PhyML 3.0. Systematic biology, v. 59, n. 3, p. 307-321, 2010.
GUPTA, S.; CHATURVEDI, P. Phytochemical Screening and Extracellular Enzymatic Enumeration of Foliar Endophytic Fungal Isolates of Centella asiatica (L.) Urban.
GUSAKOV, A. V. Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production. Trends in biotechnology, v. 29, n. 9, p. 419-425, 2011.
HANKIN, L.; ANAGNOSTAKIS, S. L. The use of solid media for detection of enzyme production by fungi. Mycologia, p. 597-607, 1975.
HATAKKA, A.; VIIKARI, L. Carbohydrate-binding modules of fungal cellulases: occurrence in nature, function, and relevance in industrial biomass conversion. Adv Appl Microbiol, v. 88, p. 103-165, 2014.
HIBBETT, D. et al. Sequence-based classification and identification of Fungi. Mycologia, p. 16-130, 2016.
HILLIS, D. M.; DIXON, M. T. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference. The Quarterly review of biology, v. 66, n. 4, p. 411-453, 1991.
HIMMEL, M. E. et al. Biomass recalcitrance: engineering plants and enzymes for biofuels production. Science, v. 315, n. 5813, p. 804-807, 2007.
HORN, Svein Jarle et al. Novel enzymes for the degradation of cellulose. Biotechnology for biofuels, v. 5, n. 1, p. 45, 2012.
IBGE. IBGE Indicadores. Estatística da Produção Agrícola. 2016.
Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., v. 35 n.1, Article No. 06, p. 21-24, 2015.
74
JAYANI, R. S.; SAXENA, S.; GUPTA, R. Microbial pectinolytic enzymes: a review. Process Biochemistry, v. 40, n. 9, p. 2931-2944, 2005.
JORDAAN, A.; TAYLOR, J. E.; ROSSENKHAN, R. Occurrence and possible role of endophytic fungi associated with seed pods of Colophospermum mopane (Fabaceae) in Botswana. South African Journal of Botany, v. 72, n. 2, p. 245-255, 2006.
JØRGENSEN, H. et al. Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary electrophoresis. Enzyme and Microbial Technology, v. 36, n. 1, p. 42-48, 2005.
JOUZANI, S. TAHERZADEH, G. M. J. Advances in consolidated bioprocessing systems for bioethanol and butanol production from biomass: a comprehensive review. Biofuel Research Journal, v. 2, n. 1, p. 152-195, 2015.
JUTURU, V.; WU, J. C. Microbial cellulases: engineering, production and applications. Renewable and Sustainable Energy Reviews, v. 33, p. 188-203, 2014.
KATOH, K. et al. MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform. Nucleic acids research, v. 30, n. 14, p. 3059-3066, 2002.
KHAN, A. L. et al. Endophytic fungi from Frankincense tree improves host growth and produces extracellular enzymes and indole acetic acid. PloS one, v. 11, n. 6, p. e0158207, 2016.
KING, B. C. et al. Arsenal of plant cell wall degrading enzymes reflects host preference among plant pathogenic fungi. Biotechnology for biofuels, v. 4, n. 1, p. 4, 2011.
KULDAU, G.; BACON, C. Clavicipitaceous endophytes: their ability to enhance resistance of grasses to multiple stresses. Biological Control, v. 46, n. 1, p. 57-71, 2008.
LANDELL, M. G. A.; BRESSIANI, J. A. Melhoramento genético, caracterização e manejo varietal. Cana-de-açúcar. Campinas: Instituto Agronômico, p. 101-155, 2008.
LOPES, M. L. et al. Ethanol production in Brazil: a bridge between science and industry. Brazilian Journal of Microbiology, v. 47, p. 64-76, 2016.
LUMYONG, S. et al. Enzymatic activity of endophytic fungi of six native seedling species from Doi Suthep-Pui National Park, Thailand. Canadian journal of microbiology, v. 48, n. 12, p. 1109-1112, 2002.
LUO, J. et al. Phylogenomic analysis uncovers the evolutionary history of nutrition and infection mode in rice blast fungus and other Magnaporthales. Scientific reports, v. 5, p. 9448, 2015.
75
LUVIZOTTO, D. M. et al. Genetic diversity and plant-growth related features of Burkholderia spp. from sugarcane roots. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 26, n. 10, p. 1829-1836, 2010.
MAGALHÃES, L. C. R.; POLETTO, C. M.; CUNHA, J. R.; FRANCO, P. F.; SALUM, T. F. C.; FAVARO, L. C. L. Sugarcane endophytic fungi as a source of new strains producing lipase. In: ENCONTRO DE PESQUISA E INOVAÇÃO DA EMBRAPA AGROENERGIA, 2., 2015, Brasília, DF. Anais ... Brasília, DF: Embrapa Agroenergia, 2015. p. 43-44.
MANDELS, M.; WEBER, J. The production of cellulases. Advances in Chemistry, Vol. 95 chapter 23, pp 391–414, 1969.
MARTÍN-SAMPEDRO, R. et al. Use of new endophytic fungi as pretreatment to enhance enzymatic saccharification of Eucalyptus globulus. Bioresource technology, v. 196, p. 383-390, 2015.
MATSUAKA.S.; GARCIA, A. A. F.; ARIZONO,H. Melhoramento da cana-de-açúcar. In: A Borém. (Org.). Melhoramento de Espécies Cultivadas. Viçosa: Editora da Universidade Federal de Viçosa. V.1, p. 205-252. 1999.
MENDES, R. Diversidade e caracterização genética de comunidades microbianas endofíticas associadas à cana-de-açúcar. 2008. Tese de Doutorado. Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz.
METSALU, T.; VILO, J. ClustVis: a web tool for visualizing clustering of multivariate data using Principal Component Analysis and heatmap. Nucleic acids research, v. 43, n. W1, p. W566-W570, 2015.
MILLER, G. L. Modified DNS method for reducing sugars. Anal. Chem, v. 31, n. 3, p. 426-428, 1959.
MUTHEZHILAN, R. et al. Dye Degrading Potential of Immobilized Laccase from Endophytic Fungi of Coastal Sand Dune Plants. International Journal of ChemTech Research, v. 6, n. 9, p. 4154-4160, 2014.
NARRA, M. et al. Production of cellulases by solid state fermentation with Aspergillus terreus and enzymatic hydrolysis of mild alkali-treated rice straw. Bioresource technology, v. 121, p. 355-361, 2012.
NASIM, G. et al. Seasonal dynamics of AM fungi in sugarcane (Saccharum officinarum L. Cv. Spf-213) in relation to red rot (Colletotrichum falcatum) disease from Punjab, Pakistan. Pakistan Journal of Botany, v. 40, p. 2587-2600, 2008.
NATH, A.; PATHAK, J.; JOSHI, S. R. Bioactivity assessment of endophytic fungi associated with Centella asiatica and Murraya koengii. Journal of Applied Biology & Biotechnology, v. 2, n. 05, p. 006-011, 2014.
OKAGAKI, La H. et al. Genome sequences of three phytopathogenic species of the Magnaporthaceae family of fungi. G3: Genes| Genomes| Genetics, v. 5, n. 12, p. 2539-2545, 2015.
76
PANDEY, A. et al. Biotechnological potential of agro-industrial residues. I: sugarcane bagasse. Bioresource technology, v. 74, n. 1, p. 69-80, 2000.
PATIL, M. G. et al. Extracellular Enzymatic Activities of Endophytic Fungi Isolated from Various Medicinal Plants. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci, v. 4, n. 3, p. 1035-1042, 2015.
PETRINI, Orlando; CARROLL, George. Endophytic fungi in foliage of some Cupressaceae in Oregon. Canadian Journal of Botany, v. 59, n. 5, p. 629-636, 1981.
PHALIP, V. et al. Plant cell wall degradation with a powerful Fusarium graminearum enzymatic arsenal. J Microbiol Biotechnol, v. 19, n. 6, p. 573-581, 2009.
POINTING, S. B. Qualitative methods for the determination of lignocellulolytic enzyme production by tropical fungi. Fungal diversity, 1999.
PONTECORVO, G. et al. The genetics of Aspergillus nidulans. Advances in genetics, v. 5, p. 141-238, 1953.
PRABAVATHY, D.; VALLI, N. C. SCREENING FOR EXTRACELLULAR ENZYMES AND PRODUCTION OF CELLULASE BY AN ENDOPHYTIC ASPERGILLUS sp, USING CAULIFLOWER STALK AS SUBSTRATE. International Journal on Applied Bioengineering, v. 6, n. 2, 2012.
PROMPUTTHA, I. et al. Can leaf degrading enzymes provide evidence that endophytic fungi becoming saprobes?. Fungal Diversity, v. 41, n. 1, p. 89-99, 2010.
PROMPUTTHA, I. et al. Fungal succession on senescent leaves of Manglietia garrettii in Doi Suthep-Pui National Park, northern Thailand. Fungal Diversity, 2002.
QUIROZ-CASTAÑEDA, R. E.; FOLCH-MALLOL, J. L. Hydrolysis of biomass mediated by cellulases for the production of sugars. Sustainable degradation of lignocellulosic biomass techniques, applications and commercialization. InTech, p. 119-155, 2013.
R Development Core Team. R: Uma Linguagem e Meio Ambiente para Computação Estatística. Viena, Áustria: a Fundação R para Computação Estatística. ISBN: 3-900051-07-0. Disponível em linha em http://www.R-project.org/. 2011.
RABELO, S. C. et al. Production of bioethanol, methane and heat from sugarcane bagasse in a biorefinery concept. Bioresource Technology, v. 102, n. 17, p. 7887-7895, 2011.
RAEDER, U.; BRODA, P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology, v. 1, n. 1, p. 17-20, 1985.
77
RAVALASON, H. et al. Fusarium verticillioides secretome as a source of auxiliary enzymes to enhance saccharification of wheat straw. Bioresource technology, v. 114, p. 589-596, 2012.
ROBL, D. et al. The capability of endophytic fungi for production of hemicellulases and related enzymes. BMC biotechnology, v. 13, n. 1, p. 1, 2013.
ROBL, D. Hemicellulases and acessory proteins from filamentous fungi and actinomycetes for lignocellulose biomass deconstruction. 2015. Tese de Doutorado. Universidade de São Paulo.
ROJAS, J. D. et al. The diversity of polyketide synthase genes from sugarcane-derived fungi. Microbial ecology, v. 63, n. 3, p. 565-577, 2012.
ROMÃO, A. S. Análise da comunidade fúngica associada à cana-de-açúcar e estudo da interação Trichoderma virens–planta hospedeira. 2010. Tese de Doutorado. Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz.
ROMÃO-DUMARESQ, A. S. et al. Diversity of Cultivated Fungi Associated with Conventional and Transgenic Sugarcane and the Interaction between Endophytic Trichoderma virens and the Host Plant. PloS one, v. 11, n. 7, p. e0158974, 2016.
SAMPEDRO, J; COSGROVE, D. J. The expansin superfamily. Genome biology, v. 6, n. 12, p. 242, 2005.
SAMSON, R. A.; HOEKSTRA, E. S. Peterson SW, Frisvad JC, Varga J. New species in Aspergillus section Terrei. Stud Mycol, v. 69, p. 39-55. 2011a.
SAMUELS, G. J. et al. The Trichoderma koningii aggregate species. Studies in mycology, v. 56, p. 67-133, 2006a.
SCHOCH, C. L. et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 109, n. 16, p. 6241-6246, 2012.
SCHULZ, B.; BOYLE, C. The endophytic continuum. Mycological research, v. 109, n. 6, p. 661-686, 2005.
SCOTT, A. J.; KNOTT, M. A cluster analysis method for grouping means in the analysis of variance. Biometrics, p. 507-512, 1974.
SHAN, L. et al. First report of Fusarium brachygibbosum causing maize stalk rot in China. Plant Disease, n. ja, 2017.
SHARMA, R. et al. Cellulolytic and xylanolytic enzymes from thermophilic Aspergillus terreus RWY. Journal of basic microbiology, v. 54, n. 12, p. 1367-1377, 2014.
78
SHIMODAIRA, H.; HASEGAWA, M. Multiple comparisons of log-likelihoods with applications to phylogenetic inference. Molecular biology and evolution, v. 16, p. 1114-1116, 1999.
SHRESTHA P, SZARO TM, BRUNS TD, TAYLOR JW. Systematic search for cultivatable fungi that best deconstruct cell walls of Miscanthus and sugarcane in the field. Appl Environ Microbiol.2011;77(15):5490–504.
SHRESTHA P., IBANEZ A. B., BAUER S., GLASSMAN S. I., SZARO T. M., BRUNS T. D., ET AL. (2015) Fungi isolated from Miscanthus and sugarcane: biomass conversion, fungal enzymes, and hydrolysis of plant cell wall polymers. Biotechnol. Biofuels. 8, 38. 10.1186/s13068-015-0221-3.
SILVA, R. L. O. et al. Endophytic fungi of Annona spp.: isolation, enzymatic characterization of isolates and plant growth promotion in Annona squamosa L. seedlings. Acta Botanica Brasilica, v. 20, n. 3, p. 649-655, 2006.
SMITH, D.; MCCLUSKEY, K.; STACKEBRANDT, E. Investment into the future of microbial resources: culture collection funding models and BRC business plans for biological resource centres. SpringerPlus, v. 3, n. 1, p. 81, 2014.
SOCCOL, C. R et al. Bioethanol from lignocelluloses: status and perspectives in Brazil. Bioresource technology, v. 101, n. 13, p. 4820-4825, 2010.
SORGATTO, M. et al. Purification and characterization of an extracellular xylanase produced by the endophytic fungus, Aspergillus terreus, grown in submerged fermentation. African Journal of Biotechnology, v. 11, n. 32, p. 8076-8084, 2012.
STROBEL, G.; DAISY, B. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiology and molecular biology reviews, v. 67, n. 4, p. 491-502, 2003.
STUART, R. M. et al. Culturable endophytic filamentous fungi from leaves of transgenic imidazolinone-tolerant sugarcane and its non-transgenic isolines. Archives of microbiology, v. 192, n. 4, p. 307-313, 2010.
STUART, R. M. Comunidade de fungos endofíticos associada à cana-de-açúcar convencional e geneticamente modificada. 2006. Tese de Doutorado. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz.
SUN, R. C.; SUN, X. F.; TOMKINSON, J. Hemicelluloses and their derivatives. Publication Date: October 7, 2003 | doi: 10.1021/bk-2004-0864.ch001, 2-22, 2004.
SUNITHA, V. H.; DEVI, D. N.; SRINIVAS, C. Extracellular enzymatic activity of endophytic fungal strains isolated from medicinal plants. World Journal of Agricultural Sciences, v. 9, n. 1, p. 01-09, 2013.
SURYANARAYANAN, T. S. et al. Fungal endophytes and bioprospecting. Fungal Biology Reviews, v. 23, n. 1, p. 9-19, 2009.
79
SWEENEY, M. D.; XU, F. Biomass converting enzymes as industrial biocatalysts for fuels and chemicals: recent developments. Catalysts, v. 2, n. 2, p. 244-263, 2012.
SYED, S.; RIYAZ-UL-HASSAN, S.; JOHRI, S. A novel cellulase from an endophyte, Penicillium sp. NFCCI 2862. American Journal of Microbiological Research, v. 1, n. 4, p. 84-91, 2013.
TOGHUEO, R. M. K. et al. Enzymatic activity of endophytic fungi from the medicinal plants Terminalia catappa, Terminalia mantaly and Cananga odorata. South African Journal of Botany, v. 109, p. 146-153, 2017.
TUPPAD, D. S.; SHISHUPALA, S. Evaluation of endophytic fungi from Butea monosperma for antimicrobial and enzyme activity. J. Med. Plants Stud, v. 2, n. 4, p. 38-45, 2014.
UZMA, Fazilath; KONAPPA, Narasimha Murthy; CHOWDAPPA, Srinivas. Diversity and extracellular enzyme activities of fungal endophytes isolated from medicinal plants of Western Ghats, Karnataka. Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences, v. 3, n. 4, p. 335-342, 2016.
VISSER, E. M. et al. Production and application of an enzyme blend from Chrysoporthe cubensis and Penicillium pinophilum with potential for hydrolysis of sugarcane bagasse. Bioresource technology, v. 144, p. 587-594, 2013.
WAITES, M. J. et al. Industrial microbiology: an introduction. John Wiley & Sons, 2001.
WANG, J. W. et al. Laccase production by Monotospora sp., an endophytic fungus in Cynodon dactylon. Bioresource Technology, v. 97, n. 5, p. 786-789, 2006.
WANG, Q. et al. Characterization of cellulase secretion and Cre1-Mediated carbon source repression in the potential lignocellulose-degrading strain Trichoderma asperellum T-1. PloS one, v. 10, n. 3, p. e0119237, 2015.
WHITE, T. J. et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications, v. 18, n. 1, p. 315-322, 1990.
WU, W. et al. Characterization of four endophytic fungi as potential consolidated bioprocessing hosts for conversion of lignocellulose into advanced biofuels. Applied Microbiology and Biotechnology, p. 1-16, 2017.
XIAO, Z.; STORMS, R.; TSANG, A. Microplate‐based filter paper assay to measure total cellulase activity. Biotechnology and Bioengineering, v. 88, n. 7, p. 832-837, 2004.
XIROS, C.; KATAPODIS, P.; CHRISTAKOPOULOS, P. Evaluation of Fusarium oxysporum cellulolytic system for an efficient hydrolysis of hydrothermally treated wheat straw. Bioresource technology, v. 100, n. 21, p. 5362-5365, 2009.
80
YADAV, R. et al. Antifungal and enzyme activity of endophytic fungi isolated from Ocimum sanctum and Aloe vera. African Journal of Microbiology Research, v. 9, n. 29, p. 1783-1788, 2015.
YANG, B. et al. Enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass. Biofuels, v. 2, n. 4, p. 421-449, 2011.
ZHANG, Y.-H. P. et al. Fractionating recalcitrant lignocellulose at modest reaction conditions. Biotechnology and Bioengineering, v. 97, n. 2, p. 214-223, 2007.
ZHANG, Y.-H. P.; HIMMEL, M. E.; MIELENZ, J. R. Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies. Biotechnology advances, v. 24, n. 5, p. 452-481, 2006.
ZHENG, Y.-K. et al. Diversity, distribution and biotechnological potential of endophytic fungi. Annals of Microbiology, v. 66, n. 2, p. 529-542, 2016.
81
ANEXOS
Anexo A - Tabela 3: Códigos e origem das 409 linhagens de fungos endofíticos de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) utilizadas neste trabalho.
Códigos das linhagens
1 15 28 43 57 71 86 101 117 132 147 162 179
2 16A 29 44 58 72 88 102 118 133A 148 163 180
3 16B 30 45 59 73 89 103 119 133B 149 164 182
4 17 31 46 60 74 90 104 120 134 150 165 183
5 18 32 47 61 75 91 105 122 135 151 167 184
7 19 33 48 62 76 92 106 124 136 152 169 186
8 20 34 49 63 78 93 107 125 137 153 170 187A
9 21 35 50 64 79 94 108 126A 138 154 171 188A
10 22 36 51 65 80 95 109 126B 140 155 172 189
11A 23 37 52 66 81 96A 111 127 141 156 173 190
11B 24 38 53 67 82 96B 112 128 142 157 174 192
12 25 39 54 68 83 97 113 129 143 158 175 194
13 26 40 55 69 84 98 114 130 144 159 176 200
14 27 42 56 70 85 99 115 131 146 160 178 277
AR100 AR13 AR153 AR173 AR192 AR213 AR235 AR255 AR275 AR290B AR32 AR50 AR83
AR101 AR131 AR155 AR174 AR195 AR214 AR236A AR257 AR277 AR293 AR33 AR51 AR85
82
Códigos das linhagens
AR102 AR133 AR156 AR175 AR196 AR215 AR236B AR258 AR278 AR294A AR36 AR52 AR86
AR103 AR135 AR157 AR176 AR197 AR217 AR238 AR259 AR279 AR294B AR37 AR53 AR87
AR104 AR136 AR158 AR177A AR198 AR218 AR239 AR26 AR28 AR296 AR38 AR55 AR88
AR105 AR136A AR159 AR177B AR199 AR219 AR240 AR261A AR280 AR299 AR39 AR58 AR92
AR107A AR137 AR160 AR179A AR20 AR22 AR242 AR261B AR281 AR30 AR4 AR6 AR93
AR107B AR138 AR161 AR179B AR204 AR220 AR243 AR264 AR283 AR301 AR40 AR61 AR94
AR112 AR14 AR162B AR18 AR206A AR221 AR245 AR265 AR284 AR302 AR41 AR65 AR95
AR117 AR141 AR163 AR181 AR206B AR222 AR246 AR266 AR285A AR303B AR42 AR66 AR98
AR118 AR142 AR164 AR182 AR207 AR223 AR248A AR267 AR285B AR304 AR43 AR67 AR99
AR12 AR143 AR167A AR183 AR208 AR224 AR248B AR268 AR286 AR305A AR45 AR69
AR120 AR144 AR167B AR184 AR209 AR225 AR249 AR27 AR287A AR305B AR46 AR70
AR122 AR146 AR168 AR185 AR21 AR226 AR25 AR270 AR287B AR306B AR47 AR74
AR125 AR147 AR169 AR186 AR210A AR227 AR250 AR272A AR288 AR308 AR48A AR77
AR126 AR148 AR17 AR187 AR210B AR231 AR252A AR272B AR289 AR308B AR48B AR79
AR127 AR150 AR171 AR188 AR211 AR233A AR252B AR273 AR29 AR309 AR49 AR80
AR128 AR151 AR172 AR190 AR212 AR234 AR254 AR274 AR290A AR31 AR5 AR82
Os códigos referem-se à identificação das linhagens mantidas na coleção de “Microrganismos e Microalgas Aplicados a Agroenergia e Biorrefinarias” da Embrapa Agroenergia (Brasília/DF). Todas as 409 linhagens são provenientes do município de Piracicaba (São Paulo). As linhagens estão preservadas pelo método Castellani, em triplicata, na coleção de microrganismos da Embrapa Agroenergia. As linhagens com códigos numéricos foram isoladas como endofíticas de folhas e raízes de cana-de-açúcar (STUART, 2006; STUART et al., 2010; MENDES, 2008). As linhagens com códigos iniciados por “AR” foram isoladas como endofíticas de raízes de cana-de-açúcar (ROMÃO, 2010).
83
Anexo B - Tabela 4: Classificação taxonômica de 296 fungos endofíticos de cana-de-açúcar baseada em análise filogenética da região ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossômico.
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
AR287B 623 99% Aspergillus terreus (KT778597)
99.6% Aspergillus terreus (JN129183)
99.6% Aspergillus terreus
(JN129182) Aspergillus [100%] A. terreus [83%]
A. alabamensis (seção Terrei)
AR136 485 100% Aspergillus brasiliensis (KX011592)
100% Aspergillus brasiliensis (JQ316521)
100% Aspergillus brasiliensis (JQ316521)
Aspergillus [100%] A. brasiliensis [89%]
A. brasiliensis (seção Nigri)
AR236B 606 100% Aspergillus brasiliensis (KT378129)
100% Aspergillus brasiliensis (JQ316521)
100% Aspergillus brasiliensis (JQ316521)
Aspergillus [100%] A. brasiliensis [73%]
A. brasiliensis (seção Nigri)
170 463 100% Aspergillus brasiliensis (KM491891)
100% Aspergillus brasiliensis (EF661198)
100% Aspergillus brasiliensis (AY939787)
Aspergillus [100%] A. brasiliensis [80%]
A. brasiliensis (seção Nigri)
AR21 547 100% Aspergillus flavus (KX572367)
100% Aspergillus flavus (JF681301)
100% Aspergillus minisclerotigenes JF41277
Petromyces [100%] A. flavus [100%]
A. flavus (seção Flavi)
153 509 100% Aspergillus flavus (KX572367)
100% Aspergillus flavus var. Oryzae (JX163919)
100% Aspergillus flavus (KC621105)
Petromyces [100%] A. flavus [100%]
A. flavus (seção Flavi)
169 572 100% Aspergillus oryzae (KX527867)
100% Aspergillus sp. (FJ378069)
100% Aspergillus flavus var. oryzae (HQ285576)
Petromyces [100%] A. flavus [100%]
A. flavus (seção Flavi)
AR131 597 100% Aspergillus fumigatus (KT972124)
100% Aspergillus fumigatus (FJ878713)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [95%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
AR137 438 99% Aspergillus fumigatus (KR023997)
100% Aspergillus fumigatus (CBS513.64)
100% Aspergillus fumigatus (CBS513.64)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [70%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
AR213 605 100% Aspergillus fumigatus (KR023997)
100% Aspergillus fumigatus (DTO 067-H1)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [96%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
AR214 614 100% Aspergillus fumigatus (NR_121481)
100% Aspergillus fumigatus (DTO 091-H1)
100% Aspergillus fumigatus (HQ026746)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [93%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
AR249 613 99% Aspergillus fumigatus (NR_121481)
99.6% Aspergillus fumigatus (DTO 091-H1)
99.6% Aspergillus fumigatus (HQ026746)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [97%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
AR252A 600 100% Aspergillus fumigatus (KT972124)
100% Aspergillus fumigatus (DTO 151-F6)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [95%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
AR252B 601 100% Aspergillus fumigatus (KR023997)
100% Aspergillus fumigatus (DTO 151-F6)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [95%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
84
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
AR261A 604 100% Aspergillus fumigatus (KT972124)
100% Aspergillus fumigatus (FJ878710)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [93%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
AR279 602 100% Aspergillus fumigatus (KT972124)
100% Aspergillus fumigatus (DTO 151-F6)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [95%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
AR301 601 100% Aspergillus fumigatus (KT972124)
100% Aspergillus fumigatus (DTO 151-E1)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [95%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
11A 510 99% Aspergillus fumigatus (KT972124)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [82%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
16B 602 100% Aspergillus fumigatus (KT972124)
100% Aspergillus fumigatus (FJ878712)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [96%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
122 604 100% Aspergillus fumigatus (NR_121481)
100% Aspergillus fumigatus (FJ878710)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [93%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
128 533 100% Aspergillus fumigatus (KT972124)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [95%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
192 608 100% Aspergillus fumigatus (NR_121481)
100% Aspergillus fumigatus (DTO 091-F6)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [94%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
200 601 100% Aspergillus fumigatus (KT972124)
100% Aspergillus fumigatus (FJ878710)
100% Aspergillus fumigatus (CBS126847)
Neosartorya [100%] A. fumigatus [95%]
A. fumigatus (seção Fumigati)
AR208 614 99% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JN129182)
100% Aspergillus terreus (JN129183)
Aspergillus [100%] A. terreus [91%]
A. hortai (seção Terrei)
AR220 591 99% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (N129182)
100% Aspergillus terreus (JN129183)
Aspergillus [100%] A. terreus [87%]
A. hortai (seção Terrei)
AR293 615 99% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JN129182)
100% Aspergillus terreus (JN129183)
Aspergillus [100%] A. terreus [90%]
A. hortai (seção Terrei)
AR274 615 99% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JN129183)
100% Aspergillus terreus (JN129183)
Aspergillus [100%] A. terreus [90%]
A. hortai (seção Terrei)
43 601 99% Aspergillus parasiticus (KF624769)
99.8% Aspergillus parasiticus (HQ340102)
100% Aspergillus parasiticus (AB074996)
Petromyces [100%] A. parasiticus [79%]
A. parasiticus (seção Flavi)
95 601 99% Aspergillus parasiticus (KF624769)
99.8% Aspergillus parasiticus (HQ340102)
100% Aspergillus parasiticus (AB074996)
Petromyces [100%] A. parasiticus [77%]
A. parasiticus (seção Flavi)
96A 605 99% Aspergillus parasiticus (KF624769)
99.8% Aspergillus parasiticus (HQ340110)
100% Aspergillus parasiticus (AB074996)
Petromyces [100%] A. parasiticus [67%]
A. parasiticus (seção Flavi)
85
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
107 522 99% Aspergillus transmontanensis (JF446612)
100% Aspergillus transmontanensis (JF446613)
100% Aspergillus transmontanensis (JF446613)
Petromyces [100%] A. parasiticus [81%]
A. parasiticus (seção Flavi)
AR255 571 100% Aspergillus terreus (KU641388)
100% Aspergillus terreus (JX481965)
100% Aspergillus terreus (KC119206)
Aspergillus [100%] A. terreus [91%]
A. pseudoterreus (seção Terrei)
AR234 499 100% Aspergillus terreus (KX011595)
100% Aspergillus terreus (MITS317)
100% Aspergillus terreus (KC119196)
Aspergillus [99%] A. alabamensis [79%]
A. pseudoterreus (seção Terrei)
AR118 540 100% Aspergillus terreus (KU743892)
100% Aspergillus terreus (JN851053)
100% Aspergillus terreus (MITS318)
Aspergillus [100%] A. terreus [100%]
A. terreus (seção Terrei)
AR136A 613 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (FJ878639)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [89%]
A. terreus (seção Terrei)
AR162B 554 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JF509456)
100% Aspergillus terreus (MITS328)
Aspergillus [100%] A. terreus [64%]
A. terreus (seção Terrei)
AR174 620 100% Aspergillus terreus (KC119206)
100% Aspergillus terreus (FJ878640)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [96%]
A. terreus (seção Terrei)
AR177A 630 99% Aspergillus terreus (KC119206)
100% Aspergillus terreus (AJ413985)
100% Aspergillus terreus (JX188057)
Aspergillus [100%] A. terreus [92%]
A. terreus (seção Terrei)
AR188 623 100% Aspergillus terreus (KC119206)
100% Aspergillus terreus (FJ878640)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [91%]
A. terreus (seção Terrei)
AR224 614 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JF509456)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [91%]
A. terreus (seção Terrei)
AR236A 578 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (KC119206)
100% Aspergillus terreus (JX188057)
Aspergillus [100%] A. terreus [92%]
A. terreus (seção Terrei)
AR246 619 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (FJ878639)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [94%]
A. terreus (seção Terrei)
AR250 628 100% Aspergillus terreus (KC119206)
100% Aspergillus terreus (GQ461901)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [94%]
A. terreus (seção Terrei)
AR254 616 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (FJ878639)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [92%]
A. terreus (seção Terrei)
AR58 637 100% Aspergillus terreus (KC119198)
100% Aspergillus terreus (JX188057)
100% Aspergillus terreus (KC119206)
Aspergillus [100%] A. terreus [93%]
A. terreus (seção Terrei)
AR147 531 100% Aspergillus terreus (KX694148)
100% Aspergillus terreus (JQ697512)
100% Aspergillus terreus (JQ697526)
Aspergillus [100%] A. terreus [99%]
A. terreus (seção Terrei)
86
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
AR285B 500 100% Aspergillus terreus (KX694148)
100% Aspergillus terreus (JX077001)
100% Aspergillus terreus (JX077001)
Aspergillus [100%] A. terreus [100%]
A. terreus (seção Terrei)
AR25 615 100% Aspergillus terreus KT778597.1
100% Aspergillus terreus (FJ878639)
100% Aspergillus terreus (GQ461911)
Aspergillus [100%] A. terreus [91%]
A. terreus (seção Terrei)
AR186 613 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (FJ878639)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [91%]
A. terreus (seção Terrei)
AR195 623 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JX188057)
100% Aspergillus terreus (JX188057)
Aspergillus [100%] A. terreus [92%]
A. terreus (seção Terrei)
AR198 625 100% Aspergillus terreus (KC119206)
100% Aspergillus terreus (CNRMA14.14)
100% Aspergillus terreus (AJ413985)
Aspergillus [100%] A. terreus [91%]
A. terreus (seção Terrei)
AR285A 574 93% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (CNRMA14.14)
100% Aspergillus terreus (JX290029)
Aspergillus [100%] A. terreus [96%]
A. terreus (seção Terrei)
22 620 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JX481965)
100% Aspergillus terreus (JX188057)
Aspergillus [100%] A. terreus [92%]
A. terreus (seção Terrei)
30 611 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (FJ878639)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [93%]
A. terreus (seção Terrei)
45 622 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JX481965)
100% Aspergillus terreus (JX188057)
Aspergillus [100%] A. terreus [94%]
A. terreus (seção Terrei)
48 614 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JF509455)
100% Aspergillus terreus (MITS321)
Aspergillus [100%] A. terreus [93%]
A. terreus (seção Terrei)
53 621 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (AJ413985)
100% Aspergillus terreus (JX188057)
Aspergillus [100%] A. terreus [89%]
A. terreus (seção Terrei)
55 615 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (FJ878639)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [91%]
A. terreus (seção Terrei)
60 566 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (FJ878638)
100% Aspergillus terreus (E37KC119206)
Aspergillus [100%] A. terreus [81%]
A. terreus (seção Terrei)
65 631 100% Aspergillus terreus (KC119206)
100% Aspergillus terreus (KC119206)
100% Aspergillus terreus (JX188057)
Aspergillus [100%] A. terreus [94%]
A. terreus (seção Terrei)
67 617 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (FJ878639)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [92%]
A. terreus (seção Terrei)
70 620 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JF509456)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [95%]
A. terreus (seção Terrei)
87
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
73 616 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JF509455)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [92%]
A. terreus (seção Terrei)
78 615 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (FJ878639)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [91%]
A. terreus (seção Terrei)
98 498 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JQ070071)
100% Aspergillus terreus (JQ697516)
Aspergillus [100%] A. terreus [99%]
A. terreus (seção Terrei)
99 615 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (FJ878639)
100% Aspergillus terreus (GQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [91%]
A. terreus (seção Terrei)
114 631 100% Aspergillus terreus (JX290029)
100 % Aspergillus terreus (AJ41398)
100% Aspergillus terreus (JX290029)
Aspergillus [100%] A. terreus [94%]
A. terreus (seção Terrei)
126A 621 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (AJ413985)
100% Aspergillus terreus (AJ413985)
Aspergillus [100%] A. terreus [89%]
A. terreus (seção Terrei)
126B 613 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JF509455)
100% Aspergillus terreus (MITS319)
Aspergillus [100%] A. terreus [91%]
A. terreus (seção Terrei)
178 613 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (FJ878639)
100% Aspergillus terreus (SGQ461903)
Aspergillus [100%] A. terreus [89%]
A. terreus (seção Terrei)
180 586 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (GQ461911)
100% Aspergillus terreus (SFJ878637)
Aspergillus [100%] A. terreus [95%]
A. terreus (seção Terrei)
93 607 100% Aspergillus tubingensis (KF624772)
100% Aspergillus tubingensis (DTO147-B7)
100% Aspergillus tubingensis (CBS117765)
Aspergillus [100%] A. awamori [52%]
A. tubingensis (seção Nigri)
AR242 630 99% Aspergillus terreus (KM491895)
100% Aspergillus terreus (JN129183)
100% Aspergillus terreus (JN129182)
Aspergillus [100%] A. terreus [91%]
Aspergillus sp. (seção Terrei)
AR245 630 99% Aspergillus terreus (KM491895)
100% Aspergillus terreus (JN129183)
99.8% Aspergillus terreus (CBS116757)
Aspergillus [100%] A. terreus [91%]
Aspergillus sp. (seção Terrei)
AR142 392 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus terreus (JQ910162)
100% Aspergillus terreus (UOA/HCPF 10178)
Aspergillus [100%] A. alabamensis [78%]
Aspergillus sp. (seção Terrei)
10 496 100% Aspergillus terreus (KX011595)
100% Aspergillus terreus (JX481965)
100% Aspergillus terreus (JF509455)
Aspergillus [100%] A. alabamensis [74%]
Aspergillus sp. (seção Terrei)
AR135 610 95% Aspergillus terreus (KT778597)
97.4% Aspergillus terreus (JQ717327)
97.4% Aspergillus terreus (JQ717316)
Neosartorya [44%] A. fumigatus [37%]
Aspergillus sp. (seção Terrei)
AR199 263 100% Aspergillus terreus (KX011595)
100% Aspergillus terreus (JX863373)
100% Aspergillus terreus (MITS2810)
Aspergillus [100%] A. alabamensis [69%]
Aspergillus sp. (seção Terrei)
88
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
AR219 401 100% Aspergillus terreus (KX011595)
100% Aspergillus terreus (JX174056)
100% Aspergillus terreus (UOA/HCPF 10178)
Aspergillus [100%] A. alabamensis [95%]
Aspergillus sp. (seção Terrei)
AR127 431 100% Aspergillus terreus (KT778597)
100% Aspergillus sp. 7 BRO 2013(KF367546)
100% Aspergillus terreus (JX481965)
Aspergillus [99%] A. alabamensis [69%]
Aspergillus sp. (seção Terrei)
21 661 99% Penicillium citrinum (KF866296)
100% Cyphellaceae (HQ116392)
100% Cyphellaceae (HQ116392)
Campanophyllum [13%] C proboscideum [13%]
Basidiomycota
AR240 510 100% Beauveria bassiana (KX255641)
100% Beauveria bassiana (JQ266099)
100% Beauveria bassiana (CBS212.61)
Cordyceps [100%] B. bassiana [100%]
Beauveria bassiana
AR69 506 100% Beauveria bassiana (KU751852)
100% Beauveria bassiana (JX188252)
100% Beauveria bassiana (CBS158.91)
Cordyceps [100%] B. bassiana [100%]
Beauveria bassiana
16A 452 100% Beauveria bassiana (KX255641)
100% Beauveria bassiana (JN195740)
100% Beauveria bassiana (JQ434752)
Cordyceps [100%] B. bassiana [99%]
Beauveria bassiana
88 511 100% Beauveria bassiana (KX255641)
100% Beauveria bassiana (JQ266099)
100% Beauveria bassiana (JQ266217)
Cordyceps [100%] B. bassiana [100%]
Beauveria bassiana
91 512 100% Beauveria bassiana (KX255641)
100% Beauveria sp. MTCC 4597 (JQ266171)
100% Beauveria bassiana (CBS212.61)
Cordyceps [100%] B. bassiana [100%]
Beauveria bassiana
138 511 100% Beauveria bassiana (KX255641)
100% Beauveria bassiana (JQ266099)
100% Beauveria bassiana (CBS212.61)
Cordyceps [100%] B. bassiana [100%]
Beauveria bassiana
154 582 100% Beauveria bassiana (KX255641)
100% Beauveria bassiana (JN713137)
100% Beauveria bassiana (JN713137)
Cordyceps [100%] B. bassiana [100%]
Beauveria bassiana
155 513 100% Beauveria bassiana (KX255641)
100% Beauveria bassiana (JQ266165)
100% Beauveria bassiana (CBS212.61)
Cordyceps [100%] B. bassiana [100%]
Beauveria bassiana
156 592 99% Cochliobolus sativus (JQ936099)
99.4% Cochliobolus sp. CMT68 (JQ754043)
99.4% Cochliobolus sp.CMT68 (JQ754043)
Cochliobolus [100%] C. sativus [71%]
Bipolaris gossypina
165 543 99% Cochliobolus sp. (JQ754043)
99.4% Cochliobolus sp. CMT68 (JQ754043)
99.4% Cochliobolus sp. CMT68 (JQ754043)
Cochliobolus [100%] C. sativus [70%]
Bipolaris gossypina
AR305B 586 99% Uncultured Chaetomium GU055594
99.8% Chaetomium sp. (KC427016)
99.8% Chaetomium sp. 11 JAS 2013 (KC427016)
Chaetomium[100%] C. megalocarpum [88%]
Chaetomium grande
AR305A 313 99% Uncultured fungus (KT799145)
99.79% Chaetomium sp. (KC427016)
99.79% Chaetomium sp. (KC427016)
Chaetomium [98%] C. megalocarpum [84%]
Chaetomium grande
AR51 539 99% Bionectria sp. (GU973628)
99.2% Bionectria sp. ASR 51 (GU973646)
99.2% Bionectria sp. ASR 51 (GU973646)
Bionectria [98%] B. ralfsii [47%]
Clonostachys lucifer
89
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
AR151 525 100% Clonostachys rosea (KF736448)
100% Bionectria ochroleuca (JQ794833)
100% Clonostachys rosea f catenulata (HM751081)
Bionectria[100%] C. rosea f catenulata[73%]
Clonostachys rosea
105 533 99% Phomopsis sp. (JF767000)
99.4% Phomopsis sp. G29 79 (JF767000)
99.4% Phomopsis sp. G29 79 (JF767000)
Diaporthe [100%] Diaporthe sp. JZG [62%]
Diaporthe lusitanicae
80 545 99% Diaporthe phaseolorum (KF498865)
100% Diaporthe phaseolorum JQ814335
100% Diaporthe phaseolorum (JQ814335)
Diaporthe [100%] D. phaseolorum [65%]
Diaporthe phaseolorum
74 594 99% Diaporthe sp. (KC343211)
99.8% Diaporthe sp. 8 RG 2013 (KC343211)
99.8% Diaporthe sp. 8 RG 2013 (KC343211)
Phomopsis [99%] P. loropetali [55%]
Diaporthe phoenicicola
108 534 99% Phomopsis sp. (JN153052)
100% Phomopsis sp. FLS 2010 (HQ022898)
100% Phomopsis sp. FLS 2010 (HQ022898)
Diaporthe [100%] Diaporthe sp. FLS [62%]
Diaporthe siamensis
38 584 99% Diaporthe melonis (KP182391)
99.8% Diaporthe sp. FLS 2010 (HQ022915)
99.8% Diaporthe sp. FLS 2010 (HQ022895)
Diaporthe [100%] D. novem [31%]
Diaporthe sp. (helianthi)
40 364 99% Phomopsis sp. (KM979820)
98.9% Phomopsis sp. Vega023 (EU002919)
98.9% Phomopsis sp. Vega023 (EU002919)
Diaporthe [100%] P. cuppatea [22%]
Diaporthe sp. (helianthi)
81 542 100% Phomopsis sp. (KM979832)
99.8% Diaporthe sp. FLS 2010 (HQ022915)
99.8% Diaporthe sp. FLS 2010 (HQ022895)
Diaporthe [100%] D. novem [37%]
Diaporthe sp. (helianthi)
127 535 99% Phomopsis sp. (KM979832)
99.8% Fungal endophyte (JX155864)
99.8% Fungal endophyte (JX155864)
Diaporthe [100%] D. novem [33%]
Diaporthe sp. (helianthi)
AR227 492 99% Dokmaia sp. (GU973777)
100% Dokmaia sp. ASR 227 (GU973777)
100% Dokmaia sp. ASR 227 (GU973777)
Dokmaia [100%] D. monthadangii [100%]
Dokmaia monthadangii
AR211 600 99% Eutypella sp. (KM396645)
99.6% Eutypella citricola (CBS128333)
99.6% Eutypella citricola (CBS128333)
Eutypella [100%] E. citricola [100%]
Eutypella citricola
AR179A 550 99% Epicoccum nigrum (KR094461)
99.7% Epicoccum nigrum (CBS174.34)
99.4% Epicoccum nigrum (FJ904828)
Phoma [96%] P. epicoccina [32%]
Epicoccum nigrum
AR79 513 100% Epicoccum nigrum (KX664419)
100% Epicoccum sp. (JQ761702)
100% Uncultured Epicoccum (KC785551)
Phoma [95%] E. nigrum [74%]
Epicoccum nigrum
101 237 100% Dothideomycetes (KU574688)
100% Epicoccum sorghi (KC106711)
100% Epicoccum sorghi (KC106699)
Epicoccum [99%] E. sorghi [99%]
Epicoccum sorghinum
148 543 100% Phoma sp. (KM259932)
100% Ascomycota sp. JY9 (GU380355)
100% Phoma sp. TMS 2011 (HQ630963)
Epicoccum [100%] E. sorghi [100%]
Epicoccum sorghinum
172 336 100% Epicoccum sorghinum (KX171661)
100% Epicoccum sorghinum (PD 88/549)
100% Ampelomyces sp. M51 (JQ936092)
Epicoccum [100%] E. sorghi [100%]
Epicoccum sorghinum
90
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
AR153 300 100% Exophiala spinifera (KU052791)
100% Exophiala spinifera (CBS132590)
100% Exophiala spinifera (CBS132590)
Exophiala [91%] E. spinifera [91%]
Exophiala spinifera
3 557 100% Setosphaeria rostrata (KU856642)
100% Setosphaeria rostrata (JN089762)
100% Exserohilum rostratum (WM 11.61)
Setosphaeria [100%] E. rostratum [100%]
Exserohilum rostratum
119 503 99% Fusarium circinatum (KC464621)
99.8% Fusarium circinatum (KC464628)
99.8% Fusarium circinatum (KC464618)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [100%]
F. begoniae (F. fujikuroi complex)
AR83 321 100% Fusarium sp. (GU973781)
100% Fusarium brachygibbosum
100% Fusarium sp. ASR 99 (GU973675)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR175 386 100% Fusarium sp. (GU973781)
100% Fusarium sp. (GQ370366)
100% Fusarium brachygibbosum
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR304 313 100% Fusarium sp. (GU973678)
100% Fusarium brachygibbosum
100% Fusarium sp. ASR 233 (GU973781)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR92 278 99% Fusarium brachygibbosum KU935701
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR138 319 99% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
99.6% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
99.6% Fusarium sp. ASR 233 (GU973781)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR270 405 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR299 329 99% Fusarium brachygibbosum (KT224240)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium sp. ASR 102 (GU973678)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR289 353 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR217 419 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR209 418 99% Fusarium brachygibbosum (KT224240)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
91
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
AR284 421 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR38 482 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium sp CBMAI 1017 (GQ370366)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR222 369 100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR141 349 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium sp. ASR 233 (GU973781)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR268 502 100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR238 501 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR13 515 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR36 500 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR157 405 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR164 467 100% Fusarium brachygibbosum KF897843.1
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR183 465 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
92
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
AR296 466 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR161 498 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR288 502 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR215 511 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR283 248 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium sp. (GQ370366)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [99%] F. brachygibbosum [99%]
F. brachygibbosum
AR231 327 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium sp. ASR 233 (GU973781)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR302 308 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR45 277 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR172 467 100% Fusarium sp. (GU973781)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR286 278 100% Fusarium sp. (GU973781)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR32 322 100% Fusarium sp. (GU973781)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium sp. ASR 102 (GU973678)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
93
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
AR275 502 100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR48A 308 100% Fusarium sp. (GU973781)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR48B 422 100% Uncultured soil fungus (DQ420786)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR206B 576 99% Fusarium brachygibbosum (GQ505450)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR206A 576 100% Uncultured soil fungus (DQ420786)
99.8% Uncultured fungus (HG327885)
99.8% Uncultured fungus (HG327905)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
19 504 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
25 404 100% Fusarium sp. (GU973781)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
32 403 100% Fusarium sp. (GU973781)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
36 149 100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
42 516 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
50 321 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium sp. ASR 233 (GU973781)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
94
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
56 328 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium sp. ASR 102 (GU973678)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
59 406 99% Fusarium brachygibbosum (KT224039)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
63 518 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
66 509 100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
68 482 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium sp. CBMAI 1017 (GQ370366)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
72 405 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
75 303 100% Fusarium brachygibbosum KF897843
100% Fusarium sp. ASR 48 (GU973643)
100% Fusarium brachygibbosum JF776653
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
97 329 100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium sp. ASR 102 (GU973678)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
117 466 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
125 501 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
134 403 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
95
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
158 518 100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
179 499 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
182 504 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
190 403 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
277 294 100% Fusarium brachygibbosum (KF897843)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
100% Fusarium brachygibbosum (JF776653)
Fusarium [100%] F. brachygibbosum [100%]
F. brachygibbosum
AR243 515 100% Fusarium dlaminii (KU680355)
100% Fusarium dlaminii (CBS481.94)
100% Fusarium dlaminii (CBS481.94)
Gibberella [100%] F. acutatum [68%]
F. dlaminii
AR169 503 99% Fusarium acutatum (NR_111142)
100% Fusarium dlaminii CBS 481.94
100% Fusarium dlaminii CBS 481.94
Gibberella [100%] F. acutatum [65%]
F. dlaminii
AR82 443 100% Fusarium dlaminii (KU680355)
100% Fusarium dlaminii (CBS481.94)
100% Fusarium sp. ASR 182 (GU973736)
Gibberella [100%] F. acutatum [68%]
F. dlaminii
AR86 528 100% Fusarium dlaminii (X94177)
100% Fusarium dlaminii (CBS481.94)
100% Fusarium dlaminii (CBS481.94)
Gibberella [100%] F. acutatum [80%]
F. dlaminii
31 443 100% Fusarium sp. (HQ631057)
100% Fusarium sacchari (AB374079)
100% Fusarium sacchari (AB374079)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [99%]
F. lactis (F. fujikuroi complex)
AR167A 563 100% Fusarium oxysporum (KJ653447)
100% Fusarium oxysporum (FJ478116)
100% Fusarium oxysporum (HQ607833)
Gibberella [100%] F. oxysporum [32%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR167B 556 100% Fusarium oxysporum (JN116678)
100% Fusarium oxysporum (EU839392)
100% Fusarium oxysporum (EU839403)
Gibberella [100%] F. oxysporum [40%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR177B 527 100% Fusarium oxysporum (KC427029)
100% Fusarium oxysporum (JN232172)
100% Fusarium oxysporum (JN232153)
Gibberella [100%] F. oxysporum [51%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR18 520 100% Fusarium oxysporum (LN828196)
100% Fusarium oxysporum (GQ365156)
100% Fusarium oxysporum (MITS1854)
Gibberella [100%] F. oxysporum [59%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
96
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
AR168 489 100% Fusarium oxysporum (KX253981)
100% Fusarium oxysporum (KC999985)
100% Fusarium oxysporum (CBS130321)
Gibberella [100%] F. oxysporum [76%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR99 509 100% Fusarium oxysporum (KX929698)
100% Fusarium oxysporum (JN400710)
100% Fusarium oxysporum (CBS132473)
Gibberella [100%] F. oxysporum [80%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR98 502 100% Fusarium oxysporum (KT461496)
100% Fusarium oxysporum (GU256752)
100% Fusarium oxysporum (CBS184.34)
Gibberella [100%] F. oxysporum [82%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR105 424 100% Fusarium oxysporum (KU872840)
100% Fusarium oxysporum (JN859443)
100% Fusarium sp. KR4 (KC623568)
Gibberella [100%] F. oxysporum [55%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR171 504 100% Fusarium oxysporum (KU935668)
100% Fusarium oxysporum (DQ016215)
100% Fusarium oxysporum (CBS130321)
Gibberella[100%] F. oxysporum[76%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR80 503 100% Fusarium oxysporum (KU935668)
100% Fusarium oxysporum (DQ016212)
100% Fusarium oxysporum (CBS130321)
Gibberella [100%] F. oxysporum [77%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR102 490 99% Fusarium oxysporum (KT461496)
99.7% Fusarium oxysporum (GU256752)
99.7% Fusarium oxysporum (CBS184.34)
Gibberella [100%] F. oxysporum [42%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR150 488 100% Fusarium oxysporum (KU935668)
100% Fusarium oxysporum (KC999985)
100% Fusarium oxysporum (HM235965)
Gibberella [100%] F. oxysporum [72%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR100 499 100% Fusarium oxysporum (KU935668)
100% Fusarium oxysporum (AB369259)
100% Fusarium oxysporum (CBS130321)
Gibberella [100%] F. oxysporum [77%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR29 503 100% Fusarium oxysporum (KX929698)
100% Fusarium oxysporum (KC577178)
100% Fusarium oxysporum (CBS132473)
Gibberella [100%] F. oxysporum [82%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR87 499 100% Fusarium oxysporum (KU935668)
100% Fusarium oxysporum (AB369259)
100% Fusarium oxysporum (CBS130321)
Gibberella [100%] F. oxysporum [77%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
AR93 501 100% Fusarium oxysporum (KU935668)
100% Fusarium oxysporum (DQ016192)
100% Fusarium oxysporum (CBS130321)
Gibberella [100%] F. oxysporum [76%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
9 511 100% Fusarium oxysporum (KU935668)
100% Fusarium oxysporum (DQ016217)
100% Fusarium oxysporum (DQ016212)
Gibberella [100%] F. oxysporum [82%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
76 268 99% Fusarium oxysporum (KU847855)
99.6% Uncultured soil fungus (JX317404)
99.6% Uncultured fungus (HG327889)
Gibberella [100%] F. acutatum [60%]
F. oxysporum (F. oxysporum complex)
7 515 100% Fusarium sacchari (KC464630)
100% Fusarium sacchari (KC464631)
100% Fusarium sacchari (KC464631)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [88%]
F. sacchari (F. fujikuroi complex)
18 443 100% Fusarium sacchari (KC464630)
100% Fusarium sacchari (KC464630)
100% Fusarium sacchari (KC464630)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [87%]
F. sacchari (F. fujikuroi complex)
97
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
27 504 99% Fusarium verticillioides (KR047092
100% Fusarium sacchari (KC464631)
100% Fusarium sp. (JQ388287)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [91%]
F. sacchari (F. fujikuroi complex)
118 500 99% Fusarium fujikuroi (KJ000436)
100% Fusarium sp. CPO 10010 (JQ388287)
100% Fusarium sp. (GQ370364)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [92%]
F. sacchari (F. fujikuroi complex)
175 554 100% Fusarium sacchari (KC464630)
100% Fusarium sacchari (KC464630)
100% Fusarium sacchari (KC464630)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [88%]
F. sacchari (F. fujikuroi complex)
176 490 100% Fusarium sacchari (KC464630)
100% Fusarium sacchari (KC464631)
100% Fusarium sacchari (SKC464631)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [84%]
F. sacchari (F. fujikuroi complex)
AR308 525 100% Fusarium solani (KT224788)
100% Uncultured Fusarium (GQ280341)
100% Haematonectria (AM412598)
Nectria [91%] F. oxysporum [90%]
F. solani
103 542 99% Fusarium solani (KT211526)
99.2% Fusarium solani (CBS130178)
99.2% Fusarium solani (CBS130178)
Haematonectria [100%] Fusarium sp. KC [88%]
F. solani
106 135 100% Fusarium oxysporum (KY031980)
100% Uncultured Fusarium (AB831201)
100% Fusarium oxysporum UOA 14172
Gibberella [100%] F. oxysporum [100%]
Fusarium sp. (F. oxysporum complex)
AR126 559 99% Fusarium sp. (KF367548)
100% Fusarium sp. 2 TMS 2011 (HQ631016)
100% Gibberella intermedia (AB646795)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [100%]
Fusarium sp. (F. fujikuroi complex)
20 445 100% Gibberella intermedia (JQ936154)
100% Gibberella intermedia (JQ936154)
100% Gibberella intermedia (AB646795)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [97%]
Fusarium sp. (F. fujikuroi complex)
102 487 100% Gibberella intermedia (JQ936154)
100% Gibberella intermedia (AB646795)
100% Gibberella intermedia (AB646795)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [99%]
Fusarium sp. (F. fujikuroi complex)
113 465 100% Fusarium sp. (HQ631016)
100% Gibberella intermedia (JQ936154)
100% Gibberella intermedia (JQ936154)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [99%]
Fusarium sp. (F. fujikuroi complex)
115 491 100% Gibberella intermedia (JQ936154)
100% Gibberella intermedia (AB646795)
100% Gibberella intermedia (AB646795)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [96%]
Fusarium sp. (F. fujikuroi complex)
143 489 100% Fusarium oxysporum (KU878135)
100% Fusarium sp. CHTAG38 (JF773629)
100% Gibberella fujikuroi var. fujikuroi (JF499676)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [99%]
Fusarium sp. (F. fujikuroi complex)
160 493 100% Gibberella moniliformis (JQ936155)
100% Gibberella fujikuroi var. fujikuroi (AB649145)
100% Gibberella fujikuroi var. fujikuroi (JQ936155)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [99%]
Fusarium sp. (F. fujikuroi complex)
162 490 100% Fusarium sp. (KF293334)
100% Gibberella intermedia (AB646795)
100% Gibberella fujikuroi var. fujikuroi (AB649145)
Gibberella [100%] F. pseudonygamai [100%]
Fusarium sp. (F. fujikuroi complex)
AR306B 578 99% Myrmecridium schulzeri (KP132480)
100% Myrmecridium schulzeri (PWQ2368)
100% Myrmecridium schulzeri (PWQ2368)
Myrmecridium [100%] M. schulzeri [100%]
Myrmecridium schulzeri
98
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
AR22 577 99% Nectria mariannaeae (FJ940904)
99.1% Nectria mariannaeae (FJ940904)
99.1% Nectria mariannaeae (FJ940904)
Nectria [100%] M. aquaticola [73%]
Mariannaea sp.
AR280 505 99% Mariannaea aquaticola (KT224837)
100% Mariannaea sp. ASR 280 (GU973818)
100% Mariannaea sp. ASR 280 (GU973818)
Nectria [100%] M. aquaticola [86%]
Mariannaea sp.
146 568 99% Gelasinospora saitoi (AY681184)
98,9% Gelasinospora saitoi (CBS435.74)
98,9% Gelasinospora saitoi (CBS435.74)
Neurospora [100%] G. tetrasperma [37%]
Neurospora calospora
94 541 94% Magnaporthaceae (JX134674)
93.0% Magnaporthaceae NZ 2013 (JX134674)
93.0% Magnaporthaceae NZ 2013 (JX134674)
Gaeumannomyces [68%] G. graminis [53%]
Omnidenptus affinis
AR122 565 100% Penicillium citrinum (KM491892)
100% Penicillium citrinum (CBS117.64)
100% Penicillium citrinum (CBS122452)
Penicillium [100%] P. griseofulvum [73%]
P. citrinum (seção Citrina)
150 476 100% Penicillium citrinum (KU743898)
100% Penicillium citrinum (JN624897)
100% Penicillium sp. MS 2011 F40 (HE608805)
Penicillium [100%] P. griseofulvum [68%]
P. citrinum (seção Citrina)
AR146 525 100% Phaeocytostroma sacchari (FR748047)
100% Phaeocytostroma sacchari (CBS275.34)
100% Phaeocytostroma sacchari (FR748047)
Diaporthe [58%] D. aspalathi [33%]
Phaeocytostroma sacchari
26 120 99% Paraphaeosphaeria sp. (GU973660)
100%Paraphaeosphaeria verruculosa CBS35480
100% Paraphaeosphaeria sp. 1 C5 (JN198486)
Paraconiothyrium [63%] P. brasiliense [49%]
Paraphaeosphaeria sp.
147 609 99% Paraphaeosphaeria sp. (GU973660)
100%Paraphaeosphaeria sp. HE584948
100% Paraphaeosphaeria sp. FF 2011 (HE584948)
Paraconiothyrium [64%] P. sporulosum [56%]
Paraphaeosphaeria sp. (michotii)
AR272B 635 99% Peniophora sp. (KJ183198)
98.2% Peniophora versiformis (CBS357.54)
98.2% Peniophora versiformis (CBS357.54)
Entomocorticium [78%] E. dendroctoni [78%]
Peniophora sp.
51 608 99% Peniophora sp. (KJ183198)
98.3% Peniophora versiformis (CBS357.54)
98.3% Peniophora versiformis (CBS357.54)
Entomocorticium [72%] E. dendroctoni [72%]
Peniophora sp.
AR197 699 99% Phialocephala sp. (KF156325)
99.1% Phialocephala sp. C73 (KF156325)
99.1% Phialocephala sp. C73 (KF156325)
Acephala [80%] Acephala sp. [80%]
Phialocephala bamuru
AR221 506 99% Fungal sp. (GU973772)
100% Fungal sp. ASR 221 (GU973772)
100% Fungal sp. ASR 221 (GU973772)
Preussia [17%] Preussia isômera [17%]
Pleosporales
AR272A 498 100% Resinicium saccharicola (DQ826548)
100% Resinicium saccharicola (DQ826548)
100% Resinicium saccharicola (DQ826548)
Resinicium [100%] R. saccharicola [100%]
Resinicium saccharicola
AR163 510 100% Saccharicola sp. (GQ370379)
99.3% Saccharicola sp. 57 SR 2012 (JX416912)
99.3% Saccharicola sp. 57 SR 2012 (JX416912)
Helminthosporium [98%] H. velutinum [59%]
Saccharicola sp. (bicolor)
29 507 100% Saccharicola sp. (GQ370379)
99.3% Saccharicola sp. (JX416912)
100% Saccharicola sp. (GQ370379)
Helminthosporium [100%]H. velutinum[57%]
Saccharicola sp. (bicolor)
99
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
84 510 99% Saccharicola sp. (GQ370379)
99.8% Saccharicola sp. (GQ370379)
99.8% Saccharicola sp. (GQ370379)
Helminthosporium [99%] H. velutinum [54%]
Saccharicola sp. (bicolor)
140 512 99% Saccharicola bicolor (KP117300)
99.8% Saccharicola sp. CBMAI 1030
99.8% Saccharicola sp. CBMAI 1030
Helminthosporium[100%] H. velutinum [68%]
Saccharicola sp. (bicolor)
144 563 99% Uncultured Ascomycota (EU490096)
99.3% Saccharicola sp. 57 SR 2012 (JX416912)
99.3% Saccharicola sp. 57 SR 2012 (JX416912)
Helminthosporium [99%] H. solani [48%]
Saccharicola sp. (bicolor)
152 563 99% Saccharicola sp. (GU973718)
99.8% Saccharicola sp. (GQ370379)
99.6% Saccharicola sp. ASR 163 (GU973718)
Helminthosporium [97%] H. velutinum [52%]
Saccharicola sp. (bicolor)
167 559 100% Saccharicola sp. (GQ370379)
99.8% Saccharicola sp. ASR 163 (GU973718)
99.8% Saccharicola sp. ASR 163 (GU973718)
Helminthosporium [96%] H. velutinum [51%]
Saccharicola sp. (bicolor)
AR266 610 99% Schizophyllum commune (KX034183)
99.8% Schizophyllum communeCNRMA15.398
99.1% Schizophyllum commune (AB369909)
Schizophyllum [100%] S. commune [100%]
Schizophyllum commune
AR257 594 99% Schizophyllum commune (LN714602)
99.1% Schizophyllum commune (CBS579.83)
99.6% Schizophyllum commune (AF280759)
Schizophyllum [100%] S. commune [100%]
Schizophyllum commune
AR179B 462 97% Scytalidium lignicola (GQ272635)
100% Scytalidium sp. (GU973733)
100% Scytalidium sp. (GU973733)
Xylogone [60%] X. ganodermophthora [44%]
Scytalidium sp. (lignicola)
AR33 524 98% Scytalidium sp. (HQ631037)
100% Scytalidium sp. (GQ370375)
100% Scytalidium sp. (GQ370375)
Xylogone [32%] X. ganodermophthora [26%]
Scytalidium sp. (lignicola)
AR261B 534 99% Myrothecium sp. (HQ631058)
99.6% Myrothecium sp. ASR 261 (GU973803)
99.6% Myrothecium sp. ASR 261 (GU973803)
Bionectria [100%] B. epichloe [93%]
Stachybotriaceae
AR210B 589 99% Talaromyces verruculosus (KR012927)
99.8% Talaromyces macrosporus CBS35072
99.8% Talaromyces macrosporus (CBS35072)
Talaromyces [100%] P. aculeatum [91%]
T. angelicus (seção Talaromyces)
AR104 535 99% Uncultured Penicillium (JX545189)
99.8% Uncultured Penicillium (JX545189)
99.8% Uncultured Penicillium (JX545189)
Talaromyces [100%] P. aculeatum [83%]
T. angelicus (seção Talaromyces)
AR27 539 99% Talaromyces pinophilus (NR_103665)
100% Talaromyces sp. (KF183638)
100% Talaromyces sp. (KF183638)
Talaromyces [100%] P. aculeatum [79%]
T. angelicus (seção Talaromyces)
69 587 99% Talaromyces verruculosus HQ608025
99.8% Talaromyces macrosporus CBS35072
99.8% Talaromyces macrosporus CBS35072
Talaromyces [100%] P. aculeatum [89%]
T. angelicus (seção Talaromyces)
AR30 606 99% Uncultured Penicillium (JX545201)
99.8% Uncultured Penicillium (JX545189)
99.8% Uncultured Penicillium (JX545189)
Talaromyces [100%] P. aculeatum [87%]
T. angelicus (seção Talaromyces)
AR264 650 99% Talaromyces trachyspermus (EU076917)
99.8% Talaromyces trachyspermus (CBS118437)
99.8% Talaromyces trachyspermus (CBS118437)
Talaromyces [97%] T. trachyspermus [91%]
T. assiutensis (seç. Trachyspermi)
100
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
135 626 98% Penicillium sp. (DQ123635)
97.5% Penicillium sp. NRRL 35186
97.5% Penicillium sp. NRRL 35186
Penicillium [100%] P. diversum [100%]
T. diversus (seç. Trachyspermi)
AR49 495 100% Penicillium sp. (GU973644)
100% Penicillium sp. EN13 (HQ343437)
100% Penicillium sp. ASR 49 (GU973644)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [57%]
T. flavovirens (seção Talaromyces)
47 584 100% Talaromyces pinophilus (KT216044)
99.0% Penicillium sp. ASR 49 (GU973644)
99.0% Penicillium sp. ASR 49 (GU973644)
Talaromyces [100%] P. aculeatum [29%]
T. flavovirens (seção Talaromyces)
61 469 100% Talaromyces pinophilus (KT216044)
100% Penicillium sp. ASR 49 (GU973644)
100% Penicillium sp. ASR 49 (GU973644)
Talaromyces [100%] T. aculeatus [40%]
T. flavovirens (seção Talaromyces)
62 598 98% Penicillium pinophilum (GU566197)
100% Penicillium sp. EN13 (HQ343437)
99.0% Penicillium sp. ASR 49 (GU973644)
Talaromyces [100%] P. aculeatum [29%]
T. flavovirens (seção Talaromyces)
64 592 98% Talaromyces verruculosus HQ608025
99.0% Penicillium sp. ASR 49 (GU973644)
99.0% Penicillium sp. ASR 49 (GU973644)
Talaromyces [100%] P. aculeatum [24%]
T. flavovirens (seção Talaromyces)
104 537 100% Talaromyces pinophilus (KT216044)
100% Penicillium sp. (HQ343437)
100% Penicillium sp. (HQ339997)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [42%]
T. flavovirens (seção Talaromyces)
AR28 292 100% Talaromyces funiculosus (KM066194)
100% Penicillium funiculosum (JQ717333)
100% Penicillium funiculosum (JQ717348)
Talaromyces [100%] T. ruber [24%]
T. funiculosus (seção Talaromyces)
4 537 100% Talaromyces funiculosus (LT558961)
100% Penicillium funiculosum (CBS43589)
100% Penicillium funiculosum (CBS4389)
Talaromyces[100%] T. macrosporus [54%]
T. funiculosus (seção Talaromyces)
17 506 100% Penicillium guizhouanum (KJ890410)
100% Penicillium guizhouanum (CBS112492)
100% Penicillium guizhouanum (CBS112492)
Talaromyces[100%] T. macrosporus [26%]
T. funiculosus (seção Talaromyces)
141 541 100% Talaromyces funiculosus (LT558961)
100% Penicillium funiculosum CBS435.89
100% Penicillium funiculosum (CBS435.89)
Talaromyces [100%] T. macrosporus [53%]
T. funiculosus (seção Talaromyces)
151 538 99% Penicillium funiculosum (JQ717333)
100% Penicillium funiculosum CBS43589
100% Penicillium funiculosum (CBS434.89)
Talaromyces[100%] T. macrosporus [47%]
T. funiculosus (seção Talaromyces)
189 326 100% Talaromyces funiculosus (KF498862)
100% Penicillium funiculosum (GU396569)
100% Penicillium oxalicum (DTO 108-H7)
Talaromyces [100%] T. ruber [30%]
T. funiculosus (seção Talaromyces)
AR278 455 99% Penicillium sp. (GU973744)
98.8% Penicillium sp. ASR 254 (GU973797)
98.8% Penicillium sp. ASR 254 (GU973797)
Talaromyces [99%] T. minioluteus [97%]
T. minioluteus (seç. Trachyspermi)
183 586 100% Acremonium cellulolyticus (AB474749)
100% Penicillium pinophilum (GU566200)
100% Penicillium pinophilum (GU566200)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [89%]
T. pinophilus (seção Talaromyces)
184 593 100% Penicillium pinophilum (GU566197)
100% Penicillium pinophilum (CBS631.66)
100% Penicillium pinophilum (CBS631.66)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [89%]
T. pinophilus (seção Talaromyces)
101
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
186 593 100% Penicillium pinophilum (AB455516)
100% Penicillium pinophilum (GU566216)
100% Penicillium allahabadense CBS76268
Talaromyces [100%] P. pinophilum [89%]
T. pinophilus (seção Talaromyces)
188A 501 100% Talaromyces pinophilus (LT558963)
100% Talaromyces pinophilus (JX684010)
100% Talaromyces pinophilus (JN198417)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [98%]
T. pinophilus (seção Talaromyces)
AR196 594 100% Penicillium pinophilum (GU566197)
100% Penicillium pinophilum (GU566197)
100% Penicillium pinophilum (CBS631.66)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [90%]
T. pinophilus (seção Talaromyces)
AR258 605 99% Penicillium pinophilum (GU566197)
100% Penicillium pinophilum (GU566200)
100% Penicillium pinophilum (CBS631.66)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [95%]
T. pinophilus (seção Talaromyces)
AR156 471 100% Talaromyces pinophilus (LT558963)
100% Talaromyces pinophilus (AB606412)
100% Talaromyces pinophilus (JN198417)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [75%]
T. pinophilus (seção Talaromyces)
AR192 585 100% Penicillium pinophilum (AB455516)
100% Penicillium pinophilum (GU566202)
100% Penicillium pinophilum (AB455516)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [92%]
T. pinophilus (seção Talaromyces)
11B 548 100% Talaromyces pinophilus (LT558963)
100% Talaromyces pinophilus (GQ370371)
100% Penicillium pinophilum (HM469418)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [93%]
T. pinophilus (seção Talaromyces)
28 542 100% Talaromyces pinophilus (LT558963)
100% Penicillium pinophilum (GU566216)
100% Penicillium pinophilum (AB369480)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [98%]
T. pinophilus (seção Talaromyces)
34 596 100% Penicillium sp. (AB455516)
100% Penicillium pinophilum (GU566202)
100% Penicillium pinophilum (CBS631.66)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [88%]
T. pinophilus (seção Talaromyces)
111 607 100% Penicillium pinophilum (AB455516)
100% Penicillium pinophilum (AB455516)
100% Penicillium pinophilum (AB369480)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [90%]
T. pinophilus (seção Talaromyces)
133B 507 100% Talaromyces pinophilus (LT558963)
100% Penicillium pinophilum (GU566197)
100% Penicillium pinophilum (AB369480)
Talaromyces [100%] P. pinophilum [96%]
T. pinophilus (seção Talaromyces)
AR143 529 100% Talaromyces trachyspermus JF714646
100% Talaromyces trachyspermus JF714646
100% Talaromyces trachyspermus (JF714646)
Talaromyces [100%] T. trachyspermus [100%]
T. trachyspermus (seç. Trachyspermi)
AR159 512 100% Talaromyces trachyspermus JF714646
100% Talaromyces trachyspermus JF714646
100% Talaromyces trachyspermus (JF714646)
Talaromyces[100%] T. trachyspermus [100%]
T. trachyspermus (seç. Trachyspermi)
AR281 754 100% Talaromyces trachyspermus (JF714646)
100% Talaromyces trachyspermus (JF714646)
100% Talaromyces trachyspermus (JF714646)
Talaromyces[100%] T. trachyspermus [100%]
T. trachyspermus (seç. Trachyspermi)
AR267 271 100% Talaromyces sp. (GU143555)
100% Talaromyces sp. ASR 207 (GU973759)
100% Talaromyces sp. ASR 207 (GU973759)
Talaromyces [100%] T. trachyspermus [100%]
T. trachyspermus (seç. Trachyspermi)
52 529 100% Talaromyces trachyspermus
100% Talaromyces trachyspermus
100% Talaromyces trachyspermus (JF714646)
Talaromyces [100%] T. trachyspermus [100%]
T. trachyspermus (seçãoTrachyspermi)
102
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
(JF714646) (JF714646)
AR55 627 99% Talaromyces radicus (EU262660)
100% Eurotiales (KF673568)
100% Eurotiales (KF673579)
Penicillium [100%] P. kloeckeri [96%]
T. wortmannii (seção Islandici)
AR218 766 100% Penicillium sp. (GU973702)
100% Penicillium sp. ASR 217 (GU973768)
100% Penicillium sp. ASR 217 (GU973768)
Talaromyces [100%] T. macrosporus [73%]
Talaromyces sp. (seção Talaromyces)
AR39 533 99% Thielavia terricola (KX431226)
100% Thielavia terricola (JX280875)
100% Thielavia terricola (JX280875)
Acrophialophora [62%] A. fusispora [62%]
Thielavia terricola
AR187 498 100% Thozetella sp. (GU973741)
100% Thozetella sp. ASR 187 (GU973741)
100% Thozetella sp. ASR 187 (GU973741)
Thozetella [100%] T. falcate [100%]
Thozetella sp. (nivea)
AR70 518 100% Trichoderma harzianum (KU933469)
100% Trichoderma harzianum (KC884829)
100% Hypocrea nigricans (HF569187)
Hypocrea [100%] H. lixii [97%]
T. afroharzianum (T. harzianum complex)
AR226 557 100% Trichoderma asperellum (KX092001)
100% Trichoderma asperellum (JN004182)
100% Trichoderma asperellum (JQ040316)
Hypocrea [100%] T. asperelloides [93%]
T. asperelloides (T. asperellum complex)
54 621 100% Hypocrea lixii (EU280079)
100% Hypocrea lixii (AY605722)
100% Hypocrea lixii (EU280079)
Hypocrea [100%] H. lixii [97%]
T. lentiforme (T. harzianum complex)
174 572 100% Trichoderma harzianum (KJ010951)
100% Trichoderma harzianum (JN704349)
100% Trichoderma harzianum (KC478545)
Hypocrea [100%] H. lixii [100%]
T. lentiforme (T. harzianum complex)
AR233A 624 100% Hypocrea virens (EU280073)
100% Hypocrea virens (JQ040393)
100% Hypocrea virens (AF099005)
Hypocrea [100%] H. crassa [100%]
T. virens
AR66 285 100% Trichoderma virens (KU935696)
100% Hypocrea virens (JQ040398)
100% Trichoderma virens (CBS609.95)
Hypocrea [100%] H. crassa [98%]
T. virens
AR223 571 100% Trichoderma virens (KU935696)
100% Hypocrea virens (AF099005)
100% Trichoderma virens (CBS609.95)
Hypocrea [100%] H. crassa [100%]
T. virens
AR125 574 100% Hypocrea virens (HQ608079)
100% Hypocrea virens (JQ040395)
100% Hypocrea virens (JQ040399)
Hypocrea [100%] H. crassa [100%]
T. virens
AR273 311 100% Trichoderma sp. (KU702374)
100% Trichoderma sp. SZMC 20777 (JX173864)
100% Trichoderma koningiopsis (KF060155)
Hypocrea [100%] H. gamsii [21%]
Trichoderma sp. (T. koningii aggregate)
AR41 561 99% Trichoderma koningiopsis (KT951305)
99.8% Trichoderma koningiopsis (KF313115)
99.8% Trichoderma koningiopsis (JQ040369)
Hypocrea [100%] H. koningii [20%]
Trichoderma sp. (T. koningii aggregate)
AR294A 575 99% Xenoacremonium recifei (KM231834)
99.5% Fungal sp. ASR 294 (GU973830)
99.5% Fungal sp. ASR 294 (GU973830)
Microcera [45%] M. larvarum [29%]
Xenoacremonium recifei
103
Linhagem Pares
de bases*
GenBank1 MycoBank1 CBS1 RDP Provável espécie
(análise filogenética)2, 3
AR148 532 99% Cosmospora sp. (JQ922189)
99.43% Acremonium recifei CBS 442.66
99.43% Acremonium recifei CBS 442.66
Cosmospora [38%] C. butyri [15%]
Xenoacremonium sp. (recifei)
164 583 100% Xylaria sp. (JQ341069)
99.8% Xylariaceae Vega190 (EU009987)
99.8% Xylariaceae Vega190 (EU009987)
Xylaria [100%] X. allantoidea [100%]
Xylaria allantoidea
85 596 99% Xylaria apiculata (KP133333)
100% Xylaria sp. (HQ260950)
100% Xylaria sp. (HQ260950)
Xylaria [100%] X. venosula [100%]
Xylaria arbuscula
12 533 99% Xylaria longipes (KU204544)
94.8% Xylaria sp. SUT195 (DQ322164)
95.3% Xylaria sp. TP041010 (AB524023)
Xylaria [80%] X. longipes [67%]
Xylaria sp. (feejeensis)
(1) Os números de acesso do GenBank , MycoBank e CBS são apresentados entre parênteses. A porcentagem representa a identidade das amostras em
relação à sequência da respectiva base de dados. (2)
Espécie definida após análise filogenética com sequências de linhagens tipo (type strain). (3)
Para linhagens classificadas ao nível de gênero, a espécie mais próxima relacionada após análise da filogenia é mostrada entre parênteses. Para os gêneros Aspergillus, Fusarium, Talaromyces e Trichoderma a seção taxonômica da qual a linhagem faz parte é mostrada entre parênteses.
(*) Tamanho da sequência
consenso de ITS rDNA utilizado para a análise.
104
Anexo C - Tabela 5: Determinação da capacidade de 409 fungos endofíticos de cana-de-açúcar em hidrolisar os polissacarídeos carboximetilcelulose (CMC), xilana, pectina, amido e Avicel em meio de cultura sólido.
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Aspergillus alabamensis (seç. Terrei) AR287B 2,16c ±0,01 1,91h ±0,10 1,99h ±0,02 1,00h ±0,00 16,06f ±0,96
Aspergillus brasiliensis (seç. Nigri) AR136 1,50f ±0,28 1,60i ±0,11 1,59j ±0,08 1,00h ±0,00 36,97c ±1,58
Aspergillus brasiliensis (seç. Nigri) 170 1,00h ±0,00 1,48i ±0,02 1,67j ±0,06 1,00h ±0,00 21,39f ±0,61
Aspergillus brasiliensis (seç. Nigri) AR236B 1,00h ±0,00 1,56i ±0,04 1,98h ±0,21 1,51f ±0,06 41,85d ±5,66
Aspergillus flavus (seç. Flavi) 169 1,53f ±0,06 1,47i ±0,20 1,64j ±0,14 1,00h ±0,00 23,08f ±0,49
Aspergillus flavus (seç. Flavi) 153 1,00h ±0,00 2,02h ±0,03 1,51j ±0,08 1,19g ±0,19 85,00a ±0,00
Aspergillus flavus (seç. Flavi) AR21 1,00h ±0,00 2,08h ±0,35 2,09g ±0,21 1,62e ±0,03 34,39e ±2,64
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) 11A 2,08d ±0,18 1,27j ±0,12 1,76i ±0,05 1,00h ±0,00 14,11f ±0,59
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) 16B 2,00d ±0,41 1,00k ±0,00 1,80i ±0,01 1,00h ±0,00 28,74e ±6,95
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) 192 1,85e ±0,06 1,64i ±0,10 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 34,16e ±7,59
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) AR249 1,81e ±0,11 1,00k ±0,00 1,69i ±0,10 - - 24,21f ±1,55
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) 122 1,75e ±0,08 1,00k ±0,00 1,50j ±0,07 1,00h ±0,00 28,61e ±6,94
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) AR131 1,67f ±0,11 1,64i ±0,03 1,56j ±0,05 1,00h ±0,00 26,03e ±1,58
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) AR214 1,59f ±0,03 1,00k ±0,00 1,76i ±0,11 1,00h ±0,00 23,34f ±2,47
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) 128 1,56f ±0,08 - - 1,52j ±0,10 1,00h ±0,00 24,28f ±1,89
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) AR261A 1,43g ±0,08 1,00k ±0,00 1,80i ±0,17 1,00h ±0,00 53,50c ±3,02
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) 200 1,00h ±0,00 1,76i ±0,13 1,77i ±0,10 1,00h ±0,00 85,00a ±0,00
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) AR137 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,39k ±0,19 1,00h ±0,00 20,44f ±1,46
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) AR213 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 2,31f ±0,09 1,00h ±0,00 23,18f ±0,56
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) AR252A 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,57j ±0,07 1,00h ±0,00 36,80c ±0,78
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) AR252B 1,00h ±0,00 1,65i ±0,09 1,00m ±0,00 1,41f ±0,06 33,53e ±3,09
105
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) AR279 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,68i ±0,03 1,00h ±0,00 24,11f ±3,27
Aspergillus fumigatus (seç. Fumigati) AR301 - - 2,65g ±0,19 2,08g ±0,08 1,00h ±0,00 - -
Aspergillus hortai (seç. Terrei) AR293 2,28c ±0,18 2,39g ±0,41 1,83i ±0,06 1,49f ±0,12 23,15f ±1,40
Aspergillus hortai (seç. Terrei) AR274 1,70f ±0,15 2,12h ±0,08 2,07g ±0,21 1,51f ±0,08 39,02d ±4,86
Aspergillus hortai (seç. Terrei) AR208 1,56f ±0,06 2,06h ±0,17 1,64j ±0,21 1,00h ±0,00 20,90f ±1,68
Aspergillus hortai (seç. Terrei) AR220 1,00h ±0,00 1,81h ±0,00 1,68i ±0,10 1,00h ±0,00 21,85f ±2,36
Aspergillus parasiticus (seç. Flavi) 95 1,43g ±0,04 1,43j ±0,02 1,00m ±0,00 1,61e ±0,17 66,01b ±19,00
Aspergillus parasiticus (seç. Flavi) 43 1,00h ±0,00 1,68i ±0,12 1,32k ±0,13 1,39f ±0,07 18,15f ±0,28
Aspergillus parasiticus (seç. Flavi) 96A 1,00h ±0,00 1,52i ±0,05 1,29l ±0,03 1,58f ±0,08 29,14e ±2,39
Aspergillus parasiticus (seç. Flavi) 107 1,00f ±0,00 1,92h ±0,08 1,37k ±0,13 1,85d ±0,13 27,07e ±0,52
Aspergillus pseudoterreus (seç. Terrei) AR234 1,78e ±0,10 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 47,45c ±1,10
Aspergillus pseudoterreus (seç. Terrei) AR255 1,44g ±0,07 1,50i ±0,03 2,00h ±0,04 1,00h ±0,00 40,00d ±5,44
Aspergillus sp. (seç. Terrei) AR219 1,95e ±0,18 2,09h ±0,12 1,63j ±0,02 1,55f ±0,08 28,01e ±0,03
Aspergillus sp. (seç. Terrei) AR127 1,59f ±0,07 1,76i ±0,09 1,66j ±0,07 1,00h ±0,00 85,00a ±0,00
Aspergillus sp. (seç. Terrei) AR135 1,38g ±0,07 1,00k ±0,00 1,55j ±0,04 - - 25,92e ±3,00
Aspergillus sp. (seç. Terrei) AR199 1,30g ±0,04 1,89h ±0,07 1,92h ±0,03 - - 26,57e ±6,85
Aspergillus sp. (seç. Terrei) 10 2,16c ±0,03 2,64g ±0,11 1,80i ±0,08 1,84d ±0,08 27,99e ±0,01
Aspergillus sp. (seç. Terrei) AR242 2,04d ±0,17 1,79h ±0,04 1,55j ±0,11 1,48f ±0,04 31,66e ±1,86
Aspergillus sp. (seç. Terrei) AR142 1,76e ±0,12 1,77i ±0,17 1,68i ±0,02 1,71e ±0,20 27,32e ±0,81
Aspergillus sp. (seç. Terrei) AR245 1,68f ±0,07 2,20g ±0,11 1,84i ±0,19 1,40f ±0,11 19,88f ±1,67
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR285A 2,66b ±0,14 2,95f ±0,18 2,96e ±0,18 1,00h ±0,00 14,07f ±1,73
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR25 2,38c ±0,10 2,35g ±0,16 1,95h ±0,06 1,54f ±0,11 29,73e ±1,12
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR285B 2,38c ±0,12 1,91h ±0,11 2,22g ±0,07 1,85d ±0,07 32,05e ±0,25
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 178 2,26c ±0,05 1,85h ±0,12 1,71i ±0,05 1,75e ±0,07 35,40d ±1,03
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR118 2,10d ±0,13 2,02h ±0,06 1,71i ±0,06 1,58f ±0,02 33,36e ±1,00
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 98 2,09d ±0,23 1,81h ±0,14 1,65j ±0,02 1,65e ±0,05 33,21e ±4,72
106
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 22 2,08d ±0,16 2,43g ±0,14 2,02h ±0,02 1,49f ±0,08 33,91e ±0,66
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 48 2,07d ±0,09 1,86h ±0,10 2,09g ±0,11 2,12c ±0,11 35,95d ±1,18
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 45 2,05d ±0,12 1,96h ±0,04 2,02h ±0,19 1,74e ±0,10 32,09d ±0,29
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 60 2,03d ±0,18 1,94h ±0,01 1,75i ±0,19 1,00h ±0,00 28,21e ±0,72
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 65 2,00d ±0,06 1,79h ±0,06 1,75i ±0,00 1,51f ±0,04 29,15e ±3,97
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR136A 1,98d ±0,07 1,89h ±0,08 2,10g ±0,03 1,67e ±0,02 32,67e ±0,41
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR195 1,95e ±0,14 2,20g ±0,12 1,97h ±0,12 1,99d ±0,03 36,74d ±2,49
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 126B 1,92e ±0,01 1,51i ±0,04 1,42k ±0,04 1,38f ±0,03 41,74d ±0,87
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR186 1,89e ±0,05 1,91h ±0,14 1,63j ±0,09 1,61e ±0,07 42,49d ±10,27
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR58 1,87e ±0,15 1,94h ±0,07 1,63j ±0,08 1,50f ±0,03 27,06e ±0,91
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 126-A 1,83e ±0,21 1,39j ±0,04 1,43k ±0,03 1,39f ±0,07 42,86d ±2,46
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR198 1,82e ±0,08 2,00h ±0,04 2,25g ±0,07 1,90d ±0,11 23,72f ±0,41
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 30 1,69f ±0,09 2,20g ±0,06 1,91h ±0,03 1,84d ±0,30 28,60e ±1,30
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 114 1,63f ±0,08 1,92h ±0,05 1,81i ±0,07 2,01d ±0,08 25,31f ±1,69
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR162B 1,63f ±0,09 1,26j ±0,43 1,85i ±0,08 1,48f ±0,04 29,85e ±0,00
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR246 1,63f ±0,03 1,89h ±0,07 2,04h ±0,12 1,30g ±0,08 19,51f ±0,16
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR254 1,52f ±0,03 1,84h ±0,25 1,96h ±0,03 1,00h ±0,00 20,01f ±2,86
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR147 1,50f ±0,05 1,70i ±0,14 1,90h ±0,06 1,00h ±0,00 22,33f ±1,04
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 67 1,45g ±0,14 1,52i ±0,14 1,73i ±0,03 1,00h ±0,00 23,55f ±0,30
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 73 1,38g ±0,05 1,61i ±0,14 1,96h ±0,12 1,00h ±0,00 28,19e ±1,11
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 53 1,00h ±0,00 1,43j ±0,08 1,56j ±0,10 1,00h ±0,00 16,96f ±0,79
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 70 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,82i ±0,12 1,00h ±0,00 20,28f ±1,39
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 99 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,73i ±0,01 1,00h ±0,00 14,41f ±0,28
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR174 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,92h ±0,04 1,00h ±0,00 15,44f ±0,49
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR177A 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,62j ±0,06 1,00h ±0,00 48,25c ±12,30
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR188 1,00h ±0,00 1,75i ±0,22 1,99h ±0,03 1,00h ±0,00 23,44f ±2,64
107
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR224 1,00h ±0,00 1,42j ±0,14 1,86h ±0,14 1,00h ±0,00 18,21f ±1,03
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR236A 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,56j ±0,06 1,00h ±0,00 25,15f ±0,18
Aspergillus terreus (seç. Terrei) AR250 1,00h ±0,00 1,64i ±0,00 1,80i ±0,06 1,18g ±0,09 21,09f ±0,17
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 55 - - - - - - - - - -
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 78 - - - - - - - - - -
Aspergillus terreus (seç. Terrei) 180 - - 1,59i ±0,02 - - - - - -
Aspergillus tubingensis (seç. Nigri) 93 - - 1,42j ±0,01 1,63j ±0,09 1,00h ±0,00 15,11f ±0,03
Basidiomycota 21 2,36c ±0,06 2,71f ±0,02 2,38f ±0,07 1,88d ±0,04 31,39e ±4,90
Beauveria bassiana AR240 1,47g ±0,19 1,34j ±0,05 1,16l ±0,07 1,00h ±0,00 45,00c ±2,50
Beauveria bassiana 16-A 1,00h ±0,00 - - 1,83i ±0,14 1,00h ±0,00 19,83f ±0,11
Beauveria bassiana 88 1,00h ±0,00 2,32g ±0,11 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 13,75f ±3,75
Beauveria bassiana 91 1,00h ±0,00 2,12h ±0,12 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 11,25f ±1,25
Beauveria bassiana 138 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,86h ±0,16 1,00h ±0,00 24,01f ±6,75
Beauveria bassiana 154 1,00h ±0,00 2,55g ±0,13 2,50f ±0,10 1,00h ±0,00 76,25a ±8,75
Beauveria bassiana 155 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,24l ±0,04 1,00h ±0,00 14,00f ±0,00
Beauveria bassiana AR69 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,65j ±0,07 1,00h ±0,00 19,72f ±0,43
Bipolaris gossypina 156 1,45g ±0,03 2,12h ±0,04 1,89h ±0,11 1,00h ±0,00 27,83e ±0,16
Bipolaris gossypina 165 1,22g ±0,13 1,87h ±0,21 1,26l ±0,01 1,56f ±0,12 - -
Chaetomium grande AR305B 1,91e ±0,01 2,53g ±0,08 1,54j ±0,14 1,84d ±0,11 11,91f ±0,41
Chaetomium grande AR305A 1,62f ±0,02 1,61i ±0,04 1,46k ±0,03 1,30g ±0,10 63,79b ±0,74
Clonostachys lucifer AR51 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 23,20f ±0,05
Clonostachys rosea AR151 1,38g ±0,04 1,01k ±0,01 1,31k ±0,06 1,32g ±0,05 32,12e ±1,37
Diaporthe lusitanicae 105 - - 3,40e ±0,18 1,58j ±0,00 - - 19,25f ±1,75
Diaporthe phaseolorum 80 2,11d ±0,26 2,20g ±0,01 1,76i ±0,12 1,51f ±0,04 23,48f ±0,31
Diaporthe phoenicicola 74 2,65b ±0,10 2,26g ±0,17 2,17g ±0,06 1,00h ±0,00 27,80e ±0,71
Diaporthe siamensis 108 2,19h ±0,08 1,73i ±0,05 1,92h ±0,12 1,00h ±0,00 30,15e ±1,87
108
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Diaporthe sp. (helianthi) 40 2,65b ±0,27 2,29g ±0,19 1,76i ±0,05 1,00h ±0,00 69,04a ±0,04
Diaporthe sp. (helianthi) 81 2,35c ±0,13 1,95h ±0,14 1,42k ±0,08 1,00h ±0,00 55,45c ±0,17
Diaporthe sp. (helianthi) 127 2,21c ±0,18 1,00k ±0,00 1,37k ±0,05 1,00h ±0,00 41,11d ±2,85
Diaporthe sp. (helianthi) 38 1,91e ±0,11 1,68i ±0,03 1,64j ±0,09 1,00h ±0,00 64,28b ±3,24
Dokmaia monthadangii AR227 1,00h ±0,00 1,51i ±0,10 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 21,70f ±0,90
Epicoccum nigrum AR179A 1,66f ±0,05 1,81h ±0,07 1,56j ±0,07 1,00h ±0,00 34,07e ±3,70
Epicoccum nigrum AR79 1,00h ±0,00 1,28j ±0,05 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 23,25f ±3,25
Epicoccum sorghinum 101 2,95a ±0,51 2,50g ±0,06 1,06m ±0,06 2,21c ±0,11 32,75e ±0,25
Epicoccum sorghinum 148 1,49f ±0,09 1,88h ±0,08 1,82i ±0,33 1,72e ±0,09 33,01e ±2,18
Epicoccum sorghinum 172 - - - - - - - - - -
Eutypella citricola AR211 1,00h ±0,00 2,05h ±0,10 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 53,58c ±4,28
Exophiala spinifera AR153 - - - - - - - - - -
Exserohilum rostratum 3 1,61f ±0,08 1,59i ±0,04 1,63j ±0,05 1,00h ±0,00 85,00a ±0,00
Fusarium begoniae (F. fujikuroi com.) 119 1,83e ±0,04 1,46i ±0,05 1,33k ±0,02 1,32g ±0,06 46,75c ±0,38
Fusarium brachygibbosum AR32 3,07a ±0,07 4,13c ±0,30 3,20e ±0,13 1,00h ±0,00 - -
Fusarium brachygibbosum 158 2,84a ±0,13 1,78h ±0,09 1,83i ±0,08 1,56f ±0,10 29,89e ±0,01
Fusarium brachygibbosum AR172 2,12d ±0,08 2,49g ±0,01 2,01h ±0,06 2,13c ±0,14 - -
Fusarium brachygibbosum AR286 2,02d ±0,05 2,39g ±0,07 2,47f ±0,09 1,78e ±0,12 - -
Fusarium brachygibbosum 66 1,95e ±0,03 1,91h ±0,07 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 85,00a ±0,00
Fusarium brachygibbosum AR164 1,95e ±0,09 1,70i ±0,05 1,68i ±0,04 1,32g ±0,05 27,69e ±0,79
Fusarium brachygibbosum AR48A 1,83e ±0,07 1,47i ±0,06 1,53j ±0,07 1,00h ±0,00 62,68b ±1,14
Fusarium brachygibbosum AR288 1,83e ±0,17 2,11h ±0,28 2,24g ±0,21 1,00h ±0,00 - -
Fusarium brachygibbosum AR48B 1,78e ±0,05 1,35j ±0,05 1,48k ±0,02 1,14h ±0,07 67,11b ±0,23
Fusarium brachygibbosum 63 1,77e ±0,04 2,25g ±0,03 1,82i ±0,09 1,00h ±0,00 53,96c ±31,04
Fusarium brachygibbosum AR157 1,77e ±0,02 2,00h ±0,05 1,86i ±0,10 1,00h ±0,00 - -
Fusarium brachygibbosum 56 1,73e ±0,18 2,31g ±0,07 1,36k ±0,06 1,95d ±0,23 32,06e ±2,28
109
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Fusarium brachygibbosum AR161 1,73e ±0,07 1,46i ±0,05 1,89h ±0,02 1,35g ±0,02 30,82e ±0,25
Fusarium brachygibbosum 182 1,67f ±0,05 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,36g ±0,08 15,50f ±0,50
Fusarium brachygibbosum 19 1,65f ±0,07 1,83h ±0,01 1,47k ±0,09 1,00h ±0,00 20,17f ±1,28
Fusarium brachygibbosum AR206B 1,64f ±0,15 1,67i ±0,07 1,00m ±0,00 1,44f ±0,04 61,80b ±2,46
Fusarium brachygibbosum AR45 1,62f ±0,13 1,59i ±0,11 1,47k ±0,03 1,00h ±0,00 21,65f ±2,48
Fusarium brachygibbosum AR206A 1,62f ±0,06 1,29j ±0,04 1,37k ±0,05 1,00h ±0,00 59,75b ±5,43
Fusarium brachygibbosum 97 1,61f ±0,03 1,78h ±0,04 1,36k ±0,11 1,52f ±0,10 19,75f ±0,25
Fusarium brachygibbosum 32 1,60f ±0,04 1,95h ±0,02 1,59j ±0,11 1,00h ±0,00 50,95c ±1,68
Fusarium brachygibbosum 134 1,59f ±0,09 1,97h ±0,03 1,27l ±0,00 1,00h ±0,00 19,50f ±0,50
Fusarium brachygibbosum 179 1,59f ±0,10 1,63i ±0,05 1,75i ±0,07 1,00h ±0,00 21,29f ±2,88
Fusarium brachygibbosum AR38 1,59f ±0,29 2,09h ±0,14 2,49f ±0,09 1,56f ±0,06 - -
Fusarium brachygibbosum 42 1,57f ±0,03 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 21,75f ±0,25
Fusarium brachygibbosum 59 1,57f ±0,09 1,82h ±0,02 1,00m ±0,00 1,77e ±0,12 17,25f ±1,25
Fusarium brachygibbosum 68 1,55f ±0,07 1,59i ±0,08 1,20l ±0,02 1,68e ±0,10 20,50f ±1,50
Fusarium brachygibbosum AR138 1,54f ±0,04 2,59g ±0,00 1,52j ±0,10 1,00h ±0,00 - -
Fusarium brachygibbosum 36 1,53f ±0,03 1,00k ±0,00 - - 1,22g ±0,03 17,00f ±0,50
Fusarium brachygibbosum 72 1,50f ±0,00 1,00k ±0,00 1,19l ±0,02 1,00h ±0,00 21,75f ±0,25
Fusarium brachygibbosum 75 1,46g ±0,04 1,87h ±0,02 1,90h ±0,01 1,00h ±0,00 26,97e ±3,32
Fusarium brachygibbosum 190 1,41g ±0,08 1,75i ±0,10 1,00m ±0,00 1,18g ±0,09 19,50f ±1,50
Fusarium brachygibbosum 25 1,40g ±0,00 1,93h ±0,04 1,00m ±0,00 1,34g ±0,10 75,00a ±15,00
Fusarium brachygibbosum 125 1,40g ±0,07 1,47i ±0,03 2,09g ±0,10 1,00h ±0,00 20,53f ±0,62
Fusarium brachygibbosum AR175 1,40g ±0,03 1,57i ±0,05 1,92h ±0,16 1,34g ±0,18 20,36f ±4,01
Fusarium brachygibbosum 117 1,37g ±0,07 2,30g ±0,06 1,33k ±0,00 1,00h ±0,00 15,00f ±0,00
Fusarium brachygibbosum AR92 1,25g ±0,03 1,69i ±0,05 1,89h ±0,06 1,00h ±0,00 31,34e ±8,59
Fusarium brachygibbosum AR83 1,19g ±0,19 1,65i ±0,03 1,22l ±0,05 1,27g ±0,15 17,25f ±2,75
Fusarium brachygibbosum 50 1,00h ±0,00 1,40j ±0,08 1,66j ±0,05 1,00h ±0,00 26,07e ±3,03
110
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Fusarium brachygibbosum 277 1,00h ±0,00 1,77i ±0,11 1,81i ±0,13 1,43f ±0,04 28,68e ±1,25
Fusarium brachygibbosum AR36 1,00h ±0,00 1,58i ±0,08 2,33f ±0,21 - - - -
Fusarium brachygibbosum AR183 1,00h ±0,00 2,92f ±0,08 2,23g ±0,07 1,82d ±0,09 - -
Fusarium brachygibbosum AR209 1,00h ±0,00 2,21g ±0,24 1,63j ±0,03 1,00h ±0,00 - -
Fusarium brachygibbosum AR215 1,00h ±0,00 1,96h ±0,04 - - 1,00h ±0,00 - -
Fusarium brachygibbosum AR222 1,00h ±0,00 2,08h ±0,05 2,63f ±0,19 1,00h ±0,00 - -
Fusarium brachygibbosum AR231 1,00h ±0,00 1,49i ±0,01 1,92h ±0,04 - - - -
Fusarium brachygibbosum AR238 1,00h ±0,00 1,98h ±0,07 1,88h ±0,05 1,00h ±0,00 - -
Fusarium brachygibbosum AR268 1,00h ±0,00 1,95h ±0,10 2,20g ±0,07 2,00d ±0,00 - -
Fusarium brachygibbosum AR270 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,63j ±0,09 1,30g ±0,00 - -
Fusarium brachygibbosum AR283 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 2,08g ±0,05 1,00h ±0,00 - -
Fusarium brachygibbosum AR289 1,00h ±0,00 3,19e ±0,36 2,24g ±0,21 - - - -
Fusarium brachygibbosum AR296 1,00h ±0,00 1,67i ±0,11 2,24g ±0,12 1,76e ±0,00 - -
Fusarium brachygibbosum AR299 1,00h ±0,00 1,98h ±0,07 2,17g ±0,07 1,79e ±0,05 - -
Fusarium brachygibbosum AR302 1,00h ±0,00 1,61i ±0,07 2,38f ±0,07 1,00h ±0,00 - -
Fusarium brachygibbosum AR304 1,00h ±0,00 1,81h ±0,21 1,78i ±0,18 1,77e ±0,15 61,39b ±0,81
Fusarium brachygibbosum AR13 - - 2,23g ±0,24 1,74i ±0,04 1,00h ±0,00 11,50f ±0,00
Fusarium brachygibbosum AR141 - - 2,17g ±0,09 1,21l ±0,15 1,00h ±0,00 20,00f ±0,00
Fusarium brachygibbosum AR217 - - 1,46i ±0,07 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 14,00f ±0,00
Fusarium brachygibbosum AR275 - - 4,00d ±0,00 - - - - - -
Fusarium brachygibbosum AR284 - - 1,00k ±0,00 1,67j ±0,00 - - - -
Fusarium dlaminii (F. fujikuroi com.) AR86 1,56f ±0,09 1,40j ±0,02 1,00m ±0,00 1,21g ±0,02 85,00a ±0,00
Fusarium dlaminii (F. fujikuroi com.) AR169 2,10d ±0,15 1,38j ±0,03 1,25l ±0,00 1,38f ±0,02 36,75d ±0,75
Fusarium dlaminii (F. fujikuroi com.) AR82 1,73e ±0,03 1,34j ±0,10 1,30k ±0,02 1,36f ±0,06 40,00d ±2,50
Fusarium dlaminii (F. fujikuroi com.) AR243 1,31g ±0,04 1,46i ±0,07 1,00m ±0,00 1,23g ±0,03 36,25d ±1,25
Fusarium lactis (F. fujikuroi com.) 31 1,42g ±0,04 1,47i ±0,06 1,28l ±0,02 1,00h ±0,00 64,58b ±0,07
111
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR105 1,55f ±0,20 1,48i ±0,03 1,00m ±0,00 1,28g ±0,04 48,50c ±2,50
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR18 1,52f ±0,05 1,68i ±0,20 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 - -
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) 76 1,00h ±0,00 1,64i ±0,10 1,25l ±0,00 1,00h ±0,00 12,75f ±1,25
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR29 - - 1,15k ±0,12 1,21l ±0,17 1,00h ±0,00 - -
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) 9 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 85,00a ±5,00
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR100 2,07d ±0,14 1,77i ±0,15 1,04m ±0,01 1,61e ±0,04 - -
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR167A 1,96e ±0,05 1,19j ±0,03 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 50,06c ±0,26
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR177B 1,76e ±0,04 1,15k ±0,03 1,00m ±0,00 1,16g ±0,01 46,31c ±2,13
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR167B 1,74e ±0,06 1,23j ±0,04 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 47,78c ±1,36
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR150 1,73e ±0,11 2,40g ±0,12 1,00m ±0,00 1,38f ±0,11 - -
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR99 1,71e ±0,11 1,23j ±0,02 - - - - - -
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR98 1,70f ±0,13 1,78h ±0,11 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 - -
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR102 1,68f ±0,06 1,56i ±0,00 1,00m ±0,00 1,57f ±0,07 50,00c ±0,00
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR93 1,66f ±0,12 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 51,84c ±1,13
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR171 1,66f ±0,13 1,38j ±0,05 1,44k ±0,06 1,54f ±0,04 41,86d ±0,09
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR87 1,62f ±0,06 1,68i ±0,12 1,14l ±0,04 1,31g ±0,18 48,75c ±1,25
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR80 1,44g ±0,06 1,39j ±0,06 1,14l ±0,00 1,28g ±0,08 50,00c ±0,00
Fusarium oxysporum (F. oxysporum com.) AR168 1,00h ±0,00 1,46i ±0,06 1,15l ±0,02 1,22g ±0,02 50,00c ±0,00
Fusarium sacchari (F. fujikuroi com.) 176 1,93e ±0,11 1,53i ±0,06 1,00m ±0,00 1,44f ±0,04 42,72d ±2,25
Fusarium sacchari (F. fujikuroi com.) 175 1,86e ±0,07 1,57i ±0,07 1,45k ±0,03 1,29g ±0,00 45,61c ±0,51
Fusarium sacchari (F. fujikuroi com.) 27 1,98d ±0,11 1,65i ±0,05 1,15l ±0,02 1,36f ±0,06 49,74c ±18,46
Fusarium sacchari (F. fujikuroi com.) 118 1,55f ±0,03 1,62i ±0,03 1,29k ±0,07 1,40f ±0,06 59,89b ±1,16
Fusarium sacchari (F. fujikuroi com.) 7 1,38g ±0,03 1,69i ±0,12 1,13l ±0,04 1,00h ±0,00 33,75e ±0,75
Fusarium sacchari (F. fujikuroi com.) 18 1,61f ±0,06 1,43j ±0,08 1,32k ±0,06 1,35g ±0,10 65,30b ±0,17
Fusarium solani (F. solani com.) 103 1,56f ±0,05 1,84h ±0,02 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 47,00c ±0,76
Fusarium solani (F. solani com.) AR308 1,42g ±0,10 1,85h ±0,10 1,65j ±0,05 1,54f ±0,13 54,04c ±1,12
112
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Fusarium sp. (F. oxysporum com.) 106 1,50f ±0,09 1,63i ±0,07 1,30k ±0,05 1,31g ±0,08 31,50e ±0,00
Fusarium sp. (F. fujikuroi com.) 160 1,93e ±0,05 1,50i ±0,06 1,46k ±0,05 1,40f ±0,02 45,08c ±5,07
Fusarium sp. (F. fujikuroi com.) 162 1,78e ±0,04 1,36j ±0,04 1,67j ±0,05 1,35g ±0,01 58,79b ±0,66
Fusarium sp. (F. fujikuroi com.) 143 1,58f ±0,04 1,42j ±0,04 1,40k ±0,02 1,00h ±0,00 46,83c ±0,24
Fusarium sp. (F. fujikuroi com.) AR126 1,48g ±0,07 1,61i ±0,08 1,90h ±0,06 1,31g ±0,02 33,49e ±0,60
Fusarium sp. (F. fujikuroi com.) 113 2,05d ±0,13 1,42j ±0,07 1,26l ±0,03 1,40f ±0,03 58,08b ±0,52
Fusarium sp. (F. fujikuroi com.) 20 1,92e ±0,41 1,60i ±0,08 1,00m ±0,00 1,33g ±0,03 58,22b ±1,96
Fusarium sp. (F. fujikuroi com.) 102 1,72e ±0,08 1,35j ±0,07 1,98h ±0,03 1,00h ±0,00 41,53d ±0,08
Fusarium sp. (F. fujikuroi com.) 115 1,72e ±0,00 1,46i ±0,05 1,14l ±0,01 1,37f ±0,06 34,50e ±1,00
Mariannaea sp. AR280 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,33k ±0,04 1,04h ±0,04 - -
Mariannaea sp. AR22 1,00h ±0,00 1,42j ±0,06 1,43k ±0,02 1,00h ±0,00 21,90f ±0,10
Myrmecridium schulzeri AR306B - - - - - - - - - -
Neurospora calospora 146 1,83e ±0,18 1,80h ±0,08 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 85,00a ±0,00
Omnidenptus affinis 94 3,15a ±0,12 2,45g ±0,15 1,86h ±0,14 - - 14,84f ±0,00
Paraphaeosphaeria sp. 26 2,35c ±0,14 1,97h ±0,04 1,00m ±0,00 1,35g ±0,18 18,75f ±1,25
Paraphaeosphaeria sp. (michotii) 147 1,35g ±0,02 2,01h ±0,15 2,38f ±0,10 1,00h ±0,00 22,17f ±1,52
Penicillium citrinum (seç. Citrina) AR122 1,54f ±0,05 1,51i ±0,04 1,69i ±0,06 1,00h ±0,00 21,25f ±0,92
Penicillium citrinum (seç. Citrina) 150 1,24g ±0,06 1,55i ±0,05 2,25g ±0,13 1,62e ±0,11 17,98f ±1,74
Peniophora sp. AR272B 2,24c ±0,09 2,72f ±0,12 3,09e ±0,23 1,56f ±0,06 - -
Peniophora sp. 51 - - - - - - - - - -
Phaeocytostroma sacchari AR146 - - 2,06h ±0,56 - - - - - -
Phialocephala bamuru AR197 - - 3,82d ±0,55 1,58j ±0,03 1,00h ±0,00 10,50f ±0,50
Pleosporales AR221 1,00h ±0,00 3,09e ±0,24 1,43k ±0,03 1,00h ±0,00 - -
Resinicium saccharicola AR272A 1,00h ±0,00 2,45g ±0,05 2,31f ±0,21 1,44f ±0,08 15,40f ±0,05
Saccharicola sp. (bicolor) 144 2,01d ±0,08 2,24g ±0,13 1,92h ±0,06 1,49f ±0,06 24,17f ±0,22
Saccharicola sp. (bicolor) 140 1,75e ±0,08 2,31g ±0,10 1,53j ±0,27 - - 33,57e ±1,19
113
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Saccharicola sp. (bicolor) 84 1,72e ±0,07 1,75i ±0,07 1,91h ±0,12 1,00h ±0,00 38,47d ±2,44
Saccharicola sp. (bicolor) 152 1,70f ±0,02 2,39g ±0,15 1,96h ±0,03 1,00h ±0,00 41,36d ±2,30
Saccharicola sp. (bicolor) 167 1,65f ±0,03 1,92h ±0,12 1,44k ±0,04 1,67e ±0,09 36,06d ±0,46
Saccharicola sp. (bicolor) 29 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,32k ±0,14 1,00h ±0,00 17,25f ±0,25
Saccharicola sp. (bicolor) AR163 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 14,63f ±2,43
Schizophyllum commune AR266 2,26c ±0,14 2,02h ±0,13 2,04h ±0,14 1,00h ±0,00 36,71d ±0,30
Schizophyllum commune AR257 - - 4,97b ±0,13 5,00a ±0,00 - - - -
Scytalidium sp. (lignicola) AR179B 1,00h ±0,00 2,11h ±0,08 2,07g ±0,01 1,00h ±0,00 15,12f ±0,55
Scytalidium sp. (lignicola) AR33 - - 3,05e ±0,28 1,41k ±0,01 - - 10,50f ±2,00
Stachybotriaceae AR261B 1,51f ±0,01 1,58i ±0,06 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 23,80f ±1,36
Talaromyces angelicus (seç. Talaromyces) AR210B 1,82e ±0,08 1,85h ±0,05 1,85i ±0,06 1,28g ±0,14 17,17f ±0,17
Talaromyces angelicus (seç. Talaromyces) AR30 1,69f ±0,07 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 23,35f ±1,71
Talaromyces angelicus (seç. Talaromyces) AR104 1,00h ±0,00 2,04h ±0,37 1,17l ±0,03 1,67e ±0,33 14,00f ±0,00
Talaromyces angelicus (seç. Talaromyces) 69 - - 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 - - 19,95f ±0,07
Talaromyces angelicus (seç. Talaromyces) AR27 - - 2,28g ±0,16 1,15l ±0,00 1,00h ±0,00 15,50f ±1,00
Talaromyces assiutensis (seç. Trachyspermi) AR264 - - 4,20c ±0,75 4,47b ±0,29 - - - -
Talaromyces diversus (seç. Trachyspermi) 135 2,06d ±0,13 1,57i ±0,16 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 18,68f ±1,79
Talaromyces funiculosus (seç. Talaromyces) 17 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,26l ±0,04 1,00h ±0,00 16,00f ±1,00
Talaromyces funiculosus (seç. Talaromyces) AR28 2,01d ±0,15 1,86h ±0,11 1,42k ±0,08 1,00h ±0,00 83,28a ±1,73
Talaromyces funiculosus (seç. Talaromyces) 141 1,52f ±0,02 1,00k ±0,00 1,18l ±0,00 1,00h ±0,00 16,25f ±0,25
Talaromyces funiculosus (seç. Talaromyces) 4 1,00h ±0,00 1,65i ±0,09 2,00h ±0,03 1,00h ±0,00 15,02f ±1,22
Talaromyces funiculosus (seç. Talaromyces) 151 1,00h ±0,00 1,54i ±0,02 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 17,45f ±0,45
Talaromyces funiculosus (seç. Talaromyces) 189 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 10,00f ±0,00
Talaromyces minioluteus (seç. Trachyspermi) AR278 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 2,00h ±0,00 1,00h ±0,00 - -
Talaromyces pinophilus (seç. Talaromyces) 186 2,57b ±0,35 1,62i ±0,10 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 85,00a ±0,00
Talaromyces pinophilus (seç. Talaromyces) 34 2,39c ±0,10 2,25g ±0,04 1,69i ±0,15 1,85d ±0,04 60,60b ±24,40
114
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Talaromyces pinophilus (seç. Talaromyces) 11B 2,08d ±0,18 1,42j ±0,15 1,87h ±0,05 1,00h ±0,00 32,35e ±2,04
Talaromyces pinophilus (seç. Talaromyces) AR156 2,03d ±0,02 2,70f ±0,19 1,99h ±0,09 2,21c ±0,25 23,83f ±1,05
Talaromyces pinophilus (seç. Talaromyces) 184 1,92e ±0,14 2,08h ±0,28 2,00h ±0,10 2,00d ±0,16 28,05e ±3,48
Talaromyces pinophilus (seç. Talaromyces) 28 1,91e ±0,11 1,98h ±0,05 1,93h ±0,09 1,54f ±0,09 85,00a ±0,00
Talaromyces pinophilus (seç. Talaromyces) 111 1,77e ±0,05 1,98h ±0,04 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 85,00a ±0,00
Talaromyces pinophilus (seç. Talaromyces) AR196 1,65f ±0,20 2,08h ±0,20 1,38k ±0,08 1,39f ±0,22 45,77c ±0,53
Talaromyces pinophilus (seç. Talaromyces) 188A 1,60f ±0,10 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 2,24c ±0,15 39,39d ±1,81
Talaromyces pinophilus (seç. Talaromyces) 183 1,50f ±0,13 2,18g ±0,06 1,64j ±0,11 1,63e ±0,02 85,00a ±0,00
Talaromyces pinophilus (seç. Talaromyces) 133B 1,49g ±0,04 1,85h ±0,03 1,79i ±0,03 1,40f ±0,06 13,95f ±4,32
Talaromyces pinophilus (seç. Talaromyces) AR258 1,45g ±0,10 1,69i ±0,01 2,00h ±0,08 1,00h ±0,00 21,16f ±2,43
Talaromyces pinophilus (seç. Talaromyces) AR192 - - 4,87b ±0,09 3,09c ±0,20 2,83a ±0,23 - -
Talaromyces rubicundus (seç. Talaromyces) 61 1,60f ±0,16 1,32j ±0,03 1,40k ±0,03 1,00h ±0,00 13,25f ±0,56
Talaromyces rubicundus (seç. Talaromyces) 47 1,32g ±0,03 1,93h ±0,26 1,44k ±0,04 1,20g ±0,10 22,32f ±0,85
Talaromyces rubicundus (seç. Talaromyces) 104 1,17h ±0,12 1,97h ±0,10 1,47k ±0,02 1,28g ±0,18 16,27f ±2,09
Talaromyces rubicundus (seç. Talaromyces) 64 1,00h ±0,00 1,51i ±0,04 1,48k ±0,09 1,35g ±0,09 18,15f ±0,93
Talaromyces rubicundus (seç. Talaromyces) 62 - - 1,53i ±0,03 1,47k ±0,01 1,00h ±0,00 15,08f ±0,55
Talaromyces rubicundus (seç. Talaromyces) AR49 - - 2,24g ±0,16 1,17l ±0,03 1,53f ±0,01 15,75f ±0,25
Talaromyces sp. (seç. Talaromyces) AR218 1,72e ±0,06 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 15,20f ±0,42
Talaromyces trachyspermus (seç. Trachyspermi) AR281 1,98d ±0,06 1,96h ±0,10 2,04h ±0,08 2,06c ±0,09 14,63f ±0,74
Talaromyces trachyspermus (seç. Trachyspermi) 52 - - 2,03h ±0,15 1,69i ±0,13 - - 11,07f ±1,22
Talaromyces trachyspermus (seç. Trachyspermi) AR143 - - 2,80f ±0,12 1,37k ±0,14 - - - -
Talaromyces trachyspermus (seç. Trachyspermi) AR159 - - 2,07h ±0,05 2,47f ±0,20 1,56f ±0,08 12,29f ±0,53
Talaromyces trachyspermus (seç. Trachyspermi) AR267 - - 1,00k ±0,00 3,48d ±0,43 - - - -
Talaromyces wortmannii (seç. Islandici) AR55 2,18c ±0,02 1,38j ±0,16 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 20,82f ±1,61
Thielavia terricola AR39 2,08d ±0,06 1,97h ±0,05 1,51j ±0,06 1,00h ±0,00 33,23e ±0,85
Thozetella sp. (nivea) AR187 - - 4,33c ±0,18 3,93c ±0,18 - - - -
115
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Trichoderma afroharzianum (T. harzianum com.) AR70 1,20g ±0,03 1,77i ±0,09 1,19l ±0,03 1,00h ±0,00 79,65a ±0,36
Trichoderma asperelloides (T. asperellum com.) AR226 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,31k ±0,10 1,00h ±0,00 85,00a ±0,00
Trichoderma lentiforme (T. harzianum com.) 174 1,39g ±0,04 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 43,00d ±0,00
Trichoderma lentiforme (T. harzianum com.) 54 1,36g ±0,05 1,01k ±0,01 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 85,00a ±0,00
Trichoderma sp. (T. koningii aggregate) AR41 1,00h ±0,00 1,10k ±0,07 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 - -
Trichoderma sp. (T. koningii aggregate) AR273 1,00h ±0,00 1,27j ±0,03 1,21l ±0,09 1,00h ±0,00 - -
Trichoderma virens AR66 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,27l ±0,03 1,00h ±0,00 85,00a ±0,00
Trichoderma virens AR125 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,16l ±0,11 1,00h ±0,00 85,00a ±0,00
Trichoderma virens AR223 1,00h ±0,00 1,01k ±0,01 1,61j ±0,12 1,00h ±0,00 19,80f ±1,86
Trichoderma virens AR233A 1,00h ±0,00 1,55i ±0,14 2,18g ±0,29 1,00h ±0,00 14,60f ±1,20
Xenoacremonium recifei AR294A 1,00h ±0,00 1,62i ±0,09 1,73i ±0,05 1,00h ±0,00 21,85f ±0,16
Xenoacremonium sp. (recifei) AR148 - - 1,67i ±0,14 1,45k ±0,02 1,22g ±0,01 12,00f ±0,50
Xylaria allantoidea 164 1,61f ±0,06 1,87h ±0,13 - - 1,00h ±0,00 22,12f ±1,34
Xylaria arbuscula 85 - - 2,52g ±0,20 2,88e ±0,17 2,57b ±0,23 19,21f ±1,06
Xylaria sp. (feejeensis) 12 2,02d ±0,01 1,62i ±0,06 1,56j ±0,03 1,61e ±0,11 24,95f ±0,47
Não identificado AR185 1,18h ±0,10 1,90h ±0,05 1,91h ±0,10 1,00h ±0,00 23,54f ±2,37
Não identificado 92 1,00h ±0,00 3,82d ±0,24 2,00h ±0,24 1,73e ±0,23 - -
Não identificado 120 2,57b ±0,20 1,80h ±0,12 1,77j ±0,11 - - 47,51c ±2,93
Não identificado AR107A 2,54b ±0,08 2,32g ±0,13 2,41f ±0,16 1,64e ±0,04 18,60f ±2,17
Não identificado 86 2,31c ±0,12 2,26g ±0,10 1,58j ±0,22 1,00h ±0,00 19,84f ±1,94
Não identificado AR107B 2,30c ±0,08 2,24g ±0,12 2,41f ±0,12 1,49f ±0,04 20,21f ±0,42
Não identificado 8 2,25c ±0,23 2,02h ±0,15 1,69i ±0,04 1,48f ±0,05 21,14f ±0,18
Não identificado 130 2,25c ±0,32 2,57g ±0,06 3,66d ±0,20 1,00h ±0,00 14,77f ±3,04
Não identificado 149 2,22c ±0,37 1,98h ±0,12 1,13l ±0,06 1,00h ±0,00 23,50f ±0,50
Não identificado AR158 2,16c ±0,12 1,79h ±0,02 1,54j ±0,06 1,00h ±0,00 32,18e ±0,15
Não identificado AR176 2,01d ±0,08 1,45i ±0,05 1,12l ±0,05 1,27g ±0,06 - -
116
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Não identificado AR181 1,99d ±0,06 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 13,69f ±0,18
Não identificado 159 1,98d ±0,05 1,76i ±0,10 1,76i ±0,16 1,00h ±0,00 31,38e ±0,96
Não identificado AR101 1,98d ±0,16 1,75i ±0,06 1,80i ±0,13 1,74e ±0,10 58,75b ±1,25
Não identificado AR210A 1,98d ±0,15 1,99h ±0,06 1,77i ±0,16 1,00h ±0,00 14,86f ±1,90
Não identificado 132 1,93e ±0,12 1,42j ±0,13 1,16l ±0,01 1,24g ±0,05 33,00e ±0,00
Não identificado AR184 1,91e ±0,08 1,50i ±0,04 1,47k ±0,03 1,42f ±0,03 52,31c ±0,06
Não identificado AR160 1,90e ±0,03 1,67i ±0,00 1,66j ±0,08 1,00h ±0,00 32,93e ±13,58
Não identificado AR144 1,89e ±0,13 2,68f ±0,15 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 23,94f ±0,00
Não identificado AR290B 1,88e ±0,14 1,00k ±0,00 1,81i ±0,13 1,45f ±0,02 60,77b ±24,24
Não identificado AR308B 1,88e ±0,15 3,30e ±0,01 1,75i ±0,31 1,00h ±0,00 - -
Não identificado AR120 1,85e ±0,22 2,43g ±0,16 1,00m ±0,00 1,47f ±0,07 26,32e ±1,45
Não identificado AR77 1,84e ±0,19 1,64i ±0,18 1,49k ±0,02 1,00h ±0,00 68,48b ±16,52
Não identificado AR103 1,81e ±0,41 2,88f ±0,18 1,31k ±0,01 2,10c ±0,12 44,75c ±1,25
Não identificado 14 1,80e ±0,02 1,54i ±0,05 1,37k ±0,04 1,00h ±0,00 52,00c ±1,84
Não identificado 1 1,79e ±0,03 2,09h ±0,09 1,00m ±0,00 1,32g ±0,14 27,35e ±6,75
Não identificado AR128 1,77e ±0,21 1,55i ±0,03 1,62j ±0,09 1,00h ±0,00 26,39e ±0,74
Não identificado AR14 1,76e ±0,10 2,07h ±0,08 1,73i ±0,05 1,53f ±0,08 21,72f ±8,27
Não identificado 5 1,75e ±0,04 1,49i ±0,05 1,32k ±0,02 1,25g ±0,02 62,50b ±3,95
Não identificado 173 1,72e ±0,25 1,61i ±0,09 1,83i ±0,08 1,56f ±0,10 55,43c ±1,80
Não identificado 137 1,71f ±0,10 1,85h ±0,00 1,00m ±0,00 1,77e ±0,00 25,90e ±2,58
Não identificado 15 1,70f ±0,11 1,13k ±0,49 1,12l ±0,01 1,00h ±0,00 21,25f ±0,25
Não identificado AR40 1,70f ±0,03 1,69i ±0,07 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 41,33d ±1,90
Não identificado AR212 1,70f ±0,00 2,12h ±0,04 1,78i ±0,05 1,86d ±0,09 - -
Não identificado 82 1,68f ±0,03 1,56i ±0,04 1,61j ±0,07 1,41f ±0,06 26,28e ±0,48
Não identificado AR67 1,64f ±0,22 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 - - 24,34f ±1,62
Não identificado AR26 1,63f ±0,20 1,67i ±0,01 1,00m ±0,00 1,28g ±0,14 34,39e ±3,43
117
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Não identificado AR248A 1,62f ±0,34 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 15,68f ±1,80
Não identificado 33 1,60f ±0,11 2,07h ±0,13 1,99h ±0,38 1,00h ±0,00 20,51f ±3,87
Não identificado AR43 1,59f ±0,05 2,02h ±0,05 1,65j ±0,03 1,57f ±0,08 42,01d ±10,71
Não identificado AR94 1,59f ±0,11 1,33j ±0,06 1,32k ±0,02 1,00h ±0,00 49,55c ±2,96
Não identificado AR133 1,59f ±0,09 1,00k ±0,00 1,06m ±0,06 1,00h ±0,00 15,71f ±1,14
Não identificado 131 1,58f ±0,31 2,01h ±0,08 1,76i ±0,15 1,00h ±0,00 27,17e ±0,02
Não identificado AR239 1,58f ±0,01 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 45,62c ±0,57
Não identificado 24 1,57f ±0,07 1,00k ±0,00 1,62j ±0,01 1,00h ±0,00 21,81f ±0,14
Não identificado AR95 1,56f ±0,13 2,64g ±0,04 1,53j ±0,07 1,00h ±0,00 - -
Não identificado AR204 1,56f ±0,23 1,62i ±0,07 1,15l ±0,01 1,28g ±0,08 52,50c ±0,00
Não identificado AR277 1,56f ±0,13 1,69i ±0,20 1,25l ±0,04 1,32g ±0,10 28,61e ±4,99
Não identificado 187A 1,55f ±0,02 1,81h ±0,10 1,76i ±0,11 1,46f ±0,07 32,11e ±2,38
Não identificado AR50 1,55f ±0,02 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,63e ±0,04 59,23b ±0,73
Não identificado 133A 1,54f ±0,04 1,00k ±0,00 1,65j ±0,02 1,00h ±0,00 27,82e ±3,02
Não identificado 163 1,54f ±0,09 1,83h ±0,12 1,61j ±0,05 1,00h ±0,00 36,52d ±0,27
Não identificado 112 1,52f ±0,05 1,78h ±0,05 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 38,24c ±3,36
Não identificado AR155 1,50f ±0,00 5,30a ±1,06 1,17l ±0,17 2,00d ±0,00 11,75f ±1,25
Não identificado 71 1,48g ±0,02 1,74i ±0,07 1,54j ±0,04 1,00h ±0,00 31,14e ±1,61
Não identificado AR259 1,47g ±0,05 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,68e ±0,11 85,00a ±0,00
Não identificado 58 1,46g ±0,09 1,84h ±0,00 1,86i ±0,13 1,28g ±0,04 23,10f ±0,60
Não identificado 23 1,45g ±0,07 1,00k ±0,00 1,37k ±0,06 1,00h ±0,00 68,08b ±2,14
Não identificado AR74 1,45g ±0,04 1,00k ±0,00 1,46k ±0,07 1,00h ±0,00 29,64e ±0,61
Não identificado AR88 1,43g ±0,05 1,46i ±0,05 1,16l ±0,01 1,24g ±0,10 30,00e ±0,00
Não identificado 44 1,41g ±0,01 1,77i ±0,22 1,33k ±0,08 1,00h ±0,00 58,09b ±2,00
Não identificado AR42 1,41g ±0,04 1,91h ±0,16 1,77i ±0,10 1,43f ±0,04 31,83e ±0,92
Não identificado AR182 1,40g ±0,06 1,55i ±0,07 1,47k ±0,02 1,30g ±0,05 43,77d ±0,85
118
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Não identificado 35 1,39g ±0,06 1,58i ±0,05 1,51j ±0,23 1,00h ±0,00 34,80e ±0,80
Não identificado AR61 1,36g ±0,06 1,34j ±0,04 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 59,56b ±1,16
Não identificado AR31 1,35g ±0,06 1,95h ±0,25 1,45k ±0,07 1,25g ±0,05 28,82e ±1,42
Não identificado 96B 1,33g ±0,02 1,66i ±0,06 1,81i ±0,04 1,00h ±0,00 32,70e ±5,24
Não identificado AR20 1,33g ±0,04 1,95h ±0,03 1,32k ±0,06 1,72e ±0,01 22,30f ±0,80
Não identificado AR52 1,32g ±0,05 1,51i ±0,08 1,75i ±0,12 1,00h ±0,00 34,26e ±1,88
Não identificado 79 1,31g ±0,06 2,36g ±0,04 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 13,00f ±1,00
Não identificado 90 1,31g ±0,00 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,03h ±0,03 85,00a ±0,00
Não identificado AR65 1,27g ±0,03 1,00k ±0,00 1,24l ±0,02 1,00h ±0,00 85,00a ±0,00
Não identificado 13 1,26g ±0,13 1,66i ±0,05 1,48k ±0,04 1,47f ±0,05 31,96e ±0,98
Não identificado AR207 1,25g ±0,13 2,51g ±0,27 1,21l ±0,08 1,81d ±0,06 20,00f ±0,00
Não identificado AR53 1,24g ±0,03 1,81h ±0,12 1,73i ±0,07 1,26g ±0,28 33,24e ±2,80
Não identificado 157 1,19g ±0,19 3,34e ±0,20 1,51j ±0,21 1,00h ±0,00 25,68f ±2,80
Não identificado AR6 1,15h ±0,24 2,37g ±0,12 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 54,01c ±0,10
Não identificado 2 1,00h ±0,00 2,21g ±0,20 1,81i ±0,03 1,44f ±0,07 28,95e ±0,21
Não identificado 37 1,00h ±0,02 1,73i ±0,10 1,29k ±0,03 1,38f ±0,06 35,31d ±14,52
Não identificado 39 1,00h ±0,00 2,01h ±0,02 1,48k ±0,04 1,33g ±0,03 16,91f ±1,93
Não identificado 46 1,00h ±0,00 1,34j ±0,15 1,61j ±0,03 1,00h ±0,00 85,00a ±0,00
Não identificado 49 1,00h ±0,00 1,90h ±0,06 1,53j ±0,06 1,74e ±0,07 44,07c ±9,13
Não identificado 57 1,00h ±0,00 1,94h ±0,07 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 40,77d ±0,57
Não identificado 89 1,00h ±0,00 2,07h ±0,11 1,63j ±0,11 1,00h ±0,00 33,45e ±6,10
Não identificado 109 1,00h ±0,00 1,26j ±0,02 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 80,00a ±0,00
Não identificado 124 1,00h ±0,00 1,65i ±0,04 1,60j ±0,10 1,00h ±0,00 26,72e ±3,35
Não identificado 129 1,00h ±0,00 1,97h ±0,02 1,20l ±0,02 1,59e ±0,09 54,21c ±2,30
Não identificado 136 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,42k ±0,01 1,48f ±0,29 24,50f ±2,00
Não identificado 142 1,00h ±0,00 1,89h ±0,08 1,62j ±0,07 1,00h ±0,00 47,84c 1±9,67
119
Identificação taxonômica Linhagem Índice enzimático
(1) Crescimento em Avicel
(2)
CMC Xilana Pectina Amido Avicel
Não identificado AR4 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,55j ±0,04 1,00h ±0,00 19,25f ±0,18
Não identificado AR17 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,31k ±0,05 1,00h ±0,00 11,39f ±2,81
Não identificado AR37 1,00h ±0,00 1,61i ±0,04 1,37k ±0,04 1,00h ±0,00 30,21e ±1,20
Não identificado AR46 1,00h ±0,00 1,98h ±0,28 1,16l ±0,03 1,00h ±0,00 8,60f ±7,40
Não identificado AR47 1,00h ±0,00 2,03h ±0,10 1,81i ±0,07 1,00h ±0,00 26,53e ±2,04
Não identificado AR85 1,00h ±0,00 1,43j ±0,04 1,93h ±0,07 1,00h ±0,00 - -
Não identificado AR112 1,00h ±0,00 2,55g ±0,21 1,18l ±0,03 1,76e ±0,12 17,50f ±1,50
Não identificado AR117 1,00h ±0,00 1,85h ±0,04 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 21,64f ±0,47
Não identificado AR173 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,65j ±0,09 1,00h ±0,00 31,28e ±3,99
Não identificado AR190 1,00h ±0,00 2,79f ±0,06 1,48k ±0,06 1,00h ±0,00 - -
Não identificado AR225 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 61,85b ±1,88
Não identificado AR235 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,75i ±0,04 - - 24,69f ±1,44
Não identificado AR287A 1,00h ±0,00 1,00k ±0,00 1,88h ±0,14 1,46f ±0,04 19,60f ±1,61
Não identificado AR290A 1,00h ±0,00 1,66i ±0,06 1,53j ±0,06 1,54f ±0,05 29,34e ±0,72
Não identificado AR294B 1,00h ±0,00 1,63i ±0,07 1,56j ±0,03 1,00h ±0,00 14,91f ±0,58
Não identificado AR309 1,00h ±0,00 1,56i ±0,12 - - - - - -
Não identificado 83 - - 1,81h ±0,10 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 25,15f ±0,35
Não identificado 171 - - - - 2,00h ±0,00 - - - -
Não identificado 194 - - 1,00k ±0,00 1,00m ±0,00 - - 16,06f ±1,11
Não identificado AR5 - - - - - - - - - -
Não identificado AR12 - - 2,02h ±0,08 2,14g ±0,32 - - - -
Não identificado AR248B - - 1,61i ±0,08 1,00m ±0,00 1,00h ±0,00 18,87f ±0,41
Não identificado AR265 - - 1,95h ±0,05 3,04e ±0,15 2,79a ±0,00 - -
Não identificado AR303B - - 2,08h ±0,07 2,30f ±0,20 - - 18,61f ±2,05
(1)Índice enzimático: razão entre o diâmetro do halo e o diâmetro da colônia. Valores ˃1 indicam secreção de enzimas no meio de cultura resultando em uma
zona de degradação visível ao redor da colônia. (2)
Crescimento (mm/dia). Em cada substrato está em negrito as 20 melhores linhagens pelo teste de Scott-
120
Knott. Médias seguidas da mesma letra não diferem pelo teste de Scott-Knott (alfa=0,05). (-) Ausência de crescimento. Para cada substrato são apresentadas a média e o (±) erro padrão. CMC (endoglicanases). Xilana (xilanase). Pectina - em pH 5,0 (poligalacturonase). Amido (amilase). Avicel - celulose microcristalina (celulases). Todas as linhagens foram crescidas a 25 °C por 4 dias.