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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

CAMPUS ARARAQUARA

“CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM

TRYPANOSOMA CRUZI”

DANIELA LUZ AMBRÓSIO

Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação

em Análises Clínicas para obtenção do título de mestre em

Análises Clínicas, área de concentração Biologia Molecular

ORIENTADORA: Profa. Dra. Regina Maria Barretto Cicarelli

ARARAQUARA

2005

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Este trabalho foi desenvolvido no laboratório de Imunologia e Biologia

Molecular do Departamento de Ciências Biológicas, pertencente à Faculdade de

Ciências Farmacêuticas – UNESP – Araraquara, com apoio da CAPES

(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), através da

concessão de uma bolsa de mestrado e auxílio à pesquisa FAPESP (proc.

04/01630-9) e FUNDUNESP (proc. 850/03).

A Deus que sempre está ao meu lado, iluminando meu caminho.

Aos meus pais Cíntia e Hamilton

e às minhas queridas irmãs Rafaela e Marcela

pelo amor, incentivo e compreensão que me ajudaram a chegar até aqui.

AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS

Em especial ao Marco Túlio, pelo carinho, companhia, paciência e incentivo, além do auxílio

nos experimentos e nas análises em bioinformática.

A Profa. Regina Cicarelli que possibilitou e incentivou meu crescimento científico,

profissional e pessoal, e pela amizade.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão de

bolsa de estudo.

Às funcionárias da pós-graduação, Cláudia, Sônia e Laura pelos serviços prestados e pela

atenção.

Às minhas queridas amigas Aline, Mirela, Tatiane e Maria Helena e aos amigos Júlio e

Nicholas que sempre estiveram ao meu lado em todos os momentos.

Às estagiárias Joyce e Gabriela que sempre estiveram prontas a ajudar, principalmente nas

reações de sequenciamento.

A todos do Laboratório de Imunologia e de Parasitologia pelo apoio técnico e pessoal.

Enfim, a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a execução deste trabalho,

meu muito obrigada!

“Não fiquem maravilhados diante do novo, nem assustados pelo que ontem vos

era desconhecido. Não recuem diante do mistério, mas procurem enfrentá-lo e

desvendá-lo... Não se considerem os únicos donos da verdade e do conhecimento,

pois um diploma não faz o cientista. Somente assim poderão cumprir sua missão,

ser úteis ao próximo... E façam tudo com amor, pois será um dia esplêndido

aquele em que dos progressos da ciência, participará também o coração”

(Pasteur)

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi - Introdução_______________ 1

1. INTRODUÇÃO

A tripanosomíase americana, esquizotripanose ou doença de Chagas,

descoberta e descrita por Carlos Chagas em 1909 é uma zoonose causada pelo

hemoflagelado denominado Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi e transmitida pelo

inseto triatomíneo (hemíptero hematófago da família Reduviidae). Esse protozoário

pertence ao subfilo Mastigophora, ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e

gênero Trypanosoma (Chagas 1909; Schmuñis 2000; Lana & Tafuri 2000; Rey

2001).

1.1. EPIDEMIOLOGIA

Segundo a OMS, existem entre 16 e 18 milhões de pessoas infectadas nas

Américas, desde o México, ao norte, até Argentina e Chile, ao sul, com 100 milhões

consideradas sob risco de contrair a doença de Chagas (Schmuñis 2000; Lana &

Tafuri 2000). Hoje, as estimativas da prevalência da infecção estão sendo

progressivamente revisadas para logo acima de 11 milhões. Muito desse sucesso na

diminuição da prevalência dessa doença se deve às iniciativas regionais em larga

escala para conter o nascimento dos vetores, o rastreamento de doadores de

sangue, detecção e tratamento de casos congênitos (Dias et al. 2002).

1.2. MORFOLOGIA

O T. cruzi apresenta principalmente as formas epimastigota, tripomastigota e

amastigota (Figura 1). A forma epimastigota caracteriza-se por ser alongada, com

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 2

cinetoplasto justanuclear e anterior ao núcleo e flagelo livre na porção anterior

(Figura 1A); essa é a forma de replicação no hospedeiro invertebrado (triatomíneo)

que se encontra na porção posterior do intestino e em cultura em meio líquido

(Chagas 1909; Lana & Tafuri 2000; Rey 2001).

A forma tripomastigota é alongada, com cinetoplasto posterior ao núcleo,

próximo da extremidade posterior, com flagelo que se estende por toda célula e

torna-se livre na porção anterior (Figura 1B). Nessa forma, observa-se um nítido

polimorfismo, podendo ser descritos dois tipos morfológicos polares, formas finas e

formas largas, que resultam em diferenças na evolução parasitológica, na patologia

e na resposta do parasitismo a diferentes substâncias. A forma tripomastigota é

encontrada na circulação sanguínea do hospedeiro vertebrado, podendo estar

presente também nos espaços intersticiais, no líquido cefaloraquidiano, leite,

esperma e em cultura de células. Os tripomastigotas metacíclicos são

morfologicamente semelhantes às formas tripomastigotas, sendo as formas

infectantes liberadas nas fezes do vetor (Chagas 1909; Lana & Tafuri 2000; Rey

2001).

A forma amastigota é arredondada ou ovalada, com um flagelo curto que não

se exterioriza (Figura 1C). É a forma de replicação no hospedeiro vertebrado,

presente no interior de vários tipos de células, mas predominantemente nas fibras

musculares estriadas e lisas e no sistema fagocítico mononuclear e em cultura de

células (Chagas 1909; Lana & Tafuri 2000; Rey 2001).


Figura 1: Morfologia do Trypanosoma cruzi: A) forma epimastigota, B) forma

tripomastigota e C) forma amastigota.

Fonte: A) http://www.uta.edu/chagas/html/biolTcru.html e http://www.ciens.ula.ve/~biolprot/protozoo/tcformas.htm; B)

http://www.uta.edu/chagas/html/biolTcru.html e http://www2.nau.Edu/~fpm/research/res.html; C) http://www.uta.edu/chagas/

html/biolTcru.html e http://www.ucm.es/info/parasito/aTLAS.htm - acesso em 08/01/05.

A

B

C

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 4

1.3. CICLO BIOLÓGICO E TRANSMISSÃO

A Figura 2 representa o ciclo biológico da Doença de Chagas. Há

multiplicação de formas epimastigotas no intestino posterior do vetor (A). Na ampola

retal, os parasitas diferenciam-se em tripomastigotas metacíclicos (B) que são

eliminados com as fezes (C). Ao penetrar no hospedeiro vertebrado, os flagelados

invadem células do sistema fagocítico mononuclear cutâneo (D) onde, sob a forma

amastigota, voltam a multiplicar-se e aí passam para o sangue, como

tripomastigotas (E). Os parasitas disseminam-se pelo organismo atacando músculos

e outros tecidos (F). O ciclo fecha-se quando o paciente é picado por outro

triatomíneo (G) e as formas sanguíneas chegam ao intestino do vetor (H) (Rey

2001).

Figura 2: Ciclo biológico do Trypanosoma cruzi.

Fonte: http://www.who.int/tdr/diseases/ chagas/lifecycle.htm – acesso em 08/01/05

A

B

C

D

E

F

G

H


Existem 3 ciclos de transmissão vetorial, doméstico, silvestre e peridoméstico.

O ciclo de maior importância epidemiológica é o doméstico, já que perpetua a

infecção em seres humanos. Nesse ciclo, o vetor cresce e multiplica-se em fendas

nas paredes, buracos no telhado, debaixo e atrás de móveis, quadros e outros

pontos das residências com paredes de barro ou tijolo crú e telhados de palha ou

junco (Chagas 1909; Dias 2000).

Os principais mecanismos de transmissão são pelo contato de fezes e urina

de triatomíneos contaminados (principais gêneros são Rhodnius, Triatoma e

Panstrongylus), transfusões sanguíneas e transmissão congênita (Chagas 1909;

Lana & Tafuri 2000).

1.4. A DOENÇA DE CHAGAS

A doença de Chagas apresenta duas fases, aguda e crônica, podendo ser

sintomática (aparente) ou assintomática (inaparente), sendo esta a mais freqüente,

90-98% dos pacientes. A fase aguda inicia-se através de manifestações locais,

quando o T. cruzi penetra na conjuntiva (sinal de Romaña) ou na pele (chagoma de

inoculação), aparecendo dentro de 4 a 10 dias após a picada do triatomíneo,

regredindo em 1 ou 2 meses. A fase crônica pode ser assintomática, em 50-69% dos

pacientes, ou sintomática, podendo apresentar uma forma cardíaca (13%), digestiva

(10%) ou formas mistas (8%) (Chagas 1909; Lana & Tafuri 2000; Brener 2000).

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 6

1.5. DIAGNÓSTICO CLÍNICO E LABORATORIAL

O diagnóstico da infecção pelo T. cruzi deve ser apoiado pela epidemiologia e

pela clínica e confirmado, quanto à etiologia, pelo diagnóstico laboratorial.

Elementos importantes para a suspeita da etiologia chagásica são a região de

procedência do paciente ou o fato de ter vivido ou pernoitado em casas onde havia

triatomíneos, além de levar em conta o fato do paciente ter recebido transfusões

sanguíneas, mesmo fora das áreas endêmicas. A presença dos sinais de porta de

entrada (sinal de Romaña e/ou chagoma de inoculação), acompanhados de febre

irregular ou ausente, adenopatia-satélite ou generalizada, hepatoesplenomegalia,

taquicardia, edema generalizado ou dos pés fazem suspeitar da fase aguda da

doença. As alterações cardíacas acompanhadas de sinais de insuficiência cardíaca

confirmada pelo eletrocardiograma e as alterações digestivas e do esôfago e do

cólon (reveladas por raios X) fazem suspeitar da fase crônica (Lana & Tafuri 2000;

Brener 2000; Rey 2001).

Os métodos de diagnóstico laboratorial apresentam diferentes resultados se

aplicados na fase aguda ou crônica da infecção. Na fase aguda, observa-se alta

parasitemia, presença de anticorpos inespecíficos e início de formação de anticorpos

específicos (IgM e IgG) que podem atingir níveis elevados. Nessa fase recomenda-

se a pesquisa direta do parasita (a fresco, micro-hematócrito, gota espessa, etc) e,

se necessário, pesquisa indireta (xenodiagnóstico, hemocultura, PCR, etc) (Lana &

Tafuri 2000; Luquetti & Rassi 2000; Rey 2001).

Na fase crônica observam-se baixíssima parasitemia e presença de

anticorpos específicos (IgG). Assim, recomendam-se métodos sorológicos (IFI,

ELISA, HAI) ou a pesquisa do parasita por métodos indiretos (xenodiagnóstico,


hemocultura, PCR, etc), que são necessários em caso de sorologia duvidosa ou

quando se deseja verificar a eficácia do tratamento (Lana & Tafuri 2000; Luquetti &

Rassi 2000; Rey 2001).

1.6. TERAPÊUTICA

A terapêutica da Doença de Chagas continua parcialmente ineficaz, apesar

dos esforços que vêm sendo desenvolvidos por vários laboratórios e pesquisadores.

Diversas substâncias vêm sendo testadas em animais e, algumas delas têm sido

usadas no homem, mas nenhuma consegue suprimir a infecção pelo T. cruzi e

promover uma cura definitiva em todos os pacientes tratados (Lana & Tafuri 2000).

No momento, somente dois medicamentos estão disponíveis para o

tratamento da doença, o benznidazol (Rochagan - grupo dos nitroimidazóis) e o

nifurtimox (Lampit - grupo dos nitrofuranos), que não resultam na cura definitiva.

No Brasil, o nifurtimox foi retirado do mercado devido a seus efeitos colaterais,

sendo o benznidazol a única alternativa para o tratamento. A eficiência desses

fármacos varia com a linhagem do parasita, possuem efeitos colaterais e devem ser

utilizados com cautela e acompanhamento criterioso (Lana & Tafuri 2000; Rey

2001).

1.7. BIOLOGIA MOLECULAR DO T. cruzi

1.7.1. O GENOMA DE T. cruzi

Como ocorre nos eucariotos, o T. cruzi possui dois genomas distintos,

situados em dois compartimentos celulares bem definidos: o núcleo e a mitocôndria.

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 8

Nos tripanosomatídeos, a mitocôndria alberga uma complexa rede de moléculas

circulares de DNA denominada de kDNA. O conteúdo total de DNA (DNA nuclear +

kDNA) do T. cruzi varia intensamente entre as diferentes cepas e clones, existindo

inclusive variações entre clones derivados de uma mesma cepa (Franco da Silveira

2000).

O tamanho do genoma do T. cruzi (100-200 X 106 pb) é relativamente

superior ao tamanho dos genomas de outros protozoários parasitas, como por

exemplo, Leishmania (33,6 X 106 pb – http://www.sanger.ac.uk/Projects/L_major,

2003) ou T. brucei (35 X 106 pb - http://www.sanger.ac.uk/Projects/T_brucei, 2004).

Porém, sua complexidade é significativamente inferior à do genoma humano (3.000

X 106 pb) (Franco da Silveira 2000).

A organização da cromatina dos tripanosomas difere em vários aspectos

daquela encontrada nos eucariotos complexos e mesmo em outros protistas. Os

cromossomos dos tripanosomas não se condensam durante a divisão celular e a

segregação dos cromossomos para as células-filhas, durante a divisão celular,

ocorre intranuclearmente, sem a dissolução da carioteca ou membrana nuclear

(endomitose). A divisão celular nos tripanosomas ocorre através do mecanismo

mitótico (Solari 1995).

O cariótipo do T. cruzi parece ser estável nas diferentes formas evolutivas do

parasita. Existe o consenso de que o cariótipo das formas epimastigotas seja

representativo das demais formas evolutivas do parasita. Apesar disso, existem

relatos de alterações na localização dos genes que codificam o RNA da sequência

líder durante o cultivo prolongado do parasita (Wagner & So 1990). Tem sido

relatada a existência de intenso polimorfismo cromossômico entre cepas e clones de

T. cruzi (Henriksson et al. 1996).


O genoma nuclear do T. cruzi, tal como ocorre em outros eucariotos, é

composto por sequências de DNA que podem ser agrupadas em 3 classes

majoritárias: a) sequências que codificam proteínas, b) sequências que codificam

RNAs e c) sequências repetitivas (DNA repetitivo), as quais, de maneira geral, não

são transcritas. Deve-se também levar em conta a presença de sequências

espaçadoras existentes entre genes codificadores de proteína ou RNA que podem

conter elementos reguladores da transcrição (promotores, ativadores etc) (Franco da

Silveira 2000).

As seqüências repetitivas representam cerca de 44% do genoma nuclear e

podem aparecer agrupadas ou dispersas no genoma. Embora a maioria das

sequências repetitivas não sejam codificadoras, alguns genes de proteínas ou RNAs

contribuem para a formação da fração repetitiva do genoma como, por exemplo, o

RNA da sequência líder que possui mais de 200 cópias dispersas no genoma

(Franco da Silveira 2000).

Muitas seqüências repetitivas estão organizadas em tandem (micro e mini-

satélites, os genes de rRNAs, RNA da sequência líder, tubulina etc), isto é, as

repetições aparecem dispostas uma após a outra de maneira regular e periódica.

Esses agrupamentos podem estar distribuídos em diferentes cromossomos, e o

número de cópias da repetição pode variar de um agrupamento para outro. Os

microssatélites são pequenas sequências de DNA (~6 nts), arranjadas em tandem e

dispersas em um grande número de loci no genoma. Apresentam elevado grau de

polimorfismo, principalmente no que diz respeito ao número de repetições em um

dado locus. Por esse motivo, os microssatélites são extremamente úteis em estudos

filogenéticos, taxonômicos e genéticos (Requena 1996).

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 10

No genoma de T. cruzi, os genes codificadores de proteína podem ser

encontrados em cópia única ou duplicados. A maioria dos genes codificadores de

proteínas ou RNA caracterizados em T. cruzi estão presentes em duas ou mais

cópias, as quais podem estar localizadas em uma única região do cromossomo ou

em diferentes cromossomos. É importante notar que as cópias duplicadas de um

determinado gene podem apresentar divergências entre si, consequência do

processo evolutivo. Os dados disponíveis sugerem haver correlação entre o número

de cópias de um dado gene do T. cruzi e a concentração de seu produto (RNA ou

proteína) na célula (Franco da Silveira 2000).

A tendência do tripanosoma em duplicar os seus genes e agrupá-los em

tandem poderia estar relacionada com a compensação de eventuais perdas de

genes essenciais durante as constantes mudanças do genoma (amplificação e

translocação das sequências gênicas) e com a transcrição policistrônica, já que o

arranjo em tandem facilitaria a síntese e manutenção dos níveis de mRNAs na célula

(Silveira 2000). Além disso, há alguma correlação entre o número de cópias de um

gene e a quantidade de seu produto na célula. Proteínas e RNAs altamente

abundantes (Ex: tubulina, Hsp 70, histonas, etc) são codificados por genes múltipla

cópia (Michels et al. 1990).

Nos tripanosomas o cinetoplasto, que está localizado próximo à base do

flagelo, corresponde a uma condensação de DNA localizada no interior de uma

mitocôndria única e ramificada por todo o corpo do protozoário, albergando

moléculas circulares de DNA (kDNA) denominadas de mini e maxicírculos (Simpson

1987).

No T. cruzi, o kDNA representa cerca de 20-25% do DNA total da célula, e é

composto por dois tipos de moléculas circulares, que diferem em tamanho e função,


denominadas de minicírculo e maxicírculo. Os minicírculos possuem cerca de 1.400

pb e estão presentes em 10.000 a 20.000 cópias por célula. O número e tipos de

classes de minicírculos podem variar entre as diferentes cepas ou isolados do

parasita. As sequências presentes no minicírculo não são traduzidas em peptídeos,

mas seqüências variáveis são transcritas gerando pequenos RNAs denominados de

gRNAs (RNA guia), que estão envolvidos no processo de editoração dos mRNAs

das enzimas mitocondriais (Macina et al. 1985, Falasca et al. 1990).

Os maxicírculos possuem cerca de 40.000 pb de tamanho, e o número de

cópias por células varia de 20 a 50. Os genes das proteínas mitocondriais e dos

rRNAs mitocondriais estão localizados no maxicírculo. Existem no maxicírculo cerca

de 15 genes que codificam as proteínas mitocondriais envolvidas na respiração

celular (Franco da Silveira 2000).

1.7.2. PROCESSAMENTO DOS RNAs

O estudo da expressão gênica dos tripanosomatídeos tem revelado a

existência de mecanismos genéticos peculiares, como, por exemplo, a organização

dos genes de proteínas em unidades transcricionais policistrônicas, o

processamento dos transcritos através de trans-splicing e a editoração (editing) do

RNA (Franco da Silveira 2000).

A maioria dos transcritos dos genes presente no maxicírculo só pode ser

traduzida em proteínas após a adição ou deleção de resíduos de uridina através de

um processo conhecido como editoração. Trata-se de um mecanismo distinto do

trans-splicing, pois, com a adição ou deleção de uridinas tem-se a formação de um

mRNA, cuja seqüência de nucleotídeos não é mais exatamente aquela codificada

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 12

pelo gene. A editoração é uma reação intermolecular que envolve duas entidades

diferentes, que são o mRNA codificado pelo gene do maxicírculo e o gRNA (guide

RNA) codificado por um gene do minicírculo (Franco da Silveira 2000).

Em tripanosomas, leishmanias e espécies relacionadas, todos os RNAs são

processados por um mecanismo não usual denominado trans-splicing. As regiões de

dois transcritos separados (em lugar de um único pré-mRNA) são unidas de modo

que todo o mensageiro maduro inicia com a mesma sequência (aproximadamente

40 nucleotídeos), denominada spliced leader (SL) (Tschudi & Ullu 1990; Nilsen 1995;

Peris et al. 1997; Sturm & Campbell 1999; Sturm & Yu 1999; Liang et al. 2003). O SL

é derivado de um RNA de 110 nts codificado por genes localizados em um ou dois

cromossomos, dependendo da cepa de T. cruzi. O RNA da SL é clivado e uma

porção resultante de 39 nts é transferida para a região 5’ do mRNA nascente. A

região 5’ do pré-mRNA também é clivada em um sítio específico (nucleotídeo

consenso AG) e substituída pelo SL. Como os RNAs mensageiro e SL são

codificados por genes situados em diferentes sítios do genoma, o processo foi

denominado de trans-splicing (Figura 3A). A reação de trans-splicing é catalisada por

um complexo multienzimático constituído por enzimas específicas (endonucleases,

ligases, etc) e ribonucleoproteínas (U2, U4, U5 e U6 snRNP); U1 snRNP parece ser

exclusiva do cis-splicing (Figura 3B) (Liang 2003).


Figura 3: Mecanismo de trans-splicing (A) e cis-splicing (B).

GU

SL

// A AG GU //

Pré-mRNA

// A AG G

U

// A AG G

U mRNA

maduro

A)

Pré-mRNA maduro

GU

éxon 1

A AG GU //

Pré-mRNA éxon 2

íntron

A AG G

U

A AG G

U

B)

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 14

O trans-splicing envolvendo SL está caracterizado em tripanosomas (Sutton &

Boothrody 1986), nemátodes (Nilsen 1989), trematodos (Rajkovic et al. 1990),

euglenóides (Frantz et al. 2000) e em cordados (Vandenberghe et al. 2001) e

requerem, em adição ao SL RNP, as pequenas ribonucleoproteínas U2, U4/U6 e U5;

a sequência SL é transferida por uma partícula RNP (ribonucleoproteína) que

contém domínio semelhante a snRNP de mamífero, incluindo sítio de ligação Sm

(Sm-binding site), embora SL RNP não seja reconhecida por autoanticorpos

humanos anti-Sm (Palfi & Bindereif 1992).

SL está teoricamente presente em todos os mRNAs do tripanosoma e sua

função exata ainda não é conhecida. Existem evidências de que SL confere

estabilidade ao mRNA, impedindo a sua degradação, auxiliando também a interação

do mRNA com os ribossomos. Transcritos desprovidos de SL perdem a sua

estabilidade e não são traduzidos (Ullu et al. 1996)

Tal como ocorre nos eucariotos, os mRNAs dos tripanosomas apresentam na

sua extremidade 3’ uma cauda composta por cerca de 30 resíduos de adenina

(cauda poli-A). Porém, ao contrário dos eucariontes superiores, os mRNAs dos

tripanosomatídeos não apresentam uma sequência consenso para adição de

resíduos de adenina. Os genes em tandem estão separados por espaçadores

intergênicos relativamente curtos (100-300 pb), que contêm regiões ricas em

resíduos de pirimidina (citosina, timina) envolvidos no controle da transcrição. A

distância entre a região rica em pirimidinas e o sítio consenso (AG) para trans-

splicing tem influência sobre a adição da cauda poli-A (Franco da Silveira 2000).

Os dados disponíveis indicam que o controle da transcrição no T. cruzi deve

operar principalmente em nível pós-transcricional. A clivagem das regiões

intergênicas do transcrito primário, com adição de SL e da cauda poli-A, deve


ocorrer à medida que o transcrito primário está sendo sintetizado (Franco da Silveira

2000).

Em tripanosomas, o trans-splicing tem papel importante na resolução de

unidades de transcrição policistrônicas (transcrito contendo diferentes mensagens,

sob controle de um único promotor) em mRNAs individuais; tais mRNAs de

transcritos policistrônicos são gerados pelo processamento de 5’ através de trans-

splicing do SL e processamento 3’ por clivagem e poliadenilação (Pays et al. 1994).

1.7.3. AS RIBONUCLEOPROTEÍNAS

As ribonucleoproteínas (snRNPs – U1, U2, U4/U6 e U5, principalmente),

complexos que consistem de pequenos RNAs ricos em uridina (UsnRNAs) unidos

fortemente à proteínas, são fatores importantes no funcionamento das células

eucariotas. Esses snRNAs apresentam diferentes tamanhos e formas, podendo ser

muito abundantes (cerca de 107 cópias por célula de mamífero, tanto quanto os

ribossomos) e altamente conservadas de leveduras ao homem. Além disso, esses

pequenos RNAs possuem um sítio Sm rico em uridina composto por duas regiões

conservadas chamadas de Sm1 e Sm2, separadas por uma região não-conservada

(Hermann et al. 1995; Séraphin 1995). Esse sítio Sm codifica para um domínio

comum (domínio Sm) responsável por mediar as interações com as proteínas Sm.

As proteínas unidas aos snRNAs podem ser classificadas em dois grupos: as

específicas que estão associadas somente a determinadas snRNPs e sete proteínas

Sm (B/B’, D1, D2, D3, E, F e G isoladas do extrato nuclear de células HeLa,

apresentando pesos moleculares de 28,0/29,0; 16,0; 16,5; 18,0; 12,0; 11,0; 9,0 kDa

e pI de 10,6/10,7; 10,5; 8,0; 8,0; 10,3; 3,3; 8,8; respectivamente) que são comuns

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para todas as partículas (Figura 4) (Luhrmann et al. 1990, Burge et al. 1999, Stark et

al. 2001).

Figura 4: Esquema de U1 snRNP. m3G: cap trimetilguanosina; B, D1, D2, D3, E, F e

G: proteínas Sm; asterisco: proteínas específicas de U1 snRNP.

Em tripanosomatídeos, os UsnRNAs são transcritos pela RNA polimerase III e

recebem um cap de 7-metilguanosina (m7G) na extremidade 5’ adicionado pela

enzima guaniltransferase que, associada à RNA polimerase, transfere GMP a partir

de GTP para um grupamento difosfato na extremidade 5’ promovendo uma ligação

5’→5’ (Lodish et al. 2000). O cap 5’ protege o mRNA da ação das exorribonucleases

5’ além de ter papel importante na tradução e processamento dos mRNAs, e

portanto, do processo de splicing, sendo extremamente importante para que ocorram

interações eficientes da U6 snRNA ao sítio de splice 5’ (O’Mullane et al. 1998). Os

snRNAs são então exportados do núcleo para o citoplasma da célula, associando-se

a sete proteínas Sm, gerando o snRNP core com estrutura semelhante a um anel

em torno do sítio Sm e que é essencial para a estabilidade metabólica do snRNP,

importação da partícula para o núcleo e ligação às proteínas específicas (Will &

Lührmann 2001). A U6 snRNP interage com U4 snRNP pelo pareamento dos

*

* *

U1 snRNA

Sítio Sm Will & Lürhmann 2001


snRNAs, formando U4/U6 snRNP; proteínas LSm (Sm-like) facilitam a interação in

vitro (Achsel et al. 1999). Já os pré-mRNAs recebem o cap 5’ durante o trans-

splicing, quando a sequência SL capped de 39 nucleotídeos é transferida, a partir de

um SL RNA, para a extremidade 5’ de cada RNA mensageiro (Marchetti et al. 1998).

Desde a descoberta do trans-splicing em tripanosomas, acreditou-se que

esses organismos perderam a maquinária para realizar o cis-splicing. Isto foi

baseado na ausência aparente de sequências intercalantes (íntrons) e de U1

snRNA, que no cis-splicing promove interações de pares de bases na região 5’

splice site durante a formação do spliceosome inicial. Mais recentemente, um

candidato a U1 snRNA foi identificado em Chritidia fasciculata, Leishmania

tarentolae e Trypanosoma brucei, que possuem alta similaridade entre si, além de

apresentar uma estrutura cap de trimetilguanosina (TMG) e estar complexada a

proteínas core comuns, semelhante às outras U1 já estudadas; além disso,

sequências intervenientes foram descritas no gene PAP de T. brucei e T. cruzi

(Schnare & Gray 1999, Mair et al. 2000, Djikeng et al. 2001, Palfi et al. 2002). A

sequência de U1 snRNA encontrada em T. brucei é extremamente pequena

(aproximadamente 70 nucleotídeos) em relação aos outros U1 snRNAs (139 a 568

nucleotídeos) (Djikeng et al. 2001; Palfi et al. 2002). Uma questão importante a ser

respondida relaciona-se com a participação dessa U1 snRNA em reações de cis-

splicing em tripanosomatídeos.

Embora bem definidos em mamíferos, as ribonucleoproteínas não estão bem

caracterizadas em certos tripanosomatídeos como o Trypanosoma cruzi. No intuito

de aprender mais sobre os fatores de splicing (principalmente as UsnRNPs), que

possam estar envolvidas na reação de trans-splicing em tripanosomatídeos, este

trabalho propôs a caracterização dos snRNAs de T. cruzi (U2, U4, U5 e U6), visando

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 18

contribuir futuramente para o conhecimento de seu papel no processamento dos

mRNAs de T. cruzi e consequentemente na interação hospedeiro-parasita. Além

disso, uma área de interesse básico e com aplicação prática direta é a descoberta

de novos pontos de ataque quimioterápico, levando em consideração os

mecanismos de resistência a drogas, já que se trata de um mecanismo de

processamento dos RNAs diferente do observado no homem. Este trabalho poderá

contribuir para estudos nesse aspecto.

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM Trypanosoma cruzi – Objetivos _______ 19

2. OBJETIVOS

1) Obtenção de U1, U4, U5 e U6 snRNAs da cepa Y de Trypanosoma cruzi por

PCR e RT-PCR, utilizando DNA genômico e RNA total do parasita,

respectivamente;

2) Clonagem e sequenciamento dos produtos obtidos, seguidos de análises em

bancos de dados, alinhamentos das seqüências com as de outros organismos,

predição de estrutura secundária e filogenia;

3) Alinhamento, predição de estrutura secundária e filogenia da seqüência de U2

snRNA anteriormente obtida no laboratório.

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 20

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Parasita

- Formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi (cepa Y) cultivados em meio LIT.

3.2. Soluções e reagentes

Para Extração de RNA total de T. cruzi

- Tampão de lavagem: 100 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl (pH 7,5); 3 mM MgCl2.

- Reagente Trizol (Invitrogen)

- Clorofórmio

- Isopropanol

- ETOH 100% e 70%

- H2O DEPC: Adicionar 0,1% de Dietilpirocarbonato (DEPC – Sigma), deixar

agitando “overnight” e autoclavar a 121 oC e 1 atm por 20 min.

- Tampão formamida: 0,025% xylene cyanol; 0,025% Azul de Bromofenol;

Formamida deionizada q.s.p.

Para gel de poliacrilamida 10% com uréia

- Acrilamida/ bis-acrilamida 40%: 40% acrilamida; 1,3% bis-acrilamida.

- TBE [10X]: 890 mM Tris base; 890 mM ácido bórico; 20 mM EDTA. Acertar o pH

para 8,3 e autoclavar a 121 oC e 1 atm por 15 min.

- TEMED

- APS 10%: solução de Perssulfato de amônio 10%.

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Materiais e Métodos _______ 21

- PAGE 10% com uréia: 7 M uréia; 1% Acrilamida/ bis-acrilamida 40%; TBE [0,5X].

Para a polimerização, adicionar 0,1% TEMED e 1% APS 10%.

Para Eluição de RNA de gel de poliacrilamida com uréia

- Tampão de extração: 2 M acetato de amônio; 1% SDS; 20 µg/ml glicogênio.

- 1-butanol

- ETOH 100% e 70%

- H2O DEPC

Para adição de cauda poli-A

- Tris-HCl 1M pH 7,5

- NaCl 5M

- MgCl2 1M

- MnCl2 50 mM

- ATP 10 mM

- BSA 10 µg/µl

- Poli-A polimerase 5 U/µl

- Fenol/ clorofórmio/ isoamilálcool

- glicogênio 20 mg/ml

- SET [20X]: 3M NaCl; 20 mM EDTA pH 8,0; 0,6 M Tris-HCl pH 8,0

- ETOH 100% e 70%

- H2O DEPC

Para Reação de RT

- kit 3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (Invitrogen)

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 22

- kit Ominiscript RT (Qiagen)

Para Extração de DNA genômico de T. cruzi

- Reagente DNAzol (Invitrogen)

Para gel de agarose

- gel 1-2%: 1-2% agarose; TAE [1X] q.s.p. Aquecer até a dissolução completa.

Adicionar 0,5 µg/ml de BrEt.

- gel 4%: 1% agarose; 3% agarose Low Melting Point; TAE [1X] q.s.p. Aquecer até a

dissolução completa. Adicionar 0,5 µg/ml de BrEt.

- TAE [50X]: 2M Tris base; 5,7% Ácido acético glacial; 50 mM EDTA (pH 8,0).

- Dye Front (tampão de amostra): 0,25% Azul de bromofenol; 0,25% Xylene Cianol

FF.

Para Reação de PCR

- Tampão PCR [10X]

- MgCl2 50 mM

- dNTP 10 mM

- primers: TcU4 dir 100 ng/µl (5’- AAGCCTTGCGCAGNGAG -3')

TcU4 inv 100 ng/µl (5’- GCGGTAGGTGTCAAATATTC -3')

TcU5 dir 100 ng/µl (5’- GCATCATCATTTCGACTT -3')

TcU5 inv 100 ng/µl (5’- GTTTAAATTGTTTGGGC -3')

TcU6 dir 100 ng/µl (5’- GTCAMAGCGAAGGACATC -3')

TcU6 inv 100 ng/µl (5’- AAAGCCATATCTCTCGAA -3')

forward 10 pmol/µl (5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’)


reverse 10 pmol/µl (5’-AACAGCTATGACCATG-3’)

- Taq DNA Polimerase [5 U/µl] (Amersham Biosciences)

Para Extração de produto de PCR de gel de agarose

- kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen)

Para adição de dATP ao inserto

- Tampão PCR [10X]

- dATP 10 mM

- Taq DNA polimerase [5 U/µl]

Para Reação de Clonagem

- kit TOPO TA Cloning for Sequencing (Invitrogen)

- Solução de CaCl2: 60 mM CaCl2; 10 mM MOPS (pH 7,0); 15% glicerol. A solução é

esterilizada por filtração em membrana de 0,22 µm.

- Kanamicina [10 mg/ml]

Para Extração de DNA plasmidial (miniprep)

- ampicilina [25 mg/ml]

- Solução I: 50 mM glicose; 25 mM Tris-HCl (pH 8,0); 10 mM EDTA. Autoclavar por

15 min.

- Solução II: 0,2 M NaOH; 1% SDS

- Solução III: 3M Acetato de potássio; 11,5% Ácido acético glacial

- Fenol/Clorofórmio

- ETOH 100% e 70%

- TE: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0); 1 mM EDTA (pH 8,0).

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 24

- RNase A 10 mg/ml (Gibco BRL)

Para Reação de Sequenciamento

- primers: forward 1,6 pmol/µl (5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’)

reverse 1,6 pmol/µl (5’-AACAGCTATGACCATG-3’)

- Tampão Save Money: 200 mM Tris-HCl (pH 9,0); 5 mM MgCl2

- Loading buffer: 5,5% Lane Code Even ou Odd (Applied Biosystem); 11,1% Loading

Color Even ou Odd (Applied Biosystem); 83,4% Formamida deionizada.

- Big Dye Terminator (Applied Biosystem)

- isopropanol 75%

3.3. Meios de cultura

- LB: 1% Triptone; 0,5% Yeast Extract; 1% NaCl. Autoclavar a 121 oC/ 1 atm por 30

min.

- LB agar: 1% Triptona; 0,5% Extrato de levedura; 1% NaCl; 2% ágar. Autoclavar a

121 oC/ 1 atm por 30 min.

- SOB: 2% Triptona; 0,5% Extrato de levedura; 8,5 mM NaCl; 2,5 mM KCl. Ajustar o

pH para 7,0 e autoclavar por 30 min. (121 oC/ 1 atm).

- SOC: SOB suplementado com 10 mM Glicose e 20 mM MgCl2.

- LIT: 68,4 mM NaCl; 5,4 mM KCl; 56,3 mM Na2HPO4; 111 mM Dextrose; 0,3% Liver

Infusion Broth; 0,5% Tryptose; 25 mg/L Haemin. Incubar a 68 oC por 1 hora. Esperar

esfriar e medir o pH que deve ser 7,2. Filtrar em membrana de 0,22 µm. Adicionar

10% de Soro Fetal Bovino estéril.


3.4. Cultura de Trypanosoma cruzi

As formas epimastigotas da cepa Y de T. cruzi (Silva & Nussenzweig 1953)

foram cultivadas em meio LIT, incubando em estufa a 28 oC. Essa cepa é mantida

no laboratório, realizando-se repiques a cada 15 dias.

3.5. Extração de RNA total de T. cruzi

- Uma cultura de 50 ml de formas epimastigotas de T. cruzi em meio LIT (~108-109

parasitas/ml) foi centrifugada por 10 min. a 4 oC e 1.500 g;

- O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspenso em 1 ml do tampão de

lavagem, centrifugando novamente por 1 min. a 2.500 g. Essa lavagem foi repetida

mais uma vez;

- Após descartar o sobrenadante foi adicionado 1 ml de Trizol, levando ao vórtex por

1 min. para o rompimento dos parasitas;

- O RNA foi extraído com 200 µl de clorofórmio, centrifugando por 10 min. à TA e

10.000 g;

- A fase superior foi retirada e colocada em um novo tubo para precipitação com 500

µl de isopropanol, misturando por inversão e centrifugando em seguida a 4 oC e

10.000 g por 10 min.;

- O sedimento foi lavado com 1 ml de ETOH 70% e ressuspenso em 100 µl de H2O

DEPC.

- A amostra foi analisada após eletroforese em PAGE 10% com uréia, corado com

BrEt e visualizado em transiluminador UV.

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 26

3.6. Eluição de RNA de gel de poliacrilamida com uréia

- O gel de poliacrilamida com uréia contendo o RNA foi colocado em tubo com 200 µl

de tampão de extração e incubado a 37 oC por 1 hora e 30 min.;

- Foi dado um pulso em centrífuga e o tampão foi transferido para um novo tubo para

extração com 200 µl de 1-butanol, homogeneizando em vórtex e centrifugando em

seguida por 5 min. à TA e 10.000 g;

- A fase superior foi descartada e o restante precipitado com 1 ml de ETOH 100%,

centrifugando a 4 oC e 10.000 g por 15 min.;

- O sedimento foi lavado com 100 µl de ETOH 70%, centrifugando por 5 min. à 4 oC

e 10.000 g;

- o sedimento foi seco e ressuspenso em 20 µl H2O DEPC.

3.7. Adição de cauda poli-A

- Foram adicionados em microtubo de 1,5 ml: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5); 250 mM

NaCl; 10 mM MgCl2; 2,5 mM MnCl2; 0,25 mM ATP; 0,5 µg/µl BSA; 6,9 U Poli-A

polimerase e 4 ng/µl RNA, incubando a 37 oC por 30 min;

- 50 µl H2O DEPC e 100 µl fenol/clorofórmio/isoamilálcool foram adicionados,

centrifugando por 5 min. a 4 oC e 12.000 g;

- o RNA foi precipitado com 0,5 µl de glicogênio [20 mg/ml], 5 µl SET [20X] e 2,5 vol.

ETOH 100%, centrifugando por 15 min. a 4 oC 12.000 g;

- Lavagem com 100 µl de ETOH 70%, centrifugando por 5 min. a 4 oC e 12.000 g.

- o sedimento foi seco e ressuspenso em 13 µl H2O DEPC.


3.8. Reação de RT-PCR

A reação de RT-PCR foi realizada com 200 ng do RNA da cepa Y extraído do

PAGE e com adição de cauda poli-A. O kit 3’ RACE (Invitrogen) foi utilizado com o

primer TcU6 dir e enzima Ominiscript (Qiagen), seguindo o protocolo abaixo:

- Incubar 13 µl RNA (200 ng) a 65 oC por 5 min. e colocar no gelo.

- Adicionar: 2,0 µl tampão [10X]; 2,0 µl dNTP 5 mM; 1,0 µl AP solution 10 µM; 1,0 µl

RNAsin [10 U/µl]; 1,0 µl Ominiscript RT; H2O DEPC q.s.p. 20 µl. Incubar a 37 oC por

1 hora.

- Inativar a enzima a 93 oC por 5 min. e colocar no gelo.

- A PCR foi realizada com 3 µl da reação de RT

- os produtos foram analisados em gel de agarose 4%, corado com BrEt e

visualizados em transiluminador UV.

Obs: a enzima Ominiscript foi utilizada ao invés da enzima presente no kit

(SuperScript), por ser uma enzima mais eficiente para desfazer loops internos da

molécula de RNA.

3.9. Extração de DNA genômico de T. cruzi

O DNA genômico de uma cultura de 50 ml de formas epimastigotas de T.

cruzi em meio LIT (108-109 parasitas/ml) foi extraído com o reagente DNAzol

(Invitrogen), seguindo as especificações do fabricante. A amostra foi analisada após

eletroforese em gel de agarose 1%, corado com BrEt e visualizada em

transiluminador UV.

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 28

3.10. Reação de PCR

Adicionou-se em tubos de 0,2 ml:

1,0 µl DNA 100 ng/µl

5,0 µl tampão de PCR [10X]

1,5 µl MgCl2 50 mM

1,0 µl dNTP 10 mM

1,0 µl primer dir [100 ng/µl]

1,0 µl primer inv [100 ng/µl]

0,5 µl Taq DNA polimerase [5 U/µl]

H2O q.s.p. 50 µl

A reação foi colocada em termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Perkin

Elmer), seguindo o ciclo abaixo:

94 oC – 5 min.

94 oC – 1 min.

53 oC – 1 min. 30 X

72 oC – 1 min. 40 seg.

72 oC – 5 min.

4 oC - ∞

Os produtos da reação de PCR foram analisados após eletroforese em gel de

agarose 2% corado com BrEt e visualizados em transiluminador UV. As bandas

referentes aos produtos de PCR foram recortadas do gel de agarose e extraídas

utilizando o kit QIAquick gel extraction (Qiagen), seguindo as especificações do

fabricante.


3.11. Adição de dATP ao inserto

A adição de adenina na extremidade 3´ foi necessária para garantir a ligação

do inserto ao vetor TOPO TA. Foram adicionados em tubo de 0,2 ml:

7 µl do produto de PCR extraído do gel de agarose (~700 ng)

1 µl Tampão de PCR [10X]

1 µl dATP 10 mM

0,5 µl Taq DNA polimerase [5 U/µl]

- A reação foi incubada a 72 oC por 15 min. em termociclador Gene Amp PCR

System 9700.

3.12. Reação de Clonagem

3.12.1. Reação de Ligação

A reação de ligação do inserto com o vetor TOPO TA (Invitrogen) foi realizada

seguindo as especificações do fabricante.

3.12.2. Preparação de Bactérias Competentes

- Um pré-inóculo de 5 ml contendo bactérias DH5α, após crescimento “overnight”, foi

transferido para 50 ml de meio LB incubando-se a 37oC em estufa sob agitação até

que atingisse uma densidade óptica a 600 nm de 0,3;

- A cultura foi centrifugada por 10 min. a 4 oC e 2.500 g e o sedimento ressuspenso

em 10 ml de solução de CaCl2;

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 30

- Novamente as bactérias foram centrifugadas por 10 min. a 4 oC e 2.500 g e o

sedimento ressuspenso em 10 ml da solução de CaCl2, sendo mantidas em gelo

durante 1 hora;

- Centrifugou-se por 10 min. a 4 oC e 2.500 g e o sedimento ressuspenso em 200µl

de solução de CaCl2;

- As bactérias foram aliquotadas em frações de 50 µl cada e congeladas a –80 oC.

3.12.3. Reação de Transformação

- Após misturar 2 µl da reação de ligação com 50 µl de solução de CaCl2, foram

adicionados 50 µl das bactérias DH5α competentes e incubadas em gelo por 30 min;

- Foi realizado um choque térmico a 42 oC por 2 min., retornando em seguida para o

gelo por 2 min. e à TA por mais 2 min.;

- Adicionou-se 500 µl de meio SOC, incubando-se a 37 oC por 1 hora e 30 min. sob

agitação (150 rpm);

- As bactérias foram então cultivadas em placas de Petri contendo meio LB ágar com

50 µg/ml de kanamicina e incubadas a 37 oC “overnight”.

3.13. PCR de colônia

- Uma pequena quantidade de bactérias presente em cada colônia foi suspensa em

20 µl de meio LB, separadamente.

- Em tubo de 0,2 ml foram adicionados: 5 µl da suspensão de bactérias; 5 µl Tampão

de PCR [10X]; 1,5 µl MgCl2 50 mM; 1 µl primer forward; 1 µl primer reverse; 1 µl

dNTP 10 mM; 0,5 µl Taq DNA polimerase [5 U/µl] e H2O q.s.p. 50 µl.


- As reações foram colocadas em termociclador Gene Amp PCR System 9700

seguindo o ciclo abaixo:

94 oC – 1 min.

94 oC – 30 seg.

52 oC – 30 seg. 30 X

72 oC – 30 seg.

72 oC – 5 min.

4 oC - ∞

- Os produtos foram analisados em gel de agarose 1% corado com BrEt e

visualizados em transiluminador UV.

Obs: o restante da suspensão de bactérias (15 µl) foi utilizada para fazer o repique.

3.14. Extração de DNA plasmidial (miniprep)

- As bactérias recombinantes foram repicadas em 5 ml de meio LB contendo 50

µg/ml de ampicilina e incubadas a 37 oC, “overnight”, sob agitação.

- A cultura de 5 ml foi centrifugada, removeu-se o sobrenadante e o sedimento foi

ressuspenso em 100 µl da Solução I;

- 200 µl da Solução II foi adicionada, misturou-se por inversão 5X e incubou-se em

gelo por 5 min;

- 150 µl da Solução III foi adicionada, misturando em vórtex e incubou-se por 5 min.

em gelo;

- os tubos foram centrifugados por 15 min. a 4 oC e o sobrenadante foi colocado em

um novo tubo;

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 32

- as amostras foram extraídas com 300 µl de fenol/clorofórmio, centrifugando por 5

min. e a fase superior foi retirada e colocada em um novo tubo;

- precipitou-se com 2 vol. ETOH 100%, incubando por 30 min. a –80 oC e

centrifugando por 20 min. a 4 oC, 10.000 g ;

- o sedimento foi lavado com 500 µl de ETOH 70%, centrifugando a 4oC por 5min.;

- o sedimento foi seco e ressuspenso em 50 µl de TE;

- 3 µl de RNAse A 10 mg/mL foi adicionado e incubou-se a 37 oC por 1 hora;

- Adicionou-se 50 µl de H2O e 100 µl de fenol/clorofórmio, centrifugando 10 min;

- a fase superior foi colocada em um novo tubo e precipitada com 2 vol. ETOH

100%, incubando a –80 o C por 30 min. e centrifugando por 20 min. a 4oC;

- o sedimento foi lavado com 100 µl de ETOH 70%, centrifugando por 5 min. a 4oC;

- o sedimento foi ressuspenso em 15 µL de H2O destilada, analisado após

eletroforese em gel de agarose 1%, corado com BrEt e visualizado em

transiluminador UV.

3.15. Reação de Sequenciamento

Para o sequenciamento dos plasmídios, foram adicionados os reagentes a

seguir:

4 µL DNA (400 ng)

2 µL Tampão Save Money

2 µL primer forward ou reverse [1,6 pmol/µl]

2 µl Big Dye Terminator


40 X

Os tubos foram colocados em termociclador Gene Amp PCR System 9700, seguindo

o ciclo abaixo:

96 oC – 2 min.

96 oC – 30 seg.

52 oC – 30 seg.

60 oC – 4 min.

4 oC - ∞

- Após a PCR, foi adicionado 80 µl de isopropanol 75% para precipitar o DNA,

deixando à TA por 15 min;

- As amostras foram centrifugadas por 15 min. (12.000 g, TA) e o sobrenadante

descartado;

- o sedimento foi lavado com 1 mL de ETOH 70%, centrifugando por 5 min. (12.000

g, TA);

- o sedimento foi então seco e ressuspenso em 2 µl de Loading buffer. As amostras

foram fervidas a 95 oC antes de aplicar em PAGE 5% e a eletroforese foi realizada

em sequenciador automático ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Perkin Elmer).

3.16. Alinhamento, Filogenia e Estrutura secundária

O alinhamento múltiplo das sequências de UsnRNAs e as porcentagens de

identidade foram realizadas com o programa GeneDoc (Nicholas & Nicholas 1997).

Para os estudos de filogenia, as seqüências foram alinhadas utilizando-se o

programa BioEdit versão 7.0.0 (Hall 1999) e a árvore filogenética foi construída

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 34

utilizando o programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) versão 2.1

(Kumar et al. 2001), com metodologia de Distância (distância-p) e algorítimo

neighbor-joining. Foram utilizados valores de bootstrap de 1000 replicações.

A estrutura secundária dos UsnRNAs foi predita pelo programa mfold versão

3.1, disponível em http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/.

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Fluxograma _____________ 35

4. FLUXOGRAMA DE TRABALHO

Cultura de T. cruzi (cepa Y)

Extração deRNA total

Extração de DNA genômico

PCR

Eluição das bandas de interesse do PAGE

RT-PCR

Eluição do produto do gel de agarose

Adição de dATP ao inserto

Ligação em vetor TOPO TA,

transformação e plaqueamento

PCR de colônia

Sequenciamento

Miniprep

Alinhamento de sequências (GeneDoc), estrutura secundária

(mfold) e filogenia (MEGA)

U4, U5 eU6 snRNA U2 snRNA

Sequência banco de dados (cód.

acesso AY205287)

- Alinhamento de sequências (GeneDoc) - Estrutura secundária (mfold) - Filogenia (MEGA)

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 36

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. CONSTRUÇÃO DOS PRIMERS

Para a amplificação de U1, U4, U5 e U6 snRNAs por RT-PCR, foram

desenhados primers específicos (programa GeneRunner versão 3.00) a partir das

sequências já conhecidas em T. brucei, que foram comparadas por BLAST com

banco de dados do Projeto Genoma de T. cruzi (http://www.tigr.org/ tdb/e2k1/tca1/);

conforme pôde ser observado na figura 5, U1, U4, U5 e U6 snRNAs de T. brucei

apresentaram 83%, 84%, 80% e 97% de identidade, respectivamente, com as

sequências existentes no banco de dados de T. cruzi.

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Resultados e Discussão______ 37

Figura 5: Comparação (BLAST) das sequências de snRNAs de T. brucei com o

genoma de T. cruzi.

Todas as sequências, com exceção de U6 snRNA, apresentaram identidade a

partir do nucleotídeo da posição 1. A sequência de U6 apresentou identidade a partir

do nucleotídeo da posição 13, dificultando a confecção de um dos primers. Assim,

optou-se por desenhar um primer com a sequência imediatamente anterior à

alinhada, referente ao clone depositado no banco de dados de T. cruzi, o qual

continha toda a seqüência de U6 snRNA (primer TcU6 dir).

T. cruzi

T. brucei

U1 T. brucei x T. cruzi (73 bases)




T. cruzi

T. brucei

T. cruzi

T. brucei

T. cruzi

T. brucei

T. cruzi

T. brucei

T. cruzi

T. brucei

T. cruzi

T. brucei

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 38

Caso não houvesse sucesso por RT-PCR, também foram construídos os

primers TcU4 inv, TcU5 inv e TcU6 inv para a amplificação direta do DNA genômico.

A composição dos primers sintetizados encontra-se abaixo:

snRNAs Primers

U1 TcU1: 5’- AACTCACCTGCAGNGNGTCA -3’

U4 TcU4 dir: 5’- AAGCCTTGCGCAGCGAG -3'

TcU4 inv: 5’- GCGGTAGGTGTCAAATATTC -3'

U5 TcU5 dir: 5’- GCATCATCATTTCGACTT -3'

TcU5 inv: 5’- GTTTAAATTGTTTGGGC -3'

U6 TcU6 dir: 5’- GTCAMAGCGAAGGACATC -3'

TcU6 inv: 5’- AAAGCCATATCTCTCGAA -3'

Não foram construídos primers para U2 snRNAs, pois esta seqüência já foi

clonada anteriormente (Bosetto 2002).

5.2. REAÇÃO DE RT-PCR

Após a obtenção do RNA total de formas epimastigotas de T. cruzi (cepa Y) e

corrida eletroforética, as bandas referentes aos snRNAs foram extraídas com intuito

de concentrar os RNAs de interesse, diminuindo-se assim a interferência de outros.

A figura 6 apresenta o RNA total das formas epimastigotas de T. cruzi, estando

indicadas as bandas que foram recortadas e extraídas para purificação.


Figura 6: Eletroforese em PAGE 5% com uréia, corado com BrEt, contendo RNA

total da cepa Y de T. cruzi (em duplicata). As bandas extraídas estão indicadas na

figura.

Como os snRNAs não possuem cauda de poli-A, foi necessário adicioná-la

para a utilização do kit 3´RACE (Life Technologies), seguindo-se as instruções do

fabricante, com a enzima Omniscript (Qiagen). Após a reação de RT, foram

realizadas reações de PCR com os primers de U1, U4, U5 e U6 dir, com

temperaturas de anelamento de 55 oC, 62oC, 50 oC e 53 oC, respectivamente.

Somente foi possível, com essa metodologia, obter o produto de U6 snRNA

de aproximadamente 100 pb, que após extração e purificação do gel, foi clonado

utilizando o kit TOPO TA (Invitrogen) (Figura 7).

Bandas extraídas

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 40

Figura 7: Vetor pCR4-TOPO, presente no kit TOPO TA Cloning for Sequencing

(Invitrogen).


Após a reação de transformação, a confirmação da presença do inserto foi

realizada através de PCR de colônia, onde a presença de uma banda de

aproximadamente 250 pb (150 pb do vetor + 100 pb inserto) indicou colônia positiva,

como demonstrado na figura 8. As três colônias que apresentaram o inserto foram

sequenciadas.

Figura 8: Eletroforese em gel de agarose 1%, corado com BrEt, contendo o produto

da PCR de colônia da clonagem de U6 snRNA por RT-PCR (1). PM: 1 Kb plus (Life

Technologies).

Até o momento, a clonagem de U1 snRNA de T. cruzi revelou apenas uma

seqüência de 23 nts, incluindo os 20 nts do primer (Bosetto 2002), por isso, neste

trabalho foram estudadas as seqüências de U2, U4, U5 e U6 snRNAs.

5.3. REAÇÃO DE PCR DO DNA GENÔMICO

O DNA genômico de formas epimastigotas da cepa Y de T. cruzi foi extraído

(Figura 9) para utilização na reação de PCR.

300 200 100

PM 1 pb

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 42

Figura 9: Eletroforese em gel de agarose 1%, corado com BrEt, contendo DNA

genômico das formas epimastigotas de T. cruzi (cepa Y). PM: 1 Kb plus (Life

Technologies).

Foram realizadas reações com os pares de primers TcU4 dir e inv, TcU5 dir e

inv e TcU6 dir e inv, com temperaturas de anelamento de 55 oC, 55 oC e 53 oC,

respectivamente. Após corrida eletroforética, observa-se na figura 10, o produto das

reações de PCR com bandas de aproximadamente 100, 50 e 100 pb para U4 (A), U5

(B) e U6 (C) snRNAs, respectivamente.

PM Y

12

2

5

1

Kb


Figura 10: Eletroforese em gel de agarose 2% (A e C) e 4% (B), corado com BrEt,

contendo o produto de PCR de U4 (A), U5 (B) e U6 (C) snRNA. C-: controle

negativo. PM: 50 pb (Life Technologies). As setas indicam as bandas de interesse.

Em seguida, a banda foi extraída do gel, purificada e clonada em vetor TOPO

TA (Invitrogen). Após a transformação, foi realizada PCR de colônia para a

confirmação da presença do inserto, como mostrado na figura 11. Observa-se a

presença de bandas com aproximadamente 250 pb para U4 (A) e U6 (C) snRNAs e

com aproximadamente 200 pb para U5 snRNA (B), que significam colônias positivas

para o inserto. No total foram obtidas e seqüenciadas 4 colônias de U4, 7 colônias

de U5 e 5 colônias de U6 snRNA.

50

150 100

350

800

PM U6 C- pb

PM U4 C-

350

150 100 50

800

pb PM U5 C-

150

100

50

pb

A C B

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 44

Figura 11: Eletroforese em de agarose 1% (A e C) e 2% (B), corado com BrEt,

contendo os produtos da PCR de colônia da clonagem de U4 (A), U5 (B) e U6 (C)

snRNA por PCR do DNA genômico. PM1: 100 pb, PM2: 50 pb e PM3: 1 Kb plus (Life

Technologies). +: colônia contendo o inserto, -: colônia sem o inserto. As setas

indicam as bandas de interesse.

5.4. ANÁLISE E COMPARAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

As seqüências de U4, U5 e U6 snRNAs de T. cruzi foram submetidas ao

banco de dados do NCBI e os códigos de acesso obtidos foram AY894522,

AY894523 e AY894521, respectivamente.

5.4.1. U2 snRNA

Pesquisas anteriores em nosso laboratório permitiram clonar o U2 snRNA de

T. cruzi, cuja sequência foi depositada no banco de dados do NCBI (National Center

of Biotechnology Information - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ - cód. acesso: AY205287)

(Bosetto 2002). De posse dessa sequência de nucleotídeos e utilizando ferramentas

300 200 100

pb PM3 + -

100

200 300

PM1 - +

50

150 100

200

PM2 - +

A C B

pb pb


de bioinformática, realizou-se a análise comparativa com outras sequências, estudo

de filogenia e predição de estrutura secundária.

Na figura 12, observa-se o alinhamento múltiplo da sequência de U2 snRNA

(pb) de T. cruzi com outros tripanosomatídeos utilizando o programa GeneDoc

(Nicholas & Nicholas 1997) com sequências obtidas no NCBI, apresentando-se na

tabela 1 as respectivas porcentagens de identidade entre as sequências.

Figura 12: Alinhamento múltiplo da sequência de nucleotídeos de U2 snRNA de

Trypanosoma cruzi (cód. acesso: AY205287) com Trypanosoma brucei (cód. acesso:

X04678), Trypanosoma congolense (cód. acesso: M58666), Leishmania

amazonensis (cód. acesso: M58665), Leishmania tarentolae (cód. acesso

AY007788), Leptomonas seymouri (cód. acesso: U23406), Leptomonas collosoma

(cód. acesso: X56455), Crithidia fasciculata (cód. acesso: AF326335). As setas

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 46

indicam as seqüências consenso, nas quais as letras em maiúsculo indicam

identidade entre todas as seqüências (caixas em preto) e as minúsculas identidade

em algumas seqüências (caixas em cinza).

Tabela 1: Porcentagem de identidade entre as sequências de U2 snRNA de

diferentes tripanosomatídeos.

T. brucei T. congolense L. amazonensis L. seymouri L. collosoma C. fasciculata L. tarentolae

T. cruzi 82 82 70 70 69 71 69 T. brucei 84 69 70 70 69 67 T. congolense 70 71 69 71 70 L. amazonensis 89 79 92 95 L. seymouri 81 92 86 L. collosoma 80 77

Podemos observar que a sequência de U2 snRNA de T. cruzi apresentou

identidade de aproximadamente 80% com as sequências dos outros tripanosomas

(T. brucei, T. congolense) e de aproximadamente 70% com os outros

tripanosomatídeos analisados (L. amazonensis, L. seymouri, L. collosoma, C.

fasciculata, L. tarentolae). Essa sequência mostrou-se altamente conservada nos

primeiros 65 nts próximos à região 5’ em todos os tripanosomatídeos analisados.

A árvore filogenética referente a esses achados foi construída, como

mostrado na figura 13. C. fasciculata foi definida como outgroup e os valores de

fidelidade dos ramos estão indicados como valores de bootstrap de 1000

replicações.


Figura 13: Árvore filogenética de U2 snRNA em tripanosomatídeos. Os valores de

bootstrap estão indicados nos nós da figura. Trypanosoma cruzi (cód. acesso:

AY205287), Trypanosoma brucei (cód. acesso: X04678), Trypanosoma congolense

(cód. acesso: M58666), Leishmania amazonensis (cód. acesso: M58665),

Leishmania tarentolae (cód. acesso AY007788), Leptomonas seymouri (cód. acesso:

U23406), Leptomonas collosoma (cód. acesso: X56455), Crithidia fasciculata (cód.

acesso: AF326335).

A análise filogenética da sequência de U2 snRNA mostrou que os

tripanosomas (T. cruzi, T. brucei e T. congolense) encontram-se próximos

evolutivamente, o mesmo acontecendo entre as leishmanias (L. amazonensis e L.

tarentolae), mas havendo uma distância filogenética entre tripanosomas e

leishmanias.

A estrutura secundária de U2 snRNA pôde ser predita, como mostrado na

figura 14, apresentando 4 loops (I, II, III e IV), semelhantes aos de U2 snRNA de T.

brucei (Günzl 1992). O cap 5´ (Gppp) e a região Sm estão representados na figura.

T.congolense

T.brucei

T.cruz i

L.collosoma

L.amazonensis

L.tarentolae

L.seymouri

C.fasc iculata

100

99

93

87

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 48

Figura 14: Estrutura secundária proposta para U2 snRNA de T. cruzi (dG = -34,1 a

37OC). Os números I, II, III e IV indicam os loops. O sítio Sm e o cap 5’ (Gppp) estão

indicados na figura.

5.4.2. U4 snRNA

Após o sequenciamento dos clones de U4 snRNA obtidos neste trabalho, uma

sequência de 102 pb foi confirmada, pelo BLAST com outros tripanosomatídeos no

banco de dados do NCBI, como sendo U4 snRNA. Assim, foi feito também o

alinhamento dessas sequências (Figura 15) e as porcentagens de identidade entre

cada uma delas estão indicadas na tabela 2.

Gppp Sm

I

II

III

IV




Mottram 1989), Leishmania tarentolae (cód. acesso: AY007789), Leptomonas

collosoma (cód. acesso: AF204671), Leptomonas seymouri (cód. acesso:

AJ245951), Crithidia fasciculata (cód. acesso: AF326336). As setas indicam as

seqüências consenso, nas quais as letras em maiúsculo indicam identidade entre

todas as seqüências (caixas em preto) e as minúsculas identidade em algumas

seqüências (caixas em cinza).

Tabela 2: Porcentagem de alinhamento entre as sequências de U4 snRNA de T.

cruzi com diferentes tripanosomatídeos.

T. brucei L. tarentolae L. collosoma L. seymouri C. fasciculata

T. cruzi 81 72 72 72 72 T. brucei 77 78 76 76 L. tarentolae 88 91 88 L. collosoma 90 86 L. seymouri 94

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 50

A sequência de T. cruzi apresentou 81% de identidade com a de T. brucei e

72% com a de outros tripanosomatídeos (L. tarentolae, L. collosoma, L. seymouri e

C. fasciculata) analisados. Entre Leishmania e as duas espécies de Leptomonas, a

identidade foi de aproximadamente 90%, mas quando comparado com os outros

tripanosomatídeos analisados houve maior divergência evolutiva para a sequência

de U4 snRNA, como observado na figura 16; entre T. cruzi e T. brucei, a distância foi

menor. C. fasciculata foi definida como outgroup e os valores de fidelidade dos

ramos estão indicados como valores de bootstrap de 1000 replicações.



AY894522), Trypanosoma brucei (cód. acesso: Mottram 1989), Leishmania

tarentolae (cód. acesso: AY007789), Leptomonas collosoma (cód. acesso:

AF204671), Leptomonas seymouri (cód. acesso: AJ245951), Crithidia fasciculata

(cód. acesso: AF326336).

A estrutura secundária de U4 snRNA de T. cruzi (Figura 17) apresentou 4

loops (I, II, III e IV), sendo que esses também foram semelhantes à estrutura

secundária de U4 snRNA de T. brucei (Mottram 1989), com exceção do loop I que

T.cruzi

T.brucei

L.collosoma

L.tarentolae

L.seymouri

C.fasciculata

94

66

84


não foi observado na estrutura de T. brucei por ser a região de provável pareamento

com U6 snRNA (assinaladas na figura 17 com linhas duplas). O cap 5´ (Gppp) e a

região Sm estão representados na figura.



indicados. As seqüências assinaladas com linhas duplas referem-se às regiões de

interação com U6 snRNA.

5.4.3. U5 snRNA

Os clones obtidos da PCR de U5 snRNA apresentaram 50 pb, que após o

BLAST no banco de dados do NCBI, mostraram identidade com U5 snRNA de

outros tripanosomatídeos. Essa sequência foi então alinhada (Figura 18) e a

porcentagem de identidade com outras sequências foi determinada (Tabela 3).

I

IV

III

II

Sm Gppp

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 52



AJ243568), Leptomonas seymouri (cód. acesso: AJ243569), Leptomonas collosoma

(cód. acesso: AF006632), Crithidia fasciculata (cód. acesso: AF182356). As setas

indicam as seqüências consenso, nas quais as letras em maiúsculo indicam

identidade entre todas as seqüências (caixas em preto) e as minúsculas identidade

em algumas seqüências (caixas em cinza).

Tabela 3: Porcentagem de alinhamento entre as sequências de U5 snRNA de T.

cruzi com diferentes tripanosomatídeos.

T. brucei L. seymouri L. collosoma C. fasciculata

T. cruzi 55 47 48 47 T. brucei 52 56 50 L. seymouri 68 76 L. collosoma 66

A porcentagem de identidade entre as seqüências dos tripanosomatídeos

analisados variou de 47 a 76%. Em relação aos outros snRNAs, a sequência de U5

mostrou ser a menos conservada, com exceção da região próxima à posição 20 do

alinhamento (Figura 19), que segundo Bell & Bindereif (1999) é uma região

altamente conservada entre os tripanosomatídeos. Entre T. cruzi e T. brucei, a


porcentagem de identidade foi de 55%, sendo que a seqüência de T. brucei

apresentou identidade de 56% com L. collosoma, maior do que T. cruzi.

A árvore filogenética (Figura 19) apresentou altos valores de confiança

(bootstrap 97), mostrando que T. cruzi e T. brucei encontram-se próximos

evolutivamente, havendo uma distância maior em relação aos outros

tripanosomatídeos. C. fasciculata foi definida como outgroup e os valores de

fidelidade dos ramos estão indicados como valores de bootstrap de 1000

replicações.



AY894523), Trypanosoma brucei (cód. acesso: AJ243568), Leptomonas seymouri

(cód. acesso: AJ243569), Leptomonas collosoma (cód. acesso: AF006632), Crithidia

fasciculata (cód. acesso: AF182356).

A estrutura secundária para U5 snRNA de T. cruzi também foi predita e

apresenta-se na Figura 20. O cap 5´ (Gppp) e a região Sm estão representados na

figura. A estrutura apresentou semelhança com aquelas propostas para T. brucei, L.

seymouri e L. collosoma (Bell & Bindereif 1999), possuindo somente um loop.

T.cruzi

T.brucei

L.collosoma

L.seymouri

C.fasciculata

95

100

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 54


37OC). O sítio Sm e o cap 5’ (Gppp) estão indicados.

5.4.4. U6 snRNA

As sequências obtidas para os produtos de RT-PCR e PCR de U6 snRNA

foram idênticas, apresentando 101 pb. O alinhamento foi realizado (Figura 21) e as

porcentagens de identidade entre as seqüências estão apresentadas na tabela 4.

Gppp Sm




X13017), Leishmania tarentolae (cód. acesso: AF305715), Leishmania mexicana

(cód. acesso: X82228), Leptomonas seymouri (cód. acesso: X78552), Leptomonas

collosoma (cód. acesso: X79014), Crithidia fasciculata (cód. acesso: X78551),

Phytomonas sp (X82229). As setas indicam as seqüências consenso, nas quais as

letras em maiúsculo indicam identidade entre todas as seqüências (caixas em preto)

e as minúsculas identidade em algumas seqüências (caixas em cinza).

Tabela 4: Porcentagem de alinhamento entre as sequência de U6 snRNA de T. cruzi

com diferentes tripanosomatídeos.

T. brucei L. tarentolae L. mexicana L. seymouri L. collosoma C. fasciculata Phytomonas sp

T. cruzi 89 91 91 92 90 89 87 T. brucei 97 97 96 95 94 92 L. tarentolae 100 99 98 97 95 L. mexicana 99 98 97 95 L. seymouri 98 97 95 L. collosoma 97 97 C. fasciculata 94

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 56

A seqüência de U6 snRNA de T. cruzi apresentou-se bastante conservada em

relação aos tripanosomatídeos analisados, mostrando aproximadamente 87 - 92%

de identidade com outras sequências. O T. cruzi apresentou identidade maior com

Leishmanias e Leptomonas do que com T. brucei, cuja identidade com outros

tripanosomatídeos ficou em torno de 95%.

Apesar dos valores de bootstrap apresentarem-se baixos na árvore

filogenética (Figura 22), ainda são valores aceitáveis. Observa-se novamente que T.

cruzi e T. brucei apresentaram proximidade evolutiva para esse gene e o mesmo

ocorrendo com as Leishmanias. C. fasciculata foi definida como outgroup e os

valores de fidelidade dos ramos estão indicados como valores de bootstrap de 1000

replicações.



AY894521), Trypanosoma brucei (cód. acesso: X13017), Leishmania tarentolae

(cód. acesso: AF305715), Leishmania mexicana (cód. acesso: X82228), Leptomonas

seymouri (cód. acesso: X78552), Leptomonas collosoma (cód. acesso: X79014),

Crithidia fasciculata (cód. acesso: X78551), Phytomonas sp (X82229).

T.cruzi

T.brucei

L.tarentolae

L.mexicana

L.seymouri

L.collosoma

Phytomonas sp

C.fasciculata

56

56

85

64


A estrutura secundária de U6 snRNA de T. cruzi foi predita conforme

mostrado na figura 23. O cap 5´ (Gppp) está representado na figura. Os loops I e IV

apresentaram semelhança com a estrutura proposta para U6 snRNA de T. brucei.

(Mottram 1989). Assim, os loops II e III não se formam por ser uma provável região

de interação com U4 snRNA (assinalada na figura 23 por linhas duplas).



indicados. A seqüência assinalada com linhas duplas refere-se à região de interação

com U4 snRNA.

5´ Gppp

IV

III

II

I

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 58

5.4.5. UsnRNAs T. cruzi X H. sapiens

As seqüências de U2, U4, U5 e U6 snRNAs foram alinhadas com as suas

respectivas seqüências presentes em humanos como apresentado na figura 24.

A) U2 snRNA

B) U4 snRNA


C) U5 snRNA

D) U6 snRNA

Figura 24: Alinhamento da seqüência de nucleotídeos de U2 (A), U4 (B), U5 (C) e U6

(D) snRNAs de Trypanosoma cruzi (cód. acesso: AY205287, AY894522, AY894523

e AY894521 para U2, U4, U5 e U6 snRNA, respectivamente) com Homo sapiens

(cód. acesso: X59360, X59361, X04215 e X59362, para U2, U4, U5 e U6 snRNA,

respectivamente). As setas indicam as seqüências consenso, nas quais as letras em

maiúsculo indicam identidade entre todas as seqüências e da mesma forma, as

caixas em preto. As caixas em cinza indicam ausência de identidade.

As sequências apresentaram 50, 48, 19 e 60% de identidade com U2, U4, U5

e U6 snRNAs de humano, respectivamente. Para U2 snRNA, em humanos observa-

se a presença de 38 nts a mais do que na sequência de T. cruzi (Figura 24, A). Na

extremidade 5’ existe uma região relativamente conservada do nucleotídeo 1 até o

85 e na região seguinte, até a posição 134 do alinhamento, encontra-se uma região

presente somente em snRNA humano.

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 60

A seqüência de U4 snRNA humano apresenta 42 nts a mais que na

seqüência de T. cruzi, enquanto a região do nt 91 até 117 mostrou-se exclusiva em

snRNA humano (Figura 24, B).

Entre as seqüências de snRNAs analisadas, a U5 foi a que apresentou menor

identidade em relação à humana (Figura 24, C); U5 snRNA de T. cruzi apresenta 50

pb, enquanto que a humana possui 116 pb. A seqüência do nt 1 até 63 foi exclusiva

em U5 snRNA humano.

A seqüência de U6 snRNA foi a mais conservada entre H. sapiens e T. cruzi,

apresentando também tamanho semelhante, em torno de 100 pb (Figura 24, D).

Embora altamente especulativo, poder-se-ia supor que tais diferenças entre

as seqüências, especialmente U2, U4 e U5 possam dever-se ao seu envolvimento

na formação dos diferentes spliceossomos para o processamento dos mRNAs de

cada espécie (cis-splicing em humanos e trans-splicing em tripanosomas).

Entretanto, mais estudos devem ser realizados para o entendimento do

envolvimento dessas estruturas na reação de trans-splicing em T. cruzi.

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UsnRNAs EM T. cruzi – Conclusões_______________ 61

6. CONCLUSÕES

Os dados apresentados neste trabalho permitiram as seguintes conclusões:

1. A reação de RT-PCR permitiu a amplificação das seqüências de U2 e U6

snRNAs de T. cruzi;

2. A reação de PCR com DNA genômico de T. cruzi possibilitou a amplificação

das seqüências de U4, U5 e U6 snRNAs;

3. Todos os produtos de PCR foram clonados e sequenciados; as seqüências

obtidas corresponderam aos snRNAs esperados;

4. Todas as seqüências obtidas alinharam-se com as respectivas seqüências de

tripanosomatídeos, com porcentagem de identidade acima de 70%, com

exceção de U5 snRNA que se mostrou a seqüência menos conservada;

5. Todas as árvores filogenéticas dos snRNAs estudados mostraram

proximidade evolutiva entre T. cruzi e T. brucei;

6. As estruturas secundárias preditas para T. cruzi apresentaram semelhança

com àquelas preditas para T. brucei;

7. As seqüências de snRNAs de T. cruzi alinharam-se com as seqüências de

Homo sapiens, apresentando regiões que são exclusivas para H. sapiens em

U2, U4 e U5 snRNAs. U6 snRNA apresentou-se conservada entre as duas

espécies;

8. Até o momento não foi possível a obtenção e clonagem de U1 snRNA de T.

cruzi pela metodologia de RT-PCR.

AMBRÓSIO, D. L. _________________________________________________________ 62

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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