Caracterização geral, genética e Caracterização geral, genética e bioquímica da microalga bioquímica da microalga Neochloris Neochloris

oleoabundansoleoabundans, visando a produção de , visando a produção de biodieselbiodiesel

Aluna: Raíssa Estrela Curado

Co-orientadora: Laudiene Meyer

• Problemática do carbono - combustíveis fósseis • Biodiesel• Considerações gerais acerca das microalgas

– Por que ainda não são utilizadas?– Como torná-las utilizáveis?– Neochloris oleoabundans

• Genômica de microalgas• Transcriptômica de microalgas• Manipulação genética e das condições de

cultivo

Introdução

• Reajustes constantes no preço do barril de petróleo

• Crise ambiental

Problemática do carbono e combustíveis fósseis

Introdução

O longo prazo requerido para a

formação de combustíveis fósseis

torna todo o processo de uso destes, insustentável

California Energy Commission, 2004

• Emissão vs. Fixação de CO2 neutro curtos prazos para o fechamento do ciclo.

BiodieselBiodieselintrodução

• Mundo Colza, girassol, soja• Brasil lei 11.097/2005 – Soja

– 2008 B2 – 2013 B5

BiodieselBiodieselintrodução

Problemas...Problemas...• Deslocamento das

fronteiras agrícolas• EUA: a total substituição

do petrodiesel por biodiesel consumido em transporte exigiria que 48% de toda a área cultivável dos EUA fosse voltada exclusivamente para o plantio de palma (Chisti, 2007)

• Baixa produtividade • Baixa eficiência

fotossintética

• Grande diversidade• Unicelulares• Altas taxas de crescimento

– EUA: 2-6% área cultivável• Alta eficiência fotossintética• Não competem por solos• Menor requerimento hídrico

Nova vertente: microalgasNova vertente: microalgasintrodução

200 a 300X Mais óleo

Área 100X menor

• Alimentação humana • Atualmente, no Brasil aqüicultura

• Altos custos implantação• Necessidade de melhor desempenho

Por que ainda não são Por que ainda não são utilizadas?utilizadas?

introdução

Como torná-las utilizáveis?Como torná-las utilizáveis?

Biorrefinaria• EUA, Canadá e

Alemanha colza e soja– Aproveitamento

total da biomassa

Manipulação• Condições de cultivo• Interferência em vias

metabólicas

introdução

• Microalga verde – C. reinhardti• Revisão bibliográfica (Griffiths e Harrison 2008; Tornabene et al. 1983; Li

et al. 2008; Band 1992)

– Alta produtividade lipídica (32% a 54%)– Bom perfil lipídico– Pouco estudada

Neochloris oleoabundansNeochloris oleoabundansintrodução

oleaginosa Teor de óleo %

soja 18-20girassol 35-45mamona 45-50palma 45-50

amendoim 45-50

• Nuclear: NCBI 9

• Cloroplasto:– Chlamydomonas reinhardtii,

Chaetosphaeridium globosum, Chlorella vulgaris e Mesostigma viride

Genômica de microalgasGenômica de microalgasintrodução

Espécie Tamanho Status Data Quem

Chlamydomonas reinhardtii 120M Draft

assemblyset/05 Department of Energy's Joint Genome

Institute

Chlorella sp. NC64A40M

in progress  Department of Energy's Joint Genome

Institute

Chlorella vulgaris 40M

in progress  Department of Energy's Joint Genome

Institute

Coccomyxa sp. C-169 

in progress  Department of Energy's Joint Genome

Institute

Dunaliella salina 

in progress  Department of Energy's Joint Genome

Institute

Micromonas pusilla   draft

assemblyfev/08 Department of Energy's Joint Genome

InstituteOstreococcus 'lucimarinus'

13M draft assembly

jul/08 Department of Energy's Joint Genome Institute

Ostreococcus sp12M draft

assemblymai/08 Department of Energy's Joint Genome

Institute

Volvox carteri 120M

in progress  Department of Energy's Joint Genome

Institute

• 21 trabalhos – diferentes fotoperíodos (Ledford et al. 2004)– situações de privação de nutrientes

• fósforo (Moseley et al. 2006)• enxofre (Nguyen et al. 2008)

Transcriptoma de microalgasTranscriptoma de microalgasintrodução

Manipulação • Cultivo• Nitrogênio, silício• Manipulação de

condições, como o pH, intensidade luminosa, temperatura, agitação

• Genética• 25 espécies passíveis

de transformação genética

• Técnicas de transformação, genes marcadores selecionáveis, promotores e genes repórteres disponíveis

Objetivos• Geral:

– Caracterização geral, genética e bioquímica da espécie estudada, visando identificar condições ambientais, genes e vias metabólicas com papéis importantes na produtividade lipídica

FotobiorreatorFotobiorreator Objetivos

B

Caracterização geralCaracterização geral

Condições de cultivo

- privação de nutrientes (nitrogênio)- em presença e ausência de glicose- em diferentes concentrações de CO2-em diferentes intensidades luminosas- em diferentes temperaturas...

medições de biomassa, produtividade lipídica,eficiência fotossintética e perfil lipídico

Condições ótimas!

Objetivos

Caracterização genéticaCaracterização genética

Extração de DNA

Seqüenciamento

Seleção das condições

ótimas

Extração de RNA

Microarray

Análise dos dados

Análise dos dados

Genes alvos Manipulação?

Objetivos

Caracterização BioquímicaCaracterização Bioquímica

Ativadores/inibidores de fotossíntese e síntese lipídica

Caracterização de complexos enzimáticos envolvidos nestes processos

Medições de atividade enzimática

Objetivos

Chlorella luteo-viridis e Neochloris oleoabundans

• Meios• Curvas de crescimento• Microscopia • Extraçao de lipidios

Resultados preliminaresResultados preliminares

Resultados preliminaresMeiosMeios

•Chlorella•Bristol •Proteose

•Proteose•Soil Extract•Soil Extract (- Soil + Fe)•Bristol• Soil Extract modificado•BBM

Observações

Curvas de crescimentoCurvas de crescimentoShaker vs. Bancada

Resultados preliminares

10mM NaNo3 vs. 5mM NaNO3

Curvas de crescimento – Curvas de crescimento – AgitaçãoAgitação

Curvas de crescimento - Curvas de crescimento - NitrogênioNitrogênio

10mM papel AL y = 0,1501Ln(x) - 0,1166R2 = 0,5202

-0,2-0,1

00,10,20,30,40,50,6

0 5 10 15

dias

A75

0nm Série1

Log. (Série1)

5mM papel Al y = 0,1812Ln(x) - 0,173R2 = 0,5587

-0,4-0,2

00,20,40,6

0 5 10 15

dias

A75

0nm Série1

Log. (Série1)

y = 0,1501Ln(x) - 0,1166R2 = 0,5202

y = 0,1812Ln(x) - 0,173R2 = 0,5587

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15

Neo - TesteNitrogênio - BBM10mM (Papel Al)

Neo - TesteNitrogênio - BBM5mM (Papel Al)

Log. (Neo - TesteNitrogênio - BBM10mM (Papel Al))

Log. (Neo - TesteNitrogênio - BBM5mM (Papel Al))

Contagem e pesagem de células

• Contagem – Neubauer– Vs. Abs e peso seco

• Pesagem – em aprimorando– Centrifugação – papel Alumínio – estufa 24h

A750nm

Peso (g/mL)

Peso (g/mL)

Nº cél/mLNº cél/mL

A750nm

MicroscopiaMicroscopia

Azul de Toluidina Vermelho neutro

Próximos passos• Extração de lipídios e cromatografia - ok• Fotobiorreator• Curvas de crescimento em privação de nitrogênio - ok• Extração de DNA - ok• Curvas de crescimento com glicose…

Obrigada!