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Susana Isabel Oliveira Lopes
Caracterização clínica e virológica do efeito do interferon peguilado e ribavirina no retratamento da hepatite C crónica
em doentes récidivantes e nâo respondedores a tratamentos prévios de combinação
Porto 2004
MESTRADO EM MEDICINA MOLECULAR DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO
Caracterização clínica e virológica do efeito do interferon
peguilado e ribavirina no retratamento da hepatite C
crónica em doentes récidivantes e não respondedores
a tratamentos prévios de combinação
Susana Isabel Oliveira Lopes
Porto 2004
DISSERTAÇÃO DE CANDIDATURA AO GRAU DE MESTRE APRESENTADA À FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO
Artigo 48°, § 3 - A Faculdade não responde pelas doutrinas expendidas na dissertação. (Regulamento da Faculdade de Medicina do Porto - Decreto n° 19337, 29 de Janeiro de 1931)
ÍNDICE
1. Agradecimentos - 5
2. Abreviaturas 6
3. Introdução 7
3.1. O vírus da hepatite c: biologia, estrutura 9
e patogenicidade
3.2. Doença hepática, doença multissistémica 28
3.3. Os tratamentos actuais: eficácia e limites do 31
interferon peguilado e da ribavirina
4. Objectivos do trabalho da Tese de Mestrado 49
5. Material e Métodos 51
6. Resultados 56
6.1. Sumário dos resultados ' 75
7. Discussão 78
8. Conclusões 90
9. Resumo 93
10. Bibliografia 97
AGRADECIMENTOS
1. AGRADECIMENTOS
Ao Doutor Guilherme Macedo, orientador da Tese de Mestrado, pela atitude
entusiástica, disponível e incentivadora que sempre demonstrou ao longo deste
percurso.
Ao Prof. Doutor Manuel Sobrinho Simões, pelo exemplo de motivação.
Ao Prof. Doutor António Luís Tomé Ribeiro e ao Prof. Doutor Fernando
Ta varela Veloso, por terem possibilitado a execução deste trabalho.
Ao Dr. Fernando Araújo, responsável pelo Centro de Biologia Molecular do
Serviço de Imunohemoterapia do H. São João, pela sua disponibilidade e
ensinamentos na análise dos parâmetros virológicos, e pela simpatia com que
sempre nos recebeu.
Ao Dr. Fernando Azevedo, pelo seu contributo empenhado no tratamento
estatístico dos dados obtidos.
À Dra. Eva Martins e à Dra. Maria Manuel Beleza, dos Serviços Farmacêuticos
do H. São João, pela grande disponibilidade demonstrada, e por terem
facultado todas as condições institucionais para a obtenção dos meios
adequados para o tratamento dos nossos doentes.
À Alzira Vila Real, pela sua dedicação amiga.
À Alfredina Cardoso, da Consulta Externa de Gastrenterologia, pelo apoio
administrativo prestado, fundamental para vencer tantas dificuldades
logísticas.
Aos meus pais, pela sua presença constante, pela sua confiança inabalável e
estímulo em tantos momentos e tantas privações.
5
2. ABREVIATURAS
ADN - Ácido desoxirribonucleico ALT - Aminotransferase da alanina APC - Células apresentadoras de antigénio ARN - Ácido ribonucleico ARNase - Enzima ribonuclease ARNm - Ácido ribonucleico mensageiro AST - Aminotransferase do aspartate cADN - Ácido desoxirribonucleico complementar CM - Crioglobulinemia mista d.p. - Desvio padrão HVR - Região hipervariável IFN - Interferon IL - Interleucina IMC - índice de massa corporal ISDR - Interferon sensitivity determining region LDL - Lipoproteína de baixa densidade LSN - Limite superior da normalidade LT - Linfócitos T MHC - Complexo major de histocompatibilidade NK - Natural killer NS - Não estruturais OAS - Oligoadenilato sintetase ORF - Open reading frame PCR - Polymerase chain reaction PCT - Porfiria cutânea tarda PEG-IFN - Peginterferon (Interferon peguilado) PKR - Proteína cínase R RBV - Ribavirina RVS - Resposta virológica sustentada UTR - Untranslated region VHB - Virus da hepatite B VHC - Virus da hepatite C VHD - Virus da hepatite D VIH - Vírus da imunodeficiência humana VLDL - Lipoproteína de muito baixa densidade
INTRODUÇÃO
3. INTRODUÇÃO
Após a identificação dos vírus da hepatite A e da hepatite B na década de 70,
tornou-se evidente que algumas formas de hepatite não se correlacionavam
etiologicamente com aqueles dois vírus12. Esta entidade passou a ser
denominada de hepatite não-A não-B até 1989, quando o vírus da hepatite C
(VHC) foi identificado por técnicas de biologia molecular3. Seguiu-se o
desenvolvimento de testes serológicos capazes de detectar a presença de
anticorpos anti-VHC, o que permitiu uma redução drástica na incidência de
hepatite pós-transfusional.
A infecção pelo VHC é uma das principais causas de morbilidade hepática,
existindo actualmente em todo o mundo cerca de 170 milhões de indivíduos
infectados, o que constitui aproximadamente 3% da população mundial4. Em
Portugal estima-se que 1,5% da população seja positiva para o an ti-VHC5"7.
Nos países industrializados, após ter sido estabelecido o controle dos produtos
derivados do sangue, o principal grupo de risco para a infecção pelo VHC
passou a ser o grupo dos toxicodependentes, com taxas de infecção de 80%89.
Em cerca de 15-30% dos indivíduos infectados permanece por identificar o
factor de risco de contágio.
O grande impacto da hepatite C em termos de saúde pública reside na sua
evolução para a cronicidade na maioria dos doentes infectados, com valores que
podem atingir os 85 %10"12. Uma das dificuldades em controlar esta evolução
prende-se com as características da infecção aguda, que é assintomática em 70-
85% dos casos. Dos indivíduos com infecção crónica, a progressão da fibrose
faz-se de forma muito variável, com indivíduos que podem evoluir para cirrose
7
INTRODUÇÃO
rapidamente, enquanto que outros permanecem em estádios precoces após 20
anos ou mais de infecção. Nesta evolução parecem ter maior importância
factores relacionas com o hospedeiro, do que as características do vírus
infectante. As estimativas apontam para uma evolução para cirrose em 20% dos
indivíduos com infecção crónica13, com uma incidência anual de 3%-4% de
hepatocarcinoma, nos indivíduos cirróticos14.
A década de 90, graças aos avanços no domínio das técnicas de biologia
molecular, foi particularmente florida em termos de conhecimento vírico. Foi
possível a caracterização genómica e estrutural do vírus, um maior
conhecimento dos seus mecanismos patogénicos, a compreensão do espectro
das suas manifestações clínicas, hepáticas e extrahepáticas, e o seu papel na
carcinogénese hepática.
O maior conhecimento em termos de estrutura e ciclo de vida vírico,
mecanismos patogénicos e resposta imunológica suscitada no hospedeiro,
permitiu a utilização de novos fármacos e novos esquemas terapêuticos.
Um dos marcos no tratamento da hepatite C foi a associação da ribavirina
(RBV) ao interferon (IFN), permitindo alcançar taxas de resposta de cerca de
45 %15-16.
Uma nova etapa foi alcançada nos últimos anos, no âmbito do tratamento desta
doença, com a introdução da molécula peguilada de interferon.
Apesar destes avanços significativos persistem muitas dificuldades na
orientação dos doentes com hepatite crónica C, pela eficácia relativa dos
regimes terapêuticos, pelos efeitos laterais que condicionam e que por vezes são
limitativos, e pela necessidade de uma melhor compreensão da biologia
molecular da infecção pelo VHC, bem como do próprio ciclo de vida do vírus.
O futuro do conhecimento da hepatite C deverá passar pelo desvendar dos
segredos e mecanismos de escape do vírus às respostas imunológicas do
hospedeiro e às acções dos fármacos disponíveis.
8
INTRODUÇÃO
3.1. O VÍRUS DA HEPATITE C: BIOLOGIA, ESTRUTURA E
PATOGENICIDADE
O vírus da hepatite C é um vírus de ARN (ácido ribonucleico) que infecta cerca
de 170 milhões de pessoas a nível mundial4. É um vírus particular pela sua
capacidade em manter uma infecção crónica e desenvolver mecanismos que lhe
permitem um escape às respostas de defesa do hospedeiro. A evolução da
infecção para a cronicidade, com estabelecimento de cirrose hepática e
carcinoma hepatocelular, torna-a uma das principais causas de transplante
hepático, com grande repercussão em termos médicos e socio-económicos.
Apesar da descoberta do VHC há mais de uma década, o seu conhecimento tem
sido dificultado pela não existência de sistemas de cultura celular, o que
condicionou a incapacidade na criação de uma vacina protectora, e limitou as
opções terapêuticas17. Os progressos da biologia molecular possibilitaram um
conhecimento da estrutura vírica mas ainda não foram capazes de desvendar na
totalidade os mecanismos de infecção e replicação vírica intracelular, de
persistência da infecção, e de patogénese da doença hepática.
Genoma vírico e processamento proteico
O VHC é um vírus ARN, com invólucro, da família Flaviviridae, género
Hepacivinis, capaz de causar nos humanos uma doença hepática aguda e
crónica, incluindo hepatite crónica, cirrose e hepatocarcinoma, bem como
manifestações sistémicas.
9
INTRODUÇÃO
O seu genoma é constituído por uma cadeia única de ARN, formada por 9600
nucleotídeos, e polaridade positiva3. Esta cadeia contém uma única open reading
frame (ORF), que codifica uma poliproteína de 3010 a 3033 aminoácidos,
dependendo do genótipo. Nas extremidades da ORF localizam-se as regiões 5' e
3' untranslated (UTR), com cerca de 340 e 230 nucleotídeos de extensão,
respectivamente. A estrutura destas regiões 3' e 5' é altamente conservada e
necessária à transdução da poliproteína e replicação vírica. A poliproteína
precursora é posteriormente processada a nível do retículo endoplasmático de
forma a dar origem a 10 proteínas maduras. As proteínas estruturais consistem
nas proteínas do invólucro El e E2, e na proteína do core, que forma o
nucleocapsideo vírico. O peptideo p7 separa as proteínas estruturais das não
estruturais (NS), que incluem as proteínas NS2 a NS5B, e que estão envolvidas
no processamento da poliproteína e na replicação vírica. A proteinase NS2-NS3
dependente do zinco, e a proteinase da serina NS3, são responsáveis pela
clivagem da poliproteína NS nas suas diversas proteínas constituintes. O
terminal C da proteína NS3 possui actividade helicase do ARN e NTPase. A
NS4B é uma proteína de membrana cuja função não é totalmente conhecida e
parece estar envolvida na adesão vírica à membrana hepatocitária; a funçaõ da
proteína NS5A não é conhecida, e a proteína NS5B tem actividade polimerase
do ARN dependente do ARN.
Ciclo de vida
A inexistência de sistemas de cultura in vitro dificultou até á actualidade o
verdadeiro conhecimento dos mecanismos moleculares da replicação vírica. Os
mecanismos de adesão e invasão celular permanecem parcialmente
desconhecidos e o ciclo replicativo baseia-se na analogia com outros vírus ARN
10
INTRODUÇÃO
de cadeia mais da família Flaviviridae. A adesão à célula alvo
(fundamentalmente hepatócitos, mas também células mononucleares
periféricas e gânglios linfáticos) provavelmente envolve interacções entre as
proteínas El e E2 e moléculas celulares que actuam como receptores. A
identidade destes receptores permanece especulativa, sendo implicados os
receptores das lipoproteínas de baixa densidade, o CD 81 e
glicosaminoglicanos18. Após a endocitose as proteínas El e E2 são responsáveis
pela fusão da membrana vírica com a membrana do endossoma, permitindo a
libertação do nucleocapsideo para o citoplasma19. O nucleocapsídeo é em
seguida "descapsulado" (uncoated) e o ARN vírico fica disponível para se ligar
ao ribossoma e iniciar a transdução com a formação da poliproteína vírica.
Após clivagem da poliproteína por proteases víricas e celulares, as proteínas
víricas permanecem associadas a membranas intracelulares, formando uma
rede membranosa. Esta rede membranosa, em associação com as proteínas NS3-
NS5B, forma o complexo replicativo20. Neste complexo, a cadeia ARN mais é
utilizada para a síntese da cadeia menos de ARN, que posteriormente serve de
modelo à síntese de novas cadeias mais. As cadeias de ARN recém formadas
ligam-se às proteínas do core sintetizadas e constituem novos nucleocapsídeos
víricos. O reconhecimento de que as proteínas do envólucro não são
transportadas para além do Golgi, pressupõe que as novas partículas víricas
sejam formadas no interior do retículo endoplasmático, onde os
nucleocapsídeos víricos adquirem o seu envólucro19. Provavelmente a
eliminação dos vírus do interior da célula faz-se através dos mecanismos
secretores celulares.
Cada um dos passos do ciclo de vida vírico constitui um alvo potencial para a
terapêutica antivírica. As 3 principais enzimas víricas, a protease da serina NS3,
a helicase NS3 e a polimerase NS5B, são por assim dizer, os alvos intensamente
estudados com o objectivo do desenvolvimento de fármacos capazes de
inibirem a replicação do ARN e o processamento da poliproteína vírica. As
11
INTRODUÇÃO
regiões 5'e 3 ' UTR, pela sua elevada conservação, são também alvos potenciais
de intervenção terapêutica, com o desenvolvimento de oligonucleotideos
antisense ou ribozimas capazes de inibirem a replicação vírica.
Morfologia vírica e proteínas estruturais
Supõe-se que, por analogia a outros flavivírus, a estrutura do VHC seja
icosahédrica, com o ARN genómico no interior, rodeado por múltiplas cópias
da proteína do core, que constituem o nucleocapsídeo, e na superfície pelas
proteínas do envólucro El e E2. Estudos por microscopia electrónica de
partículas víricas detectadas em culturas celulares ou isoladas no plasma,
demonstraram a existência de vários tipos de partículas com diâmetros entre 30
e 50 nm21'22. Para além da partícula vírica completa isolada, existem partículas
associadas a imunoglobulinas, lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e
lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL)23, partículas do core, e
partículas de nucleocapside sem envólucro.
Proteína do core
Reconhece-se actualmente que a função da proteína do core não se limita à
formação do nucleocapsídeo, estando envolvida na modulação da transcrição
de genes, proliferação e morte celular, sinalização celular, metabolismo lipídico
e supressão da resposta imune do hospedeiro24"26. Há um conjunto crescente de
evidências a implicar esta proteína na patogénese do carcinoma hepatocelular27.
Foram descobertas recentemente formas alternativas da proteína do core,
resultantes de mutações na região codificadora do core no ARN. Estas proteínas
quiméricas ocorrem durante a infecção natural pelo VHC coexistindo com as
proteínas do core "selvagens", e poderão abrir novas perspectivas no combate à
doença.
12
INTRODUÇÃO
Glicoproteínas do envólucro El e E2 e peptídeo p7
As glicoproteínas El e E2 participam na organização da partícula vírica, na
adesão e entrada do vírus na célula e induzem a fusão entre o envólucro vírico e
a membrana do endossoma. Ambas as proteínas são do tipo transmembranar,
com um ectodomínio na extremidade N e um domínio transmembranar na
extremidade C. Os aminoácidos iniciais do ectodomínio E2 formam a região
hipervariável 1 (HVR1), possuidora de uma diversidade aminoácida que pode
atingir os 80X.28 A grande variabilidade desta região resulta da selecção de
variantes de escape à pressão imune desencadeada pelos anticorpos. Não existe
correlação entre a variabilidade da HVR1 e o genótipo, carga vírica ou
gravidade da doença hepática. Não é conhecida uma função específica para esta
região, embora pareça participar na entrada do vírus na célula a infectar.
A região hipervariável 2 (HVR2) é uma sequência de 7 aminoácidos, localizada
entre as posições 91-97 da proteína E2 (genótipo 1), com uma diversidade de
100%. Não foi ainda identificada nenhuma função para esta região.
Para além da sua participação no envólucro vírico, a proteína E2 interage com a
proteína cinase activada pelo ARN (PKR), inibindo a sua actividade,
contribuindo para a resistência do VHC ao tratamento com IFN-alfa29.
O pequeno péptideo p7, assim denominado pelo seu peso molecular de 7 kDa,
separa as proteínas estruturais das não estruturais. A sua função e importância
são ainda desconhecidas.
13
INTRODUÇÃO
Proteínas não estruturais e complexo replicativo
O grupo das proteínas não estruturais é mais vasto do que o das proteínas
estruturais e engloba as seguintes proteínas: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e
NS5B.
A proteína NS2 é uma proteína de membrana não glicosilada cuja função, para
além de autocatalizar a sua dissociação da NS3 é desconhecida, não sendo
necessária à formação do complexo de replicação30.
A proteína NS3 é multifuncional, com actividade protease, NTPase e helicase
do ARN. A protease serínica NS3 autocataliza a dissociação NS3/NS4A, e em
conjugação com a proteína NS4A, promove a dissociação das ligações 4A/4B,
4B/5A,e5A/5B.
O domínio helicase NS3 participa no processo de replicação vírica ao separar as
cadeias duplas de ARN em cadeias simples.
Foram identificados alguns epitopes imunodominantes para a resposta T
helper, com elevada imunogenicidade, e outros com elevada probabilidade de
formar variantes de escape, dificultando a resposta das células T e contribuindo
para a persistência vírica31. Uma mutação no aminoácido 1449, epitope das
células CD8+, da região NS3, foi correlacionada com a cronicidade da
infecção32.
Estudos in vitro, demonstraram algum potencial oncogénico da proteína NS3.
Para além da sua ligação às proteínas víricas NS5B, NS5A e NS4B, a proteína
NS3 interactua com proteínas celulares, incluindo a proteína cinase A e C, p53 e
histonas H2B e H4.
14
INTRODUÇÃO
A proteína NS4A para além de activar e estabilizar a proteinase NS3, promove a
sua ligação à membrana do retículo endoplasmático, interage com as proteínas
NS4B e NS5A e regula a fosforilação da NS5A33.
A proteína NS4B é uma proteína de membrana, com 6 segmentos
transmembranares, de função desconhecida, mas que presumivelmente está
envolvida na replicação vírica34. Participa também na hiperfosforilação da
NS5A33 e parece desempenhar um papel determinante na organização do
complexo replicativo.
A proteína NS5A é uma fosfoproteína associada à membrana, presente na
forma fosforilada e hiperfosforilada. A sua estrutura e função ainda
permanecem desconhecidas, mas as evidências apontam o seu envolvimento no
complexo de replicação vírica. É uma das regiões do VHC com uma
distribuição do tipo quasispecies, sofrendo várias mutações pontuais na região
ISDR (interferon sensitivity determining region), cujo número se parece relacionar
com a resposta ao interferon. Parece que um número mais elevado de mutações
se associa a uma resposta sustentada à terapêutica com interferon35"38. No
entanto nem todos os trabalhos apontam no mesmo sentido39"41 e ainda não foi
encontrada o número nem o tipo de mutação determinante do tipo de resposta.
Actua como inibidora da actividade antivírica induzida pelo IFN ao interactuar
com a PKR42, ao induzir a IL-843, e ao inibir a fosforilação do factor de iniciação
eIF2a.
A sua localização comum com a proteína do core em gotículas lipídicas e a
interacção com a apolipoproteína Al, sugere um potencial envolvimento no
desiquilíbrio do metabolismo lipidico e uma contribuição para a esteatose
hepática.
15
INTRODUÇÃO
A proteína NS5B tem actividade polimerase do ARN, o que lhe confere um
papel fulcral na replicação vírica e por isso constitui um novo foco para o
desenvolvimento de antivíricos.
As interacções directas e indirectas das diferentes proteínas não estruturais
entre si são fundamentais para a organização do complexo replicativo
funcional. Provavelmente fazem também parte deste complexo elementos do
hospedeiro ainda não identificados. A ligação de todas as proteínas não
estruturais à membrana do retículo endoplasmático , faz supor que a formação,
organização e estabilização do complexo replicativo membranar depende da
interacção entre os domínios membranares das proteínas NS. Para além disso, a
produção das proteínas do VHC faz-se na proporção 1:1, ou seja, por cada
proteína El, E2, e do core, igual número de cada uma das proteínas NS é
também sintetizado. A produção de grande quantidade de proteínas NS faz
supor que possuam uma capacidade de oligomerização e formação de inúmeros
agregados de complexos de replicação. Este fenómeno parece ser responsável
pela recentemente descrita alteração ultraestrutural das membranas
intracelulares e pode participar na patogénese do VHC.
16
INTRODUÇÃO
Variabilidade genética e suas implicações clínicas e patogénicas
Em todas as espécies a diversidade genética tem como objectivo e consequência,
a selecção das variantes melhor adaptadas ao meio ambiente. O mesmo se passa
com o VHC, em que a variabilidade genética permite o escape virológico aos
mecanismos de defesa do hospedeiro. A elevada taxa de replicação vírica e a
ausência de capacidade de proofreading da polimerase vírica levam a uma
elevada taxa de mutação, na ordem dos KH-IO"5 por nucleotídeo copiado. Deste
modo, cada molécula de ARN sintetizada possui em média uma mutação44. As
mutações incorporadas nas moléculas menos têm o maior impacto porque são
rapidamente transmitidas a um elevado número de cadeias mais de ARN. O
aparecimento e selecção permanente de novas mutações tem 2 consequências
importantes: por um lado, a selecção de variantes durante a evolução em
populações epidemiológica ou geograficamente distintas, o que conduz à
progressiva diversificação dos genótipos45; por outro lado, a existência de
quasispeciesfieA7rvu.Ta mesmo indivíduo infectado.
a) Genótipos
A análise filogenética das sequências de estirpes do VHC permitiu a
identificação de 6 genótipos víricos e vários subtipos. Os genótipos diferem
entre si em 31-34% da sequência nucleotídica e 30% da sequência de
aminoácidos, enquanto que os subtipos diferem em 20-23% da sequência
nucleotídica, com diferenças significativas dependentes da região genómica48.
A análise dos genótipos e dos subtipos víricos permite determinar as rotas de
propagação do VHC, bem como compreender os seus mecanismos de
diversificação45. A elevada prevalência e diversidade dos genótipos 3 e 6 no
Continente Asiático, e do genótipo 1, 2 e 4 em África, sugere o seu aparecimento
17
INTRODUÇÃO
e diversificação nestas regiões, onde provavelmente se transmitem há muito
tempo entre a população autóctone. Em contraste, a pouca diversidade dos
genótipos infectantes do continente Europeu, Estados Unidos da América,
Japão ou Austrália, sugerem uma aquisição recente da infecção, ainda sem o
mesmo tempo de propagação e diversificação.
Na Europa Ocidental, o genótipo 1 constitui 60-65% das estirpes infectantes, e o
genótipo 3a constitui 20%. Nos últimos anos registou-se um decréscimo da
importância do genótipo lb , devido ao controlo dos produtos sanguíneos, e um
crescimento proporcional dos genótipos la e 3a, cujo modo de contágio é
fundamentalmente o consumo de drogas endovenosas, que constitui cerca de
80% dos novos casos diagnosticados49. Do mesmo modo, tem-se observado um
incremento do genótipo 4a na população dos toxicodependentes endovenosos.
Em termos clínicos, o genótipo vírico não pode ser utilizado como indicador
prognóstico, não influenciando a evolução para a cronicidade, a apresentação
clínica da doença incluindo manifestações extrahepáticas, ou a gravidade das
lesões crónicas, nomeadamente actividade necro-inflamatória e fibrose50.
Aparentemente a única lesão directamente relacionada com o genótipo vírico é
a esteatose, que se associa ao genótipo 3a50<51 e parece estar na dependência da
interacção entre a proteína do core e o metabolismo lipídico52-53.
Em contraste, o genótipo vírico influencia de forma determinante a resposta à
terapêutica antivírica54. Na infecção crónica, a inibição da replicação vírica pelo
IFN é feita de forma mais eficaz para os genótipos 2 e 3 do que para os
genótipos 1 e 4, o que parece traduzir uma resistência intrínseca dos genótipos 1
e 4 à terapêutica antivírica com interferon54. Simultaneamente, é frequente a
ocorrência de um acréscimo na replicação vírica durante as 2 primeiras semanas
de tratamento com interferon peguilado e ribavirina nos genótipos 1 e 4, o que
não está descrito com o genótipo 3. Um dos mecanismos presumivelmente
envolvido na diferente sensibilidade dos vários genótipos ao mesmo esquema
18
INTRODUÇÃO
terapêutico, relaciona-se com a produção de diferentes proteínas com diferentes
funções, entre os vários genótipos, consequência das diferenças nucleotídicas
inter-genómicas. Como as proteínas víricas interactuam com algumas das vias
efectoras antivíricas induzidas pelo IFN, isto explicaria as diferentes
sensibilidades dos vários genótipos ao IFN.
Uma proteína sobre a qual tem recaído a atenção para explicação deste
fenómeno é a proteína não estrutural NS5A. Estudos in vitro sugerem que o
principal mecanismo de resistência vírica ao INF resulta da inibição, pela NS5A,
da PKR induzida pelo INF42-55-56.
O conhecimento actual da sensibilidade à terapêutica do genótipo 1 na infecção
aguda57, sugere a existência de mecanismos complexos de interacção entre o
vírus e o sistema imune do hospedeiro, que justifiquem a resistência durante a
infecção crónica.
b) Quasispecies
As quasispecies do VHC definem-se como "pools" de variantes víricas
geneticamente distintas, embora com uma base genética comum, que infectam o
mesmo indivíduo. O termo variante aplica-se a cada sequência vírica
individual. A diferença genómica das quasispecies é de 1-6%, resultante de
mutações que ocorrem desde o início da infecção, e cuja consequência é a
coexistência de várias variantes em simultâneo. Esta característica do VHC
confere-lhe uma vantagem em termos de sobrevivência, pois a presença
simultânea de múltiplas variantes genómicas e a elevada taxa de aparecimento
de novos "mutantes", permite uma rápida selecção dos vírus mais adaptados a
determinado meio ambiente em determinado momento. A pressão de selecção
ambiental modifica-se frequentemente, de forma espontânea, dependente de
interacções metabólicas no hospedeiro, ou por factores externos, como infecções
intercorrentes, consumo de fármacos ou terapêuticas antivíricas.
19
INTRODUÇÃO
É esta capacidade de transformação do vírus que o torna resistente às
terapêuticas actualmente disponíveis, permitindo o "escape" de uma
subpopulação que perpetua a infecção.
No vírus da hepatite C a região hipervariável 1 (HVR1) constitui a base do
desenvolvimento das quasispecies. A elevada taxa de replicação vírica, a baixa
capacidade de correcção dos erros de replicação pela polimerase do ARN, e a
pressão imunológica do hospedeiro contribuem para o aparecimento de
mutações e diversidade vírica. Os indivíduos com um número elevado de
quasispecies têm maior probabilidade de evolução para a cronicidade e de menor
resposta à terapêutica com IFN58'59. No entanto, ainda não está perfeitamente
estabelecido se a cronicidade se deve ao escape imunológico, ou se a
diversidade e multiplicidade das quasispecies resulta de uma maior taxa de
replicação vírica secundária a uma falência do hospedeiro em controlar a
infecção. A atenuação da magnitude da resposta imune do hospedeiro,
especialmente das respostas celulares citotóxica e Thl, favorece a persistência
da infecção e o desenvolvimento de novas variantes e o seu escape
imunológico60-61.
A complexidade genética das quasispecies pré tratamento antivírico constitui um
factor preditivo independente de resposta sustentada62. Os doentes com uma
complexidade vírica elevada, traduzida por um grande número de
quasispecies, têm uma probabilidade muito reduzida de obterem uma resposta
sustentada, dada a maior probabilidade de uma ou várias variantes pré-
tratamento escaparem aos mecanismos efectores do IFN e serem seleccionadas.
A falência da terapêutica antivírica associa-se a uma alteração na composição
das quasispecies, já que se verificam mutações na HVR1 durante o tratamento
com IFN63, enquanto que o sucesso terapêutico se acompanha de um
decréscimo acentuado do número de variantes de quasispecies previamente à
eliminação vírica64.
20
INTRODUÇÃO
Uma vez que a HVR1 é um dos principais epitopes neutralizantes, é provável
que parte das mutações na HVR1 sejam consequência da pressão exercida pelos
anticorpos neutralizantes anti-VHC, permitindo ao vírus uma fuga permanente
ao controlo imunológico.
Para além da sua importância na persistência da infecção e da sua influência
nas resposta à terapêutica, as quasispecies estão envolvidas na
compartimentalização vírica. Apesar do hepatócito ser o principal local de
replicação vírica, esta ocorre também em células sanguíneas mononucleares e
células dendríticas. Em cada um destes elementos celulares foram identificadas
estirpes víricas com diferentes sequências genómicas, tradutoras de uma
evolução divergente e de uma compartimentalização das quasispecies65'67. Esta
compartimentalização reflecte um tropismo tecidular diferente das várias
quasispecies, reflectindo interacções específicas do genoma ou proteínas víricas
com factores intracelulares, sendo o conteúdo vírico de um determinado tipo
celular diferente do conteúdo vírico dos restantes.
21
INTRODUÇÃO
Imunopatogénese
A resposta imune específica desencadeada pela infecção vírica envolve uma
resposta humoral mediada pelos linfócitos B e uma resposta celular mediada
pelos linfócitos T. As células CD4+ desempenham uma função reguladora da
resposta imune ao activarem os linfócitos B e a produção de anticorpos, e ao
activarem as células dendríticas, que posteriormente activam as células CD8+,
efectoras finais da resposta imune antivírica.
A) Resposta Humoral
Após a infecção pelo VHC verifica-se o aparecimento de anticorpos dirigidos
contra múltiplas proteínas víricas. No entanto, a capacidade de neutralização
destes anticorpos é limitada, devido à rápida selecção de variantes de escape.
Embora sejam eficazes a neutralizar as partículas víricas circulantes, são
incapazes de eliminar os vírus localizados no interior das células68. Ao contrário
dos anticorpos que surgem noutras infecções víricas, a presença de anti-HCV
não significa o estabelecimento de uma imunidade protectora, mas sim a
presença de uma infecção activa. De facto, a maioria dos indivíduos
seropositivos apresenta também ARN do VHC detectável em circulação, e a
presença de anticorpos não impede a reinfecção por estirpes homólogas ou
heterólogas69-70.
Com a resolução da infecção aguda, o título de anticorpos diminui e pode
mesmo desaparecer, o que provavelmente ajuda a compreender o
subdiagnóstico da infecção aguda.
Uma característica da resposta humoral é a sua policlonalidade e
multiespecificidade, traduzida pela existência de anticorpos contra
praticamente todos os antigénios víricos. Os mais frequentes são os dirigidos
22
INTRODUÇÃO
contra as regiões do core, proteína E2 e NS3, que surgem em 90-100%, e as
regiões NS4 e NS5, que surgem em 50-70%. Apesar disso, os anticorpos contra a
região hipervariável (HVR) da proteína E2 parecem ser os que possuem carácter
neutralizante, tendo sido demonstrada a sua capacidade em evitar a infecção71.
Na infecção aguda, o aparecimento de anticorpos anti-HVRl parece relacionar-
se com a resolução da infecção; no entanto, está descrito o aparecimento de
variantes de escape aos anti-HVRl, que condicionam uma evolução da infecção
para a croniddade72.
A reacção imunológica humoral contra o VHC é limitada, e os anticorpos são
produzidos em títulos baixos, comparativamente com a resposta a outras
infecções.
Relativamente ao seu papel na patogénese da doença hepática, as informações
actualmente existentes são limitadas. Alguns relatos sugerem uma progressão
mais rápida da doença hepática em indivíduos com hipogamaglobulinemia73"75,
com probabilidade de evolução para cirrose num curto período de tempo. Por
outro lado, o aparecimento precoce de anticorpos contra a região hipervariável
da proteína E2 associar-se-ia a um curso autolimitado da infecção, enquanto
que uma maior distribuição inicial de quasispecies seria indicador de persistência
da infecção76. Outros estudos demonstraram a diminuição ou eliminação de
determinados anticorpos (anti-NS4 e IgM anti-core) na presença de resposta ao
IFN77. No entanto, actualmente parece ainda prematuro estabelecer uma relação
definitiva entre os títulos de anticorpos e as manifestações clínicas, não havendo
dados suficientes para o estabelecimento de um mecanismo patogénico comum.
Apesar dos inúmeros avanços no conhecimento da infecção pelo VHC,
permanece por definir o papel dos anticorpos no controlo da infecção e na
patogénese da doença hepática, embora seja de supor que a sua expressão
deficiente seja responsável pela persistência vírica.
23
INTRODUÇÃO
B) Resposta Celular
Uma vez que a imunidade humoral não é suficiente na erradicação do VHC, a
resolução da doença depende de uma resposta celular coordenada e eficaz.
A resposta imunológica específica engloba células CD4+ e CD8+ estimuladas
pela apresentação de antigénios víricos processados pelas células
apresentadoras de antigénios (APC).
As células CD4+ subdividem-se em TM, Th2, e ThO. As células Thl segregam
citocinas pró-inflamatórias (IL-2, IL-3, TNF-0, IFN-y), cuja acção amplifica a
actividade inflamatória desenvolvida pelos macrófagos, e a citotoxicidade das
células CD8+ e natural killer (NK). Por seu lado as células Th2, participam na
resposta humoral, sintetizando IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13, que
estimulam os linfócitos B na presença de antigénios específicos, induzindo a
síntese de imunoglobulinas. Estas citocinas promovem um feed-back negativo
sobre as respostas Thl , conduzindo a uma tolerância imunológica. As células
ThO segregam um padrão misto de citocinas, podendo funcionar como
percursores dos fenótipos Thl ou Th2, ou manterem-se como uma linha celular
estável e diferenciada.
Nas doenças infecciosas, o equilíbrio entre uma resposta Thl e Th2 condiciona a
evolução da infecção. A polarização da resposta para Thl associa-se a um
combate activo à infecção, enquanto que uma resposta Th2, pode conduzir à
persistência da infecção e progressão para a cronicidade.
Na hepatite C, a resolução da infecção aguda associa-se a uma resposta celular
do tipo Thl, enquanto que a evolução para a cronicidade se acompanha de uma
preponderância da resposta Th278.
Na infecção aguda, detectam-se células CD4+ específicas para o VHC, tanto no
fígado, como na circulação periférica. A resposta linfocitária periférica
correlaciona-se com a evolução clínica, na medida em que uma resposta
linfocitária específica, sustentada e vigorosa, se associa a um clearance vírico. Em
24
INTRODUÇÃO
contraste, nos indivíduos que evoluem para a cronicidade, a resposta CD4+ é
fraca, transitória e pouco expressiva.
Nos indivíduos com doença crónica, a resposta CD4+ é dirigida contra o
antigénio do core, em contraste com os indivíduos com infecção autolimitada,
em que a resposta é fundamentalmente direccionada para os antigénios não
estruturais (NS3, NS4, NS5)79-80. Embora não exista correlação evidente entre a
resposta CD4+ intrahepática e os parâmetros clínicos, a intensidade da resposta
periférica associa-se a um curso clínico mais benigno79'80. Para além disso, a
eliminação vírica com a terapêutica com IFN, acompanha-se por um aumento
sustentado da resposta proliferativa CD4+ VHC-específica81'82.
Outro tipo celular com papel preponderante na infecção pelo VHC são os
linfócitos T CD8+. Estas células são o último elo da via efectora da resposta
imune, conduzindo directa ou indirectamente à morte da célula infectada. Na
infecção aguda, uma resposta precoce e multiespecífica CD8+ associa-se à
eliminação vírica. Após a fase aguda, verifica-se um decréscimo na proliferação
destas células, com um número muito baixo de células CD8+ em circulação. No
tecido hepático, os LT CD8+ encontram-se em maior número e com um
fenótipo activado, comparativamente às células em circulação83, embora
partilhem as mesmas especificidades84. Tal como os linfócitos CD4+, as células
CD8+ adoptam preferencialmente um perfil de citocinas do tipo 1, tanto a nível
periférico como hepático.
Sumariando, podemos dizer que a resposta imunológica é insuficiente para
controlar a infecção pelo VHC, que se torna persistente na maioria dos doentes.
Relativamente à resposta humoral, apesar do desenvolvimento de anticorpos
neutralizantes dirigidos à região HVR1, é ineficaz talvez devido ao rápido
aparecimento de variantes de escape. Por seu lado, uma resposta celular CD4 e
CD8 vigorosa e multiespecífica durante infecção aguda associa-se à eliminação
25
INTRODUÇÃO
vírica. Após a supressão da replicação, a resposta CD4 é mantida a longo prazo,
enquanto que a resposta das células CD8 de memória é mantida de forma
menos eficaz. Na infecção crónica estabelecida, a resposta dos linfócitos T é
pouco expressiva, contribuindo apenas para a pressão de selecção de mutantes
de escape.
C) Mecanismos imunológicos de eliminação vírica e lesão hepática
A eliminação vírica e a lesão hepática provocada por mecanismos imunológicos
é iniciada por linfócitos T específicos do vírus, que infiltram o fígado, e
posteriormente ampliada por células não específicas de antigenio. A infecção
hepática pelo VHC, aumenta de forma substancial a população linfocitária
intrahepática, que é fundamentalmente composta por linfdócitos T CD8+
activados85. A maioria dos linfócitos encontra-se numa fase não proliférante do
ciclo celular (fase G0/G1), e uma percentagem pré determinada destas células
sofre apoptose86 diariamente, de modo a manter constante o pool de linfócitos
intrahepáticos. O mecanismo de lesão hepatocitário envolve diferentes vias de
actuação: citotoxicidade directa dos CD8+ sobre as células infectadas, através
da secreção de perforinas ou granzimas87; citotoxicidade mediada pela ligação
fas(hepatócitos)-fas L (CD8+)88; e secreção de linfocinas inibidoras da replicação
vírica, como o IFN-y e o TNF-a89. Os LT específicos do VHC produzem ainda
outras citocinas como o GM-CSF {granulocyte-macrophage colony stimulating
factor), e a IL-8, que funcionam como quimiotáticos para os neutrófilos. O
aumento de expressão das moléculas MHC I à superfície das células infectadas,
estimulado pelos IFNs, favorece o reconhecimento das células infectadas pelos
linfócitos CD8+90. Após exercerem as suas funções efectoras, a maioria dos
linfócitos T infiltrantes do fígado, sofrem apoptose.
26
INTRODUÇÃO
Estes mecanismos imunológicos de resposta vão ter primordial importância na
eliminação da infecção após terapêutica antivírica. Os doentes que mantém uma
resposta sustentada após o tratamento apresentam uma carga vírica baixa e
uma resposta linfocítica T específica activa pré-tratamento, que vai ser ampliada
durante a terapêutica91-92. Em contraste, os indivíduos que na fase pré-
tratamento apresentam uma resposta linfocítica T pouco expressiva, não vão
modificar muito esta resposta durante o tratamento, e vão ser não
respondedores no final93.
Simultaneamente, a eficácia dos esquemas terapêuticos utilizando IFN depende
de uma resposta celular do tipo Thl, o que sugere um papel imunomodulador
ao IFN e à ribavirina (RBV). O IFN estimula as resposta CD4+ e CD8+ e a RBV
inibe as respostas Th294. Muitos dos doentes com infecção crónica pelo VHC
apresentam concentrações elevadas de citocinas Th2, e os que exibem níveis de
IL-10 persistentemente aumentados geralmente não são capazes de eliminar a
viremia após o tratamento combinado9596. Supõe-se assim, que novas
estratégias terapêuticas passem pela modificação da resposta T ou do equilíbrio
Thl /Th2, tal como já tem sido verificado com o tratamento de combinação de
interferon e ribavirina.
27
INTRODUÇÃO
3.1. DOENÇA HEPÁTICA E DOENÇA MULTISSISTÉMICA
O fígado é o principal alvo do VHC, sendo responsável pelo desenvolvimento
de um quadro de hepatite. A infecção aguda passa despercebida na maioria das
vezes, pois ou é assintomática ou se acompanha de sintomas ligeiros e
inespecíficos (astenia, anorexia, mal estar e dor abdominal). Nos poucos casos
sintomáticos (icterícia) a duração do quadro clínico varia entre 2 e 12 semanas.
Os valores de transaminases sobem precocemente alcançando o seu máximo
por volta das 4 semanas, coincidindo geralmente com os títulos máximos de
viremia. Em cerca de 15% a 25% dos indivíduos o sistema imune é capaz de
conter de forma eficaz a agressão vírica, e a doença aguda é autolimitada, com
normalização das transaminases e negativação persistente do ARN do VHC no
soro. Na maioria dos doentes (75%-85%)97 verifica-se a persistência do ARN do
VHC em circulação, com o desenvolvimento de algum grau de lesão hepática
crónica e risco de progressão para cirrose e carcinoma hepatocellular. Os
factores reconhecidos como associados a uma maior progressão da lesão
hepática foram a idade avançada no momento da infecção98, o sexo masculino98,
o consumo de álcool99"103, a coinfecção pelo vírus da hepatite B104-105 ou pelo
vírus da imunodeficiência humana106107, a existência de depósitos de ferro no
tecido hepático108"110, a esteatose hepática e a sobrecarga ponderal. Para além
das repercussões em termos de morbilidade, a infecção crónica pelo VHC
também influencia a sobrevida destes doentes, que é inferior à da população
geral.
Para além das principais manifestações relacionadas com o atingimento
hepático, a infecção pelo VHC é responsável por um atingimento sistémico com
manifestações extrahepáticas de cariz autoimune ou linfoproliferativo. Estes
28
INTRODUÇÃO
factos parecem depender das características linfotrópicas do VHC, capaz de
causar uma estimulação persistente do sistema imunitário.
Para estas situações, parecem também contribuir os fármacos utilizados no
tratamento, como o IFN, ao desencadearem ou agravarem fenómenos de
autoimunidade. A situação clínica extrahepática que mais frequentemente se
associa à infecção pelo VHC é a Crioglobulinemia Mista (CM) do tipo II ou do
tipo III. Em 80% dos indivíduos com CM é possível detectar a presença do ARN
do VHC em circulação111, não havendo correlação com o genótipo vírico. Do
crioprecipitado característico da doença, para além do factor reumatóide, faz
parte o ARN do VHC.
Outra das doenças muitas vezes referida como associada à hepatite C é a
Porfiria Cutânea Tarda (PCT), sendo esta associação de 70-90% em alguns
países112-113.
Também tem sido descrita a associação do VHC com diversas situações clínicas
heterogéneas, e que incluem o linfoma de células B, a glomerulonefrite, o
síndrome de Behcet, o liquen plano, a púrpura trombocitopénica autoimune, a
úlcera da córnea de Mooren, a fibrose pulmonar idiopática, a anemia aplástica,
a artrite reumatóide, a poliarterite nodosa, o síndrome anti-fosfolípido, a
tiroidite autoimune e a sialoadenite. A disfunção tiroideia parece estar, em
alguns casos, relacionada com o vírus e não estritamente dependente da
terapêutica com IFN. Em indivíduos com predisposição genética, o IFN induz o
aparecimento de autoanticorpos antitiroideus, transitórios, mas que acarretam
compromisso da função tiroideia.
Tem sido descrita uma elevada prevalência (20%-40%) de anticorpos anti-VHC
em doentes com linfoma não Hodgkin de células B. Esta associação tem sido
mais evidente em neoplasias de baixo grau associadas com a CM, e parece estar
relacionada com a proliferação crónica das células B estimulada por antigénios,
com o eventual desenvolvimento de monoclonalidade.
29
INTRODUÇÃO
Uma outra manifestação de autoimunidade comprovadamente associada à
infecção pelo VHC é o aparecimento de autoanticorpos. Os autoanticorpos
(factor reumatóide, anticorpo anti-nuclear, anti-músculo liso, anti-liver kidney
microsomal, e anti-cardiolipina) estão presentes em 10-25% dos casos114 . Os anti-
músculo liso e anti-nuclear são os mais frequentes, estando presentes em títulos
baixos115. Na maioria das vezes a presença destes autoanticorpos não influencia
as manifestações clínicas, a evolução da doença ou a resposta ao tratamento.
30
INTRODUÇÃO
3.3 OS TRATAMENTOS ACTUAIS: EFICÁCIA E LIMITES DO
INTERFERON PEGUILADO E DA RIBAVIRINA
O uso do Interferon (IFN) no tratamento da hepatite C remonta ao ano de
1986116, antes mesmo do isolamento e caracterização vírica, e a avaliação das
taxas de resposta baseava-se na normalização das transaminases. Com os
progressos serológicos e de biologia molecular, o indicador de eficácia
terapêutica passou a ser o desaparecimento do vírus da circulação, objectivado
pela negativação do ARN do VHC de forma sustentada, pelo menos 6 meses
após a conclusão do tratamento- resposta virológica sustentada (RVS).
No início da utilização do IFN, em monoterapia e por períodos de 6 meses, as
taxas de sucesso eram diminutas, na ordem dos 6%. Quando se aumentou o
período de tratamento para 48 semanas, obtiveram-se taxas de sucesso de 12 a
16%, o que se mantinha manifestamente insuficiente.
A baixa eficácia, os efeitos laterais associados ao fármaco, e as incertezas acerca
dos candidatos ideais a tratamento, motivou muita controvérsia até aos finais
dos anos 90, relativamente a quem e como tratar. Estas dúvidas e incertezas
motivaram a realização de diversas reuniões de consenso, nomeadamente a
Reunião de Consenso de Bethesda em 1997, e posteriormente em 2002,
reunindo um abrangente painel de especialistas, da qual emanou uma série de
recomendações relativamente ao tratamento da hepatite C.
Regimes terapêuticos
Os IFNs são citocinas com propriedades antivíricas, imunomoduladoras e
antiproliferativas, capazes de estimular a resposta imune antívírica117118. A
família dos IFN é subdividida em 2 subfamílias : Tipo I e Tipo II. Os IFN da
31
INTRODUÇÃO
família Tipo I são citocinas monoméricas com uma constituição aminoácida
comum em 30-80%, uma estrutura tridimensional semelhante e que usam o
mesmo receptor celular (IFNAR) na iniciação da resposta de sinalização. O IFN
usado no tratamento da hepatite C é o IFN alfa, pertencente á subfamília Tipo I.
Os IFN do tipo I são libertados algumas horas após a infecção vírica, inibindo a
sua replicação de forma inespecífica, e constituem um dos factores solúveis
mais importantes na defesa contra agentes intracelulares. O receptor celular do
IFN é formado por 2 componentes (IFNAR1 e IFNAR2), ambos com domínios
intra e extracelulares. O IFNAR1 apresenta baixa afinidade para o IFN e a sua
actuação está dependente da presença simultânea do IFNAR2. A interacção do
IFN com os seus receptores activa os sistemas de sinalização celular, com a
propagação da informação aos diferentes compartimentos citoplasmáticos e
nucleares, levando à transcrição de genes.
A capacidade do IFN estabelecer um "estado antivírico" é a sua característica
diferenciadora , essencial à sobrevida dos vertebrados face a infecções víricas.
Deve ser realçado no entanto, que a actividade antivírica do IFN não é
intrínseca, mas sim dependente da indução da expressão de genes antivíricos.
Após a ligação do IFN aos receptores da membrana do hepatócito activam-se
vários sinais intracelulares, como a indução da 2'-5'-OAS (oligoadenilato
sintétase) e a activação da proteína cínase dependente do ARN (PKR), da
família das cínases da serina-tirosina. A cínase activada leva, por sua vez, à
fosforilação da subunidade a do factor de iniciação 2 da síntese das proteínas
(eIF2a), inibindo a síntese proteica119120. A 2'-5'-OAS activa uma
endoribonuclease (ARNase L) que degrada o ARN celular e vírico.
As proteínas Mx pertencem à família das GTPases e são induzidas pelo IFN. A
sua actuação ao nível da replicação faz-se pela inibição da transcrição, inibindo
32
INTRODUÇÃO
as polimerases víricas. Outras proteínas que se sabem interferirem com a
replicação vírica são as GBP (Guanylate Binding Protein), a proteina 9-27 e a
sintase do óxido nítrico (iNOS).
As propriedades antiproliferativas do IFN foram demonstradas através da sua
eficácia no tratamento de doenças neoplásicas. No entanto, ainda não são
conhecidos os mecanismos exactos de inibição da proliferação celular, não se
tendo identificado genes específicos relacionados com esta função.
As propriedades imunomoduladoras do IFN traduzem-se pela indução da
expressão das moléculas MHC classe II à superfície das células apresentadoras
de antigénios; pela estimulação da proliferação dos linfócitos B, com
consequente estímulo da imunidade humoral; pelo aumento da expressão de
moléculas MHC classe I à superfície celular, com consequente estimulação da
resposta T citotóxica (CD8+); e pela interacção com outras citocinas,
aumentando a expressão da resposta Thl, através do aumento da IL-2, e
diminuindo a resposta Th2, através da diminuição da expressão de IL-4 e IL-5.
A inibição da produção periférica de IL-1, IL-8 e TNF-a, bem como a
estimulação da produção de IL-10, confere ao IFN uma acção anti-inflamatória.
Apesar do conhecimento de todas estas acções do IFN, ainda não é totalmente
conhecida a relação do IFN com as proteínas víricas. Sabe-se actualmente que a
proteína do core é capaz de activar o gene da 2'-5'-OAS, sendo esta acção
potenciada pelo IFN121. Por outro lado, os indivíduos que não respondem ao
IFN têm uma baixa actividade basal e induzida da 2'-5'-OAS122. As proteínas E2
e NS5A têm também a capacidade de se ligarem à PKR, inibindo-a. Outros
factores que poderão contribuir para a não resposta ao IFN são a inibição da
actividade dos linfócitos CD8+ intrahepáticos123, a diminuição dos receptores
citoplasmáticos necessários à acção do IFN124, e a presença de anticorpos anti-
IFN (neutralizantes ou não neutralizantes). Estes anticorpos estão envolvidos
nos fenómenos de breakthrough, que ocorrem em 10% a 30% dos doentes em
tratamento125126, e se traduz pelo reaparecimento da viremia e/ou elevação das
33
INTRODUÇÃO
transaminases após controle inicial da infecção.
Em termos de cinética vírica, o declínio da replicação vírica após a
administração do IFN, tem um padrão bifásico, em que se verifica um declínio
muito rápido de cerca de 0,5-2,0 loglO, nas primeiras 48 horas, dependente de
dose, e uma segunda fase mais lenta, na dependência da lise dos hepatócitos
infectados127. Em ambas as fases se verifica uma inibição na produção de novos
vírus. As proteínas E2 e NS5A inibem a acção do IFN na fase inicial de declínio
rápido128. Os indivíduos que não respondem ao tratamento não apresentam
inibição da replicação na segunda fase.
Apesar destas limitações, a capacidade de interferência nos mecanismos de
replicação vírica e de estimulação da resposta imunológica, tornaram o IFN o
agente principal no tratamento da hepatite C. No entanto, o seu uso em
monoterapia, na dose de 3 UM, 3x/ semana, durante 48 semanas, apenas
permitiu alcançar taxas de resposta sustentada de cerca de 12-16%129.
Surgiu então um novo fármaco que passou a ser utilizado em associação com o
IFN, na tentativa de aumentar as taxas de resposta sustentada, a Ribavirina
(RBV). A RBV é um análogo sintético do nucleosido guanosina, com actividade
contra vírus ADN e ARN. A sua utilização na prática clínica remonta há mais
de 20 anos, no tratamento das infecções pelo vírus sincicial respiratório130. A
RBV passou a ser utilizada no tratamento da hepatite C há cerca de 14 anos131,
de modo combinado com o IFN. A sua eficácia em monoterapia não foi
demonstrada, mas actua de forma sinérgica com o IFN aumentando a taxa de
resposta e diminuindo a recidiva após o final do tratamento. A sua
administração é feita por via oral, possui uma biodisponibilidade de 65% e o
equilíbrio das concentrações séricas é alcançado após 4 semanas de terapêutica.
Um dos seus mecanismos de acção, e talvez o mais importante, consiste na
34
INTRODUÇÃO
inibição competitiva da inosina monofosfato desidrogenase (IMPDH). Esta
inibição enzimática conduz a uma depleção celular dos nucleotídeos de guanina
(GTP e dGTP), necessários à síntese de ADN e ARN. No entanto o seu
mecanismo de acção molecular ainda não está totalmente esclarecido, e pensa-
se que a RBV possa actuar por outros mecanismos: inibição da elongação do
ARN vírico, inibição da formação do cap de guanina pirofosfato na extremidade
5' do ARNm, supressão directa da actividade da polimerase vírica, e
polarização da resposta imunológica para um perfil de citocinas tipo 1,
favorecendo o clearance imunológico do vírus. Este último mecanismo de
modulação das citocinas, despertou um interesse particular, observando-se in
vitro a estimulação de uma resposta tipo 1 das CD4+ e CD8+ (IL-2, IFN-y, TNF-
cc), e a inibição da resposta tipo 2 (IL-4, IL-5, IL-10) ao nível da expressão do
ARNm e da proteína132'133. Os trabalhos de Fang e colaboradores134 confirmaram
estes dados, ao demonstrarem a indução da actividade NK e da produção de
IL-12, promotores da diferenciação das células CD4+ naïve em Thl. Este tipo de
diferenciação é particularmente importante na imunidade celular para a
cooperação das CD4+ com a actividade citotóxica das CD8+.
Os ensaios randomizados comparando o uso de IFN isolado ou a sua associação
com RBV, demonstraram um aumento na RVS no grupo da terapêutica
combinada (42% vs 16%)135-137. Os 2 grandes ensaios multicêntricos138-139
realizados para comparar estes 2 esquemas terapêuticos, obtiveram resultados
muito promissores ao alcançarem respostas no final do tratamento de 55% e
51%, no grupo dos doentes em terapêutica combinada por 24 e 48 semanas,
respectivamente, face a respostas de 29% no grupo de monoterapia com IFN,
durante 24 ou 48 semanas. Do mesmo modo as RVS foram também
significativamente melhores no grupo IFN+RBV (33% e 41% vs 6% e 16%),
independentemente da duração do tratamento ser de 24 ou 48 semanas.
35
INTRODUÇÃO
Apesar da maior eficácia demonstrada com a associação da RBV ao esquema
clássico de IFN, verificou-se também uma maior necessidade de redução de
dose ou interrupção do tratamento por efeitos laterais, bem como a persistência
de um grupo de doentes (aproximadamente 50%) não respondedor ou
récidivante.
A principal causa de redução de dose foi a anemia hemolítica causada pela
acumulação da forma trifosfatada da RBV nos eritrócitos, enquanto que os
quadros depressivos e os distúrbios emocionais atribuídos ao IFN, foram os
principais implicados na suspensão do tratamento.
Efeitos laterais do IFN
Os IFNs do tipo 1 actualmente disponíveis têm efeitos laterais semelhantes. Os
mais frequentes são a astenia, o síndrome gripal, mialgias, artralgias e
diminuição de peso (Tabela 1) 140-142. Apesar de frequentes, as alterações da
função tiroideia e a depressão da medula óssea, são facilmente avaliadas e
controladas. A capacidade de exacerbação de patologia depressiva e
psiquiátrica, pressupõe um rastreio dessas patologias previamente ao início do
tratamento, com apoio psiquiátrico se necessário.
Efeitos laterais da RBV
Aproximadamente 10% dos doentes tratados com RBV desenvolvem anemia
hemolítica dependente da dose. É relativamente comum, observar-se um
decréscimo de 2-3 gr / dl, no valor da hemoglobina, nas primeiras 4-8 semanas
de tratamento143; se o valor ultrapassar a barreira dos 10 gr/ dl, a dose de RBV
deve ser ajustada para 600 mg/dia. Esta diminuição de dose permite aumentar
o valor da hemoglobina em cerca de 1-1,5 gr/ dl, possibilitando a manutenção
36
INTRODUÇÃO
da terapêutica combinada. Um a dois meses após a suspensão do tratamento, os
valores da hemoglobina retornam aos valores basais pré-tratamento. Os doentes
com anemia prévia, doença coronária, doença vascular periférica, ou incapazes
de tolerar a anemia, não são candidatos a esquema combinado, devendo ser
considerados para tratamento isolado com IFN. Cerca de 15-30% dos doentes
desenvolvem tosse, dispneia, insónia, prirido, rash e anorexia, secundários ao
uso da RBV (Tabela 1)138. A teratogenicidade da RBV proibe a sua utilização em
grávidas e indivíduos incapazes de realizar uma contracepção eficaz.
Para além do aumento dos efeitos adversos persistia um grupo de doentes que,
apesar da associação de RBV ao esquema terapêutico, continuava a não
responder ou recidivava após uma resposta no final do tratamento. O grupo de
Poynard determinou 5 variáveis independentes associadas a resposta ao
tratamento: genótipo 2 e 3, carga vírica basal inferior a 3,5 milhões de
cópias/ml, ausência de fibrose portal, sexo feminino e idade inferior a 40
anos143. Enquanto que os indivíduos infectados com genótipos 2 e 3 obtiveram
taxas de RVS de 65%, independentemente da duração do tratamento ser de 24
ou 48 semanas, os indivíduos infectados com o genótipo 1, o mais prevalente
nos Estados Unidos, alcançaram apenas RVS de 17% e 29% após 24 e 48
semanas de tratamento138-139'144.
Por outro lado a carga vírica pré tratamento parece ser também um factor
preditivo de resposta nos indivíduos com genótipo 1, obtendo-se uma taxa de
RVS de 10% e 27%, às 24 e 48 semanas, quando a carga vírica é superior a 2
milhões de cópias/ml, enquanto que a duração do tratamento não parece
influenciar a resposta se a carga vírica for inferior a 2 milhões de cópias/ml
(RVS=33%). Nos indivíduos infectados com genótipo 2 e 3 a carga vírica e a
duração do tratamento não influenciam a resposta, que se situa na ordem dos
60% 145,146 A determinação do RNA do VHC sérico durante o tratamento parece
também auxiliar na determinação dos indivíduos com maior probabilidade de
37
INTRODUÇÃO
Efeitos laterais comuns Efeitos laterais raros
IFN Fadiga, mal estar, artralgias, febre,
diminuição de peso
Dificuldade de concentração
Distúrbios do sono
Irritabilidade, ansiedade, depressão
Diminuição plaquetas e leucócitos
Susceptibilidade a infecções:bronquite,
sinusite, infecções urinárias
Hiper ou hipotiroidismo
RBV Anemia hemolítica
Tosse, dispneia
Insónia
Prurido, rash
Intolerância gastrointestinal
Anorexia
Ideação suicida ou paranóide
Retoma de consumo de
álcool ou drogas
Púrpura trombocitopénica
Nefrite, S. Nefrótico
Insuf renal aguda, proteinuria
Agravamento insuf hepática
Sépsis
Diabetes
Teratogenicidade
Tabela 1. Efeitos laterais do interferon e ribavirina
não resposta, possibilitando a suspensão precoce da terapêutica nesse grupo de
doentes. Nos indivíduos tratados durante 48 semanas com a associação IFN e
RBV, a determinação do RNA VHC às 24 semanas identificou 98% dos não
respondedores, enquanto que a sua determinação às 12 semanas identificou
apenas 89%138139. A interrupção do tratamento à semana 12 impossibilitaria a
obtenção de uma RVS em 11% dos doentes, enquanto que a interrtipção à
semana 24 apenas negaria a resposta a 2% dos indivíduos tratados.
A elevada prevalência de indivíduos considerados "maus candidatos" ao
tratamento, a ainda baixa eficácia do esquema combinado de IFN e RBV, e a
elevada incidência de efeitos indesejáveis, motivou a persecução da
investigação no sentido de se encontrarem alternativas válidas e eficazes. Um
38
INTRODUÇÃO
estudo de Lam e colaboradores147 realçou a importância da inibição precoce da
replicação vírica com consequente decréscimo acentuado da carga vírica nas
fases iniciais do tratamento. Este estudo demonstrou que doses elevadas de IFN
produziam um decréscimo maior na carga vírica às 24 horas, efeito esse que
desaparecia após 48 horas da toma (Fig 1). Estes dados comprovaram que o
esquema terapêutico habitual de 3 doses semanais de IFN era insuficiente e
possibilitava o rebound vírico antes da administração da dose subsequente147.
0
Redução ~™ RNAHCV (%) -40
-60
-80
Injecção 24 h 48 h Tempo após injecção única
Fig 1. Modificações no ARN VHC após injecção única de IFN alfa-2b em doentes infectados com
genótipo 1 (Adaptado de Lam NP e colaboradores: Dose dependent acute clearance of hepatitis
C genotype 1 virus with interferon alfa, Hepatol 26:226-231,1997).
^L*». \ ****- . . . " * " 3 M U
>N. ' - . .
\ \ 5MU
\ 11̂ —" 10 MU
Outros trabalhos que contribuíram para um maior conhecimento da cinética
vírica foram os trabalhos de Neumann148, nos quais se observou que o
tratamento com IFN resulta numa descida bifásica da carga vírica: uma fase
inicial em que se observa um decréscimo acentuado da carga vírica (< 2 dias, > 2
log), resultante de um efeito antivírico directo, e uma segunda fase, mais lenta,
relacionada com a morte dos hepatócitos infectados e diminuição da taxa de
infecção de novos hepatócitos. Este reconhecimento da importância do
clearance vírico inicial na obtenção de uma resposta sustentada serviu de
39
INTRODUÇÃO
fundamento para as elevadas expectativas criadas com o interferon peguilado
(IFN-PEG).
O polietilenoglicol (PEG) é um polímero neutro, hidrofílico, linear, não tóxico e
não imunogénico (Fig. 2). A peguilação consiste na adição de polímeros de PEG
a proteínas biologicamente activas. Esta reacção permite a modificação das
propriedades imunológicas, farmacocinéticas e farmacodinâmicas das
proteínas, mantendo a sua actividade intrínseca. Assim, é possível melhorar a
actividade farmacológica, aumentar a semivida, a segurança e tolerância,
diminuindo a antigenicidade e imunogenicidade, o que se traduz num aumento
da eficácia, compliance e melhoria da qualidade de vida.
H-(OCH2CH2)„-OH PEG-OH Linear
CH HOCI^CH^-OH MPEG-OH Linear
o
/ \ MPEG2 Ramificada
' OH M P E G - O - C - N - C C H Ï ) »
'il H
Fig 2. Estrutura química de algumas moléculas de polietileno glicol [MPEG,
monometoxipoli(etilenoglicol)].
Os produtos peguilados exibem características novas que os distinguem das
moléculas originais - alterações conformacionais e nas propriedades
electrostáticas149150. A molécula de PEG permite uma absorção mais sustentada,
uma diminuição da proteólise, uma diminuição do clearance renal (o clearance
é proporcional ao peso da molécula de PEG, sendo exclusivamente renal abaixo
de determinado peso molecular, e combinado renal-hepático, para pesos mais
40
INTRODUÇÃO
elevados), um aumento da semivida plasmática151 e diminuição da
imunogenicidade, ao mascarar os locais antigénicos do IFN, impedindo o
reconhecimento imunológico. O aumento da semivida explica o aumento da
eficácia do PEG-IFN comparativamente ao IFN (Fig 3). Factores determinantes
da eficácia biológica são a massa da molécula de PEG ligada e os locais de
ligação152. A ligação da molécula de PEG à molécula de IFN pode ser feita de 3
formas: uma molécula de PEG grande ligada a um local único, uma molécula de
PEG ramificada (2 ou mais cadeias PEG médias unidas) ligada a um local único,
ou múltiplas cadeias pequenas ligadas a múltiplos locais.
Maior
Meno :
Semi-vida
Molécula de PEG ideal
Actividade antivírica
Peso molecular PEG
Fig 3. Efeitos da peguilação na semi-vida e actividade antivírica. Quanto maior o peso
molecular do PEG, menor a actividade antivírica e maior a semi-vida sérica
Actualmente existem duas formulações de PEG-IFN aprovadas para o
tratamento da hepatite C: PEG-IFN alfa-2a e PEG-IFN alfa 2b. O PEG-IFN alfa
2b consiste na adição de uma molécula linear de PEG de 12 kDa de peso
molecular, enquanto que o PEG-IFN alfa 2a consiste na adição de uma molécula
ramificada de PEG com 40 kDa. O racional para o uso de PEG-IFN no
tratamento da hepatite C foi estabelecido pelo conhecimento da semi-vida curta
41
INTRODUÇÃO
do IFN convencional (aproximadamente 6 horas) 153, o que origina grandes
flutuações nas concentrações plasmáticas de IFN, desde níveis muito elevados
após a administração até níveis praticamente indetectáveis, permitindo o
rebound da replicação vírica e justificando as baixas taxas de RVS, e a
emergência de mutantes víricos resistentes ao tratamento.
Por seu lado, os PEG-IFNs exibem uma semivida prolongada em circulação,
resultante de um aumento da resistência à degradação e diminuição do
clearance renal (Tabela 2).
Parâmetro farmacocinético
IFN convencional 2a 2b
PEG-IFN a-2b PEG-IFN a-2a
Tempo médio de absorção (h)
2.3 2.3 4.6 50
Volume de distribuição
31-73 1 981 (1.4 l/kg)
69.31 Í0.991/kg)
6-141
Tmax (h) 3-8 3-8 15-44 72-96 Duração da Q max (h)
<24 <24 48-72 168
Tempo médio de eliminação (h)
5.1 2-3 40 77
Clearance 11800 ml /h 16170 m l / h 1540 ml /h 80 m l / h
Tabela 2. Propriedades farmacocinéticas dos interferons
Na figura 4 compara-se o perfil farmacocinético do IFN alfa-2a, com um PEG-
IFN linear de 5 kDa de primeira geração, e com o PEG-IFN alfa-2a de 40 kDa
ramificado.
O objectivo final da peguilação é a obtenção de níveis séricos constantes e
sustentados de IFN alfa, que permitam a supressão vírica permanente entre as
diversas tomas e a diminuição dos efeitos laterais. Estes progressos
farmacocinéticos permitiram que a sua administração pudesse ser feita em toma
única semanal. A eficácia da peguilação no alcance destes objectivos depende,
como foi atrás mencionado, da estrutura e tamanho da molécula de PEG e do
42
INTRODUÇÃO
Ë
28
20
15
10 -
S -
0
Time (h/wk)
Fig. 4. Comparação entre a concentração plasmática do IFN alfa-2a convencional e duas formulações de PEG-IFN. (A) IFN 3MU, TIW; (B) PEG-IFN alfa-2a linear de 5 kDa; (C) PEG-IFN alfa-2a ramificado 40 kDa.
c c
0 1
2 5 I
SO 1
7 5 1 0 0 1 2 5 I S O
tipo de ligação à molécula de IFN. Na molécula PEG-IFN alfa 2b, a ligação é
feita através de pontes hidrolíticas instáveis de uretano, tornando o composto
peguilado uma pró droga, cuja actividade depende da libertação da molécula
activa de IFN alfa. A sua absorção é imediata e a semivida sérica é de
aproximadamente 40-64 horas151. A sua distribuição por vários tecidos e fluidos,
torna o volume de distribuição e a dosagem a administrar largamente
dependente do peso do doente154.
Os ensaios clínicos comparando IFN alfa-2b em monoterapia com PEG-IFN alfa
2b isolado na dose de 1,5 jj,g/Kg, durante 48 semanas, demonstraram taxas de
43
INTRODUÇÃO
RVS de 25% no grupo de PEG-IFN, face a apenas 12% no grupo do IFN
convencional. Os efeitos laterais foram semelhantes nos 2 grupos, e a falta de
eficácia no genótipo 1 ficou também demonstrada com o PEG-IFN, com taxas
de recidiva ao ano de 40-50%155. Como havia sido demonstrado para o IFN
convencional, era provável que a combinação de PEG-IFN com RBV
aumentasse as taxas de RVS no tratamento da hepatite C.
Num ensaio multicêntrico156 englobando 1530 doentes tratados durante 48
semanas, a taxa de RVS o grupo de doentes tratado com PEG-IFN 1,5 |ag/Kg +
RBV 800 mg/dia foi de 54%, versus uma taxa de RVS de 47% nos doentes
tratados com IFN alfa 2b 3 MU TIW + RBV 1000-1200 mg/dia (Tabela 3). Dos
doentes tratados com PEG-IFN que alcançaram uma RVS, 90% também
normalizaram as transaminases. Todos os grupos apresentaram melhoria da
inflamação hepática, mais evidente nos indivíduos que apresentaram resposta
sustentada, embora 44% dos não respondedores também tenham beneficiado
de melhoria histológica. Neste ensaio, uma análise secundária identificou o
peso corporal como um factor preditivo independente de resposta156, indicando
que a dose de RBV, em mg/kg, se relaciona com uma RVS. Os doentes tratados
com a dose mais elevada de PEG-IFN, e com uma dose de RBV superior a 10.6
mg/kg, alcançaram as taxas de RVS mais elevadas (61%).
O perfil de efeitos laterais observado com a combinação PEG-IFN alfa 2b + RBV
foi semelhante aos efeitos laterais observados com IFN alfa 2b + RBV. Em 13%
dos indivíduos houve necessidade de suspender o tratamento por efeitos
adversos e em 36% foi necessário proceder a modificações de dose.
Face aos benefícios inequívocos alcançados com a terapêutica combinada de
PEG-IFN + RBV, actualmente este é o esquema terapêutico preconizado para o
tratamento inicial de indivíduos infectados com o VHC.
44
INTRODUÇÃO
PEG-EFN 1x5 Hg/kg
+RBV tn=511i
PEG-IFN 1,5/0,5 x 5jig/kg IFN 3MU+RBV
+RBV (n=5141 ^=5051
RVS 54% (doentes todos)
RVS por genótipo
1 42%
2/3 82%
4/5/6 50%
RVSporVHC >2M 42%
<2M 78%
RVS por fibrose
Fibrose 0/mínima 57%
Fibrose ponte/cirrose 44%
47%
34%
80%
33%
42%
59%
51% 43%
47%
33% 79% 38%
42%
56%
49% 41%
Tabela 3. Resposta virológica sustentada com peginterferon alfa-2b e ribavirina
Os factores pré tratamento associados a maior probabilidade de RVS, tal como
na terapêutica combinada de IFN convencional e RBV, foram o genótipo 2 e 3, a
carga vírica baixa, a ausência de fibrose significativa, o sexo feminino e a idade
jovem156. Embora estes factores forneçam uma estimativa da probabilidade de
se obter uma resposta, geralmente não são eficazes na identificação dos doentes
que irão responder. A variável ou teste ideal seria aquele que identificasse o não
respondedor numa fase inicial do tratamento, de modo a que este fosse
interrompido precocemente e desse modo se evitasse a morbilidade de uma
terapêutica prolongada, mantendo-se a terapêutica nos indivíduos com maior
probabilidade de resposta. Os dados disponíveis indicam que a não obtenção
de uma diminuição da carga vírica de pelo menos 2 loglO às 12 semanas de
tratamento é indicativo de não resposta. Em contrapartida, os indivíduos que
obtêm essa diminuição têm 80% de probabilidade de uma resposta sustentada
45
INTRODUÇÃO
no final do tratamento. Convém no entanto utilizar estas regras com precaução
e de forma individualizada, uma vez que estes dados não dão relevo à melhoria
histológica que se obtém nos não respondedores.
Os dados obtidos nos diversos ensaios realizados permitiram definir um grupo
de doentes que se sabe ser mais resistente aos tratamentos disponíveis:
indivíduos infectados com genótipo 1, com cargas víricas elevadas, com fibrose
hepática, indice de massa corporal elevado e idade superior a 40 anos. Para
além deste grupo de doentes existem dois outros grupos que colocam algumas
dificuldades e incertezas quanto à sua orientação: os indivíduos não
respondedores ou récidivantes, e os indivíduos com cirrose. A recidiva define-
se como a perda do ARN do VHC durante o tratamento, seguido do seu
reaparecimento nos 6 meses seguintes à conclusão da terapêutica; a não
resposta é definida como a persistência do ARN do VHC. O aparecimento da
molécula peguilada, ao demonstrar a sua maior eficácia comparativamente aos
esquemas terapêuticos prévios, justificou o entusiasmo no retratamento de
indivíduos que não obtiveram uma RVS com o tratamento inicial.
Dos resultados obtidos nas duas metanálises157158 publicadas relativamente ao
retratamento dos não respondedores ao IFN em monoterapia, conclui-se que
apesar da variedade dos resultados obtidos nos diversos estudos, a terapêutica
combinada de IFN e RBV permitiu alcançar RVS de 12% a 15%. À semelhança
do que acontecia com os indivíduos nãive, neste grupo de doentes os indivíduos
que apresentaram melhores taxas de resposta foram os infectados com os
genótipos 2 e 3, os que apresentaram menores cargas víricas iniciais, diminuição
significativa do ARN do VHC nas fases iniciais do tratamento e recidiva ao
tratamento inicial.
Até ao momento ainda só foram realizados dois estudos159-160 utilizando PEG-
IFN e RBV no retratamento de não respondedores a IFN e RBV. Ambos os
estudos englobam doentes não respondedores a monoterapia e terapêutica
46
INTRODUÇÃO
combinada. Esta é portanto uma área de significativo interesse e expectativa,
embora a dificuldade de recrutamento de doentes já submetidos a terapêuticas
prévias, seja um factor limitativo e condicionante da escassa experiência
mundial relatada.
Apenas existem dados publicados relativamente a um dos trabalhos161, no qual
se obtiveram taxas de RVS de 18%, tendo sido identificados como factores
preditivos de resposta o tratamento prévio com IFN em monoterapia, a infecção
pelos genótipos 2 e 3, uma relação AST:ALT baixa, a ausência de cirrose, e a
manutenção da dose de RBV nas 20 semanas iniciais de tratamento.
Nos 2 estudos multicêntricos desenhados para o retratamento de doentes
récidivantes após IFN isolado162163 utilizando IFN e RBV, as respostas no final
do tratamento foram de 82% e 74%, com RVS de 47% e 56%, respectivamente.
Os resultados preliminares159 disponíveis relativos ao retratamento de
indivíduos récidivantes a terapêutica combinada, utilizando PEG-IFN e RBV,
demonstraram uma negativação do ARN do VHC no final do tratamento em
87% dos doentes, com uma resposta sustentada de 60%.
Embora o conhecimento actual favoreça o retratamento dos indivíduos não
respondedores ou récidivantes a tratamentos prévios com IFN isolado, não
existem ainda determinações definitivas sobre a orientação dos não
respondedores ou récidivantes ao tratamento combinado (IFN e RBV).
Um outro esquema terapêutico já proposto para este grupo de doentes inclui a
amantadina, isolada ou em associação com o IFN. A amantadina é um agente
antivírico, cuja acção é sinérgica com a de outros agentes. Um ensaio
randomizado e controlado, utilizando terapêutica tripla com IFN, RBV e
amantadina em doentes não respondedores, obteve uma resposta no final do
tratamento de 67%, comparativamente com 10% dos indivíduos tratados apenas
47
INTRODUÇÃO
com IFN e RBV. Quarenta e oito por cento dos indivíduos em terapêutica tripla
obtiveram uma RVS, comparativamente a apenas 5% no grupo de terapêutica
dupla164. Mantém-se assim a dúvida quanto ao interesse da amantadina no
tratamento da hepatite Q uma vez que a maioria dos estudos não demonstrou a
sua eficácia, e no entanto, em alguns trabalhos os seus resultados são
extraordinariamente promissores.
Os indivíduos com cirrose constituem um grupo particularmente difícil de
tratar, quer pelas taxas de resposta inferiores aos indivíduos não cirróticos, quer
pelo risco de descompensação da sua insuficiência hepática e menor
tolerabilidade aos efeitos laterais dos fármacos. Por outro lado é precisamente
este grupo de doentes que apresenta um maior risco de descompensção
hepática, carcinoma hepatocelular e morte num período de 5 a 10 anos. Desta
forma, torna-se importante considerar este grupo de doentes como candidato à
forma mais eficaz de tratamento disponível. No estudo de Heathcote e
colaboradores^65, que consistiu no tratamento de indivíduos com cirrose (76%) ou
fibrose em ponte (24%), com PEG-IFN alfa 2a ou IFN convencional, a taxa de
RVS no grupo PEG-IFN foi de 30% versus 8% no grupo do IFN convencional.
Nos indivíduos com genótipo não 1 as taxas de RVS foram de 51%. Para além
da resposta virológica foi também possível obter uma resposta histológica
significativamente superior no grupo do interferon peguilado (54% versus 31%,
p=0,02). Em termos de efeitos laterais, o esquema terapêutico com PEG-IFN foi
bem tolerado, com necessidade de redução transitória da dose por efeitos
hematológicos em 10%-19% dos doentes, e interrupção permanente do
tratamento em 13%. Face a estes resultados promissores em termos de controlo
da replicação vírica e possibilidade de prevenção de complicações, cada vez
mais as indicações para tratamento são mais abrangentes, o que leva a que
sejam incluídos os indivíduos com cirrose compensada.
48
OBJECTIVOS
4. OBJECTIVOS DO TRABALHO DA TESE DE MESTRADO
Apesar das evoluções verificadas ao longo da última década no conhecimento
da hepatite C, em termos de biologia molecular do vírus, e da progressiva
expansão do arsenal terapêutico, esta infecção crónica permanece ainda como
um desafio clínico, com grandes implicações em termos socio-económicos. O
conhecimento da estrutura vírica, a evolução nos meios de diagnóstico e o
aparecimento de novas moléculas com aplicação terapêutica faria pressupor
que finalmente seria possível a cura da infecção. A introdução de esquemas
terapêuticos com maior eficácia, tornou premente a questão do retratamento,
pois levantou a hipótese de se poder obter respostas virológicas sustentadas
numa proporção de indivíduos anteriormente não respondedores a esquemas
terapêuticos menos eficazes. O aparecimento do interferon peguilado,
constituiu um avanço em termos de tratamento, pelo que nos propusemos a
avaliar a sua eficácia e tolerância num grupo particularmente difícil de doentes,
indivíduos récidivantes e não respondedores a terapêutica prévia combinada de
interferon e ribavirina, alguns dos quais em estádio de cirrose. Uma das
limitações mas simultaneamente, uma das motivações para a realização deste
estudo, foi a escassa informação à data relativamente ao retratamento de não
respondedores ou récidivantes a terapêutica combinada, dado que os trabalhos
existentes eram referentes a retratamento de doentes que falharam a
monoterapia com IFN.
Assim, os objectivos deste trabalho foram os seguintes:
1- Avaliar a eficácia em termos virológicos e clínicos da terapêutica
combinada com Interferon Peguilado e Ribavirina no retratamento de
49
OBJECTIVOS
doentes não respondedores ou récidivantes a esquemas terapêuticos
prévios de combinação.
2- Definir factores preditivos de resposta ou não resposta a esta nova
terapêutica, atribuíveis primariamente ao vírus ou ao hospedeiro,
detalhando-se os parâmetros clínicos , analíticos e imunológicos dessas
circunstâncias, e caracterizar a dinâmica das variações observadas.
3- Definir o perfil de segurança e de tolerância da associação neste grupo de
doentes.
50
MATERIAL E MÉTODOS
5. MATERIAL E MÉTODOS
Procedeu-se ao estudo prospectivo de doentes com infecção crónica pelo VHC,
definidos como resistentes ou récidivantes a terapêutica prévia com Interferon e
Ribavirina, originários da Consulta de Hepatologia da Unidade de
Gastrenterologia do Hospital de São João, onde eram tratados sob a
responsabilidade do Doutor Guilherme Macedo. O estudo decorreu no período
compreendido entre Dezembro de 2001 e Dezembro de 2002, também sob a sua
orientação.
Foram incluídos no estudo os doentes com infecção crónica pelo VHC, com as
seguintes características:
ARN do VHC detectado no soro por PCR;
- Elevação das transaminases séricas, no mínimo duas vezes acima do
limite superior do normal;
- Terapêutica prévia com Interferon e Ribavirina em combinação, e
recidiva ou não resposta após/no final do tratamento;
Ausência de contraindicações conhecidas à administração de IFN e
RBV.
Foram considerados como não respondedores os doentes que não apresentaram
supressão do ARN do VHC durante o tratamento, e récidivantes, os doentes
nos quais se observou a supressão do ARN do VHC no final do tratamento, e o
seu reaparecimento nos seis meses após a suspensão da terapêutica.
Todos os doentes incluídos neste estudo tinham avaliação histológica prévia,
permitindo a sua categorização em doentes com cirrose, fibrose (portal, septal),
51
MATERIAL E MÉTODOS
e sem fibrose, bem como a quantificação da actividade necroinflamatória
(ligeira /moderada) .
O estudo anatomopatológico dos fragmentos de biópsia hepática foi realizado
no Departamento de Anatomia Patológica do Hospital de São João, dirigido
pela Prof. Doutora Fátima Carneiro.
Foram excluídos deste estudo, doentes coinfectados com o vírus da hepatite B,
D ou VIH; doentes com patologia psiquiátrica grave, patologia tiroideia,
autoimune, oncológica ou cardiovascular que condicionasse grave
compromisso biológico ou agravamento clínico com o uso do PEG-IFN e/ou
RBV; doentes com cirrose descompensada (ascite, hemorragia digestiva por
ruptura de varizes, encefalopatia, plaquetas < 50x109/1, hemoglobina < 10 g/dl ,
leucócitos < l x lOVi albumina < 3,5 g/dl , bilirrubina > 1,5 mg/dl , INR >1,5);
doentes com consumo activo de drogas, etanol ou outra doença hepática
concomitante; doentes incapazes de cumprir uma contracepção eficaz até 6
meses após a conclusão do tratamento.
A avaliação analítica prévia ao início do novo tratamento consistiu em:
- determinação serológica do VHC, VHB, VHD, e VIH;
- quantificação do ARN do VHC por PCR;
determinação do genótipo do VHC;
hemograma;
- bioquímica, com função hepática, renal, perfil lipídico, função
tiroideia, parâmetros serológicos do metabolismo do ferro, e estudo
da coagulação;
determinação de autoanticorpos (anti-tiroideus, anti-nucleares, anti-
ADN, anti-musculo liso, anti-plaquetários) e doseamento de
imunoglobulinas (IgM, IgG, IgA);
52
MATERIAL E MÉTODOS
- determinação das subpopulações linfocitárias.
O tratamento consistiu na administração de Peginterferon alfa-2b, 1,5
ug/ kg / semana, subcutâneo, e Ribavirina 800-1000 mg/dia, oral, de acordo com
o peso corporal (< 75kg versus >75kg), durante 48 semanas.
Todos os doentes foram avaliados clinica e analiticamente com periodicidade
mensal nos primeiros 4 meses de tratamento e posteriormente com
periodicidade bimensal.
A determinação do ARN do VHC foi feita às 12, 24 e 48 semanas de tratamento.
O genótipo vírico foi determinado usando o teste INNO-LiPA HCV II da
INNOGENETICS® e a carga vírica foi determinada usando o teste COBAS
AmpliPrep / COBAS AMPLICOR HCV MONITOR™, versão 2.0, da ROCHE®.
O teste INNO-LiPA HCV II permite uma determinação rápida e fácil dos 6
genótipos víricos e seus subtipos. A possibilidade de genotipagem do VHC
resulta das variações encontradas na região 5' (5'UR) dos diferentes genótipos.
Este teste baseia-se no princípio da hibridização reversa, no qual o ARN
biotinilado previamente amplificado é hibridizado com sondas de
oligonucleotídeos específicas, imobilizadsa em linhas paralelas em tiras de base
membranar. O produto marcado com biotina obtido da região 5'-UR apenas
hibridiza com a sonda cuja sequência é totalmente compatível, permitindo uma
discriminação rigorosa ao nível do subtipo. Após a hibridização é adicionada
streptavidina marcada com fosfatase alcalina que se vai ligar ao composto
híbrido biotinilado formado previamente, seguido-se a incubação com os
cromogeneos BCIP/NBT resultando na formação de um precipitado de cor
castanho. Deste modo, apenas se verifica a formação de uma linha
castanho/arroxeada ou positiva, quando se obtém um emparelhamento total
entre a sonda e o produto de PCR. O genótipo é então deduzido usando o
53
MATERIAL E MÉTODOS
painel de interpretação da INNO-LiPA HCV II, após agrupamento de todos os
números das linhas positivas.
O teste COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, v2.0 é um
teste de amplificação de ácidos nucleicos utilizado na quantificação do ARN do
VHC no soro ou plasma. Este teste baseia-se em 5 processos fundamentais:
obtenção do ARN do VHC; transcrição reversa do ARN com formação de ADN
complementar (cADN); amplificação por PCR do cADN alvo com primers
complementares específicos do VHC; hibridização dos produtos amplificados
com sondas de oligonucleotídeos específicas dos alvos; e determinação
colorimétrica dos produtos amplificados ligados à sonda.
Após o isolamento do ARN do VHC a partir de uma amostra de sangue do
doente, o ARN é transcripto de forma reversa obtendo-se ADN complementar
que posteriormente era amplificado pela técnica de PCR, dando origem a várias
moléculas de ADN de cadeia dupla com 244 pares de bases, denominadas
amplicon. A amplificação não envolve todo o genoma do VHC, apenas a região
entre os primers. O passo seguinte à amplificação é a desnaturação química do
amplicon de modo a serem obtidas cadeias simples de ADN. Em seguida
adiciona-se uma sonda de oligonucleotídeos específica para o amplicon do VHC,
ocorrendo a hibridização entre ambos. A detecção é feita após a adição de
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), que é oxidada na presença de peróxido de
hidrogéneo originando um complexo colorido, cuja absorbância é medida pelo
COBAS AMPLICOR Analyzer a um comprimento de onda de 660nm.
A quantificação do ARN vírico é feita utilizando uma segunda sequência alvo -
HCV Quantification Standard. O HCV Quantification Standard é um
transcripto ARN não-infeccioso possuidor de locais de ligação ao primer
idênticos aos do ARN do VHC e uma região única de ligação à sonda, que
permite a diferenciação entre o amplicon do VHC e o amplicon do HCV
Quantification Standard. O HCV Quantification Standard é adicionado a cada
54
MATERIAL E MÉTODOS
uma das amostras a testar num número de cópias conhecidas sendo
incorporado no processo de transcrição reversa, amplificação por PCR,
hibridização e detecção juntamente com o ARN VHC. A concentração é
expressa em Unidades Internacionais (UI)/ml.
O limite de detecção do teste utilizado é de 400 Ul/ml.
As técnicas de biologia molecular foram realizadas no Serviço de
Imunohemoterapia, sob a coordenação do Dr. Fernando Araújo.
A resposta à terapêutica combinada de PEG-IFN e RBV foi avaliada através de
determinações séricas sequenciais do ARN do VHC e das transaminases.
Foi considerada como resposta virológica a supressão do ARN do VHC no final
do tratamento, e como resposta bioquímica a normalização das transaminases
no final do tratamento. Os indivíduos que apresentaram simultaneamente
resposta virológica e resposta bioquímica no final do tratamento, foram
considerados como tendo resposta completa.
Foi ainda considerada resposta virológica precoce, a negativação da carga
vírica ou um decréscimo de 2 loglO relativamente ao valor basal, à décima
segunda semana de tratamento.
Consideraram-se não respondedores todos os doentes que não negativaram o
ARN do VHC no final do tratamento.
Para análise dos resultados, a carga vírica pré tratamento foi definida como
muito elevada se superior a 1 milhão IU/ml e as transaminases foram
categorizadas em 2 grupos: > 3 vezes o limite superior do normal e < 3 vezes o
limite superior do normal.
A análise estatística dos resultados foi realizada utilizando o programa SPSS
11.0 para o Windows. Os testes utilizados foram o^2 e o t de Student. O
significado estatístico foi considerado para valores de p inferiores a 0,05.
55
RESULTADOS
6. RESULTADOS
Características da população
As características dos 44 doentes englobados neste estudo estão resumidas na Tabela 4.
n % Sexo Masculino 26 59 Feminino 18 41 Tipo de resposta a tratamentos prévios Não respondedores 18 41 Récidivantes 26 59 Genótipo 1 35 79 3 6 14 4 3 7 Carga vírica > 1 milhão 7 16 < 1 milhão 37 84 Estádio histológico Sem fibrose 17 39 Com fibrose 19 43 Cirrose 8 18 Modo de transmissão Drogas endovenosas 15 34 Transfusão 18 41 Esporádica 11 25 índice de Massa Corporal (kg/m2) <25 14 32 >25 30 68
média d.p.
48,75 13,33 72,05 12,7 134,65 85,11 88,79 53,23 5.551ogl0 0,921ogl0
Tabela 4 . Caracterização da população
Idade (anos) Peso (kg) ALT pré tratamento AST pré tratamento ARN VHC pré tratamento
56
RESULTADOS
Dos 44 doentes tratados, 26 (59%) eram do sexo masculino e 18 (41%) do sexo
feminino. A idade média foi de 48,75 ± 13,33 anos (22-72 anos). Sessenta e oito
por cento dos indivíduos foram considerados obesos (índice de massa corporal
> 25), com peso médio de 72,05+12,7 kg.
Relativamente ao modo de transmissão do VHC, 15 doentes (34%) eram ex-
toxicodependentes por via endovenosa, 18 (41%) terão adquirido a infecção
através de produtos sanguíneos contaminados, e em 11 (25%) indivíduos não
foi possível identificar o modo de infecção.
O genótipo 1 foi o mais prevalente, presente em 79% dos doentes, enquanto que
os genótipos 3 e 4, estiveram presentes em 14% e 7% dos indivíduos,
respectivamente.
No início do tratamento 7 doentes (16%) apresentavam viremias determinadas
por PCR quantitativo superiores a 1 milhão IU/ml.
Em relação ao tipo de resposta obtida com a terapêutica prévia combinada, 18
doentes (41%) não tinham obtido resposta e 26 doentes (59%) tinham recidivado
nos seis meses seguintes à conclusão do tratamento.
A concentração média das transaminases foi de 134,65±85,11 U/L para a ALT e
de 88,79±53,23 para a AST. Categorizando os valores séricos das transaminases
pré tratamento, 21 doentes (48%) apresentaram valores inferiores a 3 vezes o
limite superior do normal e 23 doentes (52%) apresentaram valores iguais ou
superiores a 3 vezes o limite superior do normal.
Em termos de estádio histológico, 8 doentes (18%) apresentavam cirrose, em 19
(43%) descrevia-se fibrose e em 17 (39%) não se observou fibrose. Considerando
a actividade necroinflamatória, 33 doentes (75%) apresentaram actividade
ligeira e 11 (25%) apresentaram actividade moderada.
57
RESULTADOS
Na Tabela 5 estão resumidos os parâmetros analíticos avaliados pré tratamento.
média d.p mín-max
Hemoglobina (g/dl) 15,28 1,54 11,6-17,9
Leucócitos (xlO/1) 5,84 1,96 2,91-9,75
Plaquetas (xlO/1) 168,0 79,61 42-389
Creatinina (mg/l) 7,44 1,05 5,6-9,4
Albumina (g/l) 46,78 2,90 40,5-52,4
Bilirrubina total (mg/l) 8,92 3,80 2,9-19,4
Colesterol total (g/l) 1,69 0,40 1,01-1,37
Tempo de protrombina (seg) 11,81 0,70 10,5-13,5
Alfa-fetoproteína (ng/ml) 14,8 39,72 2-245
Tabela 5. Parâmetros analíticos pré-tratamento
Resposta à terapêutica : supressão do ARN do VHC e normalização das transaminases
A terapêutica combinada de PEG-IFN e RBV conduziu à supressão dos níveis
séricos de ARN do VHC às 12 semanas de tratamento em 21 doentes (48%), e à
diminuição da carga vírica em > 2 loglO em 4 doentes (9%). Considerando a
resposta no final do tratamento às 48 semanas, 13 doentes (30%) mantinham a
negativação do ARN do VHC no soro. Dos doentes que não apresentaram
resposta parcial à 12a semana, apenas 1 obteve resposta virológica no final do
tratamento.
Em termos de resposta bioquímica, às 12 semanas de tratamento 20 doentes
(45%) tinham normalizado os valores de transaminases, número que diminuiu
58
RESULTADOS
para 13 doentes às 48 semanas, tendo sido obtida uma resposta bioquímica em
30% dos doentes. A média da ALT variou de 134,6±84/9 para 56,18±34,93 e a da
AST variou de 88,79±53,23 para 46,32±29,86.
Na Tabela 6 estão sumariadas as principais características da resposta ao tratamento com PEG-INF + RBV.
i i % Supressão do ARN do VHC
Semana 12 21 48 Semana 24 11 25 Semana 48 13 30
Normalização das transaminases Semana 12 20 45 Semana 24 14 32 Semana 48 13 30
Tabela 6 Características da resposta virológica e bioquímica ao tratamento com
Interferon Peguilado e Ribavirina.
Nos Gráficos 1 e 2 estão representadas as variações da carga vírica e do valor
de transaminases ao longo das 48 semanas de tratamento.
MêsO Mês 3 Mês 6 Mês 12 Tempo
Gráfico 1. Variação da virémia durante as 48 semanas de tratamento
59
RESULTADOS
700
600 -—* 3 500-'***' « 0 400 -c E 300 -(0 w c ra 200-H
100 -
0 Mês 0 Mês 3 Mês 6 Mês 12
Tempo
Gráfico 2. Variação das transaminases durante as 48 semanas de tratamento
Quando se procedeu à análise da variação da carga vírica ao longo das 48
semanas de tratamento verificamos que dos 21 doentes com ARN do VHC
indetectável às 12 semanas de tratamento, apenas 11/21 (52%) mantiveram a
supressão vírica. Observou-se também, que os outros 2 doentes que obtiveram
resposta virológica no final do tratamento tinham carga vírica detectável às 12 e
24 semanas de tratamento. No entanto, um desses doentes apresentou resposta
virológica precoce. Dos outros 10/21 doentes com resposta virológica precoce,
apenas 3/10 (30%) mantiveram o ARN do VHC indetectável às 24 semanas de
tratamento, tendo o ARN do VHC positivado às 24 semanas nos restantes 7
doentes ("breaktrough").
Em suma, e como representado de forma esquemática na Figura 5, no final do
tratamento, 13 doentes apresentaram negativação do ARN do VHC. Desses 13
doentes, 12 apresentaram resposta virológica precoce (onze negativaram o ARN
do VHC e um apresentou uma diminuição da carga vírica >2 loglO). Apenas
60
RESULTADOS
um doente que respondeu no final do tratamento mantinha carga vírica positiva
à semana 12 e semana 24, sem diminuição significativa do seu valor.
Semana 0 ARN VHC +
(n=44)
Semanal2 ARN VHC + (n-23)
ARN VHC-(n-1)
ARN VHC+ (n=19)
ARN VHC+ (n= 21)
ARN VHC-(n=l)
ARN VHC (n=21)
ARN VHC-(n= 11)
ARN VHC+ (n=10)
Fig. 5. Variação da carga vírica ao longo das 48 semanas de tratamento.
Relativamente à variação das transaminases, dos 13 doentes (30%) que
apresentaram normalização das transaminases no final do tratamento, 4 (30%)
apresentavam valores acima do limite superior do normal à décima segunda
semana de tratamento, enquanto que os restantes 9 doentes (70%) já tinham
normalizado as transaminases a essa data. Dos 4 doentes respondedores com
valores elevados às 12 semanas, apenas 2 tinham transaminases normais às 24
semanas de tratamento. Dos 14 doentes com transaminases normais às 24
semanas, 12 apresentavam valores normais às 12 semanas, e apenas 9 (64%)
mantiveram transaminases normais no final do tratamento.
61
RESULTADOS
N a Figura 6 esquematiza-se a evolução das t ransaminases ao longo das 48
semanas de t ra tamento.
Semana 0
Semana 12
Semana 24
Semana 48
ALTN (n-20)
ALTN (n=9)
ALT AN (n=44)
ALTN (n-11)
ALT AN (n-24)
ALTN (n-4)
ALTN ALT AN ALTN ALT AN (n=12) (n=8) (n-2) (n-22)
i r i r
^
▼
ALTN (n=20)
Fig 6. Variação das transaminases ao longo das 48 semanas de tratamento.
Q u a n d o se pre tendeu analisar a ocorrência simultânea de resposta virológica e
resposta bioquímica-resposta completa (Tabela 7), verificou-se que dos 13
doentes que apresentaram negativação d o ARN do VHC, 9 (69%) normal izaram
s imul taneamente as t ransaminases . Os restantes 4 doentes apresentaram apenas
resposta virológica, m a n t e n d o valores de t ransaminases acima d o limite
superior d o normal e semelhantes aos valores pré t ra tamento. Em 4 / 1 3 (31%)
doentes verificou-se apenas u m a resposta bioquímica persist indo detectável no
62
RESULTADOS
soro o ARN do VHC. Apenas 20% (9/44) dos doentes tratados durante 48
semanas obtiveram uma resposta completa (negativação do ARN do VHC e
normalização das transaminases).
Transaminases N Transaminases AN
ARN do VHC negativo 9 (20%) 4 (9%)
ARN do VHC positivo 4 (9%) 27 (62%)
Tabela 7. Correlação entre resposta virulógica e resposta bioquímica no final do tratamento.
Efeito do tratamento nas subpopulações de linfócitos CD4 e CD8 e autoanticorpos
Avaliamos a evolução das subpopulações de linfócitos CD4 e CD8 e a razão
CD4/CD8, antes e após o tratamento com PEG-IFN e RBV. Na Tabela 8
apresentamos a comparação entre os valores médios basais e à semana 48.
Semana 0 Semana 48
média ±d.p. média ± d.p.
49,44 ± 5,58
P
Linfócitos CD4 48,12 ± 7,5
média ± d.p.
49,44 ± 5,58 0,205
Linfócitos CD8 24,95 ± 6,35 23,86 ± 4,64 0,242
Razão CD4/CD8 2,51 ± 1,74 2,52 ± 0,88 0,235
Tabela 8. Evolução das subpopulações linfocitárias com a terapêutica combinada PEG-IFN e RBV
O tratamento combinado de PEG-IFN e RBV não produziu alterações
significativas nas subpopulações linfocitárias. Embora se tenha verificado um
aumento do valor médio dos linfócitos CD4 e da razão CD4/CD8 após o
tratamento, nenhuma destas variações adquiriu significado estatístico.
63
RESULTADOS
Durante o tratamento não detectamos a presença de novo de autoanticorpos,
excepto no doente que desenvolveu hipotiroidismo com anticorpos
antitiroideus positivos. O doseamento das imunoglobulinas também não
mostrou variação ao longo do tratamento.
Factores pré tratamento e resposta à terapêutica
Os parâmetros analisados foram o sexo (feminino versus masculino), a idade
(<40 anos versus > 40 anos), o índice de massa corporal (< 25 versus > 25), o
modo de infecção (drogas endovenosas versus outros), o genótipo (genótipo 1
versus genótipo não 1), a carga vírica basal (<1 milhão cópias/ml versus >1
milhão cópias/ml), o valor basal de transaminases (< 3N versus > 3N), o tipo de
resposta ao tratamento prévio (não resposta versus recidiva), a carga vírica à
semana 12 (negativa versus positiva), a resposta vírica parcial à semana 12
(positiva versus negativa), a actividade necroinflamatória na histologia (ligeira
versus moderada), e o estádio histológico (com cirrose versus com fibrose versus
sem fibrose).
Em seguida apresentam-se as várias Tabelas que demonstram os resultados
obtidos para as diferentes variáveis estudadas.
64
RESULTADOS
Tabela 9. CORRELAÇÃO ENTRE SEXO E RESPOSTA NO FINAL DO TRATAMENTO
RESPOSTA 48 SEMANAS
Total Resposta Não Resposta Total
SEXO
Masculino 34,6% (n=9) 65,4% (n=17) 100% (n=26)
Feminino 22,2% (n=4) 77,8% (n=14) 100% (n=18)
Total 29,5% (n=13) 70,5% (n=31) 100% (n=44)
p=0,376
Não se registaram diferenças significativas entre o sexo masculino e o sexo
feminino nas taxas de resposta.
Tabela 10. CORRELAÇÃO ENTRE IDADE E RESPOSTA NO FINAL DO TRATAMENTO
RESPOSTA 48 SEMANAS
Total Resposta Não Resposta Total
IDADE
< 40 anos 61,5% (n=8) 38,5% (n=5) 100% (n=13)
> 40 anos 16,1% (n=5) 83,9% (n=26) 100% (n=31)
Total 29,5% (n=13) 70,5% (n=31) 100% (n=44)
p=0,03
O grupo dos doentes com idade inferior a 40 anos, apresentou taxas de resposta
significativamente mais elevadas do que o grupo de doentes com mais de 40
anos.
65
RESULTADOS
Tabela 11. CORRELAÇÃO ENTRE O IMC E RESPOSTA NO FINAL DO TRATAMENTO
RESPOSTA 48 SEMANAS
Total Resposta Não Resposta Total
IMC
<25 50% (n=7) 50% (n=7) 100% (n=14)
>25 20% (n=6) 80% (n=24) 100% (n=30)
Total 29,5% (n=13) 70,5% (n=31) 100% (n=44)
p= 0,042
Os indivíduos com índice de massa corporal inferior a 25 apresentaram taxas de
resposta significativamente mais elevadas.
Tabela 12. CORRELAÇÃO ENTRE MODO DE INFECÇÃO E RESPOSTA NO FINAL DO
TRATAMENTO
RESPOSTA 48 SEMANAS
Total Resposta Não Resposta Total
MODO INFECÇÃO
Tox 53,3% (n=8) 46,7% (n=7) 100% (n=15)
Não Tox 17,2% (n=5) 82,8% (n=24) 100% (n=29)^
Total 29,5% (n=13) 70,5% (n=31) 100% (n=44)
p=0,019
Os indivíduos toxicodependentes, com aquisição do VHC pelo consumo de
drogas endovenosas apresentaram taxas de resposta significativamente
superiores aos que adquiriram a infecção de forma esporádica ou pela
administração de derivados sanguíneos contaminados.
66
RESULTADOS
Tabela 13. CORRELAÇÃO ENTRE RESPOSTA AO TRATAMENTO PRÉVIO E
RESPOSTA NO FINAL DO NOVO TRATAMENTO
RESPOSTA 48 SEMANAS
Total Resposta Não Resposta Total
TX PRÉVIO
Não resposta 16,7% (n=3) 83,3% (n=15) 100% (n=18)
Recidiva 38,5% (n=10) 61,5% (n=16) 100% (n=26)
Total 29,5% (n=13) 70,5% (n=31) 100% (n=44)
p=0,119
Apesar dos indivíduos récidivantes a terapêutica prévia responderem em maior
percentagem do que os não respondedores a tratamento anterior, essa diferença
não foi estatisticamente significativa.
Tabela 14. CORRELAÇÃO ENTRE GENÓTIPO E RESPOSTA NO FINAL DO
TRATAMENTO
RESPOSTA 48 SEMANAS
Total Resposta Não Resposta Total
GENÓTTPO
Genótipo 1 31,4% (n=ll) 68,6% (n=24) 100% (n=35)
Genótipo nãol 22,2% (n=2) 77,8% (n=7) 100% (n=9)
Total 29,5% (n=13) 70,5% (n=31) 100% (n=44)
p=0,589
Não se verificaram diferenças quanto ao genótipo na taxa de resposta.
67
RESULTADOS
Tabela 15. CORRELAÇÃO ENTRE CARGA VÍRICA BASAL E RESPOSTA NO FINAL DO
TRATAMENTO
RESPOSTA 48 SEMANAS
Total Resposta Não Resposta Total
GENÔTIPO
< lmilhão Ul /ml 24,3% (n=9) 75,7% (n=28) 100% (n=37)
> lmilhão Ul /ml 57,1% (n=4) 42,9% (n=3) 100% (n=7)
Total 29,5% (n=13) 70,5% (n=31) 100% (n=44)
p=0,099
A carga vírica basal não influenciou de forma significativa a resposta ao
tratamento, com 57% dos indivíduos com carga vírica superior a 1 milhão a
responderam no final do tratamento.
Tabela 16. CORRELAÇÃO ENTRE ALT/AST BASAL E RESPOSTA NO FINAL DO
TRATAMENTO
RESPOSTA 48 SEMANAS
Total Resposta Não Resposta Total
ALT/AST
<3N 30,4% (n=7) 69,6% (n=14) 100% (n=21)
>3N 28,6% (n=6) 71,4% (n=17) 100% (n=23)
Total 29,5% (n=13) 70,5% (n=31) 100% (n=44)
p=0,438
O valor das transaminases antes do início do tratamento não influenciou de
forma significativa a resposta.
68
RESULTADOS
Tabela 17. CORRELAÇÃO ENTRE SUPRESSÃO VÍRICA À SEMANA 12 E RESPOSTA
NO FINAL DO TRATAMENTO
RESPOSTA 48 SEMANAS
Total Resposta Não Resposta Total
ARN VHC12 SEM
NEG 52,4% (n=ll) 47,6% (n=10) 100% (n=21)
POS 8,7% (n=2) 91,3% (n=21) 100% (n=23)
Total 29,5% (n=13) 70,5% (n=31) 100% (n=44)
p=0,002
A supressão do ARN do VHC às 12 semanas de tratamento associou-se
estatisticamente a resposta no final do tratamento.
Tabela 18. CORRELAÇÃO ENTRE DIMINUIÇÃO DA CARGA VÍRICA À SEMANA 12 E
RESPOSTA NO FINAL DO TRATAMENTO
RESPOSTA 48 SEMANAS
Total Resposta Não Resposta Total
ARN VHC SEM 12
< 2 loglO 5,2% (n=l) 94,8% (n=18) 100% (n=19)
> 2 loglO 48% (n=12) 52% (n=13) 100% (n=25)
Total 29,5% (n=13) 70,5% (n=31) 100% (n=44)
p=0,001
Uma resposta virológica precoce (a diminuição da carga vírica superior a 21ogl0
inclui os doentes que negativaram o ARN do VHC) associou-se a uma resposta
virológica no final do tratamento.
69
RESULTADOS
Tabela 19. CORRELAÇÃO ENTRE FIBROSE E CIRROSE E RESPOSTA NO FINAL DO
TRATAMENTO
RESPOSTA 48 SEMANAS
Total Resposta Não Resposta Total
FIBROSE
Sem Fibrose 17,6% (n=3) 82,4% (n=14) 100% (n=17)
Com Fibrose 36,8% (n=7) 63,2% ín=12) 100% ín=19)
Cirrose 37,5% (n=3) 62,5% (n=5) 100% (n=8)
Total 29,5% (n=13) 70,5% (n=31) 100% (n=44)
p=0,586
A presença ou ausência de fibrose, bem como a existência ou não de cirrose não
se correlacionou com a taxa de resposta.
Tabela 20. CORRELAÇÃO ENTRE ACTIVIDADE NECRO-INFLAMATÓRIA E
RESPOSTA NO FINAL DO TRATAMENTO
RESPOSTA 48 SEMANAS
Total Resposta Não Resposta Total
ACTIVIDADE
Ligeira 21,2% (n=7) 78,8 % (n=26) 100% (n=33)
Moderada 54,5% (n=6) 45,5% (n=5) 100% (n=ll)
Total 29,5% (n=13) 70,5% (n=31) 100% (n=44)
p=0,074
O grau de actividade necroinflamatória não se correlacionou com a taxa de
resposta.
70
RESULTADOS
Dos factores dependentes do hospedeiro, a idade inferior a 40 anos, o índice de
massa corporal inferior a 25, e a aquisição da infecção através do consumo de
drogas por via endovenosa, foram os que demonstraram influenciar de forma
significativa a resposta ao tratamento combinado com interferon peguilado e
ribavirina. Dos factores relacionados com o vírus, apenas a supressão ou a
diminuição superior a 2 loglO da virémia à décima segunda semana de
tratamento, foram preditivos de resposta.
Comparação entre parâmetros clínicos e virológicos
Para além dos factores relacionáveis com a obtenção de resposta, também
estudamos algumas correlações possíveis entre parâmetros virológicos e
características clínicas, apresentando-se em seguida os resultados obtidos.
Quando comparamos o tipo de resposta ao tratamento prévio (recidiva versus
não resposta) relativamente à carga vírica basal, ao genótipo, aos valores basais
de transaminases e à presença ou ausência de cirrose, verificamos diferenças
com significado estatístico apenas em relação ao estádio histológico (Tabela 21).
Embora em ambos os grupos predominassem os não cirróticos (constituem 82%
da população estudada), esta diferença é mais evidente no grupo dos
récidivantes, enquanto que no grupo dos não respondedores é mais equilibrada
a proporção cirróticos/não cirróticos.
Em termos de carga vírica e transaminases basais a diferença entre os dois
grupos não foi significativa (p=0,33 e p=0,42 respectivamente). O genótipo 1
estava presente em 77,8% dos não respondedores e 80% dos récidivantes
(p=0,86).
71
RESULTADOS
Tabela 21. CORRELAÇÃO ENTRE RESPOSTA AO TRATAMENTO ANTERIOR E
HISTOLOGIA
HISTOLOGIA
Total Cirrose Não cirrose Total
TX PRÉVIO
Não resposta 33,3% (n=6) 66,7% (n=12) 100% (n=18)
Recidiva 7,7% (n=2) 92,3% (n=24) 100% (n=26)
Total 18,2% (n=8) 81,8% (n=36) 100% (n=44)
p=0,03
Na comparação entre os parâmetros virológicos (carga vírica e genótipo), e os
valores basais de transaminases e estádio histológico, encontraram-se os
seguintes resultados:
- a média da ALT para carga vírica inferior a 1 milhão Ul/ml, foi de
141,73±88,85 e para carga vírica superior a 1 milhão Ul /ml foi de 91,0±36,72
(p=0,32);
- a média da AST para carga vírica inferior a 1 milhão Ul/ml, foi de 93,84±55,4 e
para carga vírica superior a 1 milhão Ul /ml 57,67±18,85 (p=0,10);
- o valor médio da carga vírica pré-tratamento foi semelhante no grupo com
cirrose (5,47 logl0±0,43) e sem cirrose (5,56±0,99) (p=0,264);
- o genótipo vírico não se relacionou com o valor de transaminases, ou seja, o
genótipo 1 e não-1 associaram-se a valores médios de transaminases sem
diferença significativa (AST:89,06±9,57 e ALT:121,59±11,49 para o genótipo 1, e
AST:87,78±14,96 e ALT:184,0±42,2 para o genótipo não 1) (p=0,39);
- quando comparamos o genótipo e a carga vírica basal não verificamos
diferenças: os indivíduos com genótipo 1 apresentavam uma carga vírica média
de 5,5 loglO, e os indivíduos com genótipo não-1 apresentavam uma carga
vírica média de 5,7 loglO (p=0.68);
72
RESULTADOS
- nenhum genótipo se associou de forma significativa à presença ou ausência de
cirrose. Dos indivíduos com genótipo 1, seis (17,1%) apresentavam cirrose, e
dos indivíduos com genótipo não-1, dois (22,2%) apresentavam cirrose
(p=0,637).
Como um dos factores preditivos de resposta encontrado foi o modo de
infecção, comparamos algumas variáveis entre as diferentes vias de contágio.
Os indivíduos toxicodependentes eram significativamente mais jovens do que
os outros 2 grupos, com uma média de idade de 38,5±9,3 anos (p=0,04). Os
indivíduos infectados através de derivados do sangue contaminados
apresentavam uma média de idade de 52,5+13,43 anos, e os indivíduos com
infecção esporádica apresentavam uma média de idade de 57,8±7,92 anos.
Neste último grupo de 11 doentes não se encontrava nenhum indivíduo com
idade inferior a 40 anos.
Em relação ao genótipo infectante não encontramos diferenças com significado
estatístico entre os 3 tipos de contágio (p=0,39), o que também se verificou em
relação à duração média da infecção (p=0,76).
Tolerabilidade e reacções adversas à terapêutica
Verificaram-se efeitos laterais clinicamente importantes em 11 doentes (25%),
tendo motivado a interrupção do tratamento em 8 doentes (18%) e redução de
dose de ribavirina em 3 doentes (7%). As causas que motivaram a suspensão do
tratamento foram as seguintes: hepatite aguda, em 2 doentes; toxicodermia,
num doente; alterações psiquiátricas graves num doente; hipotiroidismo num
doente; infecções de repetição e diabetes mellitus de difícil controlo num
doente; e não aderência ao tratamento em 2 doentes. A redução de dose,
73
RESULTADOS
necessária em 3 doentes, deveu-se aos efeitos hematológicos registados (axiemia
em 1 e trombocitopenia em 2). Após a suspensão da terapêutica verificou-se
uma recuperação total e progressiva das alterações clínicas e analíticas
observadas. Os 3 doentes que necessitaram de diminuição de dose puderam
desse modo completar a duração prevista do tratamento.
Na totalidade dos 44 doentes tratados, os efeitos laterais observados com maior
frequência foram os seguintes: astenia em 41 doentes (93%), emagrecimento
superior a 5% do peso basal em 40 doentes (90%); alterações do humor em 40
doentes (90%); dispepsia em 23 doentes (52%); prurido em 20 doentes (45%);
xerodermia em 15 doentes (34%); e atrofia cutânea no local da injecção em 3
doentes (7%). Nenhum destes efeitos secundários motivou redução de dose ou
interrupção do tratamento.
74
RESULTADOS
SUMÁRIO DOS RESULTADOS
Características ãa população
Dos 44 doentes estudados, 26 (59%) eram do sexo masculino e 18 (41%)eram do
sexo feminino. A média de idade desta população era de 48,75±13,33 anos.
Dezoito (41%) dos doentes não tinham respondido a tratamentos prévios
combinados de interferon e ribavirina, e os restantes 26 doentes (59%) tinham
recidivado após a suspensão do tratamento.
O modo de transmissão foi em 18 doentes (41%) pela administração de
produtos sanguíneos contaminados, em 15 doentes (34%) pelo uso de drogas
por via endovenosa e 11 doentes (25%) faziam parte da categoria de
transmissão esporádica.
O genótipo 1 foi o mais prevalente, estando presente em 35 doentes (79%), e o
genótipo 3 e 4 infectavam respectivamente 6 (14%) e 3 (7%)doentes.
A carga vírica basal era superior a 1 milhão de Ul /ml em 7 doentes (16%).
Em termos de estádio e actividade histológica, 8 doentes (18%) apresentavam
;, e 11 doentes (25%) apresentavam actividade inflamatória moderada. cirrose,
Todos os doentes apresentavam valores de transaminases superiores a 2xLSN,
sendo a média pré-tratamento de 134,65±85,11 U / l para a ALT e de 88,79±53,23
U / l para a AST.
75
RESULTADOS
Resposta à terapêutica : supressão do ARN do VHC e normalização das transaminases
Observámos a supressão do ARN do VHC em 13 (30%) dos 44 doentes, no fim
das 48 semanas de terapêutica combinada de interferon peguilado e ribavirina.
A normalização dos valores de transaminases ocorreu também em 13 dos 44
doentes (30%). A ocorrência simultânea de resposta virológica e bioquímica
verificou-se em 9 doentes (20%).
Efeito do tratamento nas subpopulações de linfócitos CD4 e CD8e autoanticorpos
Quando comparámos a percentagem média de linfócitos CD4, CD8 e a média
da razão CD4/CD8, antes e após o tratamento, não observamos diferenças com
significado estatístico. Um doente desenvolveu manifestações de
autoimunidade com o aparecimento de anticorpos antitiroideus e consequente
hipotiroidismo.
Factores pré tratamento e resposta à terapêutica
Em relação aos parâmetros pré tratamento analisados, os que se associaram de
forma estatisticamente significativa com a obtenção de resposta virológica no
final do tratamento foram os seguintes: obtenção de resposta virológica parcial
às 12 semanas de tratamento; infecção por meio de drogas endovenosas; idade
inferior a 40 anos e índice de massa corporal inferior a 25.
Dos restantes parâmetros analisados (carga vírica basal, transaminases basais,
genótipo, tipo de resposta a tratamento prévio, sexo e grau de actividade
inflamatória e fibrose), nenhum mostrou correlação com significado estatístico
na obtenção de resposta ao tratamento.
76
RESULTAEOS
Comparação entre parâmetros clínicos e virológicos
Quando avaliamos a associação entre as características virológicas (genótipo e
carga vírica basal) e as caracterísicas clínicas dos nossos doentes (transaminases,
estádio histológico) não encontramos nenhuma correlação. Do mesmo modo, o
tipo de resposta ao tratamento anterior também não se correlacionou com o
genótipo ou carga vírica, nem com o valor basal das transaminases. Porém,
encontramos uma associação entre o tipo de resposta prévia e a presença ou
ausência de cirrose. Noventa e dois por cento dos indivíduos récidivantes não
apresentavam cirrose, enquanto que no grupo dos não respondedores 33,3%
apresentavam cirrose (p=0,03).
Verificámos também que o grupo dos toxicodependentes, parâmetro clínico
preditivo de resposta, apresentava uma média de idade inferior aos outros 2
grupos e à média geral (p=0,04).
Tolerabilidade e reacções adversas à terapêutica
Dos 44 doentes que iniciaram a terapêutica, 8 (18%) tiveram de suspender a sua
administração previamente às 48 semanas de tratamento, pelo desenvolvimento
de efeitos laterais graves, e em 3 (7%) foi necessário proceder a redução da dose
inicial. Os efeitos laterais que motivaram a suspensão da terapêutica foram: hepatite
aguda ao PEG, toxicodermia, alterações psiquiátricas graves, hipotiroidismo,
infecções de repetição e diabetes mellitus não controlável.
Para além destes efeitos laterais verificaram-se outros com frequência elevada,
mas que não impediram a manutenção e conclusão do tratamento: astenia,
emagrecimento, alterações do humor, dispepsia, prurido, xerodermia e atrofia
cutânea no local da picada.
77
DISCUSSÃO
7. DISCUSSÃO
O nosso estudo pretendeu caracterizar os parâmetros clínicos e virológicos que
influenciam a resposta ao tratamento com interferon peguilado e ribavirina, em
indivíduos que não responderam ou recidivaram a tratamento prévio com
interferon e ribavirina. Tratando-se de um grupo de doentes particularmente
difícil, sobre os quais escasseiam dados na literatura, tentamos ainda estabelecer
critérios preditivos de resposta. A dificuldade acrescida deste grupo, ocorre não
só pela componente motivacional que condiciona a aderência a este tratamento
prolongado e incómodo, como também pela possível resistência real que
representam estes doentes, seja pelas suas características imunológicas, seja
pelas circunstâncias decorrentes do convívio prolongado hospedeiro/ vírus.
Neste estudo prospectivo foram incluídos 44 doentes com infecção crónica pelo
VHC, com sinais de replicação vírica activa e marcadores de citólise hepática,
traduzidos por ARN do VHC detectado no soro, e valores de transaminases
séricas elevados. Todos os doentes tinham sido previamente submetidos a
tratamento com interferon e ribavirina, ao qual não responderam ou
recidivaram. O estudo teve a duração de 48 semanas.
Tendo em conta a evolução da infecção crónica pelo VHC,o objectivo
primordial do tratamento é a erradicação vírica sustentada e a cura da doença.
No entanto nem sempre é possível alcançar estes objectivos, sendo então
importante definir objectivos secundários, como sejam a diminuição da
inflamação hepática e o atraso da progressão para cirrose, a prevenção da
descompensação hepática e do carcinoma hepatocelular, e a diminuição da
mortalidade.
Embora se saiba que os indivíduos tratados com terapêutica antivírica
apresentam melhoria histológica mesmo que não obtenham resposta virológica,
o significado e a duração desta melhoria permanece ainda desconhecido. Vários
78
DISCUSSÃO
estudos156165166167168 demonstraram uma melhoria significativa das alterações
histológicas nos indivíduos submetidos a tratamento da hepatite C, mais
evidente nos indivíduos que obtiveram RVS. A fibrose e mesmo a cirrose
hepática parecem ser entidades dinâmicas e parcialmente reversíveis com uma
terapêutica eficaz, possivelmente mesmo na ausência de uma resposta
virológica.
Torna-se assim plausível admitir que o aparecimento de fármacos mais eficazes,
podem permitir obter uma maior taxa de eliminação vírica, e que isso seja o
factor determinante para se obter um atraso na progressão da doença hepática
ou mesmo a sua regressão.
Os doentes incluídos neste estudo, ao não terem previamente respondido de
forma sustentada ao tratamento combinado, não podiam ser considerados à
partida como tendo um prognóstico mais favorável do que os indivíduos que
nunca haviam sido tratados, legitimando a sua admissão a propostas
terapêuticas potencialmente mais eficazes, quer em termos de acção antivírica,
ou de imunomodulação. A disponibilidade de um novo fármaco,
comprovadamente mais eficaz, capaz de obter taxas de resposta superiores às
descritas anteriormente, justificou a inclusão destes indivíduos num novo ciclo
terapêutico.
A enorme maioria dos estudos publicados na literatura acerca de retratamento
da hepatite C, são relativos a falências de tratamento em esquemas de
monoterapia com IPN. Nestes estudos, ficou demonstrado que o tipo de
resposta (não resposta versus recidiva) à terapêutica inicial e a diferença de
eficácia entre os dois regimes utilizados são factores determinantes do sucesso
do retratamento. A informação disponível na literatura sobre retratamento dos
indivíduos não respondedores ao IFN demonstrou de forma inequívoca, que a
79
DISCUSSÃO
utilização do mesmo esquema terapêutico não acrescenta qualquer benefício,
enquanto que o uso concomitante de RBV possibilitou um aumento
significativo das respostas, permitindo que 12% a 15% dos indivíduos que
inicialmente não responderam atingissem uma resposta sustentada157-158'169-170.
De igual modo, a utilização do esquema combinado de IFN e RBV permitiu
obter respostas sustentadas de 49%, nos indivíduos récidivantes a
monoterapia162.
No grupo de doentes récidivantes, o genótipo e a carga vírica basal influenciam
a resposta162, enquanto que no grupo dos não respondedores, a existência de
uma resposta parcial (diminuição da carga vírica >2 loglO) ao tratamento inicial
parece ser um indicador de resposta ao retratamento.
Relativamente ao uso do PEG-IFN no retratamento, os dados são no entanto
mais limitados, pois só recentemente o seu uso foi aprovado para retratamento
de não respondedores. Mais uma vez os dados disponíveis são relativos ao
retratamento de não respondedores ou récidivantes a monoterapia com IFN,
existindo escassos estudos que englobam (e não os incluem em exclusividade)
doentes previamente tratados com terapêutica combinada159161. A terapêutica
combinada de PEG-IFN e RBV nos indivíduos tratados em monoterapia
permitiu oter respostas sustentadas de 34%-40% para os não respondedores e
60% para os récidivantes171.
Até ao momento ainda só foram realizados dois estudos159-161 utilizando PEG-
IFN e RBV no retratamento de não respondedores a IFN e RBV. Ambos os
estudos englobam doentes não respondedores a monoterapia e terapêutica
combinada. Apenas existem dados publicados relativamente a um dos
trabalhos161, no qual se obtiveram taxas de RVS de 18%, tendo sido
identificados como factores preditivos de resposta o tratamento prévio com IFN
80
DISCUSSÃO
em monoterapia, a infecção pelos genótipos 2 e 3, uma relação AST:ALT baixa,
a ausência de cirrose, e a manutenção da dose de RBV nas 20 semanas iniciais
de tratamento. Os resultados preliminares do estudo de Jacobsen et ai159
objectivaram uma taxa de resposta global de 25% no grupo que utilizou uma
dose de PEG-IFN 1,5 ug/kg/sem, e de 40% no grupo que utilizou PEG-IFN 1,0
ug/kg/sem, associado a doses mais elevadas de RBV. Quando os resultados
foram analisados de acordo com não resposta versus recidiva prévia, o grupo
dos não respondedores demonstrou as taxas de resposta mais baixa, com RVS
de apenas 10-11%.
Relativamente ao retratamento de récidivantes à terapêutica combinada, os 15
indivíduos tratados com PEG-IFN e RBV obtiveram uma resposta no fim do
tratamento de 87% e uma resposta sustentada de 60%.
No nosso grupo de doentes, e de acordo com os resultados preliminares
descritos na literatura, obtivemos uma taxa de resposta completa (virológica e
bioquímica) no final do tratamento de 20% (9 doentes). No entanto, foi possível
obter algum tipo de resposta em mais 8 doentes: 4 obtiveram resposta
virológica sem resposta bioquímica e 4 obtiveram resposta bioquímica sem
resposta virológica. Quando analisamos estes doentes, de acordo com os
parâmetros que havíamos estabelecido, não se encontraram diferenças que
pudessem justificar esse facto. No entanto, sabe-se que cerca de 10% dos
indivíduos tratados com IFN obtêm uma resposta bioquímica sem erradicação
do ARN do VHC172"174, o mesmo ocorrendo em 80% dos indivíduos tratados
com RBV em monoterapia175"176. Mesmo com a associação dos 2 fármacos
observam-se casos de resposta bioquímica isolada138-139. Relativamente à
obtenção de uma resposta virológica isolada, este achado era frequentemente
81
DISCUSSÃO
observado em estudos utilizando altas doses de IFN em monoterapia172174,
tendo sido também observado recentemente durante o tratamento com PEG-
IFN alfa-2a177. A razão para este facto permanece desconhecida, e no nosso
grupo de doentes não encontramos diferenças clínicas ou virológicas que o
pudessem justificar. É postulável a hepatotoxicidade do próprio interferon ou
do rearranjo molecular introduzido pela peguilação, que pudesse explicar
alguns casos de hepatite aguda como os que observamos, ou o desenvolvimento
de fenómenos de autoimunidade (embora nos nossos dois doentes com hepatite
aguda, não se tenha verificado o aparecimento de autoanticorpos, num vasto
painel explorado).
Contrariando no entanto os dados disponíveis da literatura, o tipo de resposta a
tratamentos prévios (recidiva versus não resposta) não influenciou, no nosso
estudo, de forma significativa, as taxas de resposta. Apesar da taxa de resposta
dos récidivantes ter sido superior -38,5% (10/26)- à dos não respondedores -
16,7% (3/18)- esta diferença não atingiu significado estatístico (p =0,119).
Embora a resposta nos récidivantes tenha sido superior aos não respondedores
e à resposta global, foi expressivamente mais baixa do que os dados disponíveis
na literatura. À semelhança do que se verificou na maioria dos estudos não foi
possível obter dados referentes à ocorrência de uma resposta virológica precoce
no grupo dos não respondedores, durante o tratamento prévio com IFN e RBV.
Quando analisamos estes 2 grupos, récidivantes e não respondedores,
relativamente a factores pré-tratamento que os distinguissem, verificamos que
apenas o estádio histológico apresentou diferenças com significado estatístico,
com uma percentagem significativamente mais elevada de indivíduos não
cirróticos no grupo dos récidivantes.
Na nossa série, 18% dos doentes apresentavam cirrose e 43% apresentavam
fibrose. Num estudo recente165 englobando 271 doentes, com cirrose (76%) ou
82
DISCUSSÃO
fibrose em ponte (24%), os autores obtiveram resposta sustentada de 30% nos
indivíduos tratados com PEG-IFN. O esquema terapêutico foi bem tolerado
nesta população, com necessidade de redução de dose em apenas 10% -14% dos
doentes por efeitos hematológicos.
Neste estudo, 20% dos indivíduos com cirrose e 36,8% dos indivíduos com
fibrose responderam, em comparação com 30% de respondedores nos doentes
sem fibrose (p=0,932). Estes dados, em consonância com a literatura,
demonstram que a cirrose compensada não é uma contraindicação para o
tratamento, e que a presença de fibrose não significa uma taxa de resposta
significativamente menor.
Nos nossos doentes a terapêutica teve uma tolerância aceitável, com
necessidade de redução de dose em 7% e suspensão do tratamento em 18%.
Relativamente aos efeitos laterais que motivaram a suspensão do tratamento
nenhum esteve directamente relacionado com o estádio histológico. Em relação
aos doentes que
necessitaram de redução de dose, pela ocorrência de efeitos hematológicos,
todos apresentavam cirrose na histologia.
As variáveis demográficas e virológicas associadas com uma resposta
sustentada já estão bem estabelecidas para o IFN convencional, associado ou
não a RBV138'139'178. Os estudos recentes sugerem que os factores pré-tratamento
preditivos de resposta ao PEG-IFN são semelhantes aos estabelecidos para o
IFN, com algumas excepções179. O genótipo não-1 permanece como o indicador
mais importante de resposta. Como factores adicionais foram referidos o valor
basal de ALT superior a 3 vezes o limite superior do normal e um índice de
actividade histológica superior a IO*79. Uma outra variável com grande
fiabilidade a predizer a não resposta ao tratamento, é a determinação
quantitativa do ARN do VHC. Os estudos com PEG-IFN em indivíduos naïve
indicaram também a importância da obtenção de uma resposta virológica
83
DISCUSSÃO
precoce, definida como a diminuição do ARN do VHC para valores
indetectáveis ou superior a 2 loglO, às 12 semanas de tratamento. Esta resposta
precoce, mais do que ser preditiva de uma resposta sustentada, identifica os
indivíduos com maior probabilidade de não resposta, permitindo a interrupção
do tratamento. Outro factor de grande importância é a aderência ao tratamento,
com a possibilidade de manter pelo menos 80% das doses iniciais dos fármacos
por um período superior a 80% do tempo previsto180.
Na ausência de dados referentes ao grupo particular de doentes que estudamos,
fomos avaliar nesta série de 44 doentes os factores que se associariam a resposta
no final do tratamento.
Dos parâmetros biológicos analisados (sexo, idade, índice de massa corporal),
apenas o sexo não seguiu os padrões descritos na literatura, verificando-se uma
maior resposta no sexo masculino (34,6% versus 22,2%), embora sem significado
estatístico (p=0,376). Os dados relativos à idade e índice de massa corporal
confirmaram os estudos anteriores, tendo-se obtido uma maior percentagem de
resposta nos indivíduos com idade inferior a 40 anos (61,5% versus 16,1%; p=
0,03) e sem excesso de peso (50% versus 20%; p-0,042).
Relativamente ao modo de aquisição da infecção, o grupo dos
toxicodependentes por via endovenosa respondeu numa percentagem mais
elevada (53,3% versus 17,2%; p=0,019) comparativamente ao grupo em que a
transmissão teria ocorrido através de produtos sanguíneos contaminados ou de
forma esporádica. Estes dados poderiam ser tradutores de diferenças entre o
genótipo infectante, o tempo de infecção ou a idade. Na análise efectuada
verificamos que estes resultados não se relacionaram nem com o genótipo nem
com o tempo de infecção, mas apenas com a idade. O grupo dos indivíduos ex-
toxicodependentes era significativamente mais jovem do que os restantes
doentes, o que está de acordo com os dados disponíveis na literatura
evidenciando a influência da idade na taxa de resposta à terapêutica.
84
DISCUSSÃO
Quando analisámos os valores das transaminases (< 3x LSN versus >3x LSN), e
a actividade necroinflamatória (ligeira/moderada), não verificamos que a
presença de sinais tradutores de agressão hepática (citólise) se associassem a
uma maior taxa de resposta. Apenas 28,6% dos indivíduos com transaminases
superiores a 3x LSN obtiveram resposta, comparativamente a 30,4% dos
indivíduos com valores inferiores a 3x LSN. Do mesmo modo, embora os
indivíduos com uma actividade necroinflamatória mais acentuada na
biópsiahepática tenham respondido numa maior percentagem (54,5% versus
21,2%), esta diferença não adquiriu significado estatístico (p=0,074). Verificamos
também que valores de transaminases mais elevados não se associaram a cargas
víricas mais elevadas, nem a genótipos particulares. Tanto o genótipo 1 como o
genótipo não-1 se associaram a subidas semelhantes nos valores de ALT e AST.
A valores mais elevados de cargas víricas basais não corresponderam valores de
transaminases significativamente mais elevados. Estes dados estão de acordo
com o conhecimento da biologia e comportamento da infecção pelo VHC, pois
sabe-se que o genótipo e a carga vírica não influenciam a magnitude da lesão
hepática.
Dos factores relacionados com o vírus, em oposição ao que estava descrito na
literatura, o genótipo e a carga vírica basal não foram factores preditivos de
resposta. Dos 13 doentes com ARN do VHC indetectável no final do
tratamento, 12 obtiveram uma resposta virológica precoce, o que está de acordo
com a literatura. Dos 21 indivíduos que negativaram o ARN do VHC à 12a
semana de tratamento, 52% responderam no final, enquanto que apenas 8% dos
que não negativaram, responderam. Do mesmo modo, dos indivíduos que
tiveram uma diminuição da carga vírica superior a 2 loglO (incluindo os que se
tornaram PCR negativos) à semana 12, 48% respondeu no final do tratamento,
comparativamente a apenas 5% dos doentes com uma diminuição da carga
vírica inferior a 2 loglO.
85
DISCUSSÃO
Nesta série confirmamos que a obtenção de uma resposta virológica precoce é
um factor preditivo de resposta à terapêutica.
Quando comparamos o número de doentes que negativaram o ARN do VHC à
décima segunda semana (21), com o número no final do tratamento (13),
constatamos que 38% dos doentes voltaram a ter ARN do VHC detectável no
soro. Este fenómeno é referenciado na literatura como fenómeno "breakthrough",
e é definido como o reaparecimento do ARN do VHC (ou uma subida das
transaminases acima do limite superior do normal) durante o período de
tratamento, num indivíduo que já havia obtido resposta. Este padrão de
resposta parece corresponder ao aparecimento de uma nova mutação ou
quasispecies do VHC, seleccionada pela pressão farmacológica, e que deixa de
ser sensível à terapêutica181182, ou pelo desenvolvimento de anticorpos contra o
IFN183.
Os nossos doentes já haviam sido submetidos a uma pressão de selecção prévia,
e provavelmente a população vírica infectante actual seria diferente da
população inicial, com uma maior complexidade genética. Sabe-se que durante
o tratamento com IFN ocorre uma modificação na composição das quasispecies,
resultante dessa designada pressão de selecção184. Uma maior complexidade e
diversidade de quasispecies pré-tratamento associa-se a uma menor taxa de
resposta ao IFN. Pawlotski63 demonstrou que durante o tratamento com IFN se
observam alterações nas variantes major das quasispecies HVR1. Um estudo
recente utilizando análise sequencial, demonstrou que os indivíduos que
respondem apresentam uma diminuição marcada da diversidade das
quasispecies numa fase inicial do tratamento, o que não se verifica nos não
respondedores185. Uma das diferenças entre o interferon convencional e o
interferon peguilado é a capacidade de se manterem nivéis plasmáticos
constantes de fármaco entre doses consecutivas. Desse modo mantém-se uma
supressão vírica permanente, o que teoricamente limitaria a capacidade de
86
DISCUSSÃO
"escape" vírico e a constituição e proliferação de uma população resistente ao
tratamento.
Os resultados obtidos no nosso estudo contrastam com este pressuposto, na
medida em que, parece evidente que durante o tratamento se desenvolveu uma
população resistente ao interferon, explicando o reaparecimento do ARN do
VHC, e que passou a ser a população dominante, condicionando a não resposta
no final do tratamento.
Até ao momento permanecem por esclarecer os mecanismos moleculares
envolvidos na resistência do HCV ao IFN. Enomoto186 descreveu uma região
específica no gene NS5A associada à sensibilidade ao IFN, no genótipo lb , que
foi denominada IFN-sensitivity-determining region (ISDR). Os indíviduos que
responderam à terapêutica apresentavam inúmeras substituições de
aminoácidos nessa zona, enquanto que os não respondedores apresentavam
uma região muito conservada. Outros estudos40187"189 surgiram com dados
contraditórios e até ao momento não foi identificada uma sequência consensual
associada à resistência ao IFN. Um dos possíveis mecanismos de interferência
vírica com a actividade antivírica do IFN, resulta da interacção da NS5A com a
proteína cínase (PKR), uma enzima celular induzida pelo IFN42. Esta interacção
resultaria na inibição da cínase. Subsequentemente foi identificada uma região a
jusante da ISDR, essencial para a ligação à PKR, e que demonstrou apresentar
uma maior heterogeneidade no grupo dos respondedores190.
Entretanto foi identificada uma outra região56provavelmente envolvida na
resistência ao IFN, na glicoproteína E2, denominada PePHD (PKR-eIF-2a
phosphorylation site), embora os resultados dos diversos estudos sejam
contraditórios e inconclusivos.
87
DISCUSSÃO
Com os nossos dados, relativos ao possível fenómeno de escape observado no
tratamento com IFN peguilado, também subscrevemos a noção de que um dos
caminhos para a evolução do tratamento da hepatite C passará pela
identificação precisa dos mecanismos moleculares de resistência vírica e sua
aplicabilidade clínica, com determinação das quasispecies pré tratamento,
seguimento da sua evolução durante o tratamento, e determinação das zonas
do genoma vírico determinantes da resposta.
As referências relativamente aos efeitos laterais da terapêutica evidenciam uma
elevada tolerância, mesmo nos indivíduos com cirrose, com taxas de suspensão
da terapêutica ou redução da dose entre os 10-15%. Na nossa série,
encontramos uma elevada incidência de efeitos laterais, comparativamente com
os encontrados por Fried et ai166 quando comparou PEG-IFN com IFN
convencional; no entanto apenas tivemos de proceder a redução da dose de
RBV para 600 mg/d ia em 3 doentes (7%), por repercussão hematológica. Em 8
doentes(18%) houve necessidade de interromper o tratamento, por efeitos
laterais graves. Em 2 doentes diagnosticou-se hepatite aguda grave191, um
doente desenvolveu uma toxicodermia à RBV, num doente houve necessidade
de interromper o tratamento por apresentar glicemias elevadas de difícil
controlo farmacológico associadas a prostatites de repetição, um doente
desenvolveu alterações psiquiátricas graves com ideação suicida e outro doente
desenvolveu um hipotiroidismo, resultante do aparecimento de anticorpos anti-
tiroideus. Dois doentes suspenderam o tratamento por não aderência.
Salienta-se que esta associação de fármacos, não se acompanhou, ao longo do
ano, do aparecimento de fenómenos de autoimunidade com desenvolvimento
de autoanticorpos, à excepção da doente referida. Também as subpopulações
linfocitárias não registaram alterações significativas com a terapêutica
instituída.
88
DISCUSSÃO
Todos os doentes que não foram capazes de concluir as 48 semanas pré
estabelecidas e que foram considerados como não respondedores,
condicionaram um peso significativo quanto à relativização da eficácia deste
novo retratamento. Este facto permite-nos sublinhar que para além do papel
estritamente virológico quantificável, que indiscutivelmente define critérios de
eficácia duma associação de fármacos, o impacto clínico e as circunstâncias
individuais do doente são sempre variáveis mais subjectivas, mas definitivas
quanto ao desempenho final duma estratégia terapêutica.
CONCLUSÕES
8. CONCLUSÕES
Em resumo, e em resposta aos objectivos por nós delineados, podemos afirmar
que:
1. A resposta à terapêutica tendo sido avaliada em termos de supressão do
ARN do VHC (resposta virológica) e normalização das transaminases
(resposta bioquímica), permitiu constatar que o retratamento de
indivíduos não respondedores ou récidivantes a terapêutica de
combinação, com a formulação peguilada de interferon associada a
ribavirina, conseguiu obter uma resposta virológica e uma resposta
bioquímica em 30% dos doentes tratados. Em 20% dos doentes obtive-se
uma resposta completa (uma resposta virológica e bioquímica em
simultâneo).
2. O estudo dos parâmetros clínicos pré-tratamento, permitiu estabelecer
como factores preditivos de resposta a este novo esquema de
retratamento de combinação, a idade inferior a 40 anos, o índice de
massa corporal inferior a 25, e a aquisição da infecção pelo consumo de
drogas endovenosas. Relativamente aos parâmetros virológicos, apenas a
obtenção de uma resposta virológica precoce à décima segunda semana
de tratamento, se associou de forma significativa com a resposta no final
do tratamento.
Dos restantes parâmetros estudados (sexo, estádio histológico e
actividade necroinflamatória, tipo de resposta obtida com o tratamento
anterior, valor basal das transaminases, genótipo vírico e carga vírica
basal) nenhum se associou de forma significativa com a resposta obtida
no final do tratamento.
90
CONCLUSÕES
Não se observou alteração dos parâmetros imunológicos ao longo do
tratamento, à excepção do desenvolvimento de tiroidite com
autoanticorpos numa doente. As subpopulações linfocitárias não
apresentaram modificação significativa.
3. Podemos afirmar que este esquema terapêutico foi relativamente bem
tolerado. Houve necessidade de interrupção do tratamento em 18% dos
doentes por efeitos laterais graves (hepatite tóxica, toxicodermia,
alterações psiquiátricas graves, hipotiroidismo, infecções de repetição e
diabetes mellitus não controlada), e 7% dos doentes necessitaram de
redução de dose por citopenias. Os restantes doentes tratados
experimentaram efeitos laterais numa proporção significativa, mas sem
compromisso da actividade diária.
Da análise dos resultados obtidos, parece-nos que a terapêutica combinada de
interferon peguilado e ribavirina poderá constituir uma opção válida nos
indivíduos não respondedores ou récidivantes a tratamento com interferon
convencional e ribavirina. Um esquema terapêutico com maior eficácia permitiu
obter resposta numa percentagem importante destes doentes. O desafio que se
nos coloca nesta fase é o seguimento destes doentes no sentido de avaliar a taxa
de resposta sustentada. Para além disso poderá ser importante uma reavaliação
histológica e a ponderação da instituição de uma terapêutica de manutenção
com interferon peguilado, nos indivíduos que apesar de não suprimirem a
replicação vírica, apresentaram uma resposta bioquímica e uma melhoria
histológica.
91
CONCLUSÕES
Conseguimos também identificar parâmetros preditivos de resposta, alguns dos
quais num sentido divergente dos estudos publicados na literatura, e que nos
parecem ampliar o grupo de doentes passíveis de beneficiar com um novo ciclo
terapêutico. É o casos dos indivíduos com fibrose avançada e cirrose, que não
responderam significativamente pior do que os indivíduos sem fibrose e
poderão ser o grupo que mais beneficie com o tratamento.
Uma outra área que nos parece de interesse desenvolver é o estudo molecular
vírico, com a avaliação pré tratamento, no decurso do tratamento e no fim do
tratamento, da composição genómica do isolado, possibilitando desse modo um
melhor conhecimento das modificações estruturais induzidas pela pressão
farmacológica, e desse modo ser possível prever em termos moleculares quais
os indivíduos com maior ou menor probabilidade de resposta, bem como
compreender a importância da biologia do vírus na resistência à terapêutica.
Pensamos que embora permaneçam por esclarecer diversas dúvidas relativas à
patogenia, evolução e resistência ao tratamento de alguns doentes com hepatite
crónica C, a realização de trabalhos prospectivos, como o que encetamos,
poderá vir a permitir o estabelecimento de normas de orientação e de boa
prática clínica, adaptadas à nossa realidade, e que consigam responder à
inquietação dos clínicos e dos doentes sobre o possível e o ideal a oferecer
nestas situações.
92
RESUMO
9. RESUMO
A infecção pelo vírus da hepatite C é uma das principais causas de doença
hepática, sendo um agente etiológico importante na cirrose hepática, carcinoma
hepatocelular e transplante hepático.
Actualmente estima-se que existam cerca de 170 milhões de indivíduos
infectados em todo o mundo, o que constitui aproximadamente 3% da
população mundial.
A sua evolução para a cronicidade em 80% dos casos, contribui para o grande
impacto desta doença em termos de saúde pública.
Na última década, os avanços em termos de biologia molecular permitiram um
conhecimento mais aprofundado da estrutura e cinética vírica, o que se
traduziu na sua aplicabilidade em termos terapêuticos.
A introdução do interferon peguilado no tratamento da hepatite C veio
revolucionar o conceito de tratamento desta infecção, ao permitir ultrapassar
uma deficiência muito limitativa da eficácia dos esquemas terapêuticos prévios,
possibilitando a manutenção de níveis constantes de supressão vírica. As taxas
de resposta sustentada passaram de 45% com terapêutica combinada de
interferon e ribavirina, para 56% com terapêutica combinada de interferon
peguilado e ribavirina, chegando aos 80% em indivíduos infectados com os
genotipos 2 e 3. A maior eficácia deste regime terapêutico relançou o interesse
no retratamento de indivíduos que não responderam ou recidivaram a
terapêuticas prévias comprovadamente menos eficazes.
Até ao momento apenas existiam 2 trabalhos versando o retratamento deste
grupo particular de doentes, mas englobando também doentes não
respondedores a IFN em monoterapia. Os resultados desses estudos foram
promissores com respostas sustentadas de 18%.
93
RESUMO
Realizamos um estudo prospectivo envolvendo 44 doentes com infecção crónica
pelo vírus da hepatite C, previamente tratados com interferon e ribavirina, sem
resposta ou com recidiva. O estudo teve a duração de 48 semanas e pretendeu
avaliar a eficácia em termos de supressão do ARN do VHC e normalização das
transaminases, de um novo esquema terapêutico, utilizando interferon
peguilado e ribavirina. Pretendemos também estabelecer factores clínicos e
virológicos preditivos de resposta e determinar o perfil de segurança e
tolerância deste esquema terapêutico.
Em todos os doentes foi realizado estudo analítico de rotina, determinação de
marcadores de infecção pelo VHB e VIH, estudo imunológico e exclusão de
condições associadas que contraindicassem o tratamento. Todos os doentes
possuíam estudo histológico prévio, e foram avaliados clinica e analiticamente
com periodicidade mensal nos 4 primeiros meses de tratamento e
posteriormente de 2 em 2 meses.
A dose terapêutica utilizada foi de Peginterferon alfa-2b 1,5 ug /kg / semana, se,
e ribavirina 800-1000 mg/dia, oral.
A determinação do genótipo vírico foi efectuada utilizando o teste INNO-LiPA
HCV II da INNOGENETICS®, e a carga vírica foi determinada pelo teste
COBAS Amplicor HCV Monitor™, versão 2.0 da ROCHE®, cujo limiar de
detecção é de 400 IU/ml.
A avaliação da carga vírica foi realizada antes do início do tratamento, às 12, 24
e 48 semanas.
A análise estatística dos resultados foi efectuada utilizando o programa SPSS
11.0 para o Windows®, e os testes utilizados foram o e o t de Student. O
significado estatístico foi considerado para valores de p inferiores a 0,05.
94
RESUMO
Este grupo de doentes desenvolveu efeitos laterais numa percentagem
significativa, a maioria deles sem grande significado clínico e sem condicionar
uma diminuição de dose. Apesar disso houve necessidade de interromper o
tratamento em 8 doentes por efeitos laterais graves (hepatite aguda tóxica,
toxicodermia, diabetes mellitus não controlável, infecções de repetição,
alterações psiquiátricas e hipotiroidismo), e em 3 doentes foi necessário
diminuir a dose de ribavirina ou do interferon peguilado por citopenia.
Não se detectaram outras alterações imunológicas, para além do aparecimento
de anticorpos antitiroideus no doente que desenvolveu hipotiroidismo.
Em resumo, o nosso estudo demonstrou a eficácia do interferon peguilado
associado à ribavirina, no tratamento de doentes não respondedores ou
recidiventes a terapêuticas prévias. Permitiu constatar que mesmo durante o
tratamento contínuo com PEG-IFN e RBV, ocorrem fenómenos de escape numa
percentagem significativa de doentes. Permitiu também confirmar o perfil de
segurança destes fármacos, embora se tenham registado numa percentagem
elevada os efeitos laterais tradicionalmente descritos na literatura.
Os dados disponíveis atribuiram à idade, índice de massa corporal, modo de
infecção e resposta virológica parcial um valor preditivo do tipo de resposta ao
tratamento.
96
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