Universidade Estadual de Campinas Instituto de Biologia

Departamento de Genética e Evolução

Caracterização funcional do gene Bzo2h2 de Arabidopsis thaliana: um regulador da transcrição homólogo ao locus Opaco2 de milho

Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade

Estadual de Campinas, para obtenção do título de Doutor

em Genética e Biologia Molecular, área de concentração

Genética Vegetal e Melhoramento.

Luciane Gauer Orientador: Prof. Dr. Michel Georges Albert Vincentz

Campinas – SP 2004

ii

Campinas, 06 de fevereiro de 2004.

Banca Examinadora

Prof. Dr. Michel Georges Albert Vincentz Profa. Dra. Adriana Silva Hemerly Prof. Dr. Celso Eduardo Benedetti Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Profa. Dra. Marie-Anne Van Sluys Prof. Dr. José Andrés Yunes Prof. Dr. Márcio de Castro Silva Filho

iii

A ciência é algo que possuímos ou não possuímos. E se a possuímos, não podemos tirar dela somente aquilo de que gostamos. É necessário

aceitar também o imprevisto e o perturbador. (Lewis Tomas, 1979)

iv

Agradecimentos

Ao meu orientador Michel pela paciência e excelente orientação.

Aos doutores Marie-Anne Van Sluys, Celso Benedetti, Adriana Hemerly e Gonçalo

Guimarães, membros da banca examinadora.

Aos membros da pré-banca Celso Benedetti, Carlos Ramos e Marcelo Menossi

pela critica revisão e sugestões.

Ao Dr. Adilson leite (in memorian) pela amizade e pela fonte inesgotável de

conhecimento.

As meninas da secretaria, Tânia, Sandra e Fabiana por resolverem da melhor

forma possível as tão chatas questões burocráticas.

A Sandra Lúcia Martins pelo grande auxílio técnico e pelo cuidado com as plantas.

A prof. Sandra Carmelo (Depto Botânica, Unicamp) pelas discussões e pelo

acompanhamento durante as técnicas histológicas.

Ao Laboratório de Anatomia Vegetal da Unicamp pela disponibilização de espaço

e equipamentos.

A J. Giraudat (Institut des Sciences Végétales, Gyf sur Yvette, França) pela

biblioteca de cDNA de Arabidopsis thaliana.

A V. Pautot (Laboratoire de Biologie Cellulaire, INRA-Versailles, França) pela

contribuição com os experimentos de hibridação in situ.

A minha família, especialmente minha avó, que mesmo de longe sempre me

apoiou e acreditou em mim.

As amigas e irmãs do coração, Adriana e Letícia, pelas discussões, conselhos e

pela amizade sem limites. Obrigada por estarem sempre ao meu lado.

Ao meu amigo Luizinho (BH) obrigada pela amizade, você teve o melhor e o pior

de mim.

A Natália, minha primeira “aluna de iniciação”, obrigada pela grande amizade e por

tantas vezes ter quebrado meu galho.

Aos amigos do laboratório Fernanda, Amanda e Roberta pela grande amizade,

pelos divertidos momentos juntos e pela oportunidade que tive com vocês de aprender a

ensinar.

A minha amiga e conterrânea Cláudia, obrigada por me ensinar os primeiros

passos da biologia molecular.

v

Aos amigos do CBMEG, Sylvia, Paulo Schölgl, Dani, Mário, Eduardo, Márcio,

Thaís, Fábio, Vicente, Jiri, Susan, ao pessoal da Genética Animal e do laboratório do

Mano pelas trocas de idéias, “quebra-galhos” e pela amizade.

Aos ex CBMEGuianos, Eneida, Isabel, De Lucca, Almir, Luciana e Alba pelas

discussões, conselhos e pela amizade.

As amigas do “sul” Janaína e Tati, que mesmo de longe sempre estiveram por

perto.

A Giovana, obrigada pelo apoio, pela força e pela amizade na tão difícil etapa final.

Sei que não agüentas mais ouvir falar em “tese”.

Ao seu Capella e a Dona Antonieta, muito obrigada pelo grande carinho.

Aos novos amigos da Alellyx pela força na etapa final.

A FAPESP pelo apoio financeiro.

vi

Índice Lista de Abreviações ................................................................................................................ .ix Lista de Figuras e Tabela............................................................................................................x Resumo ...................................................................................................................................... xii Abstract ..................................................................................................................................... xiv 1. Introdução............................................................................................................................... 1

1.1 Regulação da expressão gênica em eucariotos ............................................................... 1

1.2 A família dos fatores de transcrição basic-leucine zíppers.............................................. ..4

1.3 Genética reversa................................................................................................. ............. 7

1.4 Diferenciação do tecido vascular.................................................................................... 11

1.5 Objetivos......................................................................................................................... 17

2. Material e Métodos ............................................................................................................... 18 2.1 Material vegetal e condições de crescimento .................................................................. 18

2.2 Métodos ........................................................................................................................... 19

2.2.1 Construções dos plasmídeos ............................................................................... 21

2.2.2 Transformação genética de A. thaliana e obtenção das linhagens homozigotas

para um locus do transgene.................................................................................26

2.2.3 Extração e análise do DNA genômico .................................................................. 27

2.2.4 Extração e análise do RNA total ........................................................................... 28

2.2.5 Ensaio histoquímico da atividade de GUS............................................................ 29

2.2.6 Localização in situ da atividade de GUS............................................................... 30

2.2.7 Ensaio fluorimétrico da atividade de GUS............................................................. 30

2.2.8 Localização in situ do mRNA Bzo2h2 ................................................................... 31

2.2.9 Análise da anatomia do cilindro vascular .............................................................. 31

3. Resultados ........................................................................................................................... 32 3.1 Identificação dos genes de A. thaliana homólogos ao gene O2 de milho .......................32

3.2 Os genes de A. thaliana homólogos ao regulador O2: padrão evolutivo da família O2...33

3.3 Caracterização genética e molecular das linhagens transgênicas de Arabidopsis..........37

3.3.1 Obtenção das linhagens transgênicas F2 homozigotas para um locus...................37

3.3.2 Atividade de GUS nas linhagens Bzo2h2 promotor (1,8 kb)::GUS e Bzo2h2

promotor (0,5 kb)::GUS....................................................................................................39

3.3.3 Nível de expressão do gene Bzo2h2 nas linhagens transgênicas de Arabidopsis..39

vii

3.3.4 Análise da integração do T-DNA .............................................................................40

3.4 Caracterização funcional de Bzo2h2: análise do padrão de expressão do gene quimérico

Bzo2h2 promotor::GUS .............................................................................................. ....43

3.4.1 Padrão de expressão do gene Bzo2h2 .................................... ............................43

3.4.2 Localização in situ da expressão de Bzo2h2 ...................................................... 46

3.4.3 Regulação da expressão de Bzo2h2.....................................................................48

3.5 Caracterização funcional de Bzo2h2: análise de plantas 35S::Bzo2h2, dsRNA Bzo2h2 e

do mutante nulo bzo2h2-1.....................................................................................................55

3.5.1 Desenvolvimento das plantas 35S::Bzo2h2, dsRNA Bzo2h2 e do mutante nulo

bzo2h2-1.........................................................................................................................56

3.5.2 Anatomia do cilindro vascular das plantas 35S::Bzo2h2 e do mutante nulo bzo2h2-1.62

4. Discussão .............................................................................................................................. 64 4.1 Evolução da família O2....................................................................................................64

4.2 Bzo2h2: um marcador da determinação/diferenciação do floema...................................66

4.3 Bzo2h2 promotor::GUS não responde aos principais reguladores do crescimento e

desenvolvimento....................................................................................................................68

4.4 Ausência de fenótipo diferenciado nas plantas com expressão alterada para

Bzo2h2...................................................................................................................................69

4.5 Conclusões......................................................................................................................71

4.6 Perspectivas.....................................................................................................................72

5. Referências Bibliográficas...................................................................................................74 6. Anexo I................................................................................................................................ ....84

viii

Lista de Abreviações

ABA ácido abscísico Apt gene da adenosina fosforribosil transferase bZIP basic leucine-zipper Bzo2h2 gene Bzo2h2 (bZIP O2 homologous 2) BZO2H2 proteína BZO2H2 bzo2h2-1 alelo nulo do gene Bzo2h2 CaMV vírus do mosaico da couve flor cDNA DNA complementar CTAB brometo de alquiltrimetilamônio DAG dias após a germinação DAP dias após a polinização DNA ácido desoxirribonucléico dsRNA dupla fita de RNA EST expressed sequence tag DEPC dietil pirocarbonato EDTA ácido etilenodiaminotetracético GCN4 general control protein 4 GFP green fluorescent protein gusA gene β-glucoronidase de Escherichia coli GUS enzima β-glucoronidase de Escherichia coli Kb kilobase (s) KDa kilodaltons MES ácido 2-N-morfolino etanosulfônico mRNA RNA mensageiro MUG 4-metil-umbeliferil-β-Dglucoronídeo NaCl cloreto de sódio nptII gene da neomicina fosfotransferase II o2 mutação opaco 2 O2 gene Opaco 2 O2 proteína Opaco 2 PCR reação da polimerase em cadeia pb par(es) de base(s) polyA sítio de poliadenilação p/v peso sobre volume RNA ácido ribonucléico RNAi RNA de interferência rpm rotações por minutos RT-PCR reverse transcriptase PCR SSC .citrato de sódio SDS dodecil sulfato de sódio T-DNA DNA de transferência de Agrobacterium tumefaciens v/v volume/volume X-Gluc ácido 5-bromo, 4-cloro, 3-indol, β-D-glucorônico

ix

Lista de Figuras e Tabelas Figura 1: Representação esquemática do domínio bZIP de um fator de transcrição....4 Figura 2: Padrão de diferenciação dos primeiros elementos do xilema e do floema no embrião e na plântula de Arabidopsis thaliana..............................................................14 Figura 3: Formação dos feixes vasculares por canalização.........................................15 Figura 4: Estratégia para construção do cassete de expressão 35S::Bzo2h2 e sua clonagem no vetor de transformação de plantas pCAMBIA 3300.................................22 Figura 5: Estratégia para construção do cassete de expressão Bzo2h2 dsRNA e sua clonagem no vetor de transformação de plantas pCAMBIA 2300.................................24 Figura 6: Estratégia para obtenção da fusão traducional da seqüência promotora Bzo2h2 com o gene gusA e sua clonagem no vetor de transformação de plantas pCAMBIA 2300..............................................................................................................25 Figura 7: Filogenia dos genes homólogos ao O2.............................................34 Figura 8: Esquema da estrutura dos genes da família O2...........................................35 Figura 9: Organização modular das proteínas homólogas à O2..................................35 Figura 10:. Modelo da evolução da família gênica OPACO2.......................................36 Figura 11: Genes quiméricos utilizados na abordagem de genética reversa...............38 Figura 12: Análise da expressão do gene Bzo2h2 em plantas dsRNA Bzo2h2, 35S::Bzo2h2 e no mutante nulo bzo2h2-1 de A thaliana..............................................41 Figura 13: Análise de Southern blot das linhagens transgênicas de A thaliana...........42 Figura 14: Padrão de expressão do gene quimérico Bzo2h2 promotor::GUS............44 Figura 15: Comparação do padrão de expressão do gene quimérico Bzo2h2 promotor:GUS em cotilédones de plantas contendo a fusão traducional de 0,5 Kb e 1,8 kb da seqüência promotora de Bzo2h2.........................................................................45 Figura 16: Localização in situ da atividade de GUS no floema de raízes e folhas de plantas Bzo2h2 promotor::GUS.....................................................................................47 Figura 17: Localização in situ do mRNA Bzo2h2 nos feixes vasculares de plantas selvagens de A. thaliana...............................................................................................49 Figura 18: Análise quantitativa da atividade de GUS em plantas Bzo2h2 promotor::GUS em resposta à auxina e à citocinina.....................................................51 Figura 19: Localização in situ da atividade de GUS em plantas Bzo2h2 promotor::GUS em resposta ao fitohormônio ABA................................................................................53 Figura 20: Análise da expressão do gene marcador gusA em plantas Bzo2h2 promotor::GUS em resposta ao ABA e ao NaCl...........................................................54 Figura 21: Padrão de expressão do gene quimérico Bzo2h2 promotor::GUS em resposta à ausência de luz............................................................................................55

x

Figura 22: Comparação do desenvolvimento de plantas superexpressando (35S::Bzo2h2) e silenciando (dsRNA) Bzo2h2 e do mutante nulo (bzo2h2-1) em relação a plantas selvagens..........................................................................................57 Figura 23: Comparação do desenvolvimento das raízes em plantas superexpressando Bzo2h2 (35S::Bzo2h2) e do mutante nulo (bzo2h2-1) em relação a plantas selvagens......................................................................................................................58 Figura 24: Desenvolvimento do mutante bzo2h2-1 em diferentes condições de crescimento...................................................................................................................59 Figura 25: Anatomia do cilindro vascular de plantas que superexpressam Bzo2h2 (35S::Bzo2h2), do mutante nulo (bzo2h2-1) e de plantas selvagens (wt)....................63 Figura 26: Genes expressos no procâmbio durante a embriogênese de Arabidopsis....................................................................................................................67 Tabela I: Oligonucleotídeos utilizados para o seqüenciamento e para as amplificações.................................................................................................................20 Tabela II: Número de acesso e localização de Bzo2h1, Bzo2h2, Bzo2h3 e Bzo2h4...33

Tabela III: Número de linhagens analisadas quanto à segregação do marcador de seleção..........................................................................................................................38

Tabela IV: Atividade de β-glucuronidase das linhagens contendo o cassete Bzo2h2 promotor::GUS..............................................................................................................39 Tabela V: Expressão de Bzo2h2 promotor::GUS nas células guarda de estômatos nas várias linhagens analisadas..........................................................................................46

xi

Resumo O locus Opaco-2 codifica um fator de regulação da transcrição do tipo bZIP que

atua no controle coordenado do metabolismo do carbono, nitrogênio e da síntese das

prolaminas de reserva durante o desenvolvimento da semente de milho. Prováveis

proteínas ortólogas e várias bZIPs similares a OPACO-2 foram identificadas e

parcialmente caracterizadas em outras monocotiledôneas. A análise filogenética de um

grupo e não redundante de bZIPs de plantas, incluindo os quatros genes de A. thaliana,

Bzo2h1, Bzo2h2, Bzo2h3 e Bzo2h4, permitiu identificar um grupo de 20 proteínas

homólogas à proteína O2, denominada de família O2. Bzo2h2 é um gene único que

provavelmente representa uma função comum a monocotiledôneas e dicotiledôneas.

Genes quiméricos a fim de promover o silenciamento gênico ou a superexpressão de

Bzo2h2, assim como fusões traducionais da seqüência promotora desse gene com o

gene marcador gusA foram introduzidos em A. thaliana. Um mutante nulo para Bzo2h2

também foi obtido a partir de um banco de mutantes de inserção de T-DNA. Bzo2h2

encontra-se expresso nos feixes vasculares, mais especificamente no floema de

cotilédones, folhas, hipocótilo, raízes, flores e vagens. A localização in situ da presença

do mRNA para Bzo2h2 através da técnica de hibridação in situ permitiu confirmar os

resultados obtidos através da avaliação da atividade de GUS. Uma análise detalhada do

padrão de expressão de Bzo2h2 ao longo do desenvolvimento revelou que a atividade de

GUS já se encontra presente no procâmbio no estágio de maturação do embrião,

indicando que mesmo antes de haver a diferenciação de xilema e floema, o gene Bzo2h2

já se encontra expresso, caracterizando assim um marcador de diferenciação do floema.

A expressão específica de Bzo2h2 no floema sugere um possível envolvimento deste

gene em algum aspecto da diferenciação deste tecido, já que ele se encontra expresso no

procâmbio e no ápice de raízes, regiões onde o xilema e o floema ainda não se

diferenciaram. Entretanto, análises histológicas da anatomia do feixe vascular de plantas

superexpressando Bzo2h2 e do mutante nulo bzo2h2-1 não revelaram diferenças na

organização e na estrutura do tecido vascular em relação a plantas selvagens. A ausência

de fenótipo diferencial nas plantas silenciando Bzo2h2 e no mutante nulo bzo2h2-1 pode

xii

estar relacionada com o fato de que as condições testadas não permitiram evidenciar o

processo no qual Bzo2h2 está envolvido, ou que as modificações são sutis e

consequentemente de difícil percepção, ou ainda que algum grau de redundância

funcional pode estar mascarando os efeitos das mutações em Bzo2h2. Juntos, os

resultados levam à identificação de um gene que se mantém expresso ao longo de

praticamente todos os estágios do desenvolvimento, exceto nos primeiros estágios

embrionários, em todos os órgãos; e que parece não responder aos principais

reguladores do crescimento e desenvolvimento, como fitohormônios, açúcares e

estresses abióticos, como estresse osmótico, ausência de luz e baixa temperatura.

xiii

Abstract

Opaque-2 (O2) is an important regulatory locus of maize seed endosperm

development. O2 is involved in coordinated regulation of storage protein synthesis,

nitrogen and carbon metabolism in developing seeds. O2 homologous genes were

identified in both monocots and dicots, but probable O2 orthologous were only described

in monocots. Phylogenetic analysis of a possible complete and nonredundant collection of

angiosperm bZIP factors, including the four genes of A. thaliana, Bzo2h1, Bzo2h2, Bzo2h3

and Bzo2h4, resulted in the identification of 20 angiosperm O2 homologues that define the

O2 gene family. Bzo2h2 is a unique gene which represents an ancestral function.

Construction containing the cDNA in sense orientation under the control of a strong

promoter was obtained for overexpressing Bzo2h2. Quimeric gene aimed at inducing gene

silencing through RNA interference mechanism was also constructed. In addition, a

construction with the promoter sequence of this gene fused to the reporter gene (gusA)

was made, in order to define the expression pattern of Bzo2h2. Knockout mutant of

Bzo2h2 was obtained. GUS activity analysis revealed that Bzo2h2 is expressed in

vascular tissues of cotyledons, leaves, hypocotyl, primary and lateral roots, flowers and

siliques. Cross sections of roots and leaves revealed that its expression is specific of the

phloem. In situ hybridization analysis confirmed the previous results. GUS activity also

revealed that Bzo2h2 expression is present in the procambial cells during the embryo

maturation stage. In this stage the xylem and phloem are not differentiated yet. This

suggests that the Bzo2h2 gene may be involved in the differentiation of this tissue. Cross

sections of roots and leaves of overexpressing Bzo2h2 and Knockout Bzo2h2 mutant

plants revealed that vascular tissue organization and structure was not altered when

compared to the wild type plants. The lack of visible phenotypes in knockout mutant and

overexpression plants could be attributed to functional redundancy or inability to detect

weak phenotipic changes. We have identified a gene that express through the whole life

cycle of plant, except in the early embryogenesis, in all organs and doesn’t respond to the

growth regulators such as phytohormones, sucrose and abiotic stress (osmotic stress),

darkness and low temperature. .........................................................................................

xiv

1. INTRODUÇÃO

1.1 Regulação da expressão gênica em eucariotos

O genoma de uma célula eucariótica contém, na sua seqüência de DNA, a

informação para codificar inúmeras proteínas diferentes. O genoma de Arabidopsis

codifica cerca de 25 mil genes (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000) enquanto o

genoma de arroz codifica para até 60 mil genes (Goff et al., 2002; Yu et al., 2002). O

mecanismo que define o momento, o local e a quantidade em que uma proteína ativa será

expressa é definido como controle da expressão gênica. A regulação da expressão gênica

é fundamental para um grande número de fenômenos biológicos tais como a

diferenciação e controle do ciclo celular, desenvolvimento geral do organismo e resposta

a estímulos ambientais (Meshi e Iwabuchi, 1995).

A regulação da expressão gênica pode ocorrer em diferentes níveis: transcrição,

processamento e transporte do mRNA para o citoplasma, tradução, pós-tradução e

multimerização (Derman, 1981; Darnel, 1982). Os diferentes passos desde um gene até a

sua proteína ativa são tradicionalmente vistos como eventos independentes, com cada

passo sendo completado antes do próximo iniciar. Recentemente tem se mostrado que

muitos destes passos, desde o gene até a proteína ativa, são conectados, sugerindo uma

teoria unificada da expressão gênica, onde cada estágio é uma subdivisão de um

processo contínuo, com cada fase fisicamente e funcionalmente conectada à próxima

(Maniatis e Reed, 2002; Orphanides e Reinberg, 2002).

Uma revisão detalhada dos principais passos envolvidos na expressão gênica

pode ser encontrada em Orphanides e Reinberg (2002). Inicialmente, a partir de um sinal

percebido pela célula, fatores de transcrição ligam-se a elementos regulatórios do gene

alvo e através de interações com outros componentes da maquinaria de transcrição,

1

facilitam o recrutamento da RNA polimerase para o sítio de iniciação da transcrição. A

transcrição de genes codificadores de proteínas é catalisada pela RNA polimerase II.

Após a RNA polimerase II iniciar a transcrição, o RNA nascente é modificado pela adição

de uma estrutura na extremidade 5’ denominada cap. O cap protege o novo transcrito de

nucleases e serve como sítio de ligação para proteínas relacionadas com o seu transporte

para o citoplasma e com a sua tradução em proteína. As seqüências não codificadoras

(introns) são removidas por processamento. Após o término da transcrição, na

extremidade 3’ do RNA é adicionada uma cauda poly A, que está envolvida com a

estabilidade do mRNA. O processo pelo qual a informação é transferida do DNA para o

RNA (transcrição) e do RNA para a proteína (tradução) são fisicamente separados nos

eucariotos pela membrana nuclear. O transporte do mRNA para o citoplasma é mediado

por fatores que se ligam ao mRNA e o dirigem para o citoplasma por interagirem com as

proteínas dos poros da membrana nuclear. A tradução do mRNA ocorre nos ribossomos e

é mecanisticamente similar à transcrição. A proteína nascente pode sofrer modificações

pós-traducionais até chegar na sua forma ativa.

Nas células eucarióticas, o DNA genômico está altamente complexado com

nucleoproteínas formando a cromatina. A unidade organizacional básica da cromatina é o

nucleossomo, que consiste de 146 pb de DNA formando quase duas voltas completas em

torno de um núcleo de proteínas. Este núcleo de proteínas é formado por duas cópias de

cada uma das quatro histonas: H2A, H2B, H3 e H4 (Luger et al., 1997). Essas pequenas

proteínas carregadas positivamente são altamente conservadas entre todos os

eucariotos. A cromatina possui um papel central na regulação da expressão gênica, haja

visto que para ocorrer a ativação da transcrição gênica é necessário que os fatores

responsáveis pela transcrição tenham acesso à molécula de DNA. As histonas sofrem

modificações covalentes que resultam na reorganização da estrutura da cromatina

permitindo o acesso da maquinaria transcricional (Kornberg, 1999). A acetilação das

histonas foi a primeira modificação a ser correlacionada com a competência transcricional

e é provavelmente o evento que inicia a liberação da estrutura do nucleossomo (Struhl,

1998). Mudanças conformacionais no nucleossomo podem ainda ocorrer por

deacetilação, metilação e fosforilação (Narlikar et al., 2002).

O controle primário da expressão gênica ocorre em nível transcricional e é

mediado por proteínas que se ligam a seqüências específicas de DNA (Latchaman, 1990;

2

Kuhlemeier, 1992; Meshi e Iwabuchi, 1995). As seqüências de DNA envolvidas no

controle da expressão gênica são chamadas de elementos cis. Os promotores são uma

classe de elementos cis que se localizam a poucos pares de bases do gene que regulam,

normalmente upstream (revisado por Blackwood e Kadonaga, 1998 e Lee e Young, 2000).

Outra classe de seqüências de DNA envolvidas com a regulação gênica são os

enhancers e os silencers (Lee e Yong, 2000). Estas seqüências atuam de uma maneira

independente da sua orientação e distância do sítio de iniciação da transcrição, sendo

sítios para a ligação de ativadores e repressores da transcrição, respectivamente

(Blackwood e Kadonaga, 1998).

As proteínas que se ligam às seqüências de DNA ou a outras proteínas, regulando

a transcrição gênica, são denominados de fatores trans. Algumas destas proteínas são

fatores gerais da transcrição, sendo necessárias para a expressão dos genes transcritos

pela RNA polimerase II, estando presentes na maioria das células e ativos nas mais

diversas condições. Entretanto, há fatores de regulação altamente específicos, presentes

apenas em determinado tipo celular e/ou num determinado momento do ciclo de vida do

organismo (Kuhlemeier, 1992).

A transcrição em procariotos pode ser regulada por uma única proteína que se liga

ao DNA como um homodímero. Entretanto, em eucariotos, a expressão gênica é

normalmente regulada por um complexo multiprotéico, composto por diferentes

polipeptídeos, que se ligam ao DNA de uma maneira seqüência específica e que

interagem diretamente ou indiretamente com a maquinaria basal de transcrição (Tijan e

Maniats, 1994). Este tipo de regulação transcricional é chamado de controle

combinatorial, gerando uma complexa rede regulatória. A regulação de um único gene por

mais de uma proteína fornece uma eficiente maneira para integrar as respostas de uma

variedade de sinais (Wolberger, 1999).

Baseado em similaridades entre seqüências de aminoácidos e estruturas dos

domínios de ligação ao DNA e multimerização dos fatores de regulação de transcrição,

estes são agrupados em diferentes classes (Pabo e Sauer, 1992). Desta forma temos: a

classe dos Homeodomínios, a dos Zinc Fingers, a dos Basic Helix-Loop-Helix, a dos

MADS box, a dos Helix-Turn-helix e a dos Basic-Leucine Zipper. Uma descrição

detalhada sobre cada uma destas classes pode ser encontrada em Wingender et al.,

(2000) (http://www.gene-regulation.com/pub/databases/transfac/cl.html). Há vários fatores

3

de transcrição que são encontrados somente em plantas, como as famílias AP2/EREBP,

NAC e WRKY, fatores responsivos à auxina (ARFs), as proteínas AUX/IAA (que não

ligam-se ao DNA diretamente, mas interagem com proteínas ARF) e outras pequenas

famílias. Similarmente, animais e levedura têm muitas famílias de fatores de transcrição

que não são encontradas em plantas (revisão por Riechmann et al., 2000).

1.2 A família dos fatores de transcrição basic-leucine zippers Os fatores de regulação da transcrição do tipo bZIP (basic leucine-zipper) são

encontrados em todos os organismos eucariotos (Kerppola e Curran, 1991; Wingender et

al., 2000). O domínio de ligação ao DNA destas proteínas é altamente conservado,

normalmente possuindo de 60 a 80 resíduos, sendo constituído por dois sub-domínios: o

zíper de leucina e uma região básica (Figura 1).

NH2

COOH

Figura 1: Representação esquemática do domínio bZIP de um fator de transcrição. As

duas α-hélices representam o domínio bZIP de um homodímero. A região em vermelho

representa o zíper de leucinas, responsável pela dimerização e a região em azul

representa o domínio básico, responsável pela interação com o DNA (em cinza). O

domínio básico se encaixa no sulco maior da dupla fita de DNA.

4

O zíper de leucinas é constituído por repetições de resíduos de leucina a cada

sete aminoácidos em uma extensão de 30 a 40 resíduos, o número de repetições de

leucina pode variar de três a nove (Pabo e Sauer, 1992; Hurst, 1995). O zíper de leucinas

é responsável pela interação entre proteínas, promovendo homo ou heterodimerizações

(Landschulz et al., 1988). Algumas bZIPs formam apenas homodímeros funcionais (como

GCN4), enquanto outras são ativas apenas na forma de heterodímeros (como na família

Fos). Diferentes combinações entre proteínas bZIP podem proporcionar diferentes níveis

de controle de expressão gênica, uma vez que tais combinações podem alterar a

afinidade de ligação aos sítios-alvo ou ainda, promover o reconhecimento de sítios

distintos ou até alterar a atividade do fator (Chiu et al., 1989; Schütte et al., 1989).

A região básica é composta por cerca de 30 aminoácidos e interage diretamente

com o DNA (Landschultz et al., 1988; Pabo e Sauer, 1992; Izawa et al., 1993). A região

básica de cada subunidade se encaixa dentro do sulco maior da seqüência alvo, onde

cinco aminoácidos estabelecem ligações iônicas ou pontes de hidrogênio com as bases

de um sítio alvo (Alber, 1992; Ellenberger et al., 1992; König e Richmond, 1993; Hurst,

1995). O conjunto destas interações é responsável pela determinação da afinidade do

domínio bZIP por uma seqüência alvo específica (Hurst, 1995).

Em plantas, análises genéticas, moleculares e bioquímicas indicam que alguns

fatores bZIP são reguladores importantes de processos fisiológicos e ontogenéticos. Entre

esses processos, podemos citar a fotomorfogênese com a participação do fator HY5

(Osterlund et al., 2000), o desenvolvimento dos órgãos florais com os fatores

PERIANTHIA e LIGULELESS2 (Walsh et al., 1997; Chuang et al., 1999), a elongação e a

morfogênese celular com os fatores RSG e RF2a (Yin et al., 1997; Fukazawa et al.,

2000), o controle do balanço de nitrogênio e carbono durante o desenvolvimento da

semente por O2 (Ciceri et al., 1999), os mecanismos de defesa com os fatores TGA2.2 e

OBFs (Zhang et al., 1999; Niggeweg et al., 2000), a via de sinalização da sacarose com

ATB2 (Rook et al., 1998), as vias de sinalização de hormônios com os fatores ABI5, ABF,

TRAB e TGA (Choi et al., 2000; Finkelstein e Linch, 2000; Uno et al., 2000; Kang et al.,

2002) e resposta à luz com os fatores CPRF2, CPRF4, GBF1, GBF2 e GBF3 (Schindler et

al., 1992; Wellmer et al., 1999).

Baseado na similaridade encontrada entre as seqüências de aminoácidos dos

domínios bZIP de cerca de 50 fatores de transcrição de plantas foi possível verificar a

5

formação de um grupo de oito proteínas de monocotiledôneas e dicotiledôneas

relacionadas ao gene Opaco-2 (O2) de milho, que provavelmente representam uma

família gênica (Vettore et al., 1998).

O2, o fator mais bem caracterizado desta família, é um regulador da síntese das

prolaminas, a principal classe de proteínas de reserva de milho que são codificadas por

uma complexa família multigênica (revisado em Heidecker e Messing, 1986). Análises

genéticas e moleculares indicam que, no endosperma da semente de milho, O2 parece

ser importante para integrar o metabolismo do carbono e nitrogênio com a síntese das

proteínas de reserva α e β-zeínas (Schmidt et al., 1992; Damerval e Le Guilloux, 1998;

Cord Neto, 1998). Ortólogos ao O2 foram caracterizados em Coix (Coix lacryma-jobi) e

sorgo (Sorghum), duas espécies relacionadas ao milho (Ottoboni et al., 1993; Pirovano et

al., 1994; Vettore et al., 1998).

A mutação recessiva o2 confere um aspecto opaco à semente de milho madura.

Além deste caráter opaco, a semente o2 apresenta vários outros efeitos pleiotrópicos.

Esta mutação causa um decréscimo de 50 a 70 % das zeínas, principalmente devido à

redução de 90 % no nível das zeínas de 22 kDa, e um aumento no conteúdo de lisina e

triptofano (Mertz et al., 1964; Delhaye e Landry, 1986; Habben et al., 1993). O aumento

relativo no conteúdo desse dois aminoácidos é uma conseqüência da expressão reduzida

das zeínas, que são pobres em lisina e triptofano (Schmidt, 1993) e a redução da

atividade da enzima lisina cetoglutarato redutase/succinato desidrogenase (LKR/SDH)

que degrada a lisina (Kemper et al., 1999). Vários outros aspectos do metabolismo da

semente também parecem estar modificados: a atividade de RNase no endosperma

mutante é maior do que em sementes normais (Wilson e Alexander, 1967), os conteúdos

de várias proteínas e enzimas relacionadas ao metabolismo de aminoácidos,

principalmente da via do aspartato, encontram-se alterados (Yunes et al., 1994; Damerval

e Le Guilloux, 1998) e ocorre ainda, alteração na expressão dos genes envolvidos na

biossíntese do amido (Giroux et al., 1994). Os mutantes o2 apresentam uma maior

susceptibilidade a patógenos (Loesch et al., 1976). A baixa resistência ao ataque de

insetos e patógenos pode estar associada, nas sementes o2, a um decréscimo

significativo nos níveis da albumina b-32, uma proteína que tem atividade de inativação de

ribossomos e atua como agente de defesa (Bass et al., 1992).

6

1.3 Genética reversa A. thaliana, pertencente à família Brassicaceae, é uma pequena erva originária da

Eurásia central, sendo a primeira planta a ter seu genoma seqüenciado. O genoma de

Arabidopsis possui 125 Mb distribuídos entre 5 cromossomos e codifica para cerca de 25

mil genes (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). O fim do projeto genoma de

Arabidopsis e o seqüenciamento de outros genomas, como o de arroz, permitirão acelerar

o progresso do conhecimento acerca dos mecanismos genéticos que controlam o

crescimento e o desenvolvimento vegetal. Ku et al. (2000) demostraram que apesar dos

110 milhões de anos de evolução independente desde a divergência de Arabidopsis e

tomate, ainda existe algum nível de conservação entre o conjunto e a ordem (sintenia)

dos genes entre essas duas espécies. Desta maneira, o seqüenciamento do genoma de

Arabidopsis fornece uma visão geral do conjunto de genes necessários para o ciclo de

vida de uma angiosperma, permitindo que as informações funcionais obtidas possam ser

transferidas para espécies menos caracterizadas (Bevan e Murphy, 1999; Bouché e

Bouchez, 2001; Barnes, 2002; Mitchell-Olds e Clauss, 2002; Soltis e Soltis, 2003).

A grande disponibilidade de informações sobre seqüências de genomas e ESTs

(expressed sequence tag) nos bancos de dados torna crítica a atribuição de funções para

os milhares de novos genes identificados. A função de um gene pode ser considerada a

partir de diferentes pontos de vista: função bioquímica, por exemplo, uma quinase; função

celular, por exemplo, um papel na via de transdução de um sinal; função

desenvolvimental, por exemplo, um papel na formação de um padrão ou ainda uma

função adaptativa, por exemplo, na contribuição do produto gênico na adaptação do

organismo (Bouchez e Höfte, 1998). A comparação da seqüência do gene de interesse

com bancos de dados é a maneira mais simples de se obter informações sobre a função

de um gene, entretanto somente em nível bioquímico. Portanto, análises computacionais

são normalmente insuficientes, sendo necessária confirmação experimental.

O prévio paradigma da genética molecular de descobrir o gene responsável por

uma função biológica (genética direta) está gradativamente sendo substituído por um

paradigma da era genômica, que é descobrir a função biológica de um gene (genética

reversa). A genética direta se baseia na utilização de métodos de seleção para identificar

mutantes afetados no processo estudado. Inúmeros mutantes foram identificados

utilizando essa estratégia, como os mutantes relacionados com desenvolvimento floral

7

(Apetala , Agamous, Bowman et al., 1993), respostas hormonais (axr, aba, abi, ein, pin,

revisado em Coruzzi e Zhou, 2001; Gazzarrini e McCourt, 2001; Vogler e Kuhlemeier,

2003), fotomorfogênese (phy, cry, Pickett e Meeks-Wagner, 1995), resistência a baixas

temperaturas (kin, ap, Tähtiharju et al., 1997; Gilmour et al., 1998) entre outros.

Entretanto, provavelmente essa estratégia chegou a um nível de saturação onde os

fenótipos mais óbvios já foram identificados. Métodos mais sofisticadas de seleção, como

o uso do gene marcador da luciferase sobre o controle de um promotor que responde a

um determinado sinal (Xiong et al., 2001) ou a procura de mutantes de reversão

(Beaudoin et al., 2000) são abordagens alternativas para identificação de novos genes

envolvidos no processo estudado. Finalmente, a identificação de parceiros interagindo

com a proteína estudada também representa uma estratégia para se desvendar a rede de

regulação na qual o gene de interesse atua (Riechmann, 2002)

A maneira mais direta de determinar a função de um gene de seqüência conhecida

é interrompê-lo ou gerar mutações em sua seqüência e analisar o fenótipo decorrente. As

estratégias de genética reversa caem em duas categorias principais, dependendo se a

mutagênese é especificamente dirigida para um locus de interesse ou se é realizada

através de todo o genoma com subseqüente screening para a lesão molecular (Henikoff e

Comai, 2003). Em plantas, um dos métodos para interferir com a função de um gene

específico é através do silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS). O PTGS é um

sistema inato encontrado na maioria dos eucariotos, na qual uma dupla fita de RNA

(dsRNA) é processada em pequenos pedaços de 22-25 pb que desencadeiam a

degradação específica das moléculas de RNA homólogas (Chuang e Meyerowitz, 2000;

Matzke et al., 2001; Vaucheret et al.; 2001; Baulcombe, 2002). Esse mecanismo, também

chamado de RNAi (RNA de interferência), pode ser desencadeado especificamente

contra um determinando gene através da sua superexpressão, da sua expressão na

orientação antisenso ou ainda diretamente pela expressão de moléculas que formem um

dupla fita de RNA em função do pareamento que ocorre devido à presença de homologia

interna (Chuang e Meyerowitz, 2000). A eficiência do silenciamento gênico pode nem

sempre ser satisfatória, entretanto essa estratégia tem a vantagem de produzir uma gama

de fenótipos, o que é particularmente interessante no caso de genes essenciais (Henikoff

e Comai, 2003).

8

A genética reversa de Arabidopsis tem sido facilitada pelo estabelecimento de uma

grande coleção de mutantes de inserção que envolve o uso de elementos transponíveis

ou T-DNAs (http://www.arabidopsis.org/links/insertion.html; Azpiroz-Leehan e Feldmann,

1997; Krysan et al., 1999; Parinov et al., 1999; Speulman et al., 1999; Tissier et al., 1999;

Parinov e Sundaresan, 2000; Sussman et al., 2000). O T-DNA (DNA de transferência) é

um segmento de um plasmídeo indutor de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens,

sendo delimitado por curtas repetições imperfeitas nas bordas. O T-DNA, incluindo

qualquer seqüência entre suas bordas, pode ser transferido para a célula vegetal através

de A. tumefaciens. Essa estratégia tem sido facilitada pela bem estabelecida metodologia

de transformação in planta de Arabidopsis (Bechtold et al., 1993) a qual não envolve os

laboriosos processos de cultura de tecido. Devido ao fato de as regiões intergênicas

serem escassas em Arabidopsis, a inserção de um pedaço de T-DNA geralmente produz

uma dramática interrupção da função gênica (Krysan et al., 1999). Além disso, o número

médio de inserções por genoma é pequeno (cerca de 1,5 por genoma diplóide) e as

inserções são aleatórias, não havendo nenhuma preferência sítio específica aparente

(Azpiroz-Leehan e Feldmann, 1997). Se uma grande população de linhagens

transformadas com o T-DNA está disponível, existe uma boa chance de se encontrar uma

planta carregando uma inserção do T-DNA dentro do gene de interesse. Mutações que

são homozigotas letais podem ser mantidas na população na forma de plantas

heterozigotas (Krysan et al., 1999). Além disso, diferentes alelos apresentando diferentes

níveis de expressão podem ser obtidos pela inserção do T-DNA na seqüência promotora,

o que pode ser particularmente interessante no caso de genes essenciais. Métodos

baseados em PCR tem sido desenvolvidos a fim de permitir o isolamento de plantas que

carreguem uma inserção de T-DNA no gene de interesse (McKinney et al., 1995; Krysan

et al., 1996).

Além da mutagênese insercional por T-DNA, têm se usado transposons e

retrotransposons com a mesma finalidade. A mutagênse insercional utilizando

transposons foi usada para clonar genes em Zea mays, Antirrhinum majus e Petunia

hybrida (Ramachandram e Sundaresan, 2001). Têm se mostrado que retrotransposons

são capazes de gerar mutações espontâneas em milho, assim também permitindo a

caracterização de genes (Varagona et al., 1992). Além disso, é possível utilizar a

mutagênese insercional através de transposons em sistemas heterólogos. Os elementos

9

Ac/Ds (Activator/Dissociator) de milho têm sido usados em A. thaliana, arroz, tomate,

cenoura, batata, tabaco, petúnia, etc (Ramachandram e Sundaresan, 2001). Uma

vantagem da mutagênse insercional por T-DNA sobre a mutagênese insercional através

de transposons é que inserções de T-DNA não se transpõem após a integração dentro do

genoma e portanto são quimicamente e fisicamente estáveis ao longo das gerações

(Krysan et al., 1999). Entretanto, a mobilidade dos transposons pode ser útil no caso de

múltiplos membros de uma família gênica arranjados lado à lado ao longo do

cromossomo. A habilidade dos transposons de se mover para regiões próximas fornece

um conveniente método para gerar mutações dentro de todos os membros de uma família

gênica em uma única planta (Krysan et al., 1999). Outra vantagem é a possibilidade de

reversão do fenótipo através da excisão do transposon do sítio de inserção para

comprovar a relação entre mutação e fenótipo (Ramachandran e Sundaresan, 2001).

A interrupção de um gene nem sempre produz um fenótipo óbvio devido a

diferentes fatores, como a redundância gênica ou a incapacidade de se detectar

mudanças sutis no fenótipo da planta analisada (Pickett e Meeks-Wagner, 1995; Weigel et

al., 2000; Bouché e Bouchez, 2001; Gu et al., 2003; Zhang, 2003). A superexpressão de

um gene oferece uma estratégia alternativa e complementar para a análise funcional, já

que pode ser menos afetada pela redundância funcional (Weigel et al., 2000; Nakazawa

et al., 2003; Zhang, 2003). A superexpressão pode ser obtida pela expressão do gene de

interesse sob o controle de um promotor forte, como o 35 S do vírus do mosaico da

couve-flor (CaMV) ou ainda pela estratégia em nível genômico de activation tagging

(Weigel et al., 2000; Jeon e Na, 2001; Nakazawa et al.; 2003). O princípio envolve o uso

de promotores fortes inseridos na região proximal da borda direita do T-DNA, o que

resulta na expressão ectópica ou superexpressão do(s) gene(s) próximo(s) ao sítio de

integração (Ramachandran e Sundaresan, 2001; Nakazawa et al., 2003). Entretanto, a

superexpressão de um gene pode gerar alelos neomorfos, onde o fenótipo observado é

inespecífico, relacionado a uma função diferente que a proteína em grande quantidade

adquire (Zhang, 2003). Ainda dentro desta estratégia em nível de análise genômica,

genes repórteres podem ser usados para construir enhancer trap e promoters trap

(Springer, 2000; Yamamoto et al., 2003), que permitirão a análise do padrão de expressão

dos genes presentes próximos à extremidade 5’ do T-DNA integrado, sem

necessariamente gerar mutações nestes genes.

10

A recombinação homóloga é uma estratégia interessante de mutagênese para

genes específicos e tem sido rotineiramente utilizada para alguns microorganismos, tais

como Escherichia coli e levedura (Struhl et al., 1979). Esse método permite a substituição

in vivo, de uma cópia selvagem de um gene, por um cópia modificada in vitro (Bouché e

Bouchez, 2001). Entretanto, esta técnica tem sido inviável para plantas, no qual o sistema

de recombinação homóloga é menos ativo (Wang et al., 2001).

A mutagênese tradicional, através de mutagênicos químicos ou físicos, é

geralmente útil em plantas e tem sido aplicada com sucesso na genética reversa,

principalmente por não requerer a transformação de plantas (Henikoff e Comai, 2003). A

maioria dos mutagênicos químicos utilizados são alquilantes ou azidas. Os mutagênicos

químicos incluem radiação eletromagnética, tais como os raios gama, raios X, luz

ultravioleta, etc. A maioria das metodologias de mutagenização é através de sementes,

mas também há metodologias descritas para plantas inteiras, pólen, bulbos, etc (Kodym e

Afza, 2003). TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) é um método de

genética reversa que combina mutagênese química aleatória com screening baseado em

PCR para identificar mutações de ponto em regiões de interesse (McCallum et al., 2000).

Em Arabidopsis essa metodologia tem sido usada em grande escala (Arabidopsis

TILLING Project, http://tilling.fhcrc.org:9366). Cromatografia de alta resolução também é

capaz de identificar mutações em um único par de base, otimizando a identificação de

mutações (Osterlund e Paterson, 2002).

Independente da estratégia utilizada, a análise da função de um gene durante o

desenvolvimento de uma planta precisa ser realizada a partir de diferentes abordagens,

considerando seu padrão de expressão, a interação com outros fatores, entre outros

aspectos.

1.4 Diferenciação do tecido vascular

A fase vegetativa do desenvolvimento de uma planta começa com uma única

célula, o zigoto, que originará um organismo funcional. O zigoto sofre três processos

desenvolvimentais básicos: divisão celular, expansão celular e diferenciação celular. Em

plantas, diferente de animais, a embriogênese não gera os tecidos e órgãos do organismo

adulto, mas apenas estabelece um plano rudimentar do corpo, que consiste de dois

cotilédones (no caso de dicotiledôneas) e um eixo, que inclui os tecidos meristemáticos.

11

Além disso, nenhuma migração celular ocorre, em contraste com os eventos de migração

celular que ocorrem em muitos tipos de embriões de animais (Goldberg et al., 1994). A

maioria das estruturas que fazem parte do corpo da planta é gerada após a

embriogênese, através da atividade dos meristemas (revisado por Clark, 1997; Berleth e

Chatfield, 2002).

As angiospermas podem exibir diferentes padrões de desenvolvimento

embriogênico (Raghavan, 2000). Em crucíferas, incluindo Arabidopsis, o padrão de

desenvolvimento durante a embriogênese tem sido extensivamente estudado (Mansfield e

Briarty, 1991; West e Harada, 1993; Goldberg et al., 1994; Berleth e Chatfield, 2002),

revelando a ocorrência de distintos estágios morfológicos. Inicialmente, um padrão

preciso de divisões celulares estabelece uma esfera simetricamente radial, conhecida

como embrião globular. Rápidas divisões celulares produzem os primórdios dos

cotilédones, dando origem à simetria bilateral no embrião no estágio de coração. A

elongação do eixo e um maior desenvolvimento dos cotilédones produz o embrião no

estágio de torpedo. No final da embriogênese, no estágio de maturação, o embrião e a

semente perdem água e tornam-se metabolicamente quiescentes.

Sendo que o embrião em desenvolvimento consiste de uma população crescente

de células, o destino de cada uma parece ser determinado mais por uma maneira

posição-dependente do que pela sua origem clonal (Laux e Jürgens, 1997). O primeiro

evento de diferenciação celular ocorre no embrião no estágio globular, onde a

protoderme, que originará a epiderme, é produzida (Goldberg et al., 1994). Subseqüentes

eventos de diferenciação celular resultam na formação de mais duas camadas celulares:

o meristema fundamental, abaixo da protoderme, que originará os tecidos corticais e, na

raiz e no hipocótilo, também produzirá a endoderme, e uma camada mais interna,

denominada de procâmbio, que originará o cilindro vascular e na raiz, também o periciclo

(Goldberg et al., 1994, Berleth e Chatfield, 2002). A protoderme, o meristema fundamental

e o procâmbio são denominados de meristemas primários, que após a embriogênese

originarão a maioria das estruturas da planta adulta.

Em contraste à epiderme e aos tecidos fundamentais, a formação do cilindro

vascular requer um padrão mais complexo, incluindo a especificação de dois tipos de

tecidos com funções especializadas, o xilema e o floema (Nakajima e Benfey, 2002).

12

O xilema é composto por elementos traqueais (elementos condutores),

parênquima xilemático e fibras xilemáticas. Os elementos traqueais nas angiospermas

são os elementos de vaso, que são células alongadas, conectadas de extremidade à

extremidade, formando os vasos condutores (Esau, 1974). Ao longo da diferenciação dos

elementos de vaso, ocorre deposição de parede celular seguido pela morte celular

programada e a formação de uma placa de perfuração entre membros adjacentes de um

mesmo vaso (Mittler e Lam, 1995; Turner e Hall, 2000). Nas gimnospermas, os elementos

condutores são os traqueídeos, que são conectados através de pontuações (com

delgadas paredes primárias) em suas extremidades, formando colunas contínuas (Esau,

1974).

O floema é composto de elementos crivados, parênquima floemático e fibras

floemáticas. Nas angiospermas, os elementos condutores são os elementos de tubo

crivado, que contêm poucas organelas e são ligados uns aos outros por uma placa

crivada. As placas crivadas são paredes com poros atravessados por filamentos que

ligam células adjacentes. Junto aos elementos de tubo crivado são encontradas as

células companheiras, que possuem a mesma origem ontogenética que os elementos de

tubo crivado mas, diferentes destes, possuem núcleo e demais organelas. Essas duas

células são altamente modificadas e interconectadas por plasmodesmas, que são

responsáveis pela comunicação entre esses dois tipos celulares. Nas gimnospermas, os

elementos condutores são as células crivadas, onde as placas crivadas não são muito

especializadas e não estão aglomeradas em regiões específicas da parede celular (Esau,

1974; Ye, 2002).

Embriões maduros de diferentes espécies variam no grau de diferenciação de

seus tecidos vasculares, em algumas espécies não há nenhuma diferenciação e em

outras há diferenciação em diferentes graus dos elementos do xilema ou do floema

(revisado por Busse e Evert, 1999). No embrião maduro de Arabidopsis não há nenhuma

diferenciação dos elementos do xilema e do floema, mas apenas o tecido precursor do

sistema vascular, o procâmbio (Busse e Evert, 1999). A primeira indicação de formação

de células procambiais ocorre no final do estágio globular, sendo que somente com a

germinação da semente os elementos do xilema e floema se diferenciam (Busse e Evert,

1999; Turner e Sieburth, 2002).

13

Em A. thaliana, o padrão de diferenciação vascular das raízes e do hipocótilo exibe

muitas similaridades (Turner e Sieburth, 2002). O primeiro sinal de diferenciação celular,

dentro do hipocótilo, é a formação de duas fileiras de elementos do protofloema, cerca de

dois a três dias após a germinação (Busse e Evert, 1999). As duas fileiras de células são

localizadas em lados opostos do cilindro vascular (Figura 2), adjacentes ao periciclo.

Embora, as células procambiais que originarão o protofloema não sejam distinguíveis por

características morfológicas, elas podem ser identificadas a partir das suas relações com

outros tipos celulares e a partir da localização conhecida do floema nos estágios

posteriores do desenvolvimento (Busse e Evert, 1999). Ainda, a determinação de quais

células são as precursoras do xilema e do floema parece depender de suas posições.

Isso sugere que as células procambiais, em posições distintas, recebem diferentes sinais

que especificam seus destinos (Ye, 2002). A diferenciação do xilema é observada em um

estágio similar, mas ocorre normalmente após o início da diferenciação do floema. O

sistema vascular é particularmente complexo nas folhas, com nervuras primárias,

secundárias, terciárias e de ordens superiores. As nervuras se originam em diferentes

momentos e são arranjadas em um padrão, referido como padrão de venação, que reflete

a ontogenia e a organização estrutural da folha (Avsian-Kretchmer et al., 2002).

procâmbio

D C

B A

14

Figura 2: Padrão de diferenciação dos primeiros elementos do xilema e do floema no embrião e naplântula de Arabidopsis thaliana. A, embrião maduro, sistema vascular é representado peloprocâmbio; B, plântula com 2,5 dias, elementos imaturos do floema são representados pelas linhastracejadas e os elementos do xilema imaturo pela linha pontilhada. A diferenciação do xilema ocorreem duas regiões separadas; C, plântula com 2,75 dias. As linhas contínuas representam elementosdo floema, as linhas pontilhadas representam elementos do xilema e D, plântulas com 3 dias. Amaioria dos elementos do xilema e do floema estão maduros. Tanto os elementos do xilema comodo floema se diferenciam acropetalmente na raiz. Retirado de Busse e Evert (1999)

A auxina tem sido associada em vários aspectos do desenvolvimento e

diferenciação do tecido vascular (Aloni, 1995). A auxina é sintetizada nos primórdios

foliares e folhas jovens e é transportada polarmente em direção à base, gerando um

gradiente de auxina ao longo da planta (Sachs, 1981; Lomax et al., 1995). A auxina não

somente desengatilha a diferenciação vascular per se, mas induz a formação de uma

faixa contínua de células. A partir de experimentos de aplicação local de auxina foi

possível verificar que a diferenciação vascular ocorre em uma estreita faixa de células,

extremamente alongada (fileira) e que conecta o sistema vascular emergente ao sistema

vascular preexistente. Supõe-se que a continuidade do sistema vascular esteja

relacionada a sinais como os do transporte polar (apical-basal) de auxina (Sachs, 1989,

1991; Mattsson et al., 1999; Sieburth, 1999), que parece ser mediado por proteínas de

influxo e efluxo localizadas seletivamente no ápice e na base da membrana celular,

respectivamente (Lomax et al., 1995; Estelle, 1998).

Sachs (1981 e 1991) propõe um modelo para a diferenciação do tecido vascular,

denominado de “canalização” (Figura 3). Este modelo propõe que o fluxo de auxina, que

se inicia por difusão, a partir do sítio de origem, induz o transporte polar de auxina

levando à canalização do mesmo ao longo de uma estreita fileira de células, induzindo a

sua diferenciação em tecido vascular. Isso acontece porque as células com altas

concentrações de auxina tornam-se especializadas para o transporte polar de auxina e

assim drenam a auxina das células ao redor. Consequentemente, a formação de um novo

tecido vascular é um processo autocatalítico no qual um aumento no transporte leva a um

aumento na concentração de auxina e à diferenciação do tecido vascular, que por sua vez

leva a um melhor transporte de auxina.

Figura 3: Formação dos feixes vasculares por canalização. As setas indicam a direção do fluxo daauxina e a largura das mesmas é proporcional à capacidade da célula de transportar auxina. A, Amaioria das células tem capacidade similar de transporte de auxina, que ocorre por difusão; B, Ofluxo aumentado de auxina em algumas células leva a um aumento na sua capacidade detransporte de auxina e C, Especialização de algumas células para transportar auxina, essas célulasdrenam a auxina dos tecidos circundantes levando a formação de uma estreita faixa de célulasdiferenciadas. Retirado de Turner e Sieburth, 2002.

15

A citocinina também é implicada com a diferenciação dos tecidos vasculares,

provavelmente por estimular a proliferação celular das células procambiais (Sachs, 1991;

D´Agostinho e Kieber, 1999; den Boer e Murray, 2000). Entretanto, pouco se conhece

sobre o mecanismo pelo qual a citocinina induz a formação das células procambiais e

junto com a auxina, leva a formação de xilema e floema (Ye, 2002).

A transição das células precursoras geneticamente totipotentes para as células

procambiais e sua subseqüente diferenciação em elementos vasculares maduros,

envolve eventos do desenvolvimento cuja natureza molecular é ainda desconhecida

(Scarpella et al., 2000). Embora a formação do xilema tenha sido bem analisada,

principalmente utilizando como modelo o sistema de cultura de células do mesófilo de

Zinnia, análises do desenvolvimento do floema são limitadas (Nishitani et al., 2001).

Alguns genes envolvidos com a diferenciação do sistema vascular foram

identificados. Athb8 (Arabidopsis thaliana homeobox), um fator de transcrição homeobox

do tipo homeodomínio-Zip, cuja expressão é detectada no procâmbio de embriões no

estágio de torpedo (Baima et al., 1995), quando superexpresso leva a superprodução de

tecidos vasculares, sugerindo que Athb8 possa estar envolvido na estimulação da

atividade das células procâmbiais (Baima et al., 2001). A análise do padrão de expressão

do fator de transcrição Oshox 1 (Oriza sativa homeobox 1) indica que esse gene deve

regular a especificação das células procambiais, pois ele já se encontra nas células

iniciais do procâmbio, antes mesmo de existir qualquer diferenciação do tecido vascular

(Scarpella et al., 2000). O mutante wol (wooden leg), que codifica para um receptor de

citocinina, leva à diferenciação de todas as células procambiais em células do xilema

(Scheres et al., 1995; Mähönen et al., 2000). Mutação do gene mp (monopteros), que

codifica um fator de regulação da transcrição responsivo à auxina, interrompe a formação

normal da continuidade dos feixes vasculares, levando a um desalinhamento das células

do xilema (Berleth e Jürgens, 1993; Przemeck et al., 1996; Hardtke e Berleth, 1998).

Mutação no gene PINOID, que codifica uma proteína quinase, elimina completamente a

formação do câmbio vascular (Christensen et al., 2000). O mutante axr6 (auxin-resistant)

e bodenlos, previamente descritos como insensíveis à auxina, são defectivos no padrão

de venação (Hamann et al., 1999; Hobbie et al., 2000). Mutação no gene PIN (Pin-

formed), que codifica um transportador de auxina, leva a um aumento no tamanho do

cilindro vascular do caule (Okada et al., 1991; Gälweiler et al., 1998. O gene Vahox 1

16

(vascular associated homeobox 1), que codifica para um fator de transcrição tipo HD-Zip I

de tomate é especificamente expresso no floema durante o crescimento secundário

(Tornero et al., 1996). O gene ZeHB3 (Zinnia elegans homeobox 3), que codifica para um

fator do tipo HD-zip I, é expresso especificamente nas células do floema de todos os

órgãos de plantas jovens de Z. elegans, sugerindo que o mRNA ZeHB3 não é acumulado

no floema secundário (Nishitani et al., 2001).

Devido ao fato dos tecidos vasculares serem relativamente inacessíveis a análise

e da identificação dos seus tipos celulares no início do desenvolvimento ser difícil, genes

repórteres célula e tecido específicos fornecem importantes ferramentas para análise do

desenvolvimento dos tecidos vasculares (Turner e Sieburth, 2002).

1.5 Objetivos: - Identificar os fatores bZIP homólogos a OPACO-2 de A. thaliana e avaliar a história

evolutiva desta família,

- Elucidar o papel fisiológico do fator de regulação da transcrição do tipo bZIP BZO2H2

de Arabidopsis, que é um dos homólogos a O2.

17

2. MATERIAL E MÉTODOS

A clonagem dos cDNAs, a análise filogenética e os programas utilizados estão

descritos no artigo em anexo.

2.1 Material vegetal e condições de crescimento

Plantas de A. thaliana (ecótipo Columbia) foram crescidas em vasos contendo solo

e vermiculita em uma proporção de 1:1, ou em meio de cultura MS (Murashige e Skoog,

1962) modificado. Sementes de uma população segregante para um mutante de inserção

do T-DNA para Bzo2h2 (bzo2h2-1, mutante nulo) foram cedidas pelo Syngenta Research

Institute (no. de ac: 569C12, www.tmri.org/index.html; Sessions et al, 2002). As sementes

foram esterilizadas em etanol 70 % por 2 minutos e em hipoclorito de sódio 1 % por 20

minutos, seguido de três ou quatro lavagens com água destilada estéril e a seguir

semeadas em meio de cultura. A sincronização da germinação foi feita pela quebra da

dormência a 4°C por no mínimo quatro dias. O fotoperíodo foi de 16 h diárias de luz

artificial (lâmpada fluorescente luz do dia e grolux, Silvania) e temperatura de 22°C.

Meio MS modificado (MS/2): 2,1 g de sais MS (MS salt mixture, Invitrogen, EUA),

sacarose 0,5 %, phytagel (Invitrogen) 0,23 % (p/v), tampão MES 3 mM pH 5,7. Os meios

MS/100 e MS/1000 foram preparados a partir de diluições de 50 e 500 vezes,

respectivamente do meio MS/2. Autoclavar por 20 minutos a 120°C. Quando necessário,

sacarose, glicose, ABA (Sigma, EUA), citocinina (cinetina, Sigma), auxina (2,4D, Sigma),

giberilina (GA3, Sigma), etileno (na forma do precursor 1-aminocyclopropano-1-carboxylic

acid ou ACPC; Sigma) e metiljasmonato (Sigma) foram adicionados ao meio de cultura.

As soluções estoques de ABA e giberilina foram preparadas em metanol a uma

concentração de 10 mM. As soluções estoques de cinetina e 2,4D foram preparadas em

18

uma solução de NaOH 0,3 M a uma concentração de 10 e 200 mM, respectivamente. A

solução estoque de metil jasmonato foi preparada em etanol a uma concentração de 100

mM. A solução de ACPC foi preparada em água numa concentração de 10 mM, no

momento da utilização. Para gerar estresse osmótico e salino, foi adicionado ao meio de

cultura manitol (5 % e 10 %) e NaCl (100-150 mM) respectivamente. O estresse ao frio foi

induzido por incubação a 4°C por quatro dias. Para o tratamento com ausência de luz, as

placas foram expostas à luz por três horas e então mantidas embaladas em papel

alumínio por três dias.

2.2 Métodos

Procedimentos básicos foram usados para digestões enzimáticas e clonagens de

DNA; transformação de Escherichia coli e minipreparações de plasmídios (Sambrook et

al., 1989). As purificações de fragmentos de DNA foram realizadas em gel de agarose

utilizando o kit QUIquick Gel Extraction (Quiagen, Alemanha) seguindo o protocolo do

fabricante. O seqüenciamento do DNA foi realizado segundo a metodologia Dye

Terminator (Big Dye Kit, Perkin Elmer, USA) e analisado com os programas DNASIS

(Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra) e BLAST no servidor NCBI

(www.ncbi.nlm.nih.gov). Os oligonucleotídeos utilizados para seqüenciamento são

apresentados na Tabela I. As reações de PCR foram realizadas em um volume final de 50

µl contendo o tampão de reação 1X (Tris HCl 10 mM pH 9,0, KCl 50 mM), MgCl2 1,5 mM,

200 µM de cada um dos dNTPs, 0,4 µM de cada um dos oligonucleotídeos, 1 unidade de

Taq DNA polimerase (Invitrogen) e cerca de 200 ng de DNA genômico de A. thaliana ou

cerca de 50 ng de DNA plasmidial. As reação de amplificação foram realizadas através de

uma etapa inicial de desnaturação a 94°C por 3 minutos, seguida de 30 ciclos de

desnaturação a 94°C por 45 segundos, anelamento dos oligonucleotídeos (temperatura

varia conforme o par de oligonucleotídeos) por 30 segundos e extensão a 72°C por 1

minuto e 30 segundos e de uma última etapa de extensão a 72°C por 5 minutos.

Todas as posições das seqüências nucleotídicas são indicadas em relação ao

nucleotídeo “A” do códon ATG de início de tradução, o qual corresponde a posição +1.

19

Tabela I: Oligonucleotídeos utilizados para o seqüenciamento e para as amplificações.

oligonucleotídeos Seqüência (5’→ 3’) Posição UsoDIR GTA AAA CGA CGG CCA GTG CC pUC 18 Seqüenciamento REV AAC AGC TAT GAC CAT GAT TAC pUC 18 pBSK(-) Seqüenciamento T7 AAT ACG ACT CAC TAT AGG GC pGEM-T-easy Seqüenciamento

SP6 CAT ACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG pGEM-T-easy Seqüenciamento

RIL3 GAA ACA AGG GTC TAG AG 83-100 do CDNA Bzo2h2 Obtenção do cDNA inteiro LG1 CTTGTGTGTTAAGCTTCAAAG - 24 a -3 do CDNA Bzo2h2 Adição do sítio Hind III para obtenção do

cDNA inteiro LG2 CAAGCCCTCTAGACCCTTG 77-95 do CDNA Bzo2h2 Obtenção do cDNA inteiro e RT-PCR do

gene Bzo2h2 LG3 GTTCTGAAGAATTCGAGTCATG 830-852 do cDNA Bzo2h2 Adição do sítio EcoR I para obtenção do

cDNA inteiro LG4 CTTTAACCTGCAGCTTCAATCTCGTTCACG -2000 a –1970 do gene Bzo2h2 Adição do sítio Pst I para construção da

fusão traducional Bzo2h2::gusA LG5 ACTTGGTAGAGCTCGAGACTC 432-457 do cDNA Bzo2h2 Adição do sítio Xho I para construção do

cassete Bzo2h2 dsRNA LG6 TACATGTTCTCTAGAAAGAGAG 836-857 do cDNA Bzo2h2 Adição do sítio Xba I para construção do

cassete Bzo2h2 dsRNA LG7 ACTTGGTGGATCCTGAGACTCAG 431-456 do cDNA Bzo2h2 Adição do sítio BamH I para construção do

cassete Bzo2h2 dsRNA LG8 TACATGTTCTCGAGAAAGAGAG 836-857 do cDNA Bzo2h2 Adição do sítio Xho I para construção do

cassete Bzo2h2 dsRNA LG9 CCAGACAGAGTGGGATCCCTAGGGC 774-799 do gene gusA Adição do sítio BamH I para construção do

cassete Bzo2h2 dsRNA LG10 CTTCGGTTTGAGCTCGCGAGTG 1710-1732 do gene gusA Adição do sítio Sst I para construção do

cassete Bzo2h2 dsRNA e RT-PCR de gusA S3GUS3 CCAGCTCGGATCCACTTCTCTCCATGGCAATGTC 22-56 do cDNA Bzo2h2 Adição do sítio BamH I para construção da

fusão traducional Bzo2h2::gusA S3GUS5 CCAAGAATACAACTGCAGATGAGTG 563-588 do gene Bzo2h2 Adição do sítio Pst I para a construção da

fusão traducional Bzo2h2::gusA Oligo dT 18 TTTTTTTTTTTTTTTTTT Extremidade 3’ polyC RT-PCR, síntese da primeira fita RTPCRH2 GATGTCTGAGACGCAGCTAAC 805-826 do cDNA Bzo2h2 RT-PCR do cDNA Bzo2h2

ATPR1 TCCCAGAATCGCTAAGATTGC 24 a 45 do gene Apt1* Controle do RTPCR ATPR2 CCTTTCCCTTAAGCTCTG 484 a 502 do gene Apt1* Controle do RTPCR

RTPCRGUS RT-PCR do cDNA gusA * gene da adenosina fosforibosil transferase, (At1g27450, AAN15689; Moffatt et al., 1994)

20

2.2.1 Construções dos plasmídeos

a) Construção gênica para obter a superexpressão de Bzo2h2

A obtenção do cDNA Bzo2h2 inteiro (n° de ac. AF310223) foi realizada a partir da

extremidade 5’ de 110 pb obtida a partir de 5’ RACE clonada em pGEM-T easy (clone 5’)

(Promega, EUA) e da extremidade 3’ de 730 pb proveniente do screening do banco de

cDNA de semente em desenvolvimento de A. thaliana clonada em pBKS+ (clone 3’). O

clone 5’ foi amplificado com os oligonucleotídeos RIL3 e LG1 (Tabela I) e o clone 3’ com

os oligonucleotídeos LG2 e LG3 (Tabela I). O produto da PCR do clone 5’ digerido com

Hind III e Xba I e o produto da PCR do clone 3’ digerido com Xba I e EcoR I foram

purificados, ligados pelas extremidades Xba I e clonados nos sítios Hind III e EcoR I em

pUC 18 (Stratagene) para formar o clone Bzo2h2::pUC18 (Figura 4) e então

seqüenciados. O cDNA inteiro foi purificado como um fragmento Hind III – EcoR I e

tratado com DNA polymerase I large (Klenow) fragment (Invitrogen) conforme

recomendação do fabricante, a fim de obtermos extremidades cegas. Para a construção

de Bzo2h2::pRT-Ω (Figura 4), o fragmento de 840 pb com extremidades cegas foi clonado

em pRT- Ω (Überlacker e Werr, 1996) previamente digerido com BamH I, tratado com

DNA polymerase I large (Klenow) fragment e desfosforilado pelo tratamento com fosfatase

alcalina (Amersham Pharmacia Biotech), conforme recomendação do fabricante. A

identificação dos clones positivos e a verificação da orientação do inserto foram

realizadas pelas digestões com Pst I e Pst I - Xba I, respectivamente. O cassete

35S::Bzo2h2 foi clonado no sítio Pst I do vetor de transformação pCAMBIA 3300

(www.cambia.org.br) e a orientação verificada pela digestão com Xho I e Xba I.

b) Construção gênica para obter o silenciamento gênico de Bzo2h2

Segundo Chuang e Meyerowitz (2000), a formação de uma dupla fita de RNA

desencadeia o silenciamento gênico do gene alvo de uma maneira muito mais eficiente do

que simplesmente a formação de uma fita simples de RNA na orientação antisenso. Essa

dupla fita é formada pela transcrição de um cassete que contenha um fragmento do gene

de interesse na orientação senso e antisenso intercalados por uma seqüência

nucleotídica qualquer. Para isso, foi construído um cassete de expressão onde um

fragmento do cDNA Bzo2h2 (436-847 pb, n° de ac. AF310223) na orientação antisenso e

senso são separados por uma seqüência do gene gusA (786-1809pb, n° de ac. M14641)

21

Construção do cDNA inteiro

5’

Hind III Xba I

clone 5‘

Hind III Xba I EcoR I

Bzo2h2 cDNA inteiro

EcoR I Xba I

Extremidade 3’clone 3’

Digestão dos produtos de PCR

Bzo2h2::pUC18

35 SXba I Pst I

poly A Ω Bzo2h2 cDNA teiro

Pst I

Clonagem do cDNA Bzo2h2 inteiro em pRT-Ω

35S::Bzo2h2

Clonagem do cassete de expressão 35S::Bzo2h2 no vetor pCAMBIA 3300

Xho I

polyA 35Sbar

pCAMBIA 3300 Borda esquerda

Figura 4: Estratégia para construção do cassete de expressão 35vetor de transformação de plantas pCAMBIA 3300. 35S: promoto

couve-flor; Ω: seqüência 5’ não traduzida de vírus do mosaicopoliadenilação do vírus do mosaico da couve-flor; bar: gen

fosfinotricina, LacZ: gene da β-galactosidase; pUC 18 MCS: mult

Pst I, Sal I, Acc I, Hinc II, Xba I, BamH I, Xma I, Kpn I, Sst I, EcoR I).

22

in

LacZ

EcoR I

Hind III pUC 18 MCS

Borda direita

S::Bzo2h2 e sua clonagem no

r 35 S do vírus do mosaico da

do tabaco; poly A: sinal de

e bar, confere resistência à

iple cloning site (Hind III, Sph I,

sob o controle do promotor 35 S do CaMV (Figura 5). Os fragmentos antisenso e senso de 411 pb do cDNA Bzo2h2 com os sítios de restrição Xho I e BamH I, Sst I e Xba I,

respectivamente foram obtidos por amplificação a partir do cDNA Bzo2h2 com o

oligonucleotídeos LG5 e LG6 (Tabela I). A seqüência de 1023 pb do gene gusA, utilizada

como intercaladora entre os fragmentos de cDNA antisenso e senso, foi amplificada a

partir do vetor pBI 121 (Clontech, EUA) com os oligonucleotídeos LG9 e LG10 que

adicionam os sítios BamH I e Sst I, respectivamente. Cada um dos produtos de PCR foi

clonado em pUC18 e seqüenciados. Inicialmente, o cDNA parcial antisenso digerido com

Xho I e BamH I e o fragmento do gene gusA digerido com BamH I e Sst I foram clonados

nos sítios Xho I e Sst I do vetor pRT100 (Überlacker e Werr, 1996). Posteriormente, o

cDNA parcial senso digerido com Sst I e Xba I foi clonado no plasmídio H2antiseno::gusA-

pRT100. O cassete completo Bzo2h2 dsRNA, contendo os cDNA senso e antisenso

separados por um fragmento do gene gusA, sob o controle do promotor 35S e com um

sinal de poliadenilação (35S::H2antisenso::gusA::H2senso::polyA), foi liberado pela

digestão com Pst I e clonado em pCAMBIA 2300 (www.cambia.org.br). A orientação do

cassete foi verificada pela digestão com as enzimas de restrição BamH I e Xho I.

c) Fusão traducional da seqüência promotora Bzo2h2 ao gene marcador gusA

A seqüência promotora do gene Bzo2h2 foi definida a partir da identificação da

seqüência nucleotídica presente nos bancos de dados. Inicialmente, com o projeto

genoma ainda não concluído, a seqüência disponível foi de cerca de 500 pb upstream ao

gene. A qual foi utilizada para construir a fusão traducional com o gene marcador gusA

(Figura 6). Entretanto, com o término do projeto genoma, foi possível verificar a presença

de mais 1500 pb upstream ao gene Bzo2h2, sendo então utilizado cerca de 1,8 kb para

realizar uma nova fusão traducional da seqüência promotora Bzo2h2 com o gene

marcador gusA (Figura 6).

A seqüência promotora de cerca de 500 pb foi amplificada com o par de

oligonucleotídeos, S3GUS5 e S3GUS3 (Tabela I), digerida com BamH I (o sítio presente

na extremidade 3’ foi adicionado pelo oligonucleotídeo S3GUS3 e o da extremidade 5’

estava presente na seqüência), gerando um fragmento de 524 pb que foi clonado em pUC

18 para seqüênciamento. A seqüência promotora de 1800 pb foi amplificada com os

oligonucleotídeos S3GUS3 e LG4 que adicionam os sítios BamH I e Pst I

23

EcoR I

Pst I

Hind IIIXho I

pUC 18 MCS

LacZpolyA 35Snpt II

Pst I Pst I

35S::H2antisenso::gusA::H2senso::polyA

H2antisenso::gusA-pRT100

Clonagem do fragmentoBzo2h2 cDNA senso nos sítiosSst I e Xba I deH2antisenso::gusA-pRT100

polyA35 S cDNA parcialXho I

gusABamH I Sst I Xba I

(Bzo2h2 dsRNA)

Clonagem do cassete de expressão Bzo2h2 dsRNA no vetor pCAMBIA 2300

Pst I

gusABamH I Sst I Xho I

cDNA parcial

BamH I Xba I Sst I

cDNA parcial

cDNA parcialgusA polyA cDNA parcial

BamH I Sst I Xba IXho I

35 S

Produtos da PCR digeridoscom as enzimas indicadaspara a clonagem em pRT100

Clonagem dos fragmentosBzo2h2 cDNA antisenso egusA em pRT100

Borda esquerda Borda direitapCAMBIA 2300

Figura 5: Estratégia para construção do cassete de expressão Bzo2h2 dsRNA e sua clonagem no vetor de transformação de plantas pCAMBIA 2300. 35S: promotor 35 S do vírus do mosaico da couve-flor; poly A: sinal de

poliadenilação do vírus do mosaico da couve-flor; npt II: gene da neomicina fosfotransferase II, confere resistência

à canamicina, LacZ: gene da β-galactosidase; pUC 18 MCS: multiple cloning site (Hind III, Sph I, Pst I, Sal I, Acc I,

Hinc II, Xba I, BamH I, Xma I, Kpn I, Sst I, EcoR I). As setas indicam a orientação do cDNA.

24

EcoR I BamH I Hind III

H2 pro 2,0 Kb

Digestão do vetor pBI 121 com Xba I e EcoR I para liberar ocassete com o gene gusA e clonagem em pUC 18

pBI 121

EcoR I

35S

Xba I BamH I

gusA Nos ter

BamH I BamH I

H2 pro 0,5 Kb

gusA::pUC 18

gusA Nos ter

Pst I Xba I BamH I EcoR I

Ligação promotor EcoR I respectiva2300

E

-1,8 kb

Pst I

Produtos da PCR digeridos

Pst I

Hind III

p

LacZ

Borda direita

Figura 6: Estratée sua clonagem

35 S do vírus d

sintetase; poly A

fosfotransferase

multiple cloning s

Ligação dos produtos de PCR em fase com gusA::pUC 18

dos cassetes com o1,8 Kb e 0,5 Kb nos sítios

e Pst I - EcoR I,mente, do vetor pCAMBIA

coR I

+ 42 pb H2pro(1,8Kb)::gusA-pUC18

EcoR I BamH IPst I BamH I

H2 pro 1,8 Kb

Hind III BamH I

gusA

EcoR I

Nos ter

gusA Nos ter H2 pro 0,5 Kb

H2pro(0,5Kb)::gusA-pUC18 + 66 pb - 481 pb

I

EcoR IUC 18 MCS

Xho IXho I poly Anpt II35S

pCAMBIA 2300 Borda esquerda

gia para obtenção da fusão traducional da seqüência promotora Bzo2h2 com o gene gusA

no vetor de transformação de plantas pCAMBIA 2300 ou pCAMBIA 3300. 35S: promotor

o mosaico da couve-flor; pro: seqüência promotora; Nos ter: terminador da nopalina

: sinal de poliadenilação do vírus do mosaico da couve-flor; npt II gene da neomicina

II, confere resistência à canamicina, LacZ: gene da β-galactosidase; pUC 18 MCS:

ite (Hind III, Sph I, Pst I, Sal I, Acc I, Hinc II, Xba I, BamH I, Xma I, Kpn I, Sst I, EcoR I).

25

respectivamente, gerando um produto de 2020 pb que foi clonado em pGEM-T easy

(Promega). Ambos produtos de PCR incluem 42 nucleotídeos, ou seja, 14 aminoácidos da

seqüência codificante do gene Bzo2h2.

Para a construção do cassete de expressão H2 promotor::gusA, o vetor pBI 121

(Jefferson, 1987) foi digerido com Hind III e EcoR I para promover a liberação do gene

gusA (Figura 7). Este cassete foi subclonado nos sítios Xba I e EcoR I de pUC 18 gerando

o plasmídeo gusA-pUC 18. As duas seqüências promotoras utilizadas, de 524 pb e de

1800 pb, foram clonadas nos sítios BamH I e Pst I-BamH I de gusA:pUC 18,

respectivamente, resultando nos plasmídeos H2pro(0,5 Kb)::gusA-pUC18, e

H2pro(1,8Kb)::gusA-pUC18. A orientação da integração dos dois cassetes foi verificada

por digestão com Pst I-EcoR I para o plasmídeo Bzo2h2pro(0,5 Kb)::gusA-pUC 18 e com

Pst I-BamH I e Pst I-Hind III para o plasmídeo Bzo2h2pro(1,8 Kb)::gusA-pUC18. A

manutenção da fase de leitura correta da seqüência Bzo2h2 fusionada ao gene gusA foi

verificada por sequenciamento. O cassete Bzo2h2pro(0,5 Kb)::gusA::NOSter foi liberado

por digestão com BamH I e EcoR I e clonado no vetor de transformação de plantas

pCAMBIA 3300, e o cassete Bzo2h2pro(1,8 Kb)::gusA::NOSter foi liberado por digestão

EcoR I e clonado no vetor de transformação pCAMBIA 2300. A orientação do cassete

Bzo2h2pro(1,8 Kb)::gusA::NOSter foi verificada por digestão com Xho I – Hind III.

2.2.2 Transformação genética de A. thaliana e obtenção das linhagens homozigotas para

um locus do transgene

Os vetores binários carregando os genes quiméricos descritos anteriormente

foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens GV3101::pMP90 (Koncz e Schell,

1986) para transformação de A. thaliana. O cultivo, conservação e transformação de A.

tumefaciens foram realizados conforme descrito por Brasileiro (1998). Os clones positivos

foram identificados através de Southern blot (Sambrook et al., 1989).

A metodologia usada para a transformação de A. thaliana foi de transformação in

planta descrita por Bechtold et al. (1993) modificada, na qual uma solução contendo A.

tumefaciens carregando o vetor de interesse é borrifada sobre plantas em estágios iniciais

do florescimento. Esse procedimento foi realizado por duas vezes com um intervalo de

uma semana entre uma aplicação e outra. Esta metodologia apresenta uma grande

vantagem sobre os métodos de transformação tradicionais, pelo fato de não requerer a

regeneração de transformantes a partir de cultura de tecidos.

26

Após a transformação, as sementes foram coletadas e semeadas em meio MS/2

suplementado com 0,5 % de sacarose, contendo o respectivo marcador de seleção,

canamicina (150 µg/ml, para pCAMBIA 2300) ou com glifosinato de amônio (3 mg/l,

Finale, para pCAMBIA 3300). As plantas selecionadas foram transferidas para vasos

com terra e vemiculita (1:1). As sementes F1 foram coletadas individualmente por planta,

novamente semeadas em meio com o agente seletivo e autofecundadas para gerar

plantas F2. A identificação das F1 homozigóticas para um locus ativo do gene quimérico foi

feita pela análise do padrão de segregação de resistência à canamicina ou ao glifosinato

de amônio na F2.

2.2.3 Extração e análise do DNA genômico

A extração de DNA das plantas F2 homozigotas para um locus do transgene foi

realizada segundo a técnica de CTAB descrita por Doyle e Doyle (1987) com modificações. Rosetas de plantas de 3 a 4 semanas crescidas em meio MS/2

suplementado com 0,5 % de sacarose foram coletadas e congeladas imediatamente em

nitrogênio líquido. Cerca de 3 g de tecido foi macerado em cadinho com nitrogênio líquido

até a obtenção de um pó fino e então transferido para um tubo contendo 5 ml de tampão

de extração (Tris-HCl 0,1 M pH 8,0; C