UNIVERSIDADE CATLICA DE GOIS PR-REITORIA DE PS-GRADUAO E PESQUISA MESTRADO EM GENTICA Dissertao de Mestrado

MONITORAMENTO GENTICO RETROSPECTIVO DE POPULAO OCUPACIONALMENTE EXPOSTA RADIAO IONIZANTE UTILIZANDO MARCADORES STR

BRULIO CANADO FLORES

ORIENTADOR: Prof. Dr. Aparecido Divino da Cruz, Ph.D. CO-ORIENTADORA: Prof. Dr. Daniela de Melo e Silva

Goinia - Go 2008

UNIVERSIDADE CATLICA DE GOIS PR-REITORIA DE PS-GRADUAO E PESQUISA MESTRADO EM GENTICA

MONITORAMENTO GENTICO RETROSPECTIVO DE POPULAO OCUPACIONALMENTE EXPOSTA RADIAO IONIZANTE UTILIZANDO MARCADORES STR

BRULIO CANADO FLORESDissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Gentica da Universidade Catlica de Gois, como requisito parcial para obteno do Ttulo de Mestre em Gentica. ORIENTADOR: Prof. Dr. Aparecido Divino da Cruz, Ph.D. CO-ORIENTADORA: Prof. Dr. Daniela de Melo e Silva

Goinia - Go 2008

i

Ficha Catalogrfica

F634m

Flores. Brulio Canado. Monitoramento gentico retrospectivo de populao ocupacionalmente exposta radiao ionizante utilizando marcadores STR / Brulio Canado Flores. 2008. 108 f. Dissertao (mestrado) Universidade Catlica de Gois, Pr-Reitoria de Ps-Graduao e Pesquisa, Mestrado em Gentica, 2008. Orientador: Prof. Dr. Aparecido Divino da Cruz. Ph.D. C-orientadora: Prof. Dr. Daniela de Melo e Silva. 1. Radiao ionizante. 2. Microssatlites. 3. Liquidators. 4. Csio 137. 5. STR (Repeties Curtas em Tandem). 6. Gentica. Ttulo. CDU: 572.224(043.3)

ii

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAO DE MESTRADO

Aluno(a): Brulio Canado Flores Orientador: Prof. Dr. Aparecido Divino da Cruz, Ph.D. Co-Orientadora: Prof. Dr. Daniela de Melo e Silva

Membros Externos: Titular: Professor Dr. Barry W. Glickman Suplente: Professor Dr. Wagner Gouva dos Santos Membros Internos: Titular: Professora Dra. Maria Paula Curado Suplente: Professor Dr. Breno de Faria e Vasconcellos

Curso de Mestrado em Gentica Universidade Catlica de Gois

Data: 27/06/2008

iii

Dedico este trabalho...

Aos meus pais queridos e minha irm pelo apoio e

incentivo que me propulsionam todos os dias da minha vida e me revitalizam ante todas as dificuldades.

iv

AgradecimentosAo Prof. Dr. Aparecido Divino da Cruz, Peixoto, por acreditar que um bombeiro poderia transformar-se em geneticista, por ter se envolvido com a Defesa Civil, por ter sonhado muitos dos meus sonhos, consolado muitos dos meus sofrimentos e regozijado muito de minhas conquistas. Agradeo pela compreenso, pela amizade, pela cumplicidade, pela lealdade, pela

competncia e principalmente pela pacincia em toda esta inusitada experincia de formao. Ao Cel QOCBM Uilson Alcntara Manzan, por ter depositado confiana no oficial maluco que resolveu ser cientista e creditado a assinatura do Corpo de Bombeiros a essa investigao cientfica. Profa Dra. Daniela de Melo e Silva, por ter sido o anjo que a providncia divina colocou em meu caminho para guiar-me pelas veredas da desconhecida investigao gentica. Agradeo por ter iluminado minha busca e se disposto a enfrentar o desafio do aluno militar e sistemtico que deveria se polir em cientista. Muito obrigado pelo companheirismo, pela disponibilidade e principalmente pelo seu maravilhoso exemplo. Aos Coronis Claiton Divino de Souza Coelho, Paulo Rocha Arantes e aos Tenentes Coronis Ismael Jos de Siqueira, Edmar de Sousa Lima e Adenir Jos Ferreira de Jesus por terem acreditado que podamos envolver a Defesa Civil com a Gentica e que essa unio seria salutar e edificante. Profa Angela Adamski da Silva Reis, M.Sc, por ter me aberto as portas de um mundo jamais sonhado e desejado por mim, por ter se configurado em mestre e amiga de muitas horas e, finalmente, por ter me apresentado a uma famlia que me satisfiz muito em escolher e da qual para sempre quero ser membro. Aos colegas e amigos Maj QOC Srgio Ribeiro Lopes, Cap QOC Pedro Carlos Borges de Lira e 1 Ten QOC Hlio Loyola Gonzaga Jnior pelo

v

incentivo e pelo conhecimento que compuseram minha formao de bombeiro e de defesa civil. s minhas meninas, Emlia Oliveira Alves Costa, Luciana Abraho Ramos e Marlia Gomes Ismar, pela amizade, pelo envolvimento, pelo comprometimento, pela luz, pela vida e pela alegria que lhes so caractersticas e compuseram cones essenciais que movimentaram o corao e o crebro deste trabalho. Aos Colegas do Replicon, em especial, Fabiano Ribeiro Borges, Eduardo Rocha Pedrosa, Julles Cristiane Rodrigues da Silva, Luciana Pinheiro Vaz e Raimundo da Silva Lima Jnior pelo auxlio na coleta das amostras e nos conhecimentos cotidianos to importantes na formao de um novo membro do Ncleo. Aos Oficiais e Praas do Corpo de Bombeiros Militar do Estado de Gois que confiaram e apoiaram minha nova empreitada numa rea, em princpio, estranha nossa atividade. Aos funcionrios da Superintendncia Leide das Neves Ferreira que aceitaram, se acostumaram e receberam muito bem mais um integrante da famlia SuLeide. Aos professores dos Programas de Mestrado e Ps-graduao em Gentica da Universidade Catlica de Gois, por auxiliar com seus conhecimentos e disponibilidade e pelo incentivo, constantemente presentes. Aos amigos e colegas de mestrado, em especial, Priscilla Rosa Silva de Almeida e Ricardo Goulart Rodovalho, pela pacincia, cumplicidade, amparo e incentivo to importantes para que eu perseverasse na labuta diuturna em busca da concluso desta obra. Aos voluntrios que participaram da pesquisa, muitas vezes superando seus traumas e preconceitos em prol do desenvolvimento cientfico e social. Aos Funcionrios da Universidade pela competncia e carinho que dignificam nosso trabalho e o tornam mais prazeroso. vi

Que voc substitua a facilidade pelo esforo; que sempre encontre alegria ao escalar novas montanhas; que jamais descanse da sua busca pelo conhecimento; que deseje ser hoje um pouco mais do que foi ontem e um pouco menos do que ser amanh. Tudo isso far de voc um ser humano completo e lhe trar a verdadeira felicidade. Rabino Benjamin Blech Beno a um amigo

vii

SumrioPgina Figuras, Tabelas e anexos Siglas, Smbolos e Abreviaturas Resumo Abstract 1. Introduo 1.1 O Atendimento Ocorrncia 1.2 Classificao do Desastre 2. Conhecimento Atual 2.1 Mutaes 2.2 Repeties em Tandem 2.3 Radiao Ionizante 2.4 Os Trabalhadores do Acidente, ou Liquidators 3. Metodologia 3.1 Grupo Amostral 3.2 Extrao e Quantificao das Amostras de DNA 3.3 Reaes de PCR 3.4 Genotipagem dos Marcadores 3.5 Anlise dos Dados Moleculares 3.6 Definio de Mutaes Germinativas 3.7 Taxa de Mutao, Qui-quadrado e Doublig Dose 4. Resultados 5. Discusso 6. Concluso 7. Referncias Bibliogrficas 8. Anexos 9 10 11 12 13 14 16 18 18 21 23 25 27 27 29 29 30 31 34 34 36 41 47 49 54

9

Figuras, Tabelas e AnexosPginaFigura 1 Exemplo de como se disps no software a representao dos tamanhos dos fragmentos para a anlise de cada marcador. Neste caso, observamos os alelos paternos (6,9), os maternos (6,7) e os filiais (6,9), indicando a coincidncia entre a gerao parental e a filial. Exemplo de como se disps no software a representao dos tamanhos dos fragmentos para a anlise de cada marcador. Neste caso, observamos os alelos paternos (11,14), os maternos (12,13) e os filiais (10,13), indicando uma mutao de origem paterna (11 10). Tipos de mutao gnica e seus mecanismos de ocorrncia Caractersticas dos 16 marcadores STR utilizados para genotipagem dos indivduos ocupacionalmente expostos radiao ionizante de csio137 em Goinia Dados gerais dos eventos mutacionais de cada locus STR no grupo ocupacionalmente exposto radiao ionizante de csio137 em Goinia Caractersticas do grupo ocupacionalmente exposto radiao ionizante de csio137 em Goinia Dados gerais dos eventos mutacionais de cada locus STR no grupo controle Caractersticas do grupo controle, de acordo com o locus mutado e a taxa de mutao/locus Questionrio aplicado aos potencialmente expostos Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Resoluo 340 CNS/MS Resoluo 347 CNS/MS Protocolo de coleta de sangue Protocolo de Extrao de DNA Protocolo de PCR e Eletroforese Artigo Submetido Publicao Comprovantes de Recebimento da Revista Cientfica 32

Figura 2

33

Tabela 1 Tabela 2

20 30

Tabela 3 Tabela 4 Tabela 5 Tabela 6 Anexo 1 Anexo 2 Anexo 3 Anexo 4 Anexo 5 Anexo 6 Anexo 7 Anexo 8 Anexo 9

38 38 39 39 54 62 65 76 80 82 85 87 108

10

Siglas, Smbolos e AbreviaturasAPAE CNS CODAR DNAEUA IGR LaGene MI MD MS PNDC STR SULEIDE Associao de Pais e Amigos dos Excepcionais Conselho Nacional de Sade Codificao Brasileira de Desastres, Ameaas e Riscos Acido Desoxirribonuclico Estados Unidos da Amrica Instituto Goiano de Radioterapia Laboratrio de Citogentica Humana e Gentica Molecular Ministrio da Integrao Nacional Manual de Desastres Desastres Humanos Ministrio da Sade Poltica Nacional de Defesa Civil Do Ingls, Short Tandem Repeats (Repeties Curtas em Tandem) Superintendncia Leide das Neves Ferreira

11

RESUMOO acidente radiolgico mais grave do ocidente aconteceu em setembro de 1987, quando um aparelho de radioterapia contendo 50.9 TBq de Cs137Cl foi removida das runas de uma clnica de radioterapia e em seguida, violada. Este acontecimento criou a oportunidade de que se investigasse os efeitos genticos da radiao ionizante. Foi investigada a variabilidade gentica em 12 loci microssatlites em 11 famlias de liquidators, que trabalharam nas aes de defesa civil. Como grupo controle, utilizamos famlias sem potencial de exposio radiao ionizante, perfazendo 900 indivduos analisados, da mesma rea do Estado de Gois. Quando comparamos os grupos exposto e controle, encontramos um incremento no nmero de novos alelos nos perfis dos liquidators expostos. A taxa de mutao encontrada foi maior nas famlias dos expostos do que no grupo controle. Estes resultados, associados a anteriores, indicaram que a anlise dos perfis allicos dos liquidators pode indicar a exposio radiao ionizante, alm de uma elevada taxa de mutaes de microssatlites poder ser atribuda a esta exposio

Palavras chave: Radiao Ionizante, Microssatlites, Liquidators, Csio 137, STR, Goinia.

12

ABSTRACT

The most serious radiological accident occurred in the western hemisphere and it happened in September of 1987, when a radiotherapy unit containing 50.9 TBq of Cs137Cl was removed from an abandoned radiotherapy clinic in the State of Goias, Brazil and it was subsequently disassembled. This event provides an opportunity to assess the genetic effects of ionizing radiation. We investigated the genetic variation of 12 microsatellite loci in 11 families of exposed liquidators, who worked at the civil defense procedures. As a control group, non-exposed families, comprised of 900 individuals, from the same area of Goias state were analyzed. When we compared the exposed and control groups, we found an increase in the number of new alleles in the offspring of the exposed liquidators. The mutation rate was found to be higher in the exposed families compared to the control group. These results, associated with previous studies, indicated that exposure to ionizing radiation can be detected in offspring of exposed liquidators and also suggest that the elevated microsatellite mutation rate can be attributed to radioactive exposure.

Keywords:

Ionizing Radiation, Microsatellite, Liquidators, Cesium 137, STR, Goiania.

13

1. INTRODUO

O uso freqente de fontes de radiao na medicina, na indstria e nas usinas nucleares cria possibilidades de acidentes radioativos. Por outro lado, a contribuio poltico-social e econmica do uso deste recurso de energia imensurvel. Conseqentemente o uso dos recursos radioativos, assim como os acidentes decorrentes desta fonte de energia, tem recebido grande ateno por parte da populao. Entretanto, os cuidados bsicos de radioproteo, preveno e controle de exposio s radiaes, s h pouco tempo, passaram a ser valorizados no territrio nacional, motivados, em parte, pelo acidente radiolgico ocorrido em Goinia no ano de 1987 (da Silva, 2000). Os acidentes radioativos podem envolver desde indivduos isolados at comunidades inteiras. O efeito agudo da exposio humana radiao ionizante pode no ser a morte celular, mas uma alterao permanente no DNA e, assim, a clula passa a sobreviver com erros incorporados ao seu genoma. Neste contexto, os efeitos genticos da exposio podem perdurar por vrias geraes (da Cruz, 1997). Alm dos conseqentes efeitos fsicos na populao exposta, a exposio individual radiao resulta em agravos emocionais, promovendo um incremento da ocorrncia de doenas

psicolgicas e elevao do nvel de estresse dos indivduos envolvidos no evento (Miranda et al, 2005, Koscheyev et al, 1993). Os efeitos biolgicos da exposio aguda radiao incluem queimaduras e danos pele. J os efeitos da exposio crnica incluem danos ao DNA, que podem resultar em doenas genticas como o cncer (Brenner et al., 2003, Montelone, 1998, da Cruz et al., 1997). As radiaes ionizantes so

14 exemplos de agentes fsicos mutagnicos que podem levar tambm ao comprometimento dos mecanismos de reparo celular (Eot-Houllier, 2005) e ao desenvolvimento de diversos tipos de cncer que variam de acordo com a intensidade, local e tempo de exposio e tipo de radionucldio (Ward, 2002, Goldman, 1982). A assistncia s populaes vitimadas por desastres compreende as atividades logsticas, assistenciais e de promoo sade. As necessidades de pronta resposta exigem um planejamento circunstanciado. Adicionalmente, de fundamental importncia elaborar um programa minucioso que envolve preparao dos rgos locais de defesa civil. Nas situaes de desastres que envolvem agentes potencialmente genotxicos relevante conhecer os efeitos genticos e os riscos populacionais deste tipo de acidente, sobretudo para que sejam propostas ferramentas e protocolos utilizados em planejamento de contingncia, que correspondem a tticas elaboradas a partir de uma hiptese de desastre para reduzir o risco relativo das populaes (BRASIL, 2008).

1.1 O ATENDIMENTO OCORRNCIA

Em setembro de 1987, ocorreu no Brasil, na cidade de Goinia, capital do Estado de Gois, a maior ocorrncia envolvendo produtos radioativos do pas. O acidente foi causado pela ruptura de uma cpsula de csio 137, por pessoas leigas, que desconheciam a natureza do objeto e os riscos associados exposio humana a elementos radioativos. Aps as medidas emergenciais de controle e conteno do acidente e identificao dos indivduos rdio acidentados, foram consideradas expostas radiao 249 pessoas, alm de

15 toda populao da cidade ter sido afetada pelo desastre. Dos expostos, 14 indivduos tiveram contaminao interna comprovada e exibiam danos graves sade e, portanto, foram encaminhados unidade especializada de tratamento no Rio de Janeiro (BRASIL, 2004). Alm do envolvimento da populao de uma forma geral, os trabalhadores de defesa civil1 foram acionados para iniciar os trabalhos de atendimento ao desastre que, em princpio, tratava-se de possvel vazamento de gs txico. Naturalmente, a preocupao principal dos trabalhadores enviados aos locais do acidente foi com o que respiravam, e no com potencial exposio de corpo inteiro radiao ionizante, situao que s seria identificada cerca de 13 dias depois da remoo do cabeote de blindagem das antigas premissas do Instituto Goiano de Radioterapia IGR (Cavalcante apud GOIS, 2002). Mesmo depois de identificada a natureza do acidente, que envolvia radiao ionizante e o risco de exposio ocupacional, os membros do Corpo de Bombeiros e da Polcia Militar permaneceram no local cumprindo suas atividades laborais. Durante a jornada de trabalho, executavam atividades de lavagem de asfalto e remoo de rejeitos, cuidavam da segurana dos locais atingidos e isolados pela equipe da Comisso Nacional e Energia Nuclear, que tambm foi envolvida no atendimento emergencial e nos cuidados inicias com a sade da populao e dos ambientes (GOIS, 2002).

No presente contexto, defesa civil deve ser compreendida como o conjunto de aes preventivas, de socorro, assistenciais e reconstrutivas destinadas a evitar ou minimizar desastres, preservar a moral da populao e restabelecer a normalidade social (BRASIL, 2008).

1

16 1.2 CLASSIFICAO DO ACIDENTE

A Codificao Brasileira de Desastres, Ameaas e Riscos (CODAR) definiu o acidente ocorrido como sendo integrante da categoria de desastres humanos de natureza tecnolgica. A categoria inclui acidentes que ocorreram em conseqncia indesejvel do desenvolvimento econmico, tecnolgico e industrial, que podem ser reduzidos em funo do incremento de medidas preventivas relacionadas, principalmente, com a segurana industrial. Os desastres desta natureza tambm esto ligados ao incremento das trocas comerciais, do trfego de cargas perigosas e com o surto de crescimento demogrfico das cidades sem um desenvolvimento compatvel e adequado da estrutura de servios essenciais (BRASIL, 2004). Desastres humanos, de natureza tecnolgica e relacionados com produtos perigosos so mais comuns durante o transporte destes produtos, nas plantas e distritos industriais, em instalaes de minerao e campos de petrleo e em parques e depsitos em conseqncia, muitas vezes, do uso ou armazenamento irresponsvel dos produtos. Ainda que sejam mais freqentes nos pases desenvolvidos, a ocorrncia dos desastres tecnolgicos costuma provocar maiores danos nos pases em desenvolvimento, em funo da maior vulnerabilidade tecnolgica, econmica e scio-cultural, uma vez que, na medida em que a sociedade melhora o seu senso de percepo de risco, desenvolve um padro de exigncia mais acentuado e o governo induzido a priorizar seus deveres com relao segurana global da populao (BRASIL, 2004).

17 A capacidade que a sociedade tem de assimilar e os recursos que tem para reagir a desastres com produtos perigosos devem ser observados e levados em considerao numa tentativa de reduzir a vulnerabilidade social aos desastres com produtos radioativos. Assim, os rgos envolvidos com atividades locais de defesa civil promoveriam a segurana contra este tipo de desastre, alm de conduzir auditorias peridicas para se determinar a viabilidade dos procedimentos e garantir a confiabilidade populao sobre qualquer empreendimento que oferea riscos ao cotidiano das pessoas e comunidades envolvidas (Castro, 2005). Mais especificamente, o acidente com o cloreto de csio137, ocorrido em 1987 em Goinia, foi classificado como um desastre relacionado com substncia e equipamentos de uso na medicina, categoria CODAR: HT.PRM/21.507, em atividade de radiodiagnstico, radioterapia ou medicina nuclear (BRASIL, 2008). Durante um acidente que envolva risco de exposio ocupacional radiao os trabalhadores da segurana pblica podem receber altas doses de radiao, principalmente quando no se conhece a natureza do material (Scott, 2005). No episdio goiano, o Governo do Estado de Gois entendeu, na Lei 14.226/2002, que o pessoal envolvido em defesa civil durante o acidente deveria ser assistido.

18

2. CONHECIMENTO ATUAL

2.1 MUTAES

Ao longo da vida do ser humano o cido desoxirribonuclico (DNA) pode, espontaneamente, sofrer mutaes, causadas por erros durante a replicao na diviso celular (Ribeiro e Marques, 2003). As mutaes ocorrem devido a uma alterao gnica ou cromossmica que pode acarretar mudana fenotpica trazendo consigo aspectos favorveis ou desfavorveis em funo do ambiente em que foram introduzidas (Westman, 2006). O estudo de mutaes pode levar a compreenso de diversos processos biolgicos e permitem ainda a compreenso destas alteraes no material herdvel das espcies como sendo a principal componente da variabilidade gentica configurando um combustvel da evoluo (Lewin, 2001). Nos organismos multicelulares as mutaes so divididas em somticas e germinativas. As somticas so as que ocorrem em clulas do corpo humano e podem afetar seu portador, entretanto no sero transmitidas prole, caracterstica fundamental na diferenciao das mutaes germinativas, que necessariamente so caracteres transmitidos gerao filial e que nem sempre apresenta sinais nos portadores (Segal et al, 2001). Mutaes cromossmicas envolvem alterao na morfofisiologia dos cromossomos. Podem afetar desde uma determinada regio at um cromossomo inteiro e traduzem-se em alteraes estruturais, englobando as translocaes, delees e inverses, ou numricas, como o caso das euploidias e aneuploidias (Watson et al, 2007). At hoje, constituem a principal

19 ferramenta de investigao gentica de biodosimetria em monitoramentos retrospectivos de acidentes que envolvem radiao ionizante (da Silva, 2000) Mutaes gnicas, como as descritas na tabela I, so alteraes nas seqncias de nucleotdeos do DNA e ocorrem devido mudana de uma ou mais bases nitrogenadas. Na espcie humana, so fundamentalmente importantes por dois motivos: primeiro, so responsveis pelas desordens herdveis e outras doenas como o cncer, que envolve alteraes nos genes e, segundo, so fontes de variaes fenotpicas relacionadas seleo natural e evoluo (Watson et al, 2007).

Tabela 1 Tipos de mutao gnica e seus mecanismos de ocorrncia. Tipo de Mutao Categoria da Mutao Substituio Insero Mecanismo Uma base trocada por outra Uma ou mais bases so inseridas alm da seqncia original Uma ou mais bases so removidas da seqncia original No ponto da mutao, o cdon substitudo por um cdon de parada A substituio de bases no acarreta em mudana do aminocido A substituio de bases acarreta em mudana do aminocido

Estrutural

Deleo

Non-sense

Funcional

Sense

Missense Fonte: Watson et al, 2007

Segundo suas origens, as mutaes podem ser espontneas, sendo a freqncia na qual elas ocorrem caracterstica para cada organismo, ou ainda induzidas, ocasionadas pela exposio do genoma aos agentes mutagnicos. A mutagenicidade de um agente qumico, fsico ou biolgico pode ser avaliada de acordo com o aumento da freqncia de mutaes induzidas em relao freqncia de mutaes em nvel basal (Westman, 2006).

20 Exemplos tpicos de exposies mutagnicas so aquelas em que o indivduo submetido a agentes qumicos, luz ultravioleta ou radiao ionizante. Esta exposio pode levar erros no DNA que ativaro os mecanismos de reparo celular e podero conduzir a clula correo destas alteraes, sobrevivncia com erros incorporados ou apoptose (Griffiths et al., 2001). A anlise de alteraes no material gentico, em especial a quantificao da freqncia de aberraes cromossmicas, microncleos, particularmente til quando existem dificuldades na interpretao retrospectiva de dados relativos exposio individual, quando o indivduo no possui um histrico dosimtrico ou mesmo nas suspeitas de exposio acidental radiao (da Silva, 2000). As informaes de biomonitoramento podem indicar a possibilidade ou suspeita da exposio a agentes genotxicos podendo at, com o uso de tcnicas apropriadas, estimarem a magnitude do evento. A dosimetria biolgica usando marcadores uma importante ferramenta na proteo radiolgica, bem como na indicao de exposio radiao (da Cruz et al., 1995).

21 2.2 REPETIES EM TANDEM2

O Genoma humano dividido dois grandes grupos. O primeiro o grupo dos genes e seqncias relacionadas, que ocupam aproximadamente a quarta parte de todo o genoma e compreendem DNA codificante e DNA no codificante. O DNA codificante so as seqncias que so traduzidas em protenas e itens constitutivos e metablicos, j os no codificantes so os ntrons, pseudogenes e seqncias no traduzidas. O segundo grupo constitudo pelo DNA extragnico, que corresponde a todo o restante do genoma e est distribudo em seqncias de cpia nica, moderada e altamente repetitiva. Entre as sequencias de aparies moderadas e altamente repetitivas esto os elementos genticos de transposio, ou transposons, o DNA espaador, os minissatlites e os microssatlites, tambm chamados STR, do ingls short tandem repeats, ou repeties curtas em tandem (Snustad e Simmons, 2008) As repeties em tandem so cpias aleatrias de seqncias de DNA, altamente variveis, distribudas ao acaso em todo genoma. Correspondem a vrias seqncias cerne de tamanhos diferentes e que se repetem em blocos (Ellegren, 2000b). Embora existam muitas seqncias em tandem constituintes de genes, a maior parte no se caracteriza como codificante. As repeties em tandem so excelentes marcadores genmicos pelo conhecimento dos j mapeados e por suas inmeras aparies (Nakamura et al, 1987). Os minissatlites e

2

Repeties em tandem so seqncias altamente variveis de nucleotdeos encontradas na maior parte dos eucariotos. Em humanos, a variabilidade destes fragmentos pode determinar o vnculo gentico, alm de possuir outras utilizaes particulares na medicina forense e legal (Nikiforov et al., 1998).

22 microssatlites (STR) so repeties menores que permitem, inclusive, diferenciar pessoas (Watson et al, 2007) num mecanismo de avaliao que aproxima o nmero de repeties de um determinado cerne de pais e filhos possibilitando o estabelecimento de vnculo gentico. Mutaes nessas regies acontecem principalmente por slippage da polimerase, um mecanismo no qual inserido ou diminudo o nmero de repeties, que registra novos valores nos filhos, muito prximos dos alelos paternos (Ellegren, 2000a). Recentemente, a freqncia de mutaes germinativas em STR tem sido usada para determinar a exposio de indivduos radiao ionizante (da Cruz et al, 2008, Dubrova, 2003b), visto que as regies de repeties em tandem tm alta sensibilidade para sofrer mutaes causadas pela exposio radiao (Jeffreys et al, 2005, Jeffreys, 1997). Num primeiro momento, a anlise de loci STR foi realizada em ratos para determinar a associao entre exposio radiao e taxas de mutao, j num estgio posterior e como mtodo consolidado, atualmente serve para, inclusive, se estabelecer o risco gentico da exposio radiao, seja ela aguda, crnica ou ocupacional. A observao de alelos de STR pode ser uma estratgia eficiente de monitoramento de mutaes radio-induzidas na linhagem germinativa dos indivduos expostos (Dubrova, 2003a). Em termos prticos, a instabilidade de microssatlites foi observada em casos de tumores de tireide ocorridos na linhagem germinativa de pessoas que trabalharam durante o acidente com a usina nuclear em Chernobyl em 1986 (Nikiforov et al, 1998). Os dados obtidos com avaliao de repeties de DNA em tandem mostraram-se muito teis no monitoramento gentico de mutaes rdio

23 induzidas em humanos. Em populaes da extinta Unio Sovitica, foram encontradas taxas particulares de mutaes nas famlias dos expostos (Furitsu et al, 2005, Dubrova, 2003b), mais tarde, foram utilizados com o mesmo xito em famlias expostas radiao ionizante do csio137 em Goinia, no Brasil (da Cruz et al, 2008).

2.3 RADIAO IONIZANTE

As radiaes ionizantes so exemplos de agentes fsicos mutagnicos que podem levar ao comprometimento dos mecanismos de reparo celular (EotHoullier, 2005) e ao desenvolvimento de diversos tipos de cncer, incluindo os tumores de tireide, pulmo, mama e os tumores hematopoiticos (Ward, 2002, Goldman, 1982). Os efeitos biolgicos da exposio radiao ionizante no dependem do istopo radioativo ao qual foi exposto o indivduo, mas da dose absorvida pelos tecidos, a quantidade recebida e a distribuio espacial da energia transferida (Svensson, 1988). So conhecidos dois tipos de efeitos principais da exposio radiao: Os efeitos determinsticos, associados morte celular, como as queimaduras por radiao e os efeitos estocsticos, associados modificao celular, dentre elas o cncer e outras desordens genticas (Flakus, 1995). A exposio radiao ionizante pode induzir a diferentes formas de instabilidade genmica, sendo estas mutaes consideradas um potencial marcador para distinguir os efeitos tardios da exposio radiao (Nikiforov et al, 1998). Num perodo embrionrio, a exposio a agentes mutagnicos

24 podem levar a uma apresentao tardia de danos a sade do indivduo. Particularmente, as mutaes em clulas germinativas podem manifestar-se apresentando doenas, deficincias e inclusive a morte (Aizawa et al, 2007). O DNA, a exemplo de algumas molculas, pode existir em pequenas quantidades nas clulas, s vezes at como cpia nica, e sua integridade depende da manuteno dos processos metablicos, da possibilidade de diviso celular e da preservao da informao gentica. J molculas como a gua, aparecem em quantidades bastante elevadas, representando at 70% da massa celular (da Silva, 2000). A Radiao Ionizante pode transferir sua energia diretamente para o DNA, de forma a modificar sua estrutura, o que caracteriza o efeito direto da radiao sobre o DNA. Em outros casos, a energia da Radiao transmitida a molculas intermedirias da clula, na maioria das vezes, para molculas de gua, causando um fenmeno de rdio-hidrlise3. Nesse caso, o dano molcula de DNA corresponde ao efeito indireto das radiaes ionizantes (Leito et al., 1994). A radiao gama de csio137 um exemplo de radiao ionizante freqentemente usada em aparelhos de radiodiagnstico. A maioria dos desastres e acidentes provocados por equipamentos de radiologia relaciona-se com erros humanos e com o descumprimento de normas de segurana nacionais e internacionais estabelecidas por instituies reguladoras do uso da radiao (BRASIL, 2004).

O fenmeno de rdio-hidrlise, neste contexto, ocorre quando a liberao da energia da + radiao quebra as molculas de gua presentes na clula, que forma produtos H e OH altamente reativos que se ligam deliberadamente molcula de DNA provocando alteraes na sua estrutura (da Silva, 2000).

3

25 2.4 OS TRABALHADORES DO ACIDENTE, OS LIQUIDATORS

O desastre na Usina Nuclear de Chernobyl, ocorrido em 1986, foi acompanhado de uma disseminao grande de radioistopos na atmosfera da regio. Em conseqncia, regies da Ucrnia, Bielorrssia e da Federao Russa foram exponencialmente contaminadas. As pessoas que moravam, freqentavam e trabalhavam nestas regies foram as mais atingidas. Estudos que compararam geneticamente as pessoas expostas a outras aparentemente no irradiadas encontraram diferena significativa de alelos mutantes induzidos pela exposio individual radiao ionizante (Livshits et al, 2001). Nikiforov e colaboradores (1998) descreveram a elevao na taxa de mutaes de DNA satlite da linhagem germinativa, observada nos filhos das pessoas que vivam nas reas prximas Usina Nuclear e dos prprios trabalhadores que ajudaram nas aes ps-desastre. Os trabalhadores envolvidos no controle e conteno do acidente de Chernobyl, chamados liquidators4, apresentaram uma maior incidncia de alteraes no DNA. No perodo que se seguiu ao acidente na Ucrnia, vrias pessoas foram expostas a diferentes doses de radiao (Fischbein et al, 1997). De acordo com a gravidade da exposio individual, as pessoas foram divididas em quatro grandes grupos e, um deles, contemplou os liquidators que, inclua os trabalhadores que, de fato, auxiliaram na limpeza do local do desastre e empenharam-se no restabelecimento dos servios do local. Estes trabalhadores tiveram uma exposio particular radiao dado que

Liquidators foi o nome dado aos trabalhadores empregados nas aes de defesa civil, segurana, limpeza, obras e infra-estrutura durante e aps o acidente radioativo que envolveu a exploso de um reator na Usina Nuclear de Chernobyl (Weinberg et al, 2001, Livshits et al, 2001).

4

26 trabalharam no isolamento, na confeco do sarcfago de concreto para o reator danificado e na limpeza da rea da usina, basicamente (Ivanov et al, 2004, Cristofaro et al, 2005). Em Goinia, em 1987, de modo semelhante Chernobyl, um grupo de trabalhadores de defesa civil atuou na assistncia populao, na descontaminao dos locais sinistrados e na escolta e guarda de rejeitos do acidente radioativo com o csio137. Os trabalhadores goianos foram reconhecidos como ocupacionalmente expostos radiao ionizante. O grupo foi constitudo, entre outros profissionais, de bombeiros e policiais militares que atuaram nas diversas atividades durante e aps a deflagrao do acidente (GOIS, 2002).

27

3. METODOLOGIA

3.1 GRUPO AMOSTRAL

Foram elaborados questionrios (Anexo 1) e procedimentos de investigao com o objetivo de avaliar retrospectivamente a exposio potencial dos trabalhadores de defesa civil radiao ionizante de csio137 durante o acidente radiolgico de Goinia. Os questionrios incluam os termos de consentimento livre e informado que foram assinados por todos os participantes do estudo (Anexo 2). A identificao dos trabalhadores candidatos realizao dos testes de biomonitoramento foi feita mediante busca ativa aos registros do Corpo de Bombeiros, da Polcia Militar do Estado de Gois e da Superintendncia Leide das Neves Ferreira (SULEIDE) feitos por ocasio do acidente. Dessa forma, foram selecionados militares que teriam trabalhado nas aes de defesa civil durante o acidente com o csio137, em 1987. Para o presente estudo, foram levantados os nomes dos 187 policiais militares e 17 bombeiros militares que constam da Lei Estadual 14.226/20025 e dos 208 policiais e 158 bombeiros militares constantes de sindicncias de suas respectivas corporaes que visam apurar os envolvidos nas aes de defesa civil durante o acidente radiolgico. Destes 570 militares, foram contatados 98

A Lei Estadual n. 14.226 de 08 de julho de 2002, publicada no Dirio Oficial do Estado n. 18.952 de 19 de julho de 2002, requisita os valores das penses especiais que especifica, dispes sobre a concesso de penses especiais s pessoas irradiadas ou contaminadas que trabalharam na descontaminao da rea acidentada com o csio137, na vigilncia do Depsito Provisrio em Abadia de Gois e no atendimento de sade s vtimas diretas do acidente e d outras providncias.

5

28 que se fizeram presentes na primeira reunio da Associao dos Militares Vtimas do Acidente do Csio 137, ocorrida em maio de 2007. Dos contatados, fizeram adeso voluntria ao estudo 22 militares, que tiveram filhos nascidos aps o acidente. Dos participantes voluntrios, 11 formaram o grupo amostral final analisado neste estudo, uma vez que no foi possvel, devido a problemas nas amostras, analisar todos os casos. Aps a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), 10 mL de sangue perifrico dos militares, de suas esposas e de pelo menos um de seus filhos biolgicos foram coletados por venipuno em tubos heparinizados. O material biolgico foi fracionado em hemcias, plasma e creme leucocitrio, armazenado entre -20C e -86C. O creme leucocitrio foi usado,

subseqentemente, para a extrao e o isolamento do DNA genmico. Os estudos foram conduzidos nos termos das Resolues 340/2004 CNS/MS e 347/2005 CNS/MS (Anexos 3 e 4). O grupo controle foi constitudo de 900 casos de estudos de vnculo gentico, para os quais foram analisadas 12 loci STR por indivduo, perfazendo um total de 21.600 alelos pesquisados (900 indivduos x 12 loci x 2 alelos por locus em indivduos diplides). Todos os controles foram avaliados entre os anos de 1998 a 2005. Os estudos de vnculo gentico entre as famlias do grupo controle foram realizados nos laboratrios da Associao de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE), de Anpolis/GO, no Laboratrio de Citogentica Humana e Gentica Molecular (LaGene) da Secretaria da Sade do Estado de Gois, em Goinia, e no Genetics Center Ltda, totalizando 800, 45 e 55 casos, respectivamente. Dos participantes foram coletados, por venipuno, 5mL de sangue heparinizado por indivduo.

29 3.2 EXTRAO E QUANTIFICAO DAS AMOSTRAS DE DNA

O DNA genmico foi purificado a partir de 350 L de creme leucocitrio utilizando-se um kit comercial de extrao de DNA (Easy DNA Purification Kit, Invitrogen, EUA), de acordo com as instrues do fabricante. A concentrao de DNA existente em cada amostra foi quantificada por anlise comparativa em gis de agarose a 1%, corados com brometo de etdio a 10ng/L e comparada com o marcador de peso molecular Low DNA Mass (Invitrogen, EUA).

3.3 REAES DE PCR

As reaes de amplificao foram realizadas para um volume final de 12,5 L de soluo contendo 100 ng de DNA, tampo da enzima livre de magnsio 10x,10 ng de soluo contendo 16 oligonucleotdeos fluorescentes marcados com os fluorforos FAN, HEX e NED (Tabela 2) e 0,5 U de Taq DNA polimerase. O termociclador DNA IQ 5 (Biorad, EUA) foi utilizado nas reaes de amplificao, sendo programado para realizar as seguintes condies de ciclagem: desnaturao inicial de 11 minutos a 95C e posteriormente de 2 minutos a 96C; 10 ciclos de 1 minuto a 94C, 1 minuto a 60C e 1minuto e 30 segundos a 70C cada; seguidos de 22 ciclos de 1 minuto a 90C, 1 minuto a 60C e 1 minuto e 30 segundos a 70C e finalmente, extenso final de 30 minutos a 60C .

30Tabela 2 Caractersticas dos 16 marcadores STR utilizados para genotipagem dos indivduos ocupacionalmente expostos radiao ionizante de csio137 em Goinia. Locus STR Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 FGA TPOX D8S1179 vWA Amelogenin2 Penta D CSF1PO D16S539 D7S820 D13S317 D5S818 Localizao Cromossmica 15q 18q21.3 21q11 - 21q21 11p15.5 3p 4q28 2p23 - 2pter 8q 12p12 - pter Xp22.1 - 22.3 e Y 21q 5q33.3 - 34 16q24 - qter 7q11.21 - 22 13q22 - q31 5q23.3 - 32 Seqncia repetitiva (5 3) AAAGA AGAA (21) TCTA Complexo (21) AATG (21) TCTA Complexo TTTC Complexo (21) AATG TCTA Complexo (21) TCTA Complexo (21) No se Aplica AAAGA AGAT GATA GATA TATC AGAT

Fonte: PowerPlex 16Bio Tutorial, GE HealthCare, 2007.

3.4 GENOTIPAGEM DOS MARCADORES

Para a leitura dos produtos de PCR foi utilizado o seqenciador automtico de DNA MEGABACE 1000 (Amersham Pharmacia Biotech, EUA). Para tanto, 2 L de cada produto de PCR foi diludo em 8 L de uma soluo contendo 7,75 L de soluo de Tween 20 a 0,1% e 0,25 L de ET-ROX GE HealthCare. Esse ltimo reagente corresponde a um padro de peso molecular usado para alinhar as diferentes corridas nos diversos capilares. Aps esse procedimento, as amostras diludas foram desnaturadas mediante aquecimento a 95C durante 5 minutos, sendo logo em seguida colocadas em gelo, para a manuteno da desnaturao das fitas duplas de DNA. Os parmetros de

31 corrida do seqenciador utilizados para injetar os fragmentos de PCR foram os 3kV / 80 segundos e 9kV / 75 minutos.

3.5 ANLISE DOS DADOS MOLECULARES

Para a anlise dos dados obtidos com a corrida eletrofortica no seqenciador automtico foi utilizado o software Fragment Profiler v1.2 (GE Healthcare, EUA). Uma vez configurados os parmetros da leitura, o programa exibia o padro de leitura e os dados obtidos para cada amostra em forma de eletroferogramas. Inicialmente, foi selecionado o procedimento para a genotipagem (Binning_AdvMicrosat_PeakPostProcessor), que torna o software aplicvel ao protocolo utilizado. Em seguida, um filtro para a definio do padro foi importado, visando estabelecer um referencial de leitura por peso molecular (PowerPlex16bio_ET550.peakfilter.xml), ou seja, definir o que o programa entenderia ser os tamanhos referncia para a leitura das concentraes colocadas como amostra. Para realizar as anlises das amostras, os picos dos fragmentos do marcador ET-ROX GE HealthCare (ET-550 Size Standard) foram selecionados e utilizados como parmetros para cada leitura. Em seguida, as amostras foram exibidas com o auxlio de

eletroferogramas, e os alelos amplificados ficaram dispostos em formas de picos. Os perfis allicos dos fragmentos analisados, contendo seus respectivos pesos moleculares, foram representados em forma de picos, que uma vez alinhados, eram comparados em cada famlia e, uma vez estabelecidos o

32 ndice de paternidade de, no mnimo 99,99%, foi investigada a presena de possveis mutaes germinativas.

Figura 1 Exemplo de como se disps no software a representao dos tamanhos dos fragmentos para a anlise de cada marcador. Neste caso, observamos os alelos paternos (6,9), os maternos (6,7) e os filiais (6,9), indicando a coincidncia entre a gerao parental e a filial.

33

Figura 2 Exemplo de como se disps no software a representao dos tamanhos dos fragmentos para a anlise de cada marcador. Neste caso,

observamos os alelos paternos (11,14), os maternos (12,13) e os filiais (10,13), indicando uma mutao de origem paterna (11 10).

34 3.6 DEFINIO DE MUTAES GERMINATIVAS

Para analisar possveis mutaes germinativas e inferir se a exposio ocupacional ao csio137 ocasionou mudanas nos tamanhos dos cernes de repetio dos loci de microssatlite, famlias compostas por pai-me e filho tiveram seus perfis allicos comparados. Uma variante em uma criana que no era observada em ambos os pais biolgicos foi considerada como uma mutao germinativa de novo. Como sugerido por Dubrova et al. 2006, o alelo considerado como o do progenitor, foi o que apresentou o tamanho, em pares de base, mais prximo ao do alelo mutante.

3.7 TAXA DE MUTAO, QUI-QUADRADO E DOUBLING DOSE

Para confrontar os dados das mutaes encontradas no grupo exposto, foi preciso calcular a taxa de mutao nos loci especficos. A taxa de mutao foi obtida com a razo entre o nmero de mutaes encontradas na gerao seguinte e o nmero total de alelos analisados na gerao parental, pois o quantitativo de mutaes nos filhos dos expostos refere-se quele nmero que no coincidiu com o ponto de partida, ou seja, o genoma parental. Para se avaliar o risco potencial da exposio ao csio137, a dose dupla foi avaliada. Esta dose definida como a quantidade de radiao necessria para se produzir um nmero significativo de mutaes, como as que ocorrem em uma gerao, resultado de mutaes espontneas. Esta dose pode ser calculada pela razo entre as taxas de mutaes espontneas e

35 induzidas em um set de loci gnicos definido, a partir de uma quantidade estimada de radiao (Sankaranarayanan e Chakraborty, 2000). Testes do qui-quadrado (BioEstat 3.0) foram realizados visando avaliar possveis diferenas estatisticamente significativas (p< 0.05), entre os grupos exposto e controle tomando-se como esperado o grupo controle e como observado o grupo exposto, relacionadas ao nmero de mutaes

germinativas, idade dos progenitores, tamanho do cerne de repetio e taxas de mutao.

36

4. RESULTADOS

Foram obtidos resultados de 07 bombeiros e 04 policiais, todos participantes de reunies da Associao dos Militares Vtimas do Acidente com o csio137. A mdia de idade dos pais, quando o acidente ocorreu era de 26 anos e a mdia de idade das mes era de 21 anos. Como grupo controle, foram utilizados 300 trios, ou seja, 900 indivduos que residiam no Estado de Gois e que realizaram exames de vnculo gentico, visando estabelecer a taxa de mutaes germinativas em 12 loci STR. No grupo exposto, dos 16 marcadores STR utilizados, 12 (75%) foram informativos, ou seja, apresentaram leituras confiveis ao eletroferograma (Tabela 3). As reaes de genotipagem dos 16 marcadores foram realizadas em duplicata e foram considerados apenas os resultados dos casos que demonstraram reprodutibilidade e clareza nos perfis allicos, aps a visualizao do marcador utilizado como padro em todas as leituras (ETROX). Desta forma, foram genotipados 528 alelos e a grande maioria das mutaes observadas nos microssatlites representou perda do cerne de repetio (Tabela 4 e Figura 2). As Tabelas 3 e 4 destacam as caractersticas dos grupos exposto, quanto aos nmeros de mutaes paternas e/ou maternas e quanto s taxas de mutao germinativa por marcador, respectivamente. As Tabelas 5 e 6 demonstram os dados do grupo controle.

37Tabela 3 Dados gerais dos eventos mutacionais de cada locus STR no grupo ocupacionalmente exposto radiao ionizante de csio137 em Goinia. Nmero de mutaes paternas 1 1 1 1 1 2 1 8 Nmero de mutaes maternas 1 1 Nmero de mutaes paternas e/ou maternas 2 2

Locus STR

D18S51 Penta E TH01 CSF1PO D13S317 D5S818 D8S1179 Amelogenin D3S1358 FGA TPOX vWA Total

Tabela 4 Caractersticas do grupo ocupacionalmente exposto radiao ionizante de csio137 em Goinia. Caso F1.033 F1.080 F3.073 F1.036 F1.080 F1.080 F1.024 F2.025 F1.025 F1.033 F2.037 Alelos maternos 12,13 7,9 11,13 13,14 12,12 10,12 13,14 13,14 20,23 21.2,21.2 8,12 Alelos do fillho 10,13 7,8 10,11 11,12 11,12 10,13 12,13 12,14 23,23 21.2,25 12,13 Alelos paternos 11,14 9,11 12,12 11,12 12,13 12,14 13,14 13,14 20,24 23,26 11,12 TPOx 0,023 FGA 0,045 D13S317 D5S818 D8S1179 0,023 0,023 0,045 Locus mutado Penta E TH01 CSF1PO Taxa de mutao 0,023 0,023 0,045

38Tabela 5 Dados gerais dos eventos mutacionais de cada locus STR no grupo controle. Nmero de Locus STR mutaes paternas D7S820 D13S317 D16S539 CSF1PO TPOx Th01 F13A01 FESPS Vwa LPL F13B HPRTB Total 2 1 2 2 7 Nmero de mutaes maternas 1 1 Nmero de mutaes maternas e/ou paternas 1 1 2 300/3600 Nmero de crianas analisadas/alel os analisados

Tabela 6 Caractersticas do grupo controle, de acordo com o locus mutado e a taxa de mutao/locus Caso A74 A143 A103 A112 A91 A161 A488 A117 A773 A655 Alelos maternos 11,13 11,12 8,12 8,10 11,14 11,11 9,14 17,18 14,16 9,10 Alelos da criana 12,13 10,12 8,11 10,11 9,13 9,10 8,13 15,18 11,14 10,11 Alelos paternos 11,11 9,12 10,12 12,12 9,11 9,10 8,12 16,17 15,16 10,10 vWA LPL 0,00007 0,00007 D13S317 0,0002 D7S820 0,0001 D16S539 0,0002 Locus mutado Taxa de mutao

O grupo exposto continha 39 indivduos, perfazendo um total de 1248 alelos analisados. Destes alelos, 936 (75%) foram informativos, apresentando clareza e reprodutibilidade. Foram encontradas 11 mutaes germinativas e uma

39 taxa de mutaes de 0,02 (Tabela 4). Os loci CSF1PO, D8S1179 e FGA apresentaram 2 mutaes cada (Tabela 3). Com exceo da amelogenina, vWA e D18S51 que no apresentaram mutaes, os demais marcadores

apresentaram apenas 1 evento mutacional (Tabela 3). Das onze mutaes observadas, 8 (73%) eram de origem paterna, 2 (18%) de origem paterna ou materna e apenas 1 (9%) foi de origem materna. Em apenas 1 das 8 mutaes de origem paterna, houve ganho no cerne de repetio, referente ao marcador FGA. As demais mutaes representaram perda no cerne de repetio, inclusive a mutao de origem materna. A idade mdia das mes e dos pais deste por ocasio do acidente foi de 21 e 26 anos e a mdia de idade na ocasio da concepo dos filhos foi de 27 e 31 anos, respectivamente. No grupo controle, 900 indivduos foram analisados, perfazendo um total de 21.600 alelos. Foram encontradas 10 mutaes germinativas e uma taxa de mutaes de 0,0007 (Tabela 6). O locus D13S317 foi o marcador com o maior nmero de mutaes apresentando 3 eventos mutacionais (Tabela 5). Nos marcadores D16S539 e D7S820 foram verificadas 2 mutaes, enquanto que nos marcadores vWA e LPL foram detectadas apenas 1 mutao (Tabela 5). Neste grupo, 7 mutaes eram de origem paterna, 1 de origem materna e 2 mutaes poderiam ter origem tanto da materna quanto paterna. Todos os resultados dos exames de vnculo gentico dos grupos exposto e controle apresentaram um ndice de paternidade de 99,99%. A idade mdia das mes e dos pais deste grupo foi de 24 e 31 anos, respectivamente. O teste do qui-quadrado demonstrou que tanto as idades paternas, quanto as idades maternas, no grupo exposto e controle, no tiveram efeito na freqncia de mutaes germinativas da prole (p=0,16 e p =0,17,

40 respectivamente). O efeito do cerne de repetio, na taxa de mutaes germinativas, em ambos os grupos, tambm foi investigado. Contudo, nenhuma evidncia do tamanho do cerne de repetio dos marcadores STR nas taxas de mutao foi observada (p=0,24). A maioria dos eventos mutacionais, em ambos os grupos exposto e controle, envolveu a perda de apenas uma unidade de repetio. Apenas no grupo controle houve 1 caso em que a criana perdeu 4 nucleotdeos. Dessa forma, a incidncia de mutaes, envolvendo ganho ou perda de unidades de repetio foi indistinguvel em ambos os grupos (10 perdas versus 1 ganho no grupo exposto; contra 7 perdas, 1 ganho e em 2 casos pode ter ocorrido perda ou ganho; 2= 3.6, g.l.=10 P= 0,96 ). Assim, pode-se concluir que houve diferenas estatisticamente significativas, quanto taxa de mutaes germinativas, em loci STR, entre os grupos estudados.

41

5. DISCUSSO

Vrios estudos tm detectado e observado os efeitos potenciais da radiao ionizante no material gentico (DNA) de filhos de sobreviventes de acidentes radioativos (da Cruz et al. 2008; Dubrova et al., 2006; Furitsu et al., 2005; Kodaira et al., 2004; Slebos et al., 2004; Kiuru et al., 2004; Weinberg et al., 2001). Alguns destes estudos utilizaram marcadores microssatlites e minissatlites visando detectar alteraes nos gametas paternos e maternos que pudessem ser transmitidos para a prole (da Cruz et al., 2008; Dubrova et al., 2006). Marcadores STR so altamente polimrficos e apresentam taxas de mutao maiores do que seqncias codificantes, uma caracterstica que os torna eficientes no rastreamento de efeitos genticos, induzidos por agentes mutagnicos (da Cruz et al., 2008; Dubrova et al., 2006). Sabe-se que a exposio radiao aumenta a freqncia de mutaes em estudos experimentais, mas os efeitos da radiao na induo de mutaes germinativas em humanos ainda permanece indefinida (da Cruz et al., 2008; Dubrova et al., 2006; Furitsu et al., 2005; Kodaira et al.,2004). Neste estudo foram encontradas 11 mutaes na prole da gerao parental exposta ocupacionalmente ao csio137, h aproximadamente vinte anos, durante o acidente radiolgico de Goinia GO. O grupo exposto foi composto por 39 indivduos e o grupo controle por 900 indivduos. De acordo com os resultados obtidos, h evidncia de que a radiao aumentou a freqncia de mutaes nos loci STR em 29 vezes (taxa de mutao nos

42 expostos/taxa de mutao nos controles, 0,02 / 0,0007), na prole dos indivduos expostos. Os resultados obtidos neste estudo so bastante semelhantes aos resultados de da Cruz et al., 2008. Naquele estudo, foram detectadas 10 mutaes na gerao parental, da qual ambos os genitores haviam sido expostos acidentalmente radiao ionizante de csio137. Quanto s mutaes encontradas no presente estudo, foi verificado que 91% eram de origem paterna, uma vez que somente os pais trabalharam nas aes de socorro, segurana e reconstruo das vtimas do acidente do csio 137. Embora outros estudos tenham relatado uma distribuio eqitativa destes valores entre pais e mes (da Cruz et al, 2008), o grupo dos bombeiros e policiais era, na poca, exclusivamente de homens que, declararam em suas entrevistas, que suas esposas no estiveram nos locais onde se guardavam os rejeitos radioativos. Ainda de acordo com da Cruz et al. 2008, como relatado anteriormente, o aumento das taxas de mutaes nos loci microssatlites, da gerao parental, exposta ao csio137, estaria relacionado a exposio radiao. Naquele estudo, foram detectadas taxas de mutao em torno de 0,02, com a utilizao de 12 loci microssatlites, neste estudo as taxas de mutao tambm apresentam este valor. Estes resultados esto dentro do esperado, uma vez que os oficiais envolvidos no socorro das vtimas tambm foram expostos ao csio137, mas no h registros das doses absorvidas por este grupo. As anlises deste estudo foram realizadas com 16 marcadores, todavia, foram selecionados os 12 marcadores STR mais especficos e de maior

43 reprodutibilidade, cujos resultados foram confiveis, e apresentaram o mesmo nmero de regies analisadas em estudos anteriores. Dado o tamanho do grupo exposto no estudo, foram obtidas taxas de mutao consideravelmente altas, quando os resultados so comparados com o grupo controle. E, considerando o nmero de trabalhadores de defesa civil envolvidos no desastre, a amostra mostra-se de tamanho significativo, pois representa cerca de 2% da quantidade total de indivduos empregados pela Defesa Civil para trabalhar na ocorrncia. Na aplicao dos questionrios foi verificado que os bombeiros e policiais militares do Estado de Gois foram empregados em diversos servios durante o atendimento ocorrncia. Os bombeiros foram empregados, prioritariamente, na lavagem das ruas e avenidas onde havia focos de material radioativo e nos lotes com rejeitos, alm da remoo de vtimas e ateno s populaes das circunvizinhanas dos focos que, expostas ou no radiao, requeressem atendimento pr-hospitalar ou remoo para algum centro especializado de sade. Os policiais militares foram, principalmente, incumbidos da segurana dos locais sinistrados bem como dos materiais e rejeitos que l estavam, da segurana dos comboios que transportavam vtimas e rejeitos e, por fim, de assegurar os depsitos provisrios e definitivos dos rejeitos radioativos, alm, claro, de conter revoltas pontuais de uma populao assustada e enfurecida pelo ocorrido. Tanto bombeiros quanto policiais declararam que nem todo pessoal que trabalhava nas zonas irradiadas, principalmente eles, dispunha de

equipamentos e vestimentas especiais para desempenhar suas funes e que, muitas foram as vezes em que suas fardas chegavam s suas casas sujas de

44 rejeitos e eram misturadas com outras roupas usadas por seus familiares, todas lavadas por suas mes e esposas. Eles relataram tambm, no terem sido assistidos do ponto de vista de sade e que no foram submetidos a nenhum tipo de dosimetria durante o acidente, para que constasse em seus registros a exposio a doses de radiao. No foi possvel precisar o nmero real de bombeiros e policiais militares potencialmente expostos radiao ionizante durante o acidente radioativo do csio137 em Goinia em 1987, pois na poca, o Corpo de Bombeiros Militar do Estado de Gois era apenas uma frao da Polcia Militar do Estado. Alm disso, ocorria um Curso de Formao de Soldados da Polcia Militar e, como era habitual, sem prvio aviso, quando havia necessidade emergencial de emprego nas ruas, os alunos eram empenhados no servio, no intuito de buscar uma melhor resposta ocorrncia e oferecer uma atuao mais eficaz, uma vez que estes alunos j tinham um determinado nvel de formao que os permitiria atuar, assistidos por seus tutores policiais, complementando a fora tarefa. Como ocorreu isso com o acidente, sabe-se que, alm dos policiais militares e bombeiros envolvidos, os alunos da turma de 1987 foram empregados, no se pode especificar, ao certo, quem, quando, onde e por quanto tempo. Embora membros de instituies militares, normalmente fechadas ideologicamente, os policiais e bombeiros que foram voluntrios para participar da pesquisa demonstraram, alm das dores e marcas psicolgicas do acidente com o csio137, uma iniciativa indita de envolvimento individual e corporativo com a pesquisa cientfica. Demonstraram envolvimento com a causa e interesse no sentido de investigar as razes para que lies fossem

45 aprendidas e ferramentas desenvolvidas para a proteo e segurana global da populao, como previsto na Poltica Nacional de Defesa Civil, cujo apelo pela pesquisa cientfica visa, entre outras razes, o esclarecimento operacional e o planejamento de contingncia. Figuram nas leis que aprovaram as penses para o pessoal que trabalhou no ocorrido 17 bombeiros e 187 policiais militares. Alm de, aproximadamente, mais 200 policiais e 150 bombeiros em sindicncias e procedimentos administrativos das respectivas corporaes solicitando

reconhecimento moral, hierrquico, meritrio e pecunirio. J sob um escopo psicolgico, os bombeiros e policiais militares, que participaram das aes emergenciais durante o acidente, relataram que se sentem demasiadamente coagidos quando se trata do assunto por trs razes fundamentais: primeiramente, o medo de perder a penso conseguida a duras custas sociais e burocrticas em aes interminveis movidas contra o Estado. Em segundo lugar, o desconforto dos familiares que se sentem expostos e tm verdadeiro pavor do preconceito que ser imposto a eles e seus familiares se forem rotulados como vtimas do acidente radioativo, numa sociedade que discrimina, quase que abertamente, esta populao. E finalmente, o sentimento de descrena na sade, na eficincia e na agilidade das instituies pblicas que deveriam ampar-los. Sob a tica do planejamento de contingncia em Defesa Civil, os dados e o conjunto da pesquisa exibiram um elevado grau de confiabilidade para a adoo de ferramentas a serem utilizadas em eventos que envolvam agentes genotxicos. Os rgos de defesa civil devem, a partir de sistemticas como

46 essa, incluir a preocupao com o rastreamento e a dosimetria em quaisquer desastres com qualquer produto perigoso. Os mecanismos de acionamento, alerta e alarme que so,

rotineiramente, inicializados em face de qualquer risco, ameaa ou desastre devem incluir as responsabilidades de biodosimetria e desenvolver, num sentido amplo, a preocupao com todas as vtimas e tambm com os envolvidos nas aes pontuais desenvolvidas pelo Sistema de Defesa Civil. No caso de um desastre de acionamento relativamente tardio, como foi o caso do csio137, deve haver uma preocupao com a informao ampla da populao sobre os riscos para que o preconceito seja diminudo e a disseminao de boatos e pnico contida. Deve haver uma acessibilidade maior e uma motivao agregada a comoo social para que quaisquer pessoas, que tiverem a mais irrisria chance de contaminao, procurem os rgos de defesa civil, e no se afastem deles no medo do diagnstico, preconceito ou tratamento. Finalmente, os resultados deste estudo demonstraram que os loci STR so marcadores potentes para o monitoramento retrospectivo da freqncia de mutaes germinativas, na prole de indivduos expostos a agentes

mutagnicos. Estes marcadores demonstraram a capacidade de se detectar mutaes induzidas, mesmo em amostras populacionais relativamente pequenas.

47

6. CONCLUSO

Pelas anlises realizadas em alguns bombeiros e policiais militares, envolvidos nas aes de segurana e socorro, durante o acidente do csio 137, em 1987, na cidade de Goinia GO, foi concludo, com a aplicao de questionrios, entrevistas e pelos resultados das taxas de mutaes germinativas em loci STR de 11 famlias, que: Existiu uma ingenuidade operacional na poca, no que tange ao emprego destes homens, dado que, segundo eles, pouqussima informao lhes era passada acerca dos riscos e que no existia um planejamento, previamente elaborado pela Defesa Civil, para atuao neste tipo de catstrofe; A exposio ocupacional dos bombeiros e policiais militares radiao ionizante do csio137 suscetibilizou a ocorrncia de mutaes no DNA, que inclusive foram comprovadas dado que, 20 anos mais tarde, na realizao da coleta de dados e material biolgico para este estudo, foi possvel encontrar, em valores relativamente considerveis, mutaes remanescentes desta exposio, numa rea do DNA j conhecida por sua eficincia em servir de marcador biolgico para exposio radiao; A taxa de mutaes germinativas em loci STR foi de 0,02; A doubling dose calculada para este grupo foi de 0,03 por gene por Gy. Outros estudos devero ser realizados com mais indivduos deste e de outros grupos, no intuito de se utilizar marcadores STR para

48 determinar a exposio radiao ionizante, dando continuidade aos estudos de biomonitoramento da populao potencialmente e acidentalmente exposta ao csio137.

49

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

AIZAWA, Kouichi et al. (2007): Responses of Embryonic Germ Cells of the Radiation-Sensitive Medaka Mutant to -irradiation. Journal of Radiation Research, vol 48. BARBER, Ruth et al. (2002): Elevated mutation rates in the germ line of first and second generation offspring of irradiated male mice. Proceedings of the national academy of sciences of United States of America, Vol 99, n 10, p. 6877 6882. BRASIL, Ministrio da Integrao Nacional, Secretaria Nacional de Defesa Civil (2004): Manual de Desastres Desastres Humanos, I Parte: De Natureza Tecnolgica. Braslia. BRASIL, Ministrio da Integrao Nacional. Secretaria Nacional de Defesa Civil (2008): Poltica Nacional de Defesa Civil. Braslia. BRENNER, David J. et al. (2003): Cancer risks attributable to low doses of ionizing radiation: Assessing what we really know. Proceedings of the national academy of sciences of United States of America, vol. 100(24), p. 13761 13766. CASTRO, Antnio Luiz Coimbra de (2005): Manual de Planejamento em Defesa Civil. Brasil. Ministrio da Integrao Nacional. Secretaria Nacional de Defesa Civil. Volume I. Braslia. CRISTOFARO, J. Di et al. (2005): ret/PTC1 and ret/PTC3 in thyroid tumors from Chernobyl liquidators: comparison with sporadic tumors from Ukrainian and French patients. Endocrine-Related Cncer, vol 12. da CRUZ, Aparecido Divino et al. (2008): Microsatellite mutations in the offspring of irradiated parents nineteen years after the Cesium-137 accident. Mutation Research. In Press. da CRUZ, Aparecido Divino, et al. (1995): Biological dosimetry of radiation exposure using cytogenetic and molecular endpoints. Centre for environmental health at the university of Victoria. da CRUZ, Aparecido Divino (1997): Monitoring the Genetic Health of Humans Accidentally Exposed to Ionizing Radiation of Cesium-137 in Goiania (Brazil). Tese (Doutorado) Department of Biology, University of Victoria. da SILVA, Cludio Carlos (2000): Avaliao Citogentica de Indivduos Expostos

Acidentalmente Radiao Ionizante de Csio-137 em Goinia (Brasil). Dissertao (Mestrado) Instituto de Cincias Biolgicas, Universidade Federal de Gois.

50DUBROVA, Yuri E e PLUMB M. A (2002): Ionizing radiation and mutation induction at mouse minisatellite loci. The story of the two generations. Mutation Research, vol. 499(2), p. 143150. DUBROVA, Yuri E et al. (2006): Minisatellite germline mutation rate in the Techa River population. Mutation Research, 602 p. 74 82. DUBROVA, Yuri E et al. (1998): Radiation-induced germline instability at minisatellite loci. International Journal of Radiation Biology, vol 74(6), p. 689 696. DUBROVA, Yuri E (2003a): Germline mutation induction at mouse and human tandem repeat DNA loci. Adv. Exp. Med. Biol. vol 518. DUBROVA, Yuri E (2003b): Monitoring of radiation-induced germline mutation in humans. Swiss Medical Weekly, vol 133. DUBROVA, Yuri E (2005): Radiation-induced mutation at tandem repeat DNA loci in the mouse germline: spectra and doubling doses. Radiation Research, vol 163. ELLEGREN, Hans (2000a): Heterogeneous mutation processes in human microsatellite DNA sequences. Nature Genetics. ELLEGREN, Hans (2000b): Microsatellite mutations in the germline: implications for evolutionary inference. Trends in Genetics, vol 16. EOT-HOULLIER, Grgory et al. (2005): Processing of a complex multiply damage DNA site by human cell extracts and purified repair proteins. Nucleic Acids Research, vol 33, n. 1 p. 260 271. FISCHBEIN, A. L. F et al. (1997): Ultramorphological Sperm Characteristics in the Risk Assessment of Health Effects after Radiation Exposure among Salvage Workers in Chernobyl. Environmental Health Perspectives, Vol 105. FLAKUS, F. N. (1995): Radiation in perspective: Improving comprehension of risks. IAEA Bulletin - Quarterly Journal of the International Atomic Energy Agency 37(2):7-11. FURITSU, Katsumi et al. (2005): Microsatellite mutation shows no increases in the children of the Chernobyl liquidators. Mutation Research, vol 581. GOIS, Corpo de Bombeiros Militar (2002): Extrato do livro da parte diria do dia 29/09/1987 do oficial de dia redigida pelo 2 Ten Elison Nunes Cavalcante. (Documentao) Goinia. GOIS, Dirio Oficial do Estado (2002): Lei 14.226 de 06 de julho de 2002. (Documentao) Goinia.

51GOLDMAN, Marvin (1982): Ionizing radiation and its risks. The western journal of medicine. GRIFFITHS, Anthony J. F. et al. (2001): Introduo gentica. Ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro. IVANOV, Victor et al. (2004): Radiation and Epidemiological Analysis for Solid Cancer Incidence Among Nuclear Workers Who Participated in Recovery Operations Following the Accident at The Chernobyl NPP. Journal of Radiation Research, Vol 45. JEFFREYS, Alec J. et al. (2005): Spontaneous and induced minisatellite instability. Electrophoresis, vol 18. JEFFREYS, Alec J. (1997): Spontaneous and induced minisatellite instability in the human genome. Clinical Science, vol 93. KIURU, A. Auvinen et al. (2003): Hereditary minisatellite mutations among the offspring of Estonian Chernobyl cleanup workers. Radiat. Res, vol 159. KODAIRA, M. et al. (2004): No evidence of radiation effect on mutation rates at hypervariable minisatellite loci in the germ cells of atomic bomb survivors. Radiat. Res, vol 162. KOSCHEYEV, Victor S. (1993): Psychological status of Chernobyl nuclear power plant operators after the nuclear disaster. Journal of Traumatic Stress. Vol. 6 p 561-68. LEITO, A.C. e GOMES, R. A. (1994): Radiobiologia e Fotobiologia Respostas celulares s leses induzidas por agentes fsicos e qumicos. Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho. Universidade Federal do Rio de Janeiro. LEWIN, Benjamin (2001): Gene VII. In. Genes so DNA. p. 03- 34. ArtMed. So Paulo SP. LIVSHITS, L. A. et al. (2001): Children of Chernobyl Cleanup Workers do not Show Elevated Rates of Mutations in Minisatellite Alleles. Radiation Research, vol 155. MIKHALEVICH, L.S et al. (2000): Radiation effects in lymphocytes of children living in a Chernobyl contaminated region of Belarus. Int. J. Radiat. Biol, vol 76. MIRANDA, Fbio Jesus et al. (2005): O acidente radioativo em Goinia: O tempo cura todos os males? . Arquivos Brasileiros de Psicologia, vol 57. MONTELONE, Beth A (1998): Mutation, Mutagens, and DNA Repair Outline. BIOL400, Human Genetics. NAKAMURA, Y et al. (1987): Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science, vol 235.

52NIKIFOROV, Yuri E et al. (1998): Prevalence of minisatellite and microsatellite instability in radiation-induced post-Chernobyl pediatric thyroid carcinomas. Oncogene, Vol 17. PINTO, Luis Felipe Ribeiro e FELZENSZWALB, Israel (2003): Gentica do cncer humano. Ulbra. Canoas RS. RIBEIRO, Lucia Regina e MARQUES, Edmundo Kanan (2003): A importncia da mutagnese ambiental na carcinognese humana. Ulbra. Canoas RS. SATOH, C. et al. (1996): Genetic analysis of children of atomic bomb survivors. Environ. Health Perspect. vol 104. SANKARANARAYANAN, S. e CHAKRABORTY, R. (2000): Ionizing radiation and genetic risks XI. The doubling dose estimates from the mid-1950s to present and the conceptual change to the use of human data on spontaneous mutation rates and mouse data on induced mutation rates for doubling dose calculations. Mutation Research, vol 453. SCOTT, Bobby R. (2005): Evaluating Residual Risks for Lethality from Deterministic Effects After Application of Medical Countermeasures Against Damage from Inhaled Radioactivity Dispersal Device Released Gamma-Emitting Radionuclides. Radiation Protection

Management, 22 n 3, p 07 26. SEGAL, Sandra L (2001): Gentica e Cncer de Mama. Revista HCPA, Vol 21. SLEBOS, Robert. et al. (2004): Mini- and microsatellite mutations in children from Chernobyl accident cleanup workers. Mutation Research, Vol 559. SNUSTAD, D. Peter e SIMMONS, Michael J. (2008): Fundamentos da Gentica. Quarta Edio. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro. SVENSSON, H. (1988): Different kinds and properties of ionizing radiation. In: Somatic and Genetic Effects of Ionizing Radiation.. Proceedings of the XVth Berzelius Symposium, pp. 9-11. WARD, Laura Sterian (2002): Entendendo o processo molecular da tumorignese. Arquivo Brasileiro de Endocrinologia e Metabolismo. Vol 46 n. 4 p. 351 360. WATSON, James D. et al. (2007): Recombinant DNA. Genes and Genomes A short Course. Third Edition. W. H. Freeman and Company, New York. WEINBERG, H. Sh et al. (2001): Very High Mutation Rate in Offspring of Chernobyl Accident Liquidators. Proc. Biol. Sci. vol 268.

53WESTMAN, Judith A. (2006): Gentica Mdica. Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro RJ. XU, X et al. (2000): The direction of microsatellite mutations is dependent upon allele length. Nat. Genet. Vol 24.

54

8. ANEXOS ANEXO 1QUESTIONRIO PARA SELEO DOS MILITARES QUE PARTICIPARAM DAS AES DE DEFESA CIVIL DURANTE O ACIDENTE DO CSIO 137 EM GOINIA, 1987 Monitoramento gentico retrospectivo de populao potencialmente exposta radiao ionizante utilizando marcadores STR

Ateno:

Este

questionrio

um

instrumento

de

pesquisa

e

esclarecimento, e ser utilizado somente para esta finalidade.

Nome _________ ________________________________________________ Idade: _____________________ Data da entrevista_____________________ Posto/Graduao:______________ RG _______________________________ Contato ( ) _________________ ( ) _________________ OBM _________

01.

Participou das aes de socorro durante o acidente radiolgico?

( ) Sim

( ) No

02.

Aproximou-se da fonte de radiao ou dos rejeitos radioativos?

( ) Sim

( ) No

03.

Foi registrado o ndice de radiao recebido?

( ) Sim

( ) No

55 04. 05. 06. Recebeu ateno mdico-hospitalar especializada? Teve filhos biolgicos aps o acidente? Seu(s) filho(s) apresentou (apresentaram) distrbio(s) de sade? 07. 08. Fuma ou fumou alguma vez na vida? Bebe ou utilizou bebida alcolica alguma vez na vida? 09. 10. 11. Usou algum medicamento por perodo prolongado? Teve algum tipo de cncer? Possua alguma doena antes do acidente radiolgico? 12. Teve filhos biolgicos antes do acidente? ( ) Sim ( ) No ( ) Sim ( ) Sim ( ) Sim ( ) No ( ) No ( ) No ( ) Sim ( ) Sim ( ) No ( ) No ( ) Sim ( ) Sim ( ) Sim ( ) No ( ) No ( ) No

13. Caso a resposta para a questo 1 tenha sido Sim responda: Por quanto tempo? _______________________________________________ Qual era a funo? _______________________________________________

14. Caso a resposta para a questo 2 tenha sido Sim responda: Como se aproximou? __________________________________________

_______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

15. Caso a resposta para a questo 3 tenha sido Sim responda: Voc possui estes registros? ( ) Sim ( ) No

56 Se no possui, sabe onde esto? ( ) Sim ( ) No Onde?_____

16. Caso a resposta para a questo 4 tenha sido Sim responda: Onde foi atendido? _______________________________________________ Foi internado? ( ) Sim ( ) No Quanto tempo? __________

Possui seus registros?

__________________________________________

17. Caso a resposta para a questo 5 tenha sido Sim responda: Quantos filhos? ( ) Um ( ) Dois ( ) Trs ( ) Trs ( ) ____________ ( ) ____________

Com quantas mulheres?( ) Um ( ) Dois A(s) me(s) (so) viva(s)?

( ) Sim

( ) No

18. Caso a resposta para a questo 6 tenha sido Sim responda: Qual distrbio(s)? _______________________________________________

19. Caso a resposta para a questo 7 tenha sido Sim responda: Voc ainda fuma? ( ) Sim ( ) No Quanto tempo? __________

A(s) me(s) do(s) filho(s) que teve depois do acidente fuma(m)? Me 1: Me 2: ( ) Sim ( ) Sim ( ) No ( ) No Quanto tempo? Quanto tempo? _______________ _______________

Fumaram?

Me 1: Me 2:

( ) Sim ( ) Sim

( ) No ( ) No

Quanto tempo? ________ Quanto tempo? ________

57

O seu(s) filho(s) nascido(s) aps o acidente fuma(m)? Filho 1: ( ) Sim Filho 2: ( ) Sim Filho 3: ( ) Sim Filho 4: ( ) Sim ( ) No ( ) No ( ) No ( ) No Quanto tempo? Quanto tempo? Quanto tempo? Quanto tempo? ___________________ ___________________ ___________________ ___________________

Fumaram?

Filho 1: Filho 2: Filho 3: Filho 4:

( ) Sim ( ) Sim ( ) Sim ( ) Sim

( ) No ( ) No ( ) No ( ) No

Quanto tempo? ________ Quanto tempo? ________ Quanto tempo? ________ Quanto tempo? ________

20. Caso a resposta para a questo 8 tenha sido Sim responda: Voc ainda utiliza? ( ) Sim ( ) No Quanto tempo? __________

A(s) me(s) do(s) filho(s) que teve depois do acidente utiliza(m)? Me 1: Me 2: ( ) Sim ( ) Sim ( ) No ( ) No Quanto tempo? __________________ Quanto tempo? __________________

J utilizaram?

Me 1:

( ) Sim

( ) No

Quanto tempo?___

Me 2:

( ) Sim

( ) No

Quanto tempo? ________

O seu(s) filho(s) nascido(s) aps o acidente utiliza (m)? Filho 1: ( ) Sim Filho 2: ( ) Sim Filho 3: ( ) Sim ( ) No ( ) No ( ) No Quanto tempo? Quanto tempo? Quanto tempo? ____________________ ____________________ ____________________

58 Filho 4: ( ) Sim ( ) No Quanto tempo? ____________________

J utilizaram?

Filho 1:

( ) Sim

( ) No

Quanto tempo?

Filho 2: Filho 3: Filho 4:

( ) Sim ( ) Sim ( ) Sim

( ) No ( ) No ( ) No

Quanto tempo? ________ Quanto tempo? ________ Quanto tempo? ________

21. Caso a resposta para a questo 9 tenha sido Sim responda: Voc ainda usa? ( ) Sim ( ) No Quanto tempo? ____________

A(s) me(s) do(s) filho(s) que teve depois do acidente usa(m)? Me 1: Me 2: ( ) Sim ( ) Sim ( ) No ( ) No Quanto tempo? __________________ Quanto tempo? __________________

J usaram? Me 1: Me 2:

( ) Sim ( ) Sim

( ) No ( ) No

Quanto tempo? Quanto tempo?

_____ _____

O seu(s) filho(s) nascido(s) aps o acidente usa (m)? Filho 1: ( ) Sim Filho 2: ( ) Sim Filho 3: ( ) Sim Filho 4: ( ) Sim ( ) No ( ) No ( ) No ( ) No Quanto tempo? Quanto tempo? Quanto tempo? Quanto tempo? _____________________ _____________________ _____________________ _____________________

J usaram? Filho 1: Filho 2: Filho 3:

( ) Sim ( ) Sim ( ) Sim

( ) No ( ) No ( ) No

Quanto tempo? ________ Quanto tempo? ________ Quanto tempo? ________

59 Filho 4: ( ) Sim ( ) No Quanto tempo? ________

22. Caso a resposta para a questo 10 tenha sido Sim responda: Voc ainda tem? ( ) Sim ( ) No Qual? __________________

A(s) me(s) do(s) filho(s) que teve depois do acidente tem(tm)? Me 1: Me 2: ( ) Sim ( ) Sim ( ) No ( ) No Qual? _________________________ Qual? _________________________

J tiveram? Me 1: Me 2:

( ) Sim ( ) Sim

( ) No ( ) No

Qual? _______________ Qual? _______________

O seu(s) filho(s) nascido(s) aps o acidente tem (tm)? Filho 1: ( ) Sim Filho 2: ( ) Sim Filho 3: ( ) Sim Filho 4: ( ) Sim ( ) No ( ) No ( ) No ( ) No Qual? Qual? Qual? Qual? _________________________ _________________________ _________________________ _________________________

J tiveram? Filho 1: Filho 2: Filho 3: Filho 4:

( ) Sim ( ) Sim ( ) Sim ( ) Sim

( ) No ( ) No ( ) No ( ) No

Qual? _______________ Qual? _______________ Qual? _______________ Qual? _______________

23. Caso a resposta para a questo 11 tenha sido Sim responda: Qual? _________________________________________________________ Por quanto tempo? _______________________________________________

60

24. Quantos anos de servio tem ou teve no Corpo de Bombeiros? _____ _______________________________________________________________

25. Em quais reas e por quanto tempo trabalhou? (Caso tenha executado servio de Polcia, especificar nos campos vagos abaixo) ( ) Combate a incndio ____________________________________________ ( ) Salvamento ( ) Mergulho ( ) Resgate ( ) Defesa Civil _______________________________________________ _______________________________________________ _______________________________________________ _______________________________________________

( ) Administrao _______________________________________________ ( ) ____________________________________________________________ ( ) ____________________________________________________________ ( ) ____________________________________________________________

26. Como classifica o seu envolvimento com o Acidente do Csio 137? ( ) Pequeno ( ) Mdio ( ) Grande ( ) Muito Grande

Por que? _______________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ ________________________________________________________

61 27. Como avalia a ateno e o servio de sade e monitoramento dado ao pessoal de segurana pblica e defesa civil durante as aes no desastre e depois que elas encerraram? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

28. Caso a resposta para a questo 5 tenha sido Sim responda: Quantos filhos? ( ) Um ( ) Dois ( ) Dois ( ) Sim ( ) Trs ( ) Trs ( ) No ( ) _______ ( ) _______

Com quantas mulheres?( ) Um A(s) me(s) (so) viva(s)?

62

ANEXO 2TERMO DE CONSENTIMENTO DOS INDIVDUOS EXAMINADOS

Monitoramento gentico retrospectivo de populao potencialmente exposta radiao ionizante utilizando marcadores STR

I.

DADOS

DE

IDENTIFICAO

DO

SUJEITO

DA

PESQUISA

OU

RESPONSVEL LEGAL

1. Nome:________________________________________________________ Documento de Identidade__________________ Org. Exp. ______________ Data de nascimento: _____/ ______/ ______ Endereo: ____________________________________________________ Bairro: ______________________ Cidade: ______________ Estado:_____ CEP: _________________ Telefone: ( ) ________________________

2. Responsvel legal _____________________________________________ Natureza (grau de parentesco, tutor, curador, etc) ____________________ Documento de identidade _______________________ Sexo: M ( ) F( )

Endereo: ____________________________________________________ Bairro: ______________________ Cidade: _____________ Estado: ______ CEP: _________________ Telefone: ( ) _________________________

63 II. DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTFICA

1. Ttulo do protocolo de pesquisa: Monitoramento gentico retrospectivo de populao potencialmente exposta radiao ionizante utilizando

marcadores STR. 2. Pesquisador responsvel: Aparecido D. da Cruz, Superintendncia Leide das Neves Ferreira. Fone: (062) 3946 1086; e-mail: acruz@ucg.br 3. Avaliao do risco da pesquisa: Os procedimentos da pesquisa oferecem risco mnimo de ocorrncia de algum dano imediato ou tardio para o paciente (apenas hematomas locais aps a coleta); 4. Durao da pesquisa: dezembro de 2006 a dezembro de 2007.

III. REGISTRO DAS EXPLICAES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU REPERESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA

Ns conduzimos um estudo para encontrar provas de contaminao com o Csio 137. Para isso solicitamos aos membros do Corpo de Bombeiros que se julgarem de alguma forma afetados com o acidente do Csio 137 em 1987, que contribuam. A sua participao na pesquisa inclui: a) responder a perguntas de um questionrio; b) doao de amostras de sangue da veia do brao (10 ml).

64 IV. ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE

GARANTIAS DO SUJEITO DA PESQUISA

Todas as informaes prestadas em questionrio e durante a entrevista sero de carter confidencial e as informaes colhidas sero utilizadas somente para fins cientficos descritos no protocolo desta pesquisa, sem qualquer identificao pessoal. Qualquer provvel benefcio do estudo para o bemestar da populao depende da exatido de suas respostas. Portanto, se o Senhor no entender alguma das questes, por favor, solicite todos os esclarecimentos que julgar necessrio sobre os procedimentos, riscos e benefcios relacionados pesquisa ou qualquer dvida. Os resultados dos estudos esclarecero apenas se existe ou no possibilidade de contaminao com o Csio - 137, sendo necessrios outros estudos para a confirmao. Os sangue que sobrar da coleta ser guardado para que outros exames e estudos sejam feitos no futuro. O Senhor tem a liberdade de no participar do estudo, saber ou no dos resultados dos exames, e retirar seu consentimento a qualquer momento deixando de participar do estudo, sem que isto traga qualquer prejuzo continuidade de sua assistncia.

Declaro que, aps convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o que me foi explicado, consinto em participar do presente Protocolo de Pesquisa em Goinia, ___/____/_____ Assinatura:_________________

65

ANEXO 3

CONSELHO NACIONAL DE SADE

RESOLUO No 340, DE 8 DE JULHO DE 2004.

O Plenrio do Conselho Nacional de Sade, em sua Centsima Quadragsima Quarta Reunio Ordinria, realizada nos dias 7 e 8 de julho de 2004, no uso de suas competncias regimentais e atribuies conferidas pela Lei no 8.080, de 19 de setembro de 1990, e pela Lei no 8.142, de 28 de dezembro de 1990, e Considerando o recente avano tcnico-cientfico e suas aplicaes na pesquisa em gentica humana, exigindo posicionamento de instituies, pesquisadores e Comits de tica em Pesquisa (CEP) em todo o Pas, demandando, portanto, regulamentao complementar Resoluo CNS No 196/96 (Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo Seres Humanos), atribuio da Comisso Nacional de tica em Pesquisa (CONEP), conforme item VIII.4 daquela Resoluo; Considerando os subsdios advindos do sistema CEPs CONEP e a experincia acumulada na anlise dos projetos de pesquisa dessa rea at o momento; e Considerando a necessidade de serem observados os riscos potenciais sade e a proteo dos direitos humanos, das liberdades

66 fundamentais e do respeito dignidade humana na coleta, processamento, uso e armazenamento de dados e materiais genticos humanos, R E S O L V E: Aprovar as seguintes Diretrizes para Anlise tica e Tramitao dos Projetos de Pesquisa da rea Temtica Especial de Gentica Humana: I - Prembulo: A presente Resoluo incorpora todas as disposies contidas na Resoluo CNS No 196/96 do Conselho Nacional de Sade, sobre Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo Seres Humanos, da qual esta parte complementar da rea temtica especfica, e incorpora tambm, no que couber, as disposies constantes das Resolues CNS Nos 251/97, 292/99, 303/2000 e 304/2000. II - Termos e Definies: II.1 - A pesquisa em gentica humana a que envolve a produo de dados genticos apresentar vrias formas: a) pesquisa de mecanismos genticos bsicos: estudos sobre localizao, estrutura, funo e expresso de genes humanos e da organizao cromossmica; b) pesquisa em gentica clnica: pesquisa que consiste no estudo descritivo de sujeitos individualmente e/ou em suas famlias, visando elucidar determinadas condies de provvel etiologia gentica, podendo envolver anlise de informaes clnicas e testes de material gentico; ou protemicos de seres humanos, podendo

67 c) pesquisa em gentica de populaes: estudos da variabilidade gentica normal ou patolgica em grupos de indivduos e da relao entre esses grupos e uma condio particular; d) pesquisas moleculares humanas: pesquisa que envolve testes moleculares associados ou no a doenas; estudos genticos ou epigenticos dos cidos nuclicos (DNA e RNA) ou de protenas visando a novos tratamentos ou preveno de desordens genticas, de outras patologias ou identificao de variabilidade molecular; e) pesquisa em terapia gnica e celular: introduo de molculas de DNA ou RNA recombinante em clulas somticas humanas in vivo (terapia gnica in vivo) ou clulas somticas humanas in vitro e posterior transferncia dessas clulas para o organismo (terapia gnica ex vivo) e pesquisas com clulas-tronco humanas com modificaes genticas; e f) pesquisa em gentica do comportamento: estudo com o objetivo de estabelecer possveis relaes entre caractersticas genticas e comportamento humano. II.2 - Todo procedimento relacionado gentica humana, cuja aceitao no esteja ainda consagrada na literatura cientfica, ser considerado pesquisa e, portanto, dever obedecer s diretrizes desta Resoluo. Incluemse procedimentos de gentica em reproduo assistida, no regulados pelo Conselho Federal de Medicina. III - Aspectos ticos:

68 A finalidade precpua das pesquisas em gentica deve estar relacionada ao acmulo do conhecimento cientfico que permita aliviar o sofrimento e melhorar a sade dos indivduos e da humanidade. III.1 - A pesquisa gentica produz uma categoria especial de dados por conter informao mdica, cientfica e pessoal e deve por isso ser avaliado o impacto do seu conhecimento sobre o indivduo, a famlia e a totalidade do grupo a que o indivduo pertena. III.2 - Devem ser previstos mecanismos de proteo dos dados visando evitar a estigmatizao e a discriminao de indivduos, famlias ou grupos. III.3 - As pesquisas envolvendo testes preditivos devero ser precedidas, antes da coleta do material, de esclarecimentos sobre o significado e o possvel uso dos resultados previstos. III.4 - Aos sujeitos de pesquisa deve ser oferecida a opo de escolher entre serem informados ou no sobre resultados de seus exames. III.5 - Os projetos de pesquisa devero ser acompanhados de proposta de aconselhamento gentico, quando for o caso. III.6 - Aos sujeitos de pesquisa cabe autorizar ou no o

armazenamento de dados e materiais coletados no mbito da pesquisa, aps informao dos procedimentos definidos na Resoluo sobre armazenamento de materiais biolgicos. III.7 - Todo indivduo pode ter acesso a seus dados genticos, assim como tem o direito de retir-los de bancos onde se encontrem armazenados, a qualquer momento.

69 III.8 Para que dados genticos individuais sejam

irreversivelmente dissociados de qualquer indivduo identificvel, deve ser apresentada justificativa para tal procedimento para avaliao pelo CEP e pela CONEP. III.9 - Nos casos de aprovao de desassociao de dados genticos pelo CEP e pela CONEP, deve haver esclarecimento ao sujeito de pesquisa sobre as vantagens e desvantagens da dissociao e Termo de Consentimento especfico para esse fim. III.10 - Deve ser observado o item V.7 da Resoluo CNS No 196/96, inclusive no que se refere a eventual registro de patentes. III.11 - Os dados genticos resultantes de pesquisa associados a um indivduo identificvel no podero ser divulgados nem ficar acessveis a terceiros, notadamente a empregadores, empresas seguradoras e instituies de ensino, e tambm no devem ser fornecidos para cruzamento com outros dados armazenados para propsitos judiciais ou outros fins, exceto quando for obtido o consentimento do sujeito da pesquisa. III.12 - Dados genticos humanos coletados em pesquisa com determinada finalidade s podero ser utilizados para outros fins se for obtido o consentimento prvio do indivduo doador ou seu representante legal e mediante a elaborao de novo protocolo de pesquisa, com aprovao do Comit de tica em Pesquisa e, se for o caso, da CONEP. Nos casos em que no for possvel a obteno do TCLE, deve ser apresentada justificativa para apreciao pelo CEP.

70 III.13 - Quando houver fluxo de dados genticos humanos entre instituies deve ser estabelecido acordo entre elas de modo a favorecer a cooperao e o acesso eqitativo aos dados. III.14 - Dados genticos humanos no devem ser armazenados por pessoa fsica, requerendo a participao de instituio idnea responsvel, que garanta proteo adequada. III.15 - Os benefcios do uso de dados genticos humanos coletados no mbito da pesquisa, incluindo os estudos de gentica de populaes, devem ser compartilhados entre a comunidade envolvida, internacional ou nacional, em seu conjunto. III.16 - As pesquisas com interveno para modificao do genoma humano s podero ser realizadas em clulas somticas. IV - Protocolo de Pesquisa: IV.1 - As pesquisas da rea de gentica humana devem ser submetidas apreciao do CEP e, quando for o caso, da CONEP como protocolos completos, de acordo com o captulo VI da Resoluo CNS No 196/96, no sendo aceitos como emenda, adendo ou subestudo de protocolo de outra rea, devendo ainda incluir: a) justificativa da pesquisa; b) como os genes/segmentos do DNA ou do RNA ou produtos gnicos em estudo se relacionam com eventual condio do sujeito da pesquisa;

71 c) explicitao clara dos exames e testes que sero realizados e indicao dos genes/segmentos do DNA ou do RNA ou de produtos gnicos que sero estudados; d) justificativa para a escolha e tamanho da amostra,

particularmente quando se tratar de populao ou grupo vulnervel e de culturas diferenciadas (grupos indgenas, por exemplo); e) formas de recrutamento dos sujeitos da pesquisa e de controles, quando for o caso; f) anlise criteriosa dos riscos e benefcios atuais e potenciais para o indivduo, o grupo e geraes futuras, quando couber; g) informaes quanto ao uso, armazenamento ou outros destinos do material biolgico; h) medidas e cuidados para assegurar a privacidade e evitar qualquer tipo ou situao de estigmatizao e discriminao do sujeito da pesquisa, da famlia e do grupo; i) explicitao de acordo preexistente quanto propriedade das informaes geradas e quanto propriedade industrial, quando couber; j) descrio do plano de aconselhamento gentico e

acompanhamento clnico, quando indicado, incluindo nomes e contatos dos profissionais responsveis, tipo de abordagens de acordo com situaes esperadas, conseqncias para os sujeitos e condutas previstas. Os

profissionais responsveis pelo aconselhamento gentico e acompanhamento clnico devero ter a formao profissional e as habilitaes exigidas pelos conselhos profissionais e sociedades de especialidade;

72 l) justificativa de envio do material biolgico e/ou dados obtidos para outras instituies, nacionais ou no exterior, com indicao clara do tipo de material e/ou dados, bem como a relao dos exames e testes a serem realizados. Esclarecer as razes pelas quais os exames ou testes no podem ser realizados no Brasil, quando for o caso; e m) em projetos cooperativos i