biotecnologia_02

7/25/2019 BIOTECNOLOGIA_02

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Curso deBiotecnologia

MDULO II

Ateno:O material deste mdulo est disponvel apenas como parmetro de estudos paraeste Programa de Educao Continuada. proibida qualquer forma de comercializao domesmo. Os crditos do contedo aqui contido so dados aos seus respectivos autoresdescritos nas Referncias Bibliografias.


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64Este material deve ser utilizado apenas como parmetro de estudo deste Programa. Os crditos deste contedo so dados aos seus respectivos autores.

MDULO II

3. A Tecnologia do DNA Recombinante

As descobertas da estrutura e da funo do DNA e da sntese proteica

foram os primeiros passos para o isolamento e, consequentemente, uma

anlise mais detalhada dos genes. Alguns motivos justificam este interesse:

I. O isolamento de um gene permite a determinao da sequncia

nucleotdica, caracterizando marcos internos do mesmo, como introns e

peptdeos sinais. Esta sequncia pode ainda ser utilizada na genmicacomparativa, que consiste em comparaes de sequncias entre organismos

filogeneticamente prximos. Assim, alm de possibilitar estudos de evoluo,

pode auxiliar tambm na descoberta da funo do gene isolado;

II. A composio de aminocidos, assim como a de nucleotdeos,

tambm auxilia na histria da genmica comparativa, deduzindo-se a funo de

determinada protena;

III. Um gene pode ser transferido de um organismo a outro,possibilitando o desenvolvimento de organismos transgnicos. Estes possuem

diversas utilizaes na biotecnologia, seja na pesquisa bsica ou mesmo em

aplicaes comerciais especializadas. Um exemplo a produo de insulina a

partir de bactrias transgnicas que contm e expressam o gene humano que

codifica esta protena.

As aplicaes a que o isolamento e caracterizao de um gene

permitem so inmeras, incluindo a produo de medicamentos e de vacinas,por exemplo. Portanto, o isolamento gnico se tornou indispensvel para a

gerao de novos bens e servios biotecnolgicos. Este mdulo trata das

metodologias envolvidas com este processo, a tecnologia do DNA

recombinante.

O aprofundamento em conhecimentos de gentica abriu a imaginao

dos pesquisadores e esta cincia se tornou uma das ferramentas mais

importantes para o desenvolvimento de tcnicas biotecnolgicas. Aliado a isto,


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o conhecimento multidisciplinar de reas como a biologia molecular e

bioqumica permitiu que a biotecnologia avanasse a aplicaes industriais. A

metodologia envolvida neste processo abarca diversas tcnicas que englobam

a manipulao do DNA visando produo de bens de interesse comercial.

Esta tecnologia do DNA recombinante, tambm conhecida como clonagem

gnica ou clonagem molecular, compreende processos de transferncia da

informao gentica (DNA) de um organismo a outro. Apesar de no haver

uma metodologia universal, os experimentos seguem um protocolo similar (Fig.

26):

I. O primeiro passo consiste em caracterizar um gene de interesse.Tendo-se um conhecimento prvio do mesmo, o segundo passo consiste em

isolar o DNA do organismo que o contm; este denominado organismo

doador;

II. O DNA de um organismo doador extrado e sofre uma clivagem

ou digesto enzimtica. Em seguida, os fragmentos gerados na digesto so

ligados a outra molcula de DNA que deve ter uma replicao autnoma, tais

como os plasmdeos bacterianos. Esta molcula atua como portadora dosfragmentos de DNA e denominada vetor de clonagem. Assim, h a formao

de um DNA hbrido, ou uma molcula de DNA recombinante. Este tambm

designado como DNA quimrico, uma analogia ao monstro grego mitolgico

Quimera;

III. O passo seguinte obteno da molcula de DNA que codifica

uma protena de interesse permitir a perpetuao do vetor recombinante at

a produo do bem de escolha. Para isso, h a necessidade de selecionar umaclula hospedeira apropriada a qual ser introduzido o vetor recombinante. A

introduo do material gentico na clula hospedeira ocorre por um processo

denominado transformao;

IV. As clulas hospedeiras so ento plaqueadas e deixadas crescer

em colnias separadas. Uma clula individual transformada com um nico

vetor recombinante ir se dividir em uma colnia com milhes de clulas, todas

portando o mesmo vetor recombinante. Portanto, esta clula individual capaz


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de se multiplicar e gerar uma populao que contm cpias idnticas do DNA

hbrido; esta populao designada clone de DNA. Neste caso, diz-se que o

hospedeiro amplificou a molcula recombinante de interesse;

V. Como o DNA foi digerido em muitos fragmentos que podem

conter insertos de DNA diferentes, necessrio selecionar o clone bacteriano

que contenha o material gentico desejado;

VI. Uma vez obtido o clone de interesse, o passo final consiste em

submet-lo a uma srie de anlises que permitam verificar se a construo

recombinante em um determinado hospedeiro capaz de expressar, tanto

quantitativa quanto qualitativamente, a protena de interesse.

Figura 26: Metodologia geral utilizada pela tecnologia do DNA recombinante.

O DNA do organismo doador e o do vetor so digeridos com enzimas

de restrio. O fragmento de interesse e o vetor linearizado so ligados e

transformados em uma clula hospedeira apropriada. Esta permite a expresso

da protena de interesse (representada pelas trs bolinhas vermelhas).

Transformao da clula hospedeira

Expresso da protena de interesse

Fonte de DNA

DNA alvo

Digesto enzimticaDigesto enzimtica

Ligao entre vetor e inserto

Vetor

Transformao da clula hospedeira

Expresso da protena de interesse

Fonte de DNA

DNA alvo

Digesto enzimticaDigesto enzimtica

Ligao entre vetor e inserto

Vetor


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A gerao de molculas recombinantes pela clonagem molecular deve

ser diferenciada daquelas obtidas por processos de crossing-over que ocorre

entre cromossomos homlogos de eucariotos. A tecnologia do DNA

recombinante consiste em procedimentos de manipulao experimental que

permitem que DNA de fontes diferentes ou heterlogas seja inserido em um

hospedeiro capaz de perpetuar o material gentico de interesse, produzindo-o

de maneira apropriada.

3.1 Isolamento de Genes

3.1.1 Extrao de DNA

Como comentado anteriormente, o passo inicial no isolamento de um

gene consiste em extrair o DNA do organismo doador. Diferentes tipos de

protocolos esto disponveis e permitem que a extrao obtenha um material

em grande quantidade e com alto grau de pureza. Aps identificar quais genes

se deseja estudar, procede-se ao isolamento do DNA genmico de eucariotosou de procariotos.

Para o vetor, o procedimento a ser adotado dependente da natureza

do mesmo. No caso de DNA plasmidial, este pode ser purificado do DNA

genmico aps a ultracentrifugao em um gradiente de densidade do cloreto

de csio contendo brometo de etdeo. Este material, alm de ser um agente

intercalante de DNA, permite que o mesmo seja visualizado aps sua

exposio luz ultravioleta. Aceita que o DNA plasmidial se torne mais densoque o genmico e, com isso, os plasmdeos formam uma banda distinta na

centrifugao e podem ser separados (Fig. 27).


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Figura 27: Isolamento de DNA plasmidial por ultracentrifugao em cloreto de csio.

Inicialmente, um clone selecionado e certificado se contm o material

de interesse, o que geralmente se faz por seleo a antibiticos. (1) O DNA

ento extrado e colocado em um gradiente de cloreto de csio e brometo de

etdeo; (2) esta mistura submetida a uma ultracentrifugao neste gradiente.

Devido ligao diferencial do brometo de etdeo nestas duas espcies de

DNA, o DNA plasmidial se torna mais denso que o cromossmico. Assim, duas

bandas distintas entre as duas espcies de DNA so formadas. Aps um furo

na poro de baixo do tubo, pode-se separar o (3) DNA cromossomal e (4)

DNA plasmidial.

O DNA plasmidial ainda pode ser extrado por uma tcnica

rotineiramente utilizada em laboratrios de biotecnologia, a lise alcalina. Este

mtodo se baseia na observao de que sob um determinado pH alcalino o

DNA genmico bacteriano se desnatura, o que no ocorre com os plasmdeos.

Este material desnaturado ento submetido a uma neutralizao que

precipita o DNA genmico, mas os plasmdeos permanecem em soluo.Procedimentos semelhantes ao utilizado no isolamento de plasmdeos

so aproveitados para outros vetores, como cosmdeos. No caso de fagos,

recupera-se uma suspenso pura dos mesmos e o DNA obtido aps a lise

das partculas virais. Aps a extrao e purificao do DNA genmico e do

vetor, o fragmento de DNA contendo o gene de interesse precisa ser isolado e

ligado a um vetor de clonagem, proporcionando a perpetuao do DNA hbrido.

O primeiro impasse a este procedimento o isolamento do fragmento.

DNA

cromossmico

plasmdeo

21 3

4

DNA

cromossmico

plasmdeo

21 3

4


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Inicialmente, o DNA cromossmico era submetido a um processo de

quebras mecnicas aleatrias, o que pode ser obtido por sucessivas

passagens do material por uma seringa ou mesmo por sonicao. Contudo,

este procedimento gera desde fragmentos grandes, como 5 Kb, at mesmo

fragmentos muito pequenos. Aliado a isto, esta fragmentao aleatria, o que

aumenta a probabilidade de que a sequncia de interesse seja fragmentada e

somente pores desta sejam clonadas. Assim, para o isolamento de uma

determinada sequncia, vrios clones devem ser analisados.

A fragmentao aleatria de sequncias de DNA ainda interfere na

eficincia da clonagem. As extremidades geradas no so complementares, oque dificulta a ligao do inserto ao seu vetor de clonagem. A eficincia da

clonagem ainda afetada pelo tamanho dos fragmentos. Fragmentos menores,

de baixo peso molecular, so mais fceis de lig-los ao vetor. Contudo, eles

so facilmente perdidos ou no recuperados. Por outro lado, a clonagem de

fragmentos de alto peso molecular um procedimento mais complicado e de

baixa eficincia.

Uma grande conquista que permitiu o salto da tecnologia do DNArecombinante foi a descoberta de enzimas que clivam o DNA aps o

reconhecimento de sequncias especficas. As enzimas responsveis por esta

digesto enzimtica so as enzimas de restrio.

3.1.2 Enzimas de Restrio

As enzimas de restrio so endonucleases responsveis pela quebraenzimtica da ligao fosfodister do DNA. O termo restrio foi adotado

devido histria da descoberta destas enzimas. Durante o estudo da infeco

de E. coli por bacterifagos observou-se que somente algumas bactrias eram

infectadas por estes vrus e, por isso, os pesquisadores relatavam que a

infeco ficava restrita. Estudos posteriores demonstraram que aps a

penetrao do DNA do fago na bactria, certas enzimas de E. coli eram

capazes de reconhec-lo e cliv-lo. Estas enzimas foram denominadas


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genericamente como enzimas de restrio.

A nomenclatura das enzimas de restrio feita pelas iniciais do

organismo a partir do qual ela foi isolada, incluindo a identificao da linhagem,

e por algarismos romanos que indicam a ordem na qual foi encontrada na

cepa. Assim, por exemplo, a EcoRI, uma enzima extremamente utilizada em

procedimentos de biologia molecular, significa que esta foi a primeira enzima

isolada de Escherichia coli, linhagem R. A primeira letra em maisculo

representa o gnero e as primeiras duas letras da espcie so escritas em

minsculo. Os nmeros em algarismos romanos so utilizados para designar a

ordem de caracterizao de diferentes enzimas de restrio isoladas domesmo organismo. Muitas enzimas de restrio j foram isoladas e seus stios

de restrio identificados (Tabela 1).

Enzima Stio de restrio Tipo de extremidade

EcoRI G A-A-T-T-C

C-T-T-A-A G

Extenso 5 fosfato

BamHI G G-A-T-C-C

C-C-T-A-G G

Extenso 5 fosfato

PstI C-T-G-C-A G

G A-C-G-T-C

Extenso 3 fosfato

PvuII C-A-G C-T-G

G-T-C G-A-C

Extremidade cega

HpaI G-T-T A-A-C

C-A-A T-T-G

Extremidade cega

HaeIII G-G C-C

C-C G-G

Extremidade cega

NotI G C-G-G-C-C-

G-C

C-G-C-C-G-G-

C G

Extenso 5 fosfato

Tabela 1: Stios de restrio reconhecidos por diferentes enzimas de restrio e o tipo

de extremidade que elas geram (Tabela modificada de Glick & Paternak, 1994).


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fragmentos em gel de agarose (Fig. 28).

Figura 28: Mapa de restrio.

(A) anlise eletrofortica representando o peso molecular da amostra

de DNA obtida aps a digesto enzimtica com as enzimas EcoRI e BamHI

separadamente e com as duas enzimas juntas. (B) mapa de restrio gerado

aps a digesto enzimtica e separao por eletroforese. (Figura modificada deGlick & Paternak, 1994).

Outras aplicaes das enzimas de restrio do tipo II so decorrentes

da caracterstica que a clivagem gera nas extremidades. A posio em que

ocorre a clivagem do DNA pode gerar dois tipos de extremidades: abruptas (ou

cegas), quando a clivagem ocorre no centro de simetria, ou coesivas (pontas

adesivas), quando a clivagem ocorre fora do centro de simetria (Fig. 29). Neste

ltimo caso, pode-se gerar uma extremidade saliente 5'ou 3' (Tabela 1).

850

600

100

500

300

600

300

250

100

950

400

Digesto

EcoRI

Digesto

BamHI

Digesto

EcoRI + BamHI

A

850

600

100

500

300

600

300

250

100

950

400

Digesto

EcoRI

Digesto

BamHI

Digesto

EcoRI + BamHI

A

500

400100

300

600

950100

300 250

600

850

EcoRI EcoRI

BamHI BamHI

B

500

400100

300

600

950100

300 250

600

850500

400100

300

600

950100

300 250

600

850

EcoRI EcoRI

BamHI BamHI

B


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Figura 29: Extremidades cegas e coesivas geradas aps a digesto com enzimas de

restrio.

Enzimas de restrio que clivem o DNA gerando desde extremidadescegas ou mesmo coesivas podem ser utilizadas com sucesso na clonagem

molecular. Contudo, a ligao do inserto ao seu vetor facilitada quando

ambos sofrem uma digesto enzimtica que geram par de pontas adesivas

unifilamentares idnticas. Estas pontas so chamadas de adesivas porque

permitem que haja um pareamento com sequncias complementares que

sero unidas (grudadas) por pontes de hidrognio.

As enzimas de restrio que geram fragmentos de extremidades

coesivas so extremamente interessantes quando se deseja a insero de uma

sequncia codificadora em especfico. Isto se deve ao fato de que somente

filamentos complementares sejam capazes de se ligar. Assim, uma digesto

dupla com duas enzimas diferentes permite que a clonagem seja direcional; ou

seja, que a sequncia codificadora se ligue a um stio de distncia ideal ao seu

promotor e na correta fase de leitura para a protena.

Analisando a ao das enzimas de restrio, pode-se afirmar que as

CCGGGA TCCTAAG

GGCCCT AGGATTC

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

CCGG GATCCTAAG

GGCCCTAG GATTC

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

Digesto com

enzima de

restrio

Digesto com

enzima de

restrio

Extremidades coesivas Extremidades cegas

CCGGGA TCCTAAG

GGCCCT AGGATTC

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

CCGG GATCCTAAG

GGCCCTAG GATTC

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

Digesto com

enzima de

restrio

Digesto com

enzima de

restrio

Extremidades coesivas Extremidades cegas


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mesmas tm pelo menos duas propriedades teis clonagem molecular:

primeiramente, os fragmentos de restrio apresentam um peso molecular

adequado para a clonagem. Segundo muitas enzimas de restrio clivam o

DNA de forma a gerar extremidades coesivas, facilitando a ligao de fontes

diferentes de DNA que possuam extremidades complementares. Esta ligao

ainda ocorre de forma que a sequncia codificadora ocorra de maneira

direcional, ou seja, na fase correta de leitura.

O uso unicamente de enzimas de restrio, entretanto, insuficiente

para finalizar o procedimento de clonagem molecular. As extremidades geradas

pela clivagem enzimtica podem se alinhar, mas a fora das pontes dehidrognio envolvidas na complementaridade de bases no suficiente para

manter as molculas de DNA referentes ao inserto e ao vetor juntas. H a

necessidade de refazer a ligao internucleotdica entre o grupo hidroxila 3' e o

grupo fosfato 5' das extremidades onde a quebra das molculas de DNA foi

gerada. A anlise da replicao do DNA forneceu uma alternativa enzimtica.

Este problema resolvido aps o passo da ligao enzimtica.

3.1.3 Ligao Enzimtica

Recapitulando, o DNA de um organismo doador sofre uma digesto

enzimtica a fim de produzir fragmentos com peso molecular adequados para a

clonagem molecular. Para que este procedimento seja facilitado, rotineiramente

se adota como estratgia a digesto, tanto do inserto como do vetor, com a

mesma enzima de restrio. De preferncia, se utiliza enzimas que produzamstios de restrio com extremidades coesivas para facilitar a ligao. Embora

os filamentos complementares permitam que as molculas se liguem por

complementaridade de bases, as sequncias acar fosfato ainda no esto

completas nas duas posies de cada juno (Fig. 30). Para selar esta ligao,

so utilizadas enzimas como a ligase.


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Figura 30: Ligao entre extremidades coesivas pela ao da Ligase.

Aps a digesto enzimtica, so geradas extremidades coesivas.

Molculas digeridas com a mesma enzima iro se unir pela complementaridade

de bases. A especificidade entre o pareamento de bases permite a formao

de pontes de hidrognio. Contudo, a unio entre molculas de DNA finalizada

pela formao de uma ligao fosfodister entre as duas fitas de DNA por ao

da enzima ligase.

As ligases so capazes de catalisar a formao de pontes fosfodister

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

Digesto comenzima de

restrio

CCGG GATCCTAAG

GGCCCTAG GATTC

OH

P

P

OH

Anelamento

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

OH P

P OH

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

Ligao

Ligase T4

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC


restrio

CCGG GATCCTAAG

GGCCCTAG GATTC

OH

P

P

OH

Anelamento

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

OH P

P OH

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC


restrio

CCGG GATCCTAAG

GGCCCTAG GATTC

OH

P

P

OH

CCGG GATCCTAAG

GGCCCTAG GATTC

OH

P

P

OH

Anelamento

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

OH P

P OH

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

Ligao

Ligase T4

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

CCGGGATCCTAAG

GGCCCTAGGATTC

Ligao

Ligase T4


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ao final das fitas de DNA que estejam mantidas juntas pela complementaridade

de bases ou mesmo quando as extremidades cegas estejam em contato ao se

ligarem enzima. A enzima responsvel por este processo a DNA ligase e

em procedimentos biotecnolgicos frequentemente se utiliza a isolada do

bacterifago T4.

Conhecendo as tcnicas e os procedimentos genricos para a

tecnologia do DNA recombinante, os prximos tpicos trataro de

procedimentos mais especficos, como os procedimentos para o isolamento de

genes. Contudo, inicialmente preciso ter clara a diferena de estrutura entre

um gene eucarioto e um procarioto.

3.1.4. Diferena Estrutural entre Genes Eucariotos e Procariotos

Para a obteno do inserto, inicialmente deve-se considerar se o gene

de interesse pertence a um organismo procarioto ou a um eucarioto. Esta

diferenciao deve-se s caractersticas estruturais dos genes destes dois

organismos. Em procariotos, a sequncia codificadora de uma protenafrequentemente representa uma minscula parcela do DNA cromossomal

(


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A obteno de um determinado gene depende dos objetivos da

clonagem, das caractersticas do gene e, enfim, do conhecimento prvio que se

tem a respeito do mesmo. Se no h um conhecimento prvio da sequncia,

uma das alternativas para o isolamento do inserto consiste em subdividir o

DNA cromossomal em pequenos fragmentos que sero ento clonados em

vetores. Em seguida, os vetores recombinantes so transformados em um

hospedeiro e ento analisados e caracterizados. Teoricamente, este

procedimento capaz de obter clones que representam todo o DNA genmico

do organismo a ser estudado. Este o princpio da criao de uma biblioteca

genmica ou banco gnico, elemento bsico do processo inicial dosequenciamento de genomas.

Uma das maneiras de criar uma biblioteca genmica tratando o DNA

com uma endonuclease de restrio cujo stio de restrio reconhea quatro

pares de bases. Assim, teoricamente o DNA ser clivado aproximadamente a

cada 256 pb. Entretanto, como as enzimas de restrio reconhecem stios

especficos, pode ocorrer que os fragmentos gerados sejam muito grandes, o

que dificulta a clonagem. Se nem todos os fragmentos referentes ao genomatotal so clonados, ento a biblioteca disponvel para a seleo est incompleta

e, assim, o fragmento de interesse pode estar interrompido ou mesmo ausente,

dificultando a seleo de um determinado gene.

Para solucionar este problema, o DNA cromossomal ento submetido

a uma digesto parcial. Assim, geram-se fragmentos de diferentes tamanhos,

permitindo que todos os fragmentos estejam representados aps a clonagem

em um determinado vetor (Fig. 31).


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de RNA, como RNAr e RNAt. Isto possvel, pois somente o RNAm possui a

cauda de poliA em sua estrutura. Para a sua purificao, o material derivado da

extrao de RNA passado por uma coluna seletiva, na qual esto ligadas

pequenas cadeias curtas de resduos de timina de aproximadamente 15

nucleotdeos. Ento, o RNAm se liga coluna devido ao pareamento de bases

entra a cauda poliA e os resduos de timina.

Por outro lado, os RNAt e os RNAr passam com o fluxo e no so

retidos na coluna, pois no h um pareamento de bases que permita a ligao.

Finalmente, o RNAm eludo da coluna aps um tratamento com um tampo

capaz de interromper as pontes de hidrognio formadas entre adenina e timina,liberando a molcula de RNAm.

Antes que as molculas de RNAm possam ser clonadas em um

determinado vetor, elas precisam ser convertidas em uma molcula de DNA

dupla fita. O sucesso deste experimento depende da ao sucessiva de duas

enzimas diferentes: a transcriptase reversa e do fragmento de Klenow da

DNAP I. Inicialmente, so adicionadas pequenas molculas de

oligonucleotdeos compostos somente por timinas ao material de RNAm eludoda coluna seletiva.

Adicionalmente, juntada a enzima transcriptase reversa e os quatro

desoxirribonucleotdeos (dATP, dTTP, dGTP e dCTP). Neste procedimento, os

pequenos oligonucleotdeos de timina se pareiam a regio da cauda poliA,

providenciando uma extremidade 3 hidroxila para que a sntese de uma fita de

DNA complementar seja iniciada.

A transcriptase reversa utiliza como molde uma fita simples de RNApara polimerizar uma cadeia de DNA. Assim, os oligonucleotdeos referentes

composio estrutural do DNA vo sendo incorporados cadeia que est

sendo polimerizada pela transcriptase reversa, baseando-se na

complementaridade de bases. Entretanto, a sntese in vitro realizada por esta

enzima frequentemente um procedimento incompleto e somente uma fita

simples de DNA produzida. Contudo, antes que a sntese desta fita simples

de DNA seja finalizada, h a formao de um looping, ou uma volta, na


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poro 5, onde a fita de DNA se dobra sobre si mesma. Esta sequncia pode

ento ser utilizada como um primer para a polimerizao da fita dupla de

DNA.

A segunda fita de DNA sintetizada aps a adio do fragmento de

Klenow. Esta enzima adiciona nucleotdeos complementares aos especificados

pela fita simples sintetizada pela transcriptase reversa, concluindo ento a

cadeia dupla de DNA. Para isto, o fragmento utiliza como iniciador a volta

formada pela dobra na poro 5do cDNA.

Para finalizar o processo de gerao de uma fita dupla de DNA a partir

de RNAm, a amostra tratada com a enzima RNase H que tem por finalidadedegradar molculas de RNAm molde. Finalmente, a volta de DNA formado na

extremidade 5 do cDNA desfeita pela ao da nuclease S1, que tem como

princpio geral degradar extenses de DNA fita simples. Ao final de todo o

procedimento, tem-se uma amostra que apresenta uma mistura composta de

cDNA de dupla fita correspondente aos RNAm que sejam os mais

representativos na amostra inicial. Este material ser clonado em um vetor

apropriado. Um esquema geral do procedimento envolvido na gerao decDNA est descrito na Fig. 32.

Figura 32: Sntese de cDNA.

RNAm

Oligo (dT)

Transcriptase reversa e

polimerizao de cDNA

Fragmento de

Klenow

RNAm

cDNA

cDNA

DNA dupla fita

RNase HDegrada fita de RNA

Nuclease S1

RNAm

Oligo (dT)

Transcriptase reversa e

polimerizao de cDNA

Fragmento de

Klenow

RNAm

cDNA

cDNA

DNA dupla fita

RNase HDegrada fita de RNA

Nuclease S1


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Um iniciador composto de nucleotdeos de timina adicionado

amostra contendo os RNAm purificados. A transcriptase reversa e os quatro

nucleotdeos constituintes da molcula de DNA so adicionados ao RNAm. A

fita simples de DNA complementar ao RNAm cDNA polimerizada, sendo

que na poro 3 do cDNA h a formao de uma volta sobre esta molcula fita

simples de DNA, que servir como iniciador para a fita complementar ao cDNA

para a de DNA fita dupla. O looping que serviu de iniciador rompido pela

ao da nuclease S1. As fitas de RNAm so degradadas pela ao da

RNaseH.

A escolha entre as abordagens de construo de uma bibliotecagenmica ou de uma biblioteca de cDNA depende do experimento em questo

e das perguntas que se deseja responder. Se a pesquisa tem por finalidade o

sequenciamento de um genoma, a biblioteca necessita obter clones que

representem todo o material gentico daquele organismo. Somente assim a

sequncia pode ser finalizada e anotada. A procura de um determinado gene

em especfico e a anlise de como ele se encontra estruturado no genoma,

como em um operon, alm das anlises de sequncias reguladoras, requeremque uma determinada sequncia grande esteja contida em um determinado

clone. Nestes casos, a melhor opo se faz pela construo de uma biblioteca

genmica.

H casos em que a inteno de realizar um experimento a anlise de

um determinado produto proteico. Um exemplo o exame de expresso de um

gene especfico e peculiar a um determinado tipo de tecido ou mesmo que se

suspeita estar envolvido com o desenvolvimento de uma determinadapatologia. O conhecimento de qual tecido o gene est sendo expresso facilita a

seleo deste gene de interesse, j que o mesmo deve estar enriquecido de

seus transcritos. Portanto, este tecido utilizado como fonte de extrao de

RNAm.

Outro aspecto se a finalidade em isolar um gene para que o mesmo

seja expresso em um hospedeiro diferente para fins comercias. Nestes casos,

a biblioteca de cDNA uma opo. Isto vantajoso principalmente quando se


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deseja expressar genes de eucariotos em clulas bacterianas. Como o cDNA

uma cpia complementar ao RNAm maduro, que j sofreu processamentos,

ento este cDNA no ir conter introns em sua sequncia. Como as clulas

bacterianas no so capazes de remover os introns e unir somente os exons, a

biblioteca de cDNA mais til nestes casos. Contudo, deve-se lembrar que o

cDNA no apresenta as regies reguladoras que constituem um gene. Assim,

neste ltimo caso, a biblioteca genmica mais til.

Em casos em que um determinado gene a ser estudado quanto a sua

estrutura e composio, o que no possvel simplesmente pela anlise de

cDNA, pode-se restringir a frao genmica usada na construo da bibliotecagenmica. Levando em considerao que determinados genomas so

extremamente grandes e at mesmo composto por um conjunto de

cromossomos, a restrio se faz possvel se o pesquisador conhecer

previamente em qual cromossomo o gene est localizado.

Uma das tcnicas utilizadas neste processo baseia-se na seleo de

cromossomos com o uso de um instrumento denominado citmetro de fluxo.

Uma suspenso de cromossomos separada por este aparelho de acordo como peso molecular e a frao contendo o gene de interesse utilizada na

construo da biblioteca genmica.

Outra tcnica possvel fracionar cromossomos inteiros pela tcnica

de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A eletroforese uma tcnica

que separa fragmentos de cido nucleico ou protenas em gis de acordo com

o tamanho quando expostos a um campo eltrico. A PFGE ou pulse field

uma eletroforese mais especializada que permite a separao de molculasmuito longas de DNA.

A tcnica consiste em imprimir vrios campos eltricos oscilantes

orientados em vrias direes diferentes. Esta estratgia permite at mesmo

que determinadas molculas cromossomais inteiras passem no gel para

posies diferentes de acordo com o tamanho de cada uma (Fig. 33). O

cromossomo desejado ento separado do gel, eludo e finalmente utilizado

na construo da biblioteca genmica.


21/55


Figura 33: Metodologia do PGFE.

O gel de agarose com as amostras de DNA so corridas em um

aparelho hexagonal que permite que o campo eltrico seja alternado a 120 a

cada 90 segundos por 18 a 24 horas a 14C. As molculas de DNA migram

paralelamente ao campo eltrico. Os fragmentos de peso molecular maior

levam mais tempo para migrarem no gel em relao s de peso molecular

menor. Isto permite que bandas distintas sejam visualizadas em um gel de

agarose. S1, S2 e S3 so amostras diferentes; Mkr: marcador de pesomolecular.

A construo de bibliotecas utilizada quando no h um

conhecimento prvio a respeito da sequncia de nucleotdeos que constituem

um gene. Em casos de organismos em que o genoma j foi sequenciado, o

isolamento de sequncias especficas extremamente facilitado, sendo que a

produo pode ser sinttica ou mesmo por tcnicas de biologia molecular,

como o PCR.

Aparelho de PFGE

Resoluo dos f ragmentos de DNA

Visualizao em gel de agarose corado com brometo de etdeo

Aparelho de PFGE

Resoluo dos f ragmentos de DNA

Visualizao em gel de agarose corado com brometo de etdeo


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3.1.5.2 Produo Sinttica de Genes

A produo qumica de um gene ou mesmo de seus fragmentos ocorre

pela sntese de cada fita complementar separadamente. Fragmentos curtos,

entre 60 a 80 pb, podem ser produzidos por fitas complementares

separadamente que depois so aneladas entre si. Contudo, para a produo

de fragmentos maiores, como acima de 300 pb, tcnicas mais apuradas devem

ser utilizadas. Isto se deve ao fato da eficincia de ciclos envolvidos durante a

sntese qumica no apresentarem uma eficincia de 100%.Um dos mtodos para a sntese de fragmentos maiores consiste na

sntese inicial de oligonucleotdeos complementares e sobrepostos, compostos

de 20 a 60 nucleotdeos. O planejamento para a sntese de cada fita ocorre de

maneira que aps o anelamento, os dois fragmentos de um gene sejam

alinhados de forma que suas extremidades se mostrem cegas, sem fitas

complementares. Cada fita sintetizada apresenta seu segmento complementar

e as extremidades 5 e 3 so tambm projetadas para que apresentem umacomplementaridade, o que permite a montagem dos fragmentos de acordo com

a sequncia do gene (Fig. 34).

Aps o anelamento entre os fragmentos, o ltimo passo para concluir a

sntese qumica de um gene selar os fragmentos entre as extremidades 5 e

3 das fitas adjacentes. Isto possvel pela ao da T4 DNA ligase.


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Figura 34: Sntese de uma sequncia codificadora a partir do anelamento entre

oligonucleotdeos.

Estes so fabricados de forma que o anelamento entre as fitas

complementares permita que uma fita dupla de DNA completa seja formada.

Para selar a cadeia, as ligaes fosfodister so ligadas por ao da enzima

T4 ligase. (Figura modificada de Glick & Paternak, 1994). Uma modificao

deste mtodo foi criada como alternativa para a produo qumica de genes.

Inicialmente, so sintetizados oligonucleotdeos complementares e sobrepostos

por aproximadamente 40 a 100 nucleotdeos.

Aps o anelamento entre as fitas complementares, permanecem

grandes regies de sequncias que no anelaram a outra sequncia

complementar, ou seja, compostas somente por fita simples (Fig. 35). Apesar

disso, as fitas se mantm unidas, o que se deve regio de nucleotdeos

sobrepostos. Estes buracos constitudos por fita simples so ento

completados pela ao de polimerizao da DNAP I de E. coli. Aps a

finalizao deste processo, as fitas so seladas pela ao da enzima T4 DNA

P O H1

P O H2

P O H3

P O H4

P O H5

P O H6

O H 2P

PO H1 P 3 O H P 5 O H

O H4

P O H6

P

P

O H

O H

P

Sntese de f i tas individuais

Anelamento

Ligao

P O H1

P O H2

P O H3

P O H4

P O H5

P O H6

P O H1

P O H1

P O H2

P O H2

P O H3

P O H3

P O H4

P O H4

P O H5

P O H5

P O H6

P O H6

O H 2P

PO H1 P 3 O H P 5 O H

O H4

P O H6

PO H 2

PP

PO HO H1 P 3P 3 O HO H P 5P 5 O HO H

O H4

PO H4

PP O H6

PO H6

PP

P

O H

O H

P

P

O H

O H

P

Sntese de f i tas individuais

Anelamento

Ligao


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tamanho do fragmento a ser amplificado deve ser condizente com a

capacidade de polimerizao de cada enzima polimerase especfica a ser

utilizada no processo;

III. A enzima responsvel pela polimerizao das cpias referente

sequncia especfica, genericamente conhecida como Taq DNA polimerase,

deve ser capaz de resistir a altas temperaturas, como 95C ou mais;

IV. Para que a reao de polimerizao ocorra, devem ser

adicionados mistura contendo DNA, enzima e tampo, os quatros

oligonucleotdeos (dNTPs, dATP, dTTP, dCTP, dGTP).

A metodologia adotada para a amplificao de fragmentos de DNA muito similar ao processo de transcrio, sendo que uma das diferenas que

ao final da PCR so obtidas molculas de DNA fita dupla ao invs de

molculas de RNA fita simples. A metodologia da PCR consiste em vrios

ciclos sucessivos, sendo que cada um tm pelo menos trs passos bsicos:

I. Desnaturao: o primeiro passo consiste na desnaturao do DNA

pelo aumento de temperatura, geralmente obtido a 95C. Esta temperatura

mantida por aproximadamente um minuto;II. Anelamento: neste passo, realizado a aproximadamente 55C, o par

de iniciadores se anela sequncia complementar de DNA da amostra;

III. Polimerizao: este passo realizado com uma temperatura mdia

de 72C, que tima para a funo cataltica da Taq DNA polimerase. A

sntese se inicia na poro hidroxila 3 de cada iniciador.

IV. A durao de cada um dos passos e a temperatura utilizada nos

mesmos variam enormemente e, por isso, cada protocolo precisa serpadronizado para a sua utilizao. A reao de amplificao ocorre em um

aparelho automatizado e programvel, o termociclador.

Para entender como se sucede a amplificao dos fragmentos de DNA,

deve-se ter em mente a localizao de cada iniciador durante o anelamento.

No primeiro ciclo, os iniciadores se ligam em direes opostas a cada uma das

molculas geradas pela desnaturao do DNA. Nos ciclos iniciais, a

amplificao vai alm da sequncia complementar ao outro iniciador (Fig. 36),


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gerando fitas mais longas. No segundo ciclo, isto tambm acontece; porm, h

a amplificao de fragmentos mais curtos, que tm a sequncia de um iniciador

na extremidade de uma fita e o outro, na outra extremidade da fita

complementar. Em ciclos subsequentes, os fragmentos de amplificao mais

curtos vo se acumulando e, ao final de 30 ciclos, elas predominaro.

Figura 36: Reao de PCR.

Durante os estgios iniciais de amplificao so geradas fitas de DNA

mais longas. Em ciclos subsequentes, o material amplificado consistir de uma

fita de DNA composta pelos iniciadores em suas extremidades. Estes

amplicons mais curtos predominaro ao final de 30 ciclos de amplificao. Uma

das aplicaes da PCR na tecnologia do DNA recombinante o isolamento de

um gene especfico, que ser produzido em grande quantidade e este pode ser

clonado em um vetor apropriado.

Para a clonagem, deve-se considerar que a Taq DNA polimerase tm

uma atividade enzimtica incomum, adicionando um nucleotdeo de adenina ao

final 3 de cada fita. Isto ideal para a clonagem em vetores do tipo que

apresentam um acrscimo de timina na poro 5 de cada fita. Apesar de esta

caracterstica dificultar a clonagem de fragmentos que possuem extremidades

DNA fita

dupladesnaturao Anelamento Extenso

Iniciador 1Iniciador 2

Primeiro

ciclo

Segundo

ciclo

Terceiro

ciclo

DNA fita

dupladesnaturao Anelamento Extenso

Iniciador 1Iniciador 2

Primeiro

ciclo

Segundo

ciclo

Terceiro

ciclo


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cegas, este fato nem sempre verdadeiro. H diferentes tipos de Taq DNA

polimerases especializadas em distintas funes e nem todas possuem a

caracterstica de acrescentar adeninas extremidade 3 das fitas de DNA.

A clonagem de insertos gerados por PCR facilitada quando tanto o

vetor como os insertos so digeridos com a mesma enzima de restrio, pois

este procedimento gera extremidades coesivas que ainda permitem a

clonagem direcional. Contudo, alguns insertos no possuem a sequncia a ser

reconhecida pela enzima desejada e a digesto com a enzima de interesse

ocorre de maneira que a sequncia codificadora seja clonada fora da fase de

leitura. Este um ponto crtico para procedimentos que tm por objetivo aexpresso de protenas. Para facilitar estes procedimentos, fragmentos de DNA

adaptadores, contendo os fragmentos de restrio desejados, podem ser

adicionados sequncia dos insertos.

3.1.5.3.1 Adaptadores

Os adaptadores so pequenos fragmentos de nucleotdeos que contma sequncia nucleotdica reconhecida por uma determinada enzima de

restrio. Uma estratgia muito utilizada na construo destes adaptadores

inserir a sequncia da enzima de restrio ao desenhar o par de iniciadores a

ser utilizado na PCR (Fig. 37). Esta tcnica, alm de ser de fcil realizao,

ainda permite que mesmo aps a insero do stio de restrio, a sequncia

codificadora de uma determinada protena seja inserida no vetor com a fase de

leitura correta.


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Figura 37: Desenho de iniciadores

com sequncias adaptadoras.

O iniciador 1 idntico em sequncia fita codificadora. O iniciador 2

complementar fita codificadora. Os stios de restrio so acrescidos poro 5 de cada iniciador (esto em itlico e sublinhados; a enzima que os

reconhece est entre parnteses). Os adaptadores constituem, portanto, uma

estratgia que facilita a clonagem. O passo seguinte ento a escolha de um

vetor de clonagem mais apropriado para um determinado inserto e para um

dado experimento.

3.2 Vetores de Clonagem

O vetor ideal deve reunir em uma molcula diversas caractersticas,

como:

I- Ser uma molcula pequena e de fcil manipulao;

II- Ser capaz de se replicar de forma autnoma e intensa, o que

permite a amplificao do fragmento de interesse;

III- Deve conter diferentes sequncias que permitam o


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reconhecimento por enzimas de restrio. Neste caso, stios nicos so

interessantes porque a insero pode ser direcionada e no h problema de

perda de fragmentos aps a digesto enzimtica. Com esta finalidade, vrios

vetores foram modificados para permitir a insero de um stio mltiplo de

clonagem. Este representa uma sequncia sinttica construda de maneira a

portar somente um nico stio de restrio reconhecido por diferentes enzimas;

IV- Ter um mtodo fcil e rpido de identificao de clones que

portam o vetor recombinante.

Atualmente, esto disponveis no mercado diversos tipos diferentes de

vetores que permitem que o procedimento de clonagem seja realizado. Aescolha entre eles depende basicamente das caractersticas do inserto e da

aplicao pretendida para o gene clonado.

3.2.1 Plasmdeos

Plasmdeos so molculas de DNA dupla fita circular e

extracromossomal, que apresentam a capacidade de autorreplicao.Virtualmente, quase todos os gneros de bactrias possuem plasmdeos. Eles

podem conter os mais variados tipos de informao. Alguns carregam

informaes que os permite se transferirem de uma clula para a outra

(plasmdeos F); podem ainda conter genes de resistncia a antibiticos ou

codificarem protenas envolvidas com metabolismos exticos. Aparentemente,

alguns plasmdeos podem no apresentar nenhuma funo extra, quando so

ento denominados de crpticos.Os plasmdeos podem pertencer ao grupo de alto nmero de cpias

com 10 a 100 cpias por clula hospedeira, ou ao grupo de baixo nmero de

cpias com 4 a 10 cpias por clula hospedeira. Independente do nmero de

cpias, mais de um plasmdeo com funes diferentes pode coexistir numa

mesma clula. A literatura j descreveu micro-organismos contendo at mesmo

de um a oito plasmdeos diferentes por clula. Alm disso, devido

especificidade da origem de replicao, os plasmdeos podem se replicar em


31/55


uma espcie especfica ou mesmo em vrias espcies de clulas hospedeiras;

por esta caracterstica, os plasmdeos so denominados como estritos ou no a

um hospedeiro.

Por serem molculas autorreplicativas, os plasmdeos so

considerados como excelentes veculos para a clonagem molecular. Com este

objetivo, os plasmdeos naturalmente isolados de bactrias foram modificados

por engenharia gentica para permitir a incluso de caractersticas essenciais a

um vetor de alta eficincia, como:

I. Serem molculas de baixo peso molecular, pois a eficincia de

transformao diminui com vetores de peso acima de 15Kb;II. A presena de um nico stio de restrio a ser reconhecido por

uma determinada enzima de restrio;

III. Possuir um ou mais marcadores de seleo que facilitem o

reconhecimento e a seleo do vetor hbrido.

IV. Dois vetores plasmidiais tm sido utilizados em gentica, o

pBR322 e pUC (Fig. 38). Eles se derivam de plasmdeos encontrados

naturalmente em espcies bacterianas, porm com modificaes genticas quepermitiram sua adaptao como vetores de clonagem eficientes.

Figura 38: Plasmdeos. (A) pBR322; (B) pUC19

A BA B


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O pBR322 possui uma estrutura mais simples que a do pUC. Possui

dois genes de resistncia a drogas: um codifica a ampicilina e outro, a

tetraciclina. Dentro da sequncia codificadora de cada um destes genes h

stios de restrio nicos, os quais tm sido utilizados na clonagem. Contudo,

geralmente a insero realizada no stio de BamHI presente na sequncia

codificadora da tetraciclina. Isto tem implicaes na seleo dos

transformantes, como ser discutido mais adiante.

O vetor pUC mais avanado e permite uma segunda alternativa de

seleo dos transformantes. Alm da resistncia ao antibitico ampicilina,

possvel uma seleo fenotpica por colorao. O vetor constitudo por partedo operon Lac. Uma frao do gene lacZ(Z) est sob o controle do promotor

indutvel do operon Lac e da protena repressora LacI. Dentro da regio

codificadora do gene lacZ foi inserido o stio mltiplo de clonagem.

Outros plasmdeos que permitem uma clonagem eficiente em at 5

minutos so aqueles que possuem adio de timinas s extremidades 5 de

cada fita do vetor linearizado. Estes vetores so rotineiramente utilizados em

laboratrios para a clonagem de produtos de PCR. Isto se deve adio deadeninas s extremidades 3 dos amplicons, como j referido anteriormente

(Fig. 39).

Figura 39: Vetor para clonagem de produtos de PCR.


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O vetor apresenta em suas extremidades 5 um nucleotdeo de timina,

que pode se parear com um resduo de adenina presente no inserto devido

ao da Taq Polimerase. Os pequenos plasmdeos que contm grandes

inseres de DNA heterlogo tendem a perder espontaneamente a insero.

Portanto, a escolha de plasmdeos como vetor de clonagem deve ser feita

quando os fragmentos de insero contenham at 10 kb de tamanho. Assim, a

clonagem de fragmentos maiores deve levar em considerao as

caractersticas de outros vetores.

3.2.2 Bacterifagos

Para a formao de uma biblioteca genmica, a clonagem de

fragmentos maiores facilita para que a mesma seja mais representativa,

contendo todo ou a maior parte do contedo cromossmico. Com essa

finalidade, foram desenvolvidos veculos de clonagem como os bacterifagos

ou fagos lambda. Em seu ciclo de vida, o bacterifago infecta a E. colie pode

culminar em dois destinos diferentes: no ciclo lisognico ou no ltico. No ciclolisognico, o DNA do fago injetado na clula hospedeira pode ser integrado ao

cromossomo da bactria.

Este material conhecido como profago e pode ser mantido

indefinidamente na clula hospedeira. Contudo, sob determinadas condies

de estresse ambiental ou nutricional, o fago pode entrar no ciclo ltico. Neste

caso, o DNA do fago pode ser excisado e utilizado na formao de novas

partculas virais, resultando na lise da clula hospedeira. Com propsitos deus-lo na tecnologia do DNA recombinante, o DNA do fago recombinante

contendo o inserto precisa ser perpetuado como um bacterifago por meio de

vrios ciclos lticos.

A formao de partculas completas do fago uma sequncia de

eventos altamente coordenada. Um bacterifago formado por uma cauda de

protenas tubulares e por um capsdeo que comporta cerca de 50 kb de DNA

(Fig. 40), sendo que aproximadamente 20 kb so essenciais para os eventos


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de integrao e exciso deste material gentico no cromossomo da clula

hospedeira. Cada extremidade 5 da molcula linear composta por uma fita

simples de doze nucleotdeos. Estas sequncias so complementares e por

isso, conhecidas por extremidades coesivas ou sequncia cos. Por serem

complementares, elas permitem que este DNA linear possa se circularizar

como um plasmdeo.

Figura 40: Composio estrutural do fago lamba.

Na fase inicial do ciclo ltico, h a replicao do material gentico do

fago com a criao de uma molcula linear composta por muitas unidades de

50 kb. Cada capsdeo comporta entre 38 a 50 kb de DNA e a localizao das

sequncias cosassegura isto (Fig. 41).

Figura 41: Empacotamento do DNA no capsdeo do fago lamba durante o ciclo ltico.


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As sequncias cs asseguram que somente 50 kb de DNA sero

utilizados na formao de cada partcula viral. (Figura modificada de Glick &

Paternak, 1994). Os bacterifagos foram ento manipulados por engenharia

gentica para permitir a incluso de stios BamHI nas regies flanqueadoras da

sequncia que codifica protenas relacionadas com a integrao do genoma do

fago. O uso da enzima gera trs fragmentos de restrio: o L, o I/E e o R. O

fragmento L contm a informao gentica para a produo do capsdeo e da

cauda. O R codifica os genes relacionados com a replicao do DNA e do ciclo

ltico. O I/E contm os genes necessrios para a integrao e exciso do DNA

do fago.Com o propsito de utilizar os bacterifagos na clonagem molecular, as

sequncias I/E so substitudas pelo inserto de interesse. Para isso, o DNA de

interesse submetido a uma digesto enzimtica com BamHI e fragmentos de

aproximadamente 20 kb so selecionados como inserto. Estas amostras so

ento ligadas ao DNA do fago digerido com a mesma enzima (Fig. 42). O DNA

recombinante ento empacotado e utilizado na formao de novas partculas

de fago durante o ciclo ltico.

Figura 42: Sistema de clonagem do bacterifago lambda.

cos

L RI/E

L RI/E

BamHI BamHI

cos

Digesto BamHI

BamHI BamHI

Digesto BamHI

Seleo fragmento

de 20kb

L R

T4 ligase

cos

cos

cos

L RI/EL RI/E

L RI/E

BamHI BamHI

cos

Digesto BamHI

BamHI BamHI

Digesto BamHI

BamHI BamHI

Digesto BamHI

Seleo fragmento

de 20kb

L RL R

T4 ligase

cos

cos


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O Bacterifago lamba modificado por engenharia gentica para

permitir que stios de restrio da enzima BamHI sejam inseridos nas

extremidades flanqueadoras da regio I/E. O DNA de interesse tambm

digerido com a mesma enzima e fragmentos resultantes de peso molecular de

20 kb so selecionados para a clonagem. Com o auxlio da T4 ligase, o inserto

selecionado ligado s regies L e R. (Figura modificada de Glick & Paternak,

1994).

A formao da partcula do fago contendo o DNA recombinante foi

possvel aps estudos in vitro que demonstraram a viabilidade do processo.Partculas infectivas podem ser produzidas aps uma simples mistura dos

elementos constituintes da partcula do fago: capsdeo, a cauda e o DNA

recombinante. Os fagos so, portanto, teis na clonagem de fragmentos que

apresentem peso molecular variando entre 20 a 25 Kb.

Contudo, a obteno de insertos maiores desejvel em determinadas

situaes, como para o sequenciamento de longas molculas de DNA do

cromossomo eucarioto. Para a clonagem de genes destes organismos,frequentemente necessrio obter fragmentos superiores a 25 kb. Como os

genes de eucariotos podem variar de 30 a 40kb, o que se deve presena de

introns, a clonagem de fragmentos maiores possibilita a incluso de toda uma

sequncia em um nico clone. Por este motivo, outros vetores tm sido

desenvolvidos para a clonagem destes fragmentos. Entre eles esto os

cosmdeos, os YACs (cromossomo artificial de leveduras) e os BACs

(cromossomo artificial bacteriano).

3.2.3 Cosmdeos

Os cosmdeos so vetores hbridos que associam elementos de

plasmdeos origem de replicao, gene de resistncia a antibiticos e o stio

mltiplo de clonagem e de fagos. Assim, o inserto de DNA pode ser

englobado no capsdeo do fago, responsvel por inserir o DNA recombinante


37/55


na clula hospedeira. Ao entrar na clula, as sequncias coscomplementares,

derivadas dos fagos, permitem que o DNA linear do fago possa se circularizar

como um plasmdeo (Fig. 43). A diferena entre fagos e cosmdeos o

tamanho do inserto que pode ser clonado nos dois vetores. O inserto

heterlogo que o cosmdeo carrega cerca de trs vezes maior que o do fago

(aproximadamente 45kb).

Figura 43: Sistema de clonagem utilizando cosmdeo como vetor.

BamHI

CosCos ScaI

Cos

BamHI

ScaICos

BamHI

Tet R

CosCos

50kb

DNA

Digesto BamHI

Ligao T4 ligase

Formao de Partculas

de fagos

Infeco

BamHI

CosCos ScaI

Cos

BamHI

ScaICos

BamHI

Tet R

CosCos

50kb

DNA

Digesto BamHI

Ligao T4 ligase

Formao de Partculas

de fagos

Infeco

BamHI

CosCos ScaI

Cos

BamHI

ScaICos

BamHI

Tet R

CosCos

50kb

CosCos

50kb

DNA

Digesto BamHI

Ligao T4 ligase

Formao de Partculas

de fagos

Infeco


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O cosmdeo contm duas sequncias intactas de stios cos

flanqueando o stio nico da enzima ScaI, um nico stio de BamHI e a

sequncia codificadora da tetraciclina, o que permite a seleo por antibitico

de clones transformados com os cosmdeos. O vetor ento digerido com ScaI

e BamHI.A fonte de DNA digerida com BamHI e os fragmentos de 40kb so

selecionados como insertos. O vetor e o inserto so ligados com o auxlio da

T4 ligase e utilizados na formao de novas partculas infectivas de fagos.

Estes infectam E. coli e as sequncias cs permitem que este DNA

recombinante se circularize como um plasmdeo. Finalmente, ostransformantes so selecionados por sua capacidade de crescerem em meio

contendo tetraciclina. (Figura modificada de Glick & Paternak, 1994).

Para a construo de um cosmdeo, a maior parte do DNA relacionado

com a estrutura do fago deletada, permanecendo somente os stios cos. Esta

estrutura modificada permite que quase toda a sequncia do DNA doadora

possa ser inserida, desde que no exceda 50 kb, capacidade mxima de DNA

que o capsdeo do fago comporta. Estratgias similares aos cosmdeos foramdesenvolvidas, como os bacterifagos P1. A vantagem do uso destes outros

vrus que os mesmos podem acomodar molculas de DNA de at 100 kb.

Fragmentos ainda maiores podem ser clonados em outros vetores, como os

BAC e os YAC.

3.2.4. Bac e Yac

Os BAC so vetores similares a outros plasmdeos, exceto que sua

origem de replicao e as protenas envolvidas na replicao so derivadas do

plasmdeo fator F de E. coli. Isto permite que os BAC sejam transferidos

clula hospedeira por conjugao (Fig. 44). Estes vetores podem conter

fragmentos de at 300 kb.


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Figura 44: Transferncia de BAC s clulas hospedeiras.

Por serem derivados do plasmdeo F, que possuem os elementos

genticos necessrios conjugao bacteriana, o BAC contendo o gene de

interesse pode ser transferido clula hospedeira atravs da conjugao.

Contudo, rotineiramente se tem utilizado a transformao como meio de

transferir o BAC para as bactrias.

A clonagem de fragmentos ainda maiores de DNA foi possvel aps a

descoberta de elementos funcionais de cromossomos de leveduras, como

centrmero, telmero e sequncias que asseguram a replicao autnoma e a

segregao correta dos cromossomos. Isto permitiu a construo de

cromossomos artificiais de leveduras que funcionam como vetores de

cromossomo BAC

pilus

Clula F-Clula F+

Clula F+Clula F+

Estabilizao no pareamento

entre as clulas

Replicao e transferncia deuma das fitas

Sntese da fita compl ementar

Finalizao da transferncia

com a separao das clulas

cromossomo BAC

pilus

Clula F-Clula F+

Clula F+Clula F+

Estabilizao no pareamento

entre as clulas

Replicao e transferncia deuma das fitas

Sntese da fita compl ementar

Finalizao da transferncia

com a separao das clulas


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clonagem. Os YAC so molculas de DNA fita dupla linear que podem conter

insertos de at um megabase (1.000 Kb). Assim, podem-se isolar clones que

apresentem sequncias sobrepostas de insertos e que contenham

coletivamente quase um cromossomo humano inteiro (Fig. 45).

Figura 45: Construo de YAC.

A partir de um vetor que contm todos os elementos necessrios para

a perpetuao de um cromossomo eucarioto, feita uma digesto enzimtica

para a linearizao do vetor. O DNA de interesse extrado, purificado e

digerido com as mesmas enzimas. Procede-se com a ligao entre as

Digesto com

BamHI e EcoRI

Ligao

DNA de interesse

Seleo

Digesto com

BamHI e EcoRI

Ligao

DNA de interesse

Seleo


41/55


extremidades coesivas do vetor e do inserto, sendo que este DNA

recombinante ser transformado em uma levedura de eleio e os clones

recombinantes sero selecionados por resistncia a antibiticos.

3.2.5 Vetores de Expresso

Os vetores de expresso so vetores de clonagem que possuem todos

os elementos genticos que permitem a expresso de protenas

recombinantes. Se os elementos genticos permitem a expresso em clulas

bacterianas, este um vetor de expresso procarioto. o tipo mais utilizadoem pesquisas, pois a manipulao de culturas bacterianas mais fcil.

Contudo, bactrias no so capazes de processar o RNAm de eucariotos e,

neste caso, os insertos a serem utilizados devem ser derivados de bibliotecas

de cDNA. Uma alternativa a esta questo o uso de vetores de expresso

eucariotos, que possuem um promotor eucarioto e sinais de poliadenilao, por

exemplo.

Os vetores de expresso so utilizados quando a busca de umadeterminada sequncia se faz por meio da deteco da protena por ela

codificada. Para isso, o stio mltiplo de clonagem inserido prximo regio

promotora. As desvantagens do uso de vetores de expresso para o

isolamento de um determinado gene de interesse se devem ao

desconhecimento da sequncia do inserto. Para que haja a expresso de uma

determinada protena, o inserto deve se ligar ao vetor de forma que a fase de

leitura correta seja reconhecida pela maquinaria celular. Se isto no ocorrer,novas protenas sero formadas e, portanto, a sequncia de interesse no ser

detectada, mesmo que ela esteja presente em um determinado clone.

3.3 Transformao da Clula Hospedeira

O processo de transformao refere-se introduo de um DNA

exgeno em uma clula hospedeira. Este processo foi inicialmente


42/55


desenvolvido em clulas bacterianas e, posteriormente, adaptado a clulas de

diferentes organismos, como leveduras, fungos, clulas vegetais e de

mamferos. A transferncia de material gentico para clulas bacterianas pode

ocorrer por meio de trs processos distintos: transduo, conjugao e

transformao.

A transduo o processo em que a aquisio do material gentico

mediada pela ao de bacterifagos. Para isso, inicialmente o fago deve

infectar e realizar o ciclo ltico. Durante a replicao e formao das partculas

do fago h a aquisio do material gentico da clula infectada, que

considerada como a clula doadora. A troca de material gentico ocorrerquando a partcula viral infectar a clula receptora e nela introduzir o DNA

bacteriano da clula doadora.

Em biotecnologia, esse processo utilizado em determinados

procedimentos, como na transferncia do material gentico clonado na

sequncia do fago ou mesmo de cosmdeos, como j exposto anteriormente. A

conjugao o processo por meio do qual o material gentico transferido de

uma clula doadora para uma receptora por meio de contato clula a clula.Para que o material gentico seja transferido de uma clula a outra,

necessrio um ntimo contato entre as clulas, com a formao de uma juno

atravs da qual o material ser transportado.

Na biotecnologia, a realizao da conjugao normalmente necessita

da presena de plasmdeos que contenham as funes conjugativas, ou seja,

que possibilitem a juno clula a clula. Se o plasmdeo portando o inseto de

interesse no possui estas funes, pode-se introduzir na mesma clula outroplasmdeo que contenha as funes de conjugao.

O protocolo envolve o uso de trs receptores bacterianos distintos: o

primeiro, contendo o plasmdeo conjugvel, deve estar em contato com a clula

que contm o plasmdeo recombinante. Neste processo, o conjugvel

transferido segunda clula. Ento, a clula contendo os dois plasmdeos deve

entrar em contato com uma terceira. Esta ser transformada com o plasmdeo

recombinante graas ao do plasmdeo conjugvel.


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Este procedimento no to simples, exigindo uma seleo rigorosa

dos clones transformantes. Portanto, em processos biotecnolgicos, a

conjugao consiste em uma alternativa quando a transferncia do material

gentico deva ser a uma clula hospedeira cuja transformao um processo

complicado.

A transformao o processo natural onde o DNA exgeno liberado

aps a lise celular capturado por outra clula, a receptora. A clula apta a

receber um DNA exgeno dita como competente. A competncia est

relacionada presena de receptores na superfcie das clulas doadoras, os

quais se ligam ao DNA exgeno e o aproximam da superfcie celular. Estematerial ento internalizado e, finalmente, incorporado ao genoma da clula

receptora.

A eficincia da transformao um processo que depende de vrios

fatores, tais como o estado fisiolgico das clulas, os componentes presentes

na cultura destas bactrias e as caractersticas genticas da espcie em

questo. O processo j foi descrito tanto para bactrias Gram-positivas como

Gram-negativas.No ambiente, a transformao um evento raro. Por isso, os cientistas

que trabalham com a tecnologia do DNA recombinante desenvolveram

metodologias que permitem o aprimoramento da tcnica. Basicamente, o que

se faz induzir o estado de competncia da clula bacteriana, pelo tratamento

com ctions bivalentes, e/ou criar poros artificiais na membrana celular, por

meio de choque eltrico ou trmico.

A transformao por choque trmico um dos mtodoscorriqueiramente utilizados nos laboratrios. A escolha deste se baseia na

facilidade de manipulao e por no ser necessria a aquisio e uso de

equipamentos sofisticados. Para isso, a induo de competncia se d por um

tratamento com ctions bivalentes. A hiptese de que estes sejam capazes

de formar uma ponte salina entre a superfcie da membrana bacteriana, que

tem carga lquida negativa, e o DNA a ser inserido, que tambm

negativamente carregado.


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Assim, os ons seriam receptores naturais, facilitando a adsoro do

DNA. Foi relatado que estes ons tambm facilitam a abertura de poros na

superfcie bacteriana. As clulas bacterianas so ento incubadas com o DNA

e h um choque trmico entre 37 e 42C. Este mtodo tem uma eficincia de

transformao (ou seja, o nmero de transformantes por microgramas de DNA

adicionados) de 107a 108.

O mtodo da eletroporao consiste em sujeitar as clulas

competentes, em presena do DNA, a uma alta corrente eltrica. O mtodo

diferenciado para cada espcie bacteriana. Em linhas gerais, inicialmente a

clula hospedeira tambm submetida a um tratamento para induzir seuestado de competncia.

A cultura celular lavada com uma soluo aquosa, que tem por

objetivo a retirada de restos de meios de cultura, cujos componentes podem

aumentar a condutividade do meio, influenciando nas condies do choque

eltrico. Em seguida, a clula submetida ao choque eltrico que desestabiliza

a membrana externa ou plasmtica, provocando a formao de poros nestas

estruturas, possibilitando a entrada do DNA no espao citoplasmtico.As vantagens deste procedimento incluem sua maior eficincia em

relao ao de choque trmico e amplamente utilizado para vrios tipos

celulares, como bactrias Gram-positivas e Gram-negativas, leveduras, fungos,

clulas vegetais e de mamferos.

Alternativa na transformao de clulas consiste em forar a entrada

do DNA recombinante por meio de partculas de ouro ou tungstnio, revestidas

pelo DNA exgeno. Estas partculas sofrem uma acelerao no vcuo com oauxlio de um equipamento especial. Estas micropartculas revestidas so

capazes de perfurar a clula hospedeira, liberando o DNA em seu interior. Este

mtodo conhecido como biobalstica e eficiente em muitos casos. Contudo,

as desvantagens incluem a necessidade de adquirir equipamentos especficos

e caros, alm de determinadas condies experimentais pouco acessveis

rotina laboratorial.

Aps a transformao, muitos procedimentos requerem uma alta


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quantidade de DNA. Por isso, os clones podem ser submetidos a um processo

que permita que o DNA recombinante seja amplificado.

3.4 Ampli ficao do DNA Recombinante

O DNA quimrico transformado em um hospedeiro apropriado capaz

de se replicar. Isto ocorre porque os vetores de clonagem utilizados possuem

uma origem de replicao autnoma. Entretanto, aps a ligao, o inserto

tambm faz parte do vetor. Assim, quando o vetor se divide, o inserto

automaticamente replicado junto com o seu portador. O resultado que cadavetor que entra na clula ir formar mltiplas cpias de si mesmo na clula

hospedeira. A quantidade de DNA recombinante ainda se torna maior aps

diversos ciclos de diviso da clula hospedeira. A cultura em que estas

bactrias se encontram conter bilhes de cpias do inserto de um

determinado clone. Este processo a uma maneira de amplificao do DNA

hbrido.

A amplificao do DNA recombinante produz uma quantidade maior doDNA quimrico, um pr-requisito para muitos procedimentos de biologia

molecular. Alm disso, este procedimento ainda apresenta como vantagem o

sistema de verificao da sequncia de DNA aps a sua replicao na clula

hospedeira, como visto na introduo gentica. Assim, a possibilidade de

mutao menor que quando a amplificao se realiza por outras tcnicas.

Aps a transformao, diversos tipos de clones podem ser obtidos.

Alm daqueles que capturaram a molcula de DNA recombinante, h outrosque capturaram somente o inserto, ou mesmo o vetor que se anelou nele

mesmo. Frente a estas possibilidades, so necessrios mecanismos que

permitam a seleo dos clones que contenham somente o inserto desejado.

3.5 Seleo de Clones Transformados com o DNA Hbrido

A seleo de clones que realmente foram transformados com o DNA


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hbrido normalmente feita por seleo a antibiticos. Plasmdeos e

cosmdeos possuem em sua estrutura entre uma a duas sequncias

codificadoras de polipeptdeos que permitem que a clula transformada seja

resistente a dois antibiticos. No caso do plasmdeo pBR322, h dois genes

que codificam resistncia a antibiticos: um para tetraciclina e outro para

ampicilina.

Normalmente, para os procedimentos de clonagem, a digesto

enzimtica realizada com a enzima BamHI. O stio de restrio reconhecido

por esta enzima se localiza na regio codificadora da tetraciclina. Assim, a

sequncia de tetraciclina interrompida aps a digesto e ligao do insertoneste stio; logo, todos os clones contendo o inseto so sensveis a este

antibitico. Por outro lado, os clones transformados com o vetor que

recircularizou, isto , sem ter havido a ligao do inserto, resistente

tetraciclina. Assim, esta a primeira seleo de clones transformados, que

realizada aps plaquear a cultura de transformantes em meio contento o

antibitico.

Outra seleo consiste na tcnica rplica plate. Neste caso,inicialmente as culturas so plaqueadas em meio contendo o antibitico

ampicilina. Todos os clones transformados com o vetor so capazes de crescer

neste meio. Esta placa servir de mapa para o prximo plaqueamento. A placa

de ampicilina demarcada em seus pontos e pressionada contra um pano de

veludo. Posteriormente, a segunda placa que tem como meio de seleo a

tetraciclina carimbada neste pano de veludo contra o qual os clones

resistentes a ampicilina foram pressionados. Assim, somente aqueles ao qual oinserto se ligou ao vetor crescero.

A tcnica de rplica plate um procedimento de difcil execuo e, por

isso, muitas vezes ele eliminado da rotina de laboratrios. Uma alternativa

consiste em selecionar os transformantes plaqueando-os em meio ao qual

foram acrescidos os dois antibiticos, tetracilina e ampicilina. Frente a este

problema, outros vetores foram manipulados de forma a proporcionar outros

mecanismos que facilitem a seleo de transformantes.


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Vetores tais como os derivados do pUC permitem que a seleo de

transformantes seja feita por antibiticos e por um outro sistema, como

exemplo, a caracterstica fenotpica entre colnias brancas e azuis. Este vetor

possui um segmento da protena Lac Z (LacZ), que representa uma poro do

gene que codifica a enzima beta-galactosidase. A expresso desta protena

regulada pelas sequncias reguladoras do operon Lac: o promotor e a protena

repressora LacI.

Portanto, quando os transformantes so crescidos sob a presena do

indutor IPTG do operon Lac, a protena inibidora incapaz de se ligar ao

promotor e o gene lacZ ento expresso. Para que a enzima beta-galactosidase seja ativa, necessrio que os vetores sejam transformados em

linhagens de bactrias que possuam a insero da sequncia codificadora da

outra frao do gene lacZ. Para isso, as duas pores expressas pelo vetor e

pelo DNA cromossomal se combinam para formar a protena ativa da beta-

galactosidase. Este processo denominado complementao alfa. A enzima

ativa capaz de hidrolisar o substrato genericamente conhecido como X-gal, o

que produz colnias azuis.Para a clonagem no vetor pUC, so realizados os mesmos

procedimentos utilizados para outros vetores. Tanto o vetor como o inserto

sofre digesto enzimtica, de preferncia com enzimas que produzem

extremidades compatveis. O stio mltiplo de clonagem dos vetores pUC se

localizam na regio codificadora da protena LacZ. Assim, ao sofrer a digesto

enzimtica, a sequncia codificadora referente frao LacZ interrompida.

Sem esta frao, a clula hospedeira incapaz de formar uma enzima comatividade biolgica. Portanto, as colnias transformadas com os vetores que

possuem o inserto no so capazes de clivar a X-gal e, por isso, formam

colnias brancas.

Portanto, alm da seleo por antibitico, adicionalmente possvel

distinguir os transformantes pela caracterstica fenotpica entre colnias

brancas ou azuis (Fig. 46)


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Figura 46: Placa contendo bactrias transformadas que apresentam a caracterstica

fenotpica de colorao branca e azul.

3.5.1 Seleo por Hibridizao de DNA

Uma determinada sequncia de DNA pode ser identificada pela tcnica

da hibridizao. A especificidade de pareamento de bases por pontes de

hidrognio, primeiramente descobertas na molcula de DNA, a base para

esta tcnica. Inicialmente, o DNA da amostra desnaturado quando exposto a

altas temperaturas ou a substncias alcalinas. Estes tratamentos rompem as

pontes de hidrognio, mas no as ligaes fosfodister. As fitas abertas so

fixadas a um suporte de nylon ou nitrocelulose e o passo seguinte consiste na

busca por sequncias especficas de DNA.

Para isso, fragmentos de DNA previamente conhecidos, compostos

geralmente por 100 a 1.000 pb, so sintetizados, desnaturados e ento

adicionados em soluo ao suporte em que a amostra est fixada. Este

material denominado sonda. Ao encontrar uma sequncia complementar, h

o pareamento de bases, assim como ocorre na replicao do DNA.


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Frequentemente, este pareamento requer uma complementaridade acima de

80% dentro de um segmento de 50 bases. Para a identificao do pareamento

de bases entre a sonda e o DNA da amostra, a sonda marcada por algum

mtodo que permite a visualizao, como o uso de radioistopos. A

visualizao, neste caso, se faz por autorradiografia.

Quando a amostra fixada ao suporte de DNA, a tcnica

denominada Southern Blot. Esta pode ser feita aps a extrao do DNA com

uma digesto enzimtica. Contudo, no caso do isolamento de genes, os clones

de uma biblioteca so plaqueados na placa mster. Esta ser marcada,

permitindo a identificao da localizao de cada clone.Os clones so ento transferidos ao suporte de nitrocelulose. Estas

clulas sofrem uma lise, seguida por desproteinizao e desnaturao do DNA

e ligao do DNA matriz. Neste estgio, a sonda marcada adicionada. Se

h hibridizao, um sinal ser detectado na autorradiografia, estas colnias so

buscadas novamente na cultura mster, de acordo com a localizao de cada

clone plaqueado e identificado antes da transferncia (Fig. 47).

Figura 47: Busca de um determinado clone por hibridizao de DNA.


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(1) Os clones so plaqueados em uma cultura mster e, em seguida,

transferidos a uma matriz de nitrocelulose. (2) As clulas so lisadas e o DNA

desnaturado. Este ento se liga matriz. (3) Um oligonucleotdeo com

sequncia complementar de um determinado gene de interesse utilizado

como sonda. Ao se ligar sua sequncia complementar, a sonda marcada

reage e permite a identificao do clone contendo a sequncia de interesse. (4)

Sempre se deve manter uma subcultura dos clones da placa mster.

Como a maioria das bibliotecas criada pela digesto parcial da

amostra de DNA, alguns clones podem gerar um sinal aps a hibridizao. O

prximo passo determinar qual clone realmente contm a sequncia e, depreferncia, completa. Geralmente, o vetor hbrido utilizado na clonagem

isolado, purificado e sequenciado, mas como isto significa mais gastos, podem-

se selecionar clones a serem submetidos ao sequenciamento por resultados

preliminares de mapeamento por restrio.

Este mecanismo revela o tamanho de cada inserto, sendo que os que

possuem um determinado tamanho compatvel sequncia do gene em

questo so escolhidos e deste modo possvel montar toda a sequncia dogene. A hibridizao, apesar do sucesso em determinadas pesquisas, possui

algumas limitaes. No possvel garantir que a sequncia completa de um

gene alvo estar presente em uma determinada biblioteca genmica. Uma

alternativa para este problema a criao de outra biblioteca a partir da

digesto enzimtica com enzimas diferentes e que permitam a gerao de

fragmentos maiores; assim, aumenta-se a chance de que algum clone

contenha toda a sequncia de um gene em especfico.A construo de outra biblioteca um processo caro e trabalhoso.

Outras opes podem ser utilizadas para a busca de um gene de interesse a

ser isolado, como a pesquisa por atividade imunolgica ou proteica.

3.5.2 Busca por Atividade Imunolg ica

Quando uma sonda de DNA no est disponvel ou mesmo a


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correta, a expresso de somente determinados fragmentos que no compe

uma enzima ativa e a necessidade de utilizar linhagens bacterianas com

mutaes especficas que evitem a interferncia no mtodo de seleo

escolhido. Aps terem sido selecionados clones que contenham o inserto de

interesse, certos procedimentos que permitam a confirmao da sequncia de

interesse devem ser adotados. Entre os mtodos, so muito utilizadas a PCR e

a digesto enzimtica, alm do sequenciamento.

3.6 Confi rmao do Inserto

Quando se h um conhecimento prvio a respeito da sequncia a ser

isolada, a confirmao de que o inserto foi clonado feita por PCR. Este

procedimento um mtodo rpido e de alta especificidade. Os iniciadores so

desenhados a partir de uma sequncia especfica e complementar, sendo que

a especificidade ainda pode ser aumentada alterando-se determinados

parmetros envolvidos na reao de amplificao.

Os amplicons produzidos so analisados por eletroforese quanto aopeso molecular esperado para o fragmento determinado. Mas a PCR uma

anlise inicial e frequentemente so necessrias informaes adicionais, como

verificar se somente um determinado fragmento foi clonado a um vetor. Estas

questes so ento verificadas por digesto enzimtica.

A digesto enzimtica se baseia no mapa de restrio de uma

sequncia. Enzimas que flanqueiam a regio de ligao inserto/vetor e que

reconhecem stios especficos dentro de uma sequncia so utilizadas nestametodologia. Os fragmentos de restrio so analisados assim como os

produtos de PCR, de acordo com o peso molecular obtido aps uma

eletroforese, comparando-se ao esperado. Contudo, para realmente confirmar

uma sequncia e sua estrutura, como por exemplo, se h alteraes de bases,

e para analisar sequncias das quais no se tem conhecimento prvio, deve-se

sequenciar o clone.

O sequenciamento a tcnica que permite determinar a ordem em que


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os nucleotdeos se encontram em uma sequncia de DNA. O mtodo baseia-se

na sntese de DNA fita simples a partir do DNA molde da amostra. A

polimerizao das novas cadeias inclui a incorporao dos quatro nucleotdeos

(dNTPs) e de dideoxinucleotdeos (ddNTPs). Os ddNTPs diferem dos dNTPs

por no possurem o grupo 3 OH necessrio elongao da cadeia. Portanto,

a adio de um destes ddNTPs impede a formao da ligao fosfodister com

o prximo dNTP e a elongao da cadeia termina nesse ponto.

A sntese das novas cadeias inicia-se na posio de um iniciador que

se anela fita molde e cada molcula sintetizada termina com uma base

especfica: A, C, G ou T. Utilizando-se os quatros ddNTPs diferentes em quatroreaes independentes, obtm-se a informao completa da sequncia do

DNA (Fig. 49).

Figura 49:

Sequenciamento de DNA.

Fragmentos de DNA

amplificados com

nucleotdeos

marcados

eletroforese

Mtodo manual Mtodo automtico

Migrao

do DNA

Laser

Detector

Dados gerados por computador

cromatograma

Fragmentos de DNA

amplificados com

nucleotdeos

marcados

eletroforese

Mtodo manual Mtodo automtico

Migrao

do DNA

Laser

Detector

Dados gerados por computador

cromatograma


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