biotecnologia soja alunos

Biotecnologia de soja

Transgenia e

Marcadores Moleculares

[email protected]

Melhoramento Genético Objetivo

• Aumento da frequência de genes ou de

combinações genéticas de interesse econômico,

através de ferramentas como cruzamentos e

seleção, para maximizar a produção nas condições

ambientais existentes

A soja é resultado de um

longo processo de seleção

realizada pelo homem

Glycine soja

Glycine max

Biotecnologia

• Aplicação dos mecanismos que

envolvem:

– Tecnologia do DNA recombinante

– Marcadores moleculares

– Cultura de tecidos

– Biologia celular e molecular

– Informática

Construindo um transgene

Plasmídeos e vetores

• ocorrem naturalmente em algumas bactérias

• são moléculas de DNA dupla fita e circular

• muitas vezes carregam genes para resistência a antibióticos

• têm replicação independente da replicação cromossômica

Características importantes dos

vetores

• Origem de replicação

• Genes para resistência a

antibióticos

– Permite que a célula

hospedeira cresça em meio

seletivo

• Múltiplos sítios de

clonagem

– Permite a inserção de DNA

exógeno

pCAMBIA1301

11837 bp

lacZ a lpha

Gus firs t exon

Gus se cond exon

kana mycin (R )

hygromycin (R)

pV S 1 sta

Ca ta lase intron

T-B order (r ight)

Histidine tag

pB R322 bom

T-B order (le ft)

Nos poly-A

Ca MV 3 5S polyA

Ca MV 35S promoter

Ca MV 3 5S promote r

pB R322 or i

pV S 1 rep

BamH I (11046)

Bgl II (8)

Bst EII (2050)

Bst XI (10782)

EcoR I (11025)

Hind III (11076)

Kpn I (11041)Nco I (1)

Pst I (11068)

Sac I (11035)

Sac II (8383)

Sal I (11058)

Sma I (11043)

Xba I (11052)

Nhe I (2014)

Nhe I (5458)

Sph I (2455)

Sph I (11074)

Xho I (8901)

Xho I (9995)

Enzimas de restrição

• Proteínas que reconhecem e clivam o DNA em

pontos específicos, geralmente em sequencias

de 4, 6 e 8 bases palíndromas

DNA recombinante

DNA ligase

Métodos de transformação

Inserção do DNA recombinante-

• INDIRETO

Agrobacterium

• DIRETA

Biobalística

Eletroporação - Protoplastos e Tecidos íntegros

Transformação por Agrobacterium

• Bactérias do solo que tem a capacidade de transferir parte do seu DNA

para dentro da célula da planta

• No laboratório, a bactéria é colocada em cultura junto com as células de

plantas, ou inoculada no tecido da planta, transferindo parte do seu DNA

para as células da planta

Transformação por Biobalística

• Partículas de ouro ou tungstênio são cobertas com DNA e

aceleradas em direção ao tecido da planta (hélio comprimido)

• As partículas perfuram a parede celular e penetram dentro da

célula

• Utilizado quando não é possível por incompatibilidade biológica o

uso de Agrobacterium

• Vetores - não requerem sequencias especiais

• Micropartículas - ouro ou tungstênio - 0,4 a 1,5 mm

Partículas de ouro Partículas de tungstenio

Acelerador de partículas com alta pressão de gás hélio (Biorad).

Esquema de funcionamento

TRANSFORMAÇÃO POR

ELETROPORAÇÃO

• Consiste em submeter os protoplastos e DNA a

um campo elétrico de intensidade controlada

• Choque elétrico - formação de poros

reversíveis na membrana plasmática

permitindo a entrada do DNA

• Fatores importantes

– Duração do pulso

– Voltagem aplicada

Esquema de eletroporção

Cubetas para eletroporção

Eletroporador

CULTIVO E REGENERAÇÃO DE PLANTAS A

PARTIR DE PROTOPLASTOS

E F

G H

A B

C D

Tipos de Transgênicos

• 1ª Geração

Características de produção

–redução do custo de produção

–resistência a herbicida, doenças e insetos

–Estresse ambiental

• 2ª Geração

Características de consumo

–agregar valor ao produto final

–melhoria nutricional

–melhor conservação pós-colheita

Variedades e eventos de transgenia

http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database









Soja: Transgênicos de 1ª geração

– GTS 40-3-2 soja tolerante ao herbicida glifosato (Roundup

Ready) da MONSANTO

• Introdução do gene cp4 epsps (5-enolpiruvil chiquimato-3-fosfato sintase)

presente em Agrobacterium tumefaciens

– ACS-GMOO5-3 soja tolerante ao herbicida glifosinato de

amônia (LibertyLink)da BAYER

• Introdução do gene gene PAT presente em Streptomyces

viridochromogenes

– BPS-CV127-9 soja tolerante ao herbicida imidazolinona

(chlorsulfuron, imazapyr e imazaquim) da BASF

• Introdução do gene csr1-2 de mutantes de A. Thaliana (serina por uma

asparagina)

- MON87701 soja tolerante a lagartas

• Introdução do gene Cry1Ac de ação biocída presente em Bacillus

thuringiensis

– Metabolismo dos principais ácidos graxos em soja e genes

associados


10.2%

Palmitic

(C16:0)

3.8%

Stearic

(C18:0)

23.8%

Oleic

(C18:1)

49.1%

Linoleic

(C18:2)

8.1%

Linolenic

(C18:3)

SAD FAD2-1 FAT-A FAD3

= 81% of fatty acids insaturated

Silenciamento do Gene Fad2-1

Duas cópias do gene

ativas

– DP-305423 soja com alto teor de ácido graxo

oleico da Pioneer Hi-Bred • Inserção de cópia de uma porção de gene GmFad2-1 provocando a

supressão (silenciamento) do gene

– G94-1, G94-19, G168 soja com alto teor de ácido

graxo oleico da Du Pont Canada • Inserção de cópia de uma porção de gene GmFad2-1 provocando a

supressão (silenciamento) do gene




• Todo e qualquer fenótipo

molecular oriundo de um gene

expresso ou sequência de DNA

(expressa ou não) onde se

pode detectar polimorfismo

• Fisicamente ligados a locos

que determinam

características de interesse

econômico (QTLs)

– Necessidade de ocorrência de

desequilíbrio de ligação para

detectar a ligação entre os locos

Alguns tipos de marcadores

de DNA

• RFLP

• VNTR

• RAPD

• SSR

• AFLP

• SNP

Hibridização

PCR

RFLP e PCR

Contribuições dos Marcadores Moleculares no

Melhoramento

Caracterização de germoplasma

Diversidade genética e genealogia

A

B

C

D

E

R

Seleção de genitores


Identificação de acessos


Proteção Varietal

Seleção Assistida por Marcadores - SAM

Ferrugem asiática– Phakopsora pachyrhizi

Marcador AFLP

Genótipo selecionado

Mapa

• Mapeamento genético

População de São Paulo

9.291.000 habitantes em 2.600.00 domicílios

Soymap

http://bldg6.arsusda.gov/cregan/soymap.htm

Akaya et al (1993)

Morgante et al (1994)

Cregan et al (1999)

Song et al (2004)

Choi et al (2007)

http://bldg6.arsusda.gov/cregan/soymap.htm

MARCADORES MOLECULARES

RFLPs: Restriction Fragment Length Polymorphisms; (Botstein et al. 1980) RAPDs: Random Amplified Polymorphic DNAs; (Williams et al. 1990; Welsh & McClelland, 1990) AFLPs: Amplified Fragment Length Polymorphisms; (Zabeau & Vos, 1993; Lin & Kuo, 1995) Microssatélites ou SSRs: Simple Sequence Repeats; (Hamada et al. 1982; Tautz & Renz, 1984)

MARCADORES MOLECULARES

SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms); (Schimid et al., 2003; Zhu et al., 2003)

MARCADORES MULTILOCO

DOMINANTES NÃO-ESPECÍFICOS

Não são dirigidos a uma região particular do

genoma

Revelam polimorfismo em dezenas de locos

simultaneamente

Desenvolvidos para cada espécie

Identificação dos heterozigotos

MARCADORES LOCO-ESPECÍFICOS

CODOMINANTES

CONCEITO DE MARCADOR dominante e codominante

dominante codominante P1 P2 P1 P2

P1 P2 P1 x P2

Ex: RAPD

P1 P2 P1 x P2

Ex: SSR

AA

A

A

A

a

a

a

a

aa Aa AA aa a

A

A

Equipamentos para

amplificação por

PCR

Equipamentos para

eletroforese em géis

de agarose

CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS

Amplificação aleatória de fragmentos de DNA

Amplificação do DNA com um pequeno e único

“primer” (9 a 10 pb) de seqüência arbitrária e com

seqüência alvo desconhecida

Random Amplified Polymorphic DNA

Isolamento do DNA

(total, cloroplasto ou mitocondrial)

Reação de PCR com um “primer”

Separação dos fragmentos de DNA em gel

de agarose

Visualização de fragmentos de DNA

usando Brometo de Etídeo

RAPD: passo a passo

PCR

Separação das fitas de DNA (94oC, 5 min.)

“Primers” ligam-se as fitas de DNA (35 a 65oC, 30s.)

Taq DNA polimerase Sintetiza novas fitas de DNA (72 o C, 2-5 min.)

Separação das fitas de DNA para início de um novo ciclo (94o C, 30s.)

Polymerase Chain Reaction

DESNATURAÇÃO

ANELAMENTO

EXTENSÃO DESNATURAÇÃO

PCR animation/pcr.exe

RAPD

DNA

Taq-DNA

polim.

“Primers”

Nucleotídeos

Genótipo A Genótipo B

A B

CARACTERÍSTICAS (RAPD)

1. AMPLIFICA VÁRIOS LOCOS

2. POLIMORFISMO: PRESENÇA / AUSÊNCIA

3. MARCADOR DOMINANTE

PADRÃO RAPD

1. “Mismatches” no sítio do “primer”

2. Surgimento de um novo sítio

3. Comprimento de uma região amplificada entre dois sítios de “primers”

CAUSAS DO POLIMORFISMO:

CRITÉRIOS PARA A LEITURA DAS BANDAS:

1. “REPRODUTIBILIDADE” 2. ESPESSURA

3. TAMANHO 4. SEGREGAÇÃO ESPERADA

Avaliação de recursos genéticos

“Fingerprint” : Identificação de materiais

Análise da diversidade genética Caracterização de germoplasma Rápida Identificação de marcadores ligados a uma

característica de interesse -Polimorfismo na região de interesse Nível de Polimorfismo – muitas marcas / ensaio

RAPD: utilização e vantagens

Identificação de cultivares

Pureza dos Híbridos Detecção de variação somaclonal; Estrutura genética de populações e domesticação

Mapeamento genômico

Não é necessário conhecimento prévio do genoma da

espécie Custo baixo em relação aos outros marcadores

RAPD: utilização e vantagens

RAPD:

LIMITAÇÕES &

DESVANTAGENS

Dominantes; Falta de conhecimento prévio da identidade dos

produtos de amplificação; Problemas com reprodutibilidade entre laboratórios;

Custos: Plásticos

Agarose Enzima

EXEMPLO

Restriction Fragment Length Polymorphism •Hibridação molecular: corte do DNA com enzima de restrição e posterior

hibridação com sonda pela homologia das sequências

•Examina diferenças nos fragmentos de DNA digeridos

•Polimorfísmo deriva de mutações pontuais, inserções e deleções

•Requer grande quantidade de DNA genômico com alto grau de pureza

•Utilização de sondas radioativas ou por quimioluminescência (a frio)

Enzimas de restrição: •Reconhecem e cortam seqüências específicas do DNA;

•Sítios palindrômicos - RADAR

•Centenas de enzimas disponíveis:

EcoRI: 5’ GAATT C 3’

3’ G TTAA G 5’

HaeIII: 5’ GGCC 3’

3’ CCGG 5’

Alteram o tamanho do fragmento de restrição

RFLP • Método:

• 1) Extração e digestão do DNA.

• 2) Eletroforese

• 3) “Southern blotting”

• 4) Marcação da sonda

• 5) Autorradiografia

SONDA MARCADOR

- cDNA library -

transcrição reversa

do mRNA

-gDNA library -

fragmentos de DNA

genômico clonados

ao acaso.

- Loco: combinação

Sonda/enzima

- Informativo

- Alelos distinguíveis

RFLP

Figura 1. Perfil de RFLP para as 18 linhagens

endogâmicas de milho com 4 diferentes enzimas de

restrição (Bam HI, Eco RI, Eco RV e Hind III). (A)

Sonda BNL6.32, (B) UMC128 e (C) UMC107.

Limitações - RFLP

Custos Instalação

Insumos Enzimas

Membranas

Hibridizações Radioativas

N-Radiativas

Nível de Polimorfismo – poucos locos / ensaio

Laborioso

Vantagens dos RFLPs

Robusto

Boa transferibilidade entre laboratórios

Codominante → Heterozigosidade

Não requer informação prévia de seqüência

Baseado em homologia de seqüência → análise filogenética

entre espécies;

Aplicável a qualquer planta

Poder discriminatório: * nível de população ou espécies

(sondas cópia única)

* nível de indivíduos

(sondas múltiplas cópias)

Microssatélites (SSR)

– Seqüências curtas (1 a 6 bases) repetidas em tandem

– Presentes em procariotos e eucariotos

– Presentes em regiões codificantes e não codificantes

– Maioria das repetições são dinucleotídeos • (AC) n (AG) n (AT)n


• Polimorfismo devido a diferenças no número de repetições – Escorregamento da DNA polimerase durante a

replicação

– Crossing-over desigual entre cromátides irmãs

• Codominantes

• Normalmente loco simples e multi-alélico

Presentes em diversos organismos

(CA)n – (TG)n: mais freqüentes em mamíferos

50.000 a 100.000 cópias por genoma

(AT)n: mais freqüente em plantas

Soja: (AG/AT)n (CCT/GGA)n (CCG/GGC)n

Par de “primers” específicos

(“Forward” e “Reverse” ~ 20 bases cada)

ALELOS 2 pb de diferença

CARACTERÍSTICAS

Microssatélites


• Detecção do polimorfismo – Seqüenciador – Géis de agarose – Géis de acrilamida (detecta diferenças de até 2pb)

• coloração direta: nitrato de prata (barato) • Coloração indireta: marcação radioativa ou fluorescente

Desenvolvimento de marcadores

microssatélites

Método tradicional

Outras estratégias

• Busca em banco de genes

• Utilização de sequências ESTs

• Utilização de BACs (Bacterial

Artificial Chromosomes


• Problemas – Custo e trabalho envolvidos no desenvolvimento dos

primers • Construção de bibliotecas genômicas • sequenciamento • Triagem dos melhores primers

Possibilidade de se usar seqüências depositadas em banco de dados

Nenhuma seqüência disponível

Usar SSRs conhecidos para isolar

clones de uma Biblioteca

(B)

Usar seqüências de SSRs como

sondas contra DNA digerido:

Biblioteca Enriquecida

Seqüênciar clones positivos

Desenhar “primers” específicos

Detectar polimorfismo

Metodologia e Visualização

dos SSRs

Metodologia :

Extração DNA

PCR com “primers” específicos

(“flanqueiam” as repetições)

Separação dos fragmentos

Visualização:

Agarose ou Metaphor: Agarose + BET, UV;

Acrilamida + Prata ou Radioisótopos

Sequenciador + fluorescência

Microssatélites (Gel de poliacrilamida 6%)

Amplified Fragment Length Polymorphism

CARACTERÍSTICAS

MARCADOR DOMINANTE

DISPERSO NO GENOMA

GRANDE NÚMERO DE LOCOS POR ANÁLISE

NÃO É ESPÉCIE-ESPECÍFICO

NÃO NECESSITA DE INFORMAÇÃO DE SEQÜÊNCIA

ROBUSTO, REPRODUZÍVEL ENTRE LABORATÓRIOS

RÁPIDO

ETAPAS AFLP

5. ANÁLISE EM GEL

1. DIGESTÃO DO DNA

2. LIGAÇÃO DE ADAPTADORES ESPECÍFICOS

3. PRÉ-AMPLIFICAÇÃO (oligonucleotídeo com

nenhuma ou apenas uma base seletiva)

4. AMPLIFICAÇÃO SELETIVA (oligonucleotídeo

com três bases seletivas)

DIGESTÃO

2) ENZIMA DE CORTE FREQÜENTE:

Reconhece a cada 04 pb – MseI , Rsa I

1) ENZIMA DE CORTE RARO:

Reconhece a cada 06 a 08 pb – EcoRI, Not I

1 a

FRAGMENTOS GERADOS PELA CLIVAGEM:

Fragmentos grandes

(cliv. da enzima rara em ambas as extremidades)

Fragmentos pequenos

(cliv. da enzima freqüente em ambas as

extremidades)

Fragmentos

intermediários

rara/freqüente

(cliv. combinada)

AFLP

4 a 5 Kb

Boa Visualização

Classe 1

Classe 2

Classe 3

LIGAÇÃO DE

ADAPTADORES

ESPECÍFICOS

1) Seqüências específicas complementares às

extremidades coesivas resultantes da clivagem

pelas enzimas de restrição:

Adaptadores EcoRI, adapatdores MseI

2) Adaptadores: 20 a 30 pb,

seqüências diferentes para cada adaptador

AFLP

2 a

PRÉ-AMPLIFICAÇÃO E

AMPLIFICAÇÃO

AFLP

3 a

• PRIMERS SEQÜÊNCIA ARBITRÁRIA

Características: - 20 a 25 nucleotídeos complementares

aos adaptadores

- 01 a 03 nucleotídeos de seqüência

arbitrária ( extremidade 3´ ) = Ação

Seletiva

Ação Seletiva Dos “Primers”

• 1a ETAPA : “primers” com apenas 01 nucleotídeo

arbitrário, não-marcados

01 em cada 04 bases (A, T, C, G) → 1 : 16 fragmentos

amplificados

• 2a ETAPA : “primers” com 03 nucleotídeos arbitrários,

aumento da intensidade de seleção, terminal 5´marcado

01 em cada 43 x 43 // 1 : 4096 fragmentos /

corte de enzima rara

GAATTCN

CTTAAGN

NTTAA

NAATT

5’ AATTC N

3’ G N

5’ AATTC N

3’ G N

N T 3’

N AAT 5’

N T 3’

N AAT 5’

Eco RI + Mse I

AATTC T

TTAAG A

C TTA

G AAT

AATTCAAC

TTAAGTTG

TTGTTA

AACAAT

AATTC N

G N

N T

N AAT MseI

AATTC N

TTAAG N

N TTA

N AAT

EcoRI

C 5’

A5’

AAC5’

AAC 5’

TTAA 5’

5’ TA

GAATTCN

CTTAAGN

NTTAA

NAATT

5’ AATTC N

3’ G N

5’ AATTC N

3’ G N

N T 3’

N AAT 5’

N T 3’

N AAT 5’

Eco RI + Mse I

AATTC T

TTAAG A

C TTA

G AAT

AATTCAAC

TTAAGTTG

TTGTTA

AACAAT

AATTC N

G N

N T

N AAT MseI

AATTC N

TTAAG N

N TTA

N AAT

EcoRI

C 5’

A5’

AAC5’

AAC 5’

TTAA 5’

5’ TA

A. AFLP ANALYSIS

- digestão, ligação, PCRs

B. ELETROFORESE VERTICAL

- gel desnaturante de poliacrilamida (6%)

- 4h

C. GEL

- método radiativo: transferido para papel de filtro, secagem a vácuo (1h), exposição filme hipersensível 10 a 15 dias

- método coloração prata: solução fixadora, solução reveladora (1h)

AFLP Polimerização Montagem Transferência

Aplicação de Amostras

Detecção do polimorfismo

Coloração com prata

P32 ou P33

Fluorescência

AFLP

• Perfil AFLP contêm de 50 e 100 fragmentos amplificados (80-500 pb) provenientes de muitos sítios do genoma,

• Interpretado como marcador dominante

• Entretanto, usando scaner automáticos de gel, heterozigotos podem ser distinguidos de homozigotos pela intensidade do sinal.

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Substituições

• Transição

– purina purina

– pirimidina pirimidina

• Transversão

– purina pirimidina

– pirimidina purina

• Inserções/deleções

(Indel)

Polimorfismos resultantes da alteração de uma única

base no genoma

A G

T C

A ou G T ou C

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

• Co-dominante

Para que uma variação seja considerada SNP

deve ocorrer em pelo menos 1% da

população

http://www.siriusgenomics.com/technology/

SNPs – Identificação

• Sequenciamento direto

– amplificação por PCR e sequenciamento de

fragmentos genômicos e de regiões gênicas

equivalentes de vários indivíduos

• Análise eletrônica da variação de ponto banco

de dados

– sequências de projetos genomas

– bibliotecas de cDNA de diferentes indivíduos

(EST’s)

Diferentes estratégias para comparar regiões

específicas do DNA de diferentes indivíduos

SNPs – Sequenciamento direto

• Necessidade de desenho de

primers para amplificar

segmentos de DNA de 400-

700 pb

• Adiciona-se à extremidade

5’ extensões que irão

facilitar o pareamento dos

primers posteriormente

usados para o

sequenciamento do

fragmento amplificado

Considerações Finais

“Biotecnologia define-se pelo uso de

conhecimentos sobre os processos

biológicos e sobre as propriedades

dos seres vivos, com o fim de

resolver problemas e criar produtos

de utilidade“

Convenção sobre Diversidade Biológica da ONU

Muito obrigada pela atenção!

Agradecimentos pela concessão de material :

Dra Luciana Becchimol (IAC)

Dra Maria Imaculada Zucchi (APTA Piracicaba)

Dra Mariza Monteiro (CTC)

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