biossíntese, aplicabilidade e recentes avanços no estudo...
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
LUÍS FELIPE BOLDRIN
Biossíntese, Aplicabilidade e Recentes Avanços no Estudo da Celulose Bacteriana
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
Lorena
2015
LUÍS FELIPE BOLDRIN
Biossíntese, Aplicabilidade e Recentes Avanços no Estudo da Celulose Bacteriana
Trabalho de Graduação apresentado à Escola de Engenharia de Lorena, como requisito parcial para conclusão da Graduação no curso de Engenharia Bioquímica
Orientador: Professora Doutora Maria Bernadete de Medeiros
Lorena
2015
Luís Felipe Boldrin
Biossíntese, Aplicabilidade e Recentes avanços no estudo de celulose
bacteriana/ Luís Felipe Boldrin. – Lorena, 201521 p. : il. (algumas color.) ; 30
cm.
Orientador: Professora Doutora Maria Bernadete de Medeiros
Trabalho de Conclusão de Curso – UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
, 2015.
IMPORTANTE: ESSE É APENAS UM TEXTO DE EXEMPLO DE FICHA
CATALOGRÁFICA. VOCÊ DEVERÁ SOLICITAR UMA FICHA
CATALOGRÁFICA PARA SEU TRABALHO NA BILBIOTECA DA SUA
INSTITUIÇÃO (OU DEPARTAMENTO).
Luís Felipe Boldrin
Biossíntese, Aplicabilidade e Recentes Avanços no Estudo da Celulose Bacteriana
Professora Doutora Maria Bernadete de
Medeiros
Orientador
Professor
Convidado 1
Professor
Convidado 2
Lorena
2015
Á minha mãe e ao meu pai que sempre me incentivaram em todos os desafios da minha vida
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Roberto Boldrin Junior e Ana Lúcia de Aguiar Sarmento Boldrin não só
pelo amor e apoio incondicional durante toda a minha vida, mas por nunca negarem esforços
para que pudesse chegar aonde cheguei e me tornar o homem que sou hoje.
Aos meus irmãos Marcelo Boldrin e Alessandra Feio Silva Boldrin pela amizade,
cumplicidade e pelos ótimos momentos compartilhados que tornaram meu caminho muito mais
fácil.
Aos meus companheiros de república César Augusto Marzola, Caio Wojslaw Girelli,
Guilherme Wojslaw Girelli, Gustavo Pereira Zago, Vinícius Marzochi Pelajo, Tiago dos Santos
Castelfranchi, Tiago dos Santos Bueno, Pedro Henrique Macedo dos Santos, Carlos Matheus
da Silva Carreira, Matheus Ronconi e Guilherme Lira pela maravilhosa amizade, pelo apoio nos
momentos de alegria e dificuldade e por se tornarem minha segunda família.
À Prof Dra Maria Bernadete de Medeiros, razão da escolha do assunto deste trabalho,
por todo o ensinamento e orientação, não só durante a elaboração desta tese, mas também
durante todo o período de graduação.
À todos os professores e funcionários da Escola de Engenharia de Lorena que por meio
de seus esforços me ajudaram a concluir a graduação e a despertar meu senso crítico, meu lado
empreendedor, humano, autodidata e sonhador, moldando o profissional que sou hoje.
RESUMO
BOLDRIN, L.F. Biossíntese, Aplicabilidade e Recentes Avanços no Estudo da
Celulose Bacteriana. 2015. 50p. Monografia (Trabalho de Conclusão de Curso de
Graduação) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena,
2015.
A celulose é o biopolímero mais abundante no planeta e possui uma vasta gama de
aplicações em diferentes setores da indústria. Em tempos de preocupações com
preservação do meio ambiente e sustentabilidade é necessário pensar em uma
alternativa à este polímero que seja menos custosa em termos ambientais. Um
material que tem se mostrado muito promissor é a celulose bacteriana, que se
diferencia de seu semelhante vegetal principalmente por apresentar fibras de caráter
nanométrico contra o micrométrico da vegetal, o que lhe confere excelentes
propriedades mecânicas como maior pureza, maior cristalinidade, maior poder de
absorção de água e maior resistência à tração, além de um baixo grau de
polimerização e melhor adaptabilidade biológica. O microrganismo mais amplamente
utilizado na produção de celulose é a bactéria Gluconacetobacter xylinum. Diversos
estudos vêm sendo feitos na tentativa de se encontrar as melhores condições para
a produção do polímero bacteriano para que um dia sua produção em larga escala
possa suprir a demanda pela celulose vegetal. Muitos são os desafios na ampliação
da escala de produção, como altos custos de operação, falta de uma unidade de
medida de produtividade universal e alta variedade de microrganismos produtores
estudados. O presente trabalho visa apresentar aspectos relevantes na produção do
polímero pela bactéria bem como parâmetros importantes na fermentação. São
também apresentados diferentes biorreatores utilizados na síntese e aplicabilidades
atuais da celulose bacteriana na indústria.
Palavras-chave: celulose, celulose bacteriana, nanocompósitos, biorreatores,
Gluconacetobacter, biossíntese
ABSTRACT
BOLDRIN, L.F. Biosynthesis, Applicability and Recent Advances on the Study of
Bacterial Cellulose. 2015. 50p. Monografia (Trabalho de Conclusão de Curso de
Graduação) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena,
2015.
Cellulose is the most abundant polymer in the planet, and has a wide range of applications
in different industries. In times of concern with preserving the environment and
sustainability is necessary to think about an alternative to this polymer that is less costly
in environmental terms. A material that has been proven to be very promising is the
bacterial cellulose, which is different from the vegetable similar especially for presenting
nanometric character of fibers compared to the micrometric character of the vegetable-
produced polymer. This characteristic gives the Bacterial Cellulose excellent mechanical
properties such as higher purity, higher crystallinity, higher water absorption, higher
tensile strength, a low degree of polymerization and better biological adaptability. The
most widely used microorganism in cellulose production is the bacteria
Gluconacetobacter xylinum. Several studies have been made in an attempt to find the
best conditions for the production of the bacterial polymer so that one day the large-scale
production can surpass the demand for vegetable cellulose. There are many challenges
in the expansion of production scale, as high operating costs, lack of a universal measure
of productivity and high variety of studied microorganisms for production. This paper
presents relevant aspects in the production of the polymer by the bacteria as well as
important parameters in the fermentation. Different bioreactors used in the synthesis are
also presented along with current applicability of the bacterial cellulose in the industry.
Key-words: cellulose, bacterial cellulose, nanocomposites, bioreactors,
Gluconacetobacter, biosynthesis
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Esquema da via metabólica da celulose na G.xilinum. Fonte: Lee
(2014)..........................................................................................................................................16
Figura 2: Diagrama esquemático das regiões do operon responsável pela produção da
celulose bacteriana na G.xylinum. Fonte: Lee
(2014)..........................................................................................................................................19
Figura 3: Produção de microfibrilas de celulose por Gluconacetobacter xylinum. Fonte:
Chawla(2009)..............................................................................................................................24
Figura 4: Reator de mistura contínua utilizado na produção de CB. Fonte: Donini
(2010)..........................................................................................................................................27
Figura 5: Funcionamento de um biorreator airlift padrão. Fonte: Donini
(2010)..........................................................................................................................................28
Figura 6: Esquema de funcionamento de um biorreator de aerossol. Fonte: Lee
(2014)..........................................................................................................................................30
Figura 7: Comparação entre tratamentos posteriores à produção de celulose vegetal e
bacteriana. Fonte: Chawla(2009)................................................................................................36
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Comparativo entre diferentes fontes de carbono, suplementação e tempo de
cultura e seus respectivos rendimentos na produção de celulose bacteriana. Fonte: Chawla
(2009)..........................................................................................................................................16
Tabela 2: Produtividade (g/L.h) de diferentes bactérias em diferentes configurações do
processo fermentativo. Fonte: Lee(2014)....................................................................................34
Tabela 3: Compósitos de celulose bacteriana e suas áreas de atuação. Fonte:
(ESA; TASIRIN; RAHMAN, 2014)................................................................................................35
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 13
2. METODOLOGIA ..................................................................................................... 15
2.1 METODOLOGIA DE LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO .............................. 15
2.2 METODOLOGIA DE PESQUISA ...................................................................... 15
2.3 METODOLOGIA DE ANÁLISE ......................................................................... 15
3. DESENVOLVIMENTO ............................................................................................ 16
3.1 VIA METABÓLICA DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE CELULOSE ............ 16
3.2 ASPECTOS GENÉTICOS DA PRODUÇÃO DE CELULOSE POR
GLUCONACETOBACTER ..................................................................................... 19
3.3 COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA ......................................................... 21
3.4 PARÂMETROS DETERMINANTES NA PRODUÇÃO DE CELULOSE
BACTERIANA ......................................................................................................... 23
3.4.1 INFLUÊNCIA DO PH NA PRODUÇÃO DE CB ....................................... 24
3.4.2 INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA PRODUÇÃO DE CB ................. 24
3.4.3 INFLUÊNCIA DO OXIGÊNIO NA PRODUÇÃO DE CB .......................... 24
3.5 ESTRUTURA DA CELULOSE BACTERIANA .................................................. 25
3.6 BIORREATORES NA PRODUÇÃO DE CELULOSE BACTERIANA ................ 26
3.6.1 REATORES DE MISTURA CONTÍNUA (CSTR) ..................................... 28
3.6.2 BIORREATORES AIRLIFT ...................................................................... 29
3.6.3 BIORREATOR DE AEROSSOL .............................................................. 31
3.6.4 BIORREATOR ROTATIVO ...................................................................... 32
3.6.5 BIORREATOR DE MEMBRANA ............................................................. 33
3.7 DIFICULDADES NA PRODUÇÃO EM ESCALA INDUSTRIAL DE CB ............ 33
3.8 COMPÓSITOS DE CELULOSE BACTERIANA ................................................ 36
3.9 RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO ................................................................. 37
4. CONCLUSÃO ......................................................................................................... 42
5. REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 44
13
1. INTRODUÇÃO
A Celulose é o biopolímero mais abundante no mundo, com uma produção anual
estimada em 1014 toneladas (DONINI et al., 2010). De grande importância tecnológica,
pode ser encontrada em diversas formas de vida, como plantas vasculares, fungos,
protozoários e procariontes (DONINI et al., 2010). Em relação a sua estrutura, a celulose
é constituída de unidades de β-D-glicopiranose unidas por ligações glicosídicas β-(1-4)
em que as unidades monoméricas estão dispostas de maneira em que uma molécula
esteja rotacionada 180⁰ em relação a outra (MOHITE; PATIL, 2014). A demanda
crescente de produtos oriundos da celulose, seja para fins industriais ou biomédicos tem
levado a problemas de origem ecológica que levam à necessidade da substituição da
produção deste polímero para uma alternativa mais sustentável (MATHUR et al., 2015).
Pesquisas recentes apontam a celulose bacteriana (CB) como um biopolímero
bastante promissor como alternativa a produção tradicional de celulose (MATHUR et al.,
2015). A celulose bacteriana se diferencia de seu semelhante vegetal principalmente por
apresentar fibras de caráter nanométrico contra o micrométrico da vegeta l(DONINI et
al., 2010), o que lhe confere excelentes propriedades mecânicas como maior pureza,
maior cristalinidade, maior poder de absorção de água e maior resistência à tração, além
de um baixo grau de polimerização e melhor adaptabilidade biológica (CZAJA et al.,
2007; TORRES; COMMEAUX; TRONCOSO, 2012).Tais características marcantes
tornam a CB um biopolímero altamente versátil utilizado em diferentes setores
economicamente importantes como produção de papel, síntese de membranas
compósitas, indústria alimentícia, farmacêutica e principalmente a biomedicina
(MOHITE; PATIL, 2014; RAJWADE; PAKNIKAR; KUMBHAR, 2015).
São encontrados na literatura diversos micro-organismos produtores de celulose
pertencentes aos gêneros Gluconacetobacter (renomeado como Komagataeibacter),
Acanthamoeba, Achromobacter, Zooglea, Agrobacterium, Aerobacter, Azotobacter,
Rhizobium, Sarcina, Salmonella, Escherichia, Pseudomonas, Alcaligenes, dentre outros
(JUNG et al., 2007; LEE et al., 2014; ROSS; MAYER; BENZIMAN, 1991). Dentre todos
os micro-organismos produtores de celulose, o mais amplamente estudado é a espécie
Gluconacetobacter xylinum (RAJWADE; PAKNIKAR; KUMBHAR, 2015), um bacilo
aeróbio estrito, não patogênico e Gram-negativo. Análises de rendimentos de espécies
14
do gênero Gluconacetobacter indicam valores de 1,0 a 4,0% (m/v) de CB em relação ao
meio fermentativo (MATHUR et al., 2015). A capacidade produtiva está intimamente
ligada aos parâmetros do bioprocesso, de modo que uma quantidade cada vez maior de
artigos tem sido elaborados na tentativa de explorar variáveis como fontes de carbono
(MATHUR et al., 2015; MOHAMMADKAZEMI; AZIN; ASHORI, 2015), agitação do meio
de cultura (LEE et al., 2014), pH, temperatura e efeitos de fontes de nitrogênio e fósforo
(GOMES et al., 2013; MATHUR et al., 2015).
A Celulose bacteriana desempenha papel de grande importância para a bactéria
funcionando como mecanismo de flotação, permitindo ao micro-organismo permanecer
em uma interface ar/líquido para obter oxigênio com maior facilidade para seu
crescimento além de prevenir a desidratação do substrato devido seu caráter
higroscópico (DONINI et al., 2010). O biofilme de celulose formado também dificulta o
acesso ao substrato por organismos não produtores do polímero, ocasionando uma
vantagem competitiva em um meio escasso, i.e., frutas deterioradas, habitat natural da
G.xylinum (RAJWADE; PAKNIKAR; KUMBHAR, 2015). A película de celulose também
funciona como barreira à radiação UV devido ao seu caráter opaco, ajuda a promover
adesão celular durante interações simbióticas, protege o micro-organismo de metais
pesados e melhora o transporte de nutrientes por difusão (IGUCHI; YAMANAKA;
BUDHIONO, 2000).
Gluconacetobacter xylinum tem sido o organismo modelo para o estudo da
biossíntese de celulose. O processo de síntese é complexo e composto de três etapas:
polimerização dos resíduos de glicose em cadeias 1-4-glucana, secreção extracelular
das cadeias e cristalização das cadeias de glucana por meio de ligações de hidrogênio
e forças de Van der Walls (DONINI et al., 2010). Neste projeto, a bioquímica do processo
bem como as etapas de secreção e cristalização serão abordadas detalhadamente.
O presente trabalho visa trazer uma compilação do que existe de mais recente
nas pesquisas relacionadas à celulose bacteriana, abordando desde a produção do
biopolímero pelo micro-organismo até ás inúmeras aplicações do produto e de seus
compósitos. Por fim, serão feitas considerações sobre a situação da produção atual e
sobre a viabilidade econômica de uma produção em ampla escala que possa atender à
demanda de celulose
15
2. METODOLOGIA
2.1 METODOLOGIA DE LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO
O levantamento bibliográfico deste trabalho foi realizado por meio de plataformas
de busca em bases de dados acadêmicos e científicos Science Direct, Wiley, Elsevier,
SciELO e Google Acadêmico. Apenas algumas definições e termos foram pesquisados
na base convencional do Google.
As palavras-chave utilizadas nas pesquisas, todas realizadas em inglês, foram
cellulose (celulose), bacterial cellulose (celulose bacteriana), nanocomposites
(nanocompósitos), biorreactors (biorreatores), Gluconacetobacter, biosynthesis
(biossíntese). Foram lidos os resumos e as introduções de todos os artigos, reviews e
livros utilizados. Os mais relevantes ao trabalho foram separados e os que mais seguiam
a perspectiva e o propósito deste projeto foram utilizados na elaboração do mesmo.
2.2 METODOLOGIA DE PESQUISA
Neste trabalho, o estudo empregado foi de caráter exploratório, descritivo e
comparativo, realizado por meio de pesquisa bibliográfica e da utilização de dados
secundários vindos de publicações científicas e industriais sobre a celulose.
2.3 METODOLOGIA DE ANÁLISE
As análises feitas foram primeiramente de caráter teórico, que tinham por objetivo
apresentar o conceito de celulose bacteriana e compará-la à celulose vegetal
convencional tanto em termos químicos e estruturais como também comerciais. A
importância de se focar na produção do polímero microbiano, bem como nas
possibilidades comerciais do mesmo.
Posteriormente, foi feita uma pesquisa do que vem sendo feito na indústria e em
estudos acadêmicos na tentativa de aumentar a produção do polímero de modo que sua
exploração seja economicamente viável e que possa um dia talvez substituir a celulose
vegetal no uso industrial, o que traria ganhos ambientais altamente relevantes.
16
3. DESENVOLVIMENTO
3.1 VIA METABÓLICA DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE CELULOSE
Dentre todos os microrganismos encontrados na literatura capazes de produzir
celulose bacteriana, o mais utilizado e usado como modelo de produção é a bactéria
Gluconacetobacter xylinum (EL-SAIED et al., 2008) devido à sua capacidade de produzir
celulose na presença de diferentes fontes de carbono e nitrogênio(LEE et al., 2014).
Czaja et al (CZAJA et al., 2006) encontraram um resultado de 15,3g/L após 50hrs de
fermentação, é o melhor resultado encontrado na literatura. Este bacilo aeróbio estrito e
Gram negativo pode ser encontrado na natureza em frutas, vegetais e em produtos
fermentados junto com outros microrganismos tais como leveduras, fungos e outras
bactérias (NEERA; RAMANA; BATRA, 2015). Outras espécies Gram negativas como
Agrobacterium, Aerobacter, Sarcina, Rhizobium e Salmonella e algumas bactérias Gram
positivas, como Gluconacetobacter hansenii também apresentaram produção de
celulose. O rendimento de algumas espécies produtoras de CB se encontra na Tabela
1.
17
Tabela 1: Comparativo entre diferentes fontes de carbono, suplementação e tempo de
cultura e seus respectivos rendimentos na produção de celulose bacteriana. Fonte:
Chawla (2009)
Em seu review, Lee et al(LEE et al., 2014) faz uma explicação bem detalhada da
via metabólica das bactérias produtoras de celulose. G.xylinum pode operar tanto no
ciclo das pentoses fosfato como no ciclo de Krebs, dependendo do estado fisiológico da
célula juntamente com a gliconeogênese. O ciclo das pentoses envolve a oxidação de
carboidratos, ao passo que o ciclo de Krebs envolve a oxidação de carboidratos
derivados de acetatos, gorduras e proteínas como oxalosuccinato e α-ketoglutarato
(DONINI et al., 2010; LEE et al., 2014). G.xylinum não é capaz de metabolizar a glicose
anaerobicamente pois não possui a enzima fosfofrutoquinase-1, requerida na via
glicolítica para a catálise da reação da fosforilação da frutose-6-fosfato a frutose-1,6-
difosfato, e por esse motivo, a síntese da celulose nessa bactéria é produto de um pool
metabólico de hexoses fosfato sustentado diretamente pela fosforilação de hexoses
exógenas e indiretamente pela via das pentoses e gliconeogênese (DONINI et al., 2010)
Bactéria Fonte de Carbono
Suplementação Tempo de cultura
(hrs) Rendimento
(g/L)
G.xylinum BRC 5 Glicose Etanol + Oxigênio 50 15.30
G. hansenii Glicose Oxigênio 48 1.72
G. hansenii Glicose Etanol 72 2.50
Acetobacter sp. V6 Glicose Etanol 192 4.16
Acetobacter sp. A9 Glicose Etanol 192 15.20 G. xylinum BPR2001 Melaço 72 7.82 G. xylinum BPR2001 Frutose Ágar e Oxigênio 72 14.10 G. xylinum BPR2001 Frutose Ágar 56 12.00 G. xylinum ssp. Sucrofermentans BPR2001 Frutose Oxigênio 52 10.40 G. xylinum ssp. Sucrofermentans BPR2001 Frutose Ágar e Oxigênio 44 8.70 G. xylinum E25 Flucose 168 3.50 G. xylinum K3 Manitol Chá Verde 168 3.34 G. xylinum IFO 13773 Glicose Lignosulfato 168 10.10
G. xylinum NUST4.1 Glicose Alginato de
Sódio 120 6.00 G.xylinum IFO 13773 Melaço 168 5.76 Gluconacetobacter sp RKY5 Glicerol 144 5.63
18
envolvendo reações de diversas etapas e a ação de enzimas individuais, complexos
catalíticos e proteínas regulatórias. Quando a fonte de carbono é a glicose, a via
metabólica possui quatro processos enzimáticos chave como mostrado na Figura 1. São
eles:
Figura 1: Esquema da via metabólica da celulose na G.xilinum. Fonte: Lee (2014)
i. Fosforilação da glicose pela enzima glucoquinase;
ii. Isomerização da glicose-6-fosfato (Glc-6-P) para glicose-1-fosfato (Glc-1-P)
pela fosfoglucomutase;
iii. Síntese de UDP-glicose (UDPGlc) pela UDPG-pirofosforilase (UGPase);
iv. Reação da celulose sintase.
UDPGlc, o precursor direto da celulose, é um composto comum a muitos
organismos. A enzima UGPase é de grande importância no processo de síntese da CB,
pois é aproximadamente 100 vezes mais ativa em organismos produtores de celulose do
que não produtores (VALLA et al., 1989). Em casos em que a fonte de carbono utilizado
é um dissacarídeo como maltose ou frutose, a via metabólica de síntese da celulose
19
começa pela hidrólise desses compostos em monossacarídeos como frutose e glicose
(LEE et al., 2014).
O composto ácido cíclico diguanílico (c-di-GMP) possui papel crucial na rota
sintética, funcionando como um ativador alostérico para a ação da celulose sintase, que
sem este composto, tem sua capacidade enzimática diminuída ou pode permanecer
inativa (VALLA et al., 1989).
Nos microrganismos, a celulose é sintetizada em duas etapas intermediárias: i) a
formação das cadeias de 1,4-β-glicano e ii) a montagem e a cristalização das cadeias de
celulose. A etapa ii) é a etapa limitante do processo (BROWN; SAXENA, 2000). O
processo de formação das cadeias de celulose ocorre entre as membranas externas e
citoplasmática das células. As moléculas de CB são sintetizadas dentro da bactéria, e
são extrusadas para o meio externo por meio de componentes exportadores de celulose
para formar protofibrilas de aproximadamente 2-4nm de diâmetro (IGUCHI; YAMANAKA;
BUDHIONO, 2000), que formarão microfibrilas em formato de fibras de
aproximadamente 80nm. O Processe da síntese de CB é bastante oneroso para a célula,
10% do ATP formado no metabolismo bacteriano é utilizado na síntese do biopolímero
(DONINI et al., 2010).
A enzima celulose sintase é a responsável por catalisar a reação de polimerização
das moléculas de glicose formando as cadeias de 1,4-β-glicano. Lee et al (LEE et al.,
2014) explicam que este processo de reação de polimerização ainda não é totalmente
compreendido pelos pesquisadores. Uma possível hipótese, é que a polimerização 1,4-
β-glicano contém um intermediário lipídico onde a molécula de glicose é transferida
primeiramente da UDPGlc para um molécula de lipídeo na membrana plasmática
formado um intermediário gluco-lipídico por meio da glicosiltransferase (VALERA et al.,
2014).
3.2 ASPECTOS GENÉTICOS DA PRODUÇÃO DE CELULOSE POR
GLUCONACETOBACTER
Lee et al (LEE et al., 2014) faz um brilhante trabalho em seu review, elucidando
os papéis dos genes envolvidos na produção da celulose. A celulose bacteriana é
20
produzida pelo operon responsável pela síntese na bactéria. Operon é uma unidade
genômica funcional do DNA que contém múltiplos genes (LEE et al., 2014). O operon da
síntese da celulose na Gluconacetobacter (acsABCD) e o operon da síntese de celulose
bacteriana (bcsABCD) são duas unidades funcionais homólogas que codificam as
proteínas essenciais na síntese do biopolímero na G.xylinum ATCC 53582 e 1306-3
respectivamente (LEE et al., 2014). As subunidades presentes na celulose sintase
podem ser três (acsAB, acsC e acsD) ou quatro (bcsA, bcsB, bcsC e bcsD) e
desempenham funções diferentes na síntese da CB. O gene bcsA, o primeiro gene do
operon bcsABCD codifica a subunidade catalítica da celulose sintase e se liga à UDPGlc.
O gene bcsB, o segundo, codifica a subunidade regulatória da celulose sintase que se
liga à proteína c-di-GMP, além de realizar um papel importante de mensageiro e ativar o
processo de síntese da celulose. Os genes acsA e acsB codificam um polipeptídeo que
possui ambas regiões responsáveis pela ligação ao substrato e pela ligação ao sítio
ativador. Os genes acsC/bcsC e acsD/bcsD ainda não possuem sua função
completamente compreendida, mas o fato dos genes acsC e bcsC codificarem proteínas
similares àquelas presentes em canais de membrana e na formação de poros, acredita-
se que seus papeis estejam relacionados à formação de poros para o transporte do
polímero para fora da célula. Estudos realizados sobre a influência dos genes na
produção da celulose (BROWN; SAXENA, 2000; SAXENA et al., 1994), mostraram que
a inativação dos genes acsA, acsB e ascC levaram à total da síntese de CB, ao passo
que a supressão de acsD levou à uma diminuição de 40% na produção, o que indica que
o papel deste gene está relacionado à cristalização das nanofibrilas de celulose.
A região montante do operon possui dois genes: cmcax e ccpAx respectivamente
como mostra a Figura 2. G. Kawano et al (KAWANO et al., 2002a) sugeriram que a
proteína CMCax, codificada pelo gene cmcax influencia na organização das tiras de
celulose. Outra proteína presente no operon é a CcpAx, que possui papel essencial na
produção e no aumento da produtividade de CB, porém, não se sabe ao certo
exatamente qual o papel da proteína. Sunagawa et al (SUNAGAWA et al., 2013)mostrou
que CcpAx possui um papel de extrema importância na localização dos complexos que
que sintetizam a celulose, o que poderia significar que esta proteína poderia funcionar
como um mediador em interações proteína-proteína.
21
A região jusante do operon contém o gene bglxA, que codifica a enzima β-
glucosidase, que hidroliza mais do que três unidades de β-1,4-glicose. Observou-se que
a ruptura do gene bglxA leva à diminuição da produção de CB (KAWANO et al., 2002b,
2008).
Figura 2: Diagrama esquemático das regiões do operon responsável pela produção da
celulose bacteriana na G.xylinum. Fonte: Lee (2014)
3.3 COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA
No geral, a fonte de carbono utilizada na produção de celulose por G.xylinum é a
glicose, no entanto, por ser uma bactéria capaz de processar uma grande variedade de
fontes de carbono como monossacarídeos, oligossacarídeos, amido álcool e ácidos
orgânicos (HESTRIN; SCHRAMM, 1954), diversas pesquisas vêm sendo feitas de modo
a estudar a possibilidade de utilizar resíduos de diferentes indústrias como fontes de
açúcar para produção de celulose bacteriana pela G.xylinum. Como exemplos de tais
22
estudos podemos citar pesquisas sobre a viabilidade da utilização de glicerol residual da
produção de biodiesel; utilização de bagaço de uva, subproduto da produção de vinhos;
milhocina (CASTRO et al., 2011; MOOSAVI-NASAB; YOUSEFI, 2011; VAZQUEZ et al.,
2013) e outros exemplos descritos por Jozala.et.al (JOZALA et al., 2014). O rendimento
da produção de celulose pela bactéria varia em relação ao açúcar utilizado. Estudos
mostraram que frutose e glicerol apresentaram rendimentos similares ao obtido
utilizando-se glicose (MASAOKA; OHE; SAKOTA, 1993) ao passo que ao estudar D-
Arabitol como fonte de carbono, observou-se que o rendimento foi 6 vezes maior do que
o encontrado utilizando glicose (KURODA, 1995).
Tais pesquisas que visam a descoberta de fontes de carbono alternativas e de
baixo custo que sirvam de substrato para G.xylinum são de extrema importância para a
viabilidade da produção de celulose bacteriana em uma escala significativa que permita
a substituição da celulose vegetal pelo biopolímero bacteriano. Estudos indicam que o
custo de produção associado ao substrato em processos fermentativos referentes à
produção de CB são responsáveis por até 65% do custo total de produção (TSOUKO et
al., 2015)(JOZALA et al., 2014). Assim, se encontrados meios de utilizar resíduos de
indústrias de grande porte para a produção de celulose bacteriana, os ganhos serão
consideráveis, visto que além de possibilitar a produção em larga escala e redução de
custo do biopolímero, há ainda o ganho de se aproveitar subprodutos de indústrias de
alto potencial poluidor, e.g laticínios (DE ARAUZ et al., 2009).
Keshk et.al (KESHK, 2014) documenta alguns estudos que fizeram uso de aditivos
no caldo de fermentação na tentativa de aumentar o rendimento na produção de CB. Em
seu review Keshk cita o estudo de Delmer(DELMER, 1999) em que ao se adicionar uma
pequena quantidade de complexo de celulase (contendo endoglucanase,
exocelobioglucosidase e β-glucosidase) no meio fermentativo, a produção de celulose
foi aumentada. Tonouichi et.al (NAOTO TONOUCHI, NAOKI TAHARA, TAKAYASU
TSUCHIDA, FUMIHIRO YOSHINAGA, TERUHIKO BEPPU, 1995) posteriormente
analisaram a produção de celulose por cepas de G.xylinum que possuíam apenas uma
espécie de β 1-4 endogluconase capaz de se ligar a moléculas de celulose, embora
desprovidas de atividade enzimática na tentativa de descobrir o papel da capacidade de
ligação às moléculas de celulose na produtividade, e descobriram que é a atividade da
23
enzima em si, não sua capacidade de se ligar à celulose a responsável pelo aumento na
produção de CB.
Na literatura encontra-se uma quantidade considerável de estudos que avaliam a
influência de parâmetros referentes ao meio de cultura na produção de CB pela
G.xylinum, como composição do meio (GOMES et al., 2013; HUANG et al., 2015),
aeração e agitação (JUNG; PARK; CHANG, 2005; PEITLER et al., 2015). Alguns
pesquisadores focaram no estudo da influência de diferentes tratamentos após a síntese
pela bactéria (GEORGE et al., 2005), outros focaram na produtividade de diferentes
espécies de microrganismos (JUNG et al., 2007; LEE et al., 2014), mas poucos estudos
foram feitos em relação à possibilidade de utilizar a engenharia genética para melhorar
o rendimento da produção de celulose pela bactéria. Um dos poucos exemplos
encontrados foi o estudo feito por Chien et.al (CHIEN et al., 2006) em que o grupo buscou
expressar a hemoglobina de uma bactéria Vitreoscilla em Gluconacetobacter xylinum na
tentativa de aumentar o crescimento celular em um meio agitado contendo celulase. O
resultado foi que não apenas a velocidade de crescimento celular aumentou em 50%
como também a produção de celulose pelos organismos recombinantes foi de 11g/L
enquanto a produção por G.xylinum sem o gene expresso foi de 6g/L. Os Resultados
encontrados por Chien et al sugerem que a engenharia genética pode ser uma área
interessante para a viabilização da produção de CB em larga escala.
3.4 PARÂMETROS DETERMINANTES NA PRODUÇÃO DE CELULOSE
BACTERIANA
Os parâmetros operacionais são determinantes na produção do polímero
bacteriano, então uma atenção especial deve ser dada á temperatura, ao pH e ao
oxigênio dissolvido no meio, pois microrganismos tendem a responder rapidamente à
esses parâmetros no que diz respeito à indução ou à repressão de atividade proteica e
mudanças na morfologia celular
24
3.4.1 INFLUÊNCIA DO PH NA PRODUÇÃO DE CB
O pH ótimo para a produção da celulose bacteriana é dependente do
microrganismo e de qual cepa especificamente será utilizada. Na literatura há um
consenso de que normalmente o melhor valor a se utilizar está entre 4 e 7. Encontram-
se estudos que variaram o pH do meio de 4,5 à 7,5, e o valor que levou à maior produção
de CB foi 6,5 como explicitado por Son et al (HONG-JOO SON , MOON-SU HEO, 2001).
Porém, industrialmente, além da atenção dada à produtividade, empresas que fabricam
o polímero para razões biomédicas trabalham com valores de pH entre 4 e 4, 5 à fim de
evitar contaminação do meio durante o cultivo (JONAS; FARAH, 1998). É importante
salientar que a adição de um tampão para evitar o abaixamento do pH durante o
processo fermentativo é necessária para se alcançar o maior rendimento possível,
devido à produção de metabólitos de caráter ácido, como os ácidos glucônico, láctico e
acético que podem levar à oscilações indesejáveis de pH.
3.4.2 INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA PRODUÇÃO DE CB
Son et al (HONG-JOO SON , MOON-SU HEO, 2001), estudou o efeito da
temperatura na produtividade da bactéria Acetobacter sp. A9 para valores entre 20⁰C e
40⁰C. O melhor valor encontrado pelo grupo foi de 30⁰C. A temperatura afeta não só a
produtividade, como também a morfologia e a estrutura cristalina do polímero final. Hirai
et al (HIRAI; TSUJI; HORII, 1997) mostraram que a CB produzida pela bactéria A.xylinum
ATCC 23769 em meio HS à 4⁰C era formada por bandas de celulose II, ao passo que o
polímero produzido em 28⁰C levou à uma morfologia formada por tiras de celulose I
3.4.3 INFLUÊNCIA DO OXIGÊNIO NA PRODUÇÃO DE CB
O Oxigênio dissolvido no meio de cultura é essencial para o metabolismo celular
e não é importante apenas no rendimento, mas também na qualidade do polímero final
(SHIRAI et al., 1994).Uma atenção especial é necessária, porém ao fato de que elevadas
taxas de oxigênio dissolvido podem aumentar a concentração de ácido glucônico, o que
pode inviabilizar a célula e reduzir o rendimento de CB. Baixas concentrações por outro
lado impedem o crescimento bacteriano e a produção de biopolímero.
25
3.5 ESTRUTURA DA CELULOSE BACTERIANA
Polissacarídeos, são macromoléculas que podem ser categorizadas dependendo
de sua localização. Podem ser polissacarídeos intracelulares quando localizados dentro
da membrana citoplasmática; polissacarídeos de parede celular, quando fazem parte da
estrutura da parede; e polissacarídeos extracelulares (exopolissacarídeos), quando
estão localizados externamente à parede das células. Exopolissacarídeos, como a
celulose bacteriana, encontram diversas aplicações em diferentes tipos de industrias,
como alimentícia, farmacêutica, têxtil e biomédica (CHAWLA et al., 2009).
A celulose vegetal, embora seja um polímero amplamente utilizado
industrialmente, possui a desvantagem de estar associada a outros compostos como
lignina, pectina e hemicelulose que prejudicam sua utilização em fins industriais. Por
outro lado, a celulose bacteriana é produzida sem a presença de outros compostos
presentes na celulose complexa (KESHK, 2014), um fator que demonstra o amplo
potencial econômico deste biopolímero.
O polímero linear da celulose é fortemente associado devido às ligações de
hidrogênio. A formação das fibras do polímero ocorre devido às interações
intermoleculares geradas entre as cadeias, e as interações intramoleculares por sua vez
garantem a rigidez da estrutura. A fórmula molecular da CB é a mesma da celulose
vegetal, porém, suas propriedades físicas e químicas são diferentes (YOSHINAGA;
TONOUCHI, [s.d.]). O polímero microbiano leva vantagem sobre o vegetal pois pode ser
obtido com maior pureza, por possuir maiores graus de polimerização e cristalinidade,
maior força de tensão e maior capacidade de armazenamento de água (CHAWLA et al.,
2009). As fibrilas de celulose bacteriana são aproximadamente 100 vezes mais finas do
que a celulose oriunda de plantas (CHAWLA et al., 2009), o que a torna um material
altamente poroso com capacidade para ser utilizado no tratamento de feridas, por atuar
como barreira física e por permitir a transferência de antibióticas e outras substâncias
até o ferimento.
Gluconacetobacter xylinum produz dois tipos de celulose: A celulose I e a forma
termodinamicamente mais estável do polímero, a celulose II. As diferenças no processo
de formação dos dois isômeros pela bactéria na região externa à membrana
citoplasmática são retratadas na Figura 3. A estrutura das microfibrilas é responsável
26
pela maioria de suas propriedades mecânicas, como maior força de tensão, alto grau de
polimerização e grau de cristalinidade (CHAWLA et al., 2009). O processo produtivo da
celulose pela bactéria ocorre em três estágios: Primeiramente, as moléculas de D-glicose
são polimerizadas (formação das ligações glicosídicas β-1,4) entre as membranas
externa e citoplasmática formando cadeias de celulose. Aproximadamente, de 10 a 15
cadeias paralelas formarão uma protofibrila de 1,5nm de largura. No segundo estágio do
processo, diversas protofibrilas são agregadas em microfibrilas de 2 - 4nm de largura, e
no terceiro estágio, uma gama da de microfibrilas são agregadas em tiras de 20 – 100nm
de largura (CASTRO et al., 2011). A película de CB é o resultado de uma matriz destas
tiras interligadas. A celulose formada possui diversos grupos hidroxila dispostos em sua
superfície, o que explica sua biodegradabilidade, hidrofilicidade e sua alta capacidade de
modificação química para diversas aplicações industriais.
Figura 3: Produção de microfibrilas de celulose por Gluconacetobacter xylinum. Fonte:
Chawla (2009)
3.6 BIORREATORES NA PRODUÇÃO DE CELULOSE BACTERIANA
Uma outra abordagem que vêm sendo estudada no sentido de aumentar a
produção de celulose bacteriana de modo à viabiliza-la industrialmente é estudar a
27
influência do meio de cultivo. A formação da membrana de CB ocorre não apenas em
cultivos estáticos, mas também em cultivos agitados, como biorreatores ou frascos com
agitação (DONINI et al., 2010). A estrutura do filme formado varia conforme o meio. Em
reatores agitados, o filme de CB se apresenta na forma de grânulos e mechas fibrosas,
ao passo que em culturas estáticas a CB é sintetizada na forma de um a película
gelatinosa na superfície (KESHK, 2014).
O crescimento das bactérias produtoras de celulose e a produção do polímero são
baixos em meios estáticos mesmo nos meios de cultura mais favoráveis. O período de
cultivo pode variar de 10 dias à 6 semanas dependendo da cepa utilizada (DUDMAN,
1960). Uma das possíveis causas para a baixa taxa de crescimento bacteriano é a
dificuldade na transferência de oxigênio e de nutrientes para o interior da película. O
rendimento típico na produção de CB em meios estáticos é de 5g/L após 27 dias de
cultivo (LEE et al., 2014).
O advento das pesquisas que estudam a produtividade de CB em meios agitados
surgiu da necessidade de diminuir este longo tempo necessário para a produção em
culturas estáticas. Dudman et.al mostra que o tempo de 3 – 4 semanas normalmente
necessário para a produção em culturas estáticas é reduzido para 2 – 4 dias em culturas
agitadas e a estrutura química da celulose em ambos os casos é exatamente a mesma
(DUDMAN, 1960). Em 4 dias, foi observado um rendimento de 2,5g/L. A taxa de
crescimento bacteriano também foi significativamente maior, embora o rendimento tenha
sido menor do que o conseguido em condições estáticas. Isto é explicado devido ao fato
de a agitação ter a desvantagem de promover a mutação das cepas produtoras de
celulose em mutantes não produtores (ENGINEERING, 2007). Na tentativa de produzir
celulose bacteriana de uma maneira viável economicamente, novos biorreatores vêm
sendo utilizados de forma a aumentar a taxa de crescimento e produtividade bacteriana
ao mesmo tempo em que tenta-se evitar ao máximo a mutação das cepas produtoras e
principalmente diminuir o custo da produção. A seguir serão citados alguns biorreatores
que vem sendo estudados no aumento de escala da produção de CB.
28
3.6.1 REATORES DE MISTURA CONTÍNUA (CSTR)
Reatores agitados além de levarem ao problema de mutação de cepas
anteriormente mencionado, também sofrem com o problema de aumento de viscosidade
do meio de cultura devido ao acumulo de CB (CHAWLA et al., 2009). Isso leva a uma
não-homogeneidade no meio de cultura, o que reduz a transferência de oxigênio para o
meio de cultura (LEE et al., 2014). O problema da não-homogeneidade do meio pode ser
remediado com o uso de um reator de mistura contínua. Kouda et al (KOUDA; YANO;
YOSHINAGA, 1996) estudaram o comportamento do meio de cultura durante a mistura
do meio de cultura em um reator CSTR. O grupo percebeu que o comportamento do
meio se tornava não-newtoniano e sua viscosidade diminuía com o aumento da tensão
cisalhante. Foi constatado também que a velocidade de agitação é determinante no
rendimento de celulose. O grupo mostrou que utilizando agitação de 1200rpm foi obtido
18g/L de CB em 45hrs, ao passo que 13g/L e 5g/L foram obtidos após 70hrs quando
utilizados rotações de 800 e 600rpm respectivamente. Isso demonstra que o crescimento
na produtividade do biopolímero está diretamente relacionada com o aumento da taxa
de transferência de oxigênio resultante do aumento na velocidade de agitação.
É importante salientar, porém, que culturas submersas como as discutidas aqui
ainda sofrem com o problema de mutação de cepas produtoras para cepas não
produtoras. A Figura 4 mostra um exemplo de configuração de um biorreator de mistura
contínua utilizado na produção de celulose.
29
Figura 4: Reator de mistura contínua utilizado na produção de CB. Fonte: Donini
(2010)
3.6.2 BIORREATORES AIRLIFT
Biorreatores airlift são amplamente utilizados na indústria em processos
bioquímicos devido ao seu design simples e de fácil manutenção, porém, tais reatores
não podem ser utilizados em fermentações que envolvam meios viscosos (LEE et al.,
2014). Chao et al (CHAO et al., 1997) utilizou um reator tipo airlift com loop interno na
tentativa de produzir CB. A concentração obtida foi baixa, apenas 2,3g/L passadas 28hrs
de fermentação. Esse baixo rendimento foi atribuído à baixa quantidade de oxigênio
dissolvido no meio de cultura, o que foi comprovado posteriormente quando ar rico em
oxigênio foi utilizado no processo e um rendimento de 5,63g/L foi obtido após 28hrs. Lee
et al (LEE et al., 2014) constata que estudos semelhantes foram feitos utilizando o
mesmo reator e foi observado que o acúmulo de CB no meio poderia acarretar em uma
diminuição na quantidade de oxigênio dissolvido no meio de cultura (CHAO; SUGANO;
SHODA, 2001). A constante de velocidade de transferência de oxigênio kLa na
suspensão de celulose apresentou decréscimo quando comparada à água (CHAO et al.,
30
2000). Para a água, o valor de kLa é 150 h-1, e quando concentrações de celulose
bacteriana de 0,25 e 0,5 %m/m em água foram estudadas, foram encontrados
respectivamente valores de kLa 90 e 40 h-1. A título de comparação, com 1% m/m de CB
em um reator de mistura convencional, o valor de kLa é de 80 h-1.
Um dos parâmetros mais importantes no estudo da viabilidade da produção
industrial é o custo de operação. Chao et al (CHAO et al., 2000) estudou o consumo
energético necessário para produzir 1g/L do biopolímero em um reator de mistura e em
um reator airlift. O grupo encontrou que o consumo necessário para o CSTR foi de 0,663
kWh ao passo que para o reator airlift com ar rico em oxigênio, o consumo foi de
0,126kWh. A Figura 5 mostra um exemplo de reator airlift utilizado na produção de
celulose por bactérias.
Figura 5: Funcionamento de um biorreator airlift padrão. Fonte: Donini (2010)
Lee et al (LEE et al., 2014) menciona em seu review alguns estudos que vêm
sendo feitos na tentativa de melhorar a produtividade em biorreatores airlift. Uma das
alternativas seria diminuir o tamanho das bolhas de oxigênio formadas no reator,
aumentando assim a proporção entre área e volume, a, no termo kLa, favorecendo assim
a aeração do sistema. Outra alternativa promissora, foi estudada por Choi et al que
utilizou um reator airlift modificado com uma coluna de bolhas esféricas. Durante o
processo, o grupo adicionou àgar ao meio de cultura para aumentar a viscosidade e
31
diminuir a tensão cisalhante sofrida pela bactéria, na tentativa de diminuir a possibilidade
de mutação de cepas. A produtividade máxima conseguida pelo grupo foi de 6,8g/L.
3.6.3 BIORREATOR DE AEROSSOL
Outra dificuldade que necessita ser superada para que o aumento da escala da
produção de celulose bacteriana seja possível é o suprimento de fontes de carbono
necessário ao crescimento das bactérias (LEE et al., 2014). Estudos mostram que
bactérias produtoras do biopolímero só estão presentes na camada externa da película
de CB em uma superfície de cultura com alta concentração de oxigênio (HORNUNG et
al., 2006, 2006). Isso implica que os nutrientes devem se difundir pela película de CB,
sendo esta a etapa limitante na velocidade do processo produtivo. Uma possibilidade de
se resolver este problema é utilizando um reator de disco rotativo, onde as bactérias se
alojam no disco, e seu movimento de rotação permite que os microrganismos tenham
um bom contato tanto com o ar quanto com o meio de cultura (LEE et al., 2014). A
desvantagem do modelo é que a produção de celulose dificulta a rotação do disco o que
acaba por limitar a transferência de oxigênio e nutrientes para as bactérias com o avanço
da reação. Uma alternativa a este reator, é o biorreator de aerossol, no qual um
dissipador localizado acima da película de polímero difunde um aerossol contendo ar e
nutrientes para dentro do meio de cultivo. Isso garante que as bactérias de superfície
sempre recebam a quantidade necessária de oxigênio e nutrientes requeridas à
produção de CB (HORNUNG; LUDWIG; SCHMAUDER, 2007). Este aerossol pode
trabalhar por longos períodos de tempo, e uma produtividade de 9g de massa seca de
polímero por dia foi obtida. A Figura 6 mostra o esquema do funcionamento deste
biorreator
32
Figura 6: Esquema de funcionamento de um biorreator de aerossol. Fonte: Lee (2014)
3.6.4 BIORREATOR ROTATIVO
O biorreator rotativo constitui em uma série de discos circulares montados em um
eixo horizontal. Conforme os discos rotacionam, eles são expostos ao ar e ao meio de
cultura alternadamente (JIANLONG, 2000; LEE et al., 2014). Pesquisas foram feitas
buscando determinar valores ótimos para a produção de CB, levando em conta
parâmetros como quantidade de discos, diâmetro dos discos, velocidade de rotação e
taxa de aeração. Kim et al (ENGINEERING, 2007) em seu estudo mostrou que a
produção ótima do polímero ocorreu com o uso de 8 discos de 12 cm de diâmetro
rotacionando a 15 rpm com uma aeração de 1,25 vvm e com 34% dos discos submersos.
Esta configuração levou a uma concentração de 5,5 g/L. Apesar de terem concluído que
estes valores dos parâmetros envolvidos levam ao maior rendimento, os autores não
souberam explicar porque ao aumentar o número de discos o rendimento da produção
cai. Outro grupo, Krystynowicz et al (KRYSTYNOWICZ et al., 2002) sugeriu que esta
diminuição no rendimento pode ser devido ao fato de que ao aumentar o número de
discos, os espaços entre os mesmos tornam-se menores, favorecendo o acúmulo de
películas de CB entre discos e levando a uma diminuição na produtividade do polímero.
33
3.6.5 BIORREATOR DE MEMBRANA
Como foi dito anteriormente, em culturas agitadas há a possibilidade de cepas
produtoras de celulose sofrerem mutações e darem origem à cepas não produtoras
graças às forças cisalhantes às quais os microrganismos estão submetidos. Desta
maneira, o rendimento de culturas estáticas é maior do que em culturas agitadas
(DUDMAN, 1960). Além desta vantagem, a cultura estática também apresenta o ponto
positivo de que a taxa de produção do polímero por unidade de seção transversal é
constante (OKIYAMA et al., 1992), logo, o rendimento por unidade de volume aumentaria
conforme a cultura fosse a mais larga e a mais rasa possível. No entanto, pensando em
uma produção em larga escala, isto seria impraticável. Assim, reatores de membrana
para o cultivo de bactérias em condições estáticas têm sido estudados para a produção
do polímero pois as membranas têm a vantagem de possuir grande área superficial.
Hofinger et al (HOFINGER; BERTHOLDT; WEUSTER-BOTZ, 2011) e Yoshino
(YOSHINO; ASAKURA; TODA, 1996) et al têm estudado reatores de membrana na
produção de celulose bacteriana. Hofinger utilizou uma membrana hidrofílica de
poliétersulfona (PES) com poro de 0,45μm em biorreator para cultivar bactérias
produtoras de celulose. Os nutrientes necessários ao cultivo são introduzidos de um lado
da membrana ao passo que G.xylinum foi introduzido do outro lado da membrana. Os
nutrientes chegam às bactérias por meio da difusão dos nutrientes para o outro lado da
membrana sem que estes danifiquem o processo de formação da película polimérica.
Uma produção de 0,4g/m².h (massa seca) foi atingida. Já o grupo de Yoshino utilizou ar
enriquecido com oxigênio para aumentar a produção de CB. O ar foi conduzido através
de uma membrana de silicone permeável à passagem de oxigênio. Neste caso, ar é
fornecido de um lado da membrana e do outro lado encontra-se o meio de cultura
inoculado com as cepas produtoras. O rendimento reportado pelo grupo foi de
aproximadamente 0,3g/m².h (massa seca).
3.7 DIFICULDADES NA PRODUÇÃO EM ESCALA INDUSTRIAL DE CB
A discussão realizada até aqui procurou mostrar o que tem sido feito de mais
moderno na tentativa de se produzir celulose bacteriana em escala industrial, porém,
34
atualmente a produção do biopolímero ainda é limitada. Uma das principais razões para
isso é que o custo de produção ainda é bem elevado e está ligado à energia necessária
ao crescimento bacteriano (LEE et al., 2014). Lee et al também sugere que outro
empecilho para a estudo do aumento de escala da produção é a falta de uma unidade
de medida unificada para se estudar os rendimentos de produção de diferentes reatores.
No caso dos biorreatores na produção de celulose bacteriana encontra-se na literatura
unidades como g/L, g/dia e g/m².h. Além disso, parâmetros essenciais como tipo de
bactéria, concentrações iniciais das fontes de carbono e tempo de cultivo variam muito
de estudo para estudo o que dificulta bastante o estudo comparativo das tecnologias
existentes. Fazendo uma normalização das unidades para que o rendimento fosse
calculado como produtividade de celulose (massa de celulose produzida por unidade de
meio de cultura x volume x tempo de cultivo) chega-se aos dados utilizados na
elaboração da Tabela 2. Da tabela podemos observar que o reator de aerossol leva ao
maior rendimento quando glicose é utilizada como fonte de carbono, com um valor de
0,38g/L.h. Conforme a demanda de CB for requerida devido à descoberta de novas
aplicações para o polímero, mais empenho da indústria será observado na tentativa de
se baratear a produção e viabilizar a produção em larga escala do biopolímero.
35
Tabela 2: Produtividade (g/L.h) de diferentes bactérias em diferentes configurações do processo fermentativo. Fonte:
Lee(2014)
Configuração do Reator Espécie de Bactéria Fonte de Carbono Produtividade
(g/L.h) Observações
Cultura estática Acetobacter acetigenum EA-I Melaço hidrolizado 0.001
Cultura agitada Acetobacter acetigenum EA-I Melaço hidrolizado 0.03
Biorreator de agitação contínua
Gluconacetobacter xylinum subsp.sucrofermentans BPR 3001A
Frutose
0.4 1200 rpm
0.19 800rpm
0.07 600rpm
G. xylinum subsp.sucrofermentans BPR 2001
Melaços
0.04 Aquecimento
0.07 Aquecimento
0.07 Hidrólise ácida
Frutose
0.15
0.26 0,4 m/m% ágar
0.18 1,0 m/m% ágar
Biorreator airlift G. xylinum subsp.sucrofermentans BPR 2001
Frutose 0.03 Ar normal
0.2 Ar enriquecido com O2
Biorreator airlift modificado (Tela Metálica) G. xylinum subsp.sucrofermentans BPR 2001
Glicose 0.04 Ar normal
0.11 Ar enriquecido com O2
Biorreator airlift modificado (Esférico) G. xylinum KJ1 Glicose 0.08 Ar normal
0.09 Ar enriquecido com O2
Biorreator de aerossol G. xylinum AX5 Glicose 0.38
Biorreator rotativo Gluconacetobacter sp RKY5 KCTC 10683BP
Glicose 0.06
Biorreator de membrana (PES) G. xylinum strain DSM 2325 Glicose 0.2
Biorreator de membrana (Silicone) A. pasteurianus AP-1SK Glicose 0.02 Fluxo de ar tortuoso
0.01 Membrana plana
36
3.8 COMPÓSITOS DE CELULOSE BACTERIANA
Embora a celulose bacteriana possua propriedades únicas que fazem com que
seja um polímero muito promissor em termos de aplicabilidade, existem algumas
limitações ao seu uso, devido à falta de propriedades antibacterianas e falta de
transparência óptica por exemplo (ESA; TASIRIN; RAHMAN, 2014). Pesquisas vem
sendo feitas, na tentativa de eliminar essas limitações, assim, compósitos de CB
formados pela matriz polimérica e por materiais de reforço vêm sendo estudados. A
celulose bacteriana possui uma natureza porosa devido à distribuição das fibras em sua
composição, o que faz com que seja possível a adição de diversos materiais nesses
poros. Os materiais adicionados podem conferir então, características físico-químicas e
biológicas ainda mais significativas ao biopolímero (SHAH et al., 2013). A adição do
composto de reforço pode se dar de duas maneiras diferentes: in situ, quando a inserção
ocorre durante o cultivo da bactéria, com o composto difundindo do meio de cultura para
a rede de fibras formada; e ex situ, quando o polímero é impregnado de aditivo após sua
formação (ESA; TASIRIN; RAHMAN, 2014) A Tabela 3 apresenta alguns compósitos de
CB, bem como sua funcionalidade, aplicabilidade, o material de reforço e os autores que
vem pesquisando essas inovações.. Na tabela são apresentados compósitos orgânicos
e inorgânicos, como polímeros, metais e óxidos metálicos, materiais sólidos e
nanomateriais.
Tabela 3: Compósitos de celulose bacteriana e suas áreas de atuação. Fonte:
(ESA; TASIRIN; RAHMAN, 2014)
Área de aplicação Material de reforço Função Referências
Eletrônica Nanoplaquetas de grafite Condutividade Elétrica (ZHOU et al., 2013)
Eletrônica Poli (ácido 4-estirenosulfônico) Bateria Redox (GADIM et al., 2014)
Biomédica/Industrial Quitosana Nanofilmes (FERNANDES et al., 2009)
Biomédica Hidróxiapatita Engenharia de Tecido Ósseo
(TAZI et al., 2012)
Biomédica Nanopartículas de Prata Curativo Antimicrobiano (ZHANG; FANG; CHEN, 2013)
Biomédica Parafina Suporte Ósseo (ZABOROWSKA et al., 2010)
Eletrônica Poliuretano Filme Substrato de LED (UMMARTYOTIN et al., 2012)
37
3.9 RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO
A celulose bacteriana apesar de não possuir outros compostos em sua
composição como ocorre com a celulose vegetal que apresenta lignina, hemicelulose e
pectina que precisam ser retirados em processos de purificação, ainda precisa passar
por processos de recuperação pois o polímero final não é puro. Impurezas como células
e componentes do meio de cultivo devem ser retiradas para que a celulose pura seja
obtida e o rendimento calculado (CHAWLA et al., 2009).
Chawla et al (CHAWLA et al., 2009) descreve em seu review os principais
processos de purificação do polímero bacteriano, tanto para aplicações gerais quanto
para aplicações médicas, qe exigem um tratamento de purificação mais refinado. O
principal processo de purificação de celulose bacteriana é o tratamento com álcali
(hidróxido de sódio ou potássio), ácidos orgânicos como ácido acético ou lavagens
repetidas com água de osmose reversa ou com água quente. Estas metodologias podem
ser usadas separadamente ou em conjunto (CHAWLA et al., 2009). Quando o polímero
final se destina à aplicações médicas, tratamentos subsequentes devem ser realizados
para que células bacterianas e toxinas sejam retiradas da celulose. Uma das
metodologias mais utilizadas consiste em processar a película de polímero gentilmente
entre duas folhas de papel absorvente que retira aproximadamente 80% da fase liquida
e então submergir o polímero em NaOH 3% por 12hrs. O procedimento é repetido por
três vezes e então a película é incubada em solução 35 de HCl, prensada e lavada com
água destilada. Finalmente, a película é esterilizada em autoclave ou por irradiação com
Co60. A Figura 7 traça um comparativo dos tratamentos necessários à purificação da
celulose de origem vegetal e a de origem bacteriana
38
Figura 7: Comparação entre tratamentos posteriores à produção de celulose vegetal e
bacteriana. Fonte: Chawla(2009)
3.10 APLICAÇÕES DA CELULOSE BACTERIANA
Como discutido ao longo deste trabalho, a Celulose Bacteriana é um biopolímero
que se destaca de seu semelhante vegetal por possuir propriedades que lhe garantem
vantagens em termos industriais, como alta pureza, alto grau de cristalinidade, alta
densidade, bom fator de forma, grande capacidade de se ligar à água e maior área
superficial. Por apresentar todas estas características, a CB tem sido utilizada em
diversas áreas como indústria têxtil, de papel, alimentícia, farmacêutica, tratamento de
efluentes, radiodifusão, mineração e refinarias (CZAJA et al., 2006; LEGGE, 1990;
SHAH; BROWN, 2005). As aplicações serão sumarizadas nas categorias a seguir.
39
3.10.1 APLICAÇÕES NA INDÚSTRIA ALIMENTÍCIA
O primeiro uso da celulose bacteriana na indústria alimentícia foi a nata de côco,
uma sobremesa indígena nativa das Filipinas que é servida na forma de cubos
gelatinosos. Possui textura suave, macia e de fácil mastigação (ESA; TASIRIN;
RAHMAN, 2014), além de não possuir colesterol, possuir baixo teor de gorduras e
calorias. Durante o processo produtivo, as bactérias são cultivadas em cultura estática
com água de côco como fonte de carbono para a Gluconacetobacter xylinum
(JAGANNATH et al., 2008). A película espessa de celulose é lavada, fervida e cozinhada
com xarope de açúcar para formar coquetéis e gelatinas. Mesomya et al
(PAKPEANKITVATANA et al., 2007)reportaram um suplemento oriundo da mistura de
nata de côco e cereais rico em fibras e que diminuiu o nível de lipídios do consumidor.
Para aplicações alimentícias, atenção especial deve ser dada à embalagem do
produto para proteger e preservar os alimentos. Além disso, há uma preocupação
crescente com a biodegradabilidade de embalagens visto que questões ambientais são
muito pertinentes nos tempos atuais. Embalagens de CB têm sido pesquisadas por
serem resistentes à água e por serem biodegradáveis, porém o fato do polímero não
possuir propriedades antibacterianas e antioxidantes faz com que seja necessária a
formação de compósitos de CB/aditivos (ARRIETA et al., 2014; GAO et al., 2014; SONIA;
PRIYA DASAN, 2013; TANG et al., 2012).
3.10.2 APLICAÇÕES MÉDICAS E FARMACÊUTICAS
O tratamento de ferimentos crônicos tais como úlceras venosas, úlceras
diabéticas e escaras requer esforço significativo tanto dos pacientes quanto como dos
profissionais de saúde, e pesquisas vem sendo feitas na tentativa de se achar um
curativo “ideal” para essas mazelas. O tratamento desses ferimentos envolve a aplicação
de diversos materiais (hidrocolóides, hidrogéis, membranas sintéticas ou biológicas)
(CHAWLA et al., 2009) que propiciem um ambiente úmido para o ferimento de modo que
a cura seja facilitada. Chawla et al menciona estudos recentes que mostram que para
um material ser considerado propício ao tratamento de ferimentos ele deve possuir
características de pele artificial, tanto estruturalmente como funcionalmente. As
40
características esperadas de um material para este tipo de tratamento são: não-
toxicidade, biocompatibilidade, não ser inflamável, habilidade de barreira perante
infecções, habilidade de controle de perda de fluido, habilidade de redução de dor
durante o tratamento, habilidade de manter umidade, permitir a introdução ou
transferência de medicamentos para o ferimento, absorver secreções que ocorrem
durante a cicatrização, apresentar alta capacidade mecânica, elasticidade e facilidade
na cura da ferida (CHAWLA et al., 2009).
A celulose bacteriana apresenta a porosidade necessária para permitir a
transferência de antibióticos e outros medicamentos para o ferimento e consegue
também funcionar como uma barreira física a entrada de corpos estranhos na ferida.
Pode-se dizer que a CB satisfaz os requisitos necessários para ser considerado um
curativo moderno para o tratamento de ferimentos (CZAJA et al., 2006). O fato deste
biopolímero apresentar alta capacidade de absorção de água e o fato do tamanho das
fibrilas ser 100 vezes menor do que o o da celulose vegetal a torna um material ainda
mais promissor a ser utilizado nesta área.
Biofill, uma empresa brasileia, investigou as propriedades do polímero bacteriano
para o tratamento de ferimentos (KLOIMSTELN; EATERMANN, 1990) e produziu dois
novos produtos: Bioprocess e Gengiflex (AMAR et al., 1989) para serem utilizados na
cura de feridas extensas. Outro produto patenteado veio da empresa americana Xylos
Corp. que criou o produto Prima Cel™ para ser utilizado no tratamento de úlceras e
ferimentos. Outra área interessante de pesquisa na área biomédica referente à celulose
bacteriana é a engenharia de tecidos sanguíneos (Tissue Engineered Blood Vessels –
TEBV) que podem auxiliar no tratamento de doenças vasculares fornecendo pequenos
enxertos no sistema circulatório favorecendo a circulação de sangue em vias obstruídas
(BÄCKDAHL et al., 2006).
Para uma extensa lista de aplicações da celulose bacteriana na área da
biomedicina o leitor é convidado à ler o review escrito por Rajwade et al (RAJWADE;
PAKNIKAR; KUMBHAR, 2015) que faz um levantamento das propriedades do polímero
que tornam possível sua aplicação em organismos vivos e que permitem a introdução de
componentes que dão origem à diversos compósitos para a aplicação na área, desde
próteses externas até implantes cardiovasculares, ósseos e neurais.
41
3.10.3 APLICAÇÕES EM ELETRÔNICA
A celulose bacteriana encontra aplicações na área da elétrica devido ao caráter
da sua estrutura fibrosa em rede formada por fibras manométricas. Yoon et al (YOON et
al., 2006) criaram um compósito condutor formado por uma matriz polimérica de CB
utilizando nanotubos de carbono como aditivos. Nogi et al (NOGI et al., 2009)
desenvolveram um painel reforçado, plano e transparente formado por um compósito de
nanofibras de CB com resina acrílica de baixo coeficiente de expansão térmica. A
eficácia deste compósito como substrato para um display plano foi comprovada
sintetizando um diodo orgânico emissor de luz (OLED). O sistema exibiu
eletroluminescência e apresenta alta capacidade para ser utilizado na síntese de displays
comerciais.
Uma aplicação muito interessante do potencial de fibras de celulose bacteriana
combinadas com nanopartículas metálicas é no seu uso como membranas trocadoras
de prótons em células combustíveis. CB carregada com nanopartículas metálicas de Pd-
e Pt- apresentaram grande potencial como oxidantes de hidrogênio em células
combustíveis (BARBARA et al., 2003; YANG et al., 2009).
Outro estudo focou em demonstrar uma maneira simples e de baixo custo de se
sintetizar compósitos altamente condutores e flexíveis para serem aplicados em
eletrônicos utilizando películas de CB como matéria prima e demonstrando que a mesma
consegue manter-se eletricamente condutora sob situações de torção e alongamento
(LIANG et al., 2012).
3.10.4 APLICAÇÕES INDUSTRIAIS
Fragmentos de CB apresentam características promissoras na indústria de papel
por possuírem comportamento flexível, durabilidade e alto teor de enchimento,
característica importante na produção de papel cédula (IGUCHI; YAMANAKA;
BUDHIONO, 2000). Como mencionado anteriormente, papel de celulose bacteriana
pode também ser utilizado como embalagem biodegradável para alimentos. O papel
obtido tanto por culturas estáticas quanto agitadas apresentaram propriedades de
42
resistência à óleos, o que o torna útil na indústria de embalagens como um todo
(SUWANNAPINUNT; BURAKORN; THAENTHANEE, 2007).
As propriedades únicas da celulose microbiana permitiram também a síntese de
uma membrana transdutora de som que mantém alta velocidade sônica com ampla
frequência resultando em um dos materiais mais nobres na indústria do áudio (MOHITE;
PATIL, 2014). As empresas japonesas Sony Corporation e Ajinomoto desenvolveram o
primeiro diafragma para caixas de som utilizando CB, porém, a produção em escala
industrial ainda não é viável devido aos altos custos de produção (IGUCHI et al., 1988).
Outra aplicação encontrada para CB na indústria é como matéria prima na
produção de derivados de celulose, como carboximetilcelulose, hidroximetilcelulose,
acetato de celulose e metil celulose (PATENTS, 2015).
3.10.5 APLICAÇÕES NA AGRICULTURA E MEIO AMBIENTE
Devido à suas características de alta cristalinidade, alta capacidade de reter água,
alta porosidade e resistência mecânica, a celulose bacteriana possui alto potencial como
bioadsorvente. Há estudos sobre remoção de metias pesados como mercúrio, cádmio e
chumbo utilizando CB(MIN; XIAO-HUI; DE-ZHOU, 2011; REZAEE et al., 2005; ZHU et
al., 2011).
No ramo da agricultura, Abdelhak et al (THESIS, 2009) estudaram o efeito de uma
blenda de poliacrilamida e celulose na absorção de água, e concluíram que a ação foi
positiva tanto na retenção de água como pelo aumento das qualidades do solo. Mohite
et al (MOHITE; PATIL, 2014) estudaram o efeito da CB no solo e concluíram que o
polímero aumenta a capacidade máxima de retenção de água pelo solo e que a
porosidade também é influenciada diretamente pela presença do biopolímero. Os
autores, no entanto, acreditam que mais estudos devem ser feitos na tentativa de
explorar mais as possibilidades de se utilizar a CB para melhorias no solo.
4. CONCLUSÃO
O presente trabalho procurou apresentar o conceito de celulose bacteriana para o
leitor, bem como trazer o que tem sido feito de mais atual em pesquisas referentes a este
biopolímero altamente promissor. Suas características físicas e estruturais o tornam
43
amplamente superior ao seu semelhante vegetal no que diz respeito à aplicabilidade na
indústria, porém, sua produção em escala industrial ainda é minada pelos altos custos
referentes à produção, a falta de uma unidade de medida de produtividade unificada e à
variedade de bactérias e meios de cultura utilizados nos estudos que dificultam um
consenso entre os pesquisadores.
Embora existam muitas dificuldades a serem superadas, o autor acredita que o
apelo ambiental somado às inúmeras aplicabilidades que vem sendo descobertas para
a celulose bacteriana farão com que pesquisas e estudos continuem sendo feitas com o
objetivo de que um dia a celulose vegetal possa ser substituída pelo seu semelhante
microbiano.
44
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