bioquímica estrutural para bioinorgânicos · que os seres vivos produzem internamente através de...
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Bioquímica estrutural para bioinorgânicos Prof. Fernando R. Xavier
UDESC 2018
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Em linhas gerais, a bioquímica pode ser descrita como um campo da ciência e
tecnologia que estuda e aplica a química da vida e os processos químicos que
ocorrem nos organismos vivos.
Ela pode ser dividida no estudo das proteínas (proteômica), enzimas (enzimologia) e da
biologia celular como um todo (carboidratos, lipídios e ácidos nucleicos).
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Moléculas importantes ao nosso estudo (bioinorgânica):
• Aminoácidos;
• Peptídeos;
• Proteínas;
• Enzimas. Tirosina (tyr, Y)
Leu-ser-ala (LSA)
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Moléculas importantes ao nosso estudo (bioinorgânica):
• Nucleotídeos;
• Ácidos nucleicos (DNA e RNA);
• Ribozimas;
• Coenzimas (NAD, FAD, etc...)
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Aminoácidos (AA): São as unidades básicas construtoras das proteínas e enzimas.
Possuem obrigatoriamente as funções químicas amina e ácido carboxílico
• R é conhecido como cadeia lateral e é específica para cada tipo de AA.
• Os seres vivos utilizam/produzem α-AA, ou seja, ambos os grupos funcionais estão
ligados no mesmo carbono (α à carbonila).
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Aminoácidos podem ser compostos quirais pois podem possuir carbono assimétrico.
• Somente L-AA (R) são constituintes das
proteínas. Há indícios que tal fato ocorra
devido a L-AA serem levemente mais
solúveis que D-AA (questão evolutiva).
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Uma vez que AA possuem grupamentos ácidos e básicos, estas moléculas são
consideradas anfóteras podendo então formar zwitteríons.
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São 20 (vinte) os aminoácidos encontrados nos seres vivos. Estes podem ser
classificados preliminarmente em essenciais e não-essenciais.
• AA essenciais são aqueles que os seres vivos
necessitam para construir proteínas porém não
são sintetizados por estes organismos.
Devem ser obtidos de fontes externas
(alimentação).
• Leucina
• Isoleucina
• Lisina
• Arginina
• Metionina
• Triptofano
• Valina
• Treonina
• Fenilalanina
• Histidina
• AA não-essenciais por outro lado, são aqueles
que os seres vivos produzem internamente
através de sua própria biossíntese.
• Glutamina
• Glicina
• Aspartato
• Serina
• Tirosina
• Alanina
• Asparagina
• Prolina
• Cisteína
• Glutamato
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Aminoácidos hidrofóbicos
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Aminoácidos polares
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Aminoácidos ácidos (carregados negativamente)
Aminoácidos básicos (carregados positivamente)
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Polimerização de aminoácidos: A formação de peptídeos
A consequente condensação de múltiplos AA poderá originar, di-, tri-, oligo- ou
polipeptídios.
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Por convenção, cadeias peptídicas são “lidas” do ponto “N-terminal” para o “C-terminal”. A
maioria dos polipeptídios naturais possui entre 50 e 2000 resíduos de AA.
• A maior proteína conhecida (tintin)
consiste de 27 mil resíduos de AA.
• A maioria das proteínas possui MM entre
5,500 e 220,000 Da.
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O esqueleto de cadeias polipeptídicas é flexível porém conformacionalmente restrito.
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Proteínas
De um ponto de vista químico, as proteínas são biopolímeros, ou seja, longas cadeias
moleculares de resíduos de AA conectados através de ligações peptídicas.
Estrutura primária: Consiste no primeiro nível de organização estrutural. É determinada
literalmente pela sequência linear dos resíduos de AA empregados em sua síntese.
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Estrutura secundária: Consiste em estruturas tridimensionais com certos padrões de
repetição mediadas geralmente por ligações de hidrogênio. Descobertas por Pauling e
Corey no início dos anos 1950.
Alfa-hélices
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Alfa-hélices (condições de ocorrência e tendências)
• Todos os aminoácidos precisam ter o mesmo tipo de
isomeria óptica (L ou D)
• A cadeia lateral pode interferir na capacidade do
aminoácido em formar hélices: O volume e a forma de
Asp, Ser, Thr e Cys podem desestabilizá-la se
estiverem muito próximos entre si; Pro e Gly
dificultam a formação de hélices;
• Relações com o vizinho também são importantes;
• Componentes amino e carbonil formam dipolo
elétrico
• Pro e Gly impedem a formação
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Beta-folhas pregueadas
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Retornos e voltas (“turns” e “loops”)
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Especialidades: Proteínas fibrosas
α-queratina: Principal componente da lã, cabelo e pele. Estas estruturas podem atingir
comprimento de 1000Å (100 nm ou 0,1 μm). Também podem atuar como uma espécie de
“esqueleto celular”.
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Especialidades: Colágeno
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Estrutura terciária: Depende da distribuição tridimensional do conjunto de alfa-hélices,
folhas-beta, turns e loops presentes em um proteína. Este macro arranjo é mantido por
diversas forças (ligações covalentes, forças eletrostáticas, ligações de coordenação a
íons metálicos, ligações de hidrogênio e forças de Van der Waals).
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A estrutura terciária de uma proteína pode ser determinada via estudos de difração de
raios-x em monocristal (DRX) ou via ressonância magnética nuclear (RMN).
Apesar da mioglobina possuir muitos
resíduos de AA hidrofóbicos todos estes
estão voltados para o interior da
estrutura proteica. Já os AA polares
estão voltados para seu exterior
fazendo com a proteína seja solúvel em
meio aquoso (biológico).
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Estrutura supersecundária: São arranjos específicos que desempenham algum papel
funcional além de estrutural em proteínas.
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Domínios: São regiões de polipeptídios que foram proteínas se organizam em regiões
compactas que estão conectadas umas as outras por trechos flexíveis de resíduos de AA.
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Estrutura quaternária: Muitas proteínas são compostas de duas ou mais cadeias
polipeptídicas, ou subunidades, cuja associação através de ligações não-covalentes
levam a um arranjo espacial chamado de estrutura quaternária.
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Proteínas com estrutura quaternária podem ser formadas por homo e heterodímeros,
trímeros, tetrâmeros, oligômeros ou ainda multímetros
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Enzimas
Proteínas que possuem arranjo tridimensional (estrutura terciária) podem atuar como
enzimas. Enzimas são, portanto, biomoléculas que atuam como catalisadores de
reações bioquímicas nos sistemas vivos (catalisadores biológicos). São características
típicas destas moléculas:
• Promover reações com altas velocidades;
• Atuar em condições brandas de temperatura e pH;
• Possuir alta especificidade por substratos;
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O local exato onde ocorre a catálise dentro de um enzima é chamado de sítio ativo.
Enzimas podem dispor de mais de um destes em sua estrutura:
ufPAP kbPAP
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Dados cinéticos de algumas enzimas
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Catalisadores poderosos e altamente específicos
A anidrase carbônica pode hidratar até 106
moléculas de CO2 por segundo.
Enzimas proteolíticas ou proteases são
extremamente específicas atuando na clivagem
de ligações peptídicas. Ex.: Tripsina e trombina.
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Classificação quanto a ocorrência
Enzimas intracelulares
• Atuam no interior da célula;
• Catalisam reações de síntese de material celular;
• Catalisam reações catabólicas (quebra de substâncias complexas e
moléculas mais simples);
Enzimas extracelulares
• Atuam fora da célula;
• Executam operações necessárias à penetração de nutrientes para o
interior das células;
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Outras classificações
Enzimas habituais ou constitutivas
• As células expressam (mantêm sua produção) permanentemente ao
longo do tempo;
Enzimas indutivas
• As células expressam sua produção somente quando estão na
presença do substrato;
Isoenzimas
• São enzimas que possuem uma mesma função, ou seja, catalisam
uma mesma reação, porém apresentam estruturas diferentes;
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Por que a catalise enzimática é tão eficiente?
1. Aumento da concentração dos reagentes na superfície da enzima: (“atração”
dos reagentes para interação com a enzima).
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2. Orientação correta dos reagentes (substratos): parte da energia de ativação
representa o posicionamento adequado dos reagentes para que haja contato entre os
átomos corretos. O sítio ativo da enzima favorece o posicionamento correto dos
reagentes.
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3. Aumento da reatividade dos reagentes: as cadeias laterais (R) dos aminoácidos
da enzima ou co-fatores e coenzimas podem interagir diretamente com os substratos,
dando-lhes carga elétrica ou polarizando-os, tornando-os quimicamente mais reativos,
ou ainda cedendo ou transferindo certas funções químicas.
rápido rápido muito rápido!
Sem catálise Catálise ácida Catálise básica Catálise ácido-básica
lento
Cadeias laterais de aminoácidos no sítio ativo de uma enzima hidrolítica
A hidrólise não enzimática de uma ligação peptídica é lenta e requer condições drásticas de pH e temperatura
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4. Indução de deformação física no substrato, por contato com as cadeias laterais
(R) dos aminoácidos das enzimas, que desestabilizam a molécula do substrato e
facilitam o rompimento de ligações covalentes.
J. Mol. Biol. (1996) 259, 737–748
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Algumas proteínas, enzimas em especial, contêm em sua molécula uma porção não
proteica, que é essencial para atividade biológica.
Enzima
holozima
Apoenzima
parte proteica
Grupo
prostético
ativa
Grupo
Prostético inativa
metal
coenzima
cofator
ZnII-CA – Active site
Metaloproteínas (ex. hemoglobina)
Metaloenzimas (ex. catalase)
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Fatores que afetam a atividade enzimática:
1. Condições do meio que afetam estabilidade proteica:
• pH
• Temperatura
Alguns desses fatores são decorrentes da natureza proteica das enzimas, como o efeito
do pH e da temperatura. Para se estudar o efeito isolado de um dos fatores acima, é
necessário que todos os outros fatores sejam mantidos fixos.
2. Concentração dos reagentes:
• Da enzima
• Do substrato
• Do co-fator(es)
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Fatores que afetam a atividade enzimática:
A enzima está pelo menos parcialmente desnaturada em pHs afastados do pH ótimo.
Quando o substrato é uma molécula ionizável, o pH ótimo da enzima também reflete o
seu estado de ionização.
O pH ótimo - reflete variações no estado de ionização de resíduos de aminoácidos do
sítio ativo.
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A estabilidade de uma enzima em relação ao pH depende ainda:
- temperatura;
- força iônica;
- natureza química do tampão;
- concentração de íons metálicos contaminantes;
- concentração de substratos ou cofatores da enzima;
- concentração da enzima.
ENZIMA pH ÓTIMO
Pepsina 1,5
Tripsina 7,7
Catalase 7,6
Arginase 9,7
Fumarase 7,8
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Fatores que afetam a atividade enzimática:
A temperatura pode afetar severamente o desempenho funcional das enzimas, havendo
neste caso também uma faixa ótima de trabalho.
Com o aumento da temperatura dois efeitos podem ocorrer:
• A taxa de reação aumenta;
• a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica.
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As proteínas desnaturadas podem voltar
aos estados nativos através de
renaturação, quando o estímulo é retirado.
Renaturação de proteínas
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Lei de Arrhenius e a energia de ativação (Ea)
ATRT
Eak
Aek RTEa
ln1
ln
/
• Ea pode ser determinada medindo-se a
constante de velocidade da reação em ≠
temperaturas.
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Fatores que controlam a atividade enzimática:
Concentração:
• da enzima
• do substrato
• de cofatore(s)
A enzima existe sob duas formas: enzima
livre E e complexo enzima-substrato ES.
No início da reação, a [E] livre cai e a do
complexo [ES] aumenta e atinge um
máximo, em que não há mais [E] livre no
meio. Nessa situação (indicada no
retângulo cinza), diz-se que a enzima está
saturada (só existe no complexo ES). A
velocidade da reação é a máxima.
tempo
co
ncen
traçã
o
O gráfico abaixo ilustra como as
concentrações de E, S e P variam ao
longo do tempo da reação.
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Considerações sobre a influência da concentração da enzima
• Velocidade de transformação do S em P quantidade de E.
Desvios da linearidade ocorrem:
- Presença de inibidores na solução de enzima;
- Presença de substâncias tóxicas;
- Presença de um ativador que dissocia a enzima;
- Limitações impostas pelo método de análise.
• Recomenda-se:
- Enzimas com alto grau de pureza;
- Substratos puros;
- Métodos de análise confiável.
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Catálise enzimática – Aspectos Cinéticos
Objetivos principais:
• Determinar as constantes de afinidade do S e dos inibidores;
• Conhecer as condições ótimas da catálise;
• Ajuda a elucidar os mecanismos de reação;
• Determinar a função de uma determinada enzima em uma rota
metabólica.
Pioneiro: Victor Henri (1903): E + S ES
Em 1912 – Cinética Enzimática
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Equação de Michaelis-Menten
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Enzimas – ordem da reação
Quando a formação de P for proporcional à
[S] a velocidade da reação é de 1a ORDEM
V
[S]
𝑆 ↓ ∴ 𝑆 ≪ 𝐾𝑀
𝑣 =𝑣𝑚á𝑥[𝑆]
𝐾𝑀 ou 𝑣 = 𝑘[𝑆]
Quando a velocidade da reação
independe da [S] a reação é de
ORDEM ZERO
𝑆 ↑ ∴ 𝑆 ≫ 𝐾𝑀
𝑣 = 𝑣𝑚á𝑥
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O método de Lineweaver-Burk
Consiste em simplesmente efetuar uma linearização da equação de Michaelis-Menten.
Foi muito utilizado no período pré-computacional pois é de fácil tratamento matemático.
Também é chamado de duplo-recíproco.
Eq. de Michaelis-Menten
Eq. Lineweaver-Burk
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Números de “turnover” ou ciclagem catalítica
O valor de velocidade máxima (vmáx) revela o número de turnovers, ou seja, o número
de moléculas de substrato convertido em produtos por uma unidade de enzima.
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Comportamento não-michaeliano: O efeito alostérico
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Inibição enzimática
É qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática.
Inibidores
Reversíveis Irreversíveis
Competitivos
Incompetitivos
Não-Competitivos
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Inibição competitiva
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Inibição competitiva
O composto methotrexato se liga ao
sítio ativo da dihidrofolato redutase
com cerca de 1000x mais potência que
seu substrato nativo: O dihidrofolato.
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Inibição incompetitiva
Na inibição incompetitiva, o inibidor
liga-se apenas no complexo enzima-
substrato. Este processo não pode ser
sobrepujado pela adição de mais
substrato.
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Inibição incompetitiva
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Inibição não-competitiva
• Diferentemente da inibição
incompetitiva, a inibição não-
competitiva, o inibidor liga-se tanto na
enzima livre quanto no complexo
enzima-substrato.
• Este processo aumenta a
concentração de enzima não funcional
no meio.
• Este processo também não pode ser
sobrepujado pela adição de mais
substrato.
• Queda no número de turnovers
realizados.
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Inibição não-competitiva
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Inibição irreversível
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Inibição irreversível
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Inibição irreversível
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Inibição irreversível – Inibidores suicidas
O grupo prostético
flavina está presente
na enzima monoamino
oxidase (MAO).