UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUÍMICOS

APOSTILA DE BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL

Análise Microbiológica de Água

EDMAR DAS MERCÊS PENHA

MÁRCIA MONTEIRO MACHADO GONÇALVES

2011

I-Introdução

Água estéril não é encontrada na Natureza. Ela recebe sua flora microbiana das mais

variadas fontes: ar, solo, águas residuárias, resíduos orgânicos, plantas, animais mortos, etc.

Isto significa que a água pode conter micro-organismos de várias espécies, patogênicas ou

não. O número de espécies presentes depende da fonte contaminante.

A análise microbiológica consiste na pesquisa do chamado “grupo coliforme” que,

quando presente, evidencia uma possível contaminação fecal. As principais características do

grupo coliforme são: bastonetes Gram (-), não esporulados, aeróbios ou anaeróbios

facultativos, que não são inibidos por sais biliares ou pelo corante verde brilhante e são

capazes de fermentar lactose com produção de aldeído, ácido e gás dentro de 48h a 35ºC. O

grupo inclui tanto espécies de bactérias originárias do trato gastrintestinal de humanos e

outros animais de sangue quente, como também espécies não entéricas. Por esse motivo, a

presença de bactérias do grupo coliforme é menos representativa como indicação da

contaminação fecal, do que a enumeração de coliformes fecais ou Escherichia coli. Embora a

presença do grupo coliforme em amostras de água seja considerada uma indicação de

contaminação.

O grupo de coliformes fecais representa os membros do grupo coliforme capazes de

fermentar a lactose com produção de gás, em 24h a 44,5oC. Esta definição teve como objetivo

selecionar os coliformes do trato gastrintestinal. Atualmente sabe-se que o grupo de

coliformes fecais inclui pelo menos três gêneros: Escherichia, Enterobacter e Klebsiella.

Entretanto, dois desses gêneros (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem não

fecal. Logo, a existência de coliformes fecais em uma determinada amostra de água pode não

significar uma contaminação fecal. Cabe ressaltar que a presença de coliformes fecais em uma

determinada amostra de água é muito mais representativa da contaminação por fezes do que a

de coliformes totais, dada à alta incidência de E. coli dentro do grupo fecal.

Dentre as bactérias de habitat fecal, pertencente ao grupo de coliformes fecais, a E.

coli é a mais conhecida e a mais facilmente diferenciada dos não fecais. Todos os demais

membros do grupo têm uma associação duvidosa com a contaminação fecal. Portanto, a

enumeração da E. coli é o melhor indicador de contaminação fecal conhecido.

A Contagem Padrão de Bactérias é realizada visando conhecer a densidade de

bactérias na água, tendo em vista que um aumento considerável da população bacteriana pode

comprometer a detecção de organismos coliformes. Embora a maioria dessas bactérias não

seja patogênica, pode representar riscos à saúde, como também, deteriorar a qualidade da

água, provocando odores e sabores desagradáveis.

II-Contagem de Coliformes Totais e Coliformes Termotolerantes (Fecais)

pelo Método do Número Mais Provável (NMP) e Contagem Padrão de

Bactérias

II.1- Coleta da amostra → quantidade representativa (± 100 mL) são coletadas em

ambientes limpos e estéreis. No caso de água clorada o frasco conterá um pouco de tiossulfato

de sódio (0,1%).

II.2- Estocagem → deve ser mantida em geladeira por no máximo 24 horas.

II.3- Técnica → a análise de coliformes é realizada em duas etapas: teste presuntivo e teste

confirmativo, quando o NMP de coliformes/mL é determinado utilizando uma tabela de NMP

apropriada. A contagem padrão de bactérias é realizada empregando a técnica de

plaqueamento pour-plate.

TABELA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL

Numero Mais Provável (NMP) por 100 mL e 95 % de intervalo de confiança para diversas combinações de tubos positivos em séries de 3 tubos. Quantidade inoculada da amostra: 10,0; 1,0 e 0,1 mL.

Portaria MS n.º 518/2004

§ 1º No controle da qualidade da água, quando forem detectadas amostras com resultado

positivo para coliformes totais, mesmo em ensaios presuntivos, novas amostras devem ser

coletadas em dias imediatamente sucessivos até que as novas amostras revelem resultado

satisfatório. Nos sistemas de distribuição, a recoleta deve incluir, no mínimo, três amostras

simultâneas, sendo uma no mesmo ponto e duas outras localizadas a montante e a jusante.

§ 2º Amostras com resultados positivos para coliformes totais devem ser analisadas para

Escherichia coli e, ou, coliformes termotolerantes, devendo, neste caso, ser efetuada a

verificação e confirmação dos resultados positivos.

§ 3º O percentual de amostras com resultado positivo de coliformes totais em relação ao total

de amostras coletadas nos sistemas de distribuição deve ser calculado mensalmente, excluindo

as amostras extras (recoleta).

§ 4º O resultado negativo para coliformes totais das amostras extras (recoletas) não anula o

resultado originalmente positivo no cálculo dos percentuais de amostras com resultado

positivo.

§ 5º Na proporção de amostras com resultado positivo admitidas mensalmente para

coliformes totais no sistema de distribuição, expressa na Tabela 1, não são tolerados

resultados positivos que ocorram em recoleta, nos termos do § 1º deste artigo.

§ 6º Em 20% das amostras mensais para análise de coliformes totais nos sistemas de

distribuição, deve ser efetuada a contagem de bactérias heterotróficas e, uma vez

excedidas 500 unidades formadoras de colônia (UFC) por ml, devem ser providenciadas

imediata recoleta, inspeção local e, se constatada irregularidade, outras providências

cabíveis.

§ 7º Em complementação, recomenda-se a inclusão de pesquisa de organismos patogênicos,

com o objetivo de atingir, como meta, um padrão de ausência, dentre outros, de enterovírus,

cistos de Giardia spp e oocistos de Cryptosporidium sp.

§ 8º Em amostras individuais procedentes de poços, fontes, nascentes e outras formas de

abastecimento sem distribuição canalizada, tolera-se a presença de coliformes totais, na

ausência de Escherichia coli e, ou, coliformes termotolerantes, nesta situação devendo ser

investigada a origem da ocorrência, tomadas providências imediatas de caráter corretivo e

preventivo e realizada nova análise de coliformes.

1ª Prática:

I-Teste Presuntivo de Coliformes Totais

1-Objetivo: verificar a fermentação da lactose com produção de gás nos tubos inoculados.

2-Meio de cultura: Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST)

3-Procedimento: Inoculação de três séries de tubos

1º - Inocular 10 mL de amostra em tubos (3 ou 5) contendo 10 mL do caldo LST em

concentração dupla e tubos de Durhan.

2º - Inocular 1 mL de amostra em tubos (3 ou 5) contendo 10 mL do caldo LST em

concentração simples e tubos de Durhan.

3º - Inocular 0,1 mL de amostra em tubos (3 ou 5) contendo 10 mL do caldo LST em

concentração simples e tubos de Durhan.

4-Incubação: 35 ± 0,5º C durante 24/48 horas.

5-Contagem: verificar a produção de gás nos tubos de Durhan e anotar os tubos positivos de

cada série.

II-Contagem Padrão de Bactérias

1-Objetivo: determinar o número de bactérias heterotróficas totais.

2-Meio de cultura: Plate Count Agar (PCA).

3-Procedimento: Transferir, com pipeta estéril, 1 ml da amostra (diluída se necessário em

solução fisiológica) para uma placa de Petri previamente esterilizada; adicionar o meio de

cultura previamente fundido e homogeneizar o conteúdo da placa em movimentos circulares

moderados em forma de (∞).

4-Incubação: incubar a placa em posição invertida a 35 ± 0,5º C durante 48 ± 3 horas.

5-Contagem: Fazer a contagem das colônias com o auxílio de um contador de colônias.

Selecionar a placa contendo entre 30 e 300 colônias. Contar o número de colônias e, de

acordo com a diluição utilizada no material de origem, expressar o número de unidades

formadoras de colônia (UFC) presentes na amostra, nas condições de teste.

Exemplo de cálculo:

nº de colônias = 54

diluição = 10-1

Total: 54 ÷ 10-1 = 54 x 101 = 5,4 x 102 UFC/g de amostra

2ª Prática:

I-Teste Confirmativo de Coliformes Totais

1-Objetivo: evidenciar o crescimento dos coliformes no caldo verde-brilhante. O verde-

brilhante inibe o crescimento dos outros micro-organismos que fermentam a lactose e não são

do grupo coliforme.

2-Meio de cultura: Caldo Verde-Brilhante

3-Procedimento: Transferir uma alçada bem carregada de cada tubo de LST onde houve

produção de gás para tubos de caldo verde-brilhante contendo tubos de Durhan.

4-Incubação: 35 ± 0,5ºC durante 24/48 horas.

5-Contagem de coliformes totais: verificar a produção de gás nos tubos de Durhan e anotar os

tubos positivos, confirmativos da presença de coliformes totais. Determinar o NMP/ml

utilizando uma tabela de NMP apropriada.

II-Teste Confirmativo de Coliformes Termotolerantes (Fecais)

1-Objetivo: evidenciar o crescimento da E. coli, uma bactéria de habitat reconhecidamente

fecal dentro do grupo coliforme.

2-Meio de cultura: Caldo E. coli (EC Medium)

3-Procedimento: Transferir uma alçada bem carregada de cada tubo de LST onde houve

produção de gás e de todos os tubos negativos em que houve crescimento após 48 horas, para

tubos de caldo E. coli contendo tubos de Durhan.

4-Incubação: em banho-maria 44,5 ± 0,2º C durante 24 ± 2 horas.

5-Contagem de coliformes fecais: verificar a produção de gás nos tubos de Durhan e anotar

os tubos positivos, confirmativos da presença E. coli. Determinar o NMP/ml utilizando uma

tabela de NMP apropriada.