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Bactérias Fitopatogênicas

Carlos Hidemi Uesugi

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Título: Bactérias Fitopatogênicas Autor: Carlos Hidemi Uesugi Editora: CopyMarket.com, 2000

Sumário


BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS Introdução................................................................................................................................................................. 02 1.1. Classificação dos Seres Vivos......................................................................................................................... 05 1.2. Diferenças Entre Procariotos e Eucariotos ................................................................................................. 05 2. Morfologia e Ultraestrutura de Células Bacteriana......................................................................................... 06 2.1. Estruturas da Célula Bacteriana...................................................................................................................... 07 2.1.1 Estruturas Externas a Parede Celular.......................................................................................................... 07 2.1.2. Estruturas Internas a Parede Celular.......................................................................................................... 09 3. Cultivo de Bactérias ............................................................................................................................................ 11 3.1. Tipos Nutritivos das Bactérias........................................................................................................................ 12 3.2. Condições Físicas Necessärias ao Crescimento .......................................................................................... 15 4. Reprodução e Crescimento................................................................................................................................ 17 5. Classificação das Bactérias Fitopatogênicas..................................................................................................... 22 5.1. Divisão I – Gracilicutes................................................................................................................................... 22 5.1.1. Classe Proteobacteria.................................................................................................................................... 22 5.2. Divisão II– Firmicutes..................................................................................................................................... 24 5.2.1. Classe Firmibacteria...................................................................................................................................... 24 5.2.2. Classe Thallobacteria ................................................................................................................................... 25 5.3. Divisão III – Tenericutes................................................................................................................................ 25 5.3.1. Classe Molicuttes .......................................................................................................................................... 25 5.4. Outras Bactérias................................................................................................................................................ 26 5.5. Bactérias Fastidiosas ........................................................................................................................................ 26 6. Espécies de Bactérias Fitopatogênicas.............................................................................................................. 28 7. Aulas Práticas ...................................................................................................................................................... 36 7.1. Características Culturais das Bactérias .......................................................................................................... 36 7.2. Roteiro para Diagnose de Doenças Bacterianas ......................................................................................... 37 7.3. Identificação das Bactérias ............................................................................................................................. 42 7.3.1. Chave para Identificação de Bactérias Fitopatogênicas ao Nível De Gênero H................................. 43 7.4. Meios de Cultura .............................................................................................................................................. 44 7.5. Isolamento de Microrganismos...................................................................................................................... 47 7.5.1. Postulado de Koc.......................................................................................................................................... 50


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1. Introdução

Carlos Hidemi Uesuge

1.1. CLASSIFICAÇÃO DOS SERES VIVOS

Classificação dos organismos vivos

Esquema de classificação Reinos Organismos Incluídos

Plantae Bactérias, fungos, algas, plantas. Linnaeus (1753)

Animalia Protozoários e animais superiores

Plantae Algas multicelulares e plantas

Animalia Animais

Haeckel (1865)

Protista Microrganismos, incluindo bactérias, protozoários, algas, bolores e leveduras.

Plantae Algas multicelulares e plantas

Animalia Animais

Protista Protozoários e algas unicelulares

Fungi Bolores e leveduras

Whittaker (1969)

Monera Todas as bactérias (Procariotos)

Archaebacteria (Archaea)

Bactérias que produzem gás metano, requerem altas concentrações de sal ou requerem altas temperaturas.

Eubacteria (Bactéria)

Todas as outras bactérias, incluindo aquelas mais familiares aos microbiologistas, tais como causadores de doenças, bactérias do solo e da água e bactérias fotossintéticas.

Woese (1977)

Eucariotas (Eucarya)

Protozoários, algas, fungos, plantas e animais.


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Conceito de Classificação dos Cinco Reinos

Robert H. Whittaker (1969)

Ampliou o sistema de classificação de Haeckel e sugeriu três níveis de organização celular para acomodar os três modos principais de nutrição:

1) Fotossíntese, o processo pelo qual a luz fornece energia para converter o dióxido de carbono em água e açúcar.

2) Absorção, a captação de nutrientes químicos dissolvidos em água.

3) Ingestão, entrada de partículas de alimentos não dissolvidas.

Neste esquema de classificação constituem,

Reino Monera que abriga os procariotos ou seja, organismos que normalmente obtém nutrientes somente por absorção, e não podem ingerir alimentos ou realizar fotossíntese.

Reino Protista inclui os microrganismos eucarióticos unicelulares, que representam os três tipos nutricionais: as algas são fotossintéticas, os protozoários podem ingerir alimentos e os fungos limosos (fungos inferiores) somente absorvem os nutrientes.

Organismos eucarióticos superiores são acomodados nos;

Reino Plantae (plantas verdes fotossintéticas e as algas superiores).

Reino Animalia (animais que ingerem os alimentos).

Reino Fungi, organismos que tem parede celular, mas não o pigmento fotossintético clorofila encontrado em outras plantas. Eles absorvem os nutrientes.

Desta maneira os microrganismos foram colocados em três dos cinco reinos: Monera (Bactéria), Protista (protozoários e algas microscópicas) e Fungi (os fungos microscópicos; leveduras e bolores). O sistema de Whittaker coloca todas as bactérias no reino Monera e sugere um ancestral comum para todos os membros deste reino. Entretanto, resultados de intensas pesquisas durante décadas recentes sugerem um ancestral diferente entre os microrganismos, como descrito a seguir.

As três categorias filogenética dos seres vivos (Woese, 1977) Arqueobactérias, Eubactérias e Eucariotos

{©Até 1977 os cientistas achavam que os procariotos eram os mais primitivos de todos os organismos, ficando subentendido que esses organismos, por causa da simplicidade estrutral, eram os ancestrais de eucariotos mais complexos. Carl Woese e seus colaboradores na Universidade de Illinois descobriram que nenhum grupo tinha se desenvolvido do outro. Eles descobriram que os procariotos e eucariotos tinham evoluído por vias completamente diferentes de uma forma ancestral comum. Evidências para sustentar esta idéia vieram de estudos com ácido ribonucléico ribossômico, ou rRNA que é essencial para a síntese de proteínas e, portanto, para a sobrevivência da célula.

RNA formado por seqüência de quatro tipos de ribonucleotídeos, arranjados em várias combinações para formar uma única e longa cadeia de centenas de unidades.

- O rRNA de qualquer organismo particular tem um arranjo distinto de ribonucleotídeos, ou uma sequência nucleotídica específica.

- Os genes que controlam a sequência nucleotídica de rRNA variam lentamente durante milhões de anos de evolução. Portanto, o rRNA pode servir como indicador de como os organismos estão intimamente relacionados. Algumas regiões da molécula de rRNA de todos os organismos vivos permanecem quase as mesmas, a despeito dos 3,5 a 4,5 bilhões de anos de evolução. Esta constância sustenta a ideia de que todos os organismos desenvolveram de formas ancestrais comuns.

- A quantidade de diferenças entre as outras regiões de rRNA pode ser usada para medir o grau de relacionamento entre os organismos. Por ex, se as seqüência de ribonucleotídeos de dois tipos de organismos diferem em grande extensão, a relação entre ambos é muito distante; isto é, os organismos divergiram há muito


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tempo de um ancestral comum. Porém se as sequências mostram mais similaridades, os organismos estão intimamente relacionados e tem um ancestral comum relativamente recente.

- Usando essas técnicas, Woese descobriu que as moléculas de rRNA em grupos de organismos diferem no arranjo ou sequência de seus nucleotídeos. Os eucariotos possuem um tipo geral de sequência e os procariotos um segundo tipo. Mas ele descobriu que alguns procariotos tem um terceiro tipo de rRNA e o arranjo desses rRNA difere dos outros procariotos e eucariotos. Em outras palavras, existem dois tipos principais de bactérias, as designadas archaeobactéria e as eubactérias.

Classificação de Woese

EUCARYA

Reinos:

Plantae

Animalia

Fungi Eumicota (Basidiomicotina) Parede celular com quitina

Protozoa

Fungi Chromista (não tem quitina na parede celular).

ARCHAEA (Archaebacteria); Abriga bactérias Termoacidófilas,

Metanogênicas, Halofilicas

Crenarchaeota - Termofílico extremo

Euryarchaeota - Metanogênicas, Halofílicas extremas

Korarchaeota

Archaea não definido

A parede celular da archaeobacteria é variável, não contém ácido murâmico (peptídioglicana).

A membrana possui lipídios ramificados, com ligação éter.

BACTERIA (Eubacteria); abriga as bactérias verdadeiras.


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1.2. DIFERENÇAS ENTRE PROCARIOTOS E EUCARIOTOS

Alguns elementos diferenciais entre células procarióticas e eucarióticas

Elemento Células procarióticas Células eucarióticas

Grupos nos quais são encontrados como

unidade estrutural.

Bactérias, Algas verdes-azuis Algas, fungos, protozoários, vegetais e animais.

Dimensões do organismo 1-2/1-4 µm ou menor Maior que 5 µm em largura ou diâmetro.

Sistema genético: Localização Nucleóide, corpo cromatínico ou material genético.

Núcleo, mitocôndria, cloroplastos.

Estrutura do núcleo

Não limitada por membrana nuclear. Um cromossomo circular

Limitada por membrana nuclear. Mais de um cromossomo linear

Replicação de cromossoma por mitose

Não Sim

Recombinação genética

Unidirecional. Transferência de DNA de forma diplóide parcial

Fusão de gametas forma diplóides que segrega por meiose

Mitocôndria Ausente Presente

Estrutura de Golgi Ausente Presente

Retículo endoplasmático Ausente Presente

Vacúolos limitados por membranas verdadeiras

Ausente Presente

Parede celular

Peptidioglicana (Mureina ou mucopeptídeo como componente)

Ausência de peptidioglicana

Ribossomo Duas subunidades 30S e 50S - Tipo 70S

Duas subunidades 40S e 60S - Tipo 80S


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2. Morfologia e Ultraestrutura de Células Bacteriana


Dimensões, formas e arranjos das células bacterianas

- Tamanhos (largura)

Ex. Streptococcus, 0,5 µm

Bacillus, 0,8 µm

Pseudomonas, 0,8 µm

Comprimento 1,4 - 2,8 µm

- Formas


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2.1. ESTRUTURAS DA CÉLULA BACTERIANA

2.1.1 Estruturas externas a parede celular

Flagelos

Compostos de 3 partes

- Estrutura basal

- Estrutura semelhante a um gancho

- Um longo filamento externo a parede celular.

Comprimento do flagelo:

- Geralmente é várias vezes o da célula, mas o seu diâmetro é uma pequena fração do diâmetro da célula (Ex. 10 a 20 nm).

Flagelação:

- Muitas espécies de bacilos possuem flagelos, mas raramente os cocos possuem.

- Fixação dos flagelos e numero de flagelos

- Atríquica - Clavibacter


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- Polar - Monotríquica - Xanthomonas

- Lofotríquica - Pseudomonas fluorescens

- Peritríquica - Erwinia

Função do flagelo:

Mobilidade, porém a mecânica exata ainda não é conhecida. Segundo algumas suposições, a cadeia protéica contrai e relaxa alternadamente produzindo movimento ondulatório.

* Flagelos movimentam em velocidade elevada.

Ex: Spirillum serpens - flagelo gira a um ritmo de 2400 rpm e o corpo a 800 rpm. A velocidade calculada de deslocamento da célula é de 50 m/s.

Vibrio comma polar 200 m/s.

Pelos (Fímbrias)

São estruturas que se assemelham aos flagelos, mas não estão envolvidos na mobilidade. São consideravelmente mais curtos do que os flagelos e mais numerosos. São encontrados tanto em espécies moveis como imóveis. Funções das fímbrias:

Possuem várias funções associadas com vários tipos de pelos. Um deles é o pelo F (pelo sexual), serve como porta de entrada de material genético durante a conjugação bacteriana. Outros tipos funcionam como sítios de adsorsão de bacteriófago (vírus bacteriano) e como mecanismo de aderência à superfície do hospedeiro.

Cápsulas

Cobertura viscosa de natureza polissacarídica (dextrano, dextrina, levano, celulose).

Funções da cápsula

* Proteção contra dessecamento

* Em algumas bactérias patogênicas aumenta seu poder infectante. A perda completa da cápsula pode resultar na perda do poder invasor ou infectante da bactéria.

Membrana externa

Todos os envelopes celulares das bactérias Gram-negativas possuem a membrana externa externamente à parede celular. Ela tem uma estrutura complexa consistindo de fosfolipídios, lipopolissacarídeos e vários tipos de proteínas. A membrana externa é ligada covalentemente à camada de peptidioglicana pela lipoproteína. As principais funções da membrana externa inclui 1) proporcionar canais para difusão passiva de nutrientes ou solutos hidrofílicos, 2) estabelecer barreira à permeabilidade a antibióticos, detergentes e outras substâncias tóxicas, 3) proporcionar sítios receptores para bacteriocinas e bacteriófagos, 4) facilitar a formação e a manutenção de pareamento durante a conjugação, e 5) dotar de hidrofilicidade à superfície da célula. Estas funções são realizadas pela proteína de membrana externa (Omp) bem como pelos lipopolissacarídeos.

- Porina

Porinas são poros relativamente não específicos, ou canais, que são organizados como trimeros de tres subunidades da proteína porina. A proteína porina é OmpA em Escherichia coli e OmpF em Pseudomonas aeruginosa e P. syringae. Os genes de OmpF são altamente conservados entre estas duas bactérias, com 72% de homologia de DNA. Os genes de OmpF P. syringae tem 33% de homologia com genes OmpA de E. coli.


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As bactérias Gram-negativas levam cerca de 105 cópias de porinas por célula na sua membrana externa. As porinas são grandes canais repletos de água que permite difusão passiva não específica de solutos hidrofílicos. A permeabilidade para solutos hidrofóbicos é pequena. As mais específicas porinas são também inducíveis dependendo das condições de crescimento. Eles incluem as proteínas responsáveis para permeação específica de maltose e maltodextrina, anions, ferro-sideroforas, e vitaminas B12.

- Lipopolissacarídeos

{©Lipopolissacarídeos cobre cerca de 40% da superfície da célula de bactéria entérica. LPS são moléculas anfipáticas com metade lipídios hidrofóbicos A e metade polissacarídeos hidrofílicos. O lipídio A que é comum para todos os LPS é composto por uma espinha de D-glucosamyl-β-D-glucosamina e cinco e sete cadeias de ácidos graxos saturados de 12 - 16 átomos de carbonos. O polissacarídeo é subdividido em estrutura central e cadeias laterais de antígeno-O. A estrutura central consiste de séries não repetitivas de resíduos de açúcares. A estrutura do antígeno-O exibe considerável variação entre espécies e isolados, e as diferenças são de importância taxonômica. O LPS de algumas bactérias fitopatogênicas tem sido sugeridos como tendo importante papel no reconhecimento da hospedeira. Em isolados de Ralstonia solanacearum avirulentos e reação de hipersensibilidade positiva possuem LPS que perderam o antígeno-O consistindo de rhamnose, 2-amino-2-deoxyglucose e xylose com proporção molar de 4: 1: 1.

Parede celular

* Formação rígida que da forma à célula

* Espessura em média de 10 a 25 nm (100 a 250 Å)

Gram negativas possui membrana externa e camada de peptídioglicana, porém, a peptídioglicana é delgada.

Gram positivas possui uma camada espessa de peptídioglicana.

Estrutura da peptídioglicana

Polímero insolúvel constituinte da parede celular da bactéria.

Composição química e estrutura variam de espécie para espécie, havendo, contudo semelhanças básicas.

São formadas por três tipos de unidades

1)Ácido acetilglucosamina (AGA)

2)Ácido acetilmuramico (AMA)

3)Peptídio constituído por 4 ou 5 aminoácidos de variedade limitada.

2.1.2. Estruturas internas à parede celular

Periplasma

Periplasma é a matriz de polipeptídeos e sacarídeos. Ela contém diversas enzimas incluindo enzimas degradadoras de tecidos vegetais tais como celulases e pectinases. Algumas enzimas localizadas no periplasma funcionam como conversora que processa a conversão de metabolitos não transportáveis em transportáveis. O oligossacarídeo do periplasma tais como β-1,2-D-glucan, derivado de membrana externa é responsável pela manutenção da pressão osmótica do periplasma equivalente ao do citoplasma. Os oligossacarídeos também funcionam para gerar carga líquida negativa para a célula bacteriana através do equilíbrio de Donnan resultante dos resíduos de anions deles.

Protoplasto, esferoplasto

- Célula sem parede celular


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Membrana citoplasmática

*Fica imediatamente abaixo da parede celular, conhecida também como membrana protoplasmática ou simplesmente membrana plasmática e incorpora várias proteínas intrinsecas. A membrana celular consiste de camada dupla de lipídio de 50 a 75% de proteína e 20 a 35% de lipídio base peso seco. O lipídio das bactérias, com exceção da archaeobacteria, é do tipo ácido graxo-glicerol ester.

*A membrana celular contém várias enzimas para metebolismo produtor de energia tais como citocromos, citocromo oxidase, desidrogenases, ATPases, sintetese de proteínas e permeases e tem importante papel na respiração, transporte ativo, rotação flagelar ou segregação de material nuclear na divisão celular.

A energia para o transporte ativo e rotação flagelar é fornecido pela força motiva de proton., ou diferença de potencial eletroquimica protonica através da membrana. A força motiva protonica é gerada pela translocação de protons da matrix do periplasma em consonância com a cadeia respiratória e/ ou hidrólise de ATP pela ATPase.

*É semipermeável, seletiva, controla a passagem de nutrientes e de escórias para dentro e para fora da célula respectivamente.

Invaginações membranosas e sistemas de membrana (mesossomo)

*Em algumas bactérias tais como Clavibacter, Streptomyces e Bacillus, uma parte da membrana invagina para dentro do citoplasma para formar complexa dobra membranosa chamado mesossomo

*Mesossomo está associado com a atividade respiratória, divisão nuclear, formação de septo, formação de esporos e secreção de enzimas hidrolíticas. Associa-se de modo complexo com o material nuclear e sua replicação.

Citoplasma

O material celular contido dentro da membrana citoplasmática pode ser dividido em:

* Área citoplasmática rica em RNA

* Área nuclear rica em DNA

*Material nuclear; Células bacterianas não contém o núcleo típico das células animais e vegetais superiores. Possui dentro de citoplasma corpúsculos que são encarados como estrutura nuclear confinando o DNA da célula bacteriana nesta área (não é um núcleo definido). Proposto, Nucleóide, cromossomo bacteriano etc.

Endospóros

Corpo oval de parede espessa (um por célula) que é uma célula altamente resistente. Chamados também de esporos.

Ex: Bacillus, Clostridium

Composição dos esporos: Ácido dipicolínico, substância não detectada nas células vegetativas. Esta substância está restrita aos esporos bacterianos onde formam de 5 a 10% do peso seco total.


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3. Cultivo de Bactérias


Para o cultivo de bactérias é necessário o conhecimento de suas exigências nutritivas e das condições físicas requeridas.

Exigências nutritivas

-Todas as formas de vidas, dos microrganismos ao homem repartem certas exigências nutritivas em termos de substâncias químicas indispensáveis ao seu crescimento e ao funcionamento normal.

-Todos os organismos vivos requerem uma fonte de energia. Alguns seres vivos, como as plantas verdes, podem utilizar a energia radiante e são denominadas fototróficos. As formas de vida incapazes de utilizar a energia radiante, como a vida animal, dependem da oxidação de compostos químicos para obtenção da energia. Por isso recebem o nome de quimiotróficos. Esses dois tipos de comportamento existem entre as bactérias (fototróficos e quimiotróficos).

-Todos os organismos vivos requerem alguma forma de carbono; todos exigem, ao menos, pequenas quantidades de dióxido de carbono, mas a maior parte também requer certos compostos orgânicos de carbono como os açúcares e outros carboidratos. As plantas usam o dióxido de carbono, convertendo-o pela fotossíntese, em carboidratos. Muitas bactérias também exigem apenas o dióxido de carbono como sua fonte nutritiva e falando sob o ponto de vista nutritivo, tais organismos são autotróficos. Caso possam obter sua energia da luz, recebem o nome de fotoautotróficos; se a energia for obtida pela oxidação de compostos químicos são chamados de quimioautotróficos. outras bactérias são semelhantes aos animais, no sentido de serem incapazes de usar o CO2 como única fonte de carbono e de dependerem de organismos autotróficos para a produção de carboidratos e outros compostos utilizados como alimentos. As formas de vidas que exigem uma fonte orgânica de carbono são heterotróficas.


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3.1. TIPOS NUTRITIVOS DAS BACTÉRIAS

Principais tipos nutritivos das bactérias.

Tipo Fonte de energia para crescimento

Fonte de carbono para crescimento

Exemplo de gênero

FOTOTRÓFICO

Fotolitotrófico (autotrófico) Luz CO2 Chromatium

Fotorganotrófico (heterotrófico)

Luz Comp. orgânico Rhodopseudomonas

QUIMIOTRÓFICO

Quimiolitotrófico (autotrófico)

Oxidação de composto inorgânico

CO2 Thiobacillus

Quimiorganotrófico (heterotrófico)

Oxidação de composto orgânico

Comp. orgânico Escherichia

Adaptado de Pelczar/Reid/Chan Microbiologia vol 1.

Fototróficas

Algumas utilizam CO2 como fonte de carbono - fotolitotróficas

Outras necessitam de compostos orgânicos - fotorganotróficas

Quimiotróficas

Organismos do gênero Nitrobacter são capazes de oxidar nitrito a nitratos e fixar o CO2, preenchendo, assim, suas necessidades de energia de carbono - quimiolitotróficos.

Muitos outros microrganismos quimiotróficos, contudo requerem compostos orgânicos de carbono, dos quais obtém energia por oxidação - quimiorganotróficos. As bactérias fotolitotróficas e quimiolitotróficas são conhecidas comumente, como autotróficas, ao passo que as espécies fotorganotróficas e quimiorganotróficas recebem a designação de heterotróficas.

As bactérias patogênicas às plantas são todas quimioheterotróficas, as quais obtém suas energias do metabolismo de carboidratos, aminoácidos ou outros componentes de carbono orgânico, a qual serve também como principais fontes de carbono.

Eutróficas e oligotróficas

{©Eutróficas são grupos de bactérias que crescem bem em meio completo rico em nutrientes, enquanto as oligotróficas podem crescer somente em meio altamente diluídos, por exemplo, 10-2 a 10-3 vezes. As oligotróficas são muito sensíveis a vários compostos orgânicos do meio de cultura, mas o efeito inibitório da peptona é particularmente pronunciado. Portanto o crescimento de oligotrófas é imensamente suprimido em meio nutriente ágar não diluído. Oligotróficas são comuns em bactérias do solo, colônias contadas em meio rico, são em menor número se comparados àquelas contadas em meio altamente diluído.

Todas as bactérias patogênicas às plantas são eutróficas. Porém Rhizobacter daucus e Rhizomonas suberifaciens, patógenos descobertos recentemente de galhas da cenoura e raiz corticosa de alface, respectivamente, tem


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comportamento oligotrófico. A descoberta destas bactérias implica se meio altamente diluído for usado para estudo, mais patógenos de planta oligotróficos pode ser isolado de raízes de plantas afetadas por causas não conhecidas.

- Fontes de carbono:

Todos os organismos requerem alguma fonte de carbono.

*Fonte de dióxido de carbono, carboidratos.

*Plantas usam dióxido de carbono e converte pela fotossíntese em carboidratos.

*Muitas bactérias também exigem apenas dióxido de carbono como sua fonte nutritiva.

- Tais organismos são: autotróficos.

Quando recebe energia da luz: fotoautotróficos

Quando a energia for obtida pela oxidação de compostos químicos é chamados quimioautotróficos.

* Aqueles que dependem de organismos autotróficos para a produção de carboidratos e outros compostos utilizados como alimentos são ditos heterotróficos.

- Fonte de nitrogênio

* Plantas utilizam nitrogênio na forma de sais inorgânicos como nitrato de potássio

* Animais exigem compostos orgânicos como proteínas e produtos da sua degradação (peptídeos, aminoácidos)

* Bactérias são versáteis - Algumas utilizam nitrogênio atmosférico, outros crescem na presença de compostos nitrogenados inorgânicos ou ainda existem aqueles que retiram nitrogênio das proteínas ou praticamente qualquer composto orgânico nitrogenado.

Nitrogênio Inorgânico - Sais de amônio e nitratos são comumente utilizados como fonte de nitrogênio. Alguns isolados de Ralstonia solanacearum e B. caryophylli realiza denitrificação, isto é, produzem gás a partir de nitrato sob condições anaeróbias.

Nitrogênio orgânico - nitrogênio orgânico é comumente fornecidos na forma de aminoácidos, peptona, extrato de carne, extrato de levedura. Peptona é um excelente nutriente porque contem quase todos os aminoácidos necessários para o crescimento das bactérias, e ainda proporciona um bom efeito tamponante ao meio. Extrato de carne e extrato de levedura são fontes ricas em vitaminas e são usados em combinação com a peptona para acelerar o crescimento bacteriano.

Fósforo e enxofre

* Alguns organismos exigem compostos orgânicos de enxofre, outros são capazes de utilizar compostos inorgânicos, um terceiro grupo pode mesmo utilizar enxofre elementar.

* Fósforo é suprido usualmente na forma de fosfato.

- Elementos minerais

Bactérias exigem vários elementos minerais para o seu desenvolvimento normal. (sódio, potássio, cálcio magnésio, manganês, ferro, zinco, cobre, fósforo e cobalto).


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- Vitaminas

Bactérias apresentam comportamento variável. Embora todas as bactérias exijam vitaminas para o seu processo metabólico normal, alguns são capazes de sintetizar todas as vitaminas.

- Água Todos os nutrientes devem ser dissolvidos em água antes de poderem ser absorvidos pelas bactérias.

Os dez principais bio-elementos, suas fontes e funções no microrganismo.

Elemento Fonte Função no metabolismo

C Composto orgânico, CO2

O

O2, H2O, Composto orgânico.

Principais constituintes do material celular

H H2, H2O, Composto orgânico.

N NH4+, NO3-, N2, Composto orgânico.

S

SO42-, HS-, S0, S2, S2O32-, Composto orgânico.

Constituinte da cisteína, metionina, fosfato de tiamina, coenzima A, biotina e ácido α-lipóico.

P HPO4-2 Constituinte do ácido nucléico, fosfolipídeos, e nucleotídeos.

K K+ Principal cátion inorgânico na célula, cofator de algumas enzimas.

Mg

Mg2+

Cofator de diversas enzimas. Presente na parede celular, membranas e éster fosfato.

Ca

Ca2+

Cofator de enzimas; presentes em exoenzimas (amilases e proteases); dipicolinato de cálcio, o componente mais importante dos endospóros.

Fe

Fe2+ , Fe3+

Presente nos citocromos, ferrodoxinas, e outras proteínas ferro-sulforosas; cofator de enzimas (algumas desidratases)

Adaptado de Pelczar/Reid/Chan Microbiologia vol. 1


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Bio-elementos de menor importância, suas fontes e funções nos microrganismos.

Elemento Fonte Função no metabolismo

Zn Zn2+ Presente em álcool dehydrogenase, fosfatase alcalina, aldolase, RNA e DNA polimerase.

Mn

Mn2+

Presente no superóxido dismutase da bactéria, cofator de algumas enzimas (PEP carcoxikinase, re-citrato sintase).

Na Na+ Requerido por bactérias halofílicas.

Cl Cl-

Mo MoO42- Presente em nitrato reductase, nitrogenase, e formato desidrogenase.

Se SeO32- Presente em glycine reductase e formato dehydrogenase.

Co Co2+ Presentes em enzimas contendo coenzima B12 (glutamate mutase, methylmalonyl-CoA mutase).

Cu Cu2+ Presente em citocromo oxidase e oxigenases.

W WO42+ Presente em algumas desidrogenases de formato.

Ni Ni2+ Presente em urease; requerido para crescimento autotrófico de bactérias oxidadora de hidrogênio.

3.2. CONDIÇÕES FÍSICAS NECESSÄRIAS AO CRESCIMENTO

- Temperatura

Uma vez que todos os processos de crescimento dependem de reações químicas, e que essas reações são influenciadas pela temperatura, o crescimento bacteriano pode ser profundamente afetado por estas condições.

* Temperatura determina em parte ritmo e quantidade total de crescimento.

* Variação térmica pode influenciar os processos metabólicos e a morfologia celular.

- Cada espécie de bactéria cresce sob temperaturas situadas em faixas características.

1) Bactérias psicrófilas: são aquelas capazes de crescerem a zero °C ou menos embora seu ótimo esteja dependendo de temperaturas mais elevadas próximo de 15 ou 20 °C. Diversas espécies da Antártida podem crescer a -7 °C, mas com o ótimo entre 20 e 30 °C.

2) Bactérias mesófilas: são aquelas que crescem melhor em temperaturas situadas entre 25 e 40 °C.

3) Bactérias termófilas: são aquelas que crescem melhor em temperaturas entre 45 e 60 °C.

- Exigências atmosféricas

Os principais gases que afetam o crescimento bacteriano são o oxigênio e o dióxido de carbono.

1) Bactérias aeróbias são aquelas que crescem na presença de oxigênio livre.


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2) Bactérias anaeróbias são aquelas que crescem na ausência de oxigênio livre.

3) Bactérias anaeróbias facultativas são aquelas que crescem tanto na presença como ausência de oxigênio livre.

4) Bactérias microaerófilas são aquelas que crescem na presença de pequena quantidade de oxigênio livre 10-15%

- Acidez e alcalinidade (pH)

Para a maioria das bactérias, o ótimo de pH para o crescimento se situa entre 6,5 e 7,5, mas alguns podem viver nos limites extremos de pHs. Variações mínimas e máximas para a maioria das espécies estão entre 4 e 9.

* Alteração de pH é corrigido com tampões. Combinação de KH2PO4 e K2HPO4


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4. Reprodução e Crescimento


Reprodução

No círculo de crescimento das bactérias o processo mais comum e sem dúvida o mais importante é a fissão binária transversal na qual uma única célula se divide em duas após desenvolver uma parede celular transversal. É um método de reprodução assexuada.

-A fissão binária não é o único método de reprodução entre bactérias.

Streptomyces: produzem muitos esporos reprodutivos (cada esporo da origem

a um novo indivíduo).

Nocardia: produz filamentos que se fragmentam e produzem células bacilar ou cocóides.

Crescimento

Velocidade de crescimento e tempo de geração

- Processo de reprodução: fissão binária, uma célula se divide formando 2 células.

20 → 21 → 22 → 23 → 24 → ......2n

* Tempo de geração: tempo necessário para que uma se divida ou para que a população se duplique.

* O tempo de geração não é o mesmo para todas as bactérias.

Ex. Para E. coli é de 17 min. já para outras pode ser de muitas horas.

Para fins de ilustração, imagine-se a situação hipotética seguinte. Uma bactéria é inoculada num meio de cultura e, após ter decorrido o tempo de geração deste microrganismo, há duas células; depois de outra geração, quatro células; após 3 gerações, oito células em cada uma das gerações sucessivas, admitindo-se a ausência de mortes, a


18

população dobra em número de seus indivíduos. A relação entre os números de células e de gerações pode ser expressa numa série de equações.

B = número de bactérias inoculadas no meio ou contagem bacteriana no tempo zero;

b = número de bactérias ao fim de um dado período de tempo;

t = período de tempo

G = tempo de geração;

n = número de gerações;

log = logaritmos decimais (logaritmos comuns).

Iniciando a experiência com uma única célula, a população total b, ao fim de um dado tempo, seria expressa como:

b = 1 x 2n

onde, 2n é a população bacteriana após a n-ésima geração. Em termos práticos, contudo, o número de bactérias B, introduzido no meio da cultura no tempo zero, não é igual a 1, mas vários milhares, de modo que a formula se modifica:

b = B x 2n (2)

Resolvendo a equação (2) para n, obtém-se:

log b = log B + n log 2

log b - log B

n = ————— (3)

log 2

Substituindo o valor de log 2, que é 0,301, chega-se a:

b

n = 3,3 log — (4)

B

Assim, usando a equação (4), pode-se calcular o número de gerações ocorridas, desde que se conheça a população inicial B e a população b, após o tempo t.

O tempo de geração G é igual ao tempo t (tempo decorrido entre b e B), dividido pelo número de gerações n, ou:

t t

G = –– = –––––––––––

n 3,3 log (b/B)


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Tempos de geração de diversas espécies de bactérias.

Bactéria Meio Temp. ºC Tempo de geração (minutos)

Bacillus mycoides caldo 37 28

B. thermophilus caldo 55 18,3

Escherichia coli caldo

leite

37

37

17

12,5

Lactobacillus acidophilus leite 37 66-87

Mycobacterium tuberculosis sintético 37 792-932

Rhizobium japonicum sais minerais + extrato de levedura + manitol

25 344-461

Staphilococcus aureus caldo 37 27-30

Streptococcus lactis caldo lactose

leite

37

37

48

26

Treponema pallidum teste em coelho 37 1980

Adaptado de Pelczar/Reid/Chan Microbiologia vol. 1


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Tempo de geração de bactérias fitopatogênicas

Bactéria Tempo de duplicação (min)

Método de cultivo

Erwinia amylovora 78 Estacionária

E. carotovora subsp. carotovora 25-30 Agitação

E. chrysanthemi pv. zeae 25 Estacionária

E. herbicola 25-30 Estacionária

Pantoea aglomerans pv. milletiae 25-30 Estacionária

Ralstonia solanacearum 66 Estacionária

P. syringae pv. syringae 73 Estacionária

P. syringae pv. apii 80 Estacionária

Xanthomonas axonopodis pv. citri 90 Estacionária

X. a. pv. phaseoli 134 Estacionária

X. oryzae pv. oryzae 90 Agitação

X.arboricola pv. pruni 92 Agitação

Rhodococcus facians 88 Estacionária

Curtobacterium flaccumfaciens pv. Flaccumfaciens

80 Estacionária

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

115 Estacionária

Agrobacterium tumefaciens 78 Estacionária

A. rhizogenes 121 Estacionária

Adaptado de Goto, M. Fundamentals of Bacterial Plant Pathology.

Ciclo normal de crescimento (curva de crescimento de cultura bacteriana).

* Fase lag: população bacteriana permanece inalterada temporariamente, mas não significa que as células estejam em repouso ou dormente; ao contrário durante esta etapa as células aumentam de tamanho além de suas dimensões normais. São fisiologicamente ativas e estão sintetizando um novo protoplasma, adaptando ao novo ambiente.

- Ao final da fase lag cada célula se divide.

- Nem todos completa a sua etapa lag simultaneamente.

- Ocorre um aumento gradual da população até o término dessa fase.

* Fase logarítmica ou exponencial: durante este período as células se dividem firmemente, num ritmo constante, e o logaritmo do número de células relacionado com o tempo resulta numa linha reta. Em condições apropriadas, o ritmo de crescimento é máximo durante esta fase.

* Fase estacionária: A fase logarítmica do crescimento começa a diminuir depois de várias horas, outra vez de forma gradual, representada por uma curva de transição entre uma linha reta (fase logarítmica) e outra, que é a fase estacionária. Esta tendência para o fim do crescimento pode, ser atribuído a uma série de circunstâncias, particularmente, á exaustão de alguns nutrientes e, com menos frequência, à produção de produtos tóxicos. A


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população permanece constante durante um certo tempo, talvez como resultado da completa cessação das divisões ou do equilíbrio entre o ritmo de reprodução e o equivalente ritmo de morte.

* Fase de declínio ou de morte. Depois do período estacionário, as bactérias podem morrer mais rapidamente do que a produção de novas células, se, de fato, algumas bactérias ainda estiverem reproduzindo-se.

{©Indubitavelmente várias condições contribuem para a morte da bacteriana, mas as mais importantes são a depleção de nutrientes essenciais e o acúmulo de substâncias inibidoras tais como os ácidos. Durante a fase de morte, o numero de células viáveis decresce geometricamente (exponencialmente), em essência, o inverso do crescimento durante a fase log. As bactérias morrem em velocidades diferentes, tal como se comportam em relação ao crescimento. Algumas espécies de cocos Gran-negativos muito rapidamente, de modo que podem restar algumas poucas bactérias vivas após 72 horas ou menos de incubação. Outras, porém, morrem tão lentamente que há células viáveis depois de meses e até anos.

Curva de crescimento típica de bactérias. (A) fase lag; (B) fase log (logarítmica); (C) fase estacionária; (D) fase de morta ou de declínio.


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5. Classificação das Bactérias Fitopatogênicas


REINO PROCARIOTAE

5.1. DIVISÃO I - Gracilicutes

Procariotos com parede celular fina, contendo o tipo de parede Gram-negativa, com células tipo esfera, bastonete ou curvo e hélice. As bactérias fitopatogênicas são todas, do tipo bastonete com raras exceções. A maioria das bactérias fitopatogênicas de importância econômica estão incluídas aqui.

5.1.1. CLASSE - Proteobacteria - maioria bactérias unicelulares.

Família Pseudomonadaceae (antiga clasificação)


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Espécies, biovares e patovares de pseudomonas organizadas de acordo com a homologia de rRNA e DNA.

Reclassificação do grupo de homologia de rRNA do gêneros Pseudomonas (antiga denominação) (Fitopatogênicas).

Grupo de homologia rRNA

Gêneros

I Pseudomonas (Fluorescentes)

II Burkholderia, Ralstonia (Grupo Burkholderia)

III Acidovorax (Comamonadaceae)

IV

V Xanthomonas (Grupo Xanthomonas)

GRUPO Pseudomonas

{©Gênero Pseudomonas - (espécie tipo - Pseudomonas aeruginosa) (Grupo I rRNA). Bastonete reto, raramente curvo, Móvel com, normalmente, mais de um flagelo polar (lofotríquio). Colônia, branca, cinza-claro ou creme. São estritamente aeróbios. Este gênero, além de bactérias fitopatogênicas, contém espécies epífitas e saprófitas, cujos habitats são a rizosfera, o solo, a superfície de plantas, os restos de cultura e água. Há também patógenos de animais. Causa numerosas manchas foliares, queimas, murchas vasculares, podridões moles, cancros e galhas.

Gênero Rhizobacter - (espécie tipo - Rhizobacter daucus). São bastonetes retos ou ligeiramente curvos e Gram negativos. Móveis por flagelos polar ou lateral ou ambos ou imóveis. São aeróbios. Colônia branca ou branca-amarela. Crescimento flocular consistindo de unidade globular em meio líquido. Causa a galha bacteriana da cenoura.

Gênero Rhizomonas - (espécie tipo - Rhizomonas suberifaciens). Bastonetes retos ou ligeiramente curvos. Móveis, por um flagelo lateral, subpolar ou polar, ou imóveis. Colônias brancas ou amareladas lisa ou vincada. São aeróbias. Causa a raiz corticosa da alface

Grupo Burkholderia

Gênero Burkholderia - (espécie tipo - Burkholderia cepacia) (Grupo II rRNA). Bastonete reto, raramente curvo, Móvel com, normalmente, mais de um flagelo polar (lofotríquio). Colônia, branca, cinza-claro ou creme. São estritamente aeróbios Causa numerosas manchas foliares, queimas, murchas vasculares, podridões moles, cancros e galhas.

Gênero Ralstonia - (espécie tipo - Ralstonia picketii) (Grupo II rRNA). Bastonete reto, raramente curvo, Móvel com, normalmente, mais de um flagelo polar (lofotríquio). Colônia, branca, cinza-claro ou creme. São estritamente aeróbios. Causa numerosas manchas foliares, queimas, murchas vasculares, podridões moles, cancros e galhas. Ex. murcha bacteriana do tomateiro (Ralstonia solanacearum).

Grupo Xanthomonas

Gênero Xanthomonas - (Homologia DNA-rRNA Grupo V). Bastonete reto móvel por um único flagelo polar (monotríquia). Colônia quase sempre amarela, havendo três espécies que apresentam colônia branca. São estritamente aeróbios. Produção de pigmento amarelo (xanthomonadina). Causa manchas em folhas frutos, queimas em plantas anuais, perenes. Murcha vascular e cancro em citrus.


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Gênero Xylella - (espécie tipo - Xylella fastidiosa). Bastonete reto (pode haver bastonete ligeiramente curvo). Não móvel. Colônia de dois tipos: lisa e rugosa, ambas opalescentes e circulares. São estritamente aeróbios. Não cresce em meios comuns usados em fitopatologia, pois é exigente em vários componentes químicos. Habitante do xilema. Causa; a pierce disease da videira, phony disease do pessegueiro, a clorose variegada do citrus (CVC) etc..

Família Comamonadaceae

Gênero Acidovorax - (espécie tipo - Acidovorax avenae) (Grupo III rRNA). Bastonetes retos ou ligeiramente curvos, móveis por um único flagelo polar. Causa; mancha foliar em milho, orquídias e melâncias.

Gênero Xylophilus - (espécie tipo - Xylophilus ampelinus). São bastonetes retos ou ligeiramente curvos, Gram negativos, moveis por um flagelo polar. São aeróbios estritos. Causa a necrose bacteriana e cancro da videira.

Família Rhizobiaceae

Gênero Agrobacterium - Bastonete reto. Móvel por um a seis flagelos subpolares ou peritíquios. Colônia branca. São estritamente aeróbios. O processo da doença é devido à presença de plasmídeo específico na célula da bactéria, A. tumefaciens (galha) A. rhizogenes (raiz), A. radiobacter (avirulento).

Gênero Liberobacter - Causa o greening dos citros. Bactéria de floema.

Família Enterobacteriaceae

Gênero Enterobacter - E. cloacae tem sido reportado causando a descoloração marrom do fruto do mamão atraves da infecção oportunistica. Erwinia herbicola, epífita comum, é muitas vezes referidos como sinônimo de Enterobacter agglomerans.

Gênero Erwinia - (espécie tipo - Erwinia amylovora). Bastonete reto Gram-negativo anaeróbio facultativo. Móvel por flagelos peritríquios, com uma exceção (E. stewartii). Colônia branca ou amarela. Algumas espécies possuem enzimas pectinolíticas e, portanto, são capazes de provocar a podridão mole em tecido vegetal.

Gênero Pantoea - A classificação dos isolados em Pantoea spp. é baseado nas diferênças na hibridação de DNA-DNA. A investigação desta parte da Enterobacteriaceae é incompleta, e a aplicação da nomenclatura necessita ser levada em conta espécies altamente relacionadas da Enterobacter e Erwinia.

Gênero Serratia - São membras das enterobacterias gram negativas com flagelos peritriquios. Geralmente formam colônias roseas. S. proteomaculans e S. marcescens tem sido reportado como patogenicos a plantas. O primeiro tem sido reportado causando mancha bacteriana em Protea cynaroides e o segundo causando a “podridão da coroa” em alfafa.

5.2. DIVISÃO II - FIRMICUTES: procariotos com parede celular espessa e forte, indicando o tipo Gram-positivo de parede celular.

5.2.1. CLASSE FIRMIBACTERIA

Gram positivas, bastonetes formadoras de espóros com ou sem flagelos peritríquios.

Gênero Bacillus - São aeróbios ou aeróbioas facultativos. Causa varias doenças tais como podridão da batata em armazenamento (Bacillus sp.), podridão da folha do fumo em processo de secagem (Bacillus sp.), podridão da muda de tomate (Bacillus sp.), podridão da soja (Bacillus sp.), estrias brancas do trigo (B. megaterium pv. cerealis).


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Gênero Clostridium - São estritamente anaeróbios. Causa a podridão da folha do fumo em processo de secagem e Sindrome da madeira molhada do álamo e do olmo.

5.2.2. CLASSE THALLOBACTERIA

Bastonetes irregulares, sem esporos, Gram-positivas.

Gênero Arthrobacter - (espécie tipo - Arthrobacter globiformis). A única espécie fitopatogênica deste gênero é Arthrobacter ilicis, que é a nova designação de Corynebacterium ilicis. Bastonete e coco. Móvel. Aeróbio estrito. Colônia amarela. Causa a queima bacteriana do azevinho americano.

Gênero Clavibacter - (espécie tipo Clavibacter michiganensis). Bastonetes pleomórficos, ou seja, com formas diversas. Não móvel. Aeróbio estrito. Colônia amarela. (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis). Causa murcha bacteriana em tomate, alfafa, batata e cancro em tomateiro (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis).

Gênero Curtobacterium - (espécie tipo Curtobacterium citreum). Bastonete curto, irregular. Móvel por flagelos laterais. Aeróbio estrito.Colônia amarela, alaranjada ou rósea. (Curtobacterium flacunfaciens pv. flacunfaciens). Causa murcha em feijoeiro e outras plantas.

Gênero Rathayibacter - (espécie tipo Rathayibacter rathayi). R. iranicus, R. rathayi, R. tritici. Estas espécies causam exudações amareladas (gomose) na inflorescência, nos grãos em formação e também nas folhas e distorções foliares em trigo e em várias espécies de gramíneas anuais. São bactérias associadas com nematoides do gênero Anguina, necessitando destes como vetores.

NOCARDIFORMES

Gênero Nocardia - Apenas uma espécie tem sido relatada como patógeno de planta (N. vaccinii).

Gênero Rhodococcus - (espécie tipo Rhodococcus rhodochrous). A única espécie fitopatogênica deste gênero é Rhodococcus facians. Células de várias formas (pleomórficas), podendo haver formação de hifas, mas não de esporos. Aeróbio estrito. Não móvel. Colônia alaranjada, cor-de-rosa ou vermelha. Causa a fasciação da ervilha doce.

STREPTOMYCETOS

Gênero Streptomyces - (espécie tipo Streptomyces albus). Apresenta colônia de crescimento lento com aspecto granular, pulverulento e aveludado. Há desenvolvimento aéreo de micélio, que é ramificado, não fragmentado e com cadeia de três ou mais esporos redondos, ovais ou cilíndricos. Gram positiva. São aeróbios.

Causa a sarna da batatinha (S. scabies).

5.3. DIVISÃO III - TENERICUTES: procariotos desprovidos de parede celular, envolvido apenas pela membrana plasmática. São denominados de micoplasmas, incluindo a Classe Mollicutes. Tem reação Gram-negativa. Alguns requerem meios complexos para crescimento e penetram a superfície do meio de cultura, formando colônias do tipo “ovo-frito”.

5.3.1. CLASSE - MOLICUTTES

Família - Spiroplasmataceae

Gênero Spiroplasma - (espécie tipo - Spiroplasma citri). Não possui parede celular. Insensível à penicilina. Sensível à tetraciclina. Forma variada (pleomorfismo), inclusive helicoidal. Não móvel alguma espécies tem


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movimento por deslizamento em superfície úmida e a forma helicoidal tem movimento rotatório e por flexão. Requer esteróis (colesterol) para crescer. A principal espécie fitopatogênica é a Spiroplasma citri agente causal da Stubborn disease (doença teimosa) do citrus.

Família (s) - ainda não conhecidas

Gênero não definido, MLO (Mycoplasma-Like-Organism). Organismos pleomorficos sem parede celular. Morfologicamente se assemelha ao micoplasma. Atualmente mais conhecido como fitoplasmas. Causam numerosas doenças conhecidas como, amarelo, superbrotamento e declínio em árvores e algumas plantas anuais.

5.4. OUTRAS BACTÉRIAS.

Vários outros gêneros incluem bactérias relatadas como patogênicas para as plantas.

Gênero Acetobacter e Gluconobacter - Causa a chamada “doença rosea” do abacaxi e a podridão marrom da maçã e da pera. Estes patógenos são oportunistas e não tem capacidade de afetar outros orgãos além do fruto.

5.5. BACTÉRIAS FASTIDIOSAS

São aquelas que não crescem em meios de cultura utilizados rotineiramente em bacteriologia.

Grupo das Riquetsias: Bactérias baciliformes, de parede celular rígida; patógenos dos sistemas vasculares.

Grupo dos Micoplasmas: Bactérias sem parede celular e sem forma definida.

Grupo dos Espiroplasmas, sem parede celular rígida.

Bactérias do raquitismo da cana de açúcar e de outras gramíneas

Xylella fastidiosa - bactéria causadora da clorose variegada dos citros.

Clavibacter xyli subsp. cynodontis - causa o raquitismo da grama bermuda (Cynodon dactylon); Bermuda-grass stunting.

Clavibacter xyli subsp. xyli - raquitismo da soqueira da cana-de-açúcar; ratoon stunting disease.

Obs: A diagnose de doenças causadas por bactérias fastidiosas são, feitas através de exames de cortes ultra-finos em microscópio eletrônico e pela reação ou reprodução de sintomas em plantas testes inoculadas mecanicamente com o suco do tecido da planta doente, através de vetores ou por enxertia.


27

Classificação das categorias superiores de Procariotos e afiliação das bactérias fitopatogênicas

Reino Divisão Classe Atributo Família Gênero

Gracilicutes Proteo-bacteria

Não fotos-sintético

Enterobacteriaceae Enterobacter Erwinia

Pantoea

Serratia

Pseudomonadaceae Pseudomonas

Rhizobacter

Rhizomonas

Grupo Burkholderia Burkholderia

Ralstonia

Grupo Xanthomonas Xanthomonas

Xylella

Comamonadaceae Acidovorax

Xylophilus

Rhizobiaceae Agrobacterium

Procariotae Liberobacter

Firmicutes Firmi-bacteria

Simples (G+)

Bacillus Clostridium

Tallo-bacteria

Ramifi-cado (G+)

Arthrobacter

Clavibacter

Curtobacterium

Nocardia

Rathayibacter

Rhodococcus Streptomyces

Tenericutes Mollicu-tes ProcariotoSem parede

Spiroplasmataceae Spiroplasma

Afiliação incerta Fitoplasma


28



6. Espécies de Bactérias Fitopatogênicas


Classificação atualizada, segundo Sub-Comité de Taxonomia de Bactérias Fitopatogênicas - ISPP. Names of plant pathogenic bacteria 1864-1995. Review of Plant Pathology 75(9): 721-763, 1996.)

Grupo Pseudomonas

Fluorescentes:

Gênero Pseudomonas

P. agarici

P. amygdali

P. asplenii

P. betle

P. caricapapayae*

P. cichorii*

P. cissicola

P. corrugata*

P. ficuserectae

P. flectens

P. fuscovaginae

P. hibiscicola

P. marginalis*

pv. alfalfae

pv. marginalis*

pv. pastinacae

P. meliae

P. rubrisubalbicans

P. savastanoi

pv. glycinea*

pv. phaseolicola

pv. savastanoi


29

P. syringae* (51 patovares)

pv. apii*

pv. coronafaciens

pv. garcae*

pv. helianthi

pv. hibisci

pv. lachrymans*

pv. passiflorae

pv. pisi

pv. sesami

pv. striafaciens

pv. syringae*

pv. tabaci*

pv. tomato*

P. syzygii

P. tolaasii

P. viridiflava*

Comamonadaceae

Não fluorescentes

Gênero Acidovorax

A. avenae (Pseudomonas avenae)

subsp. avenae (P. rubrilineans; P. alboprecipitans) *

subsp. cattleyae (P. cattleyae)

subsp. citrulli (P. pseudoalcaligenes subsp. citrulli)

A. konjaci (P. pseudoalcaligenes subsp konjaci)

Grupo Burkholderia

Não Fluorescentes

Gênero Burkholderia

B. andropogonis (Pseudomonas andropogonis; P. woodsii)

B. caryophylli (P. caryophylli)*

B. cepacia (P. cepacia)*

B. gladioli (P. gladioli)

pv. agaricicola


30

pv. alliicola*

pv. gladioli*

B. glumae (P. glumae)

B. plantarii (P. plantarii)

Gênero Ralstonia

R. solanacearum*

R. pickettii

R. syzigii

(P. rubrisubalbicans)

Grupo Xanthomonas

GÊNERO, Xanthomonas spp.

Xanthomonas albilineans* X. Cucurbitae

X. fragariae* X. hortorum

X. oryzae* X. hyacinthi

X. populi* X. melonis

X. campestris* X. pisi

X. axonopodis X. sacchari

X. arboricola X. theicola

X. bromi X. translucens

X. cassavae X. vasicola

X. codiaei X. vesicatoria

* Espécies existentes antes da reclassificação

Reclassificação de Xanthomonas

Em Julho de 1995, foi proposta a reclassificação de Xanthomonas baseado no estudo da hibridação DNA-DNA (Valterim et al.).

Nomes validados pela revisão de 1996 (Young, J. M. et al. Names of plant pathogenic bactéria 1864-1995. Review of Plant Pathology 75: 721- 763. 1996).

Patovares de Xanthomonas arboricola

pv. celebensis pv. corylina pv. juglandis pv. populi pv. pruni


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Patovares de Xanthomonas axonopodis

axonopodis alfafae bauhiniae begoniae

beticola biophyti cajani cassiae

citri clitoriae coracanae cyamopsidis

desmondii desmondiigangentici desmondiilaxiflori desmondiirotundifolii

dieffenbachiae erythrinae fascicularis glycines

khayae lespedezae maculifoliigardeniae malvacearum

manihotis* martyniicola mehlusii nakataecorchori

patelii pedalii phaseoli phillanthi

physalidicola poinsettiicola punicae rhynchosiae

ricini* Sesbaniae tamarindi vasculorum

vignaradiatae Vignicola vitians

* Apigmentada

Patovares de Xanthomonas campestris

pv. aberrans pv. armoraciae pv. barbareae pv. campestris

pv. incanae pv. plantaginis pv. raphani pv.alangii

pv. amaranthicola pv. amorphophalli pv. aracearum pv. arecae

pv. argemones pv. arracaciae pv. asclepiadis pv. azadirachtae

pv. badrii pv. betae pv. bilvae pv. blepharidis

pv. boerrhaaviae pv. brunneivaginae pv. cannabis pv. cannae

pv. carissae pv. centellae pv. clerodendri pv. convovuli

pv. coriandri pv. daturae pv. durantae pv. esculenti

pv. eucalypti pv. euphorbiae pv. fici pv. guizotiae

pv. gummisudans pv. heliotropii pv. ionidii pv. lantanae

pv. laureliae pv. lawsoniae pv. leeana pv. leersiae

pv. malloti pv. mangiferaeindicae* pv. merremiae pv. mirabilis

pv. musacearum pv. nigromaculans pv. obscurae pv. olitorii

pv. papavericola pv. parthenii pv. passiflorae pv. paulliniae

pv. pennamericanum pv. phormiicola pv. physalidis pv. sesami

pv. spermacoces pv. syngonii pv. tardicrescens pv. thespesiae

pv. thirumalscharii pv. tribuli pv. trichodesmae pv. uppalii

pv. vernoniae pv. viegasii pv. viticola* pv. vitiscarnosae

pv. vitistrifoliae pv. vitiswoodrowii* pv. zantedeschiae pv. zingibericola

pv. zinniae


32

*Apigmentada

Patovares de Xanthomonas hortorum

pv. carotae pv. hederae pv. pelargonii pv. taraxaci

Patovares de Xanthomonas oryzae

pv. oryzae pv. oryzicola

Patovares de Xanthomonas translucens

pv. arrhenatheri pv. cerealis pv. graminis pv. phlei

pv. pheipratensis pv. poae pv. secalis pv. translucens

pv. undulosa

ESPÉCIES ATUALMENTE VÁLIDAS DE CORINEBACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS E AS DOENÇAS CAUSADAS.

Arthrobacter

Arthrobacter ilicis

Clavibacter spp.

Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

Clavibacter michiganensis subsp. tesselarius.

Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis

Clavibacter tritici

Clavibacter xili subsp. xili

Clavibacter xili subsp. cynodontis

Curtobacterium spp.

Curtobacterium flaccumfaciens pv. betae

Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens

Curtobacterium flaccumfaciens pv. oortii

Curtobacterium flaccumfaciens pv. poinsetiae


33

Rathayibacter spp.

R. iranicus,

R. rathayi,

R. tritici.

Rhodococcus sp.

Rhodococcus facians

MEMBROS DA FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE

GÊNEROS (Erwinia, Enterobacter, Pantoea e Serratia)

ESPÉCIES de Erwinia

{©As diferentes espécies do gênero Erwinia podem ser divididas em três principais grupos: amylovora, ou não causadora de podridão mole; herbicola ou erwinias amarelas; e carotovora ou causadora de podridão mole. Esta divisão, no entanto, é mais uma forma didática que permite ter uma melhor visualização dos diferentes tipos que compõe o gênero Erwinia. Na realidade é impossível colocar uma linha divisória entre estes grupos devido à existencia de muitas formas intermediárias.

Grupo amylovora

As espécies deste grupo são:

E. amylovora.

E. tracheiphila.

E. mallotivora.

E. rubrifaciens.

E. quercina.

E. salicis.

E. psidii. Agente causal do crestamento foliar e das brotações da goiabeira. Ocorre apenas no Brasil e é aqui a única representante do grupo amylovora.

Grupo herbicola

Constituida praticamente pelas variantes de E. herbicola que são predominantemente epífitas, tanto da parte aérea como das raizes

E. herbicola,


34

Espécie deste grupo:

E. herbicola pv. gypsophilae

Grupo carotovora

Agrupa as erwinias causadoras de podridão mole. As mais importantes são a Erwinia carotovora e a E. chrysanthemi.

E. carotovora é distinguida em cinco subespécies

subsp. atroseptica,

subsp. betavasculorum,

subsp. carotovora,

subsp. odorifera

subsp. wasabiae

E. chrysanthemi possui seis patovares.

pv. chrysanthemi

pv. zeae

pv. dianthicola

pv. dieffenbachiae

pv. paradisiaca

pv. partheni

As outras erwinias colocadas neste grupo são:

E. cypripedii

E. rhapontici

GÊNERO Enterobacter

Enterobacter cancerogenus

Enterobacter dissolvens

Enterobacter minipressuralis

Enterobacter pyrinus

GÊNERO Pantoea


35

A classificação dos isolados em Pantoea spp. é baseado nas diferênças na hibridação de DNA-DNA. A investigação desta parte da Enterobacteriaceae é incompleta, e a aplicação da nomenclatura necessita ser levada em conta espécies altamente relacionadas da Enterobacter e Erwinia.

As espécies deste gênero são:

Pantoea aglomerans

P. aglomerans pv millettiae (E. herbicola pv. millettiaea) encontrada no Brasil.

Pantoea ananas

P. ananas pv. ananas (E. ananas = E. herbicola pv. ananas).

P. ananas pv. uredovora

Pantoea stewartii (E. stewartii) e estava incluida no grupo herbicola por ser uma bactéria que forma colônia amarela. Considerada Enterobacteriaceae por ser fermentativa (anaeróbia facultativa), mas não possui flagelos.

P. stewartii subsp. indologenes

P. stewartii subsp. stewartii


36



7. Aulas Práticas


7.1. CARACTERÍSTICAS CULTURAIS DAS BACTÉRIAS

Para descrever as características culturais das colônias bacterianas é necessário considerar quanto aos diferentes aspectos que estas colônias apresentam. Os mais relevantes são:

1) Quanto ao crescimento.

É avaliado em função do tempo necessário para que uma colônia, desenvolvida a partir de uma célula, se torne claramente visível e definida sobre o meio de cultura. Para a identificação de bactérias fitopatogênicas o crescimento das colônias podem ser classificadas em:

Muito rápido: Menos de um dia.

Rápido: Entre 1 e 2 dias.

Médio: Entre 2 e 3 dias.

Lento: Entre 3 e 4 dias.

Muito lento: Mais de 4 dias.

2) Quanto à forma:

Puntiforme Circular Irregular

3) Quanto à elevação:

Convexa Elevada Achatada Umbonada Irregular

4) Quanto à margem:

Lisa Serrilhada Ondulada Lobada Filamentosa

5) Quanto à consistência:

Mucosa, fluida, micelial.

6) Quanto à superfície:

Lisa, rugosa.


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7) Quanto ao brilho:

Brilhante, translúcido, opaco.

8) Quanto à cor:

Amarela, amarela creme, branca, branca acinzentada, etc..

9) Outras características.

- Estas características são definidas em função do meio de cultura e temperatura de incubação utilizada e da idade da cultura.

- Para as bactérias fitopatogênicas são utilizados normalmente os meios NDA (nutriente, dextrose, agar) e 523 (de Kado e Hesket) e a temperatura de 25 a 30 °C.

- A idade da cultura para a observação das características culturais varia com o seu crescimento. Nas bactérias de crescimento rápido é feita até 2 dias; nas de crescimento médio pode ser de 3 a 4 dias; nas lentas, de 4 a 6 dias e nas muito lentas, de 5 a 10 dias ou mais.

7.2. ROTEIRO PARA DIAGNOSE DE DOENÇAS BACTERIANAS

I. Sintomas de doenças bacterianas

Os primeiros dados a serem considerados na diagnose de uma doença de planta são os sintomas causados na hospedeira e as condições ambientais sob as quais esta doença foi constatada.

Os principais sintomas de doenças bacterianas estão listados abaixo:

01. Manchas foliares:

a) Manchas

b) Manchas angulares pequenas (geralmente numerosas) lesões do limbo foliar delimitada pelas nervuras secundárias.

c) Manchas com halo - Causadas pelas bactérias produtoras de certas toxinas que, ao difundirem nos tecidos adjacentes, causam degenerações da clorofila, formando um halo amarelo ao redor da lesão ou da mancha.

d) Crestamento - Grandes lesões necróticas. Podem ser também resultantes da coalescência de lesões menores.

e) Estrias - Lesões alongadas, geralmente observadas em folhas de gramíneas.

Obs: Uma das características peculiares das lesões bacterianas é o encharcamento dos tecidos afetados no início do desenvolvimento das doenças. Exudação de pus é outra característica comum em lesões bacterianas.

02. Lesões nas hastes, pecíolos e frutos:

a) Manchas

b) Podridões

c) Cancros (Lesões abertas)

03. Murchas vasculares ou infecções vasculares:

a) Murcha


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b) Morte descendente

04. Podridões moles

a) Podridões moles (é comum em hortaliças tenras em períodos úmidos, tanto no campo, como em pós-colheita).

b) Canela preta (Podridão mole da medula das hastes da batata)

c) Talo oco (Podridão mole da medula da haste do tomateiro)

Obs: A podridão mole, é causada pelas bactérias que produzem grande quantidade de enzimas pectolíticas. As enzimas pectolíticas destroem rapidamente a lamela média e, ocorre ao mesmo tempo, a morte e a liberação rápida do conteúdo celular.

05. Hipertrofia dos tecidos.

a) Galhas - Desenvolvimento anormal desordenado do tecido afetado.

b) fasciação - Estado achatado e muito ramificado da parte terminal da haste.

06. Sarna

Lesões resultantes do crescimento desordenado e posterior decomposição dos tecidos epidérmicos.

II. Exame de fluxo ou exsudação bacteriana

A exsudação ou fluxo bacteriano nos cortes dos tecidos afetados indica a presença de bactérias. Quando é abundante nas lesões novas ou nos tecidos afetados recentemente, é uma indicação bastante segura de que a bactéria é o agente causal da doença em questão.

A presença ou não do fluxo em lesões velhas não permite, no entanto, nenhuma conclusão.

Por outro lado, caso não for constatado fluxo bacteriano mesmo examinando-se várias lesões de diferentes estágios de desenvolvimento da doença, pode-se concluir que a doença não é bacteriana.

O exame de fluxo permite ainda verificar em que parte do órgão ou do tecido afetado se encontra a maior concentração bacteriana (tecido interno, vascular, parenquimatoso, etc.), possibilitando a escolha da parte mais adequada para o isolamento da bactéria.

O conhecimento da localização da bactéria permite também definir se pode ou não efetuar a desinfecção superficial do tecido com desinfetantes antes de se fazer o isolamento.

Como observar o fluxo bacteriano.

1. Manchas foliares - selecionar a lesão mais nova possível e, com uma lâmina bem afiada, retirar uma seção de aproximadamente 5mm de largura, de maneira que o corte passe pelas partes necrosada de transição e sadia. Colocar a seção sobre a lâmina de vidro com água destilada e cobrir com lamínula. Não deixar espaço vazio sem água sob a lamínula. Examinar ao microscópio. A massa bacteriana quando presente, flui para a água como uma nuvem. Quando muito abundante, pode ser vista até a olho nu.


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2. Tecidos internos - Remover a parte externa e cortar o tecido lesionado em sentido horizontal, de maneira que possa obter uma lâmina de, no máximo, um mm de espessura. Cortar uma seção desta em sentido transversal aos vasos e montar em lâmina de vidro com água e observar como no caso anterior.

3. Murchas vasculares - Nos casos de murchas vasculares, especialmente as causadas por Ralstonia solanacearum, quando a haste é cortada, ela flui abundantemente como pus sobre o corte ou em fluxos densos, quando mergulhados em água (copo ou tubo de ensaio), perfeitamente visíveis a olho nu, contra fundo claro.

III. Isolamento

Como as bactérias apresentam pouca variação morfológica é impossível identifica-las pelo exame direto dos materiais afetados ao microscópio como normalmente se faz com fungos e nematóides.

Assim sendo, a bactéria deve ser isolada para ser posteriormente identificada através das suas características culturais, morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e reação aos tratamentos com corantes.

Nas lesões de plantas são encontradas, além, de bactérias fitopatogênicas, variável gama de bactérias saprófitas que invadem rapidamente os tecidos mortos. A primeira etapa do trabalho de isolamento consiste, portanto em separar esta mistura de bactérias encontradas na lesão através da diluição do extrato do tecido afetado sobre a superfície do meio de cultura adequado, de maneira que as diferentes bactérias cresçam separadamente, formando colônias puras, sem se misturarem entre si.

A identificação das bactérias fitopatogênicas entre as inúmeras bactérias saprófitas que cresceram separadamente na placa de isolamento é feita através de exames e testes rápidos mais adequados para cada caso e todas as não fitopatogênicas devem ser descartadas.

Este trabalho de isolamento está detalhado nos itens abaixo.

a) Escolher a lesão mais nova possível, preferivelmente a que apresenta um fluxo bacteriano abundante.

b) Efetuar uma lavagem ou desinfecção superficial adequada. Quando se trata de tecido espesso ou a parte lesionada se situa na parte interna do órgão, ou ainda, a bactéria se localiza nos vasos do xilema, a desinfecção externa pode ser efetuada mergulhando-se o material no álcool. Quando a localização do patógeno é superficial ou no tecido parenquimatoso das folhas, a utilização de desinfetantes como álcool e hipoclorito é prejudicial, pois pode matar também a bactéria que se pretende isolar. Neste caso, uma boa lavagem em água é o máximo que se pode fazer.

c) Obtenção do extrato bacteriano do tecido afetado

c.1. Das manchas foliares e manchas superficiais das hastes, pecíolos e frutos. Após a desinfecção com álcool ou lavagem com água, recortar em condições asséptica possível, uma pequena secção do tecido afetado (2 a 3 mm de largura) da lesão nova ou da região de transição entre tecido necrosado e sadio. Transferir para uma lâmina de vidro esterilizada e macerar com bastão de vidro, acrescentando-se uma ou mais gotas de água estéril.

c.2. Das lesões vasculares, podridões e lesões internas de tecidos volumosos.

Após a desinfecção externa com álcool, retirar o mais assepticamente possível, a casca, epiderme ou camada superficial com o auxilio de uma lâmina fina (gilete) ou bisturi. Cortar e remover o tecido onde deve estar a maior concentração bacteriana e transferir para tubo de ensaio com 2 a 3 ml de água estéril e deixar a bactéria fluir para a água durante 5 a 10 min. Quando se tratar de tecido lenhoso (infecção vascular), a parte do tecido em que se observa o escurecimento dos vasos deve ser cortada em fatias finas e transferidas para o tubo com água. Para forçar a saída da bactéria, o tubo pode ser agitado, ou mais, o tecido macerado com um bastão de vidro. O extrato bacteriano obtido neste caso é uma suspensão com uma leve turvação esbranquiçada.


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d) Diluição na placa em riscas sucessivas

Tomar uma pequena gota do extrato bacteriano com a alça previamente flambada e espalhar no canto da placa sobre o meio da cultura, riscando-se varias vezes no mesmo lugar com um movimento alternado.

Este meio de cultura, preparado com 2 a 3 dias de antecedência deve absorver rapidamente o liquido(em aproximadamente 30 segundos) sem deixar vestígios de águas na superfície.

Após esta operação, flambar a alça, esfriar e passar novamente 1 a 2 vezes sobre o mesmo local onde foi espalhado a gota do extrato e, depois, riscar sucessivamente em linhas paralelas e bem próximas uma da outra, toda a superfície da placa.

Estes detalhes são fundamentais e devem ser seguidos a risca para se obter um bom gradiente de diluição do extrato bacteriano de maneira a obter colônias separadas sem se misturarem entre si.

e) Incubar a 25 - 30 °C durante 2 a 4 dias.

As colônias que aparecem inicialmente ou que tem crescimento muito rápido formando colônias grandes nos primeiros dias são geralmente bactérias saprófitas, não fitopatogênicas.

Verificar se há colônias isoladas com as características da bactéria ou das bactérias consideradas na diagnose preliminar.

Ao identificar o tipo da colônia da bactéria que se esta pretendendo isolar, transferir o mesmo para um tubo de ensaio com meio inclinado.

Quando não se conhecem as características culturais da bactéria que se pretende isolar ou se elas são confusas ou incertas, deve selecionar as colônias mais prováveis e transferi-las para os tubos. A bactéria que se pretende isolar deve ser separada através de testes rápidos de identificação de bactérias fitopatogênicas para descartar quanto antes possível as bactérias não fitopatogênicas ou saprófitas e possibilitar desta maneira, a execução dos demais testes de identificação.

IV. Características culturais das bactérias fitopatogênicas mais freqüentes no Brasil

1. Agrobacterium - Bactérias de crescimento médio a rápido, colônia circular, lisa, convexa, esbranquiçada brilhante ou levemente opaca e consistência mucosa.

2. Clavibacter michiganensis (Corynebacterium michiganense) - Bactérias de crescimento lento, colônia circular, lisa, convexa, amarela creme clara e consistência semi fluida.

3. Erwinias do grupo carotovora (Erwinia carotovora subsp. carotovora, E. carotovora subsp. atroseptica e E. chrysanthemi). Bactérias de crescimento rápido. Colônia opaca, esbranquiçada com tonalidade cinza ou levemente esverdeada. Bordos irregulares.

4. Pseudomonas andropogonis, P. caryophylli e P. rubrilineans. Bactérias de crescimento médio, circular, lisa esbranquiçada com tonalidade levemente amarelada, ou castanhas. P. caryophylli forma um pigmento castanho em 4 a 5 dias, que se difunde no meio de cultura.

5. P. cichorii, P. marginalis e P. viridiflava - Bactérias de crescimento rápido, colônia circular, bordo irregular, esbranquiçada opaca, levemente esverdeada ou amarelada.

6. Burkholderia. gladioli e B. cepacia - Bactérias de crescimento médio a rápido, colônia circular com bordos lisos ou irregulares esbranquiçados, com tonalidades levemente amareladas, castanhas ou acinzentadas.

7. Ralstonia solanacearum (Pseudomonas solanacearum) (compreende um grande numero de estirpes, variáveis em patogenicidade, virulência e características culturais). Bactérias de crescimento médio. Colônias brancas, opacas ou brilhantes. Quando desenvolvem isoladamente são circulares de crescimento lento. Normalmente formam-se colônias irregulares. Consistência fluida. Várias estirpes produzem pigmentos castanhos que difundem no agar.

8. Pseudomonas syringae (compreende vários patovares). Bactérias de crescimento médio a rápido. Colônia circular, esbranquiçada, levemente esverdeada ou amarelada, bordo liso ou irregular.


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9. Streptomyces - Bactérias de crescimento médio. Colônia micelial ou cotonosa. Torna-se pulverulenta depois de 4 a 5 dias. Branca com tonalidade cinza ou castanha. Pode produzir pigmento castanho que se difunde no meio de cultura.

10. Xanthomonas albilineans - Bactérias de crescimento muito lento. Colônia circular, lisa, convexa, amarela cremosa e consistência fluida.

11. Xanthomonas axonopodis - Compreende grande numero de patovares. Bactérias de crescimento médio. Colônia amarela, circular, lisa, brilhante, convexa e consistência mucosa.

12. Xanthomonas campestris - Compreende a alguns patovares com origem em brássicas. Bactérias de crescimento médio. Colônia amarela, circular, lisa, brilhante, convexa e consistência mucosa.

13. Xanthomonas fragariae - Bactérias de crescimento muito lento. Colônia amarela circular, lisa, brilhante, convexa e consistência mucosa.

V. Testes rápidos para identificação de bactérias fitopatogênicas

1. Teste de hipersensibilidade em folha de fumo.

a) Preparar suspensão bacteriana em água estéril de cada uma das culturas a serem testadas (5 ml de cada em tubo de ensaio). Utilizar somente culturas novas em desenvolvimento (Culturas de 2-3 dias a 28-30 °C).

A turbidez da suspensão deve ser aproximadamente equivalente a escala 7 de McFarland(*) (concentração MF-7), avaliada por comparação, sob o fundo claro.

(*) Escala 7 de McFarland: Misturar em um tubo de ensaio, 9,6 ml de H2SO4 1% (v/v do ácido concentrado em água destilada) e 0,4 ml de BaCl2 1%. Agitar bem antes de usar. Pode ser utilizada por tempo indeterminado, desde que esteja selada hermeticamente.

b) Infiltrar a suspensão bacteriana sob a epiderme, no espaço internerval da face inferior da folha por meio de uma seringa sem agulha. Para isso fazer um pequeno ponto no centro do espaço internerval com alfinete, ajustar bem o ponto no centro do orifício da seringa, pressionando levemente com o dedo pelo lado oposto da folha e infiltrar lentamente a suspensão ate formar uma área encharcada de aproximadamente 1 cm de lado.

É possível testar várias bactérias em folha, dependendo do seu tamanho. A área infiltrada toma uma coloração verde escura, de aspecto encharcado, a qual desaparece dentro de 20 a 30 minutos. Deve preferir as folhas mais desenvolvidas ou maduras para o teste, evitando-se, no entanto, aquelas que já está em fase de declínio.

c) Manter a planta em local iluminado, porém, ao abrigo da chuva.

d) Observar a reação no dia seguinte. A reação é positiva quando a parte infiltrada se necrosa dentro de 12 a 24 horas.

2. Teste de podridão mole em pimentão.

O método consiste em infestar a ponta do palito de dente com massa bacteriana (cultura nova de 1 a 2 dias em meio solido) e fincar no pimentão verde previamente desinfetado com álcool. Em cada pimentão e possível testar 4 a 5 bactérias. Incubar a 28 a 32 °C por 24 a 36 horas dentro de saco plástico para manter a condição de câmara úmida. Em caso positivo, o palito fica solto devido à podridão dos tecidos ao redor. Em caso positivo, o palito continua firme no lugar.

3. Teste de podridão mole em batata.

O método consiste em:


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a) Recortar ascepticamente a batata em rodelas finas de 3mm de espessura e colocar em placas de Petri. Sobre um suporte de vara de vidro, retorcido em forma de U. Para manter uma condição de câmara úmida, colocar um papel de filtro na tampa de placa e embeber com água estéril.

b) Inocular com alça a bactéria a ser testada no centro da rodela e incubar a 28 - 32 °C por 24 horas. Manter sempre o papel bem umedecido.

Quando o resultado e positivo ha uma podridão aquosa a partir do ponto de inoculação, enquanto que em caso negativo a rodela da batata se mantém intacta.

VI. Métodos de inoculação em plantas suceptiveis para testes rápido em patogenicidade.

1. Puntuação da folha.

Consiste em fazer inúmeras perfurações na folha com a ponta de uma agulha e depois passar a suspensão bacteriana com pincel ou cotonete estéril.

2. Puntuação na haste.

Consiste em colocar a massa bacteriana ou suspensão bacteriana na haste e efetuar puntuações com uma agulha.

3. Corte da ponta das folhas com tesoura.

Consiste em "molhar" a tesoura com suspensão bacteriana e cortar a ponta das folhas. ë usado para bactérias que invadem o sistema vascular das folhas.

4. Palito de dente.

Consiste em infestar o palito de dente com massa ou suspensão bacteriana e introduzir no tecido da planta susceptível (haste tenra ou fruto). É usado para bactérias que causam cancros na haste, mortes descendentes, murchas e podridões.

Em todos setes métodos (item 1 a 4) as plantas inoculadas devem ser mantidas em condições de câmara úmida, sob o abrigo da luz solar para assegurar a infecção.

5. Infiltração na folha.

É o mesmo método utilizado para infiltração em fumo, porém, com suspensão muito menos concentrada (1/100 de MF-7). É o método mais rápido e seguro para teste de patogenicidade de Xanthomonas axonopodis pv. citri e X. vesicatoria em folha de citrus e pimentão respectivamente.

6. Inoculação por aspersão.

Consiste em preparar uma suspensão bacteriana 1/100 de MF-7 e aspergir principalmente na parte inferior da folha, onde se encontra o maior numero de estomatos. Aplicar ate ficar bem úmido. Após a infestação manter a planta por no mínimo 24 horas em câmara úmida.

7.3. IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS

CHAVE PARA IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS AO NÍVEL DE GÊNERO.

A chave abaixo é valida somente para bactérias fitopatogênicas que crescem em meios de cultura, utilizados normalmente em bacteriologia. Estas bactérias, excetuando-se as Streptomyces que possuem estrutura micelial, são baciliformes que não formam endosporos. Variam no tamanho de 0,5 a 1,0 µm de diâmetro por 0,3 a 3,0 µm de comprimento.


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1. Tipo de colônia: Micelial......................................Streptomyces

Mucosa ou fluida.......................(2)

2. Teste de Gram: Gram (+).....................................Clavibacter (Corynebacterium)

..................................................Arthrobacter

.................................................Curtobacterium

................................................. Rathayibacter

.................................................Rhodococcus

Gram (-).....................................(3)

3. Teste OF: Fermentativo.......................................Erwinia, Pantoea

Oxidativo...................................(4)

4. Colônias amarelas em NDA: (+). ........................Xanthomonas amarelas

(-).............................................(5)

5. Pigmento fluorescente em King-B:

(+).............................................Pseudomonas

(-)..............................................(6)

6.Crescimento em meio de asparagina:

(+)...........................................Acidovorax, Burkholderia e Ralstonia

(-)............................................Xanthomonas apigmentada

TESTE DE GRAM (Coloração)

-PROCEDIMENTO

1) Diluição

Sobre uma lâmina para microscópio limpa e desengordurada (mergulhar em álcool e enxugar com papel higiênico de alta qualidade) colocar algumas gotas de água destilada estéril, transferir uma pequena quantidade de massa bacteriana e diluir, produzindo uma suspensão ligeiramente turva.

2) Esfregaço

-Limpar e desengordurar uma lâmina, aquecer ligeiramente e transferir com auxilio de uma alça uma alçada da suspensão preparada no item anterior, espalhando sobre a lâmina em círculo de diâmetro de aproximadamente 1 cm. Esperar secar e fazer a coloração.


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3) Coloração

-Sobre a lâmina com o esfregaço colocar algumas gotas do corante cristal violeta de Hucker. Esperar aproximadamente 30 segundos e lavar com água.

-Colocar algumas gotas de solução iodo lugol e esperar aproximadamente 30 seg.

-Lavar com álcool etílico 95%.

-Observar a lâmina contra a luz. Bactérias Gram-positivas retém a coloração azul violeta, enquanto que as bactérias Gram-negativas ficam completamente incolores.

As Gram-positivas podem ser observadas ao microscópio com a objetiva de 100X com óleo de imersão, e apresenta uma coloração azul violeta.

As Gram-negativas, para serem visualizadas ao microscópio, devem ser coloridas novamente. Usa-se safranina (vermelha) para diferenciar das Gram-positivas azuis.

ESTUDO DAS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DAS BACTÉRIAS

-PROCEDIMENTO

1) Diluição

Sobre uma lâmina para microscópio limpa e desengordurada (mergulhar em álcool e enxugar com papel higiênico de alta qualidade) colocar algumas gotas de água destilada estéril, transferir uma pequena quantidade de massa bacteriana e diluir, produzindo uma suspensão ligeiramente turva.

2) Esfregaço

-Limpar e desengordurar uma lâmina, aquecer ligeiramente e transferir com auxilio de uma alça uma alçada da suspensão preparada no item anterior, espalhando sobre a lâmina em círculo de diâmetro de aproximadamente 1 cm. Esperar secar e fazer a coloração.

3) Coloração

- Colorir o esfregaço preparado no item anterior colocando algumas gotas de safranina.

- Esperar por 2 a 3 minutos, lavar com água, secar e observar com objetiva de 100 x. Use óleo de imersão.

7.4. MEIOS DE CULTURA

Meio de cultura é o substrato utilizado para o desenvolvimento de microrganismos, de células, e de tecidos de plantas e de animais, contendo para isso, os nutrientes necessários.

Elementos do meio de cultura

1. Elementos essenciais:

a) Água

b) Carbono Orgânico: carboidratos. (Ex: dextrose, sacarose, maltose, amido etc..).

c) Nitrogênio Orgânico: proteínas e aminoácidos.

Inorgânicos: nitratos e sais de amônio.

d) Elementos minerais: exigidos em maiores quantidades, P, K, Mg, S, Ca, Na.

Microelementos Mn, Fe, B, Zn, Co, Cu, Mo.

e) Fatores de crescimento: Vitaminas do complexo B, Aminoácidos e outros.


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2. Estimulantes: Ex. MgSO4·7H2O, CaCO3, etc..

3. Tamponante: (estabilizador de pH). Exs. K2HPO4, Na2HPO4, CaCO3

4. Solidificante: Ex. Ágar.

5. Inibidores: Ex. Antibióticos, ácidos orgânicos, etc.

6. Indicadores: Substâncias que conferem uma característica especial a colônia da bactéria que se pretende isolar.

Materiais de composição definida: Ex. Dextrose, KNO3, K2HPO4, Tiamina, ZnSO4.

Materiais de composição Indefinida: Muitos materiais de composição indefinidos são utilizados para o preparo de meios de cultura. Exs:

Caldo de batata: Contém grande quantidade de amido (Carboidrato), contém ainda quantidade suficiente de fonte de nitrogênio orgânico, elementos minerais (macro e micro) e alguns fatores de crescimento para permitir o desenvolvimento de fungos e bactérias.

Caldo de verduras: Em comparação com o caldo de batata, é mais pobre em carboidratos e mais rico em sais minerais, e muito rico em fatores de crescimento.

Extrato de malte: Malte é a semente de cevada germinada. Extrato de malte parte solúvel (desidratada) do malte triturado e fervido, é rico em maltose, proteínas solúveis, aminoácidos, sais minerais e fatores de crescimento.

Extrato de carne: É a parte solúvel (desidratada) da carne moída fervida e desengordurada, rico em proteínas solúveis, sais minerais e fatores de crescimento.

Extrato de Levedura: É a parte solúvel (desidratada) das células de leveduras autolisadas. É muito rico em aminoácidos essenciais e vitaminas do complexo B, assim como em sais minerais.

Peptona: É um produto da digestão ácida ou enzimática de proteínas. Existem as mais variadas qualidades de peptonas, dependendo dos materiais utilizados (carnes de diferentes animais, peixes, resíduos de matadouro, soja, amendoim etc.) e do processo de digestão e também da enzima utilizada. As melhores peptonas são aquelas obtidas de carne de boa qualidade. Nestes casos são ricos em proteínas solúveis, aminoácidos essenciais e sais minerais.

Caseína hidrolisada: É uma peptona obtida da digestão ácida ou enzimática do leite, muito rico em proteínas solúveis, aminoácidos essenciais e sais minerais.

Ágar: É uma substância utilizada como solidificante de meios de cultura. As principais qualidades do ágar como solidificante do meio são: a) o seu ponto de liquefação é entre 90 e 100 ºC que permite cultivar os microrganismos nas mais variadas temperaturas; b) o seu ponto de solidificação entre 40 e 50 ºC permite incorporação de muitas substâncias termolábeis antes da solidificação; e c) não é digerido ou hidrolisado pelos microrganismos. Ágar é um polímero de galactose extraídos de algas marinhas do grupo das agarófitas. A qualidade do ágar varia em função do material original e do grau de purificação o qual foi submetido durante a extração.

Meios para fungos: (fórmula para 1 litro)

a) BDA (Batata-Dextrose-Ágar): Caldo de 200 g de batata picada e fervida durante 10 a 15 minutos. Água para completar 1 litro. 10 g de dextrose ou sacarose e 20g de ágar.

b) Meio de malte: Extrato de malte, 20g ; ágar 20g.

c) Meio de verduras: Caldo de 200 g de verduras. Água para completar 1 litro, 3g de CaCO3 e 20g de ágar.

Aos meios de cultura para fungos, quando são usadas para trabalhos de isolamentos, pode-se adicionar inibidores de bactérias para evitar a contaminação. Os inibidores mais utilizados são o ácido lático e os antibióticos: estreptomicina, penicilina, cloranfenicol. Estes inibidores são adicionados ao meio após a esterilização em autoclave.


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Meios para bactérias.

a) NDA (Nutriente, dextrose, ágar): Extrato de carne, 5g; peptona, 10g; dextrose, 10g e ágar. 20g.

b) Meio 523 de Kado e Heskett: Dextrose ou sacarose, 10g; caseína hidrolisada, 8g; extrato de levedura, 4g; fosfato de potássio dibásico (K2HPO4), 2g; Sulfato de magnésio (MgSO4·7H2O), 300 mg; ágar 20 g.

c) NDLA (Nutriente, dextrose, levedura, ágar): Extrato de carne, 5g; peptona, 10g; extrato de levedura, 4g; dextrose, 5g, K2HPO4, 2g; KH2PO4, 0,5g e agra 10g.

d)YD (Extrato de levedura, dextrose e carbonato de cálcio): Extrato de levedura, 20g; dextrose, 10g e carbonato de cálcio 20g.

e) BA (Batata, sacarose, agra) : caldo de 300g de batata picada e fervida; Na2HPO4, 2g; Ca(NO3)2, 0,5g; Peptona, 5g; sacarose, 15g e ágar, 20g.

Aos meios de cultura para bactérias, quando usado para trabalho de isolamento, pode-se adicionar o cicloexamida, conhecido também como actidione ou outros fungicidas para impedir a contaminação com fungos.

Correção de pH. Os fungos não são exigentes quanto ao pH e, por isso, o meio de cultura pode apresentar variações desde 5 a 8 sem afetar o seu desenvolvimento. Em meio muito ácido, no entanto, o ágar tende a se hidrolisar durante a autoclavagem, devendo ser corrigido para, no mínimo pH 6. Quanto às bactérias a grande maioria exige o pH próximo de 7 (neutro).

O pH é medido no potenciômetro ou através de fita de papel universal; em alíquotas de 50 a 100 ml. A correção é feita adicionando-se gotas de soluções de base (KOH, NaOH, etc.) ou ácidos (HCl, H2PO4, etc), tentativamente até obter o pH desejado. Através da regra de três simples, calcula-se a quantidade necessária para corrigir o volume todo.

Preparo de meio de cultura em placas: Os ingredientes devem ser colocados em frascos com dobro do volume do meio de cultura que está sendo preparado, tampado e autoclavado durante 15 a 20 minutos efetivos a 121 ºC (pressão de vapor de 1 atm.). Depois de baixar naturalmente a pressão, deve ser esfriado a aproximadamente 50 ºC para depois verter em placas previamente esterilizadas. Este esfriamento é necessário para reduzir a evaporação e a condensação da água na tampa da placa. Coloca-se aproximadamente 20 ml de meio por placa. Depois de vertido o meio, as placas devem ser mantidas em uma estufa de 30 a 35 ºC por 12 a 24 horas ou a temperatura ambiente por 2 dias em um local arejado e asséptico possível para eliminar a Água de condensação da superfície da placa do meio de cultura.

Preparo de meios de culturas em tubos: Os ingredientes devem ser colocados em frascos e aquecidos até a fervura para fundir o ágar. Depois de bem misturados, o meio é transferido para os tubos de ensaio (8 a 10 ml por tubo) e os tubos tampados com algodão, acompanhados em um recipiente, coberto com uma folha impermeável e autoclavados a 1 atm. de pressão de vapor durante 15 a 20 min. Depois de autoclavado, os tubos são inclinados sobre um suporte de aproximadamente 1 cm de altura até completa solidificação.

Esterilização em autoclave: Autoclave é um equipamento para esterilização de materiais a 110-120 ºC sob pressão de vapor de 0,5 a 1 atm. São utilizadas para esterilização de meios de cultura, líquidos e materiais que não podem ser esterilizados no forno. O tempo de esterilização varia com o material e volume. 500 ml de meio de cultura geralmente é autoclavado a 121 ºC (1 atm.) por 20 min.

Esterilização no forno: Vidrarias e materiais cirúrgicos são geralmente esterilizados a 160-200 ºC por tempo efetivo de 2 a 3 horas.

Tindalização: é o processo utilizado para esterilizar meios que não podem ser aquecidos acima de 100 ºC. Consiste em ferver durante 30 min. eliminando-se, desta maneira, todas as formas vegetativas. Deixa-se, depois, em temperatura de 28 -32 ºC durante 1 dia para que as estruturas de resistência, como endospóros, germinem e passem para a forma vegetava, para então ferver novamente durante 30 minutos. Para assegurar a esterilização, repete-se esta operação mais uma vez, totalizando-se 3 fervuras de 30 min. por três dias consecutivos.


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Filtração: Soluções ou suspensões de substâncias que não podem ser aquecidas acima de 50 ºC são esterilizadas através de filtração. a filtração é mais utilizada para esterilização de carboidratos termolábeis, aminoácidos e vitaminas. Existem vários tipos de filtros, sendo o mais utilizado o de membrana de poros inferiores a 0,4 µ.

7.5. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

1) Isolamento de microrganismos do solo, ar, filoplano e rizoplano.

2) Isolamento de fungos fitopatogênicos.

3) Observação de fluxo bacteriano em lesões de plantas causadas por bactérias fitopatogênicas.

4) Isolamento de bactérias fitopatogênicas.

Primeira parte:

1. Isolamento de microrganismos do ar.

- Abrir as placas sobre a mesa durante 30 minutos.

- Incubar a 28 - 30 ºC por 2 a 3 dias e observar.

2. Isolamento de microrganismos do filoplano

- Lavar bem as folhas, eliminar o excesso de água e deixar secar.

- Pressionar levemente a superfície da folha sobre o meio de cultura da placa de Petri.

- Incubar a 28 - 30 ºC por 2 a 3 dias e observar.

3. Isolamento de microrganismos do solo.

- Coletar o solo, secar à sombra, peneirar e pesar 1g.

- Suspender em 100 ml de água esterilizada (diluição 10-2).

- Efetuar mais 3 diluições em série de 1/10 cada para se obter suspensões diluídas a 10-3, 10-4 e 10-5.

- Transferir 0, 05 ml de cada diluição para placas de BSA com 3 repetições e espalhar uniformemente com alça de Drigalsky.

- Incubar a 28 - 30 °C por 2 a 3 dias e observar.

Esquema de diluição:


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4. Isolamento de microrganismos do rizoplano.

- Coletar raízes de uma planta.

- Lavar e deixar secar a sombra por 15 a 30 min.

- Pesar 1g e macerar em um cadinho com almofariz.

- Suspender o extrato em 100 ml de água esterilizada.

- efetuar diluição em série, de maneira a obter suspensões diluídas de 10-4, 10-5 e 10-6.

- Transferir 0,05 ml de cada diluição para placas de BSA com 3 repetições e espalhar uniformemente com alça de Drigalsky.


Esquema de diluição:

Segunda parte: Isolamento de fungos fitopatogênicos.

1. De lesões foliares:

- Observar as frutificações do fungo sobre as lesões se for o caso.

- Recortar a parte da folha onde estão as lesões.


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- Imergir em solução de álcool 70% por 30 segundos.

- Transferir para solução de hipoclorito de sódio a 1% (água sanitária diluída a 1/2) e deixar por 2 a 3 minutos.

- Transferir para água esterilizada e deixar por 2 a 3 minutos

- Enxugar sobre papel toalha.

- Recortar assépticamente seções da lesão de 1 a 3 mm de lado, preferivelmente da região de transição entre o tecido necrosado e o tecido sadio.

- Transferir as seções recortadas sobre o meio de BDA com antibiótico contra bactéria (estreptomicina). Colocar 5 a 6 seções por placa.


2. De lesões profundas (de frutos, hastes ou raízes):

- Observar frutificações do fungo sobre as lesões, se for o caso.

- eliminar a parte superficial externa da lesão com uma lâmina previamente esterilizada com álcool.

- Recortar assépticamente a parte interna da lesão da região de transição entre o tecido necrosado e sadio e transferir diretamente sobre meio de BDA com antibiótico.


Terceira parte: Observação de fluxo bacteriano em lesões de plantas causadas por bactérias fitopatogênicas.

1. Em lesões foliares ou superfícies.

- Recortar uma secção de aproximadamente 3 mm de largura por 1 cm de comprimento, abrangendo uma área necrosada, área de transição e área sadia. Se a lesão for pequena, corta-se ao meio de tal maneira que na secção recortada fique localizada a metade da lesão. A espessura da lesão deve ser no máximo 0,5 mm para poder fecha-la com lamínula. Para isso, deve-se evitar nervuras espessas ou, se necessário, deve-se efetuar um corte horizontal para eliminar a parte muito espessa.

-Transferir 2 a 3 seções recortadas sobre uma lâmina de vidro, cobrir com lamínula e encher o espaço com água. Coloca-se 2 a 3 seções para que a lamínula não fique inclinada.

- Observar ao microscópio com objetiva de menor aumento. A massa bacteriana, quando presente, flui para a água com um aspecto semelhante a uma nuvem que se dissipa lentamente no ar.

2. Em lesões profundas de hastes, raízes ou fruto.

- Eliminar a parte externa e tomar uma secção fina de no máximo 0,5 mm de espessura e 3 mm de largura

- Transferir sobre a lâmina e cobrir com lamínula, encher o espaço com água e observar ao microscópio como no item anterior.

3. Em lesões vasculares causadas por Ralstonia solanacearum.

- Cortar uma secção de 2 a 3 cm da haste ou do tecido onde se observa o enegrecimento dos vasos e prender no tubo de ensaio ou no copo de vidro, com água, de maneira que somente a parte inferior fique mergulhada na água. O fluxo bacteriano desce em forma de filete branco dentro de 1 a 3 minutos, o qual é visível a olho nu, quando se deixa incidir uma luz lateral contra um fundo escuro. Para que se possa observar o fluxo, não se deve movimentar bruscamente o tubo ou o copo. O exame de fluxo é muito útil para diagnose de doenças bacterianas, uma vez que, quando positivo, é uma indicação bastante segura de que a lesão é bacteriana. Entretanto, quando é negativo, não se pode afirmar que não é bacteriana. Lesões velhas ou muito novas


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geralmente tem poucas bactérias e não podem ser visualizadas em fluxo. È necessário, portanto, observar várias lesões das diferentes fases de desenvolvimento da doença e, se mesmo assim não se observar nenhum fluxo, pode-se concluir que a doença não é bacteriana.

O exame de fluxo é útil também para se saber o tipo de lesão ou o local da lesão onde há maior concentração bacteriana para se fazer o isolamento, ou ainda, para se saber se a bactéria esta localizada nos vasos ou no tecido parenquimatoso. Quando a bactéria esta no tecido parenquimatoso, a desinfecção deve ser rápida para não matar também a bactéria que se quer isolar. Se a localização for no vaso, é possível fazer uma boa desinfecção superficial sem afetar as bactérias que estão no seu interior.

Quarta parte: Isolamento de bactérias fitopatogênicas.

1. De lesões foliares ou superficiais

- Lavar bem o material coletado (Planta com sintoma da doença) com água corrente (de torneira).

- Preparar ao mesmo tempo, a lâmina de vidro desinfetando-a inicialmente com álcool. Limpar a seguir com papel (Guardanapo higiênico) e depois, passar rapidamente na chama.

- Recortar a parte da planta onde esta a lesão e imergir em solução de álcool 70% por 30 segundos.

- Transferir para a solução de hipoclorito de sódio a 1% por 1 a 3 min.

- Transferir para água esterilizada por 2 a 3 min.

- Enxugar sobre uma folha de papel toalha ou papel higiênico.

- Recortar assépticamente, pequenas seções de 1 a 3 mm de lado das lesões novas ou da região de transição entre parte necrosada e sadia.

- Transferir as seções sobre a lâmina desinfetada, colocar 1 a 2 gotas de água e macerar com bastão de vidro previamente flambado.

- Tomar uma alçada do extrato em riscas sucessivas. (seguir orientação do Professor).

2. De lesões ou podridões internas.

- Eliminar a parte superficial da lesão. Não é necessário fazer a desinfecção superficial como no item anterior.

- Retirar pequenas seções ou porções do tecido lesionado interno e transferir para a lâmina desinfetada, macerar e plaquear, seguindo os mesmos procedimentos descritos no item anterior.

{©- As seções ou porções do tecido lesionado pode ser transferido para tubo de ensaio com 2 a 3 ml de água esterilizada em vez de macerar em lâmina. Deixa-se algum mi nuto (1 a 15 min.) para que a bactéria saia naturalmente do tecido para a água. Pode-se agitar o tubo para apressar o processo. Uma alçada deste extrato é plaqueado sobre o meio de cultura, da mesma maneira descrita no item anterior. O método de extração de bactéria em tubo de ensaio é melhor do que a maceração em lâmina quando a quantidade de bactéria presente no tecido é grane, como nos casos de infecções vasculares (Ex. murcha bacteriana causada por Ralstonia solanacearum) e podridões moles.

Postulado de Koch

- Isolar microrganismos associados à doença ou sintoma.

- Obter cultura pura.

- Inocular e reproduzir a mesma doença ou sintoma em hospedeira susceptível.

- Reisolar o mesmo microrganismo de hospedeira susceptível.

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