avaliaÇÃo da seguranÇa prÉ-clÍnica de …
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica
AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA PRÉ-CLÍNICA DE POLIMEROSSOMOS
COMO NANOCARREADORES DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES
Camila Forster
Trabalho de Conclusão do Curso de
Farmácia-Bioquímica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da Universidade
de São Paulo.
Orientador(a):
Profa. Dra Carlota de Oliveira Rangel Yagui
São Paulo
2020
SUMÁRIO
Pág.
Lista de Abreviaturas ...................................................................... 1
RESUMO ...................................................................................... 2
1. INTRODUÇÃO 3
2. OBJETIVOS 6
3. MATERIAIS E MÉTODOS 7
4. RESULTADOS E DISCUSSÃ0 14
5. CONCLUSÃO 28
6. REFERÊNCIAS 28
7. ANEXOS 33
1
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA
Dh
DLS
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
Diâmetro hidrodinâmico
Espalhamento de luz dinâmico
EROs
FDA
HET-CAM
IC 50
NCTC929
NO
PBS
PDI
PGE2
SDS
SIRC
UV
Espécies reativas de oxigênio
Food and Drug Administration
Hen’s Egg Test – Chorioallantoic Membrane
Concentração capaz de inibir em 50% o número de células em cultura.
Linhagem celular de fibroblasto de rato
Óxido nítrico
Tampão fosfato
Índice de polidispersão
Prostoglandina E2
Dodecilsulfato de sódio
Linhagem celular de córnea de coelho
Ultra-Violeta
2
RESUMO FORSTER, C. Avaliação da segurança pré-clínica de polimerossomos como nanocarreadores de enzimas antioxidantes. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2020. Palavras-chave: Nanoestruturas, Polimerossomos, Catalase
O câncer de pele é um dos tipos de câncer com maior ocorrência no mundo devido ao acúmulo de radicais livres e espécies reativas de oxigênio na pele, induzidos pela radiação ultravioleta (UV), além da predisposição genética. Nesse trabalho, investigou-se a segurança pré-clínica de polimerossomos de Pluronic L121 (poli (óxido de etileno)-poli(óxido de propileno poli (óxido de etileno), EO5PO68EO5), com catalase encapsulada para aplicação tópica. A catalase é uma enzima do sistema antioxidativo da pele que remove peróxido de hidrogênio, H2O2, pela conversão em água e oxigênio. As nanoestruturas foram preparadas por dissolução direta de 0,2% p/v de Pluronic L121 adicionado a 0,24 mg/mL de catalase, velocidade de agitação 750 rpm por 48h. Os testes in vitro de citotoxicidade e fototoxicidade foram realizados com linhagens celulares, SIRC e NCTC929, nos quais verificou-se que a catalase é não-irritante enquanto que o polimerossomo diminuiu a viabilidade celular de forma concentração dependente (IC50: SIRC= 49,6 ± 13,5 μg/mL; NCTC929= 83,3 ± 8,3 μg/mL), sendo assim classificado como levemente irritante, resultado próximo do controle positivo dodecilsulfato de sódio (IC50: SIRC= 56,6 ± 1,5 μg/mL; NCTC929= 26,0 ± 4,2 μg/mL). Ambos foram considerados não fototóxicos. O HET-CAM foi empregado para predição do potencial irritante do polimerossomo devido à membrana corioalantóide ser altamente vascularizada e o método ser rápido, barato e sensível. Por meio deste, determinou-se que a catalase e os polimerossomos foram não irritantes porque não promoveram nenhuma alteração na membrana do ovo. Assim, o sistema desenvolvido composto por catalase encapsulada em polimerosomos de Pluronic L121 foi considerado seguro para aplicação tópica e pode ser visto como uma alternativa promissora para a fotoproteção ativa.
3
1. INTRODUÇÃO
A vida na Terra evoluiu sob influência da radiação solar, cuja energia aumenta com a diminuição do comprimento de onda (λ). Portanto, a radiação UV,
de intervalo de λ (nm) inferior, é a mais energética e de maior propensão à indução
de reações fotoquímicas. A radiação ultravioleta (UV) incidente na pele aumenta o
fluxo sanguíneo, provocando a infiltração de células do sistema imune, caracterizando um processo inflamatório UV-induzido. Isso decorre principalmente
pelo aumento da produção de óxido nítrico (NO) e prostoglandinas (PGE2) causado
pela peroxidação lipídica induzida por UV que desencadeia a reação inflamatória na
pele, gerando espécies reativas de oxigênio (EROs). Os EROs podem causar a oxidação, polimerização ou fragmentação das proteínas, acarretando na
modificação do grupamento R dos aminoácidos e danos oxidativo dos tecidos.
Atribui-se aos efeitos descritos uma das vias de indução da fotocarcinogênese
(IKEHATA; ONO 2011; HALLIDAY, 2005; ELIAS, 2008).
O câncer de pele não melanoma (carcinoma basocelular e carcinoma
espinocelular), cujo principal fator causador é a radiação ultravioleta, corresponde
a cerca de 30% de todos os tumores registrados no Brasil, sendo assim considerado
o de maior incidência na população brasileira. Para o ano de 2020, estimam-se 176.930 novos casos no Brasil, sendo 83.770 em homens e 93.160 em mulheres
(INCA, 2020). Além disso, há uma relação direta entre a incidência de câncer não
melanoma e a latitude, quanto mais próximo um indivíduo se encontra da linha do
equador, mais intensos são os índices da radiação UV que ele está exposto (RIGEL, 2008)
A pele apresenta mecanismo endógenos de proteção contra a radiação UV,
como os pelos, que funcionam como uma barreira física; o suor, que absorve e
reflete a radiação incidente; a melanina e o complexo sistema de enzimas anti-radicalares e reparadoras de DNA. (CESTARI; OLIVEIRA; BOZA, 2012; SEITÉ et
al., 2010). Apesar dos mecanismos endógenos para proteção contra os impactos
deletérios da radiação UV na pele, é necessária a utilização de uma proteção
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adicional, como fotoprotetores, além de evitar a exposição solar em horários de
maior incidência da radiação (SAMBANDAN; RATNER 2011). Assim, com o registro
do aumento da incidência do câncer de pele, apresenta-se como estratégia fotoprotetora a aplicação tópica de enzimas que degradam as espécies reativas de
oxigênio (EROs) resultantes da exposição à radiação UV, e, consequentemente,
diminuem o estresse oxidativo celular e auxiliam na prevenção contra o câncer de
pele e o fotoenvelhecimento (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DERMATOLOGIA).
A catalase é uma enzima produzida pelo organismo humano e vários outros
seres vivos, que é responsável pela decomposição do peróxido de hidrogênio, o
qual pode originar EROs e está muito relacionado ao estresse-oxidativo. Assim, a
catalase atua como antioxidante protegendo o tecidos do dano oxidativo causado pelos EROs (ELIAS, 2008). Dessa forma, pensando em uma aplicação tópica de
catalase, espera-se que o aumento da concentração de catalase na pele favoreça
a degradação do peróxido de hidrogênio, prevenindo o fotoenvelhecimento e o
câncer.
Devido à alta massa molecular da catalase (240 kDa), a penetração cutânea
pode ser um obstáculo para sua ação e a utilização de nanoestruturas pode ser a
solução. Nanoestruturas podem aumentar o perfil de penetração cutânea de
determinados ativos por formar uma camada oclusiva na pele, aumentando a hidratação (KIM et al., 2010). Há controvérsias sobre a penetração de
nanopartículas intactas através da pele humana mas, de maneira geral, existem
vários mecanismos de permeação cutânea. Por meio de um modelo teórico,
Watkinson e colabores (2013) concluíram que nanopartículas lipídicas sólidas e lipossomos, por exemplo, aumentam o perfil de permeação cutânea de
determinados ativos por formarem uma camada oclusiva na pele, aumentando sua
hidratação (KIM et al., 2010).
Com o avanço das pesquisas na área da nanotecnologia, novos polímeros e nanoestruturas foram desenvolvidos e aplicados à produtos cosméticos, em
especial, formulações destinadas à proteção contra a radiação UV (MORABITO et
al., 2011). Recentemente, copolímeros anfifílicos têm sido empregados na formação
5
de polimerossomos (ELDAR-BOOCK et al., 2013; ELZOGHBY, 2013; PACHIONI-
VASCONCELOS et al., 2016). Os polimerossomos, estruturas homólogas aos
lipossomos, apresentam forma vesicular com compartimento aquoso interno protegido por uma bicamada formada por copolímeros anfifílicos e, por possuírem
um perfil mais flexível e elástico, podem fluidificar domínios intracelulares, alterando
a natureza estrutural do estrato córneo e favorecendo dessa forma, sua penetração.
Adicionalmente, permitem o controle sobre parâmetros referentes às nanopartículas, tais como, volume interior e espessura da membrana polimérica,
permitindo encapsulação de biomoléculas de alta massa molecular (KIM et al.,
2010; HOCINE et al., 2013; LEE; FEIJEN, 2012; PACHIONI-VASCONCELOS et al.,
2016). Os polimerossomos também são biocompatíveis e permitem a encapsulação de componentes hidrofílicos e hidrofóbicos em seu interior aquoso ou membrana
sintética, respectivamente. (NICOLAS et al., 2013).
Entre os polimerossomos, há os copolímeros tribloco, como o Pluronic L121.
Esse é um copolímero anfifílico não-iônico formado pela polimerização de polióxido de etileno (PEO) e polióxido de propileno (PPO), sendo a cadeia central de PPO a
responsável pela porção mais hidrofóbica enquanto as cadeias laterais de PEO,
pelas porções mais hidrofílicas (PEO-PPO-PEO). Os Pluronics são aprovados pelo
FDA para o uso humano devido à biocompatibilidade e biodegradabilidade, sendo extensivamente utilizados na composição de nanoestruturas (BATRAKOVA;
KABANOV, 2008; BLEUL et al., 2013; CHEN et al., 2011)
Figura 1.a. Estrutura molecular do copolímero tribloco Pluronic L121.
6
Figura 1.b. Desenho esquemático da parede da vesícula de PEO-PPO-PEO
(SCHILLE ́N et al, 1999)
Pelo exposto, justifica-se o desenvolvimento de nanoestruturas poliméricas do tipo polimerossomo para encapsulação de catalase, visando à obtenção de um
veículo de aplicação tópica para utilização dermocosmética, que seja estável e
seguro de acordo com a avaliação in vitro da citotoxicidade e do potencial de
irritação.
2. OBJETIVO(S) Nesse trabalho, foram desenvolvidas nanoestruturas poliméricas do tipo
polimerossomos para encapsulação da catalase, visando à obtenção de formulações de aplicação tópica para utilização dermocosmética em fotoproteção.
A citotoxicidade in vitro e o potencial de irritação da catalase e dos polimerossomos
foram investigados pela avaliação da viabilidade mitocondrial (método de MTT)
empregando-se as linhagens celulares NCTC929 (fibroblasto de rato) e SIRC (córnea de coelho) e o potencial de irritação por método HET-CAM (Hen’s Egg Test
– Chorioallantoic Membrane), respectivamente.
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3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Desenvolvimento dos polimerossomos Utilizou-se o método de formação espontânea de vesículas para
encapsulação da catalase em duas concentrações 0,4 mg/mL e 0,8 mg/mL. O
copolímero empregado para a formação dos polimerossomos foi o Pluronic L121®
(BASF®), EO5PO68EO5, a 0,2% (0,45 mM), completando-se o volume desejado com solução tampão fosfato (pH 7,4). Os sistemas foram agitados em placa de agitação
(Corning PC-420D®) e em seguida centrifugados (3.200xg por 30 min, em centrífuga
5810 R Eppendorf®).
Tabela 1. Condições de preparo das amostras.
Sistema Concentração de catalase (mg/mL)
Velocidade de agitação (rpm)
Tempo de agitação (h)
F1 0,8 1500 24 F2 0,8 1500 48 F3 0,4 1500 24 F4 0,4 1500 48 F5 0,8 750 24 F6 0,8 750 48 F7 0,4 750 24 F8 0,4 750 48
Posteriormente, foi realizada cromatografia de exclusão molecular (SEC, do
inglês size exclusion chromatography) em coluna (Luer Lock, L 1.5 cm × 30 cm,
Sigma-Aldrich Brazil) preenchida com Sepharose (Sepharose 4B, bead diameter
45-165 μm, Sigma Aldrich Brazil) para separação das proteínas livres dos polimerossomos com proteína encapsulada. As amostras dos polimerossomos
foram adicionadas no topo da coluna e eluídas com tampão fosfato (PBS). As
frações foram coletadas e posteriormente analisadas quanto ao espalhamento de
luz dinâmico (DLS, item 3.3.1) para confirmação da presença dos polimerossomos. Devido ao fato catalase ser uma macromolécula (240 kDa), a proteína não
encapsulada demorou mais para eluir, enquanto os polimerossomos eluíram
primeiro, por serem menores.
8
3.2. Eficácia de encapsulação A eficácia de encapsulação foi determinada per método indireto, ou seja, a
partir da concentração total de proteína no sistema e da concentração de proteína livre. Dessa maneira, a concentração de proteína foi determinada na formulação de
polimerossomos com catalase sem centrifugação (encapsulada + livre) e no
sobrenadante obtido após centrifugação a 3.200xg por 30 min (Centrífuga 5810 R
Eppendorf®) (enzima livre). Utilizou-se uma formulação apenas com o polímero a 0,2% sob as mesmas condições de preparo que a formulação F8 (750rpm por 48h)
e uma solução de catalase 0,4 mg/mL para se estudar a interferência destes no
método. Para todas as amostras contendo Pluronic L121, realizou-se duas diluições
seriadas com PBS, uma de 3:7 e outra de 70x (para que a concentração estivesse abaixo da concentração micelar crítica, CMC, durante o ensaio). Empregamos o
método de Micro BCA (item 3.4) para determinar a concentração de proteínas e a
leitura espectrofotométrica das amostras obtidas a 562 nm em leitor de placas
(Spectra max Plus 384®).
3.3. Caracterização dos sistemas de polimerossomos 3.3.1. Determinação do diâmetro médio das nanoestruturas e
índice de polidispersão
O diâmetro médio e índice de polidispersão foram determinados por
espalhamento de luz dinâmico (DLS). As medidas foram realizadas em
equipamento Zetasizer Nanoseries ZEN 3600®. Para análise, alíquotas de 1,0 mL
dos sistemas nanoestruturados foram inseridas no equipamento e registrada a leitura dos referidos parâmetros. A análise de diâmetro foi realizada utilizando-se
cubeta de vidro de 1,0 cm de caminho ótico. As análises foram conduzidas em
triplicata (SIQUEIRA, 2008).
3.3.2. Microscopia eletrônica de transmissão
A análise de MET foi realizada em um microscópio Jeol 100 CX II (com
aceleração de voltagem de 80 kV). Foram depositados 5 µL da amostra em grids
9
de cobre recobertos por filme de carbono, 5 µL de ácido fosfotúngstico foi utilizado
como agente de coloração negativa, seguido de lavagem com 5 µL de água
ultrapura (Milli Q®, Millipore), entre estas etapas foi esperado o tempo de 1 min e retirado do excesso de líquido com papel de filtro.
3.4. Quantificação proteica
A concentração de proteína (catalase) foi determinada pelo método do ácido
bicinconínico empregando-se o QuantiPro BCA Assay Kit (Sigma®) e uma curva padrão a partir de BSA (albumina de soro bovino) em concentrações fixas (Anexo
1). Para obter o reagente de trabalho misturou-se 25 partes do reagente QA e 25
partes do reagente QB. Após os reagentes QA (solução de carbonato de sódio,
tartarato de sódio e bicarbonato de sódio em 0,2 M de hidróxido de sódio, com pH 11,25) e QB (solução 4% (p/v) de ácido bicinconínico, pH 8,5) estarem misturados,
adicionou-se uma parte de reagente QC (solução 4% (p/v) sulfato de cobre (II)
pentahidratada) e agitou-se até obter uma cor verde uniforme. Para o ensaio,
misturou-se 150 μL do reagente de trabalho com 150 μL da solução em análise em placa 96 poços, e o branco utilizado foi o tampão fosfato (PBS). A placa foi incubada
à 37°C por 2h e a leitura espectrofotométrica realizada a 562 nm (Spectra max Plus
384®). As análises foram conduzidas em triplicata (SIQUEIRA, 2008).
3.5. Determinação da atividade enzimática da catalase
A atividade enzimática da catalase foi determinada epectrofotometricamente
(240nm, caminho ótico = 1 cm), baseado na taxa de redução contínua do peróxido
de hidrogênio como observado na reação seguinte:
Para tal, foi preparada uma solução de peróxido de hidrogênio (0,036% p/p)
em tampão fosfato (50 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,0 a 25 °C). Em
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seguida, foi determinada a absorbância dessa solução, utilizando tampão fosfato
como branco, sendo que o valor deve estar entre 0,550 e 0,520. Posteriormente, foi
preparada uma solução de catalase (~ 100 unidades/mL) em tampão fosfato. Por fim, a reação deu-se em cubeta de quartzo (caminho ótico = 1 cm) após a adição
de 2,90 mL de solução de peróxido de hidrogênio e 0,1 mL da solução de catalase.
Foram realizados registros do tempo (em minutos) necessário para a A240 decair a
partir de 0,45 a 0,40 unidades de absorbância. A atividade enzimática da catalase foi calculada a partir da equação a seguir (Beers & Sizer, 1952; Stern, 1937):
Unidades/ ml de enzima =
Em que:
• 3,45 refere-se ao decréscimo de 0,45 a 0,40 em A240 provocado pela
decomposição de 3,45 µmols de peróxido de hidrogênio em 3.0 mL de meio
reacional;
• t = tempo em minutos requerido para decréscimo de 0.45 a 0.40 em A240;
• 0,1 é o volume em mL de solução de enzima adicionado a cubeta; e
• dl é o fator de diluição.
3.6. Avaliação da citotoxicidade dos sistemas nanoestruturados
Células NCTC929 e SIRC, originadas de fibroblasto de camundongos e da
córnea do coelho, respectivamente, manipuladas em câmara de fluxo laminar
Airstream® ESCO Class II BSC, foram cultivadas em meio de cultura DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium, Sigma®) suplementado com 10,0% v/v de soro
fetal bovino (SFB) (Sigma®), 1,0% v/v de solução de estreptomicina e penicilina
(Pen-Strep Gilco®) em atmosfera umidificada de incubadora a 5,0% de CO2 e à
37°C (CO2 Incubater LEEC®). As células, ao atingirem confluência entre 70-85%, foram tripsinizadas (Trypsin 10x Solution, Sigma®) e subcultivadas em frasco estéril
de 25 cm2 (T-Flask, treated, vented cap, sterile, VWR® Tissue Culture Flask) (etapa
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denominada de “passagem”, necessária para manutenção da cultura) ou microplaca
de 96 poços (Orange Scientific® Tissue Culture Testplates) (ensaio de
citotoxicidade), capacidade de 200,0 µL/poço (KONTARGIRIS et al., 2012; PSOTOVA et al., 2006). As células destinadas para o ensaio da citotoxicidade foram
transferidas para microplaca na densidade celular igual a 1,0 x 10⁵ células/poço e
foram mantidas em cultivo por 24 h nas condições anteriormente descritas. Após,
as amostras (catalase e polimerossomos) foram adicionadas às células. Como controles positivo e negativo, foram utilizados dodecilsulfato de sódio (SDS) 1
mg/mL e meio de cultura DMEM suplementado com 5,0% v/v de soro fetal bovino,
respectivamente. O tempo de contato das células com as amostras (e controles) foi
de 24h. Concluído o período de exposição, o meio de cultura foi removido; novo meio contendo o reagente NR (Neutral Red, Sigma®) a 1:79 foi adicionado e foi
realizada a incubação por 3h (5,0% CO2 a 37,0°C). O reagente foi removido e
adicionou-se 100 µL de solução de dispersão 50% álcool etílico, 49% água
deionizada e 1% ácido acético glacial. Os poços das microplacas foram homogeneizados com auxílio de micropipeta multicanal (Gilson®) e a absorbância
das amostras foi determinada a 540 nm em espectrofotômetro (leitor de placas,
Multiskan FC, Thermo Scientific®). Os ensaios foram realizados em triplicata
(ALARIFI et al., 2013).
3.7. Avaliação da fototoxicidade dos sistemas nanoestruturados
Células NCTC929 foram manipuladas e cultivadas conforme explicado no
item 4.2 (KONTARGIRIS et al., 2012; PSOTOVA et al., 2006). As células destinadas para o ensaio de fototoxicidade foram transferidas para microplaca na densidade
celular de 1,0 x 10⁵ células/poço e mantidas em cultivo por 24 h nas condições
descritas no item 4.2. Após, as amostras (catalase e polimerossomos) foram
adicionadas às células. Como controles positivo e negativo, utilizou-se a tetraciclina e meio de cultura DMEM suplementado com 10,0% v/v de soro fetal bovino,
respectivamente. As placas foram então incubadas a 5,0% de CO2 e à 37°C (CO2
Incubater LEEC®) por 1h e depois metade das placas foram submetidas a
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irradiação de 5J/cm² por 35 minutos (Suntest® CPS+). Após, foi realizada a lavagem
das placas com PBS e incubou-se as placas com meio de cultura DMEM
suplementado com 10,0% v/v de soro fetal bovino a 5,0% de CO2 e à 37°C (CO2 Incubater LEEC®) por 24h. Concluído o período de incubação, o meio de cultura foi
removido, novo meio contendo o reagente NR (neutral red, Sigma®) a 1:79 foi
adicionado e incubou-se por 3h (5,0% CO2 a 37,0°C). O reagente foi então removido
e adicionou-se 100 µL de solução de dispersão 50% álcool etílico, 49% água deionizada e 1% ácido acético glacial. Os poços das microplacas foram
homogeneizados com auxílio de micropipeta multicanal (Gilson®) e a absorbância
das amostras foi determinada a 540 nm em espectrofotômetro (leitor de placas,
Multiskan FC, Thermo Scientific®). Os ensaios foram realizados em triplicata (ALARIFI et al., 2013)
Os dados foram então analisados por meio do Software Phototox versão 2.0
para determinação do PIF (“photo irritation fator” – fator de fotoirritação) pela
Equação 1 e do MPE (“mean photo effect” – foto efeito médio) pela Equação 2 (OECD, 2004).
Em que IC50(-Irr) a concentração da substância em análise em que houve redução
de 50% da viabilidade celular sem irradiação da placa, e IC50(+Irr) quando houve
irradiação.
Em que, o fotoefeito (PEci) em qualquer concentração é definido como o produto do
efeito resposta (REc) e do efeito dose (DEc), ou seja, PEci = REc x DEc. O efeito
resposta é a diferença entre as respostas observadas na presença e ausência de
irradiação, ou seja, REc = Rc(-Irr) – Rc(+Irr).
(Eq. 1)
(Eq. 2)
13
3.8. Avaliação do potencial de irritação ocular por método in vitro HET-CAM - Hen's Egg Test – Chorioallantoic Membrane
Ovos de galinhas fecundados (galados) foram incubados por 9 dias a 37 oC e 65% de umidade relativa. Após o período de incubação, os ovos foram abertos
com auxílio de uma pinça e a membrana da casca foi hidratada com 300μL de
solução fisiológica (NaCl 0,9% p/v). Posteriormente, o mesmo de volume de
amostra de polimerossomos foi depositado sobre a membrana corioalantóide. O controle positivo do teste foi realizado com dispersão de dodecilsulfato de sódio
(SDS) a 1,0% (p/v) e o controle negativo com solução fisiológica. (WILSON; STECK,
2000). O ovo foi acomodado em um suporte e a câmera posicionada de maneira a
gravar as alterações da membrana corioalantóide com nitidez. Os eventos vasculares (hemorragia, lise ou coagulação) foram gravados (câmera DigiMicro 2.0
Scale) por 5 minutos (300 segundos) e analisados posteriormente. O índice de
irritação ocular (IS) foi calculado de acordo com a Equação 3 (KALWEIT et al.,
1990). Os ensaios foram realizados em triplicata.
𝐈𝐒 =(301 − 𝐇)
300 . 5 +(301 − 𝐋)300 . 7 +
(301 − 𝐂)300 . 9
Em que :
• H – tempo (s) para iniciar um evento hemorrágico;
• L - tempo (s) para iniciar uma lise vascular; e
• C - tempo (s) para iniciar uma coagulação.
A partir da Equação 3, as nanoestruturas foram classificadas quanto ao
potencial de irritação ocular conforme a Tabela 2. (KALWEIT et al., 1990)
(Eq. 3)
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Tabela 2. Classificação do potencial de irritação ocular (KALWEIT et al., 1990)
Índice de irritação ocular (IS) Classificação
0 - 0,9 Não irritante 1- 4,9 Levemente irritante
5 - 8,9 Moderadamente irritante 9 - 21 Fortemente irritante
3.9. Análise estatística A análise estatística foi realizada empregando-se o programa Minitab versão 18 (SPSS Inc, Chicago, IL) e nível de significância de 5% (p ≤ 0,05). Os
experimentos foram conduzidos de forma randômica, em triplicata. Quando
necessário, os dados foram analisados por ANOVA e em seguida pelo teste de
Tukey para comparação (p≤0.05).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Caracterização da catalase obtida comercialmente A catalase obtida comercialmente for caracterizada quanto à concentração
de proteínas e atividade, para que pudéssemos realizar os ensaios subsequentes.
A partir da curva de calibração de BSA, obtivemos que a concentração de proteínas
na amostra de catalase comercial era de 53%, sendo o restante provavelmente correspondente a excipientes empregados no processo de liofilização. A partir da
metodologia descrita no item 3.5, obteve-se a atividade enzimática igual a 26.037,74
U/mg de proteína, sendo o valor dado pelo fornecedor de 10.000U/mg de proteína.
Provavelmente, o fornecedor considerou a massa total do pó para o valor de atividade específica apresentado.
O diâmetro médio e índice de polidispersão foram determinados por
espalhamento de luz dinâmico (DLS), conforme descrito no item 3.3.1. Assim,
15
observa-se no gráfico da solução de catalase (Figura 2) um pico grande em 11 nm
e dois pequenos em 350 nm e 4000 nm, aproximadamente. O pico maior pode estar
associado à agregação proteica. No entanto, o gráfico de distribuição de tamanho por número mostra somente um pico em aproximadamente 8 nm, confirmando a
presença da enzima pura e com uma leve taxa de agregação. O índice de
polidispersão da solução de catalase foi 0,28.
Figura 2. Medida do diâmetro hidrodinâmico em função da intensidade de
espalhamento de luz da solução de catalase. A) DLS - Distribuição por intensidade;
B) DLS - Distribuição por número
4.2. Preparo e caracterização dos polimerossomos
Para a encapsulação da catalase em polimerossomos de Pluronic L121, oito
sistemas foram investigados variando-se os parâmetros: concentração de catalase,
tempo de agitação e velocidade de agitação, conforme descrito no item 3.1, a fim de encontrar o sistema mais estável. Após o período de agitação, para todas as
condições, a observação visual indicou a formação de sistema coloidal devido à
presença do efeito Tyndall, o qual é característico desse tipo de sistema e consiste
na dispersão da luz pelas partículas coloidais ou em suspensão. (LIMA, 2014)
16
Na Tabela 3 são apresentados os dados de diâmetro hidrodinâmico (Dh) e
índice de polidispersão (PDI) para as diferentes formulações investigadas. Observa-
se que o tamanho médio das vesículas sofreu alteração conforme as condições de preparo dos polimerossomos. Formulações de administração tópica com vesículas
de 300 nm ou menos podem alcançar camadas mais profundas da pele, enquanto
as de tamanho maior que 600 nm tendem a ficar depositadas nas camadas mais
superficiais da pele, portanto, para o objetivo do trabalho o ideal são vesículas em torno de 300 nm. Além disso, para formulações farmacêuticas o valor adequado do
índice de polidispersão (PDI), que fornece informações sobre a homogeneidade da
distribuição dos tamanhos, é menor que 0,3, pois assim pode-se afirmar que o
sistema é monodisperso e possui homogeneidade de tamanho das vesículas (DANEI et al, 2018). Assim, considerando o PDI e o tamanho das vesículas, nota-
se que as formulações F4 e F8 apresentam os resultados mais adequados para o
objetivo do trabalho, enquanto as demais formulações apresentam um maior
tamanho de partícula e/ou PDI. Comparando-se a formulação F8 com a de polimerossomo branco preparado nas mesmas condições, nota-se um aumento de
tamanho devido à encapsulação da catalase (Figura 3) e a manutenção do PDI
baixo.
17
Tabela 3. Tamanho médio e índice de polidispersão dos polimerossomos de L121,
obtidos a partir de medidas de espalhamento dinâmico de luz (DLS). As barras de
erro correspondem ao desvio padrão.
Amostra Concentração de catalase
(mg/mL)
Velocidade de agitação
(rpm)
Tempo de agitação
(h) Dh
(nm) PDI
Polimerossomo branco - 750 48 242,0 ± 36 0,28
F1 0,8 1500 24 290,6 ± 3,93 0,306 ± 0,054
F2 0,8 1500 48 746,2 ± 66,6 0,463 ± 0,041
F3 0,4 1500 24 316,4 ± 5,22 0,383 ± 0,012
F4 0,4 1500 48 391,5 ± 14,0 0,105 ± 0,046
F5 0,8 750 24 387,9 ± 8,5 0,486 ± 0,052
F6 0,8 750 48 349,5 ± 4,83 0,235 ± 0,021
F7 0,4 750 24 427,1 ± 15,50 0,562 ± 0,061
F8 0,4 750 48 340,5 ± 5,15 0,185 ± 0,011
Legenda: CAT= concentração de catalase; Dh= diâmetro hidrodinâmico (intensidade de
espalhamento); PDI= índice de polidispersão.
Na Figura 3, observam-se picos em torno de 260 nm tanto para a formulação
com catalase quanto para o sistema sem enzima, indicando que foram obtidas
nanoestruturas nessa faixa de tamanho. Pode-se observar com base na proximidade das curvas que a adição da catalase não provocou diferenças
significativas no sistema, ou seja, o sistema foi capaz de acomodar a enzima sem
que houvesse interferência significativa no processo de agregação das moléculas
de copolímero e no tamanho médio das vesículas formadas. O índice de
18
polidispersão observado para o polimerossomo branco foi de 0,28, e do
polimerossomo com catalase (formulação F8) foi 0,185 ± 0,011.
Figura 3. Medida de diâmetro hidrodinâmico em função da intensidade de
espalhamento de luz da formulação de polimerossomo com catalase e sem adição
da enzima, preparados nas condições da amostra F8, conforme Tabela 3.
4.3. Eficiência de encapsulação
Os oito sistemas foram submetidos ao ensaio de eficiência de encapsulação
com a intenção de determinar quais seriam as condições mais favoráveis para
formação dos polimerossomos com a enzima encapsulada. Os resultados obtidos
estão apresentados na Figura 4.
19
Figura 4. Eficiência de encapsulação dos oito sistemas estudados para
polimerossomos de Pluronic L121 contendo a enzima catalase.
Pode-se observar que a formulação com a maior taxa de encapsulação foi o
sistema F8, correspondendo a EE = 61,6%, o qual foi preparado com a menor concentração de catalase (0,4 mg/mL), menor velocidade (750 rpm) e maior tempo
(48 h) de agitação. Este resultado provavelmente foi observado devido ao fato das
partículas de L121 necessitarem de tempo e equilíbrio de tamanho de partícula para
se auto agregarem em vesículas unilamelares (SCHILLE ́N et al, 1999). Dessa forma, admitiu-se a formulação F8 como a ideal para a realização dos demais
testes.
Apesar da quantificação indireta por centrifugação ser comumente utilizada
para determinação da eficiência de encapsulação de lipossomos e nanopartículas poliméricas, acreditamos que nossos valores possam estar superestimados. A
elevada força de centrifugação a que o Pluronic L121 foi exposto provavelmente
provocou uma interação entre as camada de poli(óxido de etieno) que,
consequentemente, criou uma rede aprisionando a catalase não encapsulada, por esta ser uma macromolécula (240 kDa) (PACHIONI-VASCONCELOS, 2016). Com
isso, é provável que a quantidade de catalase encapsulada tenha sido menor do
43,9 45,9
6,810,3
0,85,6
25,7
61,6
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
Efic
iênc
ia d
e en
caps
ulaç
ão (%
)
Código das formulações
Legenda: Barras de erro = desvio padrão
20
que o resultado obtido na análise. Entretanto, em conjunto com os resultados
obtidos por DLS (item 3.3.1) no qual o polimerossomo apresentou homogeneidade
na distribuição do tamanho das partículas (HD = 340,5 ± 5,15 nm e PDI = 0,185 ± 0,01), a formulação F8 foi considerada a melhor para prosseguimento dos ensaios.
4.4. Microscopia eletrônica de transmissão
Obteve-se as imagens da vesícula composta apenas pelo polímero Pluronic L121 (Figura 5) e da vesícula de Pluronic L121 com a catalase encapsulada
(formulação F8) (Figura 6). As imagens confirmam a obtenção de estruturas
vesiculares esféricas, sendo que as vesículas contendo catalase apresentaram
tamanho superior (diâmetro de aproximadamente 300 nm em comparação à 200 nm para as vesículas vazias). Observa-se uma variação dos resultados em
comparação ao método de DLS, sendo que as vesículas aparentam ser menores
quando observadas ao microscópio. Isso em geral ocorre devido ao tratamento ao
qual as amostras são submetidas para a microscopia, que envolve desidratação.
Figura 5. Microscopia de transmissão eletrônica dos polimerossomos de Pluronic
L121.
21
Figura 6. Microscopia de transmissão eletrônica dos polimerossomos de Pluronic
L121 com catalase (Formulação F8).
4.6. Avaliação in vitro da citotoxicidade dos sistemas nanoestruturados
A catalase não apresentou nenhum efeito citotóxico nas linhagens SIRC e
NCTC929, como era esperado, uma vez que esta é uma proteína já presente em
diversas espécies (Figura 7). Já com o polimerossomo branco (sem catalase), houve redução da viabilidade celular em ambas as linhagens de forma dependente
da concentração do polímero (Figura 8). Os valores de IC50 estão de acordo com a
Tabela 4, sendo que a NCTC929, célula recomendada pela ISO para o teste,
apresentou-se menos sensível aos polimerossomos. A toxicidade dos polimerossomos de Pluronic L121 foi comparada à do tensoativo dodecilsulfato de
sódio, SDS (Tabela 4). As substâncias podem ser classificadas de acordo com os
valores de IC50 como fortemente irritantes (< 7 μg/mL), levemente irritante (≥ 7 ≤
175 μg/mL) e não irritantes (> 175 μg/mL) (BRACHER, 1987). Assim, o SDS e o Pluronic L121 são considerados levemente irritante, pois são moléculas anfifílicas
que interagem com a membrana celular, perturbando a organização dos
fosfolipídeos, afetando a permeabilidade, além de provocar mudanças na função e
estrutura das proteínas. (FEITOSA et al, 2019; TACHON et al, 1989)
22
Figura 7. Viabilidade celular de NCTC929 e SIRC após exposição à catalase
Figura 8. Viabilidade celular de NCTC929 e SIRC após exposição ao
polimerossomo branco.
0
20
40
60
80
100
120
0.8 0.7 0.5 0.3 0.2 0.1
Viab
ilida
de c
elul
ar (%
)
Concentração de catalase (mg/mL)
SIRC
NCTC 929
0
20
40
60
80
100
120
0.2 0.1 0.05 0.025 0.0125 0.00625 0.003 0.00015
Viab
ilida
de c
elul
ar (%
)
Concentração teórica de L121 (mg/mL)
SIRC
NCTC929
Legenda: Barras de erro = desvio padrão
Legenda: Barras de erro = desvio padrão
23
Tabela 4. Valores de IC50 das linhagens NCTC929 e SIRC.
Linhagem IC50 SDS IC50 Pluronic L121
SIRC 56,6 ± 1,5 μg/mL 49,6 ± 13,5 μg/mL NCTC 929 26,0 ± 4,2 μg/mL 83,3 ± 8,3 μg/mL
A variação nos valores de IC50 observados no ensaio de citotoxicidade in vitro
pode ser explicada por alguns motivos, como a utilização de diferentes linhagens
celulares, a escolha do corante (NRR ou MTT), pois de acordo com a literatura o vermelho neutro (NR) apresenta melhores resultados para tensoativos aniônicos,
enquanto o MTT é mais adequado para o teste de uma variedade de tensoativos
diferentes. Além disso, o teste é realizado com uma monocamada bidimensional
(2D) mais sensível que não representa de forma adequada o sistema do tecido in
vivo, podendo mostrar alterações celulares que não ocorreriam na pele (KORTING,
1994; TSENG, 2015).
4.7. Avaliação da fototoxicidade dos sistemas nanoestruturados
Assim como no teste de citotoxicidade, a catalase não apresentou efeitos
citotóxicos nas células da linhagem NCTC929, independente da irradiação da placa
(Figura 9) e o polimerossomo branco apresentou redução da viabilidade celular de
forma dependente ao aumento da concentração do polímero independentemente da exposição à irradiação. (Figura 10). Na figura 11, observa-se o resultado do
controle positivo (tetraciclina) que apresentou maior redução da viabilidade celular
quando a placa foi exposta a irradiação UV, como era esperado.
24
Figura 9. Viabilidade celular de NCTC929 após exposição à catalase.
Figura 10. Viabilidade celular de NCTC929 após exposição ao polimerossomo
branco.
0
20
40
60
80
100
120
140
0,66 0,33 0,165 0,083 0,041 0,021 0,01 0,005
Viab
ilida
de ce
lula
r (%
)
Concentração de catalase (mg/mL)
Irradiado
Não irradiado
0
20
40
60
80
100
120
140
0,8 0,4 0,2 0,1 0,05 0,025 0,0125 0,0067
Viab
ilida
de ce
lula
r (%
)
Concentração teórica de L121 (mg/mL)
Irradiado
Não irradiado
Legenda: Barras de erro = desvio padrão
Legenda: Barras de erro = desvio padrão
25
Figura 11. Viabilidade celular de NCTC929 após exposição à tetraciclina.
Para determinar se as substâncias são fototóxicas, observam-se dois
parâmetros, o PIF (Photo Irritation Factor) e MPE (Mean Photo Effect) obtidos com
auxílio do Software Phototox 2.0. Com base no estudo de validação de Spielmann (1998), substâncias com PIF < 2 ou MPE < 0,1 são classificadas como não
fototóxicas; PIF > 2 e < 5 ou MPE > 0,1 e < 0,15, como provavelmente fototóxicas;
e PIF > 5 ou MPE > 0,15, como fototóxicas. (OECD, 2004; SPIELMANN, 1998). De
acordo com os valores apresentados na Tabela 5, conclui-se que a catalase e o polimerossomo branco não são fototóxicos e a tetraciclina é fototóxica.
Tabela 5. Valores de PIF (Photo Irritation Factor) e MPE (Mean Photo Effect).
Amostra PIF MPE Catalase 1 ± 0 0,04 ± 0,008
Polimerossomo branco 1,56 ± 0,3 - 0,152 ± 0,1
Tetraciclina 0,16 ± 0,06 46,6 ± 4,4
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
3 1 0,3 0,1 0,03 0,01 0,005
Viab
ilida
de ce
lula
r (%
)
Concentração de tetraciclina (mg/mL)
Irradiado
Não irradiado
Legenda: Barras de erro = desvio padrão
26
4.8. Avaliação do potencial de irritação ocular por método in vitro HET-CAM - Hen’s Egg Test – Chorioallantoic Membrane
O HET-CAM utiliza uma membrana altamente vascularizada, que permite melhor correlação com os possíveis resultados in vivo devido à maior
complexidade do sistema que mimetiza melhor as condições in vivo, com a
membrana no ovo atuando como uma espécie de barreira de proteção da mesma
forma que o estrato córneo (KALWEIT, 1990; KORTING, 1994). A membrana corioalantóide do ovo de galinha é muito vascularizada e com características
estruturais semelhantes à conjuntiva ocular do coelho, sendo assim, é possível
determinar o potencial irritante substâncias, como o polimerossomo. (ANVISA,
2012; KALWEIT, 1990)
Quando aplicada a solução de SDS a 1,0%, observou-se lise e hemorragia
evidenciada pela descontinuidade dos vasos (Figura 12.b), como era esperado por
este ser um tensoativo aniônico, sendo assim classificado como fortemente irritante
de acordo com o valor da Tabela 6. Já o polimerossomo branco (Figura 12.c) e o sistema F8 (Figura 12.d) foram considerados não irritantes, pois não se observou
nenhum efeito vascular.
Tabela 6. Valores de irritação do HET-CAM.
NaCl (0,9%) SDS (1,0%) Polimerossomo branco
Sistema F8
Valor de irritação 0 11,77 ± 0,05 0 0
27
a b d
Figu
ra 1
2. S
equê
ncia
de
foto
graf
ias
mos
trand
o o
efei
to d
e 0,
3 m
L de
1,0
% d
e SD
S, p
olim
eros
som
o br
anco
e s
iste
ma
F8 n
a m
embr
ana
após
5 m
inut
os. (
a) M
embr
ana
saud
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T0,
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SD
S em
T5m
in, (
c) p
olim
eros
som
o br
anco
em
T5m
in, (
d)
sist
ema
F8 e
m T
5min
c
28
5. CONCLUSÃO Nesse trabalho foram obtidos polimerossomos de Dh ~ 340 nm e PDI ~ 0,185
contendo catalase encapsulada, havendo melhor eficiência de encapsulação nas formulações com menor concentração de catalase e velocidade de agitação
reduzida. Ademais, o polimerossomo e a catalase foram considerados não
fototóxicos pelo método utilizado, fator muito importante para uma formulação que
visa a aplicação tópica.
No, entanto, observou-se uma variação no perfil de citotoxicidade a partir dos
ensaios com culturas de células, no qual constatou-se que que o polimerossomo é
levemente irritante, e HET-CAM, no qual constatou-se que é não irritante. Essa
variação nos resultados comprova a necessidade de se utilizar diferentes método para determinar a segurança in vitro de uma formulação, cada teste possuindo suas
limitações e adequações necessárias. Com base nos diferentes ensaios, pode-se
concluir que a formulação de polimerossomos com catalase encapsulada pode ser
considerada promissora para aplicação tópica e para o futuro desenvolvimento de protetores solares mais eficazes.
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____________________________ _____________________________ Data e assinatura do aluno(a) Data e assinatura do orientador(a)
04/11/2020