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R. Periodontia - Setembro 2009 - Volume 19 - Número 03

INTRODUÇÃO

O resultado ideal da terapia periodontal é a re-generação dos tecidos perdidos, incluindo cemento,osso alveolar e ligamento periodontal. A regenera-ção periodontal é um processo bastante complexoporque, em condições ideais, o coágulo que ocupaa ferida periodontal contém células precursoras decementoblastos, osteoblastos, fibroblastos, célulasendoteliais e epiteliais que se diferenciam, multipli-cam e migram dando origem a novos tecidos(Garrett, 1996). A regeneração de tecidosperiodontais depende da disponibilidade destas cé-lulas, do ligamento periodontal, e da presença deestímulos e sinalização necessários para recrutar eestimular estas células. As proteínas da matrizextracelular (MEC) regulam como as células respon-derão a estes sinais (Polimeni et al., 2006; Ogata,2008).

Mais recentemente, alguns estudos foram reali-zados com o objetivo de se analisar qualitativamen-te, por meio de análise imunoistoquímica in vitro e invivo, os processos envolvidos na regeneraçãoperiodontal, em animais (Macneil et al., 1995;Matsuura et al., 1995; Amar et al., 1997; Ivanovskiet al., 2000; Kawaguchi et al., 2001; Sculean et al.,

2002; Chano et al., 2003; Arambawatta et al., 2006;

AVALIAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE PROTEÍNAS DAMATRIZ EXTRACELULAR NA REPARAÇÃO DE DEFEITOSAGUDOS DE FURCA CLASSE II EM CÃESImmunohistochemical evaluation of extracellular matrix proteins in the repair of acute class II

furcation defects in dogs

Fernando Peixoto Soares1, Fernando Hayashi1, Christiane Watanabe Yorioka2, Suzana C. Orsini Machado de Sousa3,Francisco Emílio Pustiglioni4

RESUMO

O estudo da reparação periodontal deve se basear emmodelos que forneçam os dados necessários para a análi-se deste fenômeno. O modelo proposto, de defeitos agu-dos de furca classe II, parece ser o mais indicado, pois pos-sui um grau previsível de regeneração espontânea, forne-cendo um ambiente em que é possível o estudo dos fato-res que favorecem a regeneração dos tecidos periodontais.O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade da repara-ção de defeitos agudos de furca classe II por meio daimunoexpressão de proteínas da matriz extracelular (MEC).Após a elevação de retalhos de espessura total, em quatrocães, foram criados defeitos agudos de furca classe II nossegundos, terceiros e quartos pré-molares de um dos la-dos da mandíbula. Os retalhos foram posicionadoscoronariamente e suturados. Após 45 dias, os espécimesforam coletados, descalcificados e analisados, em um pla-no vestíbulo- lingual, por meio de técnicaimunohistoquímica para osteopontina (OPN), sialoproteínaóssea (BSP) e osteonectina (BON). Nos tecidos periodontaisoriginais, a marcação para os anticorpos testados foi fraca-mente positiva na MEC, caracterizando a presença de teci-dos maduros. Já no interior dos defeitos, houve diferençana marcação, com marcação mais pronunciada para BSP,OPN e BON. Conclui-se que os resultados evidenciam maioratividade metabólica nos tecidos reparativos.

UNITERMOS:

1 Mestre e Doutor em Periodontia da FOUSP

2 Mestre e Doutoranda em Periodontia da FOUSP

3 Professora Titular da disciplina de Patologia Bucal da FOUSP

4 Professor Titular da disciplina de Periodontia da FOUSP

Recebimento: 26/05/09 - Correção: 03/08/09 - Aceite: 20/08/09

osteonectina, osteopontina, sialopro-teína óssea, ligamento periodontal, regeneração óssea. RPeriodontia 2009;19:117-126.

R. Periodontia - 19(3):117-126

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Christgau et al., 2007) e humanos (Pritlove-Carson et al.,1994; Amar et al., 1995; Ivanovski et al., 2001a; Ivanovski et

al., 2001b; Sculean et al., 2003; Bosshardt et al., 2005;Bosshardt et al., 2006; Lao et al., 2006).

Para melhor estudar os fenômenos envolvidos no pro-cesso de regeneração periodontal, é necessário um modeloque sofra o mínimo de distúrbios e influências externas. Omodelo proposto no presente estudo, de defeitos agudos(Caton et al., 1994) de furca grau II, sem a utilização de subs-tâncias ou técnicas regenerativas parece ser o mais indica-do. A certeza de que haverá um percentual predefinido deautorregeneração neste modelo em cães (Soares et al., 2005),permite que sejam estudados os fatores, substâncias e asequência temporal de expressão destas substâncias bioativase dos eventos envolvidos na regeneração “natural” dos teci-dos periodontais.

Com o objetivo de se conhecer um pouco mais os fenô-menos envolvidos na reparação periodontal “natural” e ca-racterizar os tecidos e células encontrados na região do de-feito, foi realizada análise imunohistoquímica para os princi-pais componentes não colágenos da MEC dos tecidosperiodontais: osteopontina (OPN), osteonectina (BON) esialoproteína óssea (BSP).

MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética da Fa-culdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universida-de de São Paulo (protocolo nº 155/2002). Foram utilizadosquatro cães jovens, saudáveis, de porte médio e sem raçadefinida que, previamente ao início do experimento, recebe-ram profilaxia da boca toda. Os animais foram submetidos àanestesia geral, descrita em Soares et al. (2005). Um retalhode espessura total com excisão de margem foi realizadoenvolvendo os segundos, terceiros e quartos pré-molaresmandibulares, de um dos lados, escolhidos aleatoriamente.Foram criados defeitos ósseos de furca grau II com dimen-sões padronizadas: 5 mm de altura, 5 mm de larguramésio-distal e 4 mm de profundidade no sentido vestíbulo-lingual (Figura 1). As raízes foram raspadas com a finalidadede se remover o cemento das raízes. Marcas foram realiza-das nas raízes, junto ao osso alveolar remanescente, e najunção esmalte-cemento, delimitando o defeito. Foram rea-lizadas incisões no periósteo dos retalhos para deixá-los li-vres de tensões. Os retalhos foram posicionadoscoronariamente à junção esmalte-cemento e suturados. Fo-ram administrados antibiótico e anti-inflamatório, como emSoares et al. (2005). O controle de placa foi realizado pormeio da aplicação tópica diária de digluconato de clorhexidina

a 0,12%1.Após 45 dias, os cães foram submetidos à eutanásia e

os espécimes obtidos, contendo um dente cada, foramimersos em solução fixadora por 24 horas e entãodescalcificados em EDTA a 10%. O plano de corte foi reali-zado no sentido vestíbulo-lingual, como descrito por Bogleet al. (1997). Os espécimes foram incluídos em parafina, ecortes de 7 µm de espessura foram obtidos para a análisehistológica em hematoxilina e eosina (H.E.) e cortes de 5 µmforam estendidos em lâminas silanizadas, para a realizaçãodas reações imunohistoquímicas, com anticorpos policlonaisdesenvolvidos em coelho contra BON, OPN e BSP. Comocontrole negativo, os cortes foram submetidos ao mesmoprocesso, com a omissão da aplicação do anticorpo. Os có-digos, titulação e tempo de incubação dos anticorpos estu-dados foram definidos após otimização e estão descritos natabela 1.

Foi seguido o seguinte protocolo para as reaçõesimunohistoquímicas:

1. Desparafinização em 2 banhos de xilol: (1) por 30 mi-nutos à temperatura de 60°C; e (2) por 20 minutos à tempe-ratura ambiente.

2. Reidratação em uma série de etanol em concentra-ções decrescentes (absoluto por 3 vezes, 95%, 85%) embanhos de 5 minutos cada, realizando, ao final, um banhode 10 minutos em hidróxido de amônio a 10% em etanol95% para a remoção de pigmentos formólicos, seguidosde 10 minutos em água corrente e 2 banhos em águadestilada.

3. Bloqueio da peroxidase endógena com solução deperóxido de hidrogênio a 6% em metanol na proporção de1:1, em 2 banhos de 15 minutos cada.

4. Lavagem em água corrente por 10 minutos e 2 ba-nhos em água destilada.

5. Dois banhos em solução tampão de TRIS-HCL(hidroximetil-amino-metano) a 0,5 M, pH 7.4, cinco minu-tos cada imersão.

Anticorpo código Título Tempode incubação

Osteonectina BON-I 1:900 60’

Osteopontina LF-166 1:250 60’

Sialoproteína óssea LF-84 1:750 90’

Tabela 1

CÓDIGO, TÍTULO E TEMPO DE INCUBAÇÃO DOS

ANTICORPOS PRIMÁRIOS (FISHER ET AL., 1987)

1 Periogard®, Colgate-Palmolive


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8. Incubação com soro suíno normal, diluído a 30% emalbumina de soro bovino (BSA), em câmara úmida, por 60minutos para OPN e BON e por 90 minutos para BSP, parabloqueio dos sítios antigênicos inespecíficos.

Após estas etapas, todos os cortes seguiram para o equi-pamento DAKO Autostainer Universal Staining System, ondese concluiu a reação com o seguinte protocolo:

1. Incubação dos anticorpos primários sob temperaturacontrolada a 37ºC.

2. Incubação com o complexo terciário estreptavidina-biotina do Kit LSAB Peroxidase (código K0690).

3. Revelação da reação com DAKO Liquid DAB plus (có-

digo K3468)4. Contra-coloração com hematoxilina de Mayer.Entre cada uma das reações, os cortes foram lavados

duas vezes em TRIS-HCL acrescida de tween. A seguir, todosos cortes foram desidratados, diafanizados, seguindo paramontagem das lâminas. Com o auxílio de um microscópiode luz, um observador calibrado realizou a análise descritivadas reações imunohistoquímicas. O grau deimunorreatividade foi determinado nas células e matriz com-ponentes dos tecidos reparativos no interior dos defeitos defurca e também nos tecidos normais, na parte lingual dasbifurcações.

Osteopontina Osteonectina Sialoproteína Óssea

Tecidos Regenerados

Defeito

Células +++/- +/- ++/-

Matriz ++ + ++

Osso

Células ++(H) ++ ++/-

Matriz ++ ++(H) +++(H)

Cemento

Células na superfície da raiz ++/- +++ +/-

Matriz ++ ++ +++(H)

Tecidos normais

Gengiva

Células - - ++/-

Matriz + ++ ++

Ligamento Periodontal

Células +++/- ++/- -

Matriz + ++ ++

Cemento

Cementoblastos +/- +/- ++/-

Cementócitos - - -

Matriz + + +

Osso

Osteoblastos - + +/-

Osteócitos - - -

Matriz + + +

Tabela 2

RESUMO DA ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA

(H) imuno-localização heterogênea da proteína- ausência de marcação+ marcação fracamente positiva

++ marcação positiva+++ marcação fortemente positiva+/- marcação ambígua


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RESULTADOS

Observações clínicas: Todos os cães toleraram bem operíodo pós-operatório e os sítios experimentais repararamsem nenhum incidente.

Análise histológica: Uma imagem representativa dosespécimes é apresentada na figura 2. As marcas (MV e MD)que definem, respectivamente, os limites vestibular e lingualdo defeito eram claramente visíveis.

O epitélio juncional teve migração apical. Subjacente aeste epitélio encontrava-se um leve infiltrado inflamatório,predominantemente linfocitário.

O novo osso preenchia, em média, metade da extensãovestíbulo-lingual do defeito. Este osso tinha característicasde osso primário ou imaturo. Os osteoblastos tinham for-mato ovalado e citoplasma basófilo, caracterizando ativida-de funcional, ou seja, estavam secretando MEC. O endósteotambém apresentava algumas células de face ovalada ecitoplasma basófilo que se alternavam com outras célulasde revestimento ósseo achatadas e alguns osteoclastos, ca-racterizando remodelação óssea.

O tecido formado entre o novo osso e a superfícieradicular tinha características de tecido conjuntivo frouxo,bastante celular, com grande densidade de feixes colágenos.Parte das fibras colágenas tinha orientação paralela à super-fície radicular e ao novo osso. Porém, eram visíveis feixescolágenos se inserindo em novo osso, sobre as superfíciesradiculares e também no novo cemento, caracterizando novoligamento periodontal. Em alguns casos, foram observadasirregularidades sobre as superfícies radiculares, indicativas dereabsorção dentinária superficial.

O cemento neoformado sobre a superfície radicular ti-nha características de cemento reparativo, ou seja, era es-pesso e bastante celular, com poucas fibras de Sharpey seinserindo em sua superfície. A extensão de formação de novocemento antigiu, em média, a metade da extensão vestíbu-lo-lingual do defeito.

Análise imunohistoquímica: Os resultados estão re-sumidos na tabela 2.

Osteopontina (OPN): O tecido conjuntivo, no interiordo defeito, apresentou marcação positiva para OPN (Figuras3a e 3b), com fibroblastos apresentando marcaçãointracelular fortemente positiva. Já a matriz do tecido ósseoneoformado apresentou marcação positiva, sendo que amarcação era mais forte em linhas de reversão (Figura 3c). Amarcação do cemento neoformado e das células que reco-brem a superfície radicular foi positiva (Figura 3d). As célulasósseas sobre as trabéculas recém-formadas apresentaram-se positivas (Figura 3e).

Do lado lingual, nos tecidos periodontais originais, a MECdo conjuntivo gengival, do ligamento periodontal, docemento e do osso apresentaram marcação fraca. As linhasde reversão no osso alveolar original apresentavam marca-ção bem evidentes (Figuras 3f, 3g, 3h, 3i).

Osteonectina (BON): O tecido conjuntivo, no interior dodefeito, apresentou marcação fracamente positiva (Figuras4a e 4b) e alguns fibroblastos, marcação intracelular fraca. Amatriz do tecido ósseo neoformado teve marcação positiva(Figura 4c). A marcação do cemento neoformado foi positi-va, enquanto que nas células que recobrem a superfícieradicular, foi fortemente positiva (Figura 4d).

As células ósseas tinham marcação negativa, com exce-ção de alguns osteoblastos nas superfícies externas detrabéculas ósseas neoformadas (Figura 4e).

Do lado lingual, nos tecidos periodontais originais, a MECdo tecido gengival, do ligamento periodontal, do cemento edo osso apresentaram, predominantemente, marcação fra-ca (Figuras 4f, 4g, 4h, 4i).

Sialoproteína óssea (BSP): O tecido conjuntivo, no interi-or do defeito, apresentou marcação positiva para a BSP (Fi-guras 5a, 5b). Os fibroblastos tiveram marcação intracelularpositiva, em alguns espécimes.

A matriz do tecido ósseo neoformado apresentou mar-cação fortemente positiva, sendo que era mais forte nas re-giões periféricas das trabéculas neoformadas e nas paredesinternas dos ósteons primários e secundários (Figura 5c). Amarcação do cemento neoformado foi fortemente positiva,enquanto que as células que recobrem a superfície radicular,em geral, não foram marcadas por anti-BSP (Figura 5d). Ososteoblastos tinham marcação predominantemente positi-va (Figura 5e).

Nos tecidos periodontais originais, do lado lingual, a MECdo tecido gengival, do ligamento periodontal e do cementoapresentaram, predominantemente, marcação fraca (Figu-

Figura 1 - Aspecto macroscópico dos defeitos agudos de furca grau II criados nos cães


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ras 5f, 5g, 5h, 5i), enquanto que as células destes tecidos,com raras exceções, tiveram marcação negativa para a BSP.O osso alveolar original apresentou predominantementemarcação fraca, sendo que as linhas de reversão e a faceinterna dos canais de Havers apresentaram marcação maisforte.

DISCUSSÃO

A avaliação histológica em animais dos resultados de-correntes da utilização das técnicas regenerativas é essenci-al para estabelecer se o seu uso estimula regeneração ououtro tipo de reparação. O defeito de furca de classe II agu-do (Caton et al., 1994) foi escolhido devido à possibilidadede padronização do tamanho dos defeitos (Selvig, 1994) etambém devido à sua característica de apresentar um nívelprevisível de regeneração de uma parte dos tecidosperiodontais perdidos (Soares et al., 2005).

O modelo utilizado apresenta altos níveis de regenera-ção quando os retalhos mucoperiostais que cobrem os de-feitos são mantidos em posição, sem recessão durante a fasede cicatrização, associado à terapia antibiótica sistêmica apósa cirurgia reconstrutiva e à terapia antimicrobiana local diá-

ria, o que permite que o coágulo formado no interior dodefeito permaneça estável, o que está de acordo com Caton& Greenstein (1993).

A análise histológica da reparação de defeitos de furcaclasse II em cães foi realizada em um plano vestíbulo-lingual,de acordo com o proposto por Bogle et al. (1997), porque ovalor real da análise de cortes no sentido mésio-distal foiquestionado por Selvig (1994), devido a dificuldade de secertificar de qual ponto, no sentido vestíbulo-lingual, o cor-te foi obtido. Quando um corte é obtido de um ponto maispróximo da parede lingual do defeito de furca vestibular, aanálise pode mostrar uma falsa idéia de maior respostaregenerativa que um corte obtido de um ponto mais distan-te do periodonto remanescente. O plano de corte utilizadono presente estudo permite a completa avaliação da res-posta reparativa do defeito de furca classe II, desde a suaporção mais lingual até o seu limite mais vestibular.

O potencial autorregenerativo do defeito pode ser atri-buído também à anatomia do defeito agudo de furca grauII, que dá melhor suporte aos retalhos e é autolimitante, fa-vorecendo a estabilidade do coágulo. Portanto, este deveser o modelo de eleição quando se quer estudar qualitativa-mente os fenômenos envolvidos no processo de regenera-

Figura 3 - Marcação imunohistoquímica (anti-OPN) nos tecidos reparativos, no interior dodefeito (a, b, c, d, e) próximos à dentina (D) e nos tecidos periodontais originais, na face lingual(f, g, h, i); (a) – 2,5 X – marcação positiva de novo tecido conjuntivo (NTC) e novo osso (NO);(b) – 10 X – detalhe de quadro linear maior em “a”: marcação positiva e homogênea do NTC emarcação positiva do novo cemento (NC); (c) – 10 X – detalhe de quadro tracejado maior em“a”: marcação positiva heterogênea de NO; (d) – 40 X – detalhe de quadro linear menor em“a”: marcação positiva de NC e NTC, com algumas marcações positivas das células; (e) – 40 X –detalhe de quadro tracejado menor em “a”: marcação positiva da MEC de NO e marcaçãopositiva de osteoblastos ; (f) – 2,5 X – marcação positiva da MEC, dos tecidos originais, do ladolingual, de cemento (C), ligamento periodontal (LP) e osso (O); (g) – 10 x – detalhe doquadrado maior em “f”: marcação fracamente positiva da MEC de C e O e positiva de LP; (h) –40 X – detalhe de quadro linear menor em “f”: marcação positiva de células do LP e positiva daMEC de C e LP; (i) – 40 X – detalhe de quadro tracejado menor em “f”: marcação fracamentepositiva de O

Figura 2 - Aspecto histológico panorâmico de espécime do grupo teste, mostrando o epitéliogengival (E), infiltrado inflamatório (*), extensão apical do epitélio juncional (seta), bordo damarca de referência vestibular (MV) utilizada como referência na histometria, bordo marca dereferência do fundo do defeito (MD) utilizada como referência na histometria, novo osso (NO) eosso preexistente (OP). Área de novo osso estudada (A) (2,5 X – H.E.)


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ção periodontal, sem a influência da adição de substânciasou técnicas regenerativas.

A regeneração de tecidos periodontais perdidos depen-de da disponibilidade das células necessárias, provenientesdo ligamento periodontal, e da presença ou ausência deestímulos e sinalização necessários para recrutar e estimularestas células. A MEC regula como estas células responderãoa estes sinais (Polimeni et al., 2006). Com o objetivo de seconhecer um pouco mais o processo de regeneração “natu-ral” e caracterizar os tecidos e células que preenchiam a re-gião do defeito, foi realizada a presente análiseimunoistoquímica, para os principais componentes nãocolágenos da MEC: osteopontina (OPN), osteonectina (BON)e sialoproteína óssea (BSP).

A marcação da BON no presente estudo está de acordocom estudos anteriores que atribuem à BON funções espe-cíficas durante o processo de reparação óssea, tais como:inibição de progressão celular, modulação da ação de fato-res de crescimento, homeostase durante a remodelação ós-sea, na reparação de feridas e na angiogênese (Brekken &Sage, 2001; Bradshaw & Sage, 2001), além de exercer fun-ção na manutenção da densidade óssea (Delany et al., 2000).

A OPN e a BSP são glicoproteínas não colágenas quesão secretadas em diferentes estágios da osteogênese e

cementogênese, tendo distribuição semelhante, entre si, noperiodonto, localizando-se principalmente nas interfaces detecidos duros (Macneil et al., 1995; Boskey, 1996; Ganss et

al., 1999; Somerman et al., 1999; Sodek et al., 2000; Grzesik& Narayanan, 2002; Arambawatta et al., 2006).

A forte marcação de BSP em áreas com neoformaçãoóssea, principalmente em áreas onde estava ocorrendo adeposição de matriz por osteoblastos, é indício da funçãoda BSN em nuclear a formação de cristais de hidroxiapatita,sugerindo um papel da BSP na mineralização inicial de ossoe cemento (Ogata, 2008).

O presente estudo demonstrou uma marcante presen-ça de BSP e OPN nos tecidos mineralizados neoformados nointerior dos defeitos, caracterizando estes tecidos como ossoe cemento. A marcação por estes dois componentes nãocolágenos da MEC, em conjunto, indica também que estestecidos e células estão intimamente associados ao processode mineralização (Amar et al., 1995; Amar et al., 1997).

Os sinais de reabsorção dentinária observados nos es-pécimes de ambos os grupos foram amplamente descritosanteriormente (Linghorne & O’Connell, 1950; Frank et al.,1974; Bosshardt et al., 2005; Soares et al., 2005; Christgauet al., 2007), e parece expor fibras colágenas da dentina para

Figura 5 – Marcação imunohistoquímica (anti-BSP) dos tecidos reparativos, no interior dodefeito (a, b, c, d, e), próximos à dentina (D) e nos tecidos periodontais originais, na facelingual (f, g, h, i); (a) – 2,5 X – marcação positiva de novo tecido conjuntivo (NTC) efortemente positiva de novo osso (NO); (b) – 10 X – detalhe de quadro linear maior em “a”:marcação positiva e homogênea do NTC e marcação fortemente positiva do novo cemento (NC);(c) – 10 X – detalhe de quadro tracejado maior em “a”: marcação positiva heterogênea de NO;(d) – 40 X – detalhe de quadro linear menor em “a”: marcação fortemente positiva de NC epositiva de NTC; (e) – 40 X – detalhe de quadro tracejado menor em “a”: marcação positiva daMEC de NO; (f) – 2,5 X – marcação fracamente positiva da MEC, dos tecidos originais, do ladolingual, de cemento (C) e osso (O) e positiva de ligamento periodontal (LP); (g) – 10 x –detalhe do quadrado maior em “f”: marcação fracamente positiva da MEC de C e O e positiva deLP; (h) – 40 X – detalhe de quadro linear menor em “f”: ausência de marcação de células do LPe cemento celular (CC) e marcação fracamente positiva da MEC de CC e LP; (i) – 40 X – detalhede quadro tracejado menor em “f”: marcação positiva heterogênea de O.

Figura 4 – Marcação imunohistoquímica (anti-BON) nos tecidos reparativos, no interior dodefeito (a, b, c, d, e) próximos à dentina (D) e nos tecidos periodontais originais, na face lingual(f, g, h, i); (a) – 2,5 X – marcação positiva de novo tecido conjuntivo (NTC) e novo osso (NO);(b) – 10 X – detalhe de quadro linear maior em “a”: marcação positiva e homogênea do NTC emarcação positiva do novo cemento (NC); (c) – 10 X – detalhe de quadro tracejado maior em“a”: marcação positiva heterogênea de NO; (d) – 40 X – detalhe de quadro linear menor em“a”: marcação positiva de NC e NTC; (e) – 40 X – detalhe de quadro tracejado menor em “a”:marcação fracamente positiva da MEC de NO; (f) – 2,5 X – marcação fracamente positiva daMEC, dos tecidos originais, do lado lingual, de cemento celular (CC), LP e O; (g) – 10 x –detalhe do quadrado maior em “f”: marcação fracamente positiva da MEC de C, O e LP; (h) –40 X – detalhe de quadro tracejado menor em “f”: ausência de marcação de células do LP emarcação fracamente positiva da MEC de CC e LP; (i) – 40 X – detalhe de quadro linear menorem “f”: marcação fracamente positiva de O


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facilitar a adesão da MEC com o novo cemento, devido àintensa marcação de OPN e BSP na interface entre dentina enovo cemento.

O tecido conjuntivo neoformado no defeito, correspon-dente ao novo ligamento periodontal teve marcação positi-va fraca para BSP e OPN, em contraste com o estudo deChristgau et al. (2007) que avaliou defeitos periodontais na-turais, ao passo que o presente estudo utilizou o modelocom defeitos agudos, sem contaminação bacteriana. Recen-temente, foi demonstrada ausência de marcação para OPNe BSP na superfície de raízes humanas, extraídas, com doen-ça periodontal prévia, demonstrado uma possível influêncianegativa no potencial de regeneração periodontal em raízespreviamente expostas à contaminação bacteriana (Lao et al.,2006).

O cemento neoformado também foi marcado fortemen-te para BSP e OPN, confirmando os estudos de Matsuura et

al. (1995), Ivanovski et al. (2000) e Christgau et al. (2007).Estes estudos sugerem que este padrão de marcação paraBSP e OPN indica que a neoformação de cemento pode terparalelo com a cementogênese.

A heterogeneidade de marcação de células entre os es-pécimes e até no mesmo espécime, está de acordo com oestudos de Ivanovski et al. (2000) e destaca a complexidadedas populações celulares recrutadas para a área onde estáocorrendo o processo de reparação periodontal.

Segundo Christgau et al. (2007), nas fases mais avança-das, após 12 meses, do processo de reparação periodontal,o padrão de marcação nos tecidos neoformados é similar aoachado em regiões de tecidos periodontais originais. No pre-sente estudo, os tecidos neoformados no interior dos defei-tos apresentaram intensidade de marcação mais forte quedo lado lingual, com os tecidos originais. Podemos inferir,também baseados nos estudos de Denhardt & Guo (1993),Ganss et al. (1999), Sodek et al. (2000) e Christgau et al.(2007) que demonstraram que osteóide neoformado temforte imunolocalização de BSP e OPN, e que osso em fasede reparação apresenta marcação mais intensa para proteí-nas matricelulares (Alford & Hankenson (2006) que o tecidoósseo neoformado estava em um estágio de reparação ain-da bastante ativo.

A análise de um momento apenas da reparaçãoperiodontal torna difícil a interpretação da sequência tem-poral do processo reparativo, o que poderia ser contornadocom a inclusão de diferentes tempos de análise (Matsuuraet al., 1995; Christgau et al., 2007). Por outro lado, foramidentificadas diferentes fases de maturação óssea em ummesmo espécime, pela marcação imunohistoquímica hete-rogênea da MEC do novo osso. O processo de reparação

ainda apresentava regiões de osteogênese na periferia doosso neoformado, em suas porções mais vestibulares, for-necendo um interessante panorama da reparaçãoperiodontal no momento estudado. A localização de BSP eOPN nas porções mais coronárias e vestibulares do ossoneoformado e em regiões de osso jovem deixa clara, umavez que estas proteínas têm um papel importante na forma-ção e remodelação óssea, a atividade metabólica aumenta-da nestas regiões, indicando que o processo reparativo ain-da estava em andamento (Ivanovski et al., 2006).

A extrapolação do conhecimento advindo dos resulta-dos do presente estudo, em cães, para humanos deve servista com reservas. Um estudo de imunolocalização em te-cidos periodontais de humanos (Ivanovski et al., 2001b)mostrou alguns resultados conflitantes com o presente es-tudo. A localização de OPN foi mais forte no ligamentoperiodontal do que na gengiva e no nosso estudo, ambasas regiões tiveram marcação semelhante, com maior marca-ção celular no novo ligamento periodontal. No estudo emhumanos a BSP não foi localizada no ligamento periodontal,em contraste com o nosso e outro estudo em cães, deIvanovski et al. (2000). Por outro lado, em um estudo emratos (Macneil et al., 1995) a BSP foi localizada em tecidosmoles no interior de defeitos periodontais em reparação,mostrando claramente a variabilidade interespécies apresen-tada na imuno-localização destas proteínas não colágenasda MEC.

Atualmente, a OPN, a BON e a BSP são definidas comoproteínas matricelulares, uma classe de proteínas compo-nentes da MEC altamente expressas em ossos maduros ouem formação (Yan & Sage, 1999; Bornstein, 2000; Bradshaw& Sage, 2001; Brekken & Sage, 2001; Sodek et al., 2002;Alford & Hankenson, 2006). Agem como mediadores bioló-gicos de função celular interagindo diretamente com as cé-lulas ou modulando a ação de fatores de crescimento,proteases e outras proteínas da MEC. No entanto, como osefeitos biológicos destas proteínas estão diretamente relaci-onados com o ambiente em que elas estão presentes, osestudos in vitro e in vivo devem ser observados em conjuntopara maior apreciação de suas possíveis funções no proces-so de regeneração periodontal. Mais importante é a realiza-ção de novos estudos em animais e humanos para se co-nhecer as funções específicas destas proteínas durante a re-generação periodontal.

Com este modelo, abre-se um excelente campo de pes-quisa para o estudo pormenorizado do processo de regene-ração espontânea de defeitos periodontais devido à altareprodutibilidade dos níveis de regeneração espontânea.Estudos futuros, analisando em detalhe vários momentos


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desta reparação, poderão fornecer dados importantes so-bre a dinâmica e a sequência temporal dos eventos biológi-cos e substâncias bioativas envolvidas neste processo, for-necendo valiosos conhecimentos para o desenvolvimentode futuras técnicas reconstrutivas.

CONCLUSÃO

Dentro das limitações do presente estudo, podemosconcluir que em cães: (1) mesmo após 45 dias de reparação,as macromoléculas associadas com reparação e remodela-ção periodontal estão imunolocalizadas mais fortemente nostecidos regenerados que nos tecidos originais, indicandoatividade metabólica elevada e (2) uma vez criado o ambien-te propício, ocorre a regeneração periodontal, com a forma-ção de novo cemento, osso e ligamento periodontal, carac-terizados imunohistoquimicamente pelas moléculas da MECestudadas.

AGRADECIMENTOS

Os anticorpos foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr.Larry W. Fisher.2

À FAPESP, pelo auxílio-pesquisa número 02/09757-2.

ABSTRACT

The study of periodontal repair should be based on

models that provide the data required for analysis of thisphenomenon. The proposed model of acute class II furcationdefects seems to be the most appropriate, as it provides apredictable degree of spontaneous regeneration, creating anenvironment where the factors that promote theregeneration of periodontal tissues can be studied. Theobjective of this study was to evaluate the quality of repair ofacute class II furcation defects, by means ofimmunoexpression of extracellular matrix (ECM) proteins.After lifting full thickness flaps in 4 dogs, acute class II furcationdefects were created in the second, third and fourth pre-molar in one side of the mandible. The flaps were coronallypositioned and sutured. After 45 days, the specimens werecollected, decalcified and analyzed in a buccal-lingual plane,by immunohistochemistry technique for osteopontin (OPN),bone sialoprotein (BSP) and osteonectin (BON). In originalperiodontal tissues, the marking for the tested antibodieswas weakly positive in the ECM, characterizing the presenceof mature tissues. Inside the defects, there was a differencein the marking, with markings more pronounced for BSP, OPNand BON. It was concluded that the results showed greatermetabolic activity in the reparative tissues.

UNITERMS:

2 Matrix Biochemistry Unit, Craniofacial and Skeletal Branch, National Institute of Health,Bethesda, MD, USA

osteonectin, osteopontin, bonesialoprotein, periodontal ligament, bone regeneration.


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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1- Garrett S. Periodontal regeneration around natural teeth. Ann

Periodontol. 1996;1(1):621-66.

2- Polimeni G, Xiropaidis AV, Wikesjö UM. Biology and principles of

periodontal wound healing/regeneration. Periodontol 2000.

2006;41:30-47.

3- Ogata Y. Bone sialoprotein and its transcriptional regulatory mechanism.

J Periodont Res. 2008;43(2):127-35.

4- MacNeil RL, Berry J, D'Errico J, Strayhorn C, Piotrowski B, Somerman

MJ. Role of two mineral-associated adhesion molecules, osteopontin

and bone sialoprotein, during cementogenesis. Connect Tissue Res.

1995;33(1-3):1-7.

5- Matsuura M, Herr Y, Han KY, Lin WL, Genco RJ, Cho MI.

Immunohistochemical expression of extracellular matrix components

of normal and healing periodontal tissues in the beagle dog. J

Periodontol. 1995;66(7):579-93.

6- Amar S, Chung KM, Nam SH, Karatzas S, Myokai F, Van Dyke TE. Markers

of bone and cementum formation accumulate in tissues regenerated

in periodontal defects treated with expanded polytetrafluoroethylene

membranes. J Periodont Res. 1997;32(1 Pt 2):148-58.

7- Ivanovski S, Li H, Daley T, Bartold PM. An immunohistochemical study

of matrix molecules associated with barrier membrane-mediated

periodontal wound healing. J Periodont Res. 2000;35(3):115-26.

8- Kawaguchi H, Ogawa T, Kurihara H, Nanci A. Immunodetection of

noncollagenous matrix proteins during periodontal tissue regeneration.

J Periodont Res. 2001;36(4):205-13.

9- Sculean A, Junker R, Donos N, Berakdar M, Brecx M, Dünker N.

Immunohistochemical evaluation of matrix molecules associated with

wound healing following regenerative periodontal treatment in

monkeys. Clinical oral investigations. 2002;6(3):175-82.

10- Chano L, Tenenbaum HC, Lekic PC, Sodek J, McCulloch CA. Emdogain

regulation of cellular differentiation in wounded rat periodontium. J

Periodont Res. 2003;38(2):164-74.

11- Arambawatta AK, Yamamoto T, Wakita M. An immunohistochemical

study of the attachment mechanisms in different kinds of adhesive

interfaces in teeth and alveolar bone of the rat. J Periodont Res.

2006;41(4):259-65.

12- Christgau M, Caffesse RG, Schmalz G, D'Souza RN. Extracellular matrix

expression and periodontal wound-healing dynamics following guided

tissue regeneration therapy in canine furcation defects. J Clin

Periodontol. 2007;34(8):691-708.

13- Pritlove-Carson S, Palmer RM, Floyd PD, Morgan PM.

Immunohistochemical analysis of tissues regenerated from within

periodontal defects treated with expanded polytetrafluoroethylene

membranes. J Periodontol. 1994;65(2):134-8.

14- Amar S, Petrungaro P, Amar A, Van Dyke TE. Immunolocalization of

bone matrix macromolecules in human tissues regenerated from

periodontal defects treated with expanded polytetrafluoroethylene

membranes. Arch Oral Biol. 1995;40(7):653-61.

15- Ivanovski S, Haase HR, Bartold PM. Expression of bone matrix protein

mRNAs by primary and cloned cultures of the regenerative phenotype

of human periodontal fibroblasts. J Dent Res. 2001a;80(7):1665-71.

16- Ivanovski S, Li H, Haase HR, Bartold PM. Expression of bone associated

macromolecules by gingival and periodontal ligament fibroblasts. J

Periodont Res. 2001b;36(3):131-41.

17- Sculean A, Junker R, Donos N, Windisch P, Brecx M, Dünker N.

Immunohistochemical evaluation of matrix molecules associated with

wound healing following treatment with an enamel matrix protein

derivative in humans. Clinical oral investigations. 2003;7(3):167-74.

18- Bosshardt DD, Degen T, Lang NP. Sequence of protein expression of

bone sialoprotein and osteopontin at the developing interface between

repair cementum and dentin in human deciduous teeth. Cell Tissue

Res. 2005;320(3):399-407.

19- Bosshardt DD, Sculean A, Donos N, Lang NP. Pattern of mineralization

after regenerative periodontal therapy with enamel matrix proteins.

Eur J Oral Sci. 2006;114 Suppl 1:225-31; discussion 54-6, 381-2.

20- Lao M, Marino V, Bartold PM. Immunohistochemical study of bone

sialoprotein and osteopontin in healthy and diseased root surfaces. J

Periodontol. 2006;77(10):1665-73.

21- Caton J, Mota L, Gandini L, Laskaris B. Non-human primate models

for testing the efficacy and safety of periodontal regeneration

procedures. J Periodontol. 1994;65(12):1143-50.

22- Soares FP, Hayashi F, Yorioka CW, Pannuti CM, Gioso MA, de Lima LA,

et al. Repair of Class II furcation defects after a reparative tissue graft

obtained from extraction sockets treated with growth factors: a

histologic and histometric study in dogs. J Periodontol.

2005;76(10):1681-9.

23- Bogle G, Garrett S, Stoller NH, Swanbom DD, Fulfs JC, Rodgers PW, et

al. Periodontal regeneration in naturally occurring Class II furcation

defects in beagle dogs after guided tissue regeneration with

bioabsorbable barriers. J Periodontol. 1997;68(6):536-44.

24- Selvig KA. Discussion: animal models in reconstructive therapy. J

Periodontol. 1994;65(12):1169-72.

25- Caton JG, Greenstein G. Factors related to periodontal regeneration.

Periodontol 2000. 1993;1(1):9-15.

26- Brekken RA, Sage EH. SPARC, a matricellular protein: at the crossroads

of cell-matrix communication. Matrix Biol. 2001;19(8):816-27.

27- Bradshaw AD, Sage EH. SPARC, a matricellular protein that functions

in cellular differentiation and tissue response to injury. J Clin Invest.

2001;107(9):1049-54.

28- Delany AM, Amling M, Priemel M, Howe C, Baron R, Canalis E.


126

Osteopenia and decreased bone formation in osteonectin-deficient

mice. J Clin Invest. 2000;105(7):915-23.

29- Boskey AL. Matrix proteins and mineralization: an overview. Connect

Tissue Res. 1996;35(1-4):357-63.

30- Ganss B, Kim RH, Sodek J. Bone sialoprotein. Crit Rev Oral Biol Med.

1999;10(1):79-98.

31- Somerman MJ, Ouyang HJ, Berry JE, Saygin NE, Strayhorn CL, D'Errico

JA, et al. Evolution of periodontal regeneration: from the roots' point

of view. J Periodont Res. 1999;34(7):420-4.

32- Sodek J, Ganss B, McKee MD. Osteopontin. Crit Rev Oral Biol Med.

2000;11(3):279-303.

33- Grzesik WJ, Narayanan AS. Cementum and periodontal wound healing

and regeneration. Crit Rev Oral Biol Med. 2002;13(6):474-84.

34- Linghorne WJ, O'Connell DC. Studies in the regeneration and

reattachment of supporting structures of the teeth; soft tissue

reattachment. J Dent Res. 1950;29(4):419-28.

35- Frank R, Fiore-Donno G, Cimasoni G, Matter J. Ultrastructural study of

epithelial and connective gingival reattachment in man. J Periodontol.

1974;45(8):626-35.

36- Denhardt DT, Guo X. Osteopontin: a protein with diverse functions.

FASEB J. 1993;7(15):1475-82.

37- Alford AI, Hankenson KD. Matricellular proteins: Extracellular

modulators of bone development, remodeling, and regeneration. Bone.

2006;38(6):749-57.

38- Ivanovski S, Gronthos S, Shi S, Bartold PM. Stem cells in the periodontal

ligament. Oral diseases. 2006;12(4):358-63.

39- Yan Q, Sage EH. SPARC, a matricellular glycoprotein with important

biological functions. J Histochem Cytochem. 1999;47(12):1495-506.

40- Bornstein P. Matricellular proteins: an overview. Matrix Biol.

2000;19(7):555-6.

41- Sodek J, Zhu B, Huynh MH, Brown TJ, Ringuette M. Novel functions of

the matricellular proteins osteopontin and osteonectin/SPARC. Connect

Tissue Res. 2002;43(2-3):308-19.

42- Fisher LW, Hawkins GR, Tuross N, Termine JD. Purification and partial

characterization of small proteoglycans I and II, bone sialoproteins I

and II, and osteonectin from the mineral compartment of developing

human bone. J Biol Chem. 1987;262(20):9702-8.

Endereço para correspondência:

Fernando Peixoto Soares

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CEP: 04604-007 - São Paulo - SP

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