avaliaÇÃo de suplementos nutricionais À base de … · 2019-10-25 · methods of quantification...

KELLYANE CORREIA DA CRUZ

AVALIAÇÃO DE SUPLEMENTOS NUTRICIONAIS À BASE

DE PROTEÍNA HIDROLISADA E AMINOÁCIDOS LIVRES

RECIFE

2013

Kellyane Correia da Cruz

Avaliação de suplementos nutricionais à base de proteína

hidrolisada e aminoácidos livres.

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Nutrição do

Centro de Ciências da Saúde da

Universidade Federal de

Pernambuco, para obtenção do grau

de mestre.

Orientador: Prof. Dr. José Almiro da

Paixão

Recife

2013

Catalogação na publicação

Bibliotecária: Mônica Uchôa, CRB4-1010

C957a Cruz, Kellyane Correia da. Avaliação de suplementos nutricionais à base de proteína hidrolisada e aminoácidos livres / Kellyane Correia da Cruz.– Recife: O autor, 2013.

65 f. : il.; tab,; 30 cm. Orientador: José Almiro da Paixão. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco,

CCS. Programa de Pós-Graduação em Nutrição, 2013. Inclui referências, apêndices e anexos. 1. Suplementos alimentares. 2. Proteínas. 3. Hidrolisados de

proteína. I. Paixão, José Almiro da (Orientador). II. Título. 612.3 CDD (23.ed.) UFPE (CCS2013-143)

Kellyane Correia da Cruz

AVALIAÇÃO DE SUPLEMENTOS NUTRICIONAIS À BASE DE PROTEÍNA

HIDROLISADA E AMINOÁCIDOS LIVRES

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição do Centro

de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, aprovada em:

15/08/2013.

Banca examinadora:

_________________________________________________

Profa Dr

a Tânia Lúcia Montenegro Stamford

Departamento de Nutrição - UFPE

_________________________________________________

Profa Dr

a Samara Alvachian Cardoso

Departamento de Engenharia Química - UFPE

_________________________________________________

Profa Dr

a Celiane Gomes Maia da Silva

Departamento de Ciências Domésticas - UFRPE

RECIFE

2013

AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha família: Jurandir Euclides e Brivanira Correia, meus pais

e Elton Euclides, meu irmão; Por todo apoio e amor demonstrados

diariamente.

Ao meu orientador, José Almiro da Paixão, pela dedicação e incentivo à

busca do conhecimento científico, além do exemplo de comprometimento

pessoal com o trabalho e com os alunos.

Ao programa de Pós-graduação em Nutrição, por possibilitar as condições

necessárias ao desenvolvimento, não apenas dos trabalhos de pesquisa, mas

também do ser humano.

A todos os professores da pós-graduação, em especial àquelas que

acompanharam mais de perto a construção deste trabalho, prestando todo o

apoio possível: Tânia Stamford e Samara Andrade.

Agradeço imensamente aos colaboradores do Laboratório de

Experimentação e Análise de Alimentos – LEAAL, Camilo, Alexandre,

Moisés, Olívia e Lourdes, que foram também professores e possibilitaram a

execução dos experimentos.

Aos colegas de mestrado, principalmente às companheiras da área de

alimentos, Simone e Júlia, pela amizade que amenizou o peso de tantas

dificuldades em comum.

Fico feliz ao pensar quão grande seria a lista de amigos que poderia citar,

que compreenderam os longos períodos de ausência, sou grata pela

amizade sincera de cada um deles.

Agradeço também à colaboração indispensável de técnicos e professores de

outros laboratórios: Júlia Campos, do Centro de Tecnologias Estratégicas

do Nordeste (CETENE) e Eliete da Central Analítica do Centro de Ciências

Exatas e da Natureza (CCEN).

Não poderia esquecer os colegas de trabalho IMIP representadas nas

pessoas de Josemere Borba, Janine Barbosa e Edijane Castro, pela

confiança, compreensão e flexibilidade necessária à conclusão desta

jornada.

Gratidão maior a Deus, por ter concedido a família, os amigos, as

oportunidades acadêmicas e profissionais. Por se fazer conhecido e

presente, apesar de mim.

RESUMO

A hidrólise proteica e a síntese de aminoácidos livres podem refletir do ponto de

vista nutricional, a melhoria de parâmetros como: Digestibilidade e utilização

proteica. Dentre os vários tipos de produtos, os suplementos alimentares surgem

como um mercado em constante ascensão e de fácil acesso pela população,

mesmo quando possuem indicações restritas de uso. O presente trabalho se

propôs a avaliar a qualidade proteica de suplemento alimentar destinado a

atletas, quanto ao teor de proteínas totais e grau de hidrólise. Foram

selecionados produtos de elevada concentração proteica, tais como: hidrolisados

do soro do leite, aminoácidos de cadeia ramificada, glutamina e creatina. Os

produtos foram analisados a partir de três diferentes métodos de quantificação de

proteína total: Biureto, Kjeldahl e Análise alimentar através da aplicação de

equação preditiva sugerida por Kumae. As frações peptídicas dos hidrolisados

foram analisadas através da precipitação com ácido tricloroacético e tungstato de

sódio, e também por espectroscopia de massas. Conforme análises química e

elementar foram encontradas inadequações significativas entre quantidade

proteica declarada no rótulo em 20% destes produtos. Foi observada forte

correlação (r>0,83) entre os métodos de quantificação de nitrogênio total:

Kjeldahl e Análise elementar; e fraca correlação (r<0,33) destes com o método

colorimétrico Biureto. A precipitação diferencial com ácidos representa uma

alternativa para a caracterização de frações peptídicas de hidrolisados proteicos,

sendo necessárias adaptações metodológicas para atender às características

destes produtos. Os suplementos nutricionais necessitam de maior

monitoramento e controle de qualidade para sua comercialização.

Palavras chave: Suplementos alimentares. Proteínas. Hidrolisados de proteína.

ABSTRACT

The protein hydrolysis and the synthesis of amino acids may reflect the nutritional point

of view, improvement of parameters such as protein digestibility and utilization. Among

the various types of products, food supplements emerge as a market in constant rise and

easily accessible by the public, even when they have restricted indications for use. This

study aimed to evaluate the protein quality of dietary supplement intended for athletes,

as the protein content and degree of hydrolysis. Were selected products of high protein

concentration, such as hydrolyzed whey, branched chain amino acids, glutamine and

creatine. The products were analyzed using three different methods to quantify total

protein: Biuret, Kjeldahl analysis and food by applying predictive equation suggested

by Kumae. The peptide fractions of the hydrolysates were analyzed by precipitation

with trichloroacetic acid and sodium tungstate and also by mass spectrometry. As

chemical and elemental analyzes found significant mismatches between protein amount

declared on the label in 20% of these products. Strong correlation (r> 0.83) between the

methods of quantification of total nitrogen: Kjeldahl and Elemental Analysis, and weak

correlation (r <0.33) with these Biuret colorimetric method. The differential

precipitation with acids represents an alternative to the characterization of peptide

fractions of protein hydrolysates, with necessary adaptations to meet the methodological

characteristics of these products. Nutritional supplements require greater monitoring and

quality control to marketing.

Keywords: Food supplements. Protein. Protein hydrolyzates

LISTA DE ABREVIATURAS

ANOVA – Analisys of Variance

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AOAC – Association of Official Analytical Chemists

BCA – Ácido bincinconínico

BCAA - Branched Chain Amino Acids

CCEN – Centro de Ciência Exatas e da Natureza

CETENE - Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste

FAO – Food Agriculture Organization

HPLC – High Performance Liquid Chromatography

LEAAL – Laboratório de Experimentação e Análise de Alimentos

MALDI-TOF- Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight

MS – Ministério da Saúde

N - Nitrogênio

n – Número de amostras

PE - Pernambuco

RDC – Resolução da Diretoria Colegiada

TCA – Ácido tricloroacético

TGA- Tungstato de Sódio

UFPE – Universidade Federal de Pernambuco

WHO – World Health Organization

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Comparação entre métodos de quantificação de proteínas totais em matriz do

tipo Whey Protein (Grupo 1)...........................................................................................35


tipo BCAA (Grupo 2)......................................................................................................36


tipo Glutamina (Grupo 3)................................................................................................36


tipo Creatina (Grupo 4)....................................................................................................37

Tabela 5. Comparação da informação nutricional declarada em rotulagem,

quantificação proteica pelos métodos distintos nos grupos

avaliados..........................................................................................................................38

Tabela 6. Correção da quantificação dos grupos glutamina e creatina pelo método

Kjeldahl, utilizando fator de conversão adaptado segundo proporção de nitrogênio da

massa molecular da matriz analisada...............................................................................39

Tabela 7. Frações peptídicas de hidrolisados do soro do leite (Whey Protein)

precipitados com ácido tricloroacético (TCA) e tungstato de sódio

(TGA)..............................................................................................................................43

Tabela 8 Coeficiente de correlação de Pearson entre os métodos de avaliação de

proteínas totais.................................................................................................................44

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Variação de custo dos produtos de acordo com origem da matéria prima e a

rotulagem do produto.......................................................................................................35

Figura 2. Correlação linear de teor de proteína total (%) entre os métodos Kjeldahl e N

elementar, em suplementos a base de hidrolisado do soro do leite.................................40


elementar, em suplementos a base de aminoácido de cadeia ramificada (BCAA).........40


elementar, em suplementos a base de glutamina.............................................................41


elementar, em suplementos a base de creatina................................................................41

Figura 6. Espectro de massa pelo MALDI-TOF-MS em precipitado proteico de

hidrolisado do soro do leite com TGA. Peso molecular 900 – 1.900 Da........................46


hidrolisado do soro do leite com ácido tricloroacético (TCA). Peso molecular: 1.000 –

3.500 Da...........................................................................................................................46


hidrolisado do soro do leite com ácido tricloroacético (TCA). Peso molecular: 6.000 –

20.000 Da.........................................................................................................................47

Figura 2. Espectro de massa pelo MALDI-TOF-MS em Aminoácidos de cadeia

ramificada (BCAA). Peso molecular: 800 – 2.200 Da....................................................47

Figura 30. Espectro de massa pelo MALDI-TOF-MS em glutamina. Peso molecular:

800 – 2.200 Da.................................................................................................................48

Figura 11. Espectro de massa, pelo MALDI-TOF-MS, em Creatina. Peso molecular:

800 – 2.200 Da.................................................................................................................48

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 11

2. OBJETIVO GERAL ............................................................................................... 13

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................... 13

3. REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 14

3.1 Hidrolisado proteico ............................................................................................. 14

3.2 Suplemento proteico para atletas .......................................................................... 15

3.3 Legislação e controle de qualidade ....................................................................... 18

3.4 Métodos analíticos para quantificação de proteínas ............................................. 19

3.4.1 Método de Kjeldahl ....................................................................................... 20

3.4.2 Análise Elementar.......................................................................................... 21

3.4.3 Método Biureto .............................................................................................. 21

3.4.4 Método Lowry ............................................................................................... 22

3.4.5 Método Bradford ........................................................................................... 22

3.4.6 Método BCA (Ácido Bicinconínico) ............................................................. 23

3.4.7 Ultravioleta a 280 nm .................................................................................... 23

4. MÉTODOS ............................................................................................................. 24

4.1 Amostra e Plano de Amostragem ......................................................................... 24

4.2 Métodos para quantificação proteica .................................................................... 24

4.2.1 Método Oficial – Kjeldahl ........................................................................ 24

4.2.2 Método de Biureto .................................................................................... 25

4.2.3 Análise Elementar por Cromatografia Gasosa ........................................ 25

4.3 Métodos para fracionamento de peptídeos e grau de hidrólise ........................ 25

4.3.1 Espectrometria de Massa – MALDI-TOF ................................................ 25

4.3.2 Precipitação de proteínas com ácido tricloroacético (TCA) e Tungstato de

sódio (TGA) ............................................................................................................ 26

4.4 Análise Estatística ................................................................................................ 26

5. RESULTADOS ...................................................................................................... 27

Artigo1: Aplicação de métodos de análise de proteínas para caracterização de

suplementos alimentares para atletas .............................................................................. 28

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ................................................ 56

REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 57

11

1. INTRODUÇÃO

A crescente preocupação e interesse dos consumidores por produtos

diferenciados que possam promover maiores benefícios à saúde e principalmente

quando estes estão associados a possíveis resultados estéticos, tem sido alguns dos

fatores responsáveis pela grande procura por suplementos alimentares (MEDEIROS, et

al. 2010).

Dentre eles, destacam-se os suplementos proteicos para atletas, cujo consumo,

ainda que não recomendada, tem se mostrado elevada entre praticantes de atividade

física em geral, sob a justificativa de promover o aumento da massa muscular ou

melhorar o desempenho no exercício (SCHMITZ & CAMPAGNOLO, 2013).

Existem vários tipos de suplementos proteicos, porém os mais sofisticados do

ponto de vista de processamento de alimentos, são: os hidrolisados da proteína do soro

do leite (Whey Protein), os aminoácidos de cadeira ramificada (BCAA) e os

aminoáciodos isolados ou sintéticos (Glutamina e Creatina). Essas modificações

estruturais agregam grande valor de mercado ao produto, pois conferem digestibilidade

e rápida absorção intestinal dos nutrientes, a fim de promover maior eficiência no

anabolismo proteico (HARAGUCHI, et al 2006; COELHO, 2010; ARAÚJO 2010;

ANDRADE 2012).

Outros segmentos de dietas também se utilizam desse processamento para

modificação estrutural das proteínas, a fim de atender às necessidades clínicas de

indivíduos que apresentam alguma disfunção absortiva do trato gastrointestinal ou

alergias à proteína em sua forma intacta, sejam elas na foram de fórmulas infantis ou

adultas. Nestes caso, estas dietas, como parte do tratamento clínico, atendem a um rigor

e exigências de elevados padrões, os quais repercutem também em elevados custos aos

produtos (RAMESH, 2008; ROSSI, 2009; SICHERER & SAMPSON, 2010).

No entanto, para os suplementos proteicos, o monitoramento e o controle de

qualidade são dificultados pelos métodos de análise de elevado custo e complexidade,

cabendo apenas às empresas a responsabilidade de garantir que seus produtos sejam

seguros e as afirmações qualitativas e quantitativas contidas nos rótulos, verdadeiras

(BRASIL, 2003).

Tendo em vista a grande variedade de suplementos proteicos no mercado, a

comercialização indiscriminada e a grande variação no preço final que é repassado ao

consumidor, questionam-se o conteúdo proteico, bem como a fidedignidade das

12

informações nutricionais contidas na rotulagem destes produtos. O estudo e o

monitoramento da qualidade desses alimentos são de fundamental importância para que

sejam atendidas as condições necessárias para comercialização e segurança no consumo

dos suplementos.

13

2. OBJETIVO GERAL

Avaliar a qualidade nutricional de proteínas e aminoácidos presentes nos

suplementos proteicos para atletas.

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar os produtos quanto às proteínas totais e estabelecer correlação

entre os resultados obtidos pelos diferentes métodos

Estimar o grau de hidrólise por diferentes métodos usando seletivamente

agentes de precipitação e espectro de massa MALDI-TOF

14

3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Hidrolisado protéico

Hidrolisados protéicos constituem uma alternativa promissora às fontes

convencionais de proteínas e representam uma diversidade de produtos para fins

especiais, por fornecer suporte nutricional específico para indivíduos com diferentes

necessidades (CLEMENTE, 2000; ROSSI, 2009).

A hidrólise pode ser realizada por meio da adição de enzimas que modificam as

propriedades físico-químicas, funcionais e sensoriais das proteínas inicialmente intactas.

A sua ação nos alimentos, em geral, promove a formação de compostos que concedem

aroma e/ou textura específicos, propriedades funcionais e formação de peptídeos com

atividade biológica. Por isso, a qualidade do produto pode variar com a natureza da

enzima e as condições de processamento (ROMAN, 2005; SCHMIDT, 2009).

Além disso, devido à complexidade das cadeias polipeptídicas, torna-se difícil

prever e controlar as transformações químicas a que estas proteínas estão sujeitas tanto

durante o seu processamento quanto no armazenamento dos alimentos. Nesse sentido,

são utilizadas comercialmente enzimas de diferentes modos de ação, a fim de aumentar

a especificidade da reação desejada. Das enzimas utilizadas no processamento de

alimentos, cerca de 60% são destinadas ao processamento de proteínas, sendo

classificadas conforme o local de atuação na cadeia peptídica ou de acordo com a

natureza química de seu sítio catalítico (BOBBIO, 2003; KOBLITZ, 2008; FENNEMA,

2010).

Como resultado da clivagem de suas ligações peptídicas, as proteínas são

transformadas em peptídeos de diferentes tamanhos e em aminoácidos livres. Porém,

de uma forma geral, a diminuição da massa molecular é responsável pela melhora de

parâmetros biológicos, tais como: digestibilidade e utilização proteica. A exposição de

grupos hidrofóbicos que estavam protegidos na estrutura original da proteína pode

conferir sabor amargo residual na maioria dos produtos (ROMAN, 2005; MARTINS,

2009; ROSSI, 2009)

Do ponto de vista nutricional, este recurso tem sido utilizado no manejo

nutricional em condições clínicas adversas de digestão, absorção e má nutrição, como

nos casos de hidrólise luminal prejudicada, falência gástrica ou hepática, câncer,

doenças inflamatórias intestinais, fístulas digestivas e alergias alimentares (RAMESH,

15

2008; SICHERER & SAMPSON, 2010). Portanto, sua aplicação na indústria de

alimentos tem se tornado cada vez mais abrangente, devido às possibilidades de

aplicação na elaboração de produtos para geriatria, suplementos alimentares, fórmulas

infantis, dietas enterais, e ração para animais (ROSSI, 2009).

3.2 Suplemento proteico para atletas

Suplementos alimentares são considerados gêneros alimentícios indicados

apenas em circunstâncias em que há impossibilidade de obter, a partir da dieta, um ou

mais nutrientes em quantidade e disponibilidade necessária ao bom desenvolvimento ou

manutenção da saúde. De uma forma geral, os suplementos podem ser classificados,

conforme a natureza de seus ingredientes, em vitaminas, minerais, extratos botânicos,

aminoácidos ou metabólitos (BRASIL, 2003; OLIVEIRA, 2007; ANDRADE, 2012).

Estes produtos são facilmente encontrados em farmácias, academias, internet e

lojas especializadas e, dependendo de sua categoria, podem ou não apresentar

obrigatoriedade de registro na Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e

Ministério da Saúde (MS).

Os suplementos dietéticos protéicos já constavam dentro da classe de alimentos

registráveis, segundo a portaria 01 de 1988, sendo reforçados na Resolução da Diretoria

Colegiada (RDC) 278/2005 com o termo: Alimentos para praticantes de atividade física.

Em seguida, com classificação mais específica, segundo a RDC 18/2010, os

suplementos protéicos passaram a ser considerados alimentos para atletas, ficando

revogadas as portarias anteriores. Nesse novo grupo foram incluídos, além da proteína,

os suplementos energéticos, hidroeletrolíticos, substitutos parciais de refeições, creatina,

cafeína e outros que podem ser autorizadas desde que haja segurança no uso e eficácia

cientificamente comprovada.

Os aminoácidos de cadeia ramificada, dispensados da obrigatoriedade de

registro, pela falta de regulamentação específica, podem ser comercializados desde que

o produto não apresente indicação para fins ergogênicos, ou seja, capaz de melhorar a

performance nas atividades físicas esportivas, ou mesmo ocupacionais . A resolução

vigente, além da obrigatoriedade de registro, também se dispõe sobre os padrões gerais

de rotulagem e composição nutricional desses produtos (BRASIL, 2010).

Além de atletas, outros grupos de interesse, tais como praticantes eventuais de

atividade física, tem estendido o consumo desses produtos, sem que haja recomendação

16

e/ou prescrição especializada. A preocupação com a estética, saúde, desempenho e um

envelhecimento saudável são os principais motivos para o crescimento nessa escala de

consumo da indústria dos suplementos.

De acordo com a Associação Brasileira de Empresas de Produtos Nutricionais

(ABENUTRI), o mercado nacional de suplementos obteve em 2008 um crescimento

considerável de 20-25%, chegando em 2011 com um faturamento estimado em R$ 300

milhões ao ano; que apesar de ser considerado incipiente em relação aos Estados Unidos

e Europa, demonstra uma tendência de fortalecimento econômico do seguimento.

Grande parte desta demanda é composta por freqüentadores de academia, que a

princípio, não necessitam de suplementação, pois suas necessidades podem ser

alcançadas com uma alimentação saudável. No entanto, este consumo tem aumentado

cada vez mais, estimulando a demanda por novos produtos muitos deles sem efeitos

comprovados cientificamente e comercializados de forma indiscriminada

(CARVALHO, 2003; KHETAN, 2008; SBME, 2009).

Estima-se que a utilização de suplementos nutricionais visando o aumento do

desempenho físico chega a alcançar índices elevados entre praticantes de atividade

física não atletas (40%), atletas de maneira geral (60%) e fisiculturistas (100%),

respectivamente (SBME, 2003).

A Sociedade Brasileira de Medicina e Esporte destaca o fato de, no Brasil, estar

correlacionado o uso abusivo de suplementos e outras drogas com finalidade ergogênica

e estética. Estudos nacionais realizados em diferentes Estados corroboram com este

dado, apresentando maior prevalência entre homens, de classe média, freqüentadores de

academia e praticantes de musculação, cujo consumo pode variar entre 50 a 80% entre

os frequentadores. (HIRSCHBRUCH et al, 2008; ANDRADE et al, 2012; SCHMITZ &

CAMPAGNOLO, 2013).

A predileção pelos suplementos protéicos justifica-se pelo objetivo de ganho de

massa muscular. Dentre os produtos que apresentam maior demanda de consumo estão

os derivados de proteínas do soro do leite (whey protein); aminoácidos de cadeia

ramificada, também conhecidos como BCAA´s (branched-chain amino acid);

glutamina e creatina (COELHO, 2010; ARAÚJO 2010; SCHMITZ &

CAMPAGNOLO, 2013; ANDRADE 2012).

As proteínas do soro do leite, também conhecidas comercialmente como Whey

Protein, possuem uma proporção de aminoácidos de alto valor biológico, rico em

aminoácidos essenciais e de cadeia ramificada. São muito utilizadas após o treinamento

17

físico a fim de proporcionar elevação plasmática da concentração de aminoácidos,

favorecendo a síntese proteica muscular. Alguns desses produtos estão disponíveis nas

formas hidrolisadas com a alegação de proporcionar uma absorção mais eficiente e

consequentemente favorecer o anabolismo de forma mais intensa. (HARAGUCHI, et al

2006).

O consumo de aminoácidos de cadeia ramificada (valina, leucina, e isoleucina),

tem sido justificado como recurso ergogênico, por representar cerca de um terço da

composição muscular, e por conseqüência, aumenta a necessidade de reposição das

moléculas oxidadas para regulação da síntese proteica (SCHNEIDER, LIBERALI,

2008).

Outro efeito atribuído à ingestão destes aminoácidos seria no retardamento da

fadiga muscular, através da competição da entrada de triptofano na barreira hemato-

encefálica, que, por sua vez, diminuiria a síntese de serotonina. Esse neurotransmissor é

associado à sensação de bem-estar, letargia e sono, diminuindo a potência muscular

durante a prática esportiva (ASCENÇÃO, 2003; NOVELLI, 2007; SCHNEIDER,

2008). Porém, devido a limitações metodológicas para protocolos experimentais, os

estudos ainda são insuficientes para permitir o entendimento da interação entre os

aminoácidos de cadeia ramificada e os sistemas orgânicos envolvidos (UCHIDA, et al.

2008).

A glutamina, considerada o aminoácido livre mais abundante no organismo

humano, apresenta grande parte de sua concentração corporal, cerca de 80% (oitenta por

cento), no músculo esquelético, sendo ativamente mobilizada durante o exercício. Por

isso, diversas alternativas de suplementação com glutamina tem sido aplicadas antes,

durante e após o exercício, para reposição da concentração plasmática e tecidual desse

aminoácido, que diminui após o exercício intenso e prolongado. (ARAÚJO, 2010).

Quanto ao consumo da glutamina, discute-se também a biodisponibilidade após

ingestão oral, já que é sabido que ela serve de substrato para células de rápida

multiplicação, e podem ser utilizadas por células como os enterócitos e leucócitos antes

que venha a atingir o objetivo de sua suplementação. Portanto, os reais efeitos da sua

suplementação oral durante o exercício, na musculatura esquelética, ainda são

questionáveis. (NOVELLI, et al. 2007).

Dentre todos os suplementos, a creatina se apresenta em destaque por fazer parte

de um seleto grupo de compostos nutricionais que tiveram sua ação ergogênica testada e

comprovada no aumento dos níveis de força e potência muscular, com maior efeito

18

observado em contrações dinâmicas (MEDEIROS, et al. 2010). Sua atuação se dá no

aumento da capacidade de suprir a adenosina trifosfato (ATP) por um período longo de

tempo durante o trabalho em alta intensidade e curta duração, através da reação da

creatina quinase e aumenta a capacidade de tolerar distúrbios ácido-base, atenuando a

ocorrência de fadiga muscular (VOLEK, 2000; PRADO, 2007).

3.3 Legislação e controle de qualidade

Segundo Câmara (2008), os estudos nacionais sobre regulamentação de produtos

industrializados e rotulagem apontaram, através de testes laboratoriais, um grande

número de irregularidades, principalmente em relação aos valores declarados nas

informações nutricionais, além de outras relativas às normas de apresentação dessas

informações. Foi observado que os valores superestimados com maior frequencia são,

em geral, relativos aos carboidratos e proteínas. As irregularidades quanto aos

nutrientes informados ao consumidor violam os direitos garantidos ao consumidor

regulamentados pela RDC 360/03 da ANVISA.

No que se refere aos suplementos alimentares, o Food and Drug Administration

(FDA), órgão governamental dos Estados Unidos da América, sob os termos da lei

Dietary Supplement Health and Education (DSHEA, 1994), ou “Saúde e Educação

sobre Suplementos Alimentares” em tradução livre, permite que os fabricantes de

suplementos alimentares comercializem seus produtos sem necessidade de aprovação

prévia, com exceção dos casos onde são incluídos novos ingredientes/alegações de

saúde, necessitando de comprovação científica para tal. Do ponto de vista qualitativo e

quantitativo, é responsabilidade da empresa garantir que seus produtos sejam seguros e

as afirmações verdadeiras.

Segundo o regimento europeu, os produtos também podem ser colocados no

mercado de acordo com seus princípios consagrados, o qual atribui a responsabilidade

do cumprimento dos requisitos previstos na legislação aplicável ao fabricante do

produto. As possíveis irregularidades ou efeitos adversos devem ser devidamente

notificados, no entanto, este processo de notificação, em geral, é feito pelo consumidor,

uma vez que não há realização de análises, livres de conflitos de interesses, que

antecedam a comercialização dos mesmos (DIRETIVA 2002/46/CE).

Da mesma forma, no mercado nacional brasileiro, o fabricante ou o responsável

pela colocação no mercado, antes de iniciar a comercialização de um produto, deve

http://pt.wikipedia.org/wiki/Estados_Unidos_da_Am%C3%A9rica

19

informar a autoridade competente dessa comercialização, enviando-lhe um modelo de

rótulo utilizado para esse produto. Os valores declarados são baseados na análise do

produto realizada pelo fabricante (BRASIL, 2003).

No caso dos alimentos protéicos e aminoácidos de cadeia ramificada para

atletas, esses são considerados pela portaria do Ministério da Saúde, como “alimentos

para atletas”, uma categoria de produtos com finalidade e públicos específicos

(BRASIL, 2010). Essa portaria ministerial tem como objetivo fixar a identidade e as

características mínimas de qualidade desses produtos, de forma a evitar o consumo

indiscriminado, e fornecer orientações precisas quanto à suplementação alimentar de

pessoas que praticam atividade física.

No entanto, apesar da indicação ser restrita, qualquer pessoa pode ter acesso a

estes produtos, sem necessitar de prescrição de profissional em saúde. Da empresa, são

exigidas documentações referentes ao atendimento dos requisitos previstos no

regulamento técnico sobre “Alimentos para Atletas”. Segundo o qual, deve-se atender

às normas de tecnologia de fabricação; de contaminantes; de características

macroscópicas, microscópicas e microbiológicas; de rotulagem geral de alimentos

embalados; de rotulagem nutricional de alimentos embalados; de embalagens e

equipamentos; de informação nutricional complementar, quando houver (BRASIL,

2010).

Do ponto de vista comercial, a legislação nacional, tem como característica a

tendência de, cada vez mais, exigir avaliação criteriosa e restritiva em relação à

validação científica dos efeitos de novos ingredientes e recomendações aos praticantes

de atividade física. Essa distinção nas regulamentações e restrições, no entanto, é

apontado como um dos principais motivos da grande comercialização de produtos

clandestinos importados, largamente utilizados por freqüentadores de academia no

Brasil; ou pelo uso indiscriminado de produtos sem a indicação apropriada

(MAUGHAN et al, 2004).

3.4 Métodos analíticos para quantificação de proteínas

A caracterização da matriz alimentar por meio de métodos analíticos é de

extrema importância para o conhecimento da natureza dos nutrientes. Portanto, a

escolha do método analítico é fundamental para a obtenção de dados sobre a

composição e características de nutrientes. A aplicação metodológica deve ser avaliada

20

considerando a matriz do alimento estudado, a fim de obter maior fidedignidade das

informações, bem como a viabilidade de sua aplicação prática (SOUTHGATE et al,

1970; SILVA, 2002; CECCHI, 2003).

Em alguns países o método analítico pode estar especificado na legislação; esta,

porém, ocasionalmente, pode também permitir a utilização de métodos que possam ser

comparados aos oficiais, com o objetivo de simplificar a execução dos mesmos e manter

um padrão de confiabilidade (DWYER, 1994; FAO, 2004).

A escolha do método depende de vários fatores, como a exatidão, rapidez e

custo; no entanto, para assegurar maior confiabilidade dos dados, é imprescindível levar

em consideração as características inerentes à amostra analisada. Em alguns casos, esta

escolha é feita com base na popularidade do método, devido à falta de estudos

comparativos de metodologias (ZAIA et al, 1998).

Os métodos existentes para determinação de proteínas em alimentos variam de

acordo com a diversidade de princípios estruturais por elas apresentados. Pode ser

baseado na presença de ligações peptídicas, elemento ou grupamento presente na

estrutura, na capacidade de absorção UV, na ligação de corantes, nos grupamentos

aminos livres ou na complexação a compostos químicos (PETERSON, 1983;

STOSCHECK, 1990; FIFIELD, 2000; NIELSEN, 2003; LEHNINGER, 2011)

3.4.1 Método de Kjeldahl

O método de kjeldahl é o método oficial da Associaton of Official Analytical

Chemists (AOAC), para determinação do teor total de nitrogênio presente no alimento.

Os compostos orgânicos são digeridos com ácido sulfúrico, na presença de catalisadores

que aceleram a oxidação da matéria, a fim de converter o nitrogênio da amostra em

sulfato de amônio (GÁSPAR, 1984). O processo de digestão da amostra ocorre em

temperaturas elevadas e continua em mais duas etapas, com a destilação da amostra

digerida, num aparelho de kjeldahl, para retenção de todo o nitrogênio na forma de

amônia (NH3) em solução de ácido bórico. O nitrogêncio é titulado com ácido

clorídrico, de forma que o volume gasto nesta titulação é proporcional à quantidade de

nitrogênio da amostra (AOAC, 2002).

Para que o valor seja expresso em proteína, é necessária a conversão do

conteúdo de nitrogênio (N) através de um fator, baseado no percentual de nitrogênio

presente na maioria das proteínas, que em geral, é de 16%, nesse caso, o fator, obtido a

21

partir da divisão de 100 pelo percentual presente na proteína (100/16), seria 6,25. A

variação do percentual de nitrogênio nos alimentos permite que outros fatores sejam

adaptados. O método de Kjeldahl é aplicável para a maioria dos alimentos e amostras

sólidas, é de baixo custo e de execução demorada, requer manipulação de reagentes

corrosivos e não faz diferenciação entre nitrogênio proteico e não proteico (JAMES,

1995).

3.4.2 Análise Elementar

A quantificação do nitrogênio é utilizado no método de análise elementar, a

partir do qual se obtém a composição química dos principais nutrientes: proteínas,

lipídeos e carboidratos. O método propõe a utilização de equações preditivas, a partir

da composição elementar de carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio. Após

incineração da amostra a uma temperatura de aproximadamente 1000°C, na presença de

gás Hélio e gás Oxigênio, os elementos orgânicos são transformados em gases, que são

separados através de uma coluna cromatográfica (KUMAE 2000; 2001). O processo é

indicado para amostras sólidas e possui a vantagem de ser rápida e não necessitar de

manipulação com reagentes corrosivos.

3.4.3 Método Biureto

O método Biureto consiste na adição de hidróxido de sódio e sulfato de cobre a

uma solução contendo ligações peptídicas (GORNALL, 1949). Estas ligações, em meio

básico, reagem com íons cúpricos, formando um complexo quadrado planar, onde um

átomo de cobre liga-se a quatro átomos de nitrogênio das ligações peptídicas.

Para que a reação ocorra, é necessária a presença de, no mínimo, duas ligações

peptídicas, sendo a concentração de proteína diretamente proporcional à intensidade da

coloração por ela produzida. O produto da reação apresenta bandas de absorção em 270

e 540 nm, sendo esta última a mais utilizada, devido à menor interferência de

substâncias presentes nas amostras (ITZHAKI, 1964). A quantificação da concentração

da amostra depende da obtenção prévia de uma curva padrão, com proteína em

diferentes concentrações conhecidas, utiliza-se em geral albumina do soro bovino

(BSA) ou Caseína. É considerado um método rápido e de baixo custo e não apresenta

variação de absortividade para proteínas específicas (GORNALL, 1949).

22

3.4.4 Método Lowry

O método de Lowry é semelhante ao método biureto, no sentido de também

resultar da reação entre o cobre e ligações peptídicas em meio alcalino. O diferencial, no

entanto, está no reagente de folin-ciocalteau, uma mistura contendo molibdato,

tungstato e ácido fosfórico, que sofre uma redução ao reagir com proteínas, na presença

do cobre, como catalisador (LOWRY, 1951). Após a adição do mesmo na proteína

tratada com cobre, é possível proporcionar a formação de uma coloração mais intensa,

que apresenta absorção máxima em 750 nm (PETERSON, 1983). A concentração das

proteínas neste caso, também depende da construção prévia de uma curva de

concentrações conhecidas de uma proteína padrão. A redução, no entanto, ocorre de

forma mais específica com alguns aminoácidos aromáticos, tirosina e triptofano

(STOSCHECK, 1990), característica essa, que faz com que o método tenha

sensibilidade variável de acordo com a composição da proteína.

Tal método pode ser utilizado na determinação de proteínas em líquor, plasma

sanguíneo, saliva, tecido animal, suco biliar, leite humano e produtos alimentícios.

Apesar de ser um método simples, sensível e rápido, pode reagir com compostos

fenólicos, presentes em amostras de origem vegetal, sendo necessária a remoção destes

interferentes (ZAIA, 1998).

3.4.5 Método Bradford

O método de Bradford baseia-se na reação indicada pelo corante azul Brilhante

de Coomassie G-250 numa solução contendo proteínas e em presença de etanol e ácido

fosfórico (BRADFORD, 1976). Ao modificar o pH da solução a um valor inferior ao

seu ponto isoelétrico, o pigmento forma uma ligação eletrostática com grupos amônio

(NH3+). Porém, como as proteínas possuem diferentes proporções de grupos amônio e

podem também reagir de forma diferente ao corante, a intensidade da coloração obtida

sofre variação com o tipo da proteína utilizada (SEDMAK & GROSSBERG, 1977).

A leitura da absorbância máxima em 595nm acontece quando o corante sai da

forma aniônica (vermelha) para a forma catiônica (azul) (BRADFORD, 1976). O

método é simples, rápido e de baixo custo, indicado para amostras em solução, de

proteínas de origem animal e microbiana. No entanto, o corante apresenta maior

afinidade com os resíduos ou cadeias laterais de arginina em detrimento de outros

aminoácidos e pode apresentar sensibilidade variável (RAUNKJAER, et al 1994).

23

3.4.6 Método BCA (Ácido Bicinconínico)

O Ácido Bicinconínico, ou método BCA, é composto por carbonato de sódio,

bicarbonato de sódio, ácido bicinconínico, tartarato de sódio e hidróxido de sódio. Este

reagente é solúvel em água e possui alta especificidade para reagir com cobre em meio

alcalino, semelhantemente ao método de Lowry. No entanto, a substituição do do

reagente Folin-Ciocalteau pelo ácido bicinconínico contribui para aumentar a

sensibilidade de detecção do produto da reação entre as ligações peptídicas e minimizar

o efeito dos interferentes (BROWN et al, 1989). O BCA reage com íons de cobre (Cu+),

produzindo uma coloração roxa, a qual pode ser aferida em absorbância de 562nm e

apresenta variação da absorbância com o tempo, além da dependência de temperatura de

incubação (SMITH et al, 1985).

3.4.7 Ultravioleta a 280 nm

O método de absorção Ultra- Violeta a 280 nm, é um método rápido e não

destrutivo da amostra, utilizando a amostra em solução sem a necessidade de adição de

reagentes. O princípio da detecção baseia-se na presença dos aminoácidos tirosina e

triptofano que apresentam esta faixa de absortividade (STOSCHECK, 1990). O método,

no entanto, é pouco confiável, pois diversas substâncias podem agir como fatores

interferentes e a sensibilidade vai variar de acordo com a presença destes aminoácidos

na proteína (PETERSON, 1983; STOSCHECK, 1990).

24

4. MÉTODOS

4.1 Amostra e Plano de Amostragem

A amostra foi constituída de produtos classificados como suplementos proteicos

e/ou aminoácidos para prática de esporte.

Os produtos foram subclassificados conforme o tipo de aminoácido ou grau de

hidrólise provável em quatro grupos específicos: 1- Proteína 100% Hidrolisada do Soro

do Leite (Whey Protein); 2- Aminoácidos de Cadeia Ramificada (BCAA); 3-

Glutamina; e 4- Creatina.

A quantidade de amostras coletadas (n=30) foi baseada na variedade de marcas

encontradas comercialmente para cada tipo de produto e ajustadas de acordo com a

disponibilidade no mercado, a saber: grupos 1 e 2, n=9; Grupos 3 e 4, n=6

4.2 Métodos para quantificação proteica

4.2.1 Método Oficial – Kjeldahl

O método de referência utilizado para determinação de proteína total foi o de

Kjeldahl (AOAC, 2008). Foram utilizadas alíquotas de 0,3 g de cada amostra, digeridas

sob aquecimento em bloco digestor, até 450 °C até destruição completa da matéria

orgânica, na presença de 15 ml de ácido Sulfúrico e 1,5g de mistura catalítica composta

de Sulfato de Potássio e Sulfato de Cobre.

Após resfriamento das amostras, foi acrescido 20 ml de água aos tubos de

digestão Kjeldahl para destilação da amostra com 50ml de Hidróxido de Sódio. A

solução concensada foi depositada em Erlenmeyer contendo 30ml de solução de Ácido

Bórico 3,5% e indicador misto (vermelho de metila e verde de bromocresol) . Titulou-

se a solução obtida (150 ml) com ácido clorídrico (HCl) 0,1N até mudança de

coloração verde para rosado. O teor de Proteína Total foi calculado de acordo com as

variáveis de volume de HCl gasto na titulação, peso da amostra, fator do HCl e fator

de conversão geral baseado no percentual de nitrogênio na proteína. Todas as amostras

foram analisadas em duplicata.

As análises foram realizadas no Laboratório de Experimentação e Análise de Alimentos

Profa

Nonete Barbosa Guerra, no Departamento de Nutrição da UFPE.

25

4.2.2 Método de Biureto

O método para quantificação de proteína total através da reação entre as ligações

peptíditas e do reativo de biureto, consistiu na adição de 1,5 g de Sulfato de Cobre

Pentahidratado, 6 g de Tartarato de Sódio, 300ml de Hidróxido de Sódio 10%,

completados com água destilada até o volume de 1L (GORNAL, 1949). As amostras

foram diluídas e homogeneizadas em água destilada na concentração de 1%. Foram

retiradas alíquotas de 1 ml de cada amostra e transferidas com pipetador automático

para tubos de ensaio contendo 3,0 ml do reagente. Os frascos foram agitados e a leitura

realizada em espectrofotômetro a 540 nm. A partir dos valores de absorbâncias de cada

análise, foi calculado o teor total de proteína, baseado na equação de reta obtida com

Soro de Albumina Bovina (BSA), uma proteína padrão utilizada na construção de

curvas de calibração da metodologia proposta. Todas as amostras foram analisadas em

triplicata.

4.2.3 Análise Elementar por Cromatografia Gasosa

A análise elementar foi obtida através da quantificação percentual dos elementos

Carbono, Hidrogênio, Nitrogênio e Oxigênio presente nas amostras. Foram utilizadas

3mg da amostra, submetidas à combustão completa. Após a combustão, os gases

produzidos são arrastados e separados em coluna de cromatografia gasosa. Para

conversão do percentual de Nitrogênio em proteína, são utilizadas equações preditivas

segundo Kumae (2000). As análises foram realizadas na Central Analítica do

Departamento de Química Fundamental, no Centro de Ciências Exatas e da Natureza,

UFPE.

4.3 Métodos para fracionamento de peptídeos e grau de hidrólise

4.3.1 Espectrometria de Massa – MALDI-TOF

Para a estimativa de peso molecular dos peptídeos retirados dos precipitados

proteicos, foi utilizado um Espectrômetro de Massa MALDI-TOF Autoflex III (Bruker

Daltonics, Billerica, MA, USA) Laser Nd:YAG, 355 nm. Freq. laser: 100 Hz Programa:

FlexControl. Versão 3.0 (Bruker Daltonics).

As amostras foram diluídas em ácido trifluoroacético (TFA) 0,1%. Matriz: ácido alfa-

ciano-4-hidroxicinâmico - HCCA (10 mg/mL) em acetonitrila P.A. 50% e ácido

trifluoracético (TFA) 0,3%.

26

Aplicação na placa de MALDI: Método da gota seca - a amostra foi misturada à

matriz e a mistura foi aplicada na placa e deixada em temperatura ambiente até secar

para ser cristalizada com a matriz. Em seguida, a amostra foi bombardeada com um

laser para evaporação; o tempo e a quantidade do material ionizado e volatilizado foi

então detectado (ALBRETHSEN, 2007).

4.3.2 Precipitação de proteínas com ácido tricloroacético (TCA) e Tungstato de

sódio (TGA)

Ácido tricloroacético (TCA)

O ácido tricloroacético foi utilizado para precipitação de pepitídeos com mais de

10 resíduos de aminoácidos. Foi pesado 0,5 g da amostra em um béquer, ao qual se

adicionou 50 ml de água destilada e 10 ml de TCA a 10%. Após 30 minutos o

precipitado foi filtrado com papel filtro Whatman # 54 ou 541 por gravidade (LICITRA

et al, 1996). A proteína retida no papel filtro foi quantificada pelo método Kjeldahl.

Tungstato de sódio

O tungstato de sódio foi utilizado objetivando a precipitação de pepitídeos com

mais de 3 resíduos de aminoácidos. Foi pesado 0,5 g da amostra em um béquer, ao qual

se adicionou 50 ml de água destilada e 8 ml de tungstato de sódio a 10%. Em seguida

foi acrescido 8 a 10 ml de ácido sulfúrico a 10% até alcançar pH 2,0. O precipitado

obtido foi filtrado com papel filtro Whatman # 54 ou 541 por gravidade (LICITRA et

al, 1996). A proteína retida no papel filtro foi quantificada pelo método Kjeldahl.

4.4 Análise Estatística

Os dados foram avaliados segundo análise de variância (ANOVA) utilizando o

teste de Duncan para comparação entre as médias (α=5%) e realizados através do

programa “Statistic for Windows 8.0”. Foi utilizada correlação de Pearson para os

métodos de nitrogênio total.

http://www.clinchem.org/search?author1=Jakob+Albrethsen&sortspec=date&submit=Submit

27

5. RESULTADOS

O artigo será submetido à Revista Journal of Agricultural and Food Chemistry, sendo

intitulada “Aplicação de métodos de análise de proteínas para caracterização de

suplementos alimentares para atletas”. A revista é classificada como A1 – Área

Nutrição.

28

Artigo1: Aplicação de métodos de análise de proteínas para

caracterização de suplementos alimentares para atletas

Kellyane Correia da Cruza; José Almiro da Paixão

b

a Programa de Pós - Graduação em Nutrição - Mestrado, Universidade Federal de Pernambuco, Recife – PE, Brasil;

b Departamento de Nutrição, Universidade Federal de Pernambuco, Recife -PE, Brasil

Resumo

A pesquisa teve como objetivo avaliar a qualidade proteica de suplementos alimentares

para atletas quanto ao teor de proteínas totais e ao grau de hidrólise. Os produtos foram

analisados por três diferentes métodos de quantificação de proteína total: Biureto,

Kjeldahl e Análise elementar através da aplicação de equação preditiva sugerida por

Kumae. As frações peptídicas dos hidrolisados foram analisadas através da precipitação

com ácido tricloroacético e tungstato de sódio, e também por espectroscopia de massas.

Conforme análise química e elementar foi encontrada inadequação significativa entre

quantidade proteica declarada no rótulo em 20% destes produtos. Foi observada forte

correlação (r>0,83) entre os métodos de quantificação de nitrogênio total: Kjeldahl e

Análise elementar. A precipitação diferencial com ácidos pode ser uma alternativa para

a caracterização de frações peptídicas de hidrolisados proteicos. Os produtos destinados

à suplementação nutricional necessitam de maior monitoramento e controle de

qualidade para sua comercialização, bem como de adaptação metodológica para atender

às características destes produtos.

Palavras Chave: Suplemento, proteína, hidrolisado

29

INTRODUÇÃO

As inovações no processamento de alimentos, mais especificamente de proteínas

tem sido de grande importância e aplicação na indústria de alimentos possibilitando a

adaptação cada vez mais abrangente da matéria prima, na elaboração de novos produtos

(HARAGUCHI et al, 2006; FENNEMA, 2010).

Uma das alternativas promissoras está na hidrólise proteica ou isolamento de

aminoácidos, a fim de melhorar a digestibilidade e promover rápida absorção intestinal

do nutriente (KEOHANE et al, 1985; ROMAN, 2005; MARTINS, 2009). Esses

recursos podem ser aplicados a uma ampla variedade de objetivos dietoterápicos,

fornecendo suporte nutricional específico para indivíduos na forma de suplementos

alimentares, fórmulas infantis, dietas enterais, e ração para animais (CLEMENTE,

2000; RAMESH, 2008; ROSSI, 2009; SICHERER & SAMPSON, 2010).

Os suplementos alimentares à base de proteínas ou aminoácidos tem ocupado

um espaço considerável no mercado nacional e internacional, por ser considerado pelos

consumidores como um recurso ergogênico e estético (CARVALHO, 2003; SCHMITZ

& CAMPAGNOLO, 2013). Esses produtos, apesar de recomendados para atletas, têm

sido largamente utilizados por praticantes de atividade física em geral, de acordo com

estudos realizados em academias de distintas regiões do país (HIRSCHBRUCH et al,

2008; MEDEIROS, et al. 2010; ANDRADE 2012).

Estimulados pela alta demanda, surgem também produtos sem efeitos

comprovados cientificamente ou com inadequações diversas. Estudo nacional sobre

rotulagem e composição nutricional em produtos industrializados, estima que as

maiores irregularidades estejam relacionadas aos valores de nutrientes por eles

declarados, geralmente superestimados (CÂMARA, 2008).

O controle de qualidade e monitoramento dos produtos torna-se dificultado pelos

métodos de análise de alto custo e complexidade, cabendo às empresas a

responsabilidade de garantir que seus produtos sejam seguros e as afirmações

qualitativas e quantitativas contidas nos rótulos, verdadeiras (BRASIL, 2003). É

necessário uma busca por métodos e procedimentos laboratoriais confiáveis que possam

ser adaptados e aplicados em estudos de qualidade e tecnologia de alimentos (DWYER,

1994; FAO, 2004; ARAÚJO, 2008; KOBLITZ, 2008).

30

Diante do exposto, esta pesquisa teve como objetivo avaliar a qualidade destes

produtos do ponto de vista quantitativo e quanto ao grau de hidrólise, utilizando

diferentes métodos para melhor adaptação metodológica.

31

MATERIAL E MÉTODOS

Amostra e Plano de Amostragem

A amostra foi constituída de produtos classificados como suplementos proteicos

e/ou aminoácidos para prática esportiva.

Os produtos foram subclassificados conforme o tipo de aminoácido ou grau de

hidrólise em quatro grupos específicos: Proteína 100% Hidrolisada do Soro do Leite;

Aminoácidos de Cadeia Ramificada (BCAA); Glutamina; e Creatina.

A quantidade de amostras coletadas (n=30) foi baseada na variedade de marcas

encontradas comercialmente para cada tipo de produto.

Métodos Analíticos

Método de Referência – Kjeldahl

O método de referência utilizado para determinação de proteína total foi o de

Kjeldahl (AOAC, 1995). Foram utilizadas alíquotas de 0,3 g de cada amostra, digeridas

sob aquecimento em bloco digestor, até 450 °C até destruição completa da matéria

orgânica, na presença de 15 ml de ácido Sulfúrico e 1,5g de mistura catalítica composta

de Sulfato de Potássio e Sulfato de Cobre.

Após resfriamento das amostras, foi acrescido 20 ml de água aos tubos de

digestão Kjeldahl para destilação da amostra com 50ml de Hidróxido de Sódio. A

solução concensada foi depositada em Erlenmeyer contendo 30ml de solução de Ácido

Bórico 3,5% e indicador misto (vermelho de metila e verde de bromocresol) . Titulou-

se a solução obtida (150 ml) com ácido clorídrico (HCl) 0,1N até mudança de

coloração verde para rosado. O teor de Proteína Total foi calculado de acordo com as

variáveis de volume de HCl gasto na titulação, peso da amostra, fator do HCl e fator

de conversão geral baseado no percentual de nitrogênio na proteína. Todas as amostras

foram analisadas em duplicata.

Método de Biureto

32

O preparo da solução reagente consistiu na adição de 1,5 g de Sulfato de Cobre

Pentahidratado, 6 g de Tartarato de Sódio, 300ml de Hidróxido de Sódio 10%,

completados com água destilada até o volume de 1L (GORNAL, 1949). As amostras

foram diluídas e homogeneizadas em água destilada na concentração de 1%. Foram

retiradas alíquotas de 1 ml de cada amostra e transferidas com pipetador automático

para tubos de ensaio contendo 3,0 ml do reagente. Os frascos foram agitados e a leitura

realizada em espectrofotômetro a 540 nm. A partir dos valores de absorbâncias de cada

análise foi calculado o teor total de proteína, baseado na equação de reta obtida com

Soro de Albumina Bovina (BSA), uma proteína padrão utilizada na construção de

curvas de calibração da metodologia proposta. Todas as amostras foram analisadas em

triplicata.

Análise Elementar - Cromatografia Gasosa

A análise elementar foi obtida através da quantificação percentual dos elementos

Carbono, Hidrogênio, Nitrogênio e Oxigênio presente nas amostras. Foram utilizadas 2

a 3 mg da amostra, sendo submetidas à combustão completa. Após a combustão, os

gases produzidos são arrastados e separados em coluna de cromatografia gasosa. Para

conversão do percentual de Nitrogênio em proteína, são utilizadas equações preditivas

segundo Kumae (2000). As análises foram realizadas na Central Analítica do

Departamento de Química Fundamental, Centro de Ciências Exatas e da Natureza,

UFPE.

Espectrometria de Massa – MALDI-TOF

Para a estimativa de peso molecular dos peptídeos retirados dos precipitados

proteicos, foi utilizado um Espectrômetro de Massa MALDI-TOF Autoflex III (Bruker

Daltonics, Billerica, MA, USA) Laser Nd:YAG, 355 nm. Freq. laser: 100 Hz Programa:

FlexControl. Versão 3.0 (Bruker Daltonics).

As amostras foram diluídas em ácido trifluoroacético (TFA) 0,1%. Matriz: ácido alfa-

ciano-4-hidroxicinâmico - HCCA (10 mg/mL) em acetonitrila P.A. 50% e ácido

trifluoracético (TFA) 0,3%.

Aplicação na placa de MALDI: Método da gota seca - a amostra foi misturada à

matriz e a mistura foi aplicada na placa e deixada em temperatura ambiente até secar

para ser cristalizada com a matriz. Em seguida, a amostra foi bombardeada com um

33

laser para evaporação; o tempo e a quantidade do material ionizado e volatilizado foi

então detectado (ALBRETHSEN, 2007).

Precipitação com Ácido tricloroacético (TCA)

O ácido tricloroacético foi utilizado para precipitação de pepitídeos com mais de

10 resíduos de aminoácidos. Foi pesado 0,5 g da amostra em um béquer, ao qual se

adicionou 50 ml de água destilada e 10 ml de TCA a 10%. Após 30 minutos o

precipitado foi filtrado com papel filtro Whatman # 54 ou 541 por gravidade (LICITRA

et al, 1996). A proteína retida no papel filtro foi quantificada pelo método Kjeldahl.

Precipitação com Tungstato de sódio

O tungstato de sódio foi utilizado objetivando a precipitação de pepitídeos com

mais de 3 resíduos de aminoácidos. Foi pesado 0,5 g da amostra em um béquer, ao qual

se adicionou 50 ml de água destilada e 8 ml de tungstato de sódio a 10%. Em seguida

foi acrescido 8 a 10 ml de ácido sulfúrico a 10% até alcançar pH 2,0. O precipitado

obtido foi filtrado com papel filtro Whatman # 54 ou 541 por gravidade (LICITRA et

al, 1996). A proteína retida no papel filtro foi quantificada pelo método Kjeldahl.

Análise Estatística

Os dados foram avaliados pela análise de variância (ANOVA) utilizando o teste de

Duncan para comparação entre as medias (α=5%), realizado através do programa

“Statistic for Windows 8.0”.


34

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Avaliação dos suplementos de acordo com a origem e forma de comercialização

Quanto à origem da matéria prima e controle sanitário, 33,3% dos produtos

analisados eram de marcas importadas ou de empresas nacionais que utilizam matéria

prima importada. Destas, 28,5% não apresentavam registro no ministério da saúde.

Entre os produtos de fabricação nacional, 50% deles não apresentavam este registro. A

Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) 18/2010, reforça a obrigatoriedade de registro

destes produtos na Agência Nacional de Vigilância Sanitátia (ANVISA)/Ministério da

Saúde, uma vez que passaram a ser classificados como “alimento para atletas”, fixando

padrões de identidade e qualidade para maior proteção à saúde do consumidor.

Os resultados obtidos em análise química e elementar demonstraram que 20%

dos produtos tinham concentração proteica que diferiam significativamente das

informações nutricionais expressas em rótulo, conforme expresso nas Tabelas 1, 2, 3 e

4. Para essa comparação, foram adotados como referência apenas os métodos de

dosagem de N total (Kjeldahl e N Elementar). O método biureto não foi considerado

adequado para quantificação de proteínas totais nestes produtos. O limite aceitável de

variação quantitativa de proteína foi de até 20% para mais ou para menos, conforme

RDC 360/03, para produtos industrializados.

A classe de produtos que apresentou maior percentual de inadequação

quantitativa foi a de BCAA (66,6%). De acordo com a RDC 18/2010, esta é a única

classe de produtos destinados a atletas que está temporariamente dispensada de registro

e pode ser comercializada livremente, pois não possui regulamentação específica. A

dispensa da obrigatoriedade pode refletir em menor controle sanitário, favorecendo

irregularidades de comercialização.

O preço final para cada 100g dos produtos variou em até 1000% entre as marcas

analisadas. Essa variação não foi justificada pela origem do produto ou classificação da

proteína ou aminoácido (Figura 1).

35

Figura 4. Variação de custo dos produtos de acordo com origem da matéria prima e a rotulagem

do produto

Tabela 1. Comparação entre métodos de quantificação de proteínas totais em matriz do tipo

Whey Protein (Grupo 1).

Amostras Bureto(%) Kjeldahl(%) N Elem. (%) Rotulo (%)

A 211,65±,52a

(-154,55)*

54,00±1,00b

(+3,1)*

54,33±0,58b

(+2,77)*

57,1

B 80,62±0,37a

(-3,72)*

79,57±0,30b

(-2,67)*

79,27±0,25b

(-2,37)

76,9

C 79,81±0,56b

(+3,49)*

82,61±1,04a

(+0,69)*

82,33±0,35a

(+0,97)*

83,3

D 75,85±0,76b

(+10,75)*

77,73±0,40a

(+8,87)*

74,20±0,53

(+12,40)*

86,6

E 58,42±0,24c

(+31,58)*

107,83±0,45a

(-17,83)*

95,63±0,40b

(-5,63)*

90

F 56,22±0,15c

(+27,08)*

80,70±0,10a

(+2,6)*

77,47±0,35b

(+5,83)*

83,3

G 62,63±0,43c

(+12,37)*

84,82±0,09a

(-9,82)*

78,37±0,40b

(-3,37)*

75

H 54,83±0,42c

(+15,27)*

81,06±0,24a

(-10,96)*

63,50±0,36b

(+6,6)*

70,1

I 148,41±0,92a

(-48,41)*

38,97±0,76b

(+61,03)*

25,60±0,53c

(+74,40)*

100

Medias seguida de letras iguais na horizontal não diferem significativamente ao nível de 5% de

significância pelo teste de Duncan. * sinal (+) ou (-) refere-se à porcentagem em que o teor

declarado no rótulo do produto é maior ou menor que o detectado pelas analises

R$ -

R$ 20,00

R$ 40,00

R$ 60,00

R$ 80,00

R$ 100,00

R$ 120,00

R$ 140,00

Hidro I BCAA I Glut I Creat I

Nacional

Importado

36


BCAA (Grupo 2)


A 51,38±0,23c

(-3,38)*

67,90±0,60b

(-19,9)*

72,30±0,30a

(-24,30)*

48

B 0,44±0,03c

(+99,56)*

5,33±0,04b

(+94,67)*

6,23±0,21a

(+93,77)

100

C 1,49±0,18c

(+38,51)*

35,70±0,62a

(+4,3)*

34,63±0,47b

(+5,37)*

40

D 0,31±0,09c

(+99,69)*

39,07±0,72a

(+60,93)*

27,93±0,85b

(+72,07)*

100

E 0,26±0,02c

(+88,54)*

73,22±0,44a

(+15,58)*

67,17±0,30b

(+21,63)*

88,8

F 5,29±0,08c

(+85,31)*

84,25±0,55a

(+6,35)*

78,30±0,48b

(+12,3)*

90,6

G 2,56±0,13c

(+83,64)*

77,56±0,13a

(+8,64)*

67,67±0,32b

(+18,53)*

86,2

H 0,16±0,04c

(+77,54)*

69,57±0,25b

(+8,13)*

71,53±0,30a

(+6,17)*

77,7

I 8,73±0,60c

(+91,27)*

68,89±0,90a

(+31,11)*

62,83±0,30b

(+37,17)*

100





Glutamina (Grupo 3).


A 0,26±0,07c

(+99,74)*

102,07±0,71a

(-2,07)*

101,07±0,21b

(-1,07)*

100

B 1,60±0,06b

(+98,40)*

101,83±0,57a

(-1,83)*

102,07±0,21a

(-2,07)

100

C 1,89±0,04c

(+98,11)*

99,38±0,07b

(+0,62)*

101,07±0,21a

(-1,07)*

100

D 0,44±0,04c

(+99,56)*

94,40±0,34b

(+5,6)*

101,97±0,15a

(-1,97)*

100

E 0,79±0,07c

(+99,21)*

88,15±0,93a

(+11,85)*

84,33±0,35b

(+15,67)*

100

F 0,67±0,13b

(+99,33)*

100,08±0,20a

(-0,08)*

99,90±0,10a

(+0,1)*

100




37


Creatina (Grupo 4).


A 0,89±0,09c

(+99,11)*

65,23±0,33a

(+34,77)*

59,30±0,61b

(+40,70)*

100

B 0,76±0,09c

(+99,24)*

99,01±0,28a

(+0,99)*

89,97±0,06b

(+10,03)

100

C 0,41±0,06b

(+99,59)*

88,20±2,34a

(+11,8)*

88,97±0,06a

(+11,03)*

100

D 0,59±0,09b

(+99,41)*

88,07±1,46a

(+11,93)*

89,10±0,85a

(+10,90)*

100

E 1,04±0,01c

(+98,96)*

84,04±2,03b

(+15,96)*

88,36±0,57a

(+11,64)*

100

F 0,79±0,10b

(+99,21)*

87,02±2,15a

(+12,98)*

87,43±0,66a

(+12,57)*

100




Fator de Conversão

Foi observado que, nos métodos baseados na dosagem de nitrogênio total, à

medida que se aumenta a especificidade da fonte nitrogenada, há necessidade de utilizar

um fator de conversão apropriado. Os resultados iniciais, utilizando o fator de conversão

padrão (6,25), superestimaram as dosagens, provocando um desvio de até 193,5% de

concentração nas amostras de glutamina e creatina (Tabela 5). Portanto, neste estudo foi

considerada a massa molecular do aminoácido para estimativa do percentual de

nitrogênio da amostra. Os fatores de conversão obtidos para fins de cálculo de

nitrogênio total foi equivalente a 5,22 para glutamina e 3,12 para a creatina, visto que

estes aminoácidos possuem, respectivamente, 19,13 e 32,02 % de nitrogênio em sua

massa molecular.

A utilização de um fator de conversão inadequado pode gerar resultados

incoerentes, influenciados pela concentração e perfil de aminoácidos. Nesta pesquisa,

após correção dos valores com fator específico, os resultados foram ajustados, passando

a apresentar coerência com o limite de concentração do nutriente na amostra (Tabela 6).

Outros trabalhos realizados com base na quantificação do nitrogênio total,

utilizando o método oficial de Kjeldahl e fator de conversão padrão (6,25) encontraram

38

resultados incompatíveis com as características da amostra, tanto em alimentos

industrializados quanto em proteína de origem microbiana, indicando a necessidade de

ajuste conforme a especificidade da amostra (GUIMARÃES & LANFER-MARQUEZ,

2005; HORNES, M. et al 2010)

Tabela 5. Comparação da informação nutricional declarada em rotulagem e quantificação

proteica pelos métodos distintos nos grupos avaliados.

CLASSE COD *Rótulo % **Kjeldahl % **N Elementar % **Biureto %

Whey

Hidro

1 57,1 55,5 54 211

2 76,9 79,6 79 78

3 83,3 82,56 82 79,8

4 86,6 77,7 74 75,1

5 90 107,85 95,2 57,7

6 83,3 80,64 77,1 55,6

7 75 84,83 78 61,6

8 70,1 77,8 63,6 55,5

9 100 37,55 25 151

BCAA

10 48 67,3 72,6 51

11 100 5,34 6 0,51

12 40 35,67 34,1 1,4

13 100 38,26 27,1 0,37

14 88,8 73,27 67,5 0

15 90,6 84,27 78,2 5,5

16 86,2 77,59 67,8 2,5

17 77,7 69,71 71,6 25,4

18 100 68,99 62,5 8,7

Glutamina

19 100 120,51 121 0

20 100 120,44 122 0

21 100 118,96 121 0

22 100 115,38 122 0

23 100 104,1 101 0,5

24 100 120,38 120 0

Creatina

25 100 130,69 120 0

26 100 193,5 180 0

27 100 176,49 178 0,1

28 100 172,7 178 0

29 100 168,5 177 0,78

30 100 173,26 177 0,15

*Informação nutricional do rótulo do produto

** Estimativa de proteínas totais (%) por diferentes métodos; Ntotal Kjeldahl e N elementar

(Fator=6,25)

39

Tabela 6. Correção da quantificação dos grupos glutamina e creatina pelo método Kjeldahl,

utilizando fator de conversão adaptado segundo proporção de nitrogênio da massa molecular da

matriz analisada.

Amostra Proteína Total (%)

(Fator:6,25)

Proteína Total (%)

(Fator corrigido pela

massa molecular)

19 120,51 100,66

20 120,44 100,59

21 118,96 99,35

22 115,38 96,45

23 104,1 87,07

24 120,38 100,62

25 130,69 65,24

26 193,5 96,61

27 176,49 88,1

28 172,7 86,26

29 168,5 84,16

30 173,26 86,49

Correlação de Pearson entre os métodos Kjeldahl e Análise Elementar

Na análise de alimentos, duas categorias básicas de métodos podem ser

utilizadas: os métodos convencionais e os métodos instrumentais. Os métodos

convencionais empregam instrumentação pouco sofisticada, reagentes e outros materiais

comuns e se baseiam em procedimentos por princípios de gravimetria e volumetria e

consequentemente com menor grau de exatidão. Entretanto, apresentam menor custo

por não necessitar de equipamento sofisticado (CECHI, 2003).

Os métodos instrumentais, em contraste aos métodos convencionais, utilizam

equipamentos de alta precisão, associados a propriedades físicas da matéria, através de

interações existentes entre a matéria e a energia (absorção, emissão e fluorescência) e

permitem a obtenção de resultados com maior especificidade, sensibilidade e precisão

(SOARES, 2006; IAL, 2008).

Nesta pesquisa, a quantificação proteica baseada na dosagem de nitrogênio total,

pelo método convencional de Kjeldahl, comparado com o método instrumental na

Análise Elementar por cromatografia gasosa, apresentou forte correlação em todos os

grupos analisados (R2>0,69), demonstrando que a metodologia tradicional produz

40

resultados satisfatórios quando comparados à análise de maior refinamento

metodológico (Figuras 2, 3, 4 e 5).


elementar, em suplementos a base de hidrolisado do soro do leite.


elementar, em suplementos a base de aminoácido de cadeia ramificada (BCAA).

41


elementar, em suplementos a base de glutamina.


elementar, em suplementos a base de creatina.

42

Estimativa das frações proteicas e peptídicas em hidrolisados do soro de leite

Segundo Gonzáles-Tello (1994), a avaliação dos hidrolisados proteicos deve

considerar a análise dos seus perfis peptídicos. Neste trabalho, os hidrolisados proteicos

foram avaliados quanto ao nível de hidrólise proteica a partir da precipitação diferencial

com ácido tricloroacético e Tungstato de Sódio. Estes agentes precipitantes são

utilizados na precipitação de proteínas, porém possuem níveis de sensibilidade

diferentes.

De acordo com LICITRA et al. (1996), o ácido tricloroacético (TCA), é menos

sensível que o tungstato de sódio e precipita frações peptídicas com número de

aminoácidos superior a dez, em relação ao segundo, no qual ocorre precipitação proteica

em frações a partir de três ligações peptídicas. Os resultados obtidos após a precipitação

de cada amostra com tais reagentes seguido da quantificação proteica conforme

metodologia oficial (Kjeldahl) confirmaram a diferença de sensibilidade entre ambos. O

conteúdo proteico retido pela precipitação com Tungstato foi proporcionalmente maior

que a quantidade retida pelo TCA em todas as amostras (Tabela 7).

A quantidade que não foi retida pelo reagente de maior sensibilidade foi

considerada como a fração de baixo peso molecular (F1), com resíduos de aminoácidos

com ligações peptídicas inferiores a três ou aminoácidos livres. A fração intermediária

(F2), com oligopeptídeos compostos por três a dez aminoácidos foi dada pela diferença

entre os valores de quantificação total de cada reagente numa mesma amostra,

representando dessa forma, o intervalo de sensibilidade entre eles. A última fração (F3),

obtida pelo precipitado com TCA, devido a sua menor sensibilidade, com ligações

peptídicas superiores a dez.

Estudo realizado com leite humano por CARRATÚ et al. (2003) também

utilizou um agente precipitante para separação e quantificação de nitrogênio não

protéico, proteína verdadeira e aminoácidos livres das amostras. O nitrogênio protéico

foi estimado pelo uso do TCA, e o não-proteico calculado pela diferença entre o

precipitado e o nitrogênio total pelo método de Kjeldahl. No entanto, de acordo com os

resultados obtidos na presente pesquisa, essa estimativa de nitrogênio protéico pode ter

sido subestimada pela menor sensibilidade do agente precipitante utilizado.

Para fins de fracionamento, Carreira (2002) utilizou a cromatografia líquida de

alta eficiência (exclusão molecular) na caracterização de peptídeos, de acordo com o

tamanho da cadeia, que possibilitou a divisão em quatro frações, de acordo como tempo

43

e retenção, em: Grandes peptídeos (> 7 resíduos de aminoácidos); médios peptídeos (4 a

7 resíduos de aminoácidos); di- e tripeptídeos: 2 a 3 resíduos; aminoácidos livres. No

entanto, e em geral, os métodos cromatográficos podem apresentar interações

secundárias indesejáveis com a fase estacionária, dificuldades de identificação e

diferenciação do tamanho de cadeias peptídicas maiores, além de danos permanentes à

coluna cromatográfica, caso a amostra não esteja hidrolisada adequadamente (ADACHI

et al, 1991; ARMSTEAD, LING 1991; DAVIS, LEE 1992; VISSER 1992;

GALLAGHER, 1994; PEREA, 1993; SILVESTRE, 1994; CARREIRA 2002). Na

precipitação diferencial com os reagentes propostos, a amostra pode ser analisada sem

que o seu grau de hidrólise seja alterado previamente como parte do preparo

metodológico, e a presença de frações proteicas não hidrolisadas (de alto peso

molecular) possa ser estimada.

Os resultados confirmaram através da não precipitação e também pela não

detecção pelo método biureto, a ausência de ligações peptídicas nas fórmulas de BCAA

e de aminoácidos isolados, indicando que não havia contaminação ou mistura com

outras fontes de proteína não declaradas no rótulo, nas amostras de 10-30 (Tabela 1).

Tabela 7. Frações peptídicas de hidrolisados do soro do leite (Whey Protein) precipitados com

ácido tricloroacético (TCA) e tungstato de sódio (TGA).

*F1: grandes peptídeos (> 10 resíduos de aminoácidos); F2: peptídeos intermediários (3 a 10 resíduos de

aminoácidos); F3: aminoácidos livres

Amostra

(Whey

Protein)

Proteína

Total (%)

(Kjeldahl)

Frações Peptídicas*

%Retido

(TGA)

%Retido

F1

(TCA)

F2

(Tung – TCA)

F3

(PTN total –

Tung)

1 55,5 ±3,6 31,98 20,88 11,1 23,52

2 79,6 ±0,4 70,91 31,1 39,81 8,69

3 82,56 ±1,4 56,4 24,9 31,5 26,16

4 77,7 ±0,5 67 30,1 36,9 10,7

5 107,85 ±0,6 41,6 6,6 35 66,25

6 80,64 ±0,07 57,4 19,9 37,5 23,24

7 84,83 ±0,12 60,1 5,73 54,3 24,73

8 77,8 ±4,8 60,3 54,6 5,7 17,5

9 37,55 ±3,1 14,4 12,9 1,5 23,15

44

Na análise colorimétrica, o grupo de amostras de proteínas do soro do leite

100% hidrolisadas apresentou quantificação significativa de proteínas, porém os valores

obtidos por este método apresentaram fraca correlação (r<0,33) quando comparados aos

métodos de quantificação por Nitrogênio total, resultado que era esperado uma vez que

o princípio de quantificação do método está na reação com as ligações peptídicas

(Tabela 8).

Tendo em vista que o produto é considerado parcial ou totalmente hidrolisado, a

quantificação seria inversamente proporcional ao seu grau de hidrólise, favorecendo a

caracterização das frações peptídicas e aminoácidos livres. No entanto, em 22,2% dos

produtos foram obtidas concentrações acima de 150%, sugestivo de presença de fatores

interferentes nas amostras, causando turbidez e desvios nas leituras das absorbâncias.

Estudos demonstram a necessidade, em alguns casos, de purificação e/ou extração

proteica para quantificação posterior, porém em geral, os métodos para obtenção destas

frações modificariam a estrutura peptídica tornando-o incompatível ao objetivo da

caracterização do grau de hidrólise e frações proteicas na amostra (Tabela 5).

Tabela 8 Coeficiente de correlação de Pearson entre os métodos de avaliação de proteínas

totais.

MÉTODOS r (coeficiente de correlação de Pearson)

Whey Hidro BCAA Glutamina Creatina

Biureto x Kjeldahl -0,79 0,22 0,21 -0,35

Biureto x N Elem -0,67 0,33 0,13 -0,31

Kjeldahl x N Elem 0,95 0,98 0,83 0,90

Caracterização de aminoácidos e precipitados proteicos (TCA e TGA) por

espectrometria de massas

A análise qualitativa dos precipitados proteicos do soro do leite através da

espectrometria de massas corroborou com os resultados anteriores quanto à diferença na

sensibilidade dos agentes precipitantes TCA e TGA. Os resultados mostram que houve

45

uma maior retenção de peptídeos de baixo peso molecular no precipitado proteico com

Tungstato, sendo possível a observação dos picos na região de peso molecular 1000 a

1900 Da, representando a proteína retida pelo agente precipitante (Figura 6). Já no

precipitado com TCA, a visualização nessa região foi consideravelmente inferior,

indicando a perda desta fração peptídica não quantificada (Figura 7). A identificação

dos picos no precipitado com TCA foi possível na região de peso molecular acima de

6000 Da (Figura 8).

Vale ressaltar que o perfil peptídico de hidrolisados com melhor qualidade, são

aqueles com maior percentual de di, tripeptídeos ou de massa molecular inferior a 500

Da, além de baixos teores de aminoácidos livres. Esse perfil peptídico é o que apresenta

maior velocidade de absorção, do que as soluções que contem aminoácidos livres

isoladamente (HARA, et al, 1984; KEOHANE, et al, 1985). Portanto, a qualidade

nutricional dos hidrolisados proteicos dependerá tanto da fonte, que deverá ser de alto

valor biológico, quanto da proporção e tamanho das cadeias peptídicas (GRIMBLE,

1989).

Embora seja possível a análise de proteínas intactas com espectrômetros de

massa de última geração, a sensibilidade desse método é consideravelmente melhor para

peptídeos, principalmente nas estruturas peptídicas compostas por até 20 aminoácidos.

Porém a identificação de picos de peptídeos nas regiões abaixo de 1000 Da foi

prejudicada devido à presença de fatores interferentes que podem ser ionizados, como

no caso de tensoativos necessários para solubilização da amostra (CANTÚ, et al, 2008).

Quanto aos aminoácidos que se encontram de forma isolada (BCAA, Glutamina

e Creatina), os resultados foram compatíveis com a não precipitação das amostras, já

que não foram identificados picos referentes a peptídeos nas amostras sem qualquer

tratamento. Foi identificada apenas a presença de estruturas com características de

polímeros de hexoses nas amostras de BCAA e glutamina, conforme figuras 9 e 10. Na

amostra de Creatina (figura 11) não foi observado expressão significativa de massas.

46

Figura 6. Espectro de massa pelo MALDI-TOF-MS em precipitado proteico de hidrolisado do

soro do leite com Tungstato de sódio. Peso molecular 900 – 1.900 Da.


soro do leite com ácido tricloroacético (TCA). Peso molecular: 1.000 – 3.500 Da.

1060.237

1761.149

1648.055

1022.279

932.568

1548.977

1144.7731271.270

1682.095

3.2 d2 0:H20 MS Raw

0

500

1000

1500

2000

2500

Inte

ns. [a

.u.]

900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900m/z

1641.070

2067.306

3 0:E13 MS Raw

0

100

200

300

400

500

Inte

ns. [a

.u.]

1000 1500 2000 2500 3000 3500m/z

47


soro do leite com ácido tricloroacético (TCA). Peso molecular: 6.000 – 20.000 Da.

Figura 5. Espectro de massa pelo MALDI-TOF-MS em Aminoácidos de cadeia ramificada

(BCAA). Peso molecular: 800 – 2.200 Da.

6786.036

14176.636

7249.292

6373.915

6301.699

6329.956

6206.887

6283.461

9344.449

14646.788

18692.208

14663.287

14992.305

03.1 LP_ProtMix 0:E10 MS Raw

0

2000

4000

6000

Inte

ns. [a

.u.]

6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000m/z

689.245

1013.429

851.346 1175.495

666.040

1337.549

1499.607

1661.670 1823.7311985.500

Hexose HexoseHexose Hexose Hexose Hexose Hexose

09.1 RP_Prot 0:F14 MS Raw

0

1000

2000

3000

Inte

ns. [a

.u.]

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200m/z

48

797.177

1002.212

1213.269

1360.333

11.1 RP_Prot 0:J15 MS Raw

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Inte

ns. [a

.u.]

1000 1500 2000 2500 3000m/z

Figura 60. Espectro de massa pelo MALDI-TOF-MS em glutamina. Peso molecular: 800 –

2.200 Da.

Figura 11. Espectro de massa, pelo MALDI-TOF-MS, em Creatina. Peso molecular: 800 –

2.200 Da.

713.266

757.277

669.258

855.140

1013.457

1175.532

1337.586

1499.649

1661.6971985.9431823.872

Hexose Hexose Hexose Hexose HexoseHexose Hexose

10.1 RP_Prot 0:I14 MS Raw

0

1000

2000

3000

4000

Inte

ns. [a

.u.]

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200m/z

49

CONCLUSÕES

A partir dos resultados apresentados, constata-se que apesar das especificações

técnicas para regulamentação e monitoramento de produtos industrializados, existe uma

grande probabilidade no consumo de gêneros que apresentam alguma não conformidade

com as informações declaradas na rotulagem. Observa-se desta forma que a qualidade

nutricional de proteínas nos suplementos destinados a atletas, de parte dos fabricantes,

não corresponde às expectativas do consumidor ao qual o produto está destinado.

Os métodos utilizados para análise do nitrogênio total por meio da análise

elementar e o método oficial Kjeldahl mostraram-se eficientes (correlação forte). O

mesmo não ocorreu com a análise colorimétrica pelo reativo de biureto para este tipo de

alimento, devido a características intrínsecas às matrizes avaliadas (Grupos 3 e 4), sem

expressiva ligações peptídicas.

A utilização de agentes precipitantes mostra-se uma boa alternativa na

caracterização de frações peptídicas de hidrolisados protéicos, considerando que o

agente precipitante tungstato de sódio possui maior sensibilidade para precipitação de

peptídeos de menor peso molecular, quando comparado ao ácido tricloroacético. Essa

diferença de sensibilidade foi confirmada pelas análises de espectrometria de massas

dos precipitados, com a menor incidência de bandas na região de baixo peso molecular,

nos precipitados com TCA. Enquanto nos precipitados com TGA houve maior

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6. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS

O presente estudo demonstrou que os métodos utilizados para análise do

nitrogênio total por meio da análise elementar e o método oficial Kjeldahl, apresentaram

forte correlação, e podem ser considerados como boas alternativas para essa

quantificação. A utilização de agentes precipitantes na caracterização de frações

peptídicas de hidrolisados protéicos revelou que o Tungstato de sódio possui maior

sensibilidade para precipitação de peptídeos de menor peso molecular, quando

comparado ao Ácido tricloroacético permitindo a caracterização de diferentes frações

protéicas. Esses achados foram confirmados tanto pela quantificação dos precipitados

protéicos pelo método de Kjeldhal, quanto pelas análises qualitativas de espectrometria

de massas. A identificação de 20% dos produtos que apresentaram alterações

significativas de nutriente em relação às informações declaradas ao consumidor, reforça

a necessidade da busca por métodos de análise que sejam adaptados e estudos mais

aprofundados para fins de monitoramento e controle de qualidade em alimentos.

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