avaliaÇÃo de mÉtodos diagnÓstico em bovinos...
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SANTA CASA DE BELO HORIZONTE
Programa de Pós-Graduação e Pesquisa Clínica Médica/Biomedicina
AVALIAÇÃO DE MÉTODOS DIAGNÓSTICO EM BOVINOS INFECTADOS
EXPERIMENTALMENTE COM SCHISTOSOMA MANSONI
JAILSON PEDREIRA LOPES
Belo Horizonte 05/2009
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AVALIAÇÃO DE MÉTODOS DIAGNÓSTICO EM BOVINOS INFECTADOS
EXPERIMENTALMENTE COM SCHISTOSOMA MANSONI
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação e Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte, como requisito para obtenção do título de Mestre em Clínica Médica/Biomedicina.
JAILSON PEDREIRA LOPES
Área de Concentração: Biomedicina/Parasitologia Orientadores: Prof°. Dr Paulo Marcos Zech Coelho
Prof°. Dr Walter dos Santos Lima
Belo Horizonte 05/2009
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Núcleo de Pós-Graduação e Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte.
Lopes, Jailson Pedreira Avaliação de métodos diagnóstico em bovinos infectados
experimentalmente por Schistosoma mansoni, Belo Horizonte – 2009. 48p. Área de concentração: Biomedicina/Parasitologia Orientador: Prof°. Dr Paulo Marcos Zech Coelho Orientador: Prof° Dr Walter dos Santos Lima Dissertação (mestrado) – Núcleo de Pós-Graduação e Pesquisa da Santa
Casa de Belo Horizonte.
Descritores: 1. SCHISTOSOMA MANSONI 2. MÉTODO DIAGNÓSTICO 3. ESQUISTOSSOMOSE BOVINA 4. INFECÇÃO
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AGRADECIMENTOS
A Deus, por se evidenciar no cuidado, no amor e na segurança sentida em cada
momento difícil.
Ao Dr. Paulo Marcos, pela oportunidade ímpar de aprendizado e pela brilhante
orientação.
Agradeço aos meus pais e irmãs, pelo suporte emocional, por sempre confiar em mim
e compartilhar comigo os meus sonhos.
À minha amada Jucielle pela paciência, amor e por me dar todo apoio necessário para
que eu chegasse até aqui.
À Dra Andréa Gazzineli pela oportunidade e confiança
Ao Dr. Walter Santos Lima pelas orientações e por ter me ensinado a “pegar boi à
unha!”
Ás secretárias da pós-graduação Shirley e Zélia, pela boa vontade e disposição em me
ajudar.
Aos professores da pós-graduação da Santa Casa, pelos ensinamentos.
Á Ana Karine e Áureo pelo valioso auxílio.
Ao Dr Nilton, do René Rachou, pela contribuição com o método PCR
A todos que diretamente ou indiretamente me motivaram para a execução deste
trabalho.
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RESUMO
LOPES, Jailson Pedreira. Avaliação de métodos diagnóstico em bovinos infectados
experimentalmente com Schistosoma mansoni. Dissertação (mestrado) Núcleo de Pós-Graduação
e Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte, 2009.
A espécie bovina, Bostaurus, tem-se demonstrado susceptível à infecção por Schistosoma mansoni,
tornando assim necessário um estudo objetivando avaliar métodos diagnóstico que permitam traçar
melhor o papel epidemiológico dos bovinos na esquistossomose. Neste trabalho buscamos avaliar
métodos diagnóstico em seis bezerros mestiços do cruzamento da raça holandesa e gir com
aproximadamente dez meses de idade, infectados experimentalmente com aproximadamente dez mil
cercárias (cepa LE, BH).
Os animais não mostraram variação estatisticamente significativa de peso durante o período
observado (46 e 126 dias pós-infecção). Dois animais morreram durante o experimento. Os métodos
de eclosão de miracídio e exame de fezes pelo gradiente salínico não evidenciaram a presença do
parasito, bem como o Ensaio de Imunoadsorção Associada à Enzimas, (ELISA), que não mostrou
diferenças significativas nos títulos de anticorpos dos animais avaliados. O método de (PCR), reação
de cadeira da polimerase, não foi efetivo ao diagnóstico no experimento. Todos os animais
apresentaram ovos de Schistosoma mansoni à raspagem retal, com exceção dos dois animais que
morreram durante o experimento. Os animais positivos, à raspagem retal, mostraram grande variação
quanto a quantidade e estadiamento dos ovos encontrados, todavia, a maioria dos ovos, 85%,
apresentaram-se inviáveis. Os resultados apresentados permitem a inferência que uma baixa taxa de
infecção certamente influencia na sensibilidade dos métodos avaliados, o que nos leva a pensar que
novos métodos ou variações nos métodos estudados podem resultar em maior sensibilidade para o
diagnóstico da doença, instrumentando melhor o estudo do papel epidemiológico da espécie bovina na
esquistossomose.
Palavras-chave: Métodos diagnóstico, Esquistossomose, Bovinos
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ABSTRACT
LOPES, Jailson Pedreira. Assesment of diagnostic methods in infected bovines with
Schistosoma mansoni. Dissertação (mestrado) Núcleo de Pós-Graduação e Pesquisa da Santa Casa
de Belo Horizonte, 2009.
The bovine’s species have demonstrated being susceptible to Schistosoma mansoni infection, become
necessary a study to evaluate diagnostic methods to allow plot better a epidemiologic role of bovines in
squistosomiasis. In current study aimed to evaluate diagnostic methods in 6 crossbred calves (Hostein
x Gir), age 10 months, infected, experimentally, about 10,000 cercariae of S. mansoni (LE-BH
strain).There was no statistically significant difference in weight in observed period (46 and 126 days
pós-infection). Two animals died during the experiment. The miracidia hatching device and fecal exams
by saline gradient method has not shown the presence of parasite, likewise enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA), did not show significant difference in the levels of antibodies from
infected animals. PCR (Polymerase Chain Reaction) methods had not diagnostic efective in
experiment. All calves showed Schistosoma mansoni eggs to rectal scrape, except two animals that
died during experiment. The presence of eggs to rectal scrape showed large range as quantity and
stage of studied eggs, although, 85% eggs were unfeasible. The results suggest that a low infection tax
can influence in sensibility of evalueted methods , that permits think that new methods or range in
studied methods can possibility major sensibility to ilness diagnostic, instrumenting bether a study to
the role epidemiologic study in bovine quistosomiasis.
Key words: Diagnostic methods, squistosomiais, bovine
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DNA- Ácido desoxirribonucléico
ELISA- Ensaio de Imunoadsorção Associada à Enzimas
FUNASA- Fundação Nacional de Saúde
HP- Hipertensão porta
Ig- Imunoglobulina
IH- Insuficiência hepática
mm- Milímetros
PBS- Tampão Fosfato Salínico
PBS-W- Tampão Fosfato Salínico de Lavagem
PCR- Reação de cadeira da polimerase
SEA- Antígenos solúveis de ovo de S. mansoni
SWAP- Antígenos de verme adulto de S. mansoni
WHO- Organização Mundial de Saúde
µm- Micrômetro
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SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO ................................................................................................................................................09 1.1-Ciclo biológico.................................... .................................................................................................14 1.2-Patogênia.............................................................................................................................................15 1.3 -Apresentação clínica...........................................................................................................................16 1.3.1- Esquistossomose aguda................................................................... ..............................................17 1.3.1- Esquistossomose crônica .................... ...........................................................................................18 1.4- Diagnóstico..........................................................................................................................................18 1.5- tratamento ..........................................................................................................................................19 1.5- Esquistossomose em bovinos.............................................................................................................20
__________________________________________________________________________________ 2- OBJETIVO..................................... ..............................................................................................................22 __________________________________________________________________________________ 3- MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................................................22
3.1- Infecção dos bovinos...........................................................................................................................22 3.2- Coletas de sangue...............................................................................................................................26 3.3- Coleta de fezes ...................................................................................................................................27 3.4- Raspagem retal...................................................................................................................................27 3.5- Método de eclosão do miracídio..........................................................................................................29 3.6- Método de exame de fezes pelo gradiente salínico.............................................................................29 3.7-Método ELISA (Ensaio de Imunoadsorção Associada à Enzimas)......................................................30 3.7.1- Obtenção de antígeno SWAP..........................................................................................................30 3.7.2- Obtenção de antígeno SEA..............................................................................................................30 3.7.3- ELISA...............................................................................................................................................31 3.8- Método PCR........................................................................................................................................31
3.8.1- Extração de DNA de soro de bovinos infectados por S. mansoni....................................................31 3.8.1.1- Fenol/clorofórmio...........................................................................................................................31 3.8.1.2- Resina...........................................................................................................................................32 3.8.2- PCR..................................................................................................................................................33 _________________________________________________________________________________ 4- RESULTADOS ...............................................................................................................................................34
4.1-Raspagem retal....................................................................................................................................34 4.2- Método de exame de fezes pelo gradiente salínico............................................................................35 4.3- Método de eclosão do miracídio........................................................................................................ 36 4.4- Método ELISA (Ensaio de Imunoadsorção Associado a Enzimas).....................................................36 4.5- Método PCR........................................................................................................................................38
__________________________________________________________________________________ 5- DISCUSSÃO ...................................................................................................................................................39
5.1- Raspagem retal......................... .........................................................................................................39 5.2- Método de exame de fezes pelo gradiente salínico............................................................................40 5.3- Método de eclosão do Miracídio..........................................................................................................40 5.4- Método ELISA (Ensaio de Imunoadsorção Associado a Enzimas).....................................................41 5.5- Método PCR........................................................................................................................................42
__________________________________________________________________________________ 6- CONCLUSÃO .................................................................................................................................................42 __________________________________________________________________________________ 7- REFERÊNCIAS ...............................................................................................................................................43
__________________________________________________________________________________
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1- INTRODUÇÃO
No Brasil e em varias regiões do mundo, as infecções helmínticas são um dos maiores
problemas de saúde pública, fato este que vem se agravando significativamente, em decorrência
principalmente, das transformações ecológicas que ocorrem nos vários países e movimentos
migratórios das populações (Chitsulo et al., 2000).
A esquistossomose é um importante problema de saúde publica no Brasil, alcançando a marca
de aproximadamente 10 milhões de pessoas infectadas ou em risco de infecção (Katz & Peixoto,
2000), No estado de Minas Gerais a prevalência da doença varia em áreas endêmicas dependendo da
região, sendo os maiores índices encontrados nas regiões norte/nordeste do estado, onde foram
realizados a maioria dos estudos desta endemia. Globalmente cerca de 600 milhões de pessoas estão
expostas ao risco de contrair esta doença (Chitsulo et al. 2000) e foram registradas cerca de 280 mil
mortes por ano atribuídas às esquistossomoses (Van der Werf et al. 2003)
As esquistossomoses é uma doença conhecida desde a antiguidade e tem o homem como o
seu principal hospedeiro, originada nos rios Nilo, na África, e o Yangtze, na Ásia. Ovos de
Schistosomas foram encontrados em vísceras de múmias egípcias cuja origem remonta a 1.250 a.C.
Igualmente, existem relatos de que na cidade de Cehang-lha, na China, foram encontrados ovos de
Schistosoma japonicum em cadáver de cerca de 2.000 anos. Destes pontos de origem, as
esquistossomoses mansôni, hematóbica e japônica foram dispersadas para outros continentes, tendo
como via os meios de transporte que foram se desenvolvendo e permitindo grandes fluxos migratórios.
Hoje estas espécies apresentam larga distribuição geográfica.
Acredita-se que o inicio da doença no Brasil ocorreu com o trafico de escravos africanos
que entraram no país através dos portos de Recife (fig-1) e Salvador para trabalharem nas lavouras de
cana de açúcar (Almeida Machado, 1982). A descoberta dos primeiros casos foi feita por Pirajá da
Silva na Bahia.
O Schistosoma mansoni pertence ao filo dos Platelmintos, classe Trematoda, família
Schistomatidae e gênero Schistosoma. O verme apresenta dimorfismo sexual e é descrito como
parasita de vasos sanguíneos de mamíferos. O parasito tem o homem como o seu principal
hospedeiro, todavia outros animais tem sido descritos como potenciais hospedeiros na natureza.
Em 1952 Bilhartz descreveu um parasito intravascular ao qual deu o nome Distoma
haematobia, posteriormente Weinland denominou o gênero deste helminto de Shistosoma, devido ao
macho ter o corpo fendido (Schisto = fenda; soma=corpo) . A denominação de Schistosoma mansoni
foi dada por Sambon em 1907
.
As espécies do gênero Schistosoma com importância epidemiológica em humanos foram
descritas em tempos diferentes e por pesquisadores diferentes: Schistosoma haematobium (Bilhartz
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1852) responsável pela esquistossomose vesical, cujo hospedeiro intermediário é um molusco do
gênero Bulinus; Schistosoma japonicum descrito por Katsurada em 1904 causador da esquistosomose
japônica com distribuição geográfica abrangendo China, Japão, Ilhas Filipinas e sudeste asiático. Os
vermes adultos vivem no sistema porta hepático e os hospedeiros intermediário são moluscos do
gênero Oncomelania; Schistosoma mekongi (Voge et al 1978), esta espécie se assemelha muito ao S.
japonicum diferenciando basicamente por pequenas características morfológicas e pelo hospedeiro
intermediário, o molusco Neotricula aperta; Schistosoma intercalatum descrito por Fischer em 1934, os
vermes adultos parasitam o sistema porta hepático e os ovos são eliminados nas fezes, tem forte
ligação filogenética com o S.haematobium e tem como seu hospedeiro intermediário moluscos do
gênero Bulinus, Todas as esquistossomoses podem ser letais (Symmers 1904, Bogliolo 1954) .
De todas as espécies de Schistosoma que parasitam o homem, somente S. mansoni (Sambon,
1987) existe na América, isso, pode se atribuir ao fato da inexistência de hospedeiros intermediários
suscetíveis à infecção.
Sabe-se que várias questões estão envolvidas na progressão da doença para zonas
não endêmicas dentre estas podemos citar saneamento básico e nível sociocultural (Kloos et al. 1998;
Gazzinelli et al. 1998), podemos ressaltar ainda que cerca 50 % dos ovos, postos pela fêmea, são
eliminados com as fezes contribuindo para a manutenção do ciclo biológico do parasito e,
consequentemente, para prevalência da doença. O numero de cercárias penetrantes que sobrevivem,
o numero de ovos depositados no tecido, bem como a carga parasitária do indivíduo dependem da
genética, de alterações fisiológicas e da resposta imune do hospedeiro.
Contudo existem características do parasito que também colaboram com a propagação da
doença tais como:
1- Longevidade dos vermes adultos, que têm vida média de cinco anos, podendo chegar a
várias décadas, fato este que leva um mesmo parasito a varias posturas de ovos aumentando assim o
impacto epidemiológico
2- postura das fêmeas, com uma média de 300 a 400 ovos por dia
3- Existência de portadores, que mesmo quando afastados dos focos de transmissão, são
capazes de continuar excretando ovos por mais de 30 anos
4- Caráter crônico e insidioso da doença, que faz com que durante muito tempo os
pacientes não busquem tratamento, dificultando o controle da doença
5- Ampla distribuição geográfica dos hospedeiros intermediários.
Aliado a isto temos a exploração dos recursos hídricos, indispensáveis a progressão industrial
e agrícola, determinando fluxos migratórios e estabelecendo novos habitats para o molusco
hospedeiro intermediário.
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Representação Esquemática da Expansão da
Esquistossomose Mansoni
- Brasil - 1997
Fig-1: Fundação Nacional de Saúde, 1999. Epidemiologia e controle da esquistossomose, Brasil.
Schistosoma mansoni tem cor esbranquiçada ou leitosa, geralmente se hospeda em vênulas
tributárias do sistema porta hepático, particularmente das mesentéricas superior e inferior do plexo
hemorroidário e mesmo da porção intra-hepática da veia porta (Pirajá da Silva, 1908).
O macho mede em torno de 6,5 a 12 mm de comprimento e é achatado, porém, adquire um
aspecto cilíndrico devido ao enrolamento ventral de suas bordas corporais para formar o canal
ginecóforo. Mais fina que o macho, a fêmea tem um comprimento de cerca de 15 mm e é
perfeitamente cilíndrica, com as extremidades afiladas. Alojando-se no canal ginecóforo do macho (fig-
2), é fecundada iniciando assim, a postura dos ovos no interior das vênulas da submucosa intestinal,
integrantes do plexo hemorroidário, para onde o casal de vermes costuma migrar por ocasião da
postura.
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Figura-2: Parasito – canal ginecófaro Fundação Nacional de Saúde, 1999. Epidemiologia e controle da esquistossomose, Brasil.
Os ovos medem cerca de 150 micrômetros de comprimento por 60 micrômetros de largura e
têm o formato oval, apresentando na sua parte mais larga um espículo voltado para trás. Na postura,
os ovos contêm o embrião ainda em formação, depois de decorridos 6 a 7 dias, o miracídio maduro
esta apto para eclodir. Se, decorridos cerca de 20 dias, os ovos não conseguirem atingir a luz
intestinal, ocorrerá a morte dos miracídios. Ao serem examinados nas fezes, por possuírem invólucro
transparente, deixam ver o embrião (miracídio) no seu interior (fig-3).
Fig-3 Ovo de Schistosoma mansoni (Hoffman - ATLAS OF HUMAN PARASITOLOLY - Second edition, 1984. LAWRENCE R. ASH AND THOMAS C. ORIHEL)
O miracídio tem uma forma cilíndrocônica e mede cerca de 160-180 µm de comprimento por 60
160-180 µm de largura (fig-4), ele representa a primeira forma larvária do Schistosoma mansoni, no
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ambiente aquático o miracídio eclode do ovo devido a hipotonicidade do meio que promove a
passagem de água para o interior da casca, a temperatura (em torno de 28°C), à luminosidade e a
própria movimentação do embrião. Este sobrevive até 24 horas em meio aquoso, dependendo das
condições. É um organismo muito móvel, graças aos numerosos cílios que lhe revestem a delgada
cutícula e ao seu sistema muscular.
Fig- 4: Miracídio Fonte: (Parasitologia humana/David Pereira Neves.-10ª Ed.-São Paulo:Editora Atheneu, 2002)
As cercárias apresentam uma calda bifurcada medindo 230 por 50 micrometros e corpo
cercariano com 190 por 70 micrômetros, tendo o comprimento de aproximadamente 500 micrometros
(fig-5). Para que as cercárias sejam eliminadas dos moluscos, estas precisam estar aptas a
desempenhar em funções especializadas no novo ambiente tais como a capacidade de apresentar
intensa movimentação e localizar e penetrar em um hospedeiro vertebrado.
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Fig- 5: Cercária. Fundação Nacional de Saúde, 1999. Epidemiologia e controle da esquistossomose, Brasil.
1.1- CICLO BIOLÓGICO
O parasito na fase adulta viveindo no sistema vascular do hospedeiro definitivo, alcança as
veias mesentéricas, principalmente a veia mesentérica inferior (Valadares et al. 1981). Indo contra a
corrente circulatória, as fêmeas fazem a postura dos ovos no nível da submucosa sendo que 50% dos
ovos ganham o meio externo. Alguns fatores são responsáveis por esta passagem à luz intestinal, tais
como a própria reação inflamatória (Miller & Wilson, 1978) e ação de enzimas proteolíticas liberadas
pelo miracídio. Esta migração leva cerca de 8 dias para acontecer, os ovos colocados nos tecidos
levam cerca de 6 dias para se tornarem maduros, com o miracídio formado. Os ovos podem ficar
presos na mucosa intestinal ou serem arrastados para o fígado. Os ovos que conseguirem chegar a
luz intestinal vão para o exterior junto com o bolo fecal tendo uma expectativa de vida de 24 horas a
cinco dias, tempo variável de acordo com as características das fezes. Ao alcançar a água os
miracídios são liberados pelos ovos tendo como estimulo temperatura, luminosidade e oxigenação da
água.
A capacidade de penetração dos miracídios no caramujo restringe-se a 8 horas após a eclosão
do ovo e tem as temperaturas mais altas como fator estimulante. Neste processo 30% dos miracídios
são capazes de penetrar em B. glabrata e apresentar evolução satisfatória; 30% penetram mas não
evoluem; e 40% não penetram no caramujo.
No Brasil, três espécies de moluscos do gênero Biomphalaria – B. glabrata, B. straminea e B.
tenagophila - atuam como hospedeiros intermediários do S. mansoni. O miracídio passa por
transformações morfológicas chegando ao estágio de cercária, um único miracídio pode gerar de 100
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a 300 mil cercarias em B. glabrata. Desde a penetração até a eliminação de cercárias é decorrido um
tempo de 27 a 30 dias, a eliminação das cercárias segue um ritmo circadiano, a luz induz a uma maior
eliminação de cercárias, ocorrendo principalmente nas horas mais claras do dia (Rey, 2001). As
cercárias podem viver de 36 a 48 horas, todavia sua maior capacidade infectiva ocorre nas primeiras 8
horas de vida. Cercárias recém eliminadas nadam ativamente com movimentos característicos,
sobretudo, pela movimentação da cauda (Cunha, 1970), a maior natação cercariana favorece o
encontro com o hospedeiro definitivo (Curwen &Wilson, 2003; McKerrow, 2003) ao alcançarem a pele
do hospedeiro definitivo iniciam a penetração com perda da cauda passando a se chamar
esquistossomulos. Este processo dura de 7 a15 minutos, através do tecido subcutâneo migram para a
rede vascular sendo levado até os pulmões, via coração direito (Cunha, 1970), daí, migram para o
sistema porta hepático pela via sanguínea ou transtissular.
Uma vez no sistema porta hepático os esquistossômulos se alimentam e se desenvolvem
transformando-se em machos e fêmeas. Trinta dias após a penetração, migram, acasalados, para o
território da veia mesentérica inferior (Wheather & Wilson, 1979), onde farão oviposição. Somente
após 40 dias se pode identificar os primeiros ovos nas fezes.
Estudos mostram que em áreas endêmicas, o grau de morbidade está associado com a
intensidade de infecção (Gryseels, 1992; Van der Werf et al. 2002). A forma grave da doença, a
hepatoesplênica, ocorre em cerca de 5% dos indivíduos portadores da infecção pelo S. mansoni em
áreas de alta prevalência, vários fatores de risco tais como socioeconômicos, demográficos,
comportamentais, imunológicos (Butterworth et al.1985, Sturrock et al. 1987, Kresmer et al. 1994), e
ambientais tem sido relacionados com a intensidade da infecção em comunidades rurais do Brasil
(Kloos et al. 1998; Gazzinelli et al. 1998; Lima e costa et al., 1998) visto isso temos que as ações de
saneamento ambiental são tidas como de grande eficácia para as modificações de caráter permanente
das condições de transmissão da esquistossomose. Dentre estas ações podemos citar: coleta e
tratamento de dejetos, abastecimento de água potável, instalações hidráulicas e sanitárias, aterros
para eliminação de coleções hídricas que sejam criadouros de moluscos, drenagens, limpeza e
retificação de margens de córregos e canais, etc (Ministério da Saúde 2005).
1.2- PATOGENIA
Os ovos depositados na parede intestinal podem apresentar 3 destinos: serem eliminados nas
fezes, permanecerem na própria parede do intestino ou serem levados pelo sangue e fixarem no
fígado, pulmões ou, mais raramente, estômago, miocárdio, pâncreas, testículos e etc. Os ovos
maduros vivos antes de morrerem produzem uma típica reação nos tecidos, a qual constituirá o
característico granuloma esquistossomótico com predominante componente exsudativo, muitos
eosinófilos, periferia pouco delimitada e freqüente necrose central ou halo de necrose periovular (Raso
& Neves, 1965). Antígenos secretados pelos ovos poderão circular e ser depositados em tecidos,
representando causa provável de lesões.
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No local da penetração da cercária, pode haver eritema, edema, pápula ou flictema. Logo após
a penetração, a cercária transforma-se em esquistossômulo, que produz discreto infiltrado inflamatório.
A hepatite esquistossomótica relaciona-se com os vermes vivos. Os vermes mortos
desencadeiam lesões graves, obstrutivas, com necrose e inflamação, seguidas de cicatrização. A
morte dos vermes pode causar piora da insuficiência hepática (IH), elevação da pressão porta (HP)
com hemorragia digestiva, deterioração da circulação pulmonar com cor pulmonale agudo,
pneumonite, asma brônquica e choque anafilático ou vasculite generalizada, podendo levar o paciente
à morte.
Fase aguda: um estado de hipersensibilidade pode ser desencadeado no organismo por
substâncias alergênicas provenientes dos vermes ou dos ovos. A hepatomegalia pode resultar do
infiltrado celular ou edema. A linfadenopatia e a esplenomegalia podem representar uma reação
imunitária. Os calafrios, a febre, a prostração e a sudorese fazem parte das manifestações do estado
toxêmico instalado nesta fase.
Formas graves: têm com fator principal a hipertensão portal; o processo patológico central é a
fibroplasia, que está relacionada à deposição de colágeno no sistema porta com posterior
envolvimento do lóbulo hepático pela fibrose.
Fígado: pode cursar com fibrose hepática
Esôfago: fibrose hepática à HP à varizes de esôfago.
Baço: O baço pode aumentar de volume, devido à congestão determinada pela hipertensão
porta e à hiperplasia dos elementos retículo-endoteliais.
Pulmão: as lesões parenquimatosas pulmonares estão relacionadas com a presença de ovos
em grau suficiente para produzir sintomatologia. As lesões mais importantes se localizam nos vasos
pulmonares e são capazes de levar à hipóxia e hipertensão pulmonar.
Intestinos: ulcerações, fibroses e formações de massas podem obstruir a luz intestinal.
Rins: alguns pacientes podem desenvolver glomérulonefrite . A glomerulopatia é explicada por
imunocomplexos (Andrade & Rocha, 1979; Andrade e Van Marck, 1984).
Sistema nervoso: Na medula espinhal, pode haver deposição de ovos ou até mesmo em casos
mais raros a migração anômala de vermes produzindo lesões graves (Ferrari, 1999; Ferrari et al.,
1993).
1.3- APRESENTAÇÃO CLÍNICA
Pose-se dizer que a fase inicial da esquistossomose se dá com a penetração das cercárias
pela pele, todavia as manifestações decorrentes deste fato sofrem influência das condições em que
aconteceram os primeiros contatos com os focos de infecção. As cercárias tem como foco de
penetração mais freqüente os pés e as pernas por serem áreas do corpo que mais ficam em contato
com águas contaminadas, e os locais de transmissão mais comuns são focos peridomiciliares: valas
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de irrigação de horta, açudes e pequenos córregos onde acontecem atividades recreativas ou de
atividade de lavadeiras de roupas.
A primeira manifestação pela penetração da cercaria na pele do hospedeiro é a dermatite
cercariana que é caracterizada por erupção urticariforme e é seguida, dentro de 24 horas, por
eritema, edema, pequenas pápulas e dor. A dermatite cercariana tende a se apresentar de forma mais
intensa nas reinfecções, onde há interferências de mastócitos com liberação de histamina,
complemento, eosinófilos e IgE, todavia, a referida dermatite não é indício seguro da instalação da
forma aguda e nem sua ausência afasta a possibilidade do diagnóstico desta (Neves, 1965). Após a
segunda semana de infecção podem ser encontrados nos vasos do fígado esquistossômulos,
podendo o hospedeiro apresentar linfadenomegalia, febre, esplenomegalia e sintomas pulmonares.
Após maturação, os vermes espoliam o hospedeiro, devido ao alto metabolismo, os vermes mortos
podem causar lesões extensas no fígado, para onde são arrastados pela circulação porta hepática.
Os ovos são os elementos fundamentais da patogenia da esquistossomose podendo provocar
hemorragias, edema da submucosa e fenômenos degenerativos, com formações ulcerativas pequenas
e superficiais, todavia, os ovos que atingem o fígado, lá permanecem causando as alterações mais
importantes da patologia, a reação inflamatória granulomatosa, daí o granuloma, composto pelo ovo +
reação granulomatosa.
1.3.1- Esquistossomose aguda
Ocorre cerca de 10 a 120 dias pós infecção podendo ser assintomática ou se caracterizar
pelos seguintes sintomas: mal estar, febre, tosse, mialgia, desconforto abdominal e um quadro de
hepatite aguda, existem evidencias que citocinas pró-inflamatórias e imunocomplexos sejam
responsáveis pelo seu inicio (Hiatt et al., 1980). Estes eventos são tidos como fase pré postural. Entre
50 a 120 dias de infecção pode ocorrer a disseminação de ovos principalmente no intestino levando a
uma enterocolite aguda e no fígado, no pulmão pode simular tuberculose. A fase aguda pode
apresentar-se com quadro clínico discreto ou até mesmo assintomático (Rocha et al., 1993). Quando
acontece a formação de granulomas simultâneos pode-se apresentar a forma toxêmica com febre,
diarréia, calafrios, tenesmo, cólicas, hepatoesplenomegalia, linfadenomegalia podendo provocar até
mesmo a morte do hospedeiro, deve-se ressaltar que o termo toxêmico deve ser empregado somente
18
em manifestações de formas intensas (Raso, Pedroso & Neves, 1986; Ferreira et al., 1966), todavia a
maioria dos pacientes com tal quadro evoluem para a fase crônica onde existe uma diminuição dos
granulomas devido uma redução da resposta imune do hospedeiro.
1.3.2- Esquistossomose crônica
Esta forma pode apresentar grande variação clínica, podendo ainda ser denominada por forma
leve devido a freqüente benignidade da sintomatologia (Prata, 2002). No intestino, o paciente pode
manifestar episódios de diarréia mucossanguinolenta (Peixinho, André & Bina, 1986), dor abdominal,
tenesmo, podendo haver fibrose de alça intestinal (Lobo, 1947), com diminuição do peristaltismo e
constipação, as alterações hepáticas surgem a partir da formação dos granulomas, fato este que é
dependente da quantidade de ovos que chega ao fígado e a reação granulomatosa. O fígado que a
princípio estaria aumentado pode apresentar-se de forma menor e fibrosado (fibrose de Symmers)
(Prata & Andrade, 1963), outra alteração é a fibrose periportal trazendo como conseqüência a
hipertensão porta com serias inplicações, entre elas podemos citar as varizes esofagianas, que
rompendo-se podem ocasionar serias hemorragias, muitas vezes fatal.
A ascite na esquistossomose é encontrada nas formas hepatoesplênicas e é decorrente das
alterações hemodinâmicas, principalmente a hipertensão portal.
1.4- DIAGNÓSTICO
O diagnóstico da esquistossomose pode ser dado de forma indireta ou direta, tendo-se o último
como diagnóstico de certeza, esta técnica baseia-se na visualização de ovos do parasito nos tecidos
ou fezes do hospedeiro, todavia, em situações onde há uma diminuição da quantidade de ovos do
parasito estes métodos se mostram menos sensíveis, sendo necessário lançar mão de métodos
imunológicos, ou indiretos, que correspondem à avaliação da resposta imune do hospedeiro frente a
antígenos parasitários, ou mesmo a apresentação clinica da patologia, todavia os métodos
imunológicos disponíveis apresentam reações cruzadas com outras helmintoses, não detectam a
intensidade da infecção, não diferenciam infecção passada e recente e podem permanecer positivos
19
durante aos após a cura quimioterápica (Smithers & Doenhoff, 1982; Mott & Dixon, 1982; Montenegro,
1992)
Métodos diretos: detectam o parasito ou parte dele, ovos, substâncias antigênicas ou
fragmentos moleculares
• Exames de fezes ou biópsia da mucosa retal buscando ovos eliminados pelas fêmeas
• Pesquisa de antígenos circulantes busca substâncias antigênicas em tegumentos ou
material de regurgitação do parasito
• Reação de cadeia da polimerase (PCR) busca DNA de ovos, tegumento ou material de
regurgitação.
Métodos indiretos: identificam evidências indiretas da presença do parasito sem visualização
direta
• Clínicos, evidência de sinais e sintomas sugestivo de esquistossomose
• Propedêutica clínica busca alterações hemodinâmicas e de imagem
• Imunológicos reação intradérmica, imunidade celular especifica, presença de anticorpo
circulante, imunidade humoral específica.
1.5- TRATAMENTO
Pode-se dizer que a localização do parasito e o potencial nocivo do verme mesmo morto são
barreiras a serem transpostas, outra questão a ser levada em conta no tratamento farmacológico é a
condição clínica do hospedeiro, visto que certas condições clínicas contra-indicam o uso imediato da
droga sendo preferível protelar o tratamento para uma intervenção mais segura. Dentre as condições
que contra-indicam o tratamento imediato da esquistossomose podemos citar a desnutrição ou anemia
acentuada, insuficiência hepática grave, cardíaca ou renal, e primeiro trimestre de gravidez.
Oxaminiquina: o mecanismo de ação da oxaminiquina parece estar relacionado com a
capacidade de inibição irreversível da síntese dos ácidos nucléicos nos vermes (Cioli, Pica-mattoccia
& Archer, 1995). È um composto não antimonial que oferece larga margem de segurança para
tratamentos em massa, passou a ser utilizada na década de 70 com efeitos colaterais sensivelmente
20
reduzidos e pequenas manifestações de intolerância gástrica, estudos sugerem a não efetividade da
droga no tratamento de bovinos experimentalmente infectados (Coelho; Lima; Modena, 1990).
Praziquantel: é também um medicamento não antimonial do grupo dos tiaxantônicos, com larga
margem de segurança no tratamento da esquistossomose, com administração oral, apresenta leves
efeitos colaterais. Apresenta também atividade anticestódeos e antitrematódeo, trabalhos mostram a
eficácia da droga contra outras espécies de Schistosomas, S. haematobium, S japonicum e também
contra S. intercalatum e S. mattheei (Gönnert & Andrews, 1977; Webbe & James, 1977; Andrews et al.,
1983). Trabalhos apontam que o estado imunitário do hospedeiro pode ser importante na resposta
terapêutica do praziquantel (Pica-Mattoccia & Cioli, 2004; Sabah et al ., 1985).
2- ESQUISTOSSOMOSE EM BOVINOS
Schistosoma mansoni tem o homem como o principal hospedeiro definitivo para a manutenção
da espécie na natureza. Entretanto, já foram relatadas inúmeras outras espécies de vertebrados
infectados, pertencentes a várias ordens de mamíferos, em áreas endêmicas para esquistossomose
mansoni. Assim o primeiro relato de animais com infecção do S. mansoni foi de Kunts em 1952, em
roedores africanos.
No Brasil no ano de 1953, Amorim e o grupo de Barbosa et al relataram os primeiros
encontros de roedores com infecção natural. Posteriormente outros artigos publicados também
notificaram a presença de vertebrados com infecção natural no Brasil (Amorim, 1954; Martins et al
1955, Barbosa et al 1958, Luz et al 1966-67 e Rodrigues & Ferreira 1969. Antunes et al, 1973, Coelho
et al 1976-79. Silva et al 1992, Gentile et al, 2006)
Estes trabalhos mostram principalmente roedores com a maior prevalência de infecção
natural (varias espécies), mas também marsupiais, gênero Didelphis, (Coelho et al 1979), carnívora,
gênero Procyon, (Coelho et al 1976-79) e Arctiodoctila, bovinos, (Barbosa et al 1962, Coelho et al
1982).
O primeiro relato de Barbosa et al em 1962, examinando animais sacrificados em
abatedouros encontrou vermes adultos de Shistosoma mansoni no mesentério de alguns bovinos de
corte. Entretanto o exame da mucosa intestinal destes animais não mostrou ovos viáveis do parasito,
o que induziu à conclusão destes autores que bovinos não seriam bons hospedeiros do trematódeo.
Posteriormente, Coelho et al (1982) em infecção experimental de bezerros
descendentes do cruzamento das raças Gir com Holstein (Holandês), com cercárias por via cutânea,
verificaram um surpreendente desenvolvimento do parasito, com taxas de desenvolvimento do
parasito e percentagem de recuperação muito semelhante aos observados em camundongos
infectados simultaneamente, que são considerados bons hospedeiros para o Shistosoma mansoni.
21
Ademais a observação da evolução dos ovos nos tecidos, da mucosa intestinal, mostrou também
similaridade com o observado nos tecidos de camundongos controle. Ovos obtidos das fezes dos
bezerros produziram miracídios com viabilidade para infectar Biomphalaria glabrata. Estes resultados
levaram os autores a investigar, em condições naturais, a infecção de bovinos por S. mansoni em
propriedades rurais em áreas endêmicas.
Na primeira propriedade em Engenheiro Caldas, município de Governador Valadares, 4
entre 8 bezerros girolandos apresentavam ovos viáveis do parasito nas fezes. Nesta propriedade
existiam todas as condições para a infecção dos bovinos ocorrer. Várias casas com pessoas com
esquistossomose mansoni desembocavam suas descargas sanitárias em um pequeno córrego,
formando um alagadiço com exuberante produção de vegetação que era usada para o pastejo dos
animais. Posteriormente, com exame de mais propriedades, a percentagem de animais infectados
situou-se próximo a 3%, número bem mais baixo do que apontava o resultado da primeira propriedade
estudada. Posteriormente, o Dr Frederico Simões Barbosa, o primeiro descobridor da infecção em
bovinos, os Drs Paulo Marcos Zech Coelho, Walter dos Santos Lima e Celina Maria Modena
montaram um projeto, que foi a tese de doutorado da Drª Celina, para elucidar melhor o potencial dos
bovinos como hospedeiros vertebrados de importância na epidemiologia. Resumindo os resultados de
um extenso estudo que resultou em várias publicações, verificou-se por estudos experimentais que
animais jovens (bezerros) eram mais susceptíveis à infecção e que bovinos holstein (holandês) eram
nitidamente mais susceptíveis que a raça indiana gir. Os bezerros derivados do cruzamento destas
duas raças apresentavam uma susceptibilidade intermediária, permitindo, entretanto o
desenvolvimento dos vermes e a eliminação de ovos viáveis pelas fezes, Modena et al (1993).
Em um experimento em condições seminaturais, 3 bezerros infectados
experimentalmente e eliminando ovos de S. mansoni pelas fezes foram mantidos com 5 bezerros
oriundos de áreas não endêmicas em um cercado de aproximadamente 2500 m2 e no qual foi
construído um tanque de cimento de 16 m2 de área com declive de 15 cm até 55 de profundidade que
foi enchido com água natural e no qual foram colocados 500 exemplares de Biomphalaria glabrata
criados em laboratórios, portanto livres de infecção de S. mansoni. Verificou-se que os animais, todos
com sangue holandês (puro ou meio sangue) entravam no tanque para se refrescar (o experimento foi
feito no verão) e defecavam freqüentemente no mesmo local. Resumindo os achados; todos os
animais controle se infectaram em um período de 79 a 202 dias após o inicio do experimento. Os
caramujos se multiplicaram no tanque atingindo (após 7 meses) o número de 3304 com taxa de
infecção (eliminando cercárias), de 49%. Estes resultados mostraram que os bovinos juntamente com
B. glabrata teriam potencial de manter um foco de transmissão do S. mansoni na ausência do ser
humano (Modena et al 1993).
Investigações de campo em áreas mais extensas mostraram uma taxa de infecção
natural de 1% (exame de fezes e curetagem retal) (Modena et al 1990), valor que talvez possa estar
sendo subestimado, levando-se em conta a não padronização para detecção do S. mansoni em
22
bovinos. Após estes estudos, não existiram outros registros de estudos em bovinos experimentais ou
epidemiológicos, ligados a esquistossomose.
Considerando o grande porte destes animais e conseqüentemente o volume de fezes
lançados na natureza (calcula-se que os bovinos eliminam diariamente cerca de 10% do peso corporal
em fezes), que os achados nos levantamentos epidemiológicos de percentuais baixos de infecção
natural seguramente subestimaram a infecção real e ainda a grande movimentação do gado entre
regiões pelo comércio permite a inferência de que os bovinos possam atuar como disseminadores da
endemia. Recentemente o Dr Helmut Kloos suspeitou que os bovinos que circulam soltos em contatos
com águas de focos de transmissão nas localidades de Virgem das Graças, seriam os prováveis e
principais responsáveis pela manutenção da infecção dos caramujos nestes focos, focos estes que
foram observados minuciosamente pela equipe que trabalha na área liderada pela Drª Andréa.
Gazzinelli et al (1998).
Na esquistossomose mansoni o diagnóstico de certeza é dado pelos métodos
parasitológicos diretos, baseando-se na visualização direta dos ovos do parasito nos tecidos (biópsia
ou raspagens retais) ou nas fezes do indivíduo infectado, contudo cargas parasitológicas baixas
podem subestimar os resultados, visto a pouca sensibilidade do método direto. Tal fato torna-se mais
evidente quando se leva em conta o volume fecal eliminado pelos bovinos e sua grande quantidade de
elementos insolúveis em água, dificultando assim o método de visualização dos ovos do parasito no
sedimento. Diante disso, vê-se a necessidade de uma melhor avaliação dos métodos diagnósticos
para esquistossomose em bovinos.
2- OBJETIVO O presente estudo visa avaliar métodos diagnósticos imunológicos, parasitológicos e moleculares para a esquistossomose em bovinos usando-se bezerros infectados experimentalmente.
3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1- INFECÇÃO DOS BOVINOS
Seis bezerros mestiços de cruzamento da raça holandesa e gir com
aproximadamente 10 meses de idade, provenientes de área seguramente não endêmica de
23
transmissão para esquistossomose foram adquiridos e levados à fazenda do Dr Walter dos
Santos Lima situada na zona rural de Curvelo a aproximadamente 170 Km de Belo Horizonte,
posteriormente foram identificados na orelha esquerda com brincos seguindo as devidas
numerações: 16, 17, 18, 19, 20, 38.
Os animais foram submetidos a coletas de sangue e fezes para posterior exame
em laboratório.
As coletas foram procedidas antes e após a infecção, sendo assim possível tomar o
mesmo grupo de animais como caso (pós infecção) e controle (antes da infecção).
A infecção foi procedida conforme descrito por COELHO et al (1982). Os animais
foram sedados com Rompum® (Bayer latoratórios) e colocados em decúbito dorsal (fig-6),
logo após, foi realizada limpeza na região inguinal dos animais com sabão neutro e água (fig-
7). A seguir, após enxugar a região previamente limpa, foram gotejadas aproximadamente
10.000 cercárias (cepa LE, BH) (fig-8). Os animais foram mantidos na posição descrita por
aproximadamente 1 hora.
24
Figura-6: Após sedação os animais foram colocados em decúbito dorsal para proceder a infecção
Figura-7: O local a ser aplicado a solução cercariana foi lavado com sabão neutro
25
Figura-8: Gotejamento da suspensão cercariana
Figura-9: Minutos após a aplicação do concentrado de cercarias pode-se observar a dermatite cercariana
Após o procedimento de infecção os animais foram colocados sob observação
em um cercado para recuperação do processo de sedação.
26
3.2- COLETAS DE SANGUE
As coletas de sangue foram feitas no período da manhã. Os animais,
previamente agrupados no curral de espera, eram colocados no brete (fig-10) para o
procedimento.
Figura-10: figura esquemático do local de coleta de material para exame
A coleta do sangue era procedida na veia jugular externa (fig-11) com material
adequado para o procedimento, sendo um volume por coleta de aproximadamente 40 ml de
sangue para cada animal, quantidade suficiente para os procedimentos necessários ao
experimento. Antes e após cada coleta, era procedida assepsia do local com álcool a 70%, os
recipientes de coleta de sangue foram identificados com o número do brinco de identificação
de cada animal e datados conforme data da coleta procedida.
Figura-11: Coleta de sangue em jugular externa
27
Após coleta os tubos contendo sangue foram colocados em repouso por um
período de aproximadamente de 2 horas a 45°de inclinação e a temperatura ambiente, sendo
posteriormente mantidos sob refrigeração para retração do coágulo e transporte.
O material coletado era transportado, em caixa térmica com gelo, para o
laboratório de parasitologia da UFMG onde o soro era separado do coágulo e centrifugado a
2000 rpm por um período de 3 minutos. O soro, então centrifugado, foi aliquotado em
recipientes tipo eppendorf seguindo um padrão de 3 ml por recipiente, identificados com data
da coleta e número do brinco de cada animal sendo então acondicionados no freezer até a
análise sorológica.
3.3- COLETA DE FEZES
As coletas de fezes dos animais eram procedidas no brete na ocasião da coleta
de sangue. As fezes eram coletadas manualmente com luvas descartáveis no reto do animal
(fig-12) e identificadas com o número do brinco e a data da coleta individualmente, logo após
a coleta o material era levado para análise em laboratório montado na fazenda.
Figura-12: Coleta de fezes no reto do animal
RASPAGEM RETAL
Foi realizada raspagem retal (fig-13) dos animais conforme técnica descrita por
Modena et al (1993), no qual fragmentos (fig-14) da mucosa foram retirados mediante a
28
introdução de aproximadamente 10 a 15 centímetros de uma cureta com borda cortante,
similar à ginecológica, sendo posteriormente analisados sob microscopia ótica em laboratório
montado no local do experimento. Até a análise microscópica o material colhido foi mantido
em solução salina a 0,85% e examinado no mesmo dia. As raspagens foram feitas 105 e 189
dias após a infecção, durante o procedimento os animais foram imobilizados no brete para
maior segurança na coleta.
Figura-13: Raspagem retal
Figura-14: Mucosa retal
29
3.5- MÉTODO DE ECLOSÃO DO MIRACÍDIO
O método de eclosão de miracídio baseia-se no forte fototropismo positivo típico do
comportamento do miracídio, elemento que certamente contribui para a infecção do
hospedeiro intermediário (Willians & Coelho 1975).
O método descrito por Jurberg et al (2008) consiste em um frasco de Erlenmeyer de
500 ml que mantém o principio dos vasos comunicantes com um pequeno coletor adaptado
em sua porção superior. Uma caixa de madeira com um orifício na porta circundado com uma
estrutura de borracha que mantém o ambiente interno da caixa, onde se localiza o aparato,
sem iluminação. Deixando apenas o dispositivo coletor em exposição luminosa. (fig-16)
Mediante estimulação luminosa os miracídios migram para o coletor, iluminado por uma
lâmpada de 60 watts, onde podem ser facilmente pipetados e observados à microscopia.
As fezes usadas no experimento foram processadas imediatamente após a coleta e a quantidade usada por bovino em cada experimento foi de 500 mg.
Figura-16: Método eclosão do miracídio
3.7- MÉTODO DE EXAME DE FEZES PELO GRADIENTE SALÍNICO
O método do gradiente salínico inventado recentemente pelo Dr Paulo Marcos sob
patente de n° PI0803835-0 tem como princípio a alta densidade dos ovos do S. mansoni . O
equipamento consiste basicamente em 2 recipientes de plástico transparente que se
intercomunicam, com fixação em níveis diferentes, sendo um reservatório de maior
30
capacidade (50ml) fixado mais alto e o de menor capacidade (10ml) fixado em um ponto mais
baixo, tendo em sua extremidade superior uma abertura que drena para outro recipiente de
descarte. Entre as colunas uma fina mangueira de borracha com um dispositivo para
interromper o fluxo faz a conexão entre os recipientes.
Em cada experimento uma amostra fecal do animal examinado foi diluída em solução
salina a 0,9% e colocada na coluna menor, na coluna com maior capacidade foi colocada
solução salina a 3% e aberto o dispositivo liberando assim o fluxo entre as duas colunas
provocando a eliminação da salina 0,9% com a suspensão do material orgânico mais leve,
clarificando o sedimento. O sedimento foi colocado em laminas, coberto por lamínulas e
analisado ao microscópio.
3.8- MÉTODO ELISA (Ensaio de Imunoadsorção Associada à Enzimas)
3.8.1- OBTENÇÃO DE ANTÍGENO SWAP (antígeno bruto de vermes adultos)
Quarenta e cinco dias após infecção por S. mansoni em camundongos BALB/c
os vermes foram recuperados do sistema porta hepático mediante técnica descrita por
Smithers & Terry (1965), colocados em aproximadamente 1 ml de PBS e triturados por 36x
de 30 segundos, alternando com descanso no gelo por 60 segundos, logo após foi submetido
a centrifugação a 4°C, 13000 rpm por 60 minutos. O sobrenadante foi retirado e o restante foi
submetido a diálise em salina 0,9% por 48 horas, trocando a salina 0,9% de 12 em 12 horas.
Mais uma vez foi centrifugada a 4ºC, 2500 rpm por 15 minutos, retirado o sobrenadante e
dosado proteínas segundo (Bradford 1976).
3.8.2- OBTENÇÃO DE ANTÍGENO SEA (antígeno solúvel do ovo)
A obtenção dos ovos para preparação do antígeno SEA se deu a partir de fígado e
intestino de camundongos previamente infectados. Fígados e intestinos foram processados
afim de liberarem os ovos do parasito do tecido do animal. Os ovos foram colocados em
vacuntainer com aproximadamente 1 ml de solução salina a 1,7 %, logo em seguida foi
inserido em um béquer com gelo e levado ao triturador por cerca de 40 minutos, logo após o
material foi centrifugado (em centrífuga refrigerada) a 13000 g (14000 rpm), 4ºC por 60
minutos. Centrifugado, o material passou por diálise por 48 horas em salina 0,9% (9g de NaCl
em 1l de água bidestilada) e dosado proteínas segundo (Bradford 1976).
31
ELISA (Ensaio de Imunoadsorção Associada à Enzimas)
A técnica foi realizada de acordo com metodologia descrita por Harlow & Lane (1988),
foram utilizadas microplacas Nunc (Rockesield, Dinamarca) de 96 poços com capacidade de
200 µl. As placas foram previamente sensibilizadas “overnight”, a 40C, com os antígenos (0,5
µg/poço) em 100 µl de tampão carbonato pH 9,6. Após sensibilização as placas foram então
lavadas 3 vezes em PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBST20) e bloqueadas com leite
desnatado (Molico) 2% em PBST20. No experimento os soros dos animais foram avaliados
com as diluições de 1:50, 1:100, 1:200 e 1:400 em PBST20 pH 7,2. Após incubação, as
placas foram lavadas 3 vezes com PBST20 e o anticorpo anti-IgG bovino conjugado a
peroxidase (Sigma, St. Louis, Mo, USA) adicionado na diluição de 1/30.000. Após nova
incubação a 370C por 1 h, as placas foram novamente lavadas e adicionado 100 µl/well do
substrato ABTS (Sigma, St. Louis, Mo, USA). As leituras foram feitas em leitor de ELISA (BIO-
RAD, Mod. 3550) a 405 nm. Como controle negativo foram testados os anticorpos
conjugados à peroxidase na ausência do soro dos animais.
3.9- MÉTODO PCR
3.9.1- Extração de DNA de soro de bovinos infectados por S. mansoni
Para a extração de DNA foi usado o sangue dos animais coletado previamente. Foram
utilizados dois métodos de extração:
1. fenol/clorofórmio (Sambrook, Fritsch, and Maniatis, 1989).
2. Resina - Instagene matrix ® Bio-Rad
Para os dois métodos foram utilizado 200µl do soro, os quais foram previamente
aquecidos por 5min a 100ºC e centrifugados a 13.000x g por 10min para a formação de um
“pellet”.
32
3.9.1.1- Fenol/Clorofórmio
Ao tubo contendo o pellet do soro, foram adicionados 100µl de tampão de
extração (50mM Tris-HCl, pH 8,0, 50mM EDTA, 100mM NaCl, SDS 1%) e 50µg/ml de
proteinase K. A amostra foi incubada a 37ºC por 12 a 16h. Foram adicionados 100µl de fenol,
a amostra foi agitada em agitador de inversão, até formar uma emulsão e centrifugada a
13.000x g por 10min. A fase aquosa foi retirada, sendo transferida para um novo tubo, ao qual
se acrescentaram 50µl de fenol e 50µl de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1). A amostra foi
agitada por 10min e centrifugada a 13.000x g por 10min. A fase aquosa foi retirada e
transferida para novo tubo, ao qual foram adicionados 100µl de clorofórmio-álcool isoamílico.
A amostra foi novamente agitada e centrifugada. A fase aquosa foi transferida para novo tubo
ao qual foi acrescentado acetato de sódio 3M, pH 5,2, em volume igual a 1/10 do seu volume.
Em seguida, para a precipitação do DNA, foram adicionadas 2,5 vezes o volume de etanol
100% a 4ºC. O tubo foi colocado a –70ºC por 1h. A amostra foi centrifugada a 13.000x g por
10 min a 4ºC. O sedimento foi lavado 2 vezes com etanol a 70% a 4ºC, centrifugando a
13.000x g por 10 min, a 4ºC. O sobrenadante etanólico foi eliminado e o tubo contendo o
sedimento incubado, com a tampa aberta, a 37ºC para evaporar o etanol remanescente. O
DNA foi ressuspendido em 25µl de tampão TE e estocado a –20ºC.
3.9.1.2- Resina
Ao tubo contendo o pellet do soro, foram adicionados 100µl de resina Instagene matrix ® Bio-Rad, e este foi incubado por 30min a 56ºC. O tubo foi agitado em vortex com alta
velocidade por 10s, centrifugado a 13.000x g por 3min à temperatura ambiente, o
sobrenadante foi retirado e estocado a –20ºC para posterior uso na PCR (a permanência do
resíduo parece comprometer a estabilidade do DNA).
Devido às baixas quantidades de DNA obtidas, não foi possível uma quantificação, com
o uso de nenhum dos métodos descritos, assim, testamos e utilizamos 4µl das preparações
de DNA para 15µl de volume final na PCR.
33
3.9.2- PCR
Para as reações usamos, 0,15U de Taq DNA polimerase (Invitrogen), tampão da
enzima, fornecido pelo fabricante (1,5mM de MgCl2, Tris-HCl 10mM pH 8,0, KCl 50mM),
200µM de dNTP, 10pmoles de cada iniciador, 4µl da preparação de DNA, e água deionizada
para um volume total de reação de 15µl. A PCR foi realizada em termociclador “PCR
Express”, Thermo Hybaid US. Nas reações foram utilizados os iniciadores; SmF
(GAGATCAAGTGTGACAGTTTTGC) e SmR (ACAGTGCGCGCGTCGTAAGC) que
amplificam um fragmento de 350 pb da subunidade 28S do rDNA de S. mansoni, previamente
descritos por Sandoval e cols., (Sandoval, 2006). O protocolo foi de 5min a 95ºC para
desnaturação e 40 ciclos consistindo de 30s a 95ºC para desnaturação, 30s a 65ºC para
anelamento dos iniciadores, 30s a 72ºC para extensão, finalizando com uma extensão de
2min a 72ºC e mantido a 4ºC após o término da reação.
Para verificarmos o sucesso da PCR, 3µl dos produtos de amplificação foram
submetidos à análise em géis de poliacrilamida a 8%. Os géis foram fixados em 150ml de
solução de etanol a 10% com ácido acético 0,5% (v/v), e impregnados com nitrato de prata a
0,3%. Finalmente, os géis foram lavados em água deionizada e revelados em solução aquosa
de hidróxido de sódio 3% (p/v) com 0,5% de formaldeído (v/v), até o aparecimento das
bandas (Sanguinetti, Dias, and Simpson, 1994).
34
4- RESULTADOS
4.1- RASPAGEM RETAL
Foram feitas duas raspagens da mucosa retal dos animais, sendo a coleta e
análise do material procedida no próprio ambiente do experimento.
A primeira coleta foi realizada com 105 dias após a infecção dos bovinos e a segunda
coleta com 189 dias também pós infecção.
O animal de brinco n° 16 morreu antes da primeira raspagem retal, portanto não consta
nos dados apresentados, o animal de brinco n° 20 participou apenas da primeira biópsia, pois
morreu antes da segunda coleta de material para o exame. Os ovos encontrados no tecido
foram classificados segundo método do oograma descrito por Pellegrino & Faria (1965).
Foi observada uma grande variação na quantidade de ovos de S.mansoni encontrados
na biopsia retal entre os bovinos (tabela-1).
Total de ovos encontrados em todas as raspagens retais
N° do animal Ovos viáveis Ovos não viáveis
N°16 __ __
N°17 2 58
N°18 0 3
N°19 10 14
N°20 0 __
N°38 1 0
Total 13 75
Tabela-1: número de ovos encontrados na biópsia retal
Todos os ovos encontrados na primeira biópsia apresentavam-se inviáveis,
portanto ineficientes na manutenção do ciclo do parasito. Em alguns animais pôde-se
35
observar também um aumento no número de ovos encontrados na segunda coleta em relação
à primeira. Foram encontrados na segunda coleta ovos viáveis do parasito.
Dos ovos viáveis encontrados pelo método da biópsia retal, pôde-se constatar
que o animal de brinco n° 19 apresentou 14 ovos na segunda coleta, sendo 4 ovos do 1°
estádio, 6 do 2° estádio e 4 do 3° estádio, o animal de brinco n°17 apresentou 2 ovos viáveis,
sendo 1 no 2° estádio e 3 no 3° estádio e o animal de brinco n°38 apresentou apenas 1 ovo
do 3° estádio.
Na primeira coleta nenhum animal apresentou ovos viáveis do parasito sendo
encontrados ovos mortos nos animais de brinco 17, 18 e 19. Os animais de brinco n° 16 e 20
não apresentaram ovos do parasito à biópsia, podendo se cogitar talvez a falha no processo
de infecção (gráfico-2).
0
10
20
30
40
50
60
B-16 B-17 B-18 B-19 B-20 B-38
N°
DE
OV
OS
ANIMAL
OVOS ENCONTRADOS NA RASPAGEM RETAL
OVOS MORTOS 1ª BIÓPSIA
OVOS MORTOS 2ª BIÓPSIA
OVOS VIÁVEIS 1ª BIÓPSIA
OVOS VIÁVEIS 2ª BIÓPSIA
Gráfico-2: Quantidade de ovos encontrados nos animais na 1ª e 2ª coleta de mucosa retal
4.2- MÉTODO DE EXAME DE FEZES PELO GRADIENTE SALÍNICO
Foram feitas 3 análises pelo método do gradiente salínico sendo os
experimentos realizados respectivamente com 46, 126 e 189 dias após a infecção. O material
após processado foi armazenado em caixa térmica com gelo e transportado para o centro de
pesquisas René Rachou em Belo Horizonte/MG. O animal de brinco n° 16 participou apenas
36
da primeira coleta vindo a morrer antes da 2ª coleta, o animal de brinco n° 20 morreu antes da
3ª coleta.
Não foi observada a presença de ovos pelo método em nenhuma das coletas.
Foi percebido grande quantidade de sedimentos durante o experimento, fato atribuído a alta
ingestão de fibras vegetais típica da dieta herbívora destes animais, deve-se ressaltar ainda a
maior dificuldade de se conseguir detectar ovos em uma única coleta de fezes/dia destes
animais, haja visto o grande volume fecal dispensado diariamente.
4.3- MÉTODO DE ECLOSÃO DO MIRACÍDIO
Todo o experimento foi realizado no campo onde uma estrutura completa
necessária ao procedimento do método foi levada e instalada no local.
Os animais foram submetidos a 2 exames pelo método sendo com 46 e 126 dias após
infecção, com exceção do animal de brinco n° 16 que morreu antes do segundo exame.
Em nenhum dos exames foi visualizada a presença de miracídios. Este fato que
pode ser relacionado a grande turbidez na água ocasionada pelas fezes bovinas dificultando o
fototropismo do miracídio. Outra questão que pode ser levantada é o grande volume fecal
diariamente produzido por estes animais, mais de 10% do peso corporal, dificultando, em uma
única coleta, a evidência do parasito. Pode-se cogitar maior efetividade do método em
animais cuja carga parasitária seja mais elevada, outra forma seria melhorar o processo da
técnica com maior numero de lavagem das fezes com salina gelada diminuindo a turbidez do
sobrenadante.
4.4- MÉTODO ELISA (Ensaio de Imunoadsorção Associada à Enzimas)
O método tem como princípio a detecção de anticorpos específicos característicos da
resposta imune do hospedeiro à presença de antígenos do parasito. Para tanto, foram
usados dois tipos de antígenos do parasito: SEA que corresponde a antígenos solúveis de
ovo de S. mansoni e SWAP que corresponde a antígenos de verme adulto de S. mansoni.
Não foi possível se fazer inferências estatísticas com os títulos de anticorpos dos
animais avaliados. O animal de brinco n° 16 não foi submetido ao exame de 126 dias pós
infecção pois o animal morreu antes da data da coleta.Os experimentos, na titulação de 1:50
antes da infecção, não foram feitos para os animais de brinco n° 16, 17, 18. Não foi feito
37
nenhum exame na diluição 1:50 do animal 18 no antígeno SWAP. Os soros dos animais 16 e
17 não foram submetidos a avaliação quanto ao antígeno SEA na titulação 1:400. (tabela-2,3)
O fato de alguns animais não terem sido submetidos a todos os exames se deve a
perda de material (morte do animal n°16) e ao limitado numero de poços (96) presentes nas
placas para o exame ELISA, tais questões não influenciaram nos resultados visto que os
demais dados apontavam por falta de uma tendência que levasse a resultados
estatisticamente significativos.
TABELA: ANTÍGENO SWAP
ANIMAL DILUIÇÃO Antes da infecção 46 dias pós infecção 126 dias pós infecção
Animal-16 1:50 0,508 0,644 MORREU 1:100 __ 0,714 MORREU
Animal-17 1:50 0,504 0,430 0,693 1:100 __ 0,374 0,396
Animal-18 1:50 0,515 0,828 0,816 1:100 __ __ __
Animal-19 1:50 0,841 1,005 0,902 1:100 0,837 0,825 0,741
Animal-20 Animal-38
1:50 0,282 0,763 0,566 1:100 0,331 0,789 0,428 1:50 0,244 1,249 0,443 1:100 0,265 0,814 0,485
Tabela-2: antígeno SWAP TABELA: ANTÍGENO SEA
ANIMAL DILUIÇÃO Antes da infecção 46 dias pós infecção 126 dias pós infecção
Animal-16 1:200 0,478 0,958 MORREU 1:400 __ 0,833 MORREU
Animal-17 1:200 0,567 0,550 0,722 1:400 __ 0,474 0,395
Animal-18 1:200 0,423 0,818 0,678 1:400 0,251 0,543 1,048
Animal-19 1:200 0,382 0,518 1,037 1:400 0,897 1,037 0,931
Animal-20 Animal-38
1:200 0,494 0,923 0,580 1:400 0,326 0,635 0,407 1:200 0,407 1,148 0,311 1:400 0,197 1,150 0,210
Tabela-3: antígeno SEA
38
4.5- MÉTODO PCR
Não houve amplificação do fragmento esperado em nenhuma das amostras, para
nenhum dos métodos de extração de DNA (fig-17)
Figura-17: Exemplo de gel de poliacrilamida 8% apresentando: canaleta L: marcador de tamanho de fragmentos, canaleta +: controle positivo com DNA de verme adulto mostrando o fragmento esperado, canaletas de 1 a 9 diferentes amostras de soro
100 bp
200
300 bp
400
L + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 -
350 bp
39
DISCUSSÃO
O estudo da esquistossomose em bovinos tem sido limitado pela ausência de uma
técnica eficiente e prática para a detecção da doença nos animais, visto que o método Kato-
Katz (Katz et al, 1972), aplicado em humanos, se mostra inviável uma vez que a quantidade
de fibras presentes nas fezes dos animais o inviabiliza. Tal fato aliado à necessidade do
esclarecimento do papel da espécie bovina na manutenção/dispersão da esquistossomose
levantou o interesse em se avaliar técnicas já estabelecidas ou em validação para a espécie
humana e que ainda não foram estudadas para o diagnóstico em bovinos.
5.1- RASPAGEM RETAL
A raspagem da mucosa retal, através de uma cureta com borda cortante tem como
objetivo colher ovos que ainda não passaram para a luz intestinal e ainda estão na mucosa
retal, tal método foi aplicado com sucesso por Modena et al (1993), os ovos encontrados nos
tecidos foram classificados segundo método descrito por Pellegrino & Faria (1965).
O experimento mostrou a suscetibilidade dos bovinos à infecção por Schistosoma
mansoni conforme referencias anteriores. Foram recuperados 88 ovos nas duas coletas
procedidas, dos ovos recuperados, 14,7 % eram viáveis, e 85,3% inviáveis. A aquisição da
cureta, necessária ao método, somente foi possível após a infecção dos animais, fato que
impossibilitou a execução do método em várias etapas antes e após o processo pós-infecção.
O animal de brinco n° 17 mostrou maior número de ovos recuperados, todavia o animal de
brinco n°19 apresentou maior numero de ovos viáveis. O animal de brinco n° 16 não foi
examinado, pois morreu antes da primeira coleta, o animal de brinco n° 20 participou apenas
do primeiro exame, morrendo antes da segunda coleta, assim os animais n°16 e 20 não
podem ser considerados positivos para o método.
A raspagem retal foi o único método, entre os avaliados, que identificou a infecção pelo
parasito nos bovinos, o processo de auto cura entre bovinos infectados experimentalmente
40
por S.mansoni, principalmente animais com sangue zebuíno pode justificar a baixa
recuperação de ovos de alguns animais (Modena et al, 1993).
Pode-se atribuir a baixa recuperação de parasitos ao método da raspagem retal a
possibilidade da baixa taxa de infecção nos animais estudados, uma vez que em estudos
anteriores (Modena et al ,1991) foi possível recuperar grande número de parasitos em
animais infectados em condições experimentais e a raspagem retal sempre mostrou grande
quantidade de ovos viáveis.
5.2- MÉTODO DE EXAME DE FEZES PELO GRADIENTE SALÍNICO
O método de exame de fezes pelo gradiente salínico, tem se apresentado como
potencialmente interessante para o diagnóstico do S.mansoni em humanos (Coelho et al,
2009) ”inpress”.
Foram avaliadas em média 17 lâminas por animal em cada exame. Como houve três
coletas, o total de lâminas examinadas por animal foi em torno de 51, todavia não foi
percebida, através do método de exame de fezes pelo gradiente salínico ovos do parasito nos
animais avaliados, talvez devido à baixa carga parasitária adquirida no processo de infecção.
Algumas questões devem ser levantadas a respeito do uso deste método na espécie
estudada, entre elas destaca-se o grande volume fecal eliminado pelo animal, girando em
torno de 10% do seu peso corporal, este fato certamente dificulta o encontro de ovos do
parasito, uma vez que estes diluídos no grande volume fecal, raramente serão detectados na
quantidade examinada (em torno de 200g). É possível que em infecções com altas cargas
parasitárias ou em experimentos onde se possa fazer mais coletas de fezes por dia, o método
possa apresentar melhor performance.
5.3- MÉTODO DE ECLOSÃO DO MIRACÍDIO
O método de eclosão do miracídio é baseado no forte comportamento de fototropismo
típico do miracídio. Tal método destaca-se pela alta sensibilidade em humanos apresentado
em estudos preliminares (Jurberg et al, 2008)
Foram feitos 2 exames, sendo o primeiro com 46 e o segundo com 126 dias após a
infecção, nenhum animal mostrou-se positivo à análise pela técnica.
A principal questão que pode ser levantada é a alta turbidez gerada das fezes bovinas,
certamente tal questão influenciou negativamente no comportamento fototrópico dos
miracídios .
41
Outra questão, já levantada no método do gradiente salínico, é o volume fecal usado
na técnica. Sabendo que o volume usado é de 500mg e que o volume fecal eliminado pelo
animal é em torno de 10% do seu peso corporal, torna-se difícil o encontro de ovos no volume
fecal usado, uma vez que os ovos eliminados nas fezes tornam-se “diluídos” nas mesmas em
animais com baixas cargas parasitárias.
Apesar de implicações no presente experimento o método pode sofrer modificações e
quem sabe e quem sabe ser útil em trabalhos de campo.
Os resultados obtidos não justificam o abandono da busca de um método
verdadeiramente eficaz ao diagnostico da esquistossomose em bovinos, visto que cada vez
mais se torna evidente a necessidade de se determinar o real papel exercido pela espécie na
manutenção do parasito em condições naturais. Emerge daí a necessidade de mais estudos
objetivando esclarecer as peculiaridades da infecção na espécie e a avaliação/adequação de
métodos já consagrados na espécie humana ou até mesmo a elaboração de um método
específico que se faça eficaz na espécie bovina.
5.4- MÉTODO ELISA (Ensaio de Imunoadsorção Associada à Enzimas)
Não foi observada variação significativa nos títulos de anticorpos à análise dos soros
dos animais.
Varias questões podem ser levantadas, embora a técnica apresente alta sensibilidade
na espécie humana, talvez uma baixa taxa de infecção nos animais estudados tenha
contribuído para a não variação considerável nos títulos de anticorpos específicos para
S.mansoni. Pode-se também cogitar a possibilidade de outras parasitoses influenciarem no
resultado do exame, visto que os animais em estudo não foram vermifugados e a técnica
aplicada para o diagnostico em humanos apresente baixa especificidade, possibilitando assim
o aparecimento de resultados cruzados.
Talvez tal técnica possa se mostrar mais eficaz em situações onde a taxa de infecção
seja maior ou em situações onde o antígeno usado seja mais específico para o parasito.
A padronização de uma técnica que realmente funcione no diagnóstico da
esquistossomose em bovinos é uma evidente necessidade. Tal instrumento subsidiará a
determinação das questões epidemiológicas que permeiam a infecção na espécie.
42
5.5- MÉTODO PCR
Uma questão que pode ser levantada na falha da técnica de PCR, para detecção do
parasito, é a possível diluição deste no grande volume sanguíneo da espécie bovina. Fato que
dificultaria o encontro de fragmentos do parasito no volume sanguíneo coletado.
Uma grande quantidade de proteínas encontradas no soro, fato que nos levou a repetir
o exame por três vezes, também pode ter influenciado nos resultados obtidos.
6- CONCLUSÃO
Após análise de resultados concluímos que o método da raspagem retal se mostrou
mais sensível ao diagnóstico de S.mansoni em bovinos nas condições experimentais
demonstradas.
43
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