UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica

AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E EFICIÊNCIA DO USO DE

CARRAGENAS EM CERVEJAS ARTESANAIS

Rafael Pissuto Pinheiro

Trabalho de Conclusão do Curso de

Farmácia-Bioquímica da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da

Universidade de São Paulo.

Orientador:

Prof. João Carlos Monteiro de Carvalho

São Paulo

2017

2

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................... 3

RESUMO.................................................................................................................. 4

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 5

2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS.................................................................... 8

3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................... 9

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 14

5. CONCLUSÃO ................................................................................................. 26

6. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................... 27

3

LISTA DE ABREVIATURAS

a.C.

Akt

ANVISA

FDA

IL-8

kDa

Antes de Cristo

Proteína Quinase B Fosforilada

Agencia Nacional de Vigilância Sanitária

Food and Drug Administration

Interleucina 8

Quilodaltons

min Minutos

mL

nm

Mililitros

Nanômetros

pH Potencial Hidrogeniônico

PIB

RPM

TK

Produto Interno Bruto

Rotações por Minuto

Timina Quinase

4

RESUMO

PISSUTO PINHEIRO, R. Avaliação da Segurança e Eficiência do Uso de

Carragenas em Cervejas Artesanais. 2017. Trabalho de Conclusão de Curso

de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas –

Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.

Palavras-chave: carragena, segurança, clarificação, cerveja artesanal.

Embora carragenas sejam amplamente utilizadas das mais diversas

formas em alimentos e seu uso seja autorizado por agências regulatórias ao

redor do mundo, ainda é possível observar conflitos de opinião acerca de sua

segurança em humanos. A produção de cervejas artesanais, em plena

ascensão no Brasil, é um dos muitos campos que fazem o uso de carragenas.

Porém, os dados de seus efeitos frente ao produto final ainda são muitos

restritos. Face ao exposto, o objetivo deste trabalho é revisar publicações

científicas relevantes no que tangem a segurança alimentar de modo a

esclarecer sua potencial toxicidade em humanos e avaliar, por meio da

produção de amostras e execução de experimentos, os impactos sobre o

produto acabado. Para a revisão bibliográfica, foram utilizados artigos

científicos, em português e inglês, acessados nas bases de dados Web of

Science e PubMed, além de alguns websites e livros. O primeiro passo foi a

busca pelos artigos, seguido pela seleção dos materiais. Prosseguiu-se, então,

com uma leitura dinâmica e com os artigos e publicações selecionados,

realizou-se a leitura aprofundada e as informações obtidas foram analisadas,

interpretadas e discutidas. Para a avaliação dos efeitos no produto final, foram

produzidas amostras com diferentes concentrações de carragenas e sacarose,

utilizada no primming, seguido da execução de experimentos visando mensurar

a turbidez, formação espuma e produção de etanol. Com os resultados dos

experimentos, fez-se a análise dos dados para correlacionar com o uso de

carragenas. Da revisão bibliográfica, temos como resultado uma série de

artigos publicados que não distinguem carragena de poligenanas, sendo a

segunda comprovadamente nociva à saúde. Outro achado comum é a

negligência à matriz alimentar, condicionando uma maior exposição da

5

carragena às mucosas do trato gastrointestinal. Além disso, pode-se afirmar

que a conversão de carragena à poligenanas não ocorre no sistema biológico.

Com relação à prática, notou-se um padrão associado com a formação de

espuma no sentido de que maiores concentrações de carragena

desestabilizam a espuma 2 minutos após sua formação, contudo, a formação

inicial não é afetada. Notou-se uma pequena variação do teor alcoólico entre

alguns experimentos. Porém, essa variação não foi atribuída à carragena, uma

vez que em experimentos analisados sob mesmas concentrações de sacarose

utilizadas no primming, não foram observadas variações significativas na

concentração de etanol. A turbidez, na faixa de 0,125 g/L a 0,25 g/L de

carragena, demonstra que a mesma auxilia no processo de clarificação da

cerveja artesanal. Porém, em altas concentrações, a própria carragena pode

interferir no produto no sentido de contribuir com sobrenadantes insolúveis e,

consequentemente, prejudicar a clarificação. Conclui-se, portanto, que

atualmente se desconhecem impactos nocivos à saúde atribuídos à carragena

e que seu uso na produção de cervejas artesanais pode contribuir na

clarificação. Contudo, faz-se a ressalva de que o uso exacerbado pode ter

efeitos não desejados à espuma e turbidez.

1. INTRODUÇÃO

Considerada a terceira bebida mais popular do mundo, atrás apenas da

água e do chá, acredita-se que a cerveja tenha sido criada por acidente.

Registros sumérios e mesopotâmios precedentes à escrita tais como desenhos

e símbolos primitivos datados de 6.000 a.C. remetem à produção de uma

bebida derivada da cevada, usada como moeda de troca na região atualmente

conhecida como Oriente Médio (NELSON, 2005).

Contudo, foi somente no século XIX com a descoberta de artefatos

babilônicos, como a Estela de Hamurabi (1760 a.C.), contendo critérios para a

produção e comercialização de cerveja, que se teve acesso aos ingredientes,

processos produtivos e leis primitivas daquela bebida que já foi considerada

pão em estado líquido (MORADO, 2009).

6

Atualmente, a cerveja tal qual conhecemos difere muito daquela bebida

original. Com o advindo do processo industrial e aditivos alimentares, que

melhoram não apenas os aspectos sensoriais, mas também prolongam a vida

de prateleira dos produtos, a cerveja tornou-se um amplo campo de estudo e

uma atividade comercial que movimenta internamente R$ 70 bilhões,

respondendo por 1,6% do PIB do Brasil e 14% da indústria nacional de

transformação (CERVBRASIL, 2015).

Embora alguns estilos de cerveja requeiram um aspecto turvo, com

sobrenadantes em seu corpo, pode-se dizer que em uma ampla gama de

estilos é desejado um aspecto translúcido. Além da recirculação em cama de

malte, resfriamento e a execução de whirpool (método físico que consiste na

execução de um rodamoinho para concentrar o material particulado no meio e

ao fundo da panela de brassagem), cervejeiros artesanais buscam clarificar as

cervejas através de métodos que fazem uso de aditivos alimentares, tais como:

ictiocola, gelatina sem cor/sabor, alginatos e pastilhas whirfloc (carragenas),

sendo este último provavelmente o método mais comum pelo fato das pastilhas

serem facilmente encontradas em casas especializadas e por estarem

presentes em kits de fabricação de cervejas artesanais.

Carragenas são extraídas de algas marinhas vermelhas das espécies

Gigartina, Hypnea, Eucheuma, Chondrus e Iridaea, da classe Rodophyta e

utilizadas na indústria alimentícia como espessantes, gelificantes e

estabilizantes. Descobertas em 1785 na cidade irlandesa de Carragheen, algas

Chondrus crispus eram utilizadas para aumentar a viscosidade do leite.

Somente em 1837 foi feita a primeira extração de carragena e em 1871, foi

patenteado, por Bourgade, um processo de purificação. Apenas em 1930, nos

Estados Unidos, foram construídas as primeiras instalações industriais para a

extração de grandes volumes para fins comerciais. Atualmente, a carragena é

extraída de algas produzidas em diversas regiões, como Marrocos, França,

Irlanda, Brasil, Chile, China e Japão (ADITIVOS & INGREDIENTES, 2016;

PEREIRA, 2012; UBM BRAZIL, 2016).

Existem três tipos de carragenas: kappa, iota e lambda; a composição

da carragena encontrada na alga está ligada à espécie e a quantidade varia

conforme luminosidade, nutrientes, oxigenação e temperatura. Trata-se de um

coloide hidrófilo, polissacarídeo de alto peso molecular, que contém entre 15%

7

e 40% de ésteres sulfato de potássio, sódio, cálcio, magnésio e amônio, e

copolímeros de D-galactose e 3,6-anidro-galactose, unidas por ligações α-(1-3)

e β-(1-4) glicosídica. As diferenças entre os tipos de carragenas são

determinadas pela posição e número de grupos éster sulfato e pela presença

ou não de 3,6-anidro-galactose. Na clarificação de cervejas, é utilizada a

kappa-carragena (Figura 1), a qual contém entre 25% e 30% de éster sulfato e

entre 28% e 35% de 3,6-anidro-galactose (ADITIVOS & INGREDIENTES,

2016; ANVISA, 2010; UBM BRAZIL, 2016; WHO, 2014).

Figura 1. Estrutura molecular da kappa-carragenana

A clarificação pelo uso de pastilhas de whirfloc é possível devido à

interação das proteínas de alta massa molar da cerveja, as quais possuem

carga parcial positiva, com resíduos de radicalares OSO3- (portanto, negativo)

presentes nos monômeros de galactose dos carragenas, fazendo assim com

que ocorra a precipitação de sobrenadantes e proteínas de alto peso molecular

(PEREIRA, 2012; UBM BRAZIL, 2016).

Contudo, acredita-se o uso exacerbado de tais aditivos pode trazer

problemas à produção, uma vez que a formação da espuma da cerveja estaria

condicionada à presença de proteínas de alto peso molecular, ou seja, uma

maior quantidade de aditivos capazes de precipitar tais proteínas ou

tratamentos excessivos com enzimas proteolíticas poderia prejudicar a

formação de espuma (SILVA, FERREIRA, TEIXEIRA, 2006).

Outro aspecto relevante ao uso de aditivos é a segurança alimentar,

pois se especula que o uso excessivo de tais substâncias, sobretudo as

carragenas, podem trazer malefícios à saúde, tais como doenças inflamatórias

intestinais e cânceres do trato gastrointestinal (MCKIM, 2014; WEINER, 2014).

A situação se torna ainda mais grave pela baixa ou inexistente fiscalização da

quantidade de aditivos usados nos meios produtivos das cervejas artesanais,

pois cervejeiros caseiros geralmente produzem para consumo próprio,

8

amigos/familiares ou então para um pequeno comércio local, sem a

necessidade de aprovação sanitária e/ou regulatória. A ANVISA publicou em

02 de dezembro de 2011 a primeira resolução aprovando o uso de carragenas

como adjuvante no processo de fabricação de cervejas (ANVISA, 2011).

Porém, não há referências de valores, mínimos máximos, para seu uso. O

FDA, por sua vez, regulamenta este uso através da CFR Title 21, de 01 de abril

de 2012 (FDA, 2012) também sem referências a valores.

2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS

O presente Trabalho de Conclusão de Curso tem como principais

objetivos: (1) revisar a segurança alimentar do uso de carragenas como

aditivos, (2) avaliar, em termos de eficiência, o uso de diferentes concentrações

de carragenas na clarificação de cervejas artesanais do tipo American India

Pale Ale e (3) relacionar tais concentrações com a formação de espuma,

avaliando também seus impactos.

A revisão sobre o uso de carragenas como aditivos alimentares é

justificada pelo fato de que muito frequentemente é possível observar conflitos

de opinião acerca de sua segurança em humanos, sendo que alguns estudos

recentes de pesquisadores ligados a relevantes institutos de pesquisa sugerem

a associação de carragenas com inflamações gástricas, câncer e até mesmo

diabetes (CORNUCOPIA INSTITUTE, 2016).

Com relação à eficiência e impacto à formação de espuma, além da

preocupação com o aspecto sensorial gerado condicionado pela espuma e

translucidez, faz-se necessária a avaliação da necessidade de utilizar insumos

que geram um maior custo ao processo produtivo de microcervejarias, as quais

frequentemente sofrem forte pressão de grandes empresas, mas ainda assim

possuem um mercado em plena ascensão de cerca de 20% ao ano,

impulsionado sobretudo pelo consumo que atinge principalmente as classes

sociais mais abastadas e exigentes do mercado (SEBRAE, 2017).

9

3. MATERIAL E MÉTODOS

Para avaliar a segurança do uso de carragenas, foi realizada uma

revisão bibliográfica, através da busca de artigos científicos, seguido de

avaliação crítica destas publicações. Foram utilizados artigos em línguas

inglesa e portuguesa, acessados nas bases de dados PubMed, SciELO,

SciFinder e Web of Science. Alguns websites e revistas online especializadas

na área também foram consultadas.

Unitermos incluindo, mas não limitando, carragena, carragenana,

clarificação, cerveja artesanal, segurança, saúde, toxicidade, polissacarídeos,

algas vermelhas, bem como suas respectivas traduções para o inglês, foram

associadas a operadores booleanos (or, and, and not, etc.) durante as buscas.

Preferencialmente, foram usados artigos publicados do ano de 2007 até a

atualidade. Contudo, exceções foram feitas dependendo do conteúdo e

impacto das publicações anteriores a este período, visto que existem diversas

publicações citam e referenciam artigos que datam do início dos anos 90.

Realizou-se a primeira seleção dos artigos e publicações através da

leitura do título e seu abstract, ou resumo, se aplicável. Em um segundo

momento, prosseguiu-se com uma leitura dinâmica, a fim de selecionar aqueles

materiais de interesse para o trabalho. Ao todo, foram selecionados 35 artigos,

publicações e websites, os quais estão aqui referenciados na bibliografia. Com

os artigos e publicações escolhidos, prosseguiu-se com a leitura aprofundada e

registro das informações extraídas. Por fim, as informações obtidas foram

analisadas, interpretadas e discutidas através de uma leitura analítica e

readequação do texto.

Na parte prática, fez-se o uso do software BeerSmith para o cálculo

das quantidades de insumos e de temperaturas utilizadas para a produção da

cerveja, as quais estão resumidamente retratadas na Tabela 1 a seguir. Trata-

se de um software americano muito popular entre os cervejeiros artesanais

devido à facilidade operacional, uma vez que lhe fornece detalhadamente como

proceder conforme o setup do equipamento disponível para fabricação e a

escolha do estilo de cerveja.

10

Tabela 1. Resumo dos dados fornecidos pelo software BeerSmith.

Item Especificação Volume de Água Inicial 18 L

Fermento Mangroove Jack's M44 10 g Lúpulo Cáscade em t=100 min 15 g Lúpulo Cáscade em t=155 min 25 g

Malte Muntons Crystal 150 150 g Malte Muntons Pale Ale Propino 4200 g

Temperatura de Mosturação 72 ºC Tempo de Mosturação 60 min

Embora o processo produtivo das amostras como um todo não seja foco

principal deste trabalho, cabe descrever ser resumidamente para a melhor

compreensão os principais passos realizados através do fluxograma da Figura

2 a seguir:

Figura 2. Fluxograma de produção.

11

Iniciou-se a mosturação, com o malte moído, em água a 72ºC (t=0) para

a extração dos açúcares que proporcionaram a fermentação e produção de

álcool. Decorridos 60 minutos de mosturação com temperatura igual a 72ºC

(t=60 min), fez-se a recirculação em cama de malte durante 40 minutos,

seguido do descarte de cascas de malte. A recirculação em cama de malte

consiste em um método físico de clarificação, no qual o mosto é retirado por

um registro ao fundo da panela de mosturação e depositado encima do malte

com o uso de uma escumadeira para “quebrar” o fluxo e impedir a formação de

caminhos preferenciais. Ao fim da recirculação, foi iniciada a fervura (t=100min)

juntamente com a primeira adição de lúpulos segundo o estilo desejado. Em

t=145 min o mosto fervente foi fracionado em 3 volumes iguais de 5 litros cada

para que as diferentes concentrações de carragenas fossem adicionadas a

cada uma das partes. Seguiu-se então com uma segunda lupulagem em t=155

min, apenas 5 minutos antes do fim da fervura.

Em t=160 min foi feito o whirpool e dado início ao processo de

resfriamento, o qual levou 30 minutos até atingir a temperatura ideal para se

inocular a levedura (28ºC) e resultou no descarte do trub grosso, que decantou

ao fundo da panela, composto basicamente por proteínas coaguladas,

sobrenadantes insolúveis derivados do malte e restos de lúpulos.

Com a inoculação da levedura hidratada em t=190 min, foi iniciado o

processo de fermentação em temperatura ambiente (cerca de 26ºC) que,

depois de decorridos 7 dias, chegou ao fim. Fez-se então o descarte do trub

fino, composto em sua grande maioria por leveduras mortas e foi dado início da

maturação em geladeira (4ºC) por mais 7 dias. Após este período a cerveja foi

envasada em garrafas com primming de sacarose para que a segunda

fermentação ocorresse dentro da garrafa e o gás carbônico ficasse dissolvido

no líquido, necessitando pelo menos mais 10 dias, e finalizando o processo.

A eficiência da técnica de clarificação foi avaliada através do preparo de

12 experimentos com a adição de diferentes concentrações de carragenas,

variando também a concentração de sacarose utilizada no primming, conforme

Tabela 2 a seguir:

12

Tabela 2. Experimentos realizados

Experimento Sacarose (g/L) Carragena (g/L)

1 0,007 0

2 0,007 0,125 3 0,007 0,25 4 0,007 0,5

5 0,01 0 6 0,01 0,125

7 0,01 0,25 8 0,01 0,5 9 0,015 0

10 0,015 0,125 11 0,015 0,25

12 0,015 0,5

A espuma foi avaliada construindo um simples aparato laboratorial

composto por suporte universal, garras e braçadeiras para o escoamento da

amostra (similar à Figura 3, a seguir), permitindo quantificar a formação de

espuma gerada pelo choque do líquido e uma proveta graduada, com o ângulo

de queda passível de reprodução com todas as amostras (CONSTANT, 1992).

Foram observados o volume de líquido e de espuma no momento seguinte ao

escoamento (inicial) e após decorridos 2 minutos, visando avaliar a estabilidade

da espuma formada.

Figura 3. Aparato para escoamento da amostra.

Também foi determinada a concentração de etanol produzido para se

verificar um possível impacto sobre sua produção quando carragenas são

13

utilizadas. Essa determinação foi feita pela adaptação do método do

microdicromato (JOSLYN, 1970), onde uma amostra de 1 mL é destilada em

um microdestilador, recolhendo aproximadamente 30 mL em um erlenmeyer

contendo 10mL de solução de dicromato de potássio de concentração

rigorosamente conhecida e em excesso. A seguir, tampa-se o erlenmeyer, que

é colocado em banho maria a 70ºC por 20 minutos para que se tenha a

completa oxidação do etanol. Após esse período e depois de seu resfriamento,

seguiu-se com a titulação com sulfato ferroso amoniacal, utilizando

ortofenantrolina como indicador.

A concentração de etanol na amostra foi obtida a partir da expressão:

E(g/L) = 11,5 x Vd x Nd x (1-Va/Vb) ; onde:

• Vb = Volume da solução de sulfato ferroso amoniacal (mL) gasto para

titular o volume Vd de normalidade Nd (19,15 mL).

• Nd = Normalidade do dicromato de potássio (0,687mol/L).

• Va = Volume da solução de sulfato ferroso amoniacal gasto para titular o

dicromato de potássio que sobrou da reação com a amostra (mL).

• Vd = Volume de dicromato utilizado para recebimento do etanol

destilado (10 mL).

• 11,5 = Equivalente grama de etanol na reação com dicromato de

potássio.

A turbidez foi avaliada através do material orgânico particulado presente

nas cervejas obtidas. Para tal, fez-se o uso de um espectrofotômetro Femto,

modelo 700 Plus, realizando leituras em 254nm em cubetas de quartzo após a

centrifugação a 8.000 RPM por 20 minutos em uma centrífuga Sorvall, modelo

RC 5C Pluse, e ressuspensão do precipitado em água deionizada para o

mesmo volume inicial. A centrifugação e ressuspensão se fez necessária para

eliminar outros pigmentos que estariam presentes e poderiam interferir na

leitura das amostras. Dessa forma, é possível inferir que as absorbâncias

obtidas das amostras se devem exclusivamente ao material sobrenadante,

sendo que, quanto maior o valor de absorbância, maior é a quantidade de

material particulado, ou seja, mais turva é a amostra.

14

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As carragenas comerciais compreendem moléculas que podem variar

de 200 a 800 kDa, mas existem também fragmentos naturais de carragenas

que variam entre 20 e 50 kDa. Elas são produzidas no interior das células das

algas vermelhas a partir de enzimas e moléculas de galactose, contudo, ao se

realizar a extração, temos moléculas de diversos tamanhos. Sob condições

específicas, a maioria das moléculas é reduzida a fragmentos que possuem

massas molares abaixo de 20 kDa, denominados poligenanas, as quais podem

ser usadas para induzir inflamação em animais de experimentação. Elas são

produzidas laboratorialmente submetendo as carragenas à hidrólise ácida (pH

0,9 a 1,3) e altas temperaturas (480 ºC) por longos períodos de tempo

(PANARAS & MARTIN, 1985). Com base no pH do estômago, nas enzimas

intestinais, nas propriedades das carragenas e no veículo utilizado, seria

possível que uma pequena parte das carragenas sofresse hidrólise à

poligenanas no trato gastrointestinal. No entanto, não foi demonstrado em nível

do trato gastrointestinal a hidrólise das carragenas à poligenanas, seja por

hidrólise ácida ou por microflora, conforme será discutido adiante.

O reconhecimento de polissacarídeos por enzimas de digestão baseia-

se principalmente no tipo de ligação glicosídica. A carragena é considerada um

polissacarídeo estrutural, que consiste em ligações glicosídicas peculiares que

não são reconhecidas por amilases ou pelas enzimas da microflora intestinal.

Isso reduz a degradação enzimática da carragena no intestino de humanos e

roedores. Em ratos e camundongos, o pH das regiões do estômago varia de 3

a 5. Em contraste, o estômago humano possui um pH que é mais ácido,

variando de 1 a 2 em jejum e de 4 a 5 na presença de alimentos, sendo o

tempo para uma refeição passar pelo estômago de cerca de 3 a 4 horas, tanto

em ratos quanto em humanos (KARARLI, 1995). Assim, logo de início já deve

se levar em conta que os estudos usando ratos e camundongos podem

apresentar desfechos diferentes se realizados em humanos. Embora tenha

sido relatado em estudos animais com ratos que a carragena administrada via

água pode ser absorvida pelo trato gastrointestinal, a quantidade foi

considerada extremamente baixa e não há evidência de absorção em seres

humanos. Além disso, em pelo menos dois estudos de Nicklin & Miller (1984,

15

1983) em que carragena foi fornecida em água, não foram observadas lesões

intestinais.

Em outro estudo, a k-carragenana foi adicionada à dieta e não houve

efeitos mensuráveis observados, incluindo nenhum achado histopatológico

(WEINER et al., 2007). Alguns estudos usando ratos em que carragena foi

fornecida em água resultaram em um aumento na atividade de um indicador de

proliferação celular no trato gastrointestinal, a timidina quinase (TK) (CALVERT

e REICKS, 1988; CALVERT & SATCHITHANANDAM, 1992; WILCOX et al.,

1992). Em um desses estudos, a carragena na dieta aumentou a proliferação

celular do cólon em cinco vezes, mas ainda assim não houve alterações

histológicas observadas (CALVERT & REICKS, 1988). Em um estudo posterior

de Calvert & Satchithanandam (1992), um aumento na proliferação celular só

foi observado na dosagem mais alta administrada, estimada em 100 vezes a

ingestão humana máxima e, ainda assim, não houve anormalidades

histológicas observadas em nenhuma das dosagens. Uma explicação plausível

para diferentes efeitos com formulações de carragena (água versus dieta com

alimentos) é que a carragena utilizada em alimento estaria menos disponível

para interação com os epitélios intestinais devido à estreita associação com

proteínas da matriz dos alimentos e a um menor tempo de trânsito no trato

gastrointestinal, ambos contribuindo para a redução à exposição às células

intestinais.

Geralmente, a comunidade científica reconhece que a carragena

intacta não é degradada à poligenanas porque as enzimas intestinais não

reconhecem as ligações glicosídicas α-(1-3) e β-(1-4) alternadas da carragena,

e carragenases não estão presentes no trato gastrointestinal humano ou

microflora. Nos seres humanos duas enzimas intestinais têm atividade em

dissacarídeos de glicose-galactose (lactose), sendo que esse dissacarídeo

possui uma ligação glicosídica β-(1-4). Embora esta enzima tenha uma

afinidade pela lactose, acredita-se também que seja capaz de reconhecer e

clivar outras moléculas com ligações β-(1-4), tal como a carragena, que possui

uma ligação α-(1-3) que se alterna com a ligação β-(1-4). Portanto, enquanto a

clivagem da carragena na ligação α-(1-3) não ocorreria, poderia ser possível na

ligação β(1-4), desde que a conformação espacial da carragena permita o

16

reconhecimento pela enzima e que se tenha um ambiente reacional adequado.

Porém, isso só foi demonstrado em condições in vitro com enzimas purificadas.

Os produtos de degradação da incubação in vitro de carragena com

galactosidases de diferentes tipos tiveram efeitos na liberação de uma citocina

pró-inflamatória, a interleucina-8 (IL-8), no epitélio do cólon humano

(BHATTACHARYYA et al., 2010; MOYER et al., 1996). No entanto, cabe

destacar que se desconhecem estes produtos de degradação in vivo e muitas

das enzimas utilizadas neste estudo não estão presentes ou são encontradas

em pequenas quantidades no trato gastrointestinal humano. Neste estudo de

Calvert & Satchithanandam (1992), as enzimas utilizadas para experiências in

vitro incluíram várias α-galactosidases recombinantes preparadas a partir de

Escherichia coli. Estas enzimas reconhecem e clivam as porções de α-

galactosil de glicolipídeos e glicoproteínas. As α-galactosidases ajudam na

digestão de moléculas derivadas de plantas presentes na dieta humana. Os

seres humanos e os animais monogástricos não possuem a enzima α-

galactosidases. Sendo assim, a degradação de galactosidases requer

suplementação dietética. Por conseguinte, estas enzimas deverão ter pouca

relevância para a degradação intestinal da carragena porque estão ausentes

ou então em concentrações muito baixas.

É quimicamente improvável ter qualquer hidrólise ácida significativa

com base nos maiores valores de pH (3-5) estomacais, temperatura do corpo

(37 ºC) e o curto período de tempo de residência no estômago (3-4h). Contudo,

estudos in vitro (EKSTROM, 1985; EKSTROM et al., 1983) são frequentemente

citados como evidências para hidrólise ácida da carragenas em poligenanas.

Estes estudos relataram que a k-carragenana era mais suscetível à

degradação do que a i-carragenana no suco gástrico simulado de pH entre 1,2

e 1,9, com degradação considerável de k-carragenana após uma incubação de

apenas 4 horas. À primeira vista essas descobertas parecem contraditórias

com os demais estudos. No entanto, há quatro advertências importantes que

devemos considerar: (1) os experimentos in vitro foram realizados na ausência

de proteína ou matriz de alimentos. A ausência de proteína aumentaria a

porção de carragena livre disponível para hidrólise. Em comparação, na

presença de proteínas alimentares a carragena estaria passível de interação

com a matriz alimentar, tornando-se significativamente menos disponível para a

17

hidrólise e reduzindo a exposição celular. (2) LiCl foi adicionado à preparação

da carragena, o que desconformaria sua estrutura e aumentaria a eficiência da

hidrólise, condição não encontrada em animais ou seres humanos. (3) O pH do

estômago dos ratos é mantido na faixa entre 3 e 5 e o pH no estômago

humano após uma refeição está entre 4 e 5 e depois diminui à medida que o

alimento sai do estômago. E (4) os estudos in vivo em que carragenas ou

poligenanas foram administrados em água devem ser vistos de forma diferente,

uma vez que a carragena na água tem ligação limitada com proteína e,

portanto, estará mais disponível para a hidrólise, assim como ocorre nos

experimentos in vitro. Além disso, a maioria dos produtos comerciais contendo

carragena destinados à exposição humana são formulados em matrizes onde

há ligação com proteínas.

Há alguns estudos em que a carragena administrada em roedores

relataram respostas proliferativas no trato gastrointestinal, que incluíram

hiperplasia e hipertrofia do intestino delgado. Esses efeitos foram mais

pronunciados e duraram mais tempo após a cessação do tratamento quando

poligenanas foram administradas (CALVERT & REICKS, 1988; CALVERT &

SATCHITHANANDAM, 1992; WILCOX et al., 1992). Ikegami et al. (1990)

compararam os efeitos de vários polissacarídeos indigestíveis, que incluíram

pectinas, carragenas, goma alfarroba, goma xantana e goma guar na dieta de

ratos em altas doses. Os resultados mostraram um aumento na espessura do

intestino delgado, ceco e intestino grosso, sendo que esses efeitos foram vistos

pelos autores como mecanismos adaptativos em resposta a agentes viscosos

indigestíveis no trato gastrointestinal. Como a presença destes agentes reduziu

a absorção de alimentos, provocando um aumento na atividade da função biliar

e pancreática, o corpo tentou melhorar a eficiência da digestão levando à

hiperplasia e hipertrofia dos órgãos digestivos, com aumento da secreção de

sucos digestivos. Dessa forma, pode-se dizer que esses efeitos fisiológicos

indiretos foram tidos como de natureza compensatória.

Em dois estudos do FDA (CALVERT & REICKS, 1988; CALVERT &

SATCHITHANANDAM, 1992), constatou-se um aumento significativo na

atividade de TK após a administração de carragenas em altas dosagens. No

entanto, não houve alterações histológicas em nenhuma das dosagens do

estudo e também não foram relatadas alterações histoquímicas. No entanto,

18

após um período de recuperação, a atividade de TK dos animais tratados com

carragenas retornou aos níveis basais, mas os animais tratados com

poligenanas tiveram níveis de atividade que permaneceram elevados,

equivalente a duas vezes em relação ao grupo controle. Em conclusão, temos

que a carragena não resultou em alterações histopatológicas em qualquer

dosagem. Embora a atividade de TK possa ser um indicador de proliferação

celular relacionada com o câncer de cólon, ela não nos fornece uma medida

direta de uma proporção aumentada de células na fase S, que poderia

relacionar a um possível mecanismo neoplásico. (IKEGAMI et al., 1990;

POKSAY & SCHNEEMAN, 1983).

Bhattacharyya et al. (2012) relataram que os camundongos expostos à

mistura λ-k-carragenanas em água tiveram um menor metabolismo de glicose,

conforme determinado por um teste de tolerância à glicose. Como a resistência

à insulina pode causar intolerância à glicose, o estudo avaliou os efeitos da

carragena em vários componentes das vias de sinalização da insulina. Essas

experiências mostraram que no fígado de camundongos expostos a carragenas

em água houve uma redução na atividade de proteína quinase B fosforilada

(Akt), sem redução na quantidade absoluta de proteína Akt . Os autores

apresentaram um mecanismo proposto para explicar esses achados em que a

carragena administrada por via oral seria absorvida a partir do intestino, entra

no fígado, se liga especificamente e ativa uma cascata de sinalização que

culminaria na redução da absorção de glicose pelo fígado. Porém, embora os

camundongos expostos a carragenas tenham mostrado uma taxa reduzida de

absorção de glicose hepática, sob as mesmas condições, os níveis globais de

glicose parecem cair dentro dos intervalos normais quando relatados por outros

pesquisadores (ANDRIKOPOULOS et al., 2008).

Além disso, acredita-se que quando administrada oralmente, a

carragena permaneça intacta à medida que passa através do intestino, uma

vez que a molécula possui um alto peso molecular e pode ser recuperada

quantitativamente nas fezes (ARAKAWA et al., 1988; UNO et al., 2001).

Com relação aos resultados experimentais do presente trabalho, os

resultados obtidos nas análises de espuma foram apresentados na Tabela 3 a

19

seguir, sendo volumes iniciais quando a amostra foi escoada para a proveta

(t=0) e volumes finais após decorridos 2 minutos do escoamento.

Tabela 3. Volumes obtidos nas análises de espuma das cervejas obtidas sob

diferentes concentrações de sacarose no primming e concentrações de carragena.

Experimento Sacarose

(g/L) Carragena

(g/L)

Volume Inicial da Fase Líquida

(mL)

Volume Final da Fase Líquida

(mL)

Volume Total Inicial (mL)

Volume Total Final (mL)

1 0,007 0 140 210 520 490 2 0,007 0,125 130 230 520 480 3 0,007 0,25 150 250 540 480

4 0,007 0,5 140 260 540 460 5 0,01 0 110 195 560 490

6 0,01 0,125 110 205 560 480 7 0,01 0,25 110 205 560 470 8 0,01 0,5 105 220 575 465

9 0,015 0 110 130 620 540 10 0,015 0,125 100 150 620 530

11 0,015 0,25 110 160 630 530 12 0,015 0,5 100 180 620 500

Visando o melhor entendimento e interpretação dos dados, calculou-se

as porcentagens de cada fração (líquido/espuma) em relação nos momentos

t=0 e t=2 min (Tabela 4), seguido da construção de gráficos comparativos

(Gráficos 1 a 6):

Tabela 4. Porcentagens correspondentes às fases nos experimentos realizados.

Experimento Sacarose

(g/L) Carragena

(g/L)

% Fase Líquida Inicial

% Espuma Inicial

% Fase Líquida Final

% Espuma Final

1 0,007 0 26,92% 73,08% 42,86% 57,14% 2 0,007 0,125 25,00% 75,00% 47,92% 52,08%

3 0,007 0,25 27,78% 72,22% 52,08% 47,92% 4 0,007 0,5 25,93% 74,07% 56,52% 43,48%

5 0,01 0 19,64% 80,36% 39,80% 60,20% 6 0,01 0,125 19,64% 80,36% 42,71% 57,29% 7 0,01 0,25 19,64% 80,36% 43,62% 56,38%

8 0,01 0,5 18,26% 81,74% 47,31% 52,69% 9 0,015 0 17,74% 82,26% 24,07% 75,93%

10 0,015 0,125 16,13% 83,87% 28,30% 71,70% 11 0,015 0,25 17,46% 82,54% 30,19% 69,81%

12 0,015 0,5 16,13% 83,87% 36,00% 64,00%

20

Gráfico 1 (esq.): Fases líquida e de espuma dos experimentos em t=0 com primming

de 0,007g/L sacarose.

Gráfico 2 (dir.): Fases líquida e de espuma dos experimentos em t=2 min com

primming de 0,007g/L sacarose.

Gráfico 3 (esq.): Fases líquida e de espuma dos experimentos em t=0 com primming

de 0,01 g/L sacarose.

Gráfico 4 (dir.): Fases líquida e de espuma dos experimentos em t=2 min com

primming de 0,01 g/L sacarose.

21

Gráfico 5 (esq.): Fases líquida e de espuma dos experimentos em t=0 com primming

de 0,015 g/L sacarose.

Gráfico 6 (dir.): Fases líquida e de espuma dos experimentos em t=2 min com

primming de 0,015 g/L sacarose.

Analisando os gráficos, temos uma melhor visualização dos dados

apresentados na Tabela 4 com o claro reconhecimento de um padrão

associado com o aumento da fase líquida em t=2 min à medida em que temos

maiores concentrações de carragena. Tal fato pode ser explicado devido à

menor estabilidade da espuma quando em maiores concentrações de

carragena, uma vez que a mesma teria proporcionado uma maior precipitação

de proteínas de alto peso molecular no processo produtivo. Além disso,

analisando as amostras em t=0 sob a mesma concentração de sacarose

(gráficos 1, 3 e 5), pode-se fazer a restrição de que a carragena impacta

apenas na estabilidade da espuma, visto que praticamente não houve variação

no valor percentual de formação de espuma, apenas uma oscilação que pode

ser decorrente da aferição operacional.

Além disso, como já era esperado, pode-se notar que houve maior

percentual de formação de espuma nos experimentos de acordo com o

aumento da concentração de sacarose adicionada como primming, resultando

em uma maior produção de gás carbônico. Assim, pode-se mais uma vez dizer

22

que a carragena não teve impactos sob a formação de espuma em si, apenas

de sua estabilidade, uma vez que maiores concentrações de sacarose

resultaram em uma maior espuma formada.

Com relação à quantificação de etanol nas cervejas obtidas sob as

diferentes condições experimentais, foram necessários volumes Va (mL) de

solução de sulfato ferroso amoniacal gastos para titular o dicromato que restou

da reação com a amostra.

Assim, aplicando a equação E(g/L) = 11,5 x Vd x Nd x (1-Va/Vb), temos

conforme a Tabela 5 a seguir:

Tabela 5. Concentrações de etanol nas cervejas obtidas sob diferentes condições

experimentais.

Experimento Sacarose (g/L) Carragena (g/L) Va (mL) Etanol (g/L) 1 0,007 0 7,40 48,48

2 0,007 0,125 7,45 48,27 3 0,007 0,25 7,30 48,89

4 0,007 0,5 7,40 48,48 5 0,01 0 7,15 49,51 6 0,01 0,125 7,20 49,30

7 0,01 0,25 7,25 49,09 8 0,01 0,5 7,20 49,30

9 0,015 0 6,80 50,95 10 0,015 0,125 6,80 50,95 11 0,015 0,25 6,90 50,54

12 0,015 0,5 6,70 51,36

Para melhor visualização dos dados, optou-se por construir o Gráfico 7 a

seguir, de concentração de primming utilizado versus a concentração de etanol.

Essa escolha foi feita uma vez que, sabidamente, os experimentos com

maiores concentrações de sacarose utilizadas como primming estariam

condicionados a uma maior formação de etanol.

Assim, para efeito de vislumbrar um possível impacto na formação de

etanol por conta da carragena, levou-se em conta a comparação de grupos

com a mesma concentração de sacarose (amostras 1-4, 5-8 e 9-12).

23

Gráfico 7. Concentração de Etanol x Primming de Sacarose.

Do gráfico 7, temos que a variação de concentração de etanol nas

cervejas entre os 3 grupos de experimentos (1-4, 5-8 e 9-12) pouco variaram,

sendo que dentro de cada grupo as concentrações possuem valores próximos,

embora a real expectativa seria de valores iguais. Assim, pode-se dizer que

essas pequenas variações possam decorrer da variabilidade experimental do

método analítico, uma vez que se acredita não ter ocorrido falha na adição de

primming de sacarose por conta das concentrações de etanol do grupo 1-4

estarem mais próximas do grupo 5-8, em comparação do grupo 5-8 com o

grupo 10-12.

Visando avaliar a turbidez das cervejas, foram obtidas absorbâncias a

254nm em duplicata para a avaliação da turbidez, seguido do cálculo das

médias, conforme disposto na Tabela 6 e Gráfico 8, apresentados a seguir.

24

Tabela 6. Absorbâncias a 254nm.

Amostra Sacarose (g/L) Carragena (g/L) Abs. 1 Abs. 2 Média Abs.

1 0,007 0 0,867 0,858 0,863

2 0,007 0,125 0,842 0,855 0,849

3 0,007 0,25 0,810 0,798 0,804

4 0,007 0,5 0,886 0,889 0,888

5 0,01 0 0,726 0,741 0,734

6 0,01 0,125 0,781 0,716 0,749

7 0,01 0,25 0,599 0,719 0,659

8 0,01 0,5 0,623 0,611 0,618

9 0,015 0 0,699 0,690 0,695

10 0,015 0,125 0,710 0,710 0,710

11 0,015 0,25 0,590 0,588 0,589

12 0,015 0,5 0,656 0,654 0,655

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Ab

sorb

ânci

a

Concentração de carragena (g/L)

0,007 g/L Sacarose

0,01 g/L Sacarose

0,015 g/L Sacarose

Gráfico 8. Absorbâncias a 254 nm correspondentes ao material suspenso nas cervejas

obtidas com uso de diferentes concentrações de carragena, sob diferentes

concentrações de sacarose no primming.

Esperava-se obter um padrão de absorbância no sentido de que, quanto

maior a concentração de carragena em amostras de mesma concentração de

25

sacarose, menor seria a absorbância, uma vez que teria ocorrido uma maior

precipitação de proteínas e material sobrenadante.

Observando-se o Gráfico 8, nota-se, que houve uma redução da

absorbância na passagem de concentração de carragena de 0,125 g/L a 0,25

g/L, independentemente da concentração de sacarose utilizada no primming.

Isso indica que a concentração de carragena de 0,125 g/L não foi suficiente

para a remoção de material particulado insolúvel da cerveja. Por outro lado, o

aumento da concentração de carragena para 0,5 g/L levou a um aumento da

absorbância, com exceção do emprego de concentração de 0,01 g/L de

sacarose no primming, o que pode ter ocorrido devido à variabilidade da

metodologia utilizada para a medida de material suspenso nas cervejas. O

aumento de absorbância decorrente do aumento de carragena no processo de

produção da cerveja se deve ao fato de que em altas concentrações de

carragena, ocorreria uma interferência na leitura da absorbância por conta da

detecção da própria carragena insolúvel, que ficaria como material residual na

cerveja.

Cabe destacar que o método clássico para quantificação de turbidez

seria com uso de um turbidímero, juntamente com a construção de uma curva

padrão de acordo com a Nota Técnica Interna NTS 008 da Companhia de

Saneamento Básico do Estado de São Paulo (SABESP). Essa técnica vem

sendo a escolhida, pois mede a luz dispersa pela partícula, uma vez que o

detector de luz fica a 90º em relação à emissão de luz. Porém, com uso de

espectrofotômetro, cujo detector de luz está situado a 180º em relação o ponto

de emissão de luz, a técnica proposta no presente trabalho mostra-se como

uma alternativa para detecção de material insolúvel em líquidos, os quais

provocam turbidez, pois permite retirar os pigmentos e outros materiais

solúveis que interferem na medida direta de absorbância nestes aparelhos. No

entanto, estudo mais aprofundados com padrões devem ser realizados para a

comprovação desta hipótese.

26

5. CONCLUSÃO

Considerando os artigos utilizados na revisão bibliográfica acerca da

segurança do uso de carragenas como aditivos alimentares, pode-se dizer que

muito do que se afirma ser potencialmente prejudicial à saúde é decorrente de

não se fazer uma distinção entre carragena e poligenanas, sendo que a

conversão da primeira à segunda em nosso organismo não ocorre ou ocorreria

em uma extensão tão baixa que não seria nociva. Além disso, cabe destacar

que em muitos testes laboratoriais in vitro ou in vivo a matriz alimentar é

negligenciada, resultando em dados que não correspondem ao que ocorre

normalmente no processo digestivo de produtos alimentícios.

Com relação à parte prática, é possível assegurar que o uso de

carragena tem impacto direto na estabilidade da espuma no sentido de

desestabilizá-la, possibilitando verificar um claro padrão associado com a

concentração de carragena utilizada. Contudo, pode-se restringir o impacto à

manutenção da espuma formada, pois a formação inicial não foi

significativamente afetada. Outro parâmetro que não se verificou alteração

notável pelo uso de diferentes concentrações de carragena foi a produção de

etanol, variando muito pouco de acordo com a concentração de sacarose

usada como primming, fato esperado devido aos diferentes aportes de fonte de

carbono disponíveis para a conversão do açúcar em álcool.

Recomenda-se então o uso de 0,25 g/L de carragena na produção de

cervejas artesanais, metade do indicado em kits de produção comercializados

no mercado, uma vez que nesta concentração temos uma maior precipitação

de materiais insolúveis e uma estabilidade de espuma intermediária, conferindo

aspectos sensoriais desejáveis à degustação.

27

6. BIBLIOGRAFIA

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