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PROJETO DE PESQUISA

AVALIAÇÃO DOS MECANISMOS ANTIOXIDANTES DO

LICOPENO EM UM MODELO DE INFLAMAÇÃO HEPÁTICA

INDUZIDA PELO PARACETAMOL (APAP) EM RATOS.

Apresentado à FAPEMIG atendendo ao Edital 01/2013– Demanda Universal

Ouro Preto

2013

Universidade Federal de Ouro Preto

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas - NUPEB

Campus Universitário Morro do Cruzeiro - ICEB II

Laboratório de Bioquímica Metabólica

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SUMÁRIO

I- JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 3

II- OBJETIVOS ................................................................................................................... 7

III- METODOLOGIA ......................................................................................................... 8

IV- CRONOGRAMA ....................................................................................................... 16

V- ATIVIDADES DOS MEMBRO DA EQUIPE ............................................................ 17

VI- INSTALAÇÕES E EQUIPAMENTOS EXISTENTES ............................................. 18

VII-RELEVÂNCIA DA PROPOSTA............................................................................... 19

VIII- ALCANCE DOS RESULTADOS E POSSÍVEIS IMPACTOS .............................. 20

IV-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................21

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JUSTIFICATIVA

O fígado é um órgão essencial para a manutenção do metabolismo corporal,

sendo responsável por funções vitais como: o metabolismo da glicose, o metabolismo e

a detoxificação de xenobióticos, a síntese de hormônios, a síntese e a degradação de

proteínas plasmáticas e também participa da regulação do sistema imune (Nemeth et al.,

2009). Ele é particularmente susceptível a agressões, pois é o primeiro a manter contato

com substâncias ingeridas oralmente como, por exemplo, bebidas alcoólicas, fármacos e

outros xenobióticos. A gravidade da lesão hepática induzida por substâncias químicas

varia entre pequenas modificações na estrutura e função desse órgão à lesões agudas,

cirrose e tumores malignos, nos casos mais graves (Gu et al., 2012).

O organismo é constantemente exposto a uma variedade de xenobióticos e

muitos deles são conhecidos por serem potencialmente hepatotóxicos (Iovdijová et al.,

2010). A utilização do acetaminofeno (APAP), também conhecido como paracetamol,

um fármaco de efeito antipirético e analgésico (Hinson et al., 2010), é a principal causa

de lesão hepática induzida por medicamentos (Reuben et al., 2010). O APAP é uma

droga segura em doses terapêuticas. Contudo, em quantidades elevadas pode causar

danos ao fígado (Larson et al., 2005) e aos rins e até mesmo levar a morte em humanos

e animais de laboratórios (Jollow, et al., 1974).

Em doses terapêuticas o APAP é rapidamente metabolizado no fígado,

principalmente, através de glucoronidação e sulfatação, e uma pequena porção é

oxidada pelo citocromo P450 2E1 (CYP2E1), para gerar um intermediário altamente

reativo e citotóxico, o N-acetil-p-benzoquinona-imine (NAPQI) (Lee, et al., 1996;

Vermeulen, et al., 1992), o qual é rapidamente conjugado pela glutationa (GSH)

hepática para gerar um produto não reativo solúvel em água, o ácido mercaptúrico

(figura 1). Depois de uma elevada dose de APAP a capacidade para glucoronidação e

sulfatação é excedida (Slattery e Levy, 1979; Prescott, 1980; Hjelle e Klaassen, 1984) e

uma grande quantidade de NAPQI é formada via citocromo P450 2E1 (Hjelle e

Klaassen, 1984), resultando em uma rápida depleção nas concentrações de glutationa

(GSH). A depleção de glutationa conduz a um aumento na produção de espécies

reativas de oxigênio (EROs), conduzindo a um dano celular e, finalmente, a um dano

hepático (Rousar et al., 2012). Subsequentemente, o NAPQI se liga covalentemente a

proteínas celulares, principalmente as proteínas mitocondriais, também levando a lesão

hepática (figura 1) (Saito et al., 2010, Jaeschke et al., 2011).

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Figura 1: Metabolização hepática do paracetamol

Fonte: Gilmar, 2001, p. 517

Sendo assim, o estresse oxidativo é um dos mecanismos postulados ter

importância no desenvolvimento da toxicidade do APAP (James et al., 2003). Apesar de

muitas vias estarem envolvidas na produção de EROS, uma fonte importante nas lesões

inflamatórias é a NADPH oxidase. A NADPH-oxidase é formada por subunidades de

membrana, como gp91phox

, p22phox

, formando o citocromo b558 e subunidades

citosólicas, como p47phox

, p67phox

, p40phox

e GTPases Rac1 ou Rac2 (Forman et al.,

2001). Em células quiescentes, esse sistema enzimático de multicomponentes não está

ativado. A ativação desta enzima conduz a translocação de GTPase Rac, p47 e p67phox

para a membrana plasmática, onde p67phox

interage através de seu domínio de ativação

com as subunidades ligadas a membrana. Esta interação é requerida para a ativação da

oxidase e facilita a transferência de elétrons do NADPH para o oxigênio (Brandes et al.,

2005). A NADPHoxidase então catalisa a redução de oxigênio a ion superóxido pela

doação de um elétron, à custa do NADPH (Brandes et al., 2005). Ion superóxido pode

rapidamente reagir com o óxido nítrico, formando peroxinitrito, uma molécula oxidante

e altamente citotóxica (Beckman and Koppenol, 1996).

Atualmente, há um crescente interesse em avaliar o potencial terapêutico de

produtos naturais que apresentam capacidade hepatoprotetora. Neste sentido, o dano

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hepático induzido por APAP é um modelo atrativo e amplamente utilizado, pois é

clinicamente relevante e experimentalmente conveniente por ser de baixo custo e de

fácil execução (Jaeschke et al., 2011). Vários estudos tem demonstrado a capacidade de

antioxidantes de origem natural em prevenir a toxidade em órgãos vitais (Küpeli et al.,

2006; Wang et al., 2010; Wu et al., 2008, 2010; Yuan et al., 2010; Jaeschke et al.,

2011). Neste contexto, sabe-se que o licopeno é um carotenóide lipossolúvel,

sintetizado por diversas plantas e microrganismos, sendo responsável pela cor vermelha

de muitas frutas e vegetais, tais como os tomates (Rao et al., 2007). Estudos recentes

sugerem que uma dieta rica em licopeno é capaz de reduzir os riscos de doenças graves

como o câncer (Giovannucci et al., 1999; Teodoro et al., 2012; Qiu et al., 2013) e

doenças cardiovasculares (Rao et al., 2002; Palozza et al., 2012; Giordano et al., 2012).

O licopeno além de ser um composto comum na dieta é o carotenóide com maior

atividade antioxidante, sendo capaz de neutralizar espécies reativas. Estudos já

demonstraram que o licopeno é capaz de atuar modulando a expressão de enzimas do

citocromo P450 (Palozza et al., 2012) e também a atividade de enzimas antioxidantes

(Hadad et al., 2012), ambas as vias relacionadas à inflamação induzida pelo APAP. De

fato, o licopeno tem sido reportado como um inibidor de espécies reativas de oxigênio

(EROs) (Di Mascio et al., 1989; Aidin et al., 2012), óxido nítrico (NO) e citocinas pró-

inflamatórias (Britton et al., 1995), além de afetar as vias de sinalização envolvidadas

em processos inflamatórios, incluindo NADPH oxidase (Di Mascio et al., 1989) e

proteína cinase C (PKC), que desempenha papel importante da ativação da NADPH

oxidase (Gopalakrishna et al., 1992).

Estudos sugerem que o licopeno pode desempenhar um importante papel em

doenças relacionadas ao estresse oxidativo. Entende-se por estresse oxidativo a

condição na qual as defesas celulares antioxidantes não são suficientes para inativar

completamente as espécies reativas. Este desequilíbrio é gerado devido a produção

excessiva de espécies reativas, pela perda de defesas antioxidantes, ou ambos, e pode

causar danos à lipídios, proteínas e ao DNA (Dalle-Done et al., 2006). Entretanto, os

mecanismos do estresse oxidativo não se limitam apenas aos danos macromoleculares

causados por radicais livres, havendo também efeitos sobre a sinalização redox. Desta

forma, o estresse oxidativo pode ser contemporaneamente definido como uma disfunção

da sinalização redox e dos mecanismos de controle (Jones, 2006).

Células e tecidos contêm mecanismos de defesas antioxidantes que previnem a

produção de espécies reativas e mantêm o balaço redox da célula ou tecido (Rains e

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Jain, 2011). Os antioxidantes de forma geral podem ser enzimáticos ou não enzimáticos

(Vincent, 2004; Sies, 1993).

Dentre as principais enzimas antioxidantes, destacam-se a superóxido dismutase

(SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx). A enzima SOD é capaz de

converter o ânion superóxido (•O2-) em peróxido de hidrogênio (H2O2) (Marklund et al.,

1982). O H2O2 formado pela SOD é rapidamente difundido através da membrana

mitocondrial e transformado em água por enzimas antioxidantes como CAT e pela GPx

(Naudi et al., 2011). A catalase é uma hemoproteína que se localiza nos peroxissomos e

catalisa a detoxificação do peróxido de hidrogênio em oxigênio e água (Aebi, 1984). A

GPx é uma enzima dependente de selênio que ao catalisar o peróxido de hidrogênio e

outros peróxidos converte a glutationa reduzida para o seu estado oxidado. Por isso

outra enzima fundamental é a glutationa redutase, que regenera a glutationa usada como

doadora de hidrogênio pela GPx durante a eliminação do H2O2 (Johansen et al., 2005).

A maioria dos antioxidantes enzimáticos, como SOD, GPx, catalase estão

abundantemente expressos no fígado, sendo este o principal órgão envolvido em

processos oxidativos e de detoxificação (Stadler et al. 2003).

Sendo assim, considerando as propriedades antioxidantes do licopeno

demonstradas in vivo e in vitro (Wertz et al., 2004), e as evidências de que o licopeno

também atua como um agente anti-inflamatório (Kim et al., 2004, Siler et al., 2004),

este estudo terá como fundamento avaliar o efeito do licopeno nos possíveis

mecanismos envolvidos na modulação do estresse oxidativo em um modelo de

inflamação induzido por APAP.

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OBJETIVO

Avaliar os mecanismos antioxidantes do licopeno em um modelo de inflamação

hepática induzida pelo APAP em ratos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Na primeira fase deste projeto, teremos como objetivo primordial avaliar o efeito do

licopeno sobre marcadores de função hepática, renal e perfil lipidico. Como objetivos

específicos teremos:

► Em soro de ratos intoxicados com APAP e submetidos ou não ao tratamento com

licopeno avaliaremos:

1. Alanina aminotransferase (ALT) e aspartato amino transferase (AST);

2. Creatinina e Uréia;

3. Triacilgliceróis, Colesterol total e HDL;

► Análise histológica

Na segunda fase deste projeto, teremos como objetivo primordial avaliar o efeito do

licopeno sobre o balanço oxidante/antioxidante no fígado de ratos intoxicados com

APAP. Como objetivos específicos teremos:

1. Quantificação das espécies reativas de oxigênio (EROs) e óxido nítrico (NO);

2. Avaliação da atividade das enzimas antioxidantes (SOD, Catalase, Glutationa

Peroxidase e Redutase);

3. Avaliação da concentração de Glutationa total e a relação glutationa reduzida (GSH)/

glutationa oxidada (GSSG)

Na terceira fase deste projeto, teremos como objetivo primordial avaliar os

mecanismos responsáveis pela modulação do estresse oxidativo induzido pelo licopeno

no fígado de ratos intoxicados com APAP. Como objetivos específicos teremos:

1. A avaliação da expressão do RNA-m para as sub-unidades da NADPH oxidase e

óxido nítrico sintase;

2. A avaliação da expressão do RNA-m para mediadores inflamatórios, tais como: IL-8,

TNF-alfa, IL-1 beta;

3. Avaliação da atividade da proteína cinase C;

4. Avaliação da expressão protéica das sub-unidade citosólicas, p47phox

e p67phox

, da

NADPH oxidase, NO sintase e a enzima CYP 2E1

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METODOLOGIA

1. DESENHO EXPERIMENTAL:

Serão utilizados 48 ratos machos da linhagem Fischer, com massa corporal de

aproximadamente 200g, provenientes do biotério do Laboratório de Nutrição

Experimental da Universidade Federal de Ouro Preto. Os animais serão acondicionados

em grupos de 5 por gaiola, com temperatura, umidade e luminosidade controladas e

receberão água e ração padrão balanceada ad libitum.

O presente trabalho será realizado de acordo com as normas internacionais de

proteção aos animais e com os princípios éticos do Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal, já tendo sido aprovado pela Comissão de Ética no Uso de

Animais (CEUA) da UFOP (protocolo no. 2012/40).

Os animais serão divididos nos seguintes grupos: Grupo Controle – receberá

1mL de água via gavagem, Grupo Controle Óleo – receberá 1 mL de óleo de girassol

por gavagem, Grupo Licopeno – receberá 10 mg/kg de licopeno diluído em 1 mL de

óleo de girassol por gavagem, Grupo APAP – receberá dose diária de 835 mg/kg de

APAP por gavagem; Grupo APAP Óleo – receberá óleo de girassol e 1 hora depois

receberá uma dose de 835 mg/kg de APAP por gavagem; e Grupo APAP + Licopeno –

receberá 10 mg/kg de licopeno diluído em 1 mL de óleo de girassol e 1 hora depois

receberá uma dose de 835 mg/kg de APAP por gavagem.

O tratamento com o licopeno será realizado durante 14 dias consecutivos

(Jamshidzadeh et al., 2008). Os animais serão eutanasiados 24 horas após a última dose

de licopeno. A dose de APAP necessário para indução de dano hepático foi previamente

padronizado em nosso laboratório por Pádua et al., 2010.

2. MODELO DE INFLAMAÇÃO INDUZIDO POR ACETAMINOFENO

(PARACETAMOL)

O Paracetamol (APAP) é uma droga analgésica e antipirética segura em doses

terapêuticas. Contudo, em quantidades elevadas pode causar danos ao fígado e aos rins

e até mesmo levar a morte em humanos e animais de laboratórios (Jollow et al., 1973).

Em doses terapêuticas o APAP é rapidamente metabolizado no fígado,

principalmente, através de glucoronidação e sulfatação, e uma pequena porção é

oxidada pelo citocromo P450 2E1, para gerar um intermediário altamente reativo e

citotóxico, o N-acetil-p-benzoquinona-imine (NAPQUI) que é rapidamente conjugado

pela glutationa (GSH) hepática para gerar um produto não-reativo solúvel em água, o

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ácido mercaptúrico (Lee et al., 1996, Vermeulen et al., 1992). Depois de uma overdose

de APAP a capacidade para glucoronidação e sulfatação é excedida (Slattery et al.,

1979) e uma grande quantidade de NAPQUI é formada via citocromo P450 2E1,

resultando em uma rápida depleção nas concentrações de GSH (Mitchell et al., 1973).

Subseqüentemente, NAPQUI se liga covalentemente no DNA e proteínas das células

hepáticas parenquimais, resultando em uma injúria hepática (Corcoran et al., 1980).

Em adição a esses eventos, recentes evidências sugerem que mediadores

inflamatórios tais como citocinas, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio liberadas

pelas células de Kupffer/macrófagos e leucócitos polimorfonucleares (Ishida et al.,

2002) tem sido implicadas na hepatoxicidade induzida por altas doses de APAP (Blazka

et al., 1995), o que de certa forma, o torna bastante utilizado em modelos experimentais

que visam descobrir compostos naturais com propriedades antioxidantes e

antiinflamatórias. Os ratos do projeto receberão uma dose diária de 835mg/kg de

acetaminofeno (Yen, et al., 2008; Pádua et al., 2010).

3. AVALIAÇÃO DA INJÚRIA HEPÁTICA INDUZIDA POR APAP

Para avaliar a injúria hepática induzida por APAP serão utilizados dez ratos,

divididos em dois grupos de cinco animais de acordo com o tratamento recebido: grupo

controle (C), o qual receberá, por gavagem, 600 mg/kg de PBS e o grupo APAP, que

também, por gavagem, receberá uma dose única de 835mg/kg de APAP. Em diferentes

intervalos de tempo amostras de sangue serão coletadas, via plexo ocular, para a

quantificação da atividade da ALT (alanina aminotransferase) e AST (aspartato

aminotransferase) em resposta a uma elevada dose de APAP.

4. ANÁLISE DOS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS DO SORO

As dosagens de colesterol total, triacilgliceróis, HDL, enzimas hepáticas (ALT e

AST), creatinina e uréia serão feitas com soro. As dosagens serão realizadas a partir de

kits comerciais do laboratório LABTEST® (Lagoa Santa, MG, Brasil).

5. EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL PARA PCR QUANTITATIVA EM TEMPO

REAL

A extração de RNA total será realizada utilizando o kit "Purelink Micro-to-Midi

Total RNA purification system" (Invitrogen). A cada amostra será adicionado 1 mL de

Trizol e com auxílio de um politron, por aproximadamente 1 minuto todo material será

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completamente solubilizado. Em seguida, a mistura será incubada por 5 minutos a

temperatura ambiente. Depois da extração do RNA, fases de separação com

clorofórmio, e precipitação com isopropanol e etanol 70%, como descrito pelo método

acima, procede-se à lavagem e eluição do ácido nucléico. Todo material eluido será

descartado e a coluna transferida para o tubo coletor onde o RNA será eluido em 30 L

de água livre de RNAse e incubado por 1 minuto. Para separar o RNA total da amostra,

este será centrifugado por 12.000 g por 2 minutos, e mantido a -80ºC até o uso.

5.1. QUANTIFICAÇÃO DO RNA

As concentrações de RNA serão estimadas a partir da medida de absorbância a

260nm. Uma unidade de absorbância a 260nm corresponde aproximadamente a

40µg/mL para RNA e DNA de fita simples. O grau de pureza da preparação será

estimado através da relação entre as leituras a 260 e 280nm.

5.2. PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL

A qPCR será usada para determinar a expressão do mRNA da NADPH oxidase,

óxido nítrico sintase induzida (iNOS) e as citocinas pró-inflamatórias. O uso da qPCR

será útil para comparar o nível de expressão das sub-unidades da NADPH oxidase,

iNOS e citocinas em fígado de ratos intoxicados com APAP submetidos ou não ao

tratamento com licopeno, dando uma idéia a respeito das mudanças da expressão que

ocorrem durante o tratamento.

Para tal, oligonucleotídeos iniciadores serão construídos com base nas

sequências das subunidades da NADPH oxidase, iNOS, IL-8, TNF- e IL1β de Rattus

norvegicus, disponíveis no banco de dados GenBank (National Center for

Biotechnology Information GenBank). Os iniciadores serão desenhados com o auxílio

do programa OLIGO 4.0 e depois analisados quanto à especificidade utilizando o

programa BLAST (ALTSCHUL et al., 1997), disponível na página do NCBI (National

Center for Biotechnology Information).

O cDNA será obtido através da reação de transcrição reversa (RT-PCR),

utilizando-se o iniciador oligo dT e a enzima MutiScribeTM Reverse Transcriptase

(Applied Biosystems), conforme o manual do fabricante. O cDNA obtido de cada

reação será utilizado como molde nas reações de qPCR, que serão feitas em triplicata,

utilizando o kit Platinum SYBR green qPCR SuperMix-UDG ROX (INVITROGEN),

conforme o manual do fabricante. O aparelho utilizado para a qPCR será ABI 7500

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(Applied Biosystems). O gene constitutivo -actina será utilizado também em reações

para normalizar a quantidade interna de RNA. As análises serão feitas utilizando o

método do ∆∆Ct, utilizando a fórmula 2-∆∆Ct, para calcular a expressão gênica relativa

dos genes em estudo, conforme boletim técnico do fabricante do aparelho de qPCR

(Applied Biosystems).

6. WESTERN BLOT

Será utilizada a técnica de Western Blot para verificar se ocorrerá mudanças no

padrão de expressão das proteínas das sub-unidades da NADPH oxidase, óxido nítrico

sintase (NOS)e da enzima CYP 2E1 em animais submetidos ou não ao tratamento. Os

homogenizados de fígado serão preparados em 0,2% de NP40, 1 M DTT, 1mM de

EDTA, 10mM de Tris e 1% de inibidor de protease (Sigma Aldrich, St. Louis, MO,

USA. O tecido será homogenizado em politron e posteriormente centrifugado a 4°C,

durante 90 minutos a 13000 g, retirando o sobrenadante e aliquotando a amostra. As

proteínas serão separadas por gel de poliacrilamida 10-12% e transferidas para

membranas de fluoreto de polivinilideno (GE Healthcare). Posteriormente as

membranas serão lavadas com TBS-T e colocadas na solução de bloqueio (TBS-T e

leite desnatado 10%). Após o bloqueio, a membrana será incubada durante a noite a 4oC

com os anticorpos primarios policlonais p47, p67, NOS e CYP2E1 e a β-actina será

usada para normalizar a intensidade das bandas entre as amostras. Em seguida, as

membranas serão lavadas com TBS-T e incubadas durante 3 a 4 horas em temperatura

ambiente com anticorpo secundário anti-imunoglobulina de coelho unido a peroxidase.

Será utilizado o sistema de revelação por quimioluminescência, usando o kit ECL-plus

(GE Healthcare).

7. DEFESAS ANTIOXIDANTES

7.1 ATIVIDADE DA SUPERÓXIDO DISMUTASE

Para se obter a atividade da enzima superóxido dismutase será utilizado o

Superoxide Dismutase Assay Kit-Cayman Chemical. Este kit utiliza um sistema de

geração de ânions superóxido, xantina e xantina oxidase, e avalia a capacidade da

solução teste, sob condições padrões, em inibir a reação do ânion superóxido com o

WST (2-(4 iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio). Esta reação quando ocorrida

forma um composto denominado formazan, o qual absorve luz à 450nm.

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7.2 ATIVIDADE DA CATALASE

A determinação da atividade da enzima catalase é baseada na sua capacidade de

clivar o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio molecular, conforme

descrito por Aebi, 1984 (40). Para a determinação da atividade da catalase em

neutrófilos será utilizado o EnzyChromT Catalase Assay Kit- Biossays.

7.3. GLUTATIONA TOTAL, OXIDADA E REDUZIDA

A glutationa está presente nas células principalmente na sua forma reduzida

(GSH) representando em torno de 90%, o restante aparece na forma de glutationa

oxidada (GSSG). Esta dosagem foi adaptada do kit comercial Sigma #CS0260, e utiliza

um método cinético para mensurar os níveis de glutationa total (GSH+GSSG) em

amostras biológicas, através da redução do DTNB (Ácido 5,5´-Ditio-bis-(2-

nitrobenzóico) à TNB.

Para realização da dosagem, amostra de 100mg de tecido hepático será

homogeneizada com 1mL de ácido de sulfosalicílico 5% (SSA), e em seguida

centrifugado a 10.000 g por 10 minutos à 4ºC. O sobrenadante será retirado e usado

como amostra biológica.

Inicialmente serão adicionados aos poços 150 μl da mistura de trabalho que

contém glutationa redutase, DTNB, e 100 mM tampão fosfato de potássio. Em seguida

será adicionado 10 μl de amostra para os testes e 10 μl de 100 mM tampão fosfato de

potássio para o branco. As amostras serão incubadas por 5 minutos e em seguida a

reação será iniciada com a adição de 50 μl de solução de NADPH. Com o início da

reação, a absorbância será imediatamente medida a 405 nm utilizando um leitor de placa

de ELISA (Biotek ELx808). Para mensurar os níveis de glutationa oxidada, o

procedimento será o mesmo, porém a amostra biológica passa por um processo de

derivatização antes do início da dosagem. Para isso deve ser feito uma alíquota de 100

μl de amostra e acrescentado à esta 2 μl de vinilpiridina e 3 μl de TEA. Esta nova

amostra deverá ter o pH entre 6 e 7 e ficará incubada por uma hora. Após este período,

será utilizado 10 μl desta nova amostra para reagir com a mistura de trabalho, como

anteriormente descrito.

As concentrações de glutationa total e oxidada serão obtidas através de uma

curva padrão realizada para cada uma das dosagens. A subtração da concentração de

glutationa oxidada do valor da concentração da glutationa total fornecerá o valor da

concentração da glutationa reduzida.

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7.4. ATIVIDADE DA GLUTATIONA PEROXIDASE (GPX)

A atividade da enzima glutationa peroxidase será mensurada utlizando o

“Glutathione Peroxidadse Activity Kit” (Assay Designs Inc., catalog #900-158,

Michigan, EUA) adaptado. O ensaio é baseado na oxidação da glutationa reduzida a

oxidada catalisada pela enzima glutationa peroxidase. A glutationa oxidada por sua vez

é reciclada e convertida de volta a glutationa reduzida pela enzima glutationa redutase

utilizando NADPH. O decréscimo na absorbância medida a 340nm durante a oxidação

do NADPH a NADP+ é indicativo da atividade de glutationa peroxidase.

Para realização da dosagem, uma amostra de 40mg de tecido hepático será

homogeneizado em 200 μl de tampão de ensaio proveniente do kit contendo 0,4 mM do

inibidor de protease PMSF e 1% de Triton x-100. O homogenato será centrifugado a

1.000g por 15 minutos a 4˚C, o sobrenadante será coletado para ser utilizado como

amostra.

Em cada poço serão adicionados 200μl do tampão de ensaio contido no kit com

pH 7,0, 20 μl do mix de reação (contendo glutationa reduzida, NADPH, glutationa

redutase e azida sódica), e 20 μl de amostra para os testes, padrão de glutationa

peroxidase para o controle positivo, e tampão de ensaio para o branco. A reação será

iniciada ao serem adicionados 20 μl de H2O2 a todos os poços. A absorbância será

imediatamente medida a 340 nm utilizando um leitor de placa de ELISA (Biotek

ELx808).

7.5. ATIVIDADE DA GLUTATIONA REDUTASE (GR)

A atividade da enzima glutationa redutase será determinada utilizando o

“Glutathione Reductase Assay kit” (Sigma, Missouri, EUA). O ensaio é baseado na

redução da glutationa pelo NADPH em presença de glutationa redutase.

Uma amostra de 50mg de tecido hepático será homogeneizada com 500 μl de

tampão proveniente do kit (10 mM fosfato de potássio pH 7,5, 1 mM EDTA e 1mg/ml

de albumina bovina sérica). O homogenato será centrifugado a 1.000g por 15 minutos a

4˚C e o sobrenadante foi coletado para ser utilizado como amostra.

Em cada poço será adicionado 125 μl de 2 mM glutationa oxidada, 40 μl de

tampão de ensaio proveniente do kit, 10 μl de amostra para os testes, padrão de

glutationa redutase para o controle positivo, e tampão de ensaio para o branco. Em

seguida serão adicionados 62,5 μl de 3 mM DTNB e a reação será iniciada ao adicionar

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12,5 μl de 2 mM NADPH em todos os poços. A absorbância será imediatamente medida

a 412 nm utilizando um leitor de placa de ELISA (Biotek ELx808).

8. AVALIAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (EROS)

A avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) será

realizada utilizando o Kit Image-iT™ LIVE Green Reactive Oxygen Species

(Invitrogen®) que permite a detecção de EROs intracelular por citometria de fluxo. A

técnica utiliza um marcador fluorogênico não fluorescente (5-ou-6)-carboxy-2′,7′

dichlorodihydro fluorescein diacetate (carboxy-H2DCFDA), que quando clivado por

esterases intracelulares não específicas, gera a molécula carboxy-DCFH que é

susceptível a reagir com as EROs não específicas tornando-se fluorescente. A inibição

da produção de EROs será realizada através do bloqueio da enzima NADPH oxidase. O

Diphenyleneiodonium chloride (DPI) é capaz de inibir a enzima NADPH oxidase. A

aquisição dos dados será realizada em citômetro de fluxo BD FACSCalibur™,

utilizando o software CellQuestTM

.

9. QUANTIFICAÇÃO DE ÓXIDO NITRICO (NO)

Em soluções aeróbias aquosas, o nitrito é o principal metabólito estável da

decomposição do óxido nítrico (Ignarro et al., 1993). Assim, a produção de óxido nítrico

será avaliada indiretamente pela quantificação de nitrito, segundo a reação de Griess. O

tecido hepático será homogenizado em PBS (pH 7.4) e centrigugado a 10000g a 4oC. Em

seguida o sobrenadante será recolhido e utilizado para a dosagem de nitrito, utilizando-se

o Kit QuantiChrom TM

Nitric Oxide Assay Kit da BioAssay Systems®.

O conteúdo da placa será analisado em leitor de ELISA, no comprimento de onda

de 540nm. A concentração de nitrito será calculada por regressão linear, utilizando a

curva padrão obtida a partir de uma solução de nitrito de sódio 1mM em RPMI. Na

obtenção da curva padrão, r2 deverá ser sempre superior a 0,98.

10. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA PROTEÍNA CINASE C (PKC)

A atividade da enzima PKC será realizada utilizando o kit PKC kinase activity

da Enzo Life Sciences®. Este método utiliza um peptídeo sintético específico como

substrato para PKC e um anticorpo policlonal que reconhece a forma fosforilada do

substrato. A leitura será feita em leitor de ELISA.

15

11. ANÁLISE HISTOLÓGICA

O fígado dos ratos será removido ao final de cada experimento e fixado em

formol tamponado a 4%. Fragmentos do fígado de até 4mm de diâmetro serão fixados

em uma solução de formaldeído 4%. Em seguida serão desidratados e embebidos em

parafina. O tecido hepático será fixado e processado em série decrescente de alcoóis e

posteriormente embebido em parafina. Secções parafinadas de aproximadamente 4μm

serão obtidas em micrótomo semiautomático, montadas e coradas pela técnica

Hematoxilina & Eosina (H&E), para visualização de dano histológico. As análises

morfométricas serão realizadas no Laboratório Multiusuários do NUPEB.

Fotomicrografias serão obtidas em microscópio óptico Leica com o software de análises

DM5000 do Leica QWin Plus versão 3.0 (Leica Microsystems INc., Buffalo Grove, IL,

USA).

12. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados serão expressos em média ± erro padrão da média. Utilizaremos

P<0,05 como valor de significância e o teste estatístico one-way ANOVA seguido do

pós-teste de Tukey para dados paramétricos e o teste de Kruskal Wallis seguido do pós-

teste de Dunns para dados não paramétricos. A análise estatística será realizada com o

auxílio do software GraphPad Prism versão 5.

16

CRONOGRAMA

BIMESTRE

ATIVIDADE A SER DESENVOLVIDA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1ª ETAPA DOS OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obtenção dos animais, tratamento com licopeno e

eutanásia para coleta do soro e fígado

Procedimento já realizado

Avaliação dos marcadores de função hepática, renal e

perfil lipídico

Procedimento já realizado

Análise histológica X

2ª ETAPA DOS OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Quantificação das espécies reativas de oxigênio

(EROS) e óxido nítrico (NO);

X X

Avaliação da atividade das enzimas antioxidantes

(SOD, Catalase, Glutationa Peroxidase e Redutase)

X X

Avaliação da concetração de Glutationa total e a

relação GSH/ GSSG.

X X

Processamento do resultados e análises estatísticas X

Elaboração de manuscrito X

3ª ETAPA DOS OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Expressão gênica das subunidades da NADPH

oxidase, óxido nítrico sintase e citocinas

X X

Avaliação da expressão protéica de p47phox

e p67phox

da

NADPH oxidasde, NO sintase e a enzima CYP 2E1

X X X

Avaliação da atividade da proteína cinase C X

Processamento do resultados e análises estatísticas X

Elaboração de manuscrito X

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IDENTIFICAÇÃO DOS DEMAIS PARTICIPANTES DO PROJETO

1. Nome: Marcelo Eustáquio Silva

Titulação: Doutor

Departamento: de Alimentos - Escola de Nutrição – UFOP

Função: Colaborador. Ficará responsável por prover a estrutura do biotério e

manutenção dos ratos.

2. Nome: Wanderson Geraldo de Lima

Titulação: Doutor

Departamento: Ciências Biológicas (DECBI) – UFOP

Função: Colaborador. Auxiliará nas análises histológicas.

3. Nome: Cintia Lopes de Brito Magalhães

Titulação: Doutora

Departamento: Ciências Biológicas (DECBI) – UFOP

Função: Colaboradora. Auxiliará nas análises de expressão protéica.

4. Nome: Frank da Silva Bezerra

Titulação: Doutor

Departamento: Ciências Biológicas (DECBI) - UFOP

Função: Colaborador. O professor é co-orientador da tese de doutorado da aluna Ana

Carla Balthar Bandeira e auxiliará nas dosagens das enzimas antioxidantes, na discussão

de resultados e na confecção de manuscritos.

5. Nome: Ana Carla Balthar Bandeira

Titulação: Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

(NUPEB)/UFOP.

Função: Executora. A segunda e terceira fase dos objetivos específicos farão parte da

tese de doutorado da referida aluna.

6. Nome: Talita Prato

Titulação: Mestranda do programa de Pós-Graduação em Saúde e Nutrição/Escola de

Nutrição/UFOP. Função: Executora: O primeiro objetivo específico fará parte da

dissertação de mestrado da aluna.

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DISPONIBILIDADE EFETIVA DE INFRA-ESTRUTURA

1. INFRA-ESTRUTURA

O tratamento dos ratos será realizado no Biotério do Laboratório de Nutrição

Experimental, Escola de Nutrição, UFOP com a colaboração do prof. Marcelo

Eustáquio Silva. As dosagens bioquímicas, os ensaios de expressão molecular e western

blot serão realizados no Laboratório de Bioquímica Metabólica (LBM), do qual faço

parte. O LBM apresenta equipamentos como, espectrofotômetro, centrífugas

termociclador, transluminador, leitor de Elisa, cubas para eletroforese, blot de

transferência, entre outros. A análise histológica será realizada no laboratório de

Patologia, coordenado pelo prof Wanderson Geraldo de Lima. O citômetro de fluxo, o

microscópio utilizado nas análises histológicas e o Real Time fazem parte dos

equipamentos presentes no Laboratório Multi-Usuários do NUPEB, do qual também

faço parte. Sendo assim, apresento toda a infra-estrutura necessária para a execução

deste projeto, necessitando apenas de materiais de consumo para a realização do

mesmo.

2. APOIO TÉCNICO

Sr. Jair Pastor - Bioterista do Laboratório de Nutrição Experimental, UFOP.

Sra. Renata Rebeca - Laboratorista do Laboratório de Bioquímica Metabólica, UFOP.

19

RELEVÂNCIA DA PROPOSTA

A inflamação é um processo protetor e essencial para a preservação da

integridade do organismo, mas é freqüente que a resposta inflamatória provoque lesões

severas ocasionando erroneamente danos em tecidos normais (Brandes et al., 2005). Um

exemplo importante deste mecanismo de lesão é a produção de espécies reativas do

oxigênio, como ânions superóxido, peróxido de hidrogênio e peroxinitrito. Sabe-se que

a intoxicação com APAP está associada a um aumento do estresse oxidativo (Jaeschke,

1990), uma diminuição de enzimas antioxidantes, e indução do citocormo P450 2E1

(Jaeschke et al., 2011). O dano hepático induzido pelo APAP é um modelo clinicamente

relevante e adequado para testar a eficácia de produtos naturais com potencial

hepatoprotetor. Dado o amplo conhecimento dos mecanismos envolvidos no dano

hepático induzido pelo APAP, este modelo pode ser utilizado para investigar os

mecanismos de ação terapêutica de diferentes produtos naturais (Jaeschke et al., 2011).

Neste sentido o licopeno, carotenóide presente no tomate, e em algumas frutas e

vegetais, apresenta potencial antioxidante desempenhando um papel importante na

prevenção de doenças crônicas, principalmente àquelas que têm como seu mecanismo

principal eventos relacionadas a processos oxidativos e inflamatórios (Catalano et al.,

2013; Aydin et al., 2012). Embora os vários efeitos benéficos do licopeno já tenham

sido descritos, incluindo a capacidade de atuar como agente anti-oxidante(Palozza et al.,

2011), inibir processos inflamatórios (Palozza et al., 2010a) e melhorar a resposta imune

(Chew and Park, 2004), os mecanismos pelos quais o licopeno pode modular estes

efeitos e como isto poderia contribuir para minimizar os danos observados em doenças

crônicas ainda permanece desconhecido.

Sendo assim, uma vez que já foi demonstrado que o licopeno pode inibir a

expressão de citocinas inflamatórias e reverter a perda de enzimas antioxidantes

induzida por processos inflamatórios (Reifen et al., 2006), e que a diminuição de

antioxidantes, representado principalmente pela depleção de glutationa tem sido

relacionado ao aumento do estresse oxidative induzido por APAP (Jaeschke et al.,

2011), o ojetivo deste projeto será avaliar o efeito do licopeno nos possíveis

mecanismos envolvidos na modulação do estresse oxidativo em fígado de ratos

intoxicados com paracetamol (APAP).

Os resultados deste projeto poderá contribuir para o melhor entendimento dos

mecanismos pelos quais o licopeno exerce seu efeito antioxidante em um modelo de

20

inflamação hepática, podendo ser utilizado, no futuro, como um agente terapêutico

importante para minimizar os danos hepáticos induzidos por processos inflamatórios.

ALCANCE DOS RESULTADOS E POSSÍVEIS IMPACTOS

1. FORMAÇÃO DE RECURSOS HUMANOS: este projeto é parte integrante de uma

dissertação de mestrado no programa de Saúde e Nutrição e uma tese de doutorado

vinculada ao programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas/NUPEB. Sendo

assim, os resultados deste projeto contribuirá para a formação de recursos humanos em

dois programas de pós graduação distintos, ambos pertencentes à UFOP.

2. IMPACTO DOS RESULTADOS: um estudo científico aprofundado e bem delineado

do efeito do licopeno em um modelo de inflamação e os mecanismos envolvidos nesta

regulação poderá trazer subsídios para o melhor entendimento das vias de sinalização

envolvidas neste processo.

3. PRODUTOS A SEREM OBTIDOS AO FINAL DO PROJETO: Nossa meta é tentar

elucidar as vias de sinalização que são responsáveis pela modulação do balanço

EROs/NO em um modelo de inflamação induzido pelo APAP. Ao final do projeto, os

produtos a serem obtidos poderá trazer subsídeos para validar o uso do licopeno em

processos inflamatórios e conhecimentos a respeito das vias de sinalização relacionadas

a este processo.

Produtos a serem obtidos:

02 artigos científicos em revistas de qualidade da área;

01 tese de doutorado;

01 dissertação de mestrado;

04 resumos em congressos.

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