avaliaÇÃo da tintura de arruda ruta graveolens l. (rutaceae) em relaÇÃo a cistos de giardia...
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Trabalho de conclusão de curso onde foi avaliada a ação da tintura de Arruda (Ruta graveolens L.) sobre Giardia lamblia.TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE JOSÉ DO ROSÁRIO VELLANO – UNIFENAS
DIEGO CARDOSO LOPES
MÍRIAN CALASENSE COUTO
AVALIAÇÃO DA TINTURA DE ARRUDA Ruta graveolens L.
(RUTACEAE) EM RELAÇÃO A CISTOS DE Giardia lamblia
Divinópolis – MG
2011
1
DIEGO CARDOSO LOPES
MÍRIAN CALASENSE COUTO
AVALIAÇÃO DA TINTURA DE ARRUDA Ruta graveolens L.
(RUTACEAE) EM RELAÇÃO A CISTOS DE Giardia lamblia
Divinópolis – MG
2011
Monografia apresentada a Universidade José do Rosário Vellano, como parte das exigências do Curso de Farmácia para conclusão do curso de graduação ORIENTADOR: Prof. Dnd. Wendel Luiz de Oliveira
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_______________________________________________
DIEGO CARDOSO LOPES
_______________________________________________
MÍRIAN COUTO
Avaliação da tintura de arruda Ruta graveolens l. (RUTACEAE) em relação a cistos de Giardia lamblia
Monografia apresentada como parte das exigências para conclusão do curso de Farmácia, da
Universidade José do Rosário Vellano.
Aprovada em: ____________________________________
_______________________________________ Prof. Orientador: Prof. Dnd. Wendel Luiz Oliveira
Universidade José do Rosário Vellano
_______________________________________ Profa. Cínthia da Silva Moura
Universidade José do Rosário Vellano
_______________________________________ Profa. Aléida dos Santos Plasschaert e Freitas
Universidade José do Rosário Vellano
3
Dedico este trabalho aos milhões de seres humanos no
mundo vítimas de “Doenças Negligenciadas”. E a todos os
terapeutas e xamãs que com suas ervas curam o corpo e a
alma.
4
A colega Mírian Couto e ao Prof. Wendel Oliveira, ao meu
avó Lourival Cardoso, pelo exemplo a seguir, a amiga
Conceição Coelho, do laboratório de apoio da UNIFENAS
Divinópolis, e a todos os Anjos que me guiaram e ajudaram
durante a graduação o meu muito obrigado.
5
“Que tenhamos sempre alegria e gratidão em nossos
corações pelas ervas que, em Seu Amor por nós, o
Grande Criador de todas as coisas colocou nos campos
para nossa cura.”
(Dr. Edward Bach)
6
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 – Forma trofozoídica.........................................................................................17
FIGURA 2 – Forma cística..................................................................................................18
FIGURA 3 – Ciclo biológico...............................................................................................18
FIGURA 4 – Partes aéreas de Ruta graveolens...............................................................20
FIGURA 5 – Diluição da tintura bruta (TB)...................................................................23
FIGURA6 – Agulhas de gavagem para inoculação de cistos de Giardia lamblia .................26
FIGURA 7 – Tratamento dos animais..............................................................................27
FIGURA 8 – Pesagem dos ratos.........................................................................................27
FIGURA 9 – Média de cistos após a infecção....................................................................29
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LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Principais atividades atribuídas a quercetina, rutina e psoraleno .................21
TABELA 2 – Diluições utilizadas no estudo.......................................................................23
TABELA 3 – Relação de ratos por grupo e diluições utilizadas em cada grupo......................24
TABELA 4 – Doses administradas por grupo........................................................................29
TABELA 5 – Diluições utilizadas e quantidade de cistos após o tratamento...........................30
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 9
2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 11
2.1 Objetivo geral .................................................................................................................. 11
2.2 Objetivo específico.......................................................................................................... 11
3 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 12
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................... 14
4.1 Plantas medicinais ........................................................................................................... 14
4.2 Considerações gerais sobre Giardia lamblia .................................................................. 16
4.3 Considerações sobre Ruta graveolens ............................................................................. 19
4.4 Obtenção das plantas de Ruta graveolens ....................................................................... 22
4.5 Obtenção da tintura ......................................................................................................... 22
4.5.1. Obtenção das diluições da tintura ................................................................................... 22
4.6 Princípios éticos .............................................................................................................. 23
4.7 Ensaio biológico .............................................................................................................. 24
4.8 Cultivo dos cistos de Giardia lamblia ............................................................................ 25
4.8.1. Metodologia para cultivo de cistos de Giardia lamblia em sílica gel a
25ºc ......................................................................................................................................... 25
4.9 A infecção dos animais ................................................................................................... 25
4.10 Tratamento dos animais com tintura de Ruta graveolens ............................................... 26
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 28
6 CONCLUSÃO ................................................................................................................ 32
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 33
ANEXOS .................................................................................................................................. 38
9
1 INTRODUÇÃO
A humanidade utiliza os vegetais para proteção da saúde e alívio de seus males
desde o princípio de sua existência na Terra, há muito tempo, as plantas medicinais têm sido
usadas como forma alternativa ou complementar aos medicamentos da medicina tradicional.
O seu uso na medicina popular e a literatura etnobotânica têm descrito o uso dos extratos,
infusões e pós de plantas medicinais por vários séculos contra todos os tipos de doenças
(VAND EN BERGHE et al., 1986).
É provável que a utilização das plantas como medicamento seja tão antiga quanto
o próprio homem. Numerosas etapas marcam a evolução da arte de curar, porém torna-se
difícil delimitá-las com exatidão, já que a medicina esteve por muito tempo associada as
práticas mágicas místicas e ritualísticas. Consideradas ou não seres espirituais, as plantas por
suas propriedades terapêuticas ou tóxicas, adquiriram fundamental importância na medicina
popular (MARTINS et al., 2000).
A biodiversidade pode ser analisada pelo seu papel evolutivo, ecológico ou como
recurso biológico. “Sob o termo ‘recursos biológicos’ identifica-se os componentes da
biodiversidade que têm uma utilização direta, indireta ou potencial para a humanidade”
(LÉVÊQUE, 1999).
As atividades extrativas no meio natural constituem um dos principais usos da
diversidade biológica. As espécies vegetais para uso medicinal têm recebido atenção especial,
pelos diferentes significados que as plantas medicinais assumem em nossa sociedade como
um recurso biológico e cultural, destacando-se seu potencial genético para o desenvolvimento
de novas drogas, possível fonte de recursos financeiros, através de sua comercialização, para
o resgate e fortalecimento da identidade cultural e como acesso primário à saúde para muitas
comunidades (SILVA, 2002).
As espécies vegetais de uso medicinal representam a principal matéria médica
utilizada pelas chamadas medicinas tradicionais, ou não ocidentais, em suas práticas
terapêuticas, sendo a medicina popular a que utiliza o maior número de espécies diferentes
(HAMILTON, 2003).
As plantas medicinais, que têm avaliadas a sua eficiência terapêutica e a
toxicologia ou segurança do uso, dentre outros aspectos, estão cientificamente aprovadas a
serem utilizadas pela população nas suas necessidades básicas de saúde, em função da
facilidade de acesso, do baixo custo e da compatibilidade cultural com as tradições populares.
10
Uma vez que as plantas medicinais são classificadas como produtos naturais, a lei permite que
sejam comercializadas livremente, além de poderem ser cultivadas por aqueles que
disponham de condições mínimas necessárias. Com isto, é facilitada a automedicação
orientada nos casos considerados mais simples e corriqueiros de uma comunidade, o que
reduz a procura pelos profissionais de saúde, facilitando e reduzindo ainda mais o custo do
serviço de saúde pública (MARTINS et al., 2000).
Várias doenças têm sido alvo de pesquisas que envolvem plantas medicinais,
dentre as quais estão as nematodioses gastrintestinais (MCLEOD, 1995; FOX, 1997;
GASBARRE et al, 2001; GITHIGIA et al., 2001). Apesar da existência de diversos anti-
helmínticos disponíveis comercialmente, o desenvolvimento de resistência pelos nematóides e
a busca do mercado consumidor por fontes de tratamento que substituam produtos químicos,
têm justificado diversas pesquisas que buscam plantas medicinais para o controle de
nematóides gastrintestinais. A total aceitação de drogas derivadas de plantas e a fitoterapia na
medicina científica só poderão ocorrer se estes produtos cumprirem os mesmos critérios de
eficácia, segurança e controle de qualidade que os produtos sintéticos (RATES, 2001), ou
seja, os produtos retirados de plantas devem ter eficácia avaliada e confirmada, assim como
deve ser garantida que sua administração a organismos vivos ocorra sem riscos para sua saúde
(CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2005).
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar o efeito da administração por via oral de arruda (Ruta graveolens) em
ratos Wistar em um biotério convencional, experimentalmente infectados com cistos de
Giardia lamblia.
2.2 Objetivo específico
Determinar se Ruta graveolens apresenta atividade parasiticida contra Giardia
lamblia.
Observar qual concentração apresenta efeito parasitiostático sobre Giardia
lamblia demonstrando a importância da arruda como futuro agente terapêutico.
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3 JUSTIFICATIVA
O uso de plantas medicinais pela população mundial tem sido muito significativo
nos últimos tempos. Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) mostram que cerca de
80% da população mundial fez o uso de algum tipo de erva na busca de alívio de alguma
sintomatologia dolorosa ou desagradável. Desse total, pelo menos 30% deu-se por indicação
médica (FUNASA, 2000).
Os benefícios das plantas medicinais estão associados aos princípios ativos, que
estão presentes em todas as suas partes: folhas, flores, galhos, raízes, sementes e grãos.
Entretanto os relatos sobre os efeitos adversos e as possíveis interações farmacológicas entre
os compostos químicos das plantas medicinais e as drogas alopáticas ainda são escassos,
devido ao pouco conhecimento sobre os mecanismos de ação dessas plantas. Diversas plantas
ainda não foram padronizadas quanto à posologia, indicação e efeitos adversos, levando as
autoridades em saúde à preocupação de criar estratégias que viabilizem a sua segurança,
eficácia e qualidade (BENARROZ, 2007).
O Brasil é um dos países de maior diversidade genética vegetal, contando com
mais de 55.000 espécies catalogadas (NODARI e GUERRA 1999), entretanto, como
conseqüência da revalorização mundial do uso de plantas medicinais, a pressão ecológica
exercida sobre alguns desses recursos naturais tem sido grande nos últimos anos colocando
em perigo a sobrevivência de muitas espécies medicinais nativas (MONTANARI, 2002). De
acordo com Sánchez e Valverde (2000), o comércio local de plantas medicinais leva à
deterioração de populações naturais, tanto quanto a pressão extrativista da indústria
farmacêutica.
É provável que cerca de 200.000 espécies vegetais que possam existir no Brasil,
pelo menos a metade pode ter alguma propriedade terapêutica útil a população, mas nem 1%
dessas espécies com potencial foi motivo de estudos adequados. As pesquisas com estas
espécies devem receber apoio total do poder público, pois, além do fator econômico, há que
se destacar a importância para a segurança nacional e preservação dos ecossistemas onde
existam essas espécies (MARTINS et al., 2000).
O parasitismo intestinal ainda se constitui um dos mais sérios problemas de Saúde
Pública no Brasil, principalmente pela sua correlação com o grau de desnutrição das
populações, afetando especialmente o desenvolvimento físico, psicossomático e social de
escolares. Embora haja uma vasta literatura sobre a importância das enteroparasitoses para a
13
Saúde Pública, e especialmente, em relação a escolares, pouca atenção tem sido dada ao
assunto, nos programas de formação de educadores(FERREIRA e ANDRADE, 2005).
As pesquisas voltadas para o estudo e avaliação de produtos naturais como
terapêuticos e, principalmente, com atividade antiparasitária devem ter um maior incentivo
com o objetivo de criar novas drogas ou adaptar as já existentes para que voltem a ter
atividade (SIMÕES et al., 2004).
14
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 Plantas medicinais
A utilização da fitoterapia vem desde épocas remotas. A referência mais antiga
que se tem conhecimento do uso das plantas data de mais de sessenta mil anos. As primeiras
descobertas foram feitas por estudos arqueológicos em ruínas do Irã. Também na China, em
3.000 a.C., já existiam farmacopéias que compilavam as ervas e as suas indicações
terapêuticas. A utilização das plantas medicinais faz parte da história da humanidade, tendo
grande importância tanto no que se refere aos aspectos medicinais, como culturais (SAÚDE É
VITAL, 1991)
No percurso de seu processo evolutivo, o homem aprendeu a selecionar plantas
tanto para a alimentação como para o alívio das doenças, processo que resultou no domínio do
conhecimento do uso de ervas e plantas medicinais. Ainda hoje muitas destas são utilizadas
para o tratamento de diversas patologias, mesmo existindo medicamentos sintéticos no
mercado para este fim (FERREIRA, 2010).
Vários autores tem pesquisado utilização de plantas medicinais em suas
comunidades (LUZ, 2001; REZENDE 2002; SILVA et al., 2006; JUNIOR, 2008;
BRASILEIRO et al., 2008; SANTOS et al., 2008; SANTOS et al., 2009; OLIVEIRA et al.,
2010; NETO, 2010), o que comprova o interesse da ciência em entender e avaliar os ricos e
benefícios desta prática.
A espécie humana se aproveita de uma fração muito pequena das plantas com as
quais sempre conviveu e que a antecedem no planeta Terra. O reino vegetal ainda permanece
como uma grande incógnita cujos mistérios começam a serem desvendados (PINTO, 2002).
Plantas medicinais é um tema recorrente na pauta da ciência brasileira.
Unanimidade entre químicos e farmacólogos brasileiros de reconhecida expressão
internacional, os estudos com plantas medicinais ainda não receberam no Brasil, a atenção
que o tema merece das agências financiadoras, embora já exista uma massa crítica de
pesquisadores qualificados nas áreas de química e farmacologia (PINTO, 2002).
Segundo França et al. (2008), percebe-se, na atualidade, o interesse
governamental e profissional em associar o avanço tecnológico ao conhecimento popular e ao
desenvolvimento sustentável visando a uma política de assistência em saúde eficaz,
15
abrangente, humanizada e independente da tecnologia farmacêutica. Nesse sentido, o Estado
brasileiro instituiu as legislações que classificam os fitoterápicos como medicamentos, e
paralelo ao interesse governamental em debater a comercialização dos fitoterápicos, a adesão
da população a esses produtos incrementou a sua comercialização de modo que o Estado
precisou regulamentar esse mercado.
Nos países em desenvolvimento, entre eles o Brasil, assim como em países
desenvolvidos, a partir da segunda metade dos anos 70 e década de 80, tem-se verificado o
crescimento das “medicinas alternativas” e, entre elas, a fitoterapia (TOMAZZONI et al.,
2006).
O aumento do consumo de fitoterápicos pode ser associado ao fato de que as
populações estão questionando os perigos do uso abusivo e irracional de produtos
farmacêuticos e procuram substituí-los por plantas medicinais. A comprovação da ação
terapêutica também favorece essa dinâmica. Além disso, registra-se a insatisfação da
população perante o sistema público de saúde oficial e também a necessidade de poder
controlar seu próprio corpo e recuperar sua saúde, assumindo as práticas de saúde para si ou
para sua família (TOMAZZONI et al., 2006).
Além da crença sobre o poder de cura desta ou daquela planta, a fitoterapia evolui
e sofisticou-se: portanto o conhecimento sobre o poder curativo das plantas não pode ser mais
considerado apenas como tradição passada de pais para filhos, mas como ciência que vem
sendo estudada, aperfeiçoada e aplicada por diversas culturas, ao longo dos tempos
(TOMAZZONI et al., 2006).
O uso de medicamentos é recente, e sua comprovação com testes clínicos é ainda
mais recente. A maioria dos medicamentos possuem apenas um princípio ativo responsável
pelo seu efeito desejado, enquanto os extratos vegetais e de fungos são constituídos por
compostos ativos, parcialmente ativos e inativos, que atuam em alvos farmacológicos
distintos. As plantas biossintetizam substâncias para atuar em alvos específicos em seus
predadores, bem como para modular seu próprio metabolismo, consequentemente, estes
podem agir de forma terapêutica em alvos patológicos humanos (FERREIRA, 2010). Estima-
se que 80% dos fármacos em usos são de origem natural ou foram inspirados pela natureza, da
morfina a penicilina, passando pelo antineoplásico paclitaxel (COSTA-LOTUFO et al.,
2009). Dos medicamentos aprovados pelo FDA (Food and Drug Administration) de 1981 a
2006, 50% foram direta ou indiretamente derivados de produtos naturais, já que mesmo
quando o novo medicamento natural não passa em todos os testes clínicos, ele pode servir de
modelo para a síntese de novos fármacos (FERREIRA, 2010).
16
Evidências indicam que aproximadamente uma pessoa em cinco no mundo vem a
óbito por causa de algum tipo de patologia relacionada a parasitose (ALBERTS et al., 1997).
No Brasil cerca de 98 milhões de pessoas descobrem que tem algum tipo de parasita por ano
que pode causar sintomatologia ou simplesmente viver em simbiose com o hospedeiro
(NEVES et al, 2004). Porém, cerca de 15% destes, poderá ter complicações mais drásticas
que levará a morte, sendo que cerca de 12% destes são crianças e idosos (NEVES et al, 2004).
As verminoses representam um dos problemas de saúde pública, notadamente nas
zonas de grande concentração demográfica (CAMARGO, 1998).
Não obstante o grande progresso em terapêutica das verminoses intestinais, a
medicina popular procura resolver este problema através do uso de plantas medicinais, às
quais são atribuídas atividades anti-helmínticas. Entre os fatores que justificam o uso de
plantas medicinais no meio popular, destaca-se o baixo nível sócio-econômico existente
(CAMARGO, 1998).
4.2 Considerações gerais sobre Giardia lamblia
Giardia lamblia é um dos mais comuns parasitas intestinais humanos. De
prevalência mundial, é principalmente encontrado em crianças, e estima-se que de 2 – 5% da
população em países desenvolvidos e em 20 – 30% em países em desenvolvimento estão
contaminados. A infecção por este parasita esta associada as más condições de higiene e
saneamento. A infecção se dá pela ingestão de cisto de Giardia lamblia por hospedeiros
suscetíveis através de água ou alimentos contaminados, e também por transmissão de
hospedeiro para hospedeiro ou de animais para humanos. Dados da OMS revelam que 200
milhões de pessoas na Ásia, África e América Latina têm sintomas de infecção pelo parasito,
com mais de 500 mil novos casos por ano, sendo as crianças em idade pré-escolar as mais
atingidas (PEREIRA et al, 2007).
O parasito apresenta duas formas: o trofozoíto (FIG. 1) e o cisto (FIG. 2). O
trofozoíto tem formato de pêra, com simetria bilateral e mede 20 micrômetros de
comprimento por 10 micrômetros de largura. A face dorsal é lisa e convexa, enquanto a face
ventral é côncava, apresentando uma estrutura semelhante a uma ventosa, que é conhecida por
várias denominações: disco ventral, adesivo ou suctorial. Abaixo do disco, ainda na parede
ventral, é observada a presença de uma ou duas formações paralelas, em forma de vírgula,
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conhecidas como corpos medianos, no interior do trofozoíto, e localizado na sua parte frontal,
são encontrados dois núcleos. O trofozoíto possui ainda quatro pares de flagelos que se
originam de blefaroplastos ou corpos basais situados nos pólos anteriores dos dois núcleos
(NEVES, 2003).
FIGURA 1 – Forma trofozoídica.
Fonte:http://www.musee-afrappier.qc.ca/images/site/large/giardia-joelmancuso.jpg
O cisto é oval ou elipsóide, medindo cerca de 12 micrômetros de comprimento
por 8 micrômetros de largura. O cisto, quando corado, pode mostrar uma delicada membrana
destacada do citoplasma. No seu interior encontram-se dois ou quatro núcleos, um número
variável de fibrilas (axonemas de flagelos) e os corpos escuros com forma de meia-lua e
situados no pólo oposto aos núcleos (NEVES, 2003).
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FIGURA 2 – Forma cística.
Fonte: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/giardiase/imagens/giardiase-2.jpg
Possui ciclo biológico direto (FIG. 3). A via normal de infecção do homem e
animais é a ingestão de cistos. Em cobaias estima-se que um número pequeno de cistos (de 10
a 100 cistos) é suficiente para produzir a infecção. Após a ingestão do cisto, o
desencistamento é iniciado no meio ácido do estômago e completado no duodeno e jejuno,
onde ocorre a colonização do intestino delgado pelos trofozoítos. Este se reproduz por divisão
binária longitudinal, resultando assim dois trofozoítos (NEVES, 2003).
FIGURA 3 – Ciclo biológico
Fonte: http://www.cve.saude.sp.gov.br/htm/hidrica/Giardiase_arquivos/image002.gif
19
A giardíase é transmitida pela contaminação ambiental e de alimentos pelos cistos
do parasito. A contaminação pode ser direta de pessoa a pessoa, por isso, recomenda-se
higiene pessoal, proteção dos alimentos e da água. Embora haja evidências de que cistos
resistem à cloração da água, eles podem ser destruídos se fervido a água. Recomenda-se
verificar principalmente animais domésticos como cães e gatos e examiná-los para detectar se
há ou não infecção se for constado deve-se tratá-los (NEVES, 2003).
O exame de fezes é a forma clássica de diagnóstico laboratorial, sendo utilizado
em fezes liquefeitas o método direto, que permite a visualização da forma trofozoítica em
movimento, e a hematoxilina férrica, que evidencia as estruturas citoplasmáticas e nucleares
de ambas as formas da Giardia lamblia Já nas amostras sólidas, o método de concentração de
Faust et al 1970 é o mais indicado.O método imunoenzimático qualitativo também pode ser
utilizado (MACHADO, 2001).
4.3 Considerações sobre Ruta graveolens
Subarbusto que mede cerca de um metro e quinze centímetros de altura, com
espessa ramagem. A cor das folhas é resultante de um misto de verde azul, o que lhes confere
uma bela coloração. São alternas e pecioladas em 10 ou 11 lóbulos estreitos e desprovidos de
pêlos; flores miúdas e amareladas em graciosos cachos, que exalam, bem como todas as
outras partes da planta, um cheiro desagradável; e fruto dividido em cinco compartimentos
que guardam as sementes (CAMARGO, 1998).
Atualmente é utilizada como agente aromatizante, vermífugo intestinal, repelente
de insetos, para o alívio da dor de ouvido e dentes, como antídoto para o veneno de serpentes
e escorpião (FREIRE et al., 2010), apresenta propriedades cicatrizante, antiinflamatória, anti-
reumática e antiulcerogênica (CÂNDIDA, 2003), para complicações menstruais, aumento da
resistência venenosa, além de possuir ação abortiva (SOUZA et al., 2007)
Ruta graveolens é uma das 565 espécies das 125 famílias de plantas medicinais
usadas tradicionalmente em diversas regiões geográficas que são consideradas como fonte de
novas drogas, a partir das quais um grande número de substâncias tem sido descoberto.
(FREIRE et al., 2010), é uma planta de existência longa que se renova a cada ano, suas folhas
verde claro, contrastam com o amarelo-ouro de suas flores em ramalhete dotadas de quatro
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pétalas, com exceção da flor central, que possui cinco pétalas. Os frutos têm a forma de
cápsulas arredondadas (OLIVEIRA, 2006).
FIGURA 4 - Partes aéreas de Ruta graveolens.
Fonte: http://botanical.com/botanical/mgmh/r/rue---20-l.jpg
Esta planta contém mais de 120 compostos de diferentes classes (RATHEESH et
al., 2010). Em sua avaliação do perfil cromatográfico e da presença de quercetina, rutina,
psoraleno em Arruda (Ruta graveolens) produzida em consórcio com Alface (Lactuca sativa),
CARDOSO et al. (2006) confirmou a prevalência destas três substâncias em todas as suas
análises, e destacou suas principais propriedades medicinais (Tab. 1). Portanto supõe-se que
estes sejam seus principais componentes ativos, porém são necessários mais estudos para se
estabelecer com segurança qual, ou quais substâncias tiveram atividades sobre o parasita
estudado.
21
TABELA 1 Principais atividades atribuídas a quercetina, rutina e psoraleno
Princípio Ativo
Principais Atividades
Quercetina
Analgésica, antiHIV, antialérgica, bactericida, antidiabética,
carminativa, antigástrica, hepatoprotera, antihistamínica, antiinflamatória,
antioxidante, antiespasmódica, antitumoral, antiviral e
larvistático.
Rutina
Inibe a aldose-redutase, combate a fragilidade dos capilares, anticatarata, antidermatítico, antidiabético, antiedêmico, antieritêmico,
antihematúrico, antihistamínico, antiinflamatório,
antioxidante, antitrombogênico, antitumor, antivira, preventivo do câncer, protetor
capilar, hipotensor, larvistático, pesticida,
espasmolítico e vasopressor
Psoraleno
Vitiligo e psoríase CARDOSO, C. A. L. et al.; Avaliação do perfil cromatográfico e da presença de quercetina, rutina e psoraleno em arruda produzida em consórcio com alface. Associação Brasileira de Horticultura. Anais CBO 2006. Disponível em: <http://www.abhorticultura.com.br/biblioteca/arquivos/Download/Biblioteca/46_0678.pdf>. Acesso em: 01 jun 2011.
22
METODOLOGIA
4.4 Obtenção das plantas de Ruta graveolens
As diferentes estruturas vegetais (folhas e flores) de Ruta graveolens (FIG. 4)
utilizados nos ensaios, foram obtidas de plantas cultivadas na cidade de Divinópolis –MG.
Estas estruturas foram colhidas no mês de outubro de 2010
4.5 Obtenção da tintura
No laboratório de farmacognosia da Universidade José do Rosário Vellano –
UNIFENAS - Divinópolis, foi obtida a tintura por maceração, pesando-se 515,46g de planta
fresca, que foi deixada em estufa a 37º por quatro dias. Após esse período obteve-se a 100g da
planta seca, que foi posta, devidamente dividida, em contato com 850ml do líquido extrator
(álcool 99,5%) por 15 dias em vidro âmbar ao abrigo de umidade e calor, agitando-se a
solução todos os dias. Em seguida filtrou-se por duas vezes os resíduos e acrescentou-se
250mL do líquido extrator, obtendo-se então 1L de tintura mãe, que foi rotavaporizado para
eliminação do líquido extrator. Este método foi uma adaptação do método de obtenção de
tintura mãe de origem vegetal da Farmacopéia Brasileira 2ºed. Parte I (1997).
4.5.1. Obtenção das diluições da tintura
A partir da tintura bruta (TB) (C = 0,944g/L) preparou-se as diluições (FIG. 5)
1:2, 1:10 e 1:100 (Tab. 2), para os testes sobre o parasito Giardia lamblia.
23
TABELA 2 Diluições utilizadas no estudo
Diluição Quantidade de tintura bruta (ml)
Quantidade de água mineral (ml)
TB (0,944g/L) 1 ml _ 1:2 (0,472g/L) 1 ml 1 ml
1:10 (0,094g/L) 1ml 9 ml 1:100 (0,009g/L) 1ml 99 ml
Figura 5: Diluição da tintura bruta (TB)
4.6 Princípios éticos
A importância deste trabalho foi avaliada e aprovado pelo Comitê de Ética da
Universidade José do Rosário Vellano – Campus Alfenas – MG, sob nº 05A/2010, do dia 10
de maio de 2010.(ANEXO A)
24
4.7 Ensaio biológico
A tintura bruta e suas diluições foram submetidas a ensaios biológicos onde
verificou-se sua atividade antiparasitária contra Giardia lamblia pelo método de incubação in
vivo em ratos Wistar, tratados a partir da tintura da espécie Ruta graveolens em diferentes
concentrações.
Foram submetidos ao teste 42 ratos Wistar, machos com peso médio de 350
gramas provenientes do biotério central da UNIFENAS – Campus Alfenas. Estes ratos foram
pesados inicialmente e foi feita uma investigação parasitológica através do recolhimento de
fezes recém-formadas.
Durante todo o experimento os animais foram mantidos em caixas individuais,
com restrição a água mineral, tratados com ração “Labina” e mantidos em temperatura de 22º
a 24ºC, com caixas higienizadas diariamente para se obter controle de qualidade e não haver
contaminação direta. Os animais ficaram divididos em 6 grupos: G1 – tintura bruta; contendo
6 ratos; G2 – diluição 1:2, contendo 12 ratos; G3 – diluição 1:10, contendo 12 ratos; G4 –
diluição 1:100, contendo 6 ratos; G5 – controle positivo, contendo 3 ratos; G6 – controle
negativo, contendo 3 ratos. Os ratos dos grupos G2 e G3 foram subdivididos em G2 A e G2
B, cada um com seis ratos, e G3 A e G3 B, cada um com seis ratos também (Tab. 3),
facilitando-se assim a visualização e comparação dos resultados nestes grupos.
TABELA 3 Relação de ratos por grupo e diluições utilizadas em cada grupo
Grupo Diluição Quantidade de Ratos
G1 TB 6 G2 A 1:2 6 G2 B 1:2 6 G3 A 1:10 6 G3 B 1:10 6 G4 1:100 6 G5 Controle positivo 3 G6 Controle negativo 3
25
4.8 Cultivo dos cistos de Giardia lamblia
Os cistos foram obtidos por exames laboratoriais realizados em Laboratórios de
Análises Clínicas da cidade de São Gotardo - MG
O método utilizado foi adaptado segundo a metodologia descrita por Lutz ou
Hoffman, Pons e Janer (NEVES et al, 2004). (Anexo B)
4.8.1. Metodologia para cultivo de cistos de Giardia lamblia em sílica gel a 25ºc
A técnica que foi utilizada é adaptada segundo OLIVEIRA (2001). Utilizou-se neste
método:
100 g de sílica gel granulada em flocos. Foram colocados em 1 vidro cor âmbar estéril de 250
ml e acrescentou-se 50 ml de solução fisiológica 0,9%. Adicionou-se também 2 ml de solução
tampão fosfato 100 mmol/L pH 7,5; Nitroprussiato de sódio 5 mmol/L; Salicilato de sódio
300 mmol/L; estabilizantes e conservantes. Após, semeou-se cistos de Giardia lamblia. O
reativo teve que ser estável a 25º C por um período de 3 semanas, assim obtendo-se cistos
infectáveis.
Antes da inoculação colocou-se o “pool” em estufa a 37ºC, por 24 horas, estando
então viável para a infecção.
4.9 A infecção dos animais
Neste trabalho foram utilizados Rattus norvegicus Berkenhout, 1769 (Rodentia:
Muridae) da linhagem Wistar, do biotério convencional pertencente à Universidade José do
Rosário Vellano – UNIFENAS – Campus Alfenas.
Em cada “pool” de cultivo em sílica gel a 25º foi feito uma contagem presuntiva
de cistos por mm3, a contagem foi realizada com o auxílio da câmara de Newbauer, achando-
se um total de 150 cistos/ mm3.
26
Após contagem presuntiva de cistos por mm3 de Giardia lamblia, inoculou-se por
via oral com o auxílio de agulha de gavagem (FIG. 6) de acordo com o peso corpóreo.
Decorrido o tempo necessário para fixação da forma trofozoítica de Giardia
lamblia no intestino do rato, foi feita uma análise parasitológica durante 3 dias consecutivos
(NEVES et al, 2004), para confirmar assim a infecção, obtendo-se assim o resultado positivo
para o parasito em todos os roedores, com exceção do controle negativo que não foi infectado.
Figura 6: Agulhas de gavagem para inoculação de cistos de Giardia lamblia.
fONTE
4.10 Tratamento dos animais com tintura de Ruta graveolens
Para realização dos testes, amostras da TB e das diluições de Ruta graveolens
foram inoculadas em seus devidos grupos de cobaias com auxílio de agulha de gavagem (FIG.
7), duas vezes por dia. A dosagem da tintura variou de acordo com o peso corpóreo de cada
rato. As avaliações foram realizadas diariamente, visualizando as características físicas dos
roedores (variação de peso e stress) e realizando os exames de fezes como controle de
qualidade (FIG. 8).
27
FIGURA 7 – Tratamento dos animais
FIGURA 8 – Pesagem dos ratos
28
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Sendo uma patologia recorrente de países em desenvolvimento, a Giardíase se
encontra entre a classe de doenças negligenciadas, não sendo de interesse da indústria
farmacêutica o desenvolvimento de novos fármacos para o seu controle. Segundo artigo
publicado na revista Lancet em 2006, apenas 1,3% dos medicamentos disponibilizados entre
1975 e 2004 foi para as doenças negligenciadas, apesar de representarem 12% da carga global
de doenças. Apesar dos esforços do setor público, solução para o problema se esbarra na falta
de interesse da indústria farmacêutica, que não vê mercado lucrativo que justifiquem a
pesquisa de medicamentos (PONTES, 2009). Isto evidência a importância social e científica
deste trabalho, já que além da busca de uma nova forma terapêutica há principalmente a
preocupação com o bem estar social das populações marginalizadas.
VALVERDE et al., (2009) constatou em seus estudos com Ruta graveolens a redução
dos níveis de glicose e variações nos níveis de triglicerídeos e colesterol em modelos de ratos
diabéticos. Já AMBROZIM et al., (2004) relatou que os extratos e frações obtidos de Ruta
graveolens são uma promissora fonte de busca de novos fármacos para a doença de Chagas.
Ruta graveolens é utilizada para diversos tratamentos na medicina popular, entre eles é como
antiparasitário, porém sem se saber sobre quais parasitas especificamente a planta tem
atividade farmacológica. Neste trabalho foi testada a ação de Ruta graveolens sobre Giradia
lamblia,
Os cuidados com a condição sanitária dos animais de laboratório são indispensáveis
para que não haja interferências nos resultados de pesquisa e em testes biológicos.
Sendo assim neste ensaio biológico, os animais foram submetidos a um rigoroso
controle químico com antiparasitários antes da utilização nos testes. Todos os grupos foram
tratados previamente com benzolimetronidazol a 4%, 0,5mL/Kg 4 vezes ao dia por 5 dias, e
após foi confirmada a ausência de parasitas por testes parasitológicos.
Neste estudo fez-se a inoculação de cistos de Giardia lamblia em ratos Wistar pelo
método de inoculação de cistos cultivados em sílica gel a 25ºC e notou-se infestação
progressiva similar ao teste descrito por SANTOS (2006), do método utilizado após 72 horas
depois da infecção (Gráfico 1).
29
FIGURA 9 - Média de cistos após a infecção
Fonte: SANTOS 2006
Após infecção confirmada, através de exames parasitológicos das fezes dos roedores
em dias consecutivos, observou-se número de cistos ideal de Giardia lamblia para início da
pesquisa.
Os roedores foram tratados com a TB (C= 0,944 g/l) e 3 diluições (1:2, 1:10, 1:100)
em 2 dias consecutivos. Foram administradas doses de 0,5mL das soluções aos seus
respectivos grupos (Tab. 4) duas vezes ao dia.
TABELA 4 Doses administradas por grupo
Grupos Quantidade Diluição
G1 0,5 ml TB G2 A 0,5 ml 1:2 G2 B 0,5 ml 1:2 G3 A 0,5 ml 1:10 G3 B 0,5 ml 1:10 G4 0,5 ml 1:100 G5 - Controle positivo G6 - Controle negativo
FREIRE et al. (2011) constatou em seus estudos sobre os efeitos antiparasitários e
tóxicos do extrato alcoólico de Ruta graveolens sobre ratos infectados com o parasita
30
Vampirolepis nana, um leve a moderato efeito hepatóxico e um pobre efeito antiparasitário. Já
o nosso trabalho demonstrou um promissor efeito antiparasitário de Ruta graveolens sobre
Giardia lamblia conforme exemplifica a Tabela 5.
TABELA 5 Diluições utilizadas e quantidade de cistos pós tratamento
Diluição Quantidade de tintura bruta (ml)
Quantidade de cisto pós tratamento (Cistos/mm3)
TB 1 ml 0 1:2 1 ml 0
1:10 1ml 32,7 1:100 1ml 74
Foi constatado neste estudo que a TB e diluição 1:2 tiveram efeito parasiticida, e as
diluições 1:10 e 1:100 tiveram efeito parasitiostáticos sobre Giardia lamblia (Gráfico 2).
Gráfico 1 – Quantidade de cistos por grupo ao final do tratamento
31
Gráfico 2 – Número de cistos após o tratamento
Além de confirmar o efeito parasiticida e parasitiostático, este estudo aponta a
viabilidade da continuidade das pesquisas para se identificar e isolar, a, ou as substâncias com
atividade farmacológica sobre Giardia lamblia, bem como para se estabelecer os demais
parâmetros farmacodinâmicos e farmacológicos através de pesquisas pré-clínicas e clínicas.
32
6 CONCLUSÃO
Com base na avaliação do efeito da administração por via oral de arruda (Ruta
graveolens) em ratos Wistar infectados com Giardia lamblia, foi possível comprovar a
atividade parasiticida da tintura bruta (TB) e da diluição 1:2 obtidas da planta, e o efeito
parasitiostático das diluições 1:10 e 1:100, o que demonstra sua importância como futuro
agente terapêutico.
33
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ANEXOS
39
ANEXO A – CARTA COMITÊ DE ÉTICA
-
40
ANEXO B – METODOLOGIA DESCRITA POR LUTZ OU HOFFMAN, PONS E
JANER