avaliaÇÃo da perfusÃo sequencial com as …livros01.livrosgratis.com.br/cp044387.pdf · and...
TRANSCRIPT
VLADIMIR SCHRAIBMAN
AVALIAÇÃO DA PERFUSÃO SEQUENCIAL COM AS SOLUÇÕES DE EURO-COLLINS E BELZER PARA
PRESERVAÇÃO DO PÂNCREAS EM RATOS
São Paulo 2005
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Mestre em Ciências
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
VLADIMIR SCHRAIBMAN
AVALIAÇÃO DA PERFUSÃO SEQUENCIAL COM AS SOLUÇÕES DE EURO-COLLINS E BELZER PARA PRESERVAÇÃO DO PÂNCREAS EM RATOS.
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de
Mestre em Ciências
ORIENTADOR: Prof. Dr. Alberto Goldenberg CO-ORIENTADORES: Prof. Dr. Ivan Hong Jun Koh Prof. Dr. Adriano Miziara Gonzalez
São Paulo 2005
Schraibman, Vladimir
AVALIAÇÃO DA PERFUSÃO SEQUENCIAL COM AS SOLUÇÕES DE EURO-COLLINS E BELZER PARA PRESERVAÇÃO DO PÂNCREAS EM RATOS.
/ Vladimir Schraibman – São Paulo, 2005 xi, 66p. Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Gastroenterologia Cirúrgica. Título em inglês: EVALUATION OF SEQUENTIAL PERFUSION WITH EURO-COLLINS AND BELZER SOLUTIONS FOR PANCREAS PRESERVATION IN RATS.
1.Transplante. 2. Pâncreas. 3. Preservação. 4. Perfusão. 5. Ratos
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIRURGIA
Chefe do Departamento: Prof. Dr. Tarcísio Triviño Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Delcio Matos
iv
Dedicatória
A meus pais, Emil e Tsilia, maiores incentivadores, que com amor e
dedicação, souberam semear em meu coração o gosto pelo estudo, pelo trabalho e
pela vida.
A minha futura esposa, Carolina, que com amor e compreensão
soube entender as minhas ausências e, além de tudo, soube estimular-me, não só
neste trabalho, mas em tudo que realizamos, sempre com alegria.
v
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Alberto Goldenberg, minha gratidão pela oportunidade de ter sido seu
orientando e pelos valiosos ensinamentos em pesquisa científica. Sem dúvida, o
convívio desses anos, sua preciosa participação incondicional como orientador desse
trabalho e, sobretudo, sua amizade, muito contribuíram para a minha formação médica
e humana.
Ao Prof. Dr. Ivan Hong Jun Koh, minha gratidão pelos seus ensinamentos em pesquisa
científica. Sem dúvida, seus ensinamentos e seu preciosismo científico foram
fundamentais para o meu amadurecimento e a minha formação como médico e ser
humano, desde os tempos de graduação.
Ao Prof. Dr. Adriano Miziara Gonzalez, idealizador deste trabalho e co-responsável
pela realização do mesmo. Agradeço pelo estímulo, solidariedade e cooperação
incondicional em todas as etapas deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Delcio Matos, Coordenador do Curso de Pós-Graduação da UNIFESP-
EPM, pela acolhida no curso, pelos valiosos ensinamentos, estímulo, orientação e
formação como Gastrocirugião.
Aos Profs. Edson José Lobo, Tarcísio Triviño, José Carlos Del Grande, Gaspar de
Jesus Lopes Filho e Sarhan Sydney Saad, pelos ensinamentos durante a Residência
Médica e pela minha formação como Gastrocirurgião.
vi
Aos Profs. José Pinus, Jaques Pinus e Edson Khodor Cury, seres humanos únicos, que
com certeza tiveram enorme influência na minha formação médica e no incentivo a
carreira acadêmica.
Ao Dr. Ricardo Artigiani, Patologista do Departamento de Patologia da UNIFESP-EPM,
pela dedicada orientação e análise histológica.
Aos alunos de graduação Adriano Molinari e Stela Cezarino de Morais, pelo valioso
auxílio na execução dos atos operatórios.
A Estaticista Sra Adriana Sanuto, pela dedicada orientação e análise estatística.
A secretária Claudia pela ajuda em todos os momentos da realização desta tese, muito
obrigado.
A todas enfermeiras, funcionários e funcionárias da Disciplina de Gastrocirurgia pelo
convívio e ensino nesses últimos anos.
A todos os funcionários da UNIFESP-EPM que de inúmeras formas me tornaram um
ser humano melhor e mais completo.
A todos os pacientes, que sem dúvida alguma são o objetivo final desta pesquisa.
vii
SUMÁRIO
Lista de figuras ...........................................................................................................viii Lista de tabelas.............................................................................................................ix Lista de quadros............................................................................................................x Resumo .........................................................................................................................xi 1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................1 2 OBJETIVO...................................................................................................................5 3 MÉTODO .....................................................................................................................7 3.1 AMOSTRA ..............................................................................................................8
3.2 DISTRIBUIÇÃO DOS ANIMAIS.....................................................................................8
3.3 COMPONENTES DA SOLUÇÃO ...................................................................................8
3.4 DELINEAMENTO DA PESQUISA ................................................................................10
3.5 PROCEDIMENTO .............................................................................................10
3.5.1 PREPARO PRÉ-OPERATÓRIO E ANESTESIA .............................................. 10
3.5.2 TÉCNICA OPERATÓRIA ..................................................................................11
3.6 VARIÁVEIS ESTUDADAS.................................................................................16
3.6.1 AMILASE ...........................................................................................................16
3.6.2 HISTOLOGIA.....................................................................................................16
4 RESULTADOS.......................................................................................................................................... 19
4.1 TAMANHO DA AMOSTRA ................................................................................20
4.2 PESO DOS ANIMAIS EM CADA GRUPO..........................................................20
4.3 PESO DA PEÇA RESSECADA .........................................................................21
4.4 VALORES DE AMILASE NO LÍQUIDO DE PRESERVAÇÃO ............................22
4.5 HISTOLOGIA.....................................................................................................26
4.5.1 ANÁLISE HISTOLÓGICA ..................................................................................29
5 DISCUSSÃO..............................................................................................................32 6 CONCLUSÃO............................................................................................................40 7 ANEXOS.....................................................................................................................42 8 REFERÊNCIAS ..........................................................................................................44 Abstract ........................................................................................................................50 Bibliografia consultada...............................................................................................51
viii
Lista de figuras
Figura 1 Fotografia demonstrando os locais onde o duodeno foi ligado (setas)............11
Figura 2 Fotografia demonstrando o local no qual a aorta foi reparada (seta).. ........... 12
Figura 3 Fotografia demonstrando a aorta infra-renal reparada com o fio de algodão
(seta)...............................................................................................................................12
Figura 4 Fotografia demonstrando o Gelco 22 fixado na aorta. .............................. 13
Figura 5 Fotografia demonstrando: seta escura indicando local da secção da veia
cava inferior intra-torácica, seta branca indicando local da toracotomia anterior. ........ 14
Figura 6 Fotografia demonstrando a secção da veia cava inferior com drenagem do
perfusato (seta)...............................................................................................................14
Figura 7 Fotografia demonstrando o aspecto do pâncreas após a perfusão................15
Figura 8 Fotografia demonstrando a peça ressecada (duodeno e pâncreas).......... 15
Figura 9 Fotografia demonstrando a peça ressecada e pesada. ............................. 16
Figura 10 Gráfico demonstrando média e erro padrão dos valores de amilase ao......... longo do tempo de preservação de todos os grupos.................................................... 25 Figura 11 Classificação de edema de acordo com o grupo ....................................... 28
Figura 12 Classificação de necrose tecidual de acordo com o grupo ....................... 28
Figura 13 Classificação de necrose de ilhotas de acordo com o grupo ..................... 29
Figura 14 Classificação de infiltrado inflamatório de acordo com o grupo ................ 29
Figura 15 Fotomicrografia mostrando necrose tecidual (seta) no pâncreas do grupo
Soro Fisiológico. ........................................................................................................... 30
Figura 16 Fotomicrografia mostrando necrose de ilhotas (seta) no pâncreas do grupo
Euro-Collins. ................................................................................................................. 31
Figura 17 Fotomicrografia mostrando aspecto normal de ilhota no pâncreas do grupo
CB ................................................................................................................... 31
ix
Lista de tabelas TABELA 1 MEDIDAS DESCRITIVAS DO PESO DOS ANIMAIS SEGUNDO O GRUPO..................................................................... 20
TABELA 2 MEDIDAS DESCRITIVA DO PESO DA PEÇA RESSECADA SEGUNDO O GRUPO......................................................... 21
TABELA 3 VALOR DE AMILASE NO GRUPO SORO FISIOLÓGICO AO LONGO DO TEMPO.........................................................22
TABELA 4 VALOR MÉDIO DE AMILASE NO GRUPO EURO-COLLINS AO LONGO DO TEMPO....................................................23
TABELA 5 VALOR MÉDIO DE AMILASE NO GRUPO BELZER AO LONGO DO TEMPO..................................................................23
TABELA 6 VALOR MÉDIO DE AMILASE NO GRUPO EURO-COLLINS/BELZER AO LONGO DO TEMPO..................................24
TABELA 7 DISTRIBUIÇÃO DOS PARÂMETROS DA ANÁLISE HISTOLÓGICA OBSERVADOS NOS GRUPOS .............................27
x
Lista de quadros
QUADRO 1 COMPONENTES DA SOLUÇÃO DE EURO-COLLINS ......................................... 9
QUADRO 2 COMPONENTES DA SOLUÇÃO DE BELZER ................................................... 9
xi
RESUMO
Objetivo: Investigar o efeito das soluções de Euro-collins e Belzer na perfusão sequencial do pâncreas durante a preservação. Métodos: Foram utilizados 45 ratos Wistar-EPM. Os animais foram distribuídos em 4 grupos, de acordo com a solução utilizada para preservação: Grupo Soro Fisiológico (SF) – pâncreas perfundido e preservado em soro fisiológico; Grupo Euro-Collins (C) – pâncreas perfundido e preservado com solução de Euro-Collins; Grupo Belzer (B) – pâncreas perfundido e preservado em solução de Belzer e Grupo Euro-Collins/Belzer (CB) – pâncreas perfundido com solução de Euro-Collins e Belzer em partes iguais e seqüencialmente e preservado em solução de Belzer. Após a perfusão, os animais tiveram o pâncreas ressecado e preservado com a solução destinada em 4º C. Dosagens de amilase em 12, 24, 36 e 48 horas foram realizadas no líquido de preservação. Após a última dosagem a peça foi submetida à análise histológica. Foi realizado estudo estatístico a partir dos resultados. Resultados: Os grupos SF e C foram os que apresentaram os maiores valores de amilase ao longo do tempo, sendo superiores e diferentes dos grupos B e CB (p=0,05). Os grupos B e CB apresentaram valores de amilase similares até o período de 24 horas. A análise histológica demonstrou significância estatística em relação à necrose de ilhotas e edema tecidual. Os grupos B e CB mostraram-se similares histologicamente (p=0,001) e diferentes dos grupos SF e C. Conclusões: A aplicação das soluções de Euro-collins e Belzer de modo seqüencial mostrou-se eficaz na preservação do pâncreas de ratos até o período de 24 horas.
1 INTRODUÇÃO
2
1 INTRODUÇÃO
O transplante simultâneo de pâncreas e rim que teve seu início em 1966 é indicado nos
pacientes diabéticos do tipo 1, com insuficiência renal terminal. Os avanços obtidos com a
realização deste procedimento culminaram com a aceitação pela Associação Americana de
Diabetes do transplante combinado pâncreas–rim como o tratamento de eleição para o
doente diabético tipo I com doença renal terminal (Bennett et al, 1995).
O custo médio do Transplante combinado gira em torno de 110.000 a 125.000
dólares, durante o período de internação, de acordo com dados americanos. (The Diabetes
Control and Complications Trial Research Group, 1993). No Brasil, apesar do alto custo
deste procedimento, o governo tem se esforçado para mantê-los rotineiros; o valor pago
pelo governo é de 13.000 dólares americanos, em média. Apesar desse valor ser baixo em
relação aos valores pagos nos países desenvolvidos, o Brasil se destaca positivamente no
cenário mundial, quando se analisa o número de transplantes por renda per capita (Selby et
al, 1990). Por ser um país em desenvolvimento, com reduzidos recursos para saúde, é
importante que se tente economizar nos procedimentos de alto custo, desde que esta
economia não acarrete perda de qualidade.
O sucesso de um transplante depende de vários fatores, que inclui: o perfil do
doador, a captação do pâncreas, o perfil do receptor e o ato do transplante em si. A partir da
década de 60, o estudo da preservação de órgãos se tornou proeminente. O princípio é
manter sua viabilidade pelo maior tempo possível, para que, quando transplantado, o órgão
funcione imediatamente (Krishnamurthi et al, 2001).
As soluções de preservação, que contêm substâncias osmoticamente ativas para
impedir a entrada de água nas células em isquemia, vêm sendo estudadas e aprimoradas
(American Diabetes Association, 2000). Existem diversas formas no mercado, mas duas
delas se destacaram na prática clínica. Na década de 70, houve o desenvolvimento da
solução de Euro-Collins e, mais recentemente, na década de 80, a solução de Belzer (Kuo
et al, 1997).
3
Toledo-Pereyra et al (1979) demonstraram, em experimento com animais, que
soluções cristalóides, como a de Euro-Collins, não eram suficientes para manter a
preservação do pâncreas por mais de 24 horas, sendo necessário empregar outras
soluções. Abouna et al. (1988) revelaram que a solução de Euro-Collins, em transplante de
pâncreas em cachorro, era insuficiente na preservação após 48 horas de isquemia do
órgão. O enxerto apresentava áreas de necrose e autólise, possivelmente causadas por
oclusão vascular periférica pela precipitação do magnésio em ambiente alcalino.
Apesar da solução de Euro-Collins ter predominado na preservação dos transplantes
de pâncreas até o final da década de 80, Sutherland et al (1987) concluíram que esta
solução não era a mais adequada para este fim.
Toledo-Pereira et al (1985), demonstraram experimentalmente que para atingir 48-72
horas de isquemia, outras soluções necessitavam ser desenvolvidas, pois a solução de
Euro-Collins se mostrava ineficaz, tornando o seu uso um procedimento de risco.
Em 1987, Wahlberg et al. experimentaram a utilização de uma nova solução de
preservação, a de Belzer, no transplante de pâncreas em cachorro, que atingiu 72 horas de
preservação com boa qualidade do enxerto.
Belzer, em 1993, demonstraram que, utilizando sua solução na preservação dos
pâncreas transplantados, o índice de não funcionamento primário do enxerto foi de apenas
0,5%, com tempo médio de isquemia de 18 horas. Esta revolucionária solução ganhou
popularidade e se tornou a solução de preservação padrão nos transplantes, inclusive o de
pâncreas.
Múltiplas técnicas de captação de órgãos com a infusão de soluções geladas pela
aorta têm sido descritas (D’Alessandro et al, 1990). Utiliza-se, em geral, em torno de dois
litros da solução de Belzer, mais um litro no saco plástico onde se armazena o pâncreas
para a realização da “cirurgia de banco” à espera do transplante (Sollinger et al, 1998).
O custo de 1 litro da solução de Belzer é 400 dólares americanos. Utilizam-se, em
geral, 3 litros durante o transplante de pâncreas-rim, gastando-se desta forma
aproximadamente 1200 dólares americanos, ou seja, 8,0% do valor pago pelo governo
4
brasileiro por todo o procedimento. Assim, é notório o valor da solução de Belzer no custo
do transplante combinado pâncreas-rim.
Por outro lado, apesar de a solução de Belzer ser a solução padrão, já houve
questionamento desta em relação ao transplante hepático. Pirenne et al, (2001)
demonstraram que infundindo-se pela aorta uma solução de menor viscosidade que a
solução de Belzer, obtiveram menor índice de estenose da via biliar, provavelmente pelo
fato de a solução penetrar com mais facilidade e rapidez nos pequenos canalículos
vasculares, impedindo, assim, a estagnação de sangue e a formação de pequenos trombos
(Uhlmann et al, 2002).
A solução de Euro-Collins é uma solução mais barata, podendo ser, inclusive,
fabricada em instituições brasileiras ou comprada por 10 dólares americanos, ou seja, em
média, 40 vezes menos que a solução de Belzer. (Hospital São Paulo - Setor de Compras)
O primeiro litro da solução de preservação tem por finalidade iniciar o resfriamento e
retirar o sangue do órgão a ser captado. A solução de Euro-Collins, por ser menos viscosa
(Uhlman et al, 2002), poderia ser utilizada nesta primeira lavagem para substituição do
sangue quente de uma forma rápida e efetiva, sendo que a posterior infusão da solução de
Belzer permaneceria durante todo o período de preservação. Esta mudança traria uma
sensível diminuição nos custos do procedimento.
Schwartz et al (1991) descreveram, pela primeira vez, a utilização das soluções de
Euro-Collins e Belzer de forma sequencial para o transplante de fígado com sucesso.
Gonzalez et al (2005) estudaram a primeira série de casos clínicos comparando a utilização
da solução de Euro-collins e em seqüência a solução de Belzer e, a solução de Belzer
isoladamente no transplante combinado pâncreas-rim, demonstrando não existirem
diferenças quanto ao resultado clínico. Contudo, até o momento, ainda não está bem
estabelecida a utilização das duas soluções e nem há estudo experimental comprovando a
sua eficácia. Isto nos motivou a estudar o uso sequencial da solução de Euro-Collins e
Belzer para o transplante de pâncreas.
5
2 OBJETIVO
6
2 OBJETIVO
Investigar o efeito da perfusão sequencial do pâncreas de ratos com as soluções de Euro-collins e Belzer na fase de preservação.
7
3 MÉTODO
8
3 MÉTODO
3.1 Amostra
Foram utilizados 45 ratos Wistar-EPM fêmeas com idade variando de 3 a 6 meses.
Os procedimentos operatórios obedeceram aos critérios, normas técnica e direitos
internacionais de pesquisa em animais, do Comitê de Ética do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA). O estudo foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética
em Pesquisa da UNIFESP-EPM ( anexo1).
3.2 Distribuição dos animais
Os animais foram distribuídos em 4 grupos não pareados, de acordo com a solução
utilizada para perfusão e preservação:
- Grupo Soro Fisiológico (SF) – Animais perfundidos e preservados em soro fisiológico
(n=7).
- Grupo Euro-Collins (C) – Animais perfundidos e preservados em solução de Euro-Collins
(n=13).
- Grupo Belzer (B) – Animais perfundidos e preservados em solução de Belzer (n=18).
- Grupo Euro-Collins/Belzer (CB) – Animais perfundidos com solução de Euro-Collins e
Belzer em partes iguais e seqüencialmente e preservados em solução de Belzer (n=7).
3.3. Componentes da solução
Os componentes da solução de Euro-Collins e da solução de Belzer utilizadas no
experimento estão descritos nos quadros 1 e 2.
9
Quadro 1 Componentes da solução de Euro-Collins
Componentes Volume
Potássio 115 (mM)
Sódio 10 (mM)
Fosfato 57,5 (mM)
Magnésio 30 (mM)
Sulfato 30 (mM)
Glicose 140 (mM)
Osmolalidade 350 (mosm/L)
PH 7.1
Fonte: Southard et al (1995)
Quadro 2 Componentes da solução de Belzer
Componentes Volume
K Lactobionato 100 (mmol/L)
KH2PO4 25 (mmol/L)
MgSo4 5 (mmol/L)
Rafinose 30 (mmol/L)
GSH 3 (mmol/L)
Adenosina 5 (mmol/L)
Alopurinol 1 (mmol/L)
Pentafração 50 (g/L)
Penicilina 200.000 (U/L)
Insulina 40 (U/L)
Dexametasona 16 (mg/L)
Sódio 25 (mmol/L)
Potássio 125 (mmol/L)
Osmolalidade 320 (mOsm/L)
Ph 7.4
Fonte: Southard et al (1995)
10
3.4 Delineamento da pesquisa
O esquema abaixo ilustra os procedimentos realizados nos respectivos grupos.
3.5 Procedimentos
Os animais foram inicialmente mantidos em gaiolas comunitárias com número
máximo de 6 animais, por 24 horas antes do experimento no Biotério da UNIFESP-EPM,
com ciclo normal de dia e noite.
3.5.1 Preparo pré-operatório e anestesia
RATOS WISTAR-EPM (n= 45)
GRUPO SF (n= 7)
GRUPO EURO-
COLLINS (n= 13)
GRUPO BELZER (n= 18)
GRUPO EURO-COLLINS/BELZER
(n= 7)
PERFUSÃO COM 20 ml DE SORO FISIOLÓGICO
PERFUSÃO COM 20 ml DE EURO-
COLLINS
PERFUSÃO COM 20 ml DE BELZER
PRESERVAÇÃO COM SORO
FISIOLÓGICO
PRESERVAÇÃO COM EURO-
COLLINS
PRESERVAÇÃO COM BELZER
PRESERVAÇÃO COM BELZER
COLETAS DE AMILASE E HISTOLOGIA
COLETAS DE AMILASE E HISTOLOGIA
COLETAS DE AMILASE E HISTOLOGIA
COLETAS DE AMILASE E HISTOLOGIA
PERFUSÃO COM 10 ml DE BELZER
PERFUSÃO COM 10 ml DE EURO-COLLINS
11
Os animais permaneceram em jejum no pré-operatório por 12 horas. Todos os
animais foram anestesiados e operados pelo mesmo cirurgião (V.S.) no Laboratório de
Cirurgia Experimental da Disciplina de Técnica Operatória da UNIFESP-EPM. No dia do
experimento foram pesados e submetidos à anestesia geral. A anestesia utilizada foi a
combinação de Ketamina (20%) e Xelasina (80%), na dose de 0,1ml/100g de peso do
animal, por via intra-peritoneal. Após a anestesia, o animal foi levado à mesa cirúrgica,
sendo mantido na posição dorsal por meio da contenção dos 4 membros. A anti-sepsia da
pele foi feita com álcool 70%. A seguir, o campo operatório foi delimitado utilizando-se
gazes estéreis e o ato operatório realizado com técnica asséptica.
3.5.2. Técnica operatória
Foi realizada uma laparotomia mediana com exposição da cavidade abdominal. A
partir deste momento foi utilizado o microscópio D. F. Vasconcellos, modelo M 900 com
aumento de 16 X. O duodeno foi exposto e ligado com fio de algodão 2-0 em dois pontos,
logo após o piloro e na transição duodeno-jejunal (figura 1), nas porções duodenais que
englobam o tecido pancreático.
Figura 1 – Fotografia demonstrando os locais onde o duodeno foi ligado (setas).
12
A seguir, foi realizada a identificação e dissecção da aorta abdominal, e o
posicionamento dos reparos com fio de algodão 2-0, junto ao diafragma (figura 2) e ao nível
das artérias renais (figura 3) a fim de delimitar os limites proximal e distal. Em seqüência foi
reparada a veia cava inferior ao nível da veia renal direita, onde foi puncionada e injetado,
com seringa de 1 ml e agulha 23G, o volume de 0,1 ml de heparina e aguardado o tempo de
1 minuto.
Figura 2 – Fotografia demonstrando o local no qual a aorta foi reparada (seta).
13
Figura 3 – Fotografia demonstrando a aorta infra-renal reparada com o fio de algodão
(seta).
A aorta ao nível da artéria renal foi puncionada com Gelco 22 (figura 4) e o mesmo
fixado neste ponto com algodão 2-0.
Figura 4 – Fotografia demonstrando o Gelco 22 fixado na aorta.
A seguir, a aorta infra-diafragmática foi ligada e iniciada a infusão da solução pré-
destinada através do uso de bomba de infusão (SAMTRONIC, modelo ST 670 – fluxo de
150 ml/hora) com volume total de 20 ml. Neste momento foi seccionada a veia cava inferior
intra-torácica por meio de toracotomia anterior para drenagem do perfusato (figuras 5 e 6).
14
Figura 5 – Fotografia demonstrando: seta escura indicando local da secção da veia
cava inferior intra-torácica, seta branca indicando local da toracotomia anterior.
Figura 6 – Fotografia demonstrando a secção da veia cava inferior com drenagem do
perfusato (seta).
15
No grupo Euro-collins-Belzer foi infundido inicialmente 10 ml da solução de Euro-
collins seguido de 10 ml da solução de Belzer. Após a perfusão com a solução designada, o
duodeno, juntamente com o pâncreas, foi ressecado (figura 7 e 8).
Figura 7 – Fotografia demonstrando o aspecto do pâncreas após a perfusão (seta).
Figura 8 – Fotografia demonstrando a peça ressecada (duodeno e pâncreas).
A peça foi então pesada em balança digital (figura 9) (modelo GEHAKA – BG 400) e
imersa no mesmo tipo de solução infundida, no volume de 20 ml, dentro de um frasco de
coleta. No grupo Euro-collins-Belzer foi colocada a solução de Belzer no líquido de
preservação.
16
Figura 9 – Fotografia demonstrando a peça ressecada e pesada.
O frasco de coleta, contendo o órgão e a solução, foi mantido em geladeira a 4ºC por
48 horas.
3.6 Variáveis estudadas
3.6.1 Amilase
A dosagem de amilase foi realizada pelo método colorimétrico enzimático com o kit
Bayer – 1650, no aparelho ADVIA 1650 Chemistry System
Foram realizadas coletas de 2 ml do líquido de preservação após 12, 24, 36 e 48
horas da ressecção do órgão. O volume retirado era reposto conforme o líquido de
preservação utilizado. Estas amostras foram enviadas ao Laboratório Central da UNIFESP-
EPM para dosagem de amilase.
.
3.6.2 Histologia
A avaliação histológica dos enxertos pancreáticos foi realizada após 48 horas de
preservação. As peças foram retiradas do frasco de preservação e fixadas em solução
17
aquosa de formaldeído a 10%. O fragmento da peça, a ser incluído em parafina, foi obtido
por secção, no sentido longitudinal ao plano mediano do parênquima pancreático, de forma
a abrangê-lo completamente.
Foram realizados, em micrótomo, 3 cortes com 5 micra de espessura, escalonados,
em cada superfície de secção. Posteriormente, os fragmentos foram estendidos em banho-
maria, colados em lâminas de vidro e corados pelo método de Hematoxilina-eosina.
Um único patologista do Departamento de Patologia – UNIFESP EPM (R.A), avaliou
as peças, sem conhecimento do grupo a qual pertencia o órgão. Esta análise avaliou a
presença e a intensidade de: edema (leve ou moderado), infiltrado inflamatório (leve ou
moderado), necrose de ilhotas (ausente, leve ou intenso) e necrose tecidual (ausente, leve
ou intenso), de acordo com a classificação utilizada por Schmidt et al (1992).
3.7 Análise estatística
Para as variáveis quantitativas (PESO do animal, PESO da peça e AMILASE) foram
calculadas medidas resumo tais como média, desvio-padrão, mediana, mínimo e máximo
para cada um dos grupos avaliados. No caso da amilase, como foi realizada mais do que
uma medida ao longo do tempo então essas medidas também foram calculadas em cada
um dos tempos de avaliação. A comparação do peso tanto do animal como da peça foi
realizada através de uma análise de variância com um fator (ANOVA-ONEWAY) seguido de
comparações múltiplas do tipo Tukey para detectar possíveis diferenças entre os grupos
avaliados (Altman, 1991).
Como a Amilase foi avaliada ao longo do tempo (12, 24, 36 e 48 horas) isso induz
uma correlação entre as medidas. Foi utilizado um modelo de Análise de Variância
(ANOVA) com medida repetida que permitiu a inclusão do efeito do Grupo (Soro Fisiológico,
Euro-Collins, Belzer e Euro-Collins/Belzer), Tempo (12, 24, 36 e 48 horas) e a interação
18
entre Grupo e Tempo. Possíveis diferenças entre as categorias desses efeitos foram
avaliadas através da construção de contrastes (Singer et al, 2000).
A associação entre os parâmetros da análise da microscopia e grupo foi avaliada
através do teste do Qui-Quadrado ou Generalização do Teste Exato de Fisher caso alguma
das freqüências esperadas fosse menor do que 5 (Altman, 1991).
Em toda análise estatística foi adotado um nível de significância de 5% (alfa=0,05),
ou seja, foram considerados significantes resultados que apresentaram p-valor inferior a 5%
(p<0,05).
Para o cálculo do tamanho da amostra e a distribuição dos animais entre os grupos,
foi calculado o poder do efeito de interação obtido da ANOVA com medida repetida fixando-
se o nível de significância (Erro Tipo I) em 5%. O poder obtido para o efeito da interação
entre Grupo e Tempo foi de 90%, ou seja, se de fato houver alguma diferença entre os
grupos ao longo do tempo, a probabilidade dessa diferença ser detectada é de 90%.
19
4 RESULTADOS
20
4 RESULTADOS
4.1 Tamanho da amostra Os grupos foram considerados comparáveis entre si segundo a análise estatística do
cálculo do tamanho da amostra.
4.2 Peso dos animais em cada grupo
Tabela 1 - MEDIDAS DESCRITIVAS DO PESO DOS ANIMAIS SEGUNDO O GRUPO
GRUPO
Soro Fisiológico Euro-collins Belzer
Euro-
collins/Belzer
Média 195,0 203,1 210,9 263,6
Desvio padrão 29,3 16,7 21,7 28,8
Mediana 190,0 200,0 203,5 260,0
Mínimo 160,0 170,0 180,0 220,0
Máximo 240,0 230,0 250,0 300,0
Nº animais 7 13 18 7
Por meio da análise de variância (ANOVA-ONEWAY) observou-se diferença
estatisticamente significante do peso médio dos animais (p<0,001). Através do método de
comparações múltiplas de Tukey observou-se que os animais dos grupos: Soro Fisiológico,
Euro-Collins e Belzer apresentaram pesos semelhantes (p=0,409). Somente os animais do
grupo Euro-Collins/Belzer apresentaram peso maior que os outros três grupos (p<0,001).
21
4.3 Peso da peça ressecada em cada grupo
Tabela 2 - MEDIDAS DESCRITIVAS DO PESO DA PEÇA RESSECADA SEGUNDO O GRUPO
GRUPO
Soro Fisiológico Euro-Collins Belzer
Euro-
Collins/Belzer
Média 1,51 1,50 1,35 1,66
Desvio padrão 0,29 0,26 0,20 0,25
Mediana 1,52 1,45 1,31 1,72
Mínimo 1,05 1,07 1,06 1,34
Máximo 1,93 2,12 1,77 1,92
Nº animais 7 13 18 7
Por meio de uma análise de variância (ANOVA-ONEWAY) observou-se diferença
estatisticamente significante do peso médio da peça ressecada dos animais (p=0,036).
Através do método de comparações múltiplas de Tukey observou-se que o peso médio da
peça ressecada dos animais do grupo Euro-Collins/Belzer foi maior do que o do grupo
Belzer (p=0,029). Os grupos Soro Fisiológico, Euro-Collins e Belzer não se diferenciaram
em termos do peso da peça ressecada (p>0,307). Não foram encontradas diferença
estatisticamente significante do peso da peça ressecada entre os grupos Soro Fisiológico,
Euro-Collins e Euro-Collins/Belzer (p>0,513).
22
4.4 Valores de amilase no líquido de preservação
As Tabelas 3 a 6 apresentam as medidas para os valores médios de amilase ao
longo do tempo para cada grupo. De acordo com essas tabelas pode-se observar que todos
os grupos apresentaram aumento progressivo dos níveis de amilase ao longo do tempo,
porém este aumento apresentou variabilidade ao longo do tempo e entre os grupos; com
exceção do grupo Soro Fisiológico que teve um aumento da variabilidade do tempo 12
horas para o tempo 24 horas, porém do tempo 24 horas para o tempo 36 horas essa
variabilidade apresentou um decréscimo e voltou a aumentar no tempo 36 horas.
Tabela 3 - VALOR DE AMILASE NO GRUPO SORO FISIOLÓGICO AO LONGO DO TEMPO
Tempo
Soro Fisiológico 12 horas 24 horas 36 horas 48 horas
Média 1869,9 3116,4 4077,5 4484,8
Desvio padrão 669,0 1027,6 684,4 1101,9
Mediana 2180,0 3560,0 4330,0 4802,0
Mínimo 819,0 1335,0 3070,0 2980,0
Máximo 2650,0 4091,0 4580,0 5355,0
Nº animais 7 7 7 7
Legenda:
Amilase expressa em UI/ml
23
Tabela 4 - VALOR MÉDIO DE AMILASE NO GRUPO EURO-COLLINS AO LONGO DO TEMPO
Tempo
Euro-collins 12 horas 24 horas 36 horas 48 horas
Média 1453,2 2823,5 3587,1 4413,6
Desvio padrão 1046,7 1932,5 2306,8 2677,7
Mediana 990,0 2235,0 2640,0 3440,0
Mínimo 315,0 554,0 1530,0 1780,0
Máximo 3950,0 6925,0 7695,0 9230,0
Nº animais 13 13 13 13
Legenda:
Amilase expressa em UI/ml
Tabela 5 - VALOR MÉDIO DE AMILASE NO GRUPO BELZER AO LONGO DO TEMPO
Tempo
Belzer 12 horas 24 horas 36 horas 48 horas
Média 763,8 1619,3 2822,2 3806,5
Desvio padrão 486,4 849,3 1477,7 1923,0
Mediana 610,0 1449,5 2761,5 3506,5
Mínimo 190,0 378,0 569,0 721,0
Máximo 2067,0 4131,0 6218,0 7207,0
Nº animais 18 18 18 18
Legenda:
Amilase expressa em UI/ml
24
Tabela 6 - VALOR MÉDIO DE AMILASE NO GRUPO EURO-COLLINS/BELZER AO LONGO DO TEMPO
Tempo
Euro-
Collins/Belzer 12 horas 24 horas 36 horas 48 horas
Média 780,7 1917,9 3625,3 5157,5
Desvio padrão 248,9 827,5 1090,9 1481,4
Mediana 738,0 2015,0 3227,0 4805,0
Mínimo 442,0 923,0 2260,0 3770,0
Máximo 1093,0 3009,0 5101,0 7250,0
Nº animais 7 7 7 7
Legenda:
Amilase expressa em UI/ml
A Figura 10 apresenta os valores médios e erro padrão de amilase ao longo do
tempo.
Figura 10: Gráfico demonstrando média e erro padrão dos valores de amilase ao longo do
tempo de preservação de todos os grupos.
25
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0 12 24 36 48Tempos de Coleta (h)
Nív
el S
éric
o de
Am
ilase
SF Collins Belzer Collins-Belzer
Por meio da Figura 10 pode ser observado que o grupo Belzer apresentou níveis de
amilase menores do que o apresentado pelas outras três soluções ao longo de todo o
tempo. O grupo Euro-Collins/Belzer apresentou até 24 horas um comportamento de amilase
próximo ao apresentado pelo grupo da solução Belzer, no tempo 36 horas a média de
amilase apresentada pelos grupos Euro-Collins/Belzer e Euro-Collins não apresenta
diferenças. No tempo 48 horas o grupo Euro-Collins/Belzer apresentou média de amilase
maior do que os outros três grupos, sendo essa média a maior de todo o experimento.
Pelo teste de ANOVA verificou-se efeito significante de interação entre grupo e tempo
(p<0,001), ou seja, os grupos não apresentaram ao longo do tempo o mesmo
comportamento de amilase.
Os grupos Soro Fisiológico e Euro-Collins apresentaram, em média, o mesmo
comportamento de amilase ao longo das quatro coletas (p=0,288), além disso não foi
observada diferença estatisticamente significante entre o valor médio de amilase
apresentado por esses dois grupos ao longo de toda coleta (p=0,855). Para os grupos Soro
26
Fisiológico e Euro-Collins ocorreu um acréscimo médio do valor de amilase do tempo 12h
para o tempo 36h estimado em 2436,9 ± 450,9 UI/ml (p<0,001).
Entre os tempos 12h e 24h os grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer apresentaram
valores similares de amilase (p=0,385). Do tempo 12h para o tempo 24 horas esses grupos
apresentaram um aumento médio na quantidade de amilase estimado em 996,3 ± 160,3
UI/ml (p<0,001).
No tempo 36 horas os grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer apresentaram valores
similares de amilase (p=0,320).
No tempo 48 horas o grupo Euro-Collins/Belzer apresentou, em média, 1883,5 ±
999,5 UI/ml a mais de amilase do que o grupo Belzer, porém o teste estatístico para essa
comparação mostrou-se apenas marginalmente significante uma vez que o valor de p obtido
foi de p=0,067, portanto sem significância estatística para este período.
Também pode ser observado através das Tabelas 3 a 6 que o comportamento da
mediana do nível de amilase foi o mesmo descrito para a média do nível de amilase.
4.5 Histologia
Os achados histológicos estão relacionados na tabela 7 e nas Figuras 11, 12, 13 e 14.
27
Tabela 7 - DISTRIBUIÇÃO DOS PARÂMETROS DA ANÁLISE HISTOLÓGICA OBSERVADOS NOS GRUPOS
GRUPOS
SF
(n=7)
Euro-Collins/Belzer
(n=13)
Belzer
(n=18)
CB
(n=7)
p-valor+
Edema 0,001 *
Leve 4 (57,1%) 2 (15,4%) 12 (66,7%) 7 (100,0%)
Moderado 3 (42,9%) 11 (84,6%) 6 (33,3%) -
Necrose Tecidual
0,610
Ausente 1 (14,3%) 1 (7,7%) 1 (5,6%) -
Leve 5 (71,4%) 8 (61,5%) 14 (77,8%) 7 (100,0%)
Intenso 1 (14,3%) 4 (30,8%) 3 (16,7%) -
Necrose de Ilhotas
0,001 *
Ausente 1 (14,3%) 1 (7,7%) 4 (22,2%) 3 (42,9%)
Leve 1 (14,3%) 8 (61,5%) 14 (77,8%) 4 (57,1%)
Intenso 5 (71,4%) 4 (30,8%) - -
Infiltrado Inflamatório
0,171
Leve 7 (100,0%) 11 (84,6%) 18 (100,0%) 7 (100,0%)
Moderado - 2 (15,4%) - -
Legenda: + Generalização do Teste Exato de Fisher
* Significância estatística
28
0%
20%
40%
60%
80%
100%
SF Collins Belzer CB
Tipos de soluções
LeveModerado
Figura 11 – CLASSIFICAÇÃO DO EDEMA DE ACORDO COM O GRUPO
0%
20%
40%
60%
80%
100%
SF Collins Belzer CB
Tipos de soluções
AusenteLeveIntenso
Figura 12 – CLASSIFICAÇÃO DA NECROSE TECIDUAL DE ACORDO COM O GRUPO
29
0%
20%
40%
60%
80%
100%
SF Collins Belzer CB
Tipos de soluções
AusenteLeveIntenso
Figura 13 – CLASSIFICAÇÃO DE NECROSE DE ILHOTAS DE ACORDO COM O GRUPO
0%
20%
40%
60%
80%
100%
SF Collins Belzer CB
Tipos de soluções
LeveModerado
Figura 14 – CLASSIFICAÇÃO DE INFILTRADO INFLAMATÓRIO DE ACORDO COM O GRUPO
4.5.1 Análise histológica
Quanto à necrose tecidual e infiltrado inflamatório, os achados foram semelhantes
entre os grupos (p>0,05). (figura 15)
30
No entanto a avaliação quanto ao edema e necrose de ilhotas mostrou uma relação
estatisticamente significante relacionada a solução de preservação (p=0,001).
O achado de edema foi similar nos grupos Soro Fisiológico e Euro-Collins (maior
número em grau moderado). Os grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer apresentaram achado
de edema similar (maior número grau leve). Esta diferença entre os grupos (Belzer e Euro-
Collins/Belzer) e (Soro Fisiológico e Euro-Collins) mostrou-se estatisticamente significante.
Necrose de ilhotas (figura 16 e 17) também se mostrou associada com o tipo de
solução (p=0,001). Os grupos que apresentaram maior grau de necrose foram o Soro
Fisiológico e Euro-Collins quando comparados aos grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer.
Esta diferença entre os grupos (Belzer e Euro-Collins/Belzer) e (Soro Fisiológico e Euro-
Collins) mostrou-se estatisticamente significante.
Figura 15 – FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO NECROSE TECIDUAL (SETA) NO PÂNCREAS DO GRUPO SORO FISIOLÓGICO. (400 X HE)
31
Figura 16 - FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO NECROSE DE ILHOTAS (SETA) NO PÂNCREAS DO GRUPO EURO-COLLINS. (400 X HE)
Figura 17 - FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO ASPECTO NORMAL DE ILHOTA NO PÂNCREAS DO GRUPO CB. (400 X HE)
32
5 DISCUSSÃO
33
5 DISCUSSÃO
Em 1967 deu-se o início a era dos transplantes de pâncreas e rim; Kelly et al.
(1967), relataram os dois primeiros pacientes transplantados rim-pâncreas. Desde então,
numerosas mudanças foram feitas a fim de se diminuir a morbidade e a mortalidade
associadas a este procedimento.
Em 1979, Calne et al. introduziram o uso da ciclosporina na prática clínica, com
grande melhora na imunosupressão. Aprimoramentos da técnica cirúrgica (Cook et al,
1983), o entendimento nos eventos celulares associados à rejeição e preservação dos
órgãos, os melhores esquemas antibióticos, a evolução no diagnóstico radiológico e
abordagens percutâneas trouxeram resultados bastante animadores (Kuo et al, 1997).
No entanto, apesar de o transplante de pâncreas estar ganhando popularidade,
com aumento progressivo no número de centros ao redor do mundo, ele ainda continua
sendo o transplante com o maior índice de complicações cirúrgicas entre todos os órgãos
sólidos, o que o torna um procedimento de alto custo (Humar et al, 2000). Segundo dados
americanos o custo médio atual do transplante de pâncreas – rim durante o período de
internação é de US$ 110.000 a 125.000 dólares (Kuo et al, 1997).
Stratta et al (1997) avaliaram o custo hospitalar do transplante de pâncreas – rim
em duas épocas (1991 e 1995) e notaram diminuição no tempo de internação e no uso de
recursos hospitalares. No entanto, o aumento dos gastos no processo de captação de
órgãos fez com que o custo hospitalar nos dois períodos se mantivesse estável, em torno de
US$ 111.000 dólares (Stratta et al, 1997).
De acordo com Belzer et al (1993), o objetivo da preservação de órgãos a serem
transplantados é que permita usar o maior número de órgãos possível, com a máxima
qualidade e com o menor custo.
34
No processo de preservação, três princípios básicos devem ser notados: a
hipotermia, a prevenção do edema celular e os efeitos bioquímicos (Belzer et al, 1993). A
hipotermia retarda o efeito da isquemia, entretanto, diminui o metabolismo e inibe a bomba
de sódio e potássio da membrana, uma das responsáveis pelo edema celular. Durante a
isquemia, a quebra da glicose, por processo anaeróbio, é estimulada. Neste momento,
torna-se importante à utilização das soluções de preservação (Olthoff et al, 1990).
Diversas substâncias vêm sendo estudadas para a preservação de órgãos, contudo
duas delas têm se destacado; a partir da década de 70, houve o surgimento da solução de
Euro-collins e, mais recentemente, na década de 80, a solução de Belzer (Southard et al,
1995).
Numerosos estudos têm sido realizados com ambas as soluções com o intuito de
melhor definir e aprimorar a utilização e as limitações, contudo, a indiscutível eficácia da
solução de preservação de Belzer revolucionou a prática dos transplantes, tornando-a a
solução padrão-ouro na preservação dos órgãos abdominais (Uhlmann et al, 2002; Toledo-
Pereyra et al, 1979, Abouna et al, 1988; Stratta et al, 1990).
Por outro lado, o alto custo da solução de Belzer (Adam et al, 1996) e à
exclusividade de benefícios associada ao seu uso, fazem necessários novos estudos a fim
de se encontrar a melhor relação custo-benefício; ou seja, uma solução de custo baixo e
efetividade comprovada.
Na prática clínica, o alto custo da solução de Belzer, faz com que muitas equipes
responsáveis pela captação de fígados utilizem esquemas diversos, como fazer uso da
solução de Euro-Collins previamente à de Belzer, ou mesmo de outras soluções, como
histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK) ou Celsior.
Assim sendo, o desenvolvimento de uma solução de preservação ideal é assunto
de grande interesse no meio médico, visto que o número de transplantes vêm aumentando
significantemente nos últimos anos (American Diabetes Association, 2000).
Gonzalez et al (2005) descreveram a primeira série de casos clínicos comparando a
utilização da solução de Euro-Collins e em sequência a solução de Belzer isoladamente no
35
transplante combinado pâncreas-rim, mostrando não existirem diferenças quanto ao
resultado clínico e, com a vantagem de custos menores.
Até o presente momento nenhum trabalho experimental foi realizado na tentativa de
comprovar a eficácia da utilização da solução de Euro-Collins e Belzer de forma seqüencial
na perfusão do pâncreas.
Na intenção de investigar os efeitos da associação de duas soluções no transplante
de pâncreas, após a análise da literatura, dois trabalhos demonstraram que a dosagem da
amilase no líquido de preservação, pode demonstrar a viabilidade do tecido pancreático
perfundido (Kinasiewicz et al, 2003; Fiedor et al, 1996). Com a progressão do tempo de
isquemia, existe uma liberação de amilase pelo tecido pancreático, estando relacionada à
elevação do seu valor à evolução da lesão tecidual (Kinasiewicz et al, 2003; Fiedor et al,
1996). A partir destes relatos, a dosagem de amilase no líquido de preservação pôde ser
utilizada como um parâmetro laboratorial de forma a predizer o grau de lesão tecidual do
pâncreas ao longo do tempo. Ainda, a dosagem de amilase do líquido de preservação,
possui utilidade prática para o uso rotineiro em um ambiente de captação de órgãos em
seres humanos, tornando este método factível e realista para as equipes de captação de
órgãos.
Hoffmann et al (1995) demonstraram que a lesão de isquemia-reperfusão provoca
uma reação inflamatória similar à causada por um quadro de pancreatite aguda. Neste
sentido, a análise histológica foi definida como parâmetro de avaliação por ser um método já
bem estabelecido e descrito por Schmidt FV et al. (1992), de baixo custo, praticidade e
aplicabilidade a fim de se avaliar a lesão de isquemia, em moldes similares às avaliações de
quadros pancreáticos inflamatórios como os de pancreatite aguda.
Numerosos trabalhos experimentais têm utilizado o rato com sucesso para o
transplante de pâncreas (Obermaier et al, 2002; Vollmar et al, 1999), devido a facilidade de
obtenção, baixos custos e ter características histológicas similares ao ser humano. Por
estes motivos utilizou-se o rato neste estudo.
No grupo Belzer foram alocados maior número de animais. Apesar do número de
animais ser diferente nas quatro amostras, não houve prejuízo na análise estatística.
36
A técnica operatória para perfusão e ressecção do pâncreas, foi baseada nos
trabalhos de Lee et al (1972) e Yongping et al (2001) e adaptada para realização no
Laboratório de Cirurgia Experimental da Técnica Operatória da UNIFESP- EPM.
No transplante clínico de pâncreas em adulto, a perfusão do órgão é feita com cerca
de 2 litros de Belzer, independentemente do peso do paciente ou do órgão. Utilizamos no
nosso experimento um método similar ao que é feito no transplante clínico, com uma
perfusão padrão de 20 ml independentemente do peso do animal; volume no qual ocorre o
clareamento total do órgão. Foi utilizada uma bomba de infusão a fim de manter estável o
fluxo, minimizando assim a lesão por alteração de fluxo e pressão da perfusão.
O tempo das coletas para dosagem de amilase foi padronizado de acordo com
resultados obtidos em um projeto piloto no qual evidenciou-se que o nível de amilase cresce
até o período de 48 horas. A partir deste período os valores tornam-se heterogêneos devido
à necrose do órgão. Para a análise histológica, padronizou-se o tempo de 48 horas baseado
no projeto piloto, aonde foi notado que antes deste período não são detectáveis alterações
histológicas.
Pode-se observar que existe ao longo do tempo um aumento do valor da amilase nas
soluções de preservação. Este aumento está relacionado à liberação de amilase pelo tecido
pancreático que sofre a lesão de isquemia (Kinasiewicz et al, 2003; Fiedor et al, 1996). O
aumento progressivo demonstra a progressão da lesão (Kinasiewicz et al, 2003).
Embora os animais do grupo Collins-Belzer tenham apresentado o maior peso
corporal e o maior peso da peça ressecada, os valores de amilase não foram maiores que
dos outros grupos, mostrando que este fato não alterou os resultados.
Os grupos Euro-Collins e Soro Fisiológico apresentaram valores de amilase em 12
horas superiores estatisticamente em relação aos grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer;
diferença esta que permaneceu até 24 horas de isquemia. Isto sugere que a associação das
duas soluções (Euro-Collins + Belzer) produz resultado similar quanto à preservação
quando avaliado pelo valor de amilase no líquido de preservação. Após este período não
houve diferença estatística entre os grupos (Belzer e Euro-Collins/Belzer) e (Soro Fisiológico
37
e Euro-Collins) em relação ao valor da amilase, levando a pensar que, após 24 horas, o
efeito benéfico das soluções de preservação ”gold standard” diminui, e a produção de
amilase pelo pâncreas é acelerada, levando a níveis similares aos do grupo Soro Fisiológico
e Euro-Collins em períodos mais tardios.
Isto mostra que a preservação do órgão é semelhante nos grupos Belzer e Euro-
Collins/Belzer no período de 24 horas. Após este período a dosagem de amilase no grupo
Euro-Collins/Belzer passa a ser maior do que do grupo Belzer. No período 36 horas, embora
não haja significância estatística, a amilase do grupo Euro-Collins/Belzer é maior do que do
grupo Belzer e a diferença torna-se estatisticamente significante no período 48 horas.
Estes achados indicam que a preservação do pâncreas para transplante é tão boa no
grupo Belzer quanto no Euro-Collins/Belzer até 24 horas; após este período deve-se ficar
atento a um maior sofrimento no grupo Euro-Collins/Belzer.
A avaliação histológica em relação ao enxerto demonstrou não existir diferença
estatisticamente significante da distribuição de necrose tecidual e infiltrado inflamatório
segundo o tipo de solução empregada (p>0,005). Muito provavelmente isto ocorreu porque
a necrose tecidual é a última manifestação do processo de isquemia (Drognitz et al. 2004),
sendo necessário talvez, um período mais prolongado a fim de se evidenciar este tipo de
alteração.
Para o achado de edema, observou-se que no grupo Euro-Collins/Belzer todas as
peças apresentaram edema leve ao passo que para o grupo Euro-Collins, aproximadamente
85% dos enxertos apresentaram edema moderado. Através da Generalização do Teste
Exato de Fisher observou-se associação estatisticamente significante entre edema e tipo de
solução (p=0,001). Contudo, o achado de edema é pouco específico e está presente em
inúmeros processos inflamatórios que envolvem o pâncreas (Hackert et al. 2005).
Necrose de ilhotas também se mostrou associada com o tipo de solução empregada
(p=0,001) sendo que aproximadamente 71% dos animais no grupo Soro Fisiológico
apresentaram necrose de ilhotas intensa sendo que para os outros grupos a maioria das
peças apresentou necrose de ilhotas leve. A partir deste achado podemos caracterizar,
segundo alguns autores (Orsoni et al, 1993; Kuroda et al, 1992), que a necrose de ilhotas é
38
a primeira manifestação de isquemia. O encontro de diferença estatisticamente significante
entre os grupos Soro Fisiológico e Euro-Collins/Belzer, Euro-Collins e Euro-Collins/Belzer e
similaridade dos grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer nos faz pensar que, histologicamente,
os grupos Belzer e Euro-Collins/Belzer são similares. Logo, sofreram menor grau de
necrose de ilhotas e conseqüentemente menor lesão por isquemia do que os grupos Euro-
Collins e Soro Fisiológico.
A análise histológica mostrou não haver diferenças entre os grupos Belzer e Euro-
Collins/Belzer, porém como já foi comentado, a amilase mostrou diferença, por isso não se
recomenda a sua utilização em pâncreas perfundido com as soluções após 24 horas.
Podemos tentar avaliar se é o tecido pancreático localizado na periferia ou no centro
do enxerto o primeiro a sofrer as lesões e a liberar amilase no líquido de preservação, de
modo a que possa ser efetivamente contabilizada. Sabe-se que a superfície periférica do
enxerto se mantém embebida no líquido de preservação, enquanto que a parte mais central
do enxerto já sofreu o processo de perfusão e não mais mantém contato com o líquido
mantido no frasco de preservação. Assim sendo, pode-se supor que as células do órgão a
ser transplantado sofrem agressões diferentes se localizadas na periferia ou no centro do
órgão.
As peças ressecadas permaneceram imersas na solução de preservação. O grupo
Soro Fisiológico em soro fisiológico, o grupo Euro-Collins em solução de Euro-collins, o
grupo Belzer em solução de Belzer e o grupo Euro-Collins/Belzer em solução de Belzer.
Este líquido de preservação banha o tecido, teoricamente as células periféricas estariam
mais protegidas do que as células centrais, as quais receberam a solução de preservação
somente no momento da perfusão. Histologicamente este fato não foi comprovado.
Na prática clínica, tanto para o fígado quanto para o pâncreas, quando se perfunde
inicialmente com Euro-Collins e depois com Belzer, o líquido de preservação em que a peça
esta imersa é a solução de Belzer. Se a peça ficasse imersa na solução de Euro-Collins, os
custos iriam diminuir ainda mais. Isto abre a possibilidade de novos estudos perfundindo
inicialmente com Euro-Collins, a seguir o Belzer e imersão em Euro-Collins.
39
A partir dos achados provenientes dos valores de amilase e da análise histológica do
enxerto pudemos comprovar o benefício experimental do uso seqüencial das soluções de
Euro-Collins e Belzer na preservação do pâncreas em ratos. Ainda são necessários mais
estudos a fim de avaliar melhor o foco isquêmico no enxerto, a interação entre os tempos da
perfusão e preservação e suas relações com as soluções de preservação a fim de melhor
elucidar os mecanismos envolvidos na preservação de órgãos.
40
6 CONCLUSÃO
41
6 CONCLUSÃO
A aplicação das soluções de Euro-collins e Belzer de modo seqüencial mostrou-se
eficaz na preservação do pâncreas de ratos até o período de 24 horas.
42
7 ANEXOS
43
44
8 REFERÊNCIAS
45
1. Bennett PH, Haffner S, Kasiske BL, Keane WF, Mogensen CE, Parving HH, Steffes
MW, Striker GE. Screening and management of microalbuminuria in patients with
diabetes mellitus: recommendations to the Scientific Advisory Board of the National
Kidney Foundation from an ad hoc committee of the Council on Diabetes Mellitus of
the National Kidney Foundation. Am J Kidney Dis 1995; 25(1):107-12.
2. The Diabetes Control and Complications Trial Reasearch Group. The effect of
intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term
complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and
Complications Trial Research Group. N Engl J Med 1993; 329(14):977-86.
3. Selby JV, Fitz Simmons SC, Newman JM, Katz PP, Sepe S, Showstack J. The natural
history and epidemiology of diabetic nephropathy. Implications for prevention and
control. JAMA 1990; 263(14):1954-60.
4. Krishnamurthi V, Philosophe B, Bartlett ST. Pancreas transplantation: contemporary
surgical techniques. Urol Clin North Am 2001; 28(4):833-8.
5. Pancreas transplantation for patients with type 1 diabetes: American Diabetes
Association. Diabetes Care 2000; 23(1):117.
6. Kuo PC, Johnson LB, Schweitzer EJ, Bartlett ST. Simultaneous pancreas/kidney
transplantation--a comparison of enteric and bladder drainage of exocrine pancreatic
secretions. Transplantation 1997; 63(2):238-43.
7. Toledo-Pereyra LH, Chee M, Condie RM, Najarian JS, Lillehei RC. Forty-eight hours
hypothermic storage of whole canine pancreas allografts. Improved preservation with
a colloid hyperosmolar solution. Cryobiology. 1979; 16(3):221-8.
8. Abouna GM, Heil JE, Sutherland DE, Najarian JS. Factors necessary for successful
48-hour preservation of pancreas grafts. Transplantation 1988; 45(2):270-4.
9. Sutherland DE, Moudry KC. Clinical pancreas and islet transplantation Transplant
Proc 1987; 19:113-20.
46
10. Wahlberg JA, Love R, Landegaard L, Southard JH, Belzer FO. 72-hour preservation
of the canine pancreas. Transplantation 1987; 43(1):5-8.
11. Belzer FO. Evaluation of preservation of the intra-abdominal organs. Transplant Proc
1993; 25(4):2527-30.
12. D'Alessandro AM, Sollinger HW, Hoffmann RM, Kalayoglu M, Melzer JS, Reed A,
Knechtle SJ, Pirsch JD, Belzer FO. Experience with combined hepatic,
pancreaticoduodenal, and renal procurement with UW solution. Transplant Proc 1990;
22(4):2076-7.
13. Sollinger HW, Odorico JS, Knechtle SJ, D'Alessandro AM, Kalayoglu M, Pirsch JD.
Experience with 500 simultaneous pancreas-kidney transplants. Ann Surg 1998;
228(3):284-96.
14. Pirenne J, Van Gelder F, Coosemans W, Aerts R, Gunson B, Koshiba T, Fourneau I,
Mirza D, Van Steenbergen W, Fevery J, Nevens F, McMaster P. Type of donor aortic
preservation solution and not cold ischemia time is a major determinant of biliary
strictures after liver transplantation. Liver Transpl 2001; 7(6):540-5.
15. Uhlmann D, Armann B, Ludwig S, Escher E, Pietsch UC, Tannapfel A, Teupser D,
Hauss J, Witzigmann H. Comparison of Celsior and UW solution in experimental
pancreas preservation. J Surg Res 2002; 105(2):173-80.
16. Schwartz ME, Nishizaki T, Thung SN, Manzarbeitia C, Maharajh A, Gordon R, Miller
CM. Initial flush solution for donor liver procurement: lactated Ringers' or UW
solution? A randomized, prospective trial. Transplant Proc 1991; 23:1554-6.
17. Gonzalez AM, Lopes Filho GJ, Pestana JOM, Linhares M, Silva MHG, Moura RMAM,
Melaragno C, Sá JR, Rangel EB, Trivino T. Effects of Eurocollins Solution as Aortic
Flush for the Procurement of Human Pancreas.Transplantation. No prelo 2005.
18. Southard JH, Belzer FO. Organ preservation. Annu Rev Med 1995; 46:235-47.
47
19. Schmidt J, Lewandrowsi K, Warshaw AL, Compton CC, Rattner DW. Morphometric
characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. Int J
Pancreatol. 1992 Aug;12(1):41-51.
20. Douglas G. Altman; Practical Statistics for Medical Research. Chapman &
Hall/CRC.1991. 611p.
21. Singer, J.M. and Andrade, D.F. (2000). Analysis of Longitudinal Data. In Handbook of
Statistics, Volume 18: Bio-Environmental and Public Health Statistics, P.K.Sen and
C.R.Rao (eds). Amsterdam: North Holland. (p. 115 a 160).
22. Kelly WD, Lillehei RC, Merkel FK, Idezuki Y, Goetz FC. Allotransplantation of the
pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy. Surgery
1967; 61(6):827-37.
23. Calne RY, Rolles K, White DJ, Thiru S, Evans DB, McMaster P, Dunn DC, Craddock
GN, Henderson RG, Aziz S, Lewis P. Cyclosporin A initially as the only
immunosuppressant in 34 recipients of cadaveric organs: 32 kidneys, 2 pancreases,
and 2 livers. Lancet 1979; 2(8151):1033-6.
24. Cook K, Sollinger HW, Warner T, Kamps D, Belzer FO. Pancreaticocystostomy: an
alternative method for exocrine drainage of segmental pancreatic allografts.
Transplantation 1983; 35(6):634-6.
25. Kuo PC, Johnson LB, Schweitzer EJ, Bartlett ST. Simultaneous pancreas/kidney
transplantation--a comparison of enteric and bladder drainage of exocrine pancreatic
secretions. Transplantation 1997; 63(2):238-43.
26. Humar A, Kandaswamy R, Granger D, Gruessner RW, Gruessner AC, Sutherland DE.
Decreased surgical risks of pancreas transplantation in the modern era. Ann Surg
2000; 231(2):269-75.
48
27. Stratta RJ, Cushing KA, Frisbie K, Miller SA. Analysis of hospital charges after
simultaneous pancreas-kidney transplantation in the era of managed care.
Transplantation 1997; 64(2):287-92.
28. Olthoff KM, Millis JM, Imagawa DK, Nuesse BJ, Derus LJ, Rosenthal JT, Milewicz AL,
Busuttil RW. Comparison of UW solution and Euro-collins solutions for cold
preservation of human liver grafts. Transplantation 1990; 49(2):284-90.
29. Adam R, Astarcioglu I, Raccuia JS, Ducot B, Reynes M, Bismuth H. Beneficial effects
of EuroEuro-collins as aortic flush for the procurement of human livers.
Transplantation 1996; 61(5):705-9.
30. Kinasiewicz A, Fiedor P. Amylase levels in preservation solutions as a marker of
exocrine tissue injury and as a prognostic factor for pancreatic islet isolation.
Transplant Proc. 2003 Sep;35(6):2345-6.
31. Fiedor P, Goodman ER, Sung RS, Czerwinski J, Rowinski W, Hardy MA. The effect of
clinical and biochemical donor parameters on pancreatic islet isolation yield from
cadaveric organ donors. Ann Transplant. 1996;1(1):59-62.
32. Hoffmann TF, Leiderer R, Waldner H, Arbogast S, Messmer K. Ischemia reperfusion
of the pancreas: a new in vivo model for acute pancreatitis in rats. Res Exp Med
(Berl). 1995;195(3):125-44.
33. Obermaier R, Benz S, Von Dobschuetz E, Drognitz O, Schareck W, Jonas L,
Messmer K, Hopt UT. Characterization of microcirculatory disturbance in a novel
model of pancreatic ischemia-reperfusion using intravital fluorescence-microscopy.
Pancreas. 2002 Aug;25(2):142-8.
34. Vollmar B, Janata J, Yamauchi J, Wolf B, Heuser M, Menger MD. Exocrine, but not
endocrine, tissue is susceptible to microvascular ischemia/reperfusion injury following
pancreas transplantation in the rat. Transpl Int. 1999;12(1):50-5.
49
35. Lee S, Tung KS, Koopmans H, Chandler JG, Orloff MJ. Pancreaticoduodenal
transplantation in the rat. Transplantation. 1972 Apr;13(4):421-5.
36. Yongping G, Jianyun G, Jieshou L. Combined pancreaticoduodenal-kidney
transplantation in rats. Microsurgery. 2001;21(2):55-7.
37. Drognitz O, Obermaier R, Liu X, Neeff H, von Dobschuetz E, Hopt UT, Benz S.
Effects of organ preservation, ischemia time and caspase inhibition on apoptosis and
microcirculation in rat pancreas transplantation. Am J Transplant. 2004 Jul;4(7):1042-
50. Erratum in: Am J Transplant. 2004 Nov;4(11):1928-9.
38. Hackert T, Werner J, Uhl W, Gebhard MM, Buchler MW, Schmidt J. Reduction of
ischemia/reperfusion injury by antithrombin III after experimental pancreas
transplantation. Am J Surg. 2005 Jan;189(1):92-7.
39. Orsoni P, Houvenaeghel G, Monges G, Delpero JR, Picaud R, Guerinel G. Pancreas
transplantation in dogs, effect on the endocrine pancreas of pancreatic duct
obliteration and the mode of pancreas preservation. Histological study by surface
analysis in dogs. Chirurgie. 1993-94;119(4):168-71. French.
40. Kuroda Y, Fujino Y, Morita A, Tanioka Y, Suzuki Y, Kawamura T, Ku Y, Saitoh Y.
Successful 96-hour preservation of the canine pancreas. Transpl Int. 1992;5 Suppl
1:S388-90.
50
Abstract Objective: Investigate the effect of Euro-collins and Belzer solution in the sequential perfusion of the pancreas, during the preservation period. Methods: Forty five Wistar-EPM rats were used. The animals were distributed in 4 groups, according to the solution used during preservation: Saline solution (SF), pancreas perfused and preserved with saline solution; Euro-collins group (C), pancreas perfused and preserved with euro-collins solution; Belzer group (B) pancreas perfused and preserved with belzer solution; Euro-collins/Belzer group (CB), pancreas perfused with euro-collins and belzer solutions in equal parts and sequentially and preserved with Belzer solution. After the perfusion, the animals had their pancreas resected and preserved according to the destinated solution in 4º C. Amilase dosages after 12, 24, 36 e 48 hours were performed in the preservation solution. After last dosage, the pancreas was submitted to histological analysis. Statistical analysis was done. Results: SF and C groups presented the higher amilase levels in the preserving solution during all periods, being superior to C and CB groups (p=0,05). Amilase levels were similar in b and CB groups until 24 hours (p=0,05). Histological analysis was statistically significant for pancreas islet cells and tecidual edema. Groups B and CB were histologically similar (p=0,001) and different from groups SF and C. Conclusions: The use of Euro-collins and Belzer solution sequentially showed to be effective in pancreas preservation in rats until 24 hours.
51
Bibliografia consultada
52
1. Rother ET, Braga MER. Como elaborar sua tese: estrutura e referências.
São Paulo; 2001.
2. DeCS – Descritores em Ciências da Saúde. São Paulo: Bireme; 1996.
3. International Serials Data System International Organization
Standardization – Liste d’abreviations de mots des titres de publications
em série: conforme à ISSO 4-1984/ Listo f serial title word abreviations: in
accordance with ISSO 4-1984. Paris: ISDS/ISSO, 1985.
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo