Dr.N.K.Nayuni

Avaliação da eficácia de limpeza do Endozime

Xtreme Power e um Detergente Alcalino.

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Protocolo: Estudo quantitativo de instrumental cirúrgico em CME

Preparado para: Ruhof Corporation, USA

Preparado por:

Dr.N.K.Nayuni

Cientista, Bioanálise

Instituto de Pesquisas William Harvey

Londres. EC1M 6BQ.

Glossário:

- 1mg (miligrama) = 1000μg (micrograma)

- 1μg (micrograma) = 1000ng (nanograma)

- SSD (Sterile Services Departament) = Centro de Materiais e Esterilização

(CME)

- LoD: Limite de detecção

- LoQ: Limite de quantificação

- RFU: Unidade de Fluorescência Relativa

- BSA: (Bovine Serum Albumin) - Albumina de soro bovino

- OPA/NAC – Reagente patenteado a base de o-ftaldialdeído

Introdução:

A eficácia de limpeza de dois detergentes foi testada usando o protocolo para

detergentes de lavagem V020712 preparado para a Ruhof. A aplicação do

protocolo requisitado foi para realizar um estudo quantitativo em instrumental

cirúrgico em uma CME. Foi usado tecido de cérebro de rato no estudo, pois foi

demonstrado no nosso laboratório que as proteínas de tecido de cérebro

aderem fortemente ao aço inoxidável e fornecem um teste realístico da eficácia

de limpeza de detergentes de lavagem.

Instrumentos de aço inoxidável de uso único foram usados para o estudo. A

análise usou a recente tecnologia de detecção de proteína fluorescente

desenvolvida no Barts (Escola de Medicina e Odontologia de Londres) onde o

método foi otimizado e validado.

Materiais

Cérebros de rato: Cérebros de rato foram coletados de ratos machos Wistar

(Laboratórios Charles River).

Reagente OPA/NAC: Reagente patenteado

Sistema ProReveal: Sistema patenteado de detecção de proteína.

Instrumentos cirúrgicos: Adquiridos da Surgical Holdings Ltda. (G.B –

Inglaterra).

Lavadora: BHT Hygienetechnik

Detergentes de Lavagem:

1) Endozime XP (Ruhof)

2) Detergente alcalino

Ciclo de lavagem

Programa: Ver apêndice A para detalhes na íntegra.

Tempo de limpeza na presença do Endozime XP = 10 minutos e 50 segundos.

Temperatura: 45°C – 55°C

Diluição do detergente

1) Endozime XP : 2ml/L em água filtrada por Osmose Reversa

2) Alcalino: 4ml/L em água filtrada por Osmose Reversa

Método:

Estudo quantitativo de instrumento cirúrgico (em lavagem de CME

usando lavadora desinfectora - LD - (BHT Hygienetechnik)

40 instrumentos cirúrgicos novos de uso único comprados para o estudo. Os

instrumentos foram inicialmente lavados na CME para remover quaisquer

fragmentos de fabricação e potencial contaminação por proteína devido ao

manuseio.

Os instrumentos lavados foram acondicionados em sacos estéreis na sala de

limpeza com ambiente controlado de CME antes de serem transportados para

o laboratório.

Os instrumentos foram contaminados com tecido de cérebro de rato através da

manipulação dos cérebros. O peso do tecido aderido foi determinado usando

uma balança analítica de 4 unidades. Os cérebros foram homogeneizados e a

proteína total medida usando um reagente Biuret (Bio-RAd Ltda.).

Após as manipulações os instrumentos foram colocados para secar em uma

temperatura ambiente por 48 h.

Os instrumentos foram imediatamente transportados para a CME onde foram

limpos em uma das lavadoras desinfectoras (LD) hospitalares (BHT Hygiene

technik) usando ciclos padronizados. Cada LD foi otimizada para um dos

detergentes de lavagem por engenheiros usando testes de acordo com as

diretrizes do fabricante.

Os instrumentos lavados e secos foram vedados em sacos estéreis em um

ambiente limpo de CME e retornaram ao laboratório do Barts para análise.

A proteína residual em cada instrumento foi medida em relação ao padrão de

proteína (BSA) usando o método de detecção de proteína OPA/NAC.

Resultados:

Um padrão BSA foi medido antes da análise dos instrumentos cirúrgicos

lavados na CME. A regressão linear de fluorescência é mostrada na

Figura 1.

Figura 1: Regressão linearde BSA (0 – 20 μg) usando o método de detecção

de proteína OPA/NAC. O RFU é registrado em relação à concentração de

proteína. A equação da linha do R² = 0.99 é Y=73.9x + 9.98.

LoD: O limite de detecção do método é calculado a partir de um padrão em

submicrograma.

O LoD (Limite de Detecção) do método é de 5 ng (0,005 μg).

LoQ:

O LoQ (Limite de quantificação) do método é de 17 ng (0,017μg).

Seis tipos diferentes (S,C,B,E,D e P) de instrumentos foram testados sob cada

condição. O conteúdo total de proteína de tecido aderido foi de 369 ± 48 e 336

± 28 μg / instrumento em fórceps (Tipo E) e tesouras (Tipo D) respectivamente

(Tabelas 2 e 3). A porcentagem de proteína remanescente por instrumento

após uma lavagem Alcalina em CME nas condições descritas foi de 7.7 ± 1.6 (n

= 6) e 13.9 ± 0.9 (n = 8) para fórceps (Tipo E) e tesouras (TipoD)

respectivamente(Figura 2). Quando os instrumentos foram lavados com

Endozime XP em CME o % de proteína remanescente por instrumento foi de

0.3 ± 0.2 (n = 6) e 2.3 ± 0.9 (n = 8) para fórceps (TipoE) e tesouras(TipoD)

respectivamente(Figura 2). O % de proteína remanescente por instrumento em

ambos os tipos de instrumentais foi significativamente menor (P<0.001) quando

lavados com o Endozime XP comparados com a lavagem Alcalina usando a

Lavadora Desinfectora (LD) BHT Hyginetechnik (Figura 2, 3,4 e 5).

Lavagem Alcalina

Instrumento Proteína total aderida no

RFU Proteína % de Proteína

tecido (Volume total)

remanescente após

remanescente/

lavagem Instrumento (μg/Instrumento) (μg/ Instrumento)

MPS1 666. 7637068 103.25 15.48

MPC1 443 682314 9.10 2.05

MPB2 116 59638 0.67 0.58

MPB1 245 65324 0.75 0.30

MPE2 121 600595 8.00 6.60

MPE1 235 1365267 18.35 7.78

MPE4 84 487314 6.46 7.64

MPE3 461 4585914 61.95 13.41

MPE5 396 367251 4.84 1.22

MPE6 485 3517194 47.48 9.78

UD11(P) 388 4759824 64.30 16.53

UD32(P) 265 2786146 37.58 14.13

UD17(P) 270 3149155 42.50 15.74

UD33(p) 562 5410828 73.12 13.01

UD15(P) 582 6262106 84.64 14.53

UD16(P) 227 2495100 33.64 14.78

UD12(P) 233 2508778 33.83 14.47

UD37 (P) 239 1470835 19.78 8.25

MPA1 616 6260796 84.62 13.72

MPP1 62 104056 1.27 2.04

Tabela 1: Tabela sumária de instrumentos lavados com detergente

Alcalino na análise final.

Lavagem com Endozime XP

Instrumento Proteína total aderida no

RFU Proteína % de Proteína

tecido (Volume total)

remanescente após

remanescente /

lavagem Instrumento (μg/Instrumento) (μg/

Instrumento)

MES1 409.0 705043. 9.41 2.30

MEC1 511.8 775564 10.36 2.03

MEB2 294.2 <LoD <LoD <LoD

MEB1 205.5 <LoD <LoD <LoD

MEE4 296.2 <LoD <LoD <LoD

MEE2 304.3 <LoD <LoD <LoD

MEE6 467.5 124296 1.55 0.33

MEE1 483.6 31316 0.29 0.06

MEE3 439.3 35960 0.35 0.08

MEE5 652.5 760100 10.16 1.55

UD13 ( E ) 350.6 390538 5.15 1.47

UD14 ( E ) 298.2 398933 5.27 1.77

UD28 ( E ) 255.9 939585 12.58 4.92

UD27 ( E ) 328.4 1900277 25.59 7.79

UD21 ( E ) 300.2 240643 3.12 1.04

UD19 ( E ) 253.9 177431 2.27 0.89

UD 18 ( E ) 396.9 59193 0.67 0.17

UD38 ( E ) 429.2 60548 0.68 0.16

MEA1 346.6 <LoD <LoD <LoD

MEP1 98.7 <LoD <LoD <LoD

Tabela 2: Tabela sumária de instrumentos lavados com Endozime XP na

análise final.

Figura 2: Remoção comparativa de proteínas de cérebro secas usando LD

em uma CME.

Fórceps e tesouras foram usados para manipular tecido de cérebro de rato por

5 minutos, logo após os instrumentos foram secados a ar por 48 h. O peso do

tecido aderido foi medido e o total de proteína calculado. Os instrumentos

foram lavados em uma Lavadora Desinfectora BHT Hyginetechnik em uma

CME usando os ciclos otimizados para o produto Alcalino (Barras Vermelhas) e

Endozime XP (Barras Azuis). Os instrumentos lavados foram borrifados com

reagente OPA/NAC e a proteína residual foi medida em relação ao padrão

BSA. Os resultados foram em média ± SEM. N=6 para fórceps e n=8 para

tesouras em cada lavagem. *** = P<0.001. A diferença estatística foi

determinada pela ANOVA.

Figura 3: Imagens de fluorescência típica de tesouras contaminadas

lavadas em uma CME usando Prolystica Alcalino (acima à direita) e

Endozime XP (abaixo ao centro). A coloração do amarelo ao vermelho

demonstra mais proteína na região avermelhada.

Figura 4: Imagens de fluorescência típica de Fórceps contaminados

lavados em uma CME usando o Alcalino (acima à direita) e Endozime XP

(abaixo ao centro). A coloração do amarelo ao vermelho demonstra mais

proteína na região avermelhada.

Figura 5: Imagens de fluorescência típica de poços de Spencer

contaminados lavados em uma CME usando o Alcalino (acima à direita) e

Endozime XP (abaixo ao centro). A coloração do amarelo ao vermelho

demonstra mais proteína na região avermelhada.

Conclusões:

O estudo revelou que uma simples manipulação de tecido cerebral com

instrumentos cirúrgicos resulta em cerca de 33± 10 mg ( 33000 ± 10 μg ) de

tecido aderido na ponta de manuseio. Em média 369 ± 48 μg de proteína total

estava presente no tecido aderido em cada lado de um fórceps. Quando esses

instrumentos foram lavados com detergente alcalino em uma CME, 7.7 ± 1.6 %

de proteína permaneceu no instrumento, enquanto que os instrumentos

lavados com Endozime XP possuíam apenas 0.3 ± 0.2 % de proteína residual.

Isso o torna 25 vezes mais eficaz que o detergente alcalino na limpeza.

Tesouras possuíam 336 ± 28 μg de proteínas totais no tecido aderido e,destes,

13.9 ± 0.9 % de proteína permaneceu após uma lavagem Alcalina. Uma

lavagem com EndoZime XP desses instrumentos possuía 2.3 ± 0.9 % de

proteína remanescente na superfície do instrumento com melhora de 6 vezes

na remoção de proteína.

Proteínas hidrofóbicas ligam-se fortemente no aço inoxidável e são difíceis de

remover com água apenas. A proteína que estiver seca por mais de 24h torna-

se muito difícil de ser removida porque adere firmemente às superfícies. O uso

de enzimas proteolíticas em detergentes, como no detergente enzimático

Endozime XP, proporciona melhor remoção de proteína comparada a

detergentes de lavagem alcalinos.

Embora o Endozime XP seja melhor na remoção de proteínas, existem

instrumentos com quantidades μg de proteínas ainda aderidas no final do

trabalho com os instrumentos (Figuras 3,4 e 5). O uso de spray que

mantenham os instrumentos contaminados úmidos (evitando que a proteína

seque) irá melhorar a eficácia da limpeza do Endozime XP.

Recomendações:

1) Testes suplementares da eficácia da limpeza com Endozime XP em

condições de umidade.

ApêndiceA:

Lavadora1(Usada para lavagem Alcalina)

Lavadora 2 (Usada para lavagem com Endozime XP)

Declaração:

Esse estudo foi conduzido usando o protocolo acordado V020712 e o método

de medição de detecção de proteína aprovado e validado desenvolvido em

nosso laboratório. Esse relatório descreve com precisão os procedimentos

usados e os resultados e conclusões refletem precisamente os dados básicos

do estudo. Os registros originais desse relatório estão armazenados no

laboratório.

Esse relatório é destinado para o uso exclusivo da Ruhof Corporation, USA.

Esses resultados são válidos e estão relacionados apenas aos instrumentos e

amostras usadas e testadas aqui. Quaisquer extrapolações devem ser

confirmadas pelo cientista e é requerida uma comunicação por escrito. A

significância dos dados está sujeita aos detergentes de lavagem usados nas

CME’s e os números das cargas correspondentes. Qualquer responsabilidade

por perdas ou danos resultantes da publicação ou uso desses resultados na

literatura é unicamente do patrocinador do estudo e não do cientista que

realizou os testes.

Dr. N.K. Nayuni

15/08/2012.