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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE LEITE E DERIVADOS
KAIO MACIEL DE SANTIAGO SILVA
Londrina 2017
AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL DO POTENCIAL EFEITO DE Bifidobacterium lactis HN019® EM MODELO ANIMAL DE
DEPRESSÃO E ANSIEDADE
KAIO MACIEL DE SANTIAGO SILVA
Cidade
ano
Londrina
2017
AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL DO POTENCIAL EFEITO DE Bifidobacterium lactis HN019® EM MODELO ANIMAL DE
DEPRESSÃO E ANSIEDADE
Dissertação apresentada à UNOPAR, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados. Orientador(a): Prof(a). Dr(a). Giselle Aparecida Nobre Costa
KAIO MACIEL DE SANTIAGO SILVA
AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL DO POTENCIAL EFEITO DE Bifidobacterium lactis HN019® EM MODELO ANIMAL DE
DEPRESSÃO E ANSIEDADE
Dissertação apresentada à UNOPAR, no Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e
Derivados, área e concentração em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados como
requisito parcial para a obtenção do título de Mestre conferido pela Banca Examinadora
composta pelos seguintes membros:
_________________________________________ Prof(a). Dr(a). Giselle Aparecida Nobre Costa
(UNOPAR)
_________________________________________ Prof(a). Dr(a). Joice Sifuentes dos Santos
(UNOPAR)
_________________________________________ Prof(a). Dr(a). Gislaine Garcia Pelosi Gomes
(UEL)
Londrina, 06 de Março de 2017.
A todos que contribuíram para o sucesso do presente trabalho, afinal ninguém vence sozinho.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela força, saúde concedida e acima de tudo por guiar e iluminar meus
passos.
Ao meu porto seguro, meus pais Lazara Eli e Silvio Alves pelo amor, carinho,
incentivo, compreensão, ajuda financeira em tempos difíceis. Em especial minha mãe
por ser minha fortaleza e por suportar minhas loucuras, a vocês meus infinitos
agradecimentos.
A minha irmã Gabrielle, minha jóia rara.
Aos laços de amizade criados durante esses dois anos, os quais tornaram a
caminhada mais leve, em especial minhas amigas Carla Manfrinato e Joyce Valle.
A todos os professores que convivi durante esse período, por compartilhar seus
conhecimentos.
A minha orientadora, Profª Drª Gisele Nobre Costa, pela sua orientação,
disponibilidade, paciência, compreensão, amizade, pela confiança e oportunidade de
trabalhar ao seu lado e acima de tudo pelo incentivo e encorajamento na superação de
meus limites.
À aluna de iniciação científica Sara de Lima, pela disponibilidade e apoio nas
análises.
Ao Laboratório de Neurociência e Farmacologia Cardiovascular da Universidade
Estadual de Londrina (UEL), em especial a Profª Drª Gislaine Pelosi, pela dedicação,
ensinamento, sugestões e por disponibilizar o laboratório e animais. Aos seus alunos,
Viviane e Luiz Fernando, por compartilharem seus conhecimentos, pela paciência e
ajuda durante o desenvolvimento do trabalho.
“Existem muitas hipóteses em ciências que estão erradas. Isso é perfeitamente aceitável, elas são a abertura para achar as que estão certas”.
Carl Sagan
SILVA, Kaio Maciel de Santiago. Avaliação comportamental do potencial efeito de Bifidobacterium lactis HN019® em modelo animal de depressão e ansiedade. 2017. 44 f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados) - Unidade Piza, UNOPAR, Londrina, 2017.
RESUMO No trato gastrointestinal, a microbiota mantem uma estreita relação com seu hospedeiro, exercendo funções como manutenção do sistema imunomodulador, integridade da barreira epitelial, motilidade e absorção de nutrientes. Estudos em animais sugerem que perturbações de comportamento, como o estresse e depressão, podem alterar a composição e a atividade metabólica da microbiota intestinal, por consequência, podem afetam o comportamento emocional e sistemas cerebrais relacionados. Apesar do interesse emergente na comunicação cérebro-intestino e seu possível papel nos transtornos do humor, há poucos estudos que abordam aspectos centrais e periféricos destas doenças. O objetivo deste trabalho foi produzir um leite probiótico contendo Bifidobacterium animalis subsp lactis HN019 e um leite esterilizado, dito placebo, administra-los em ratos wistar durante 30 dias e avaliar o efeito do probiótico sobre modelos animais de ansiedade e depressão. Os animais foram submetidos a 3 testes de análises comportamentais, tratados via oral (gavagem). Nos testes de labirinto em cruz elevado e campo aberto respectivamente, os animais foram divididos em 2 subgrupos iguais para cada teste, onde (1.1 e 2.1 n=7) receberam 4 mL de leite probiótico e (1.2 e 2.2 n=7) 4 mL de leite placebo. No teste de natação forçada, foram alocados em 3 subgrupos (3.1 n=7) receberam 4 mL de leite probiótico, (3.2 n=7) 4 mL de placebo e (3.3 n=5) 15 mg/Kg (i.p.) de imipramina. O leite probiótico apresentou pH = 5,35, acidez titulável de 0,35% (ácido láctico) e a viabilidade do probiótico se manteve em média 5,1x108 UFC/mL no produto pronto. Não houve redução de ciclo logarítmico de B. lactis HN019 após 30 dias de armazenamento em refrigeração (5ºC). A análise do comportamento dos animais revelou que a administração de B. lactis HN019 apresentou efeito significativo (p≤0,05), aumentando o tempo (p≤0,01) e a
frequência (p≤0,01) de entrada dos animais tratados nos braços abertos do labirinto em cruz elevado em comparação com o grupo placebo, o que caracteriza redução do comportamento de ansiedade. Por outro lado, não foi observado alteração na atividade locomotora no teste de campo aberto entre os animais do grupo probiótico e do grupo placebo (p>0,05) sugerindo que não houve interferência locomotora no efeito ansiolítico. Considerando os comportamentos característicos de depressão, não houve redução no índice de imobilidade nos animais tratados em comparação com o grupo placebo (p>0,05) no teste de natação forçada. A redução nos comportamentos de
ansiedade no teste de labirinto em cruz elevado a partir da ingestão de B. lactis HN019 fornecem evidências encorajadoras para apoiar a proposta de que este probiótico pode apresentar propriedades ansiolíticas. No entanto, estes resultados são preliminares e mais investigações sobre parâmetros bioquímicos e mecanismos envolvidos, devem ser realizadas.
Palavras-chave: Eixo cérebro-intestino. Microbiota. Neurociência. Probiótico.
SILVA, Kaio Maciel de Santiago. Avaliação de efeito antidepressivo do Bifidobacterium lactis HN019® em ratos wistar. 2016. 44 p. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados) - Unidade Piza, UNOPAR, Londrina, 2017.
ABSTRACT
In the gastrointestinal tract, the microbiota maintains a close relationship with its host, performing functions such as the maintenance of the immunomodulatory system, the epithelial barrier integrity, motility and nutrients absorption. Studies in animals suggest that behavioral disturbances, such as stress and depression, can alter the composition and metabolic activity of the intestinal microbiota, and therefore can affect emotional behavior and related brain systems. Despite the emerging interest in brain - bowel communication and its possible role in mood disorders, there are few studies that address central and peripheral aspects of these diseases. The main goal of this work was to produce a probiotic milk containing Bifidobacterium animalis subsp lactis HN019 and a sterilized milk, said placebo, administered in wistar rats for 30 days and to evaluate the effect of the probiotic on animal models of anxiety and depression. The animals were submitted to three behavioral analysis tests, treated orally (gavage). In the elevated plus maze and open field tests respectively, the animals were divided into 2 equal subgroups for each test, where (1.1 and 2.1 n = 7) received 4 mL of probiotic milk and (1.2 and 2.2 n = 7) 4 mL of placebo milk. In the forced swimming test, they were allocated into three subgroups (3.1 n = 7) receiving 4 mL of probiotic milk, (3.2 n = 7) 4 mL of placebo and (3.3 n = 5) 15 mg / kg (i.p.) of Imipramine. The probiotic milk presented pH = 5.35, titratable acidity of 0.35% (lactic acid) and the probiotic viability remained on the average 5.1x108 CFU / mL in the finished product. There was no logarithmic cycle reduction of B. lactis HN019 after 30 days of storage under refrigeration (5° C). Analysis of the animals behavior revealed that the administration of B. lactis HN019 showed a significant effect (p≤0.05), increasing the time (p≤0.0152) and the frequency (p≤0.0052) of the animals entry treated in the open arms of the elevated plus maze compared to the placebo group, which characterizes reduction of anxiety behavior. On the other hand, no locomotor activity change was observed in the open field test between the probiotic and placebo group animals (p> 0.05), suggesting that there was no locomotor interference in the anxiolytic effect. Considering the depression behaviors characteristic, there was no reduction in the immobility index in the treated animals compared to the placebo group (p> 0.05) in the forced swimming test. The reduction in anxiety behaviors in the test elevated plus maze from the ingestion of B. lactis HN019 provide encouraging evidence to support the proposition that this probiotic may exhibit anxiolytic properties. However, these results are preliminary and further investigations on biochemical parameters and involved mechanisms should be performed. Key words: Brain-gut axis. Microbiota. Neuroscience. Probiotics.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 4
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .............................................................................. 5
2.1 Microbiota intestinal ............................................................................................... 5
2.1.1 Relação cérebro e intestino ................................................................................ 6
2.2 Probióticos ............................................................................................................. 7
2.2.1 O gênero Bifidobacterium sp .............................................................................. 8
3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 11
3.1 Objetivo Geral........................................................................................................11
3.2 Objetivos específicos ........................................................................................... 11
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 12
4. ARTIGO – AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL DO POTENCIAL EFEITO DE BIFIDOBACTERIUM LACTIS HN019® EM MODELO ANIMAIL DE DEPRESSÃO E ANSIEDADE................................................................................................................17 CONCLUSÃO GERAL .............................................................................................. 36
ANEXO.......................................................................................................................37
Anexo 1 – Aprovação do Comitê de Ética de Uso Animal. ........................................ 38
4
1. INTRODUÇÃO
Áreas de estudos como microbiologia, imunologia, neurologia, bioquímica e
nutrição estão convergindo rapidamente gerando pesquisas relacionadas ao papel
decisivo do intestino na regulação recíproca do cérebro, devido à sinalização entre o
trato gastrointestinal e o sistema nervoso central. É cada vez mais evidente a existência
de uma comunicação bidirecional cérebro-intestino; de forma que tal comunicação seja
suficiente para regular os sistemas tanto neurais, hormonais quanto
imunomoduladores. Este conceito é definido como “eixo cérebro-intestino”, um sistema
vital para determinação da homeostase que se reflete em estado de saúde e doença
dependendo do tipo de colonização da microbiota intestinal (BERCIK; COLLINS, 2009;
COLLINS et al., 2012; DE PALMA et al., 2014; DESBONNET et al., 2008).
Importante ressaltar que a quantidade de bactérias da microbiota intestinal é de
trilhões de microrganismos, contém 100 vezes mais genes que nosso genoma (GILL et
al., 2006). Desta forma, diante do vasto ecossistema biológico, microrganismos
probióticos e seus efeitos sobre o organismo e recentemente sobre o sistema nervoso
central têm sido cada vez mais enfatizados (WANG et al., 2016).
Apesar do interesse emergente da influência de bactérias probióticas na
comunicação microbiota-cérebro-intestino e seu papel atenuador nos transtornos de
humor como estresse, depressão e ansiedade, se faz necessário estudos com este
enfoque. Assim, este estudo visa avaliar os efeitos da ingestão de leite probiótico
contendo Bifidobacterium lactis HN019 em modelo animal de depressão e ansiedade
em ratos normais tipo wistar.
5
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Microbiota intestinal
A colonização bacteriana se inicia nos primeiros dias de vida em mamíferos,
representando um período de suma importância. A formação da microbiota envolve
uma combinação única de diferentes populações de organismos que habitam o
intestino, principalmente bactérias, mas também, archaea, vírus e protozoários (GILL
et al., 2006; SEKIROV et al., 2010).
O trato gastrointestinal contém um vasto ecossistema microbiano extremamente
complexo, baseado em competição e simbiose (MACKIE et al., 1999). Cerca de 400 a
500 diferentes espécies bacterianas são encontradas no intestino, representando uma
população de até 1010 a 1011 / g de conteúdo fecal (MACKIE; WHITE, 1997; SAVAGE,
1977; ZOETENDAL, et al., 2004; ZOETENDAL et al., 2008).
Hooper e Gordon (2001) ressaltam que a presença de um rico ecossistema
microbiano comensal saudável favorece o hospedeiro, pois este atua na proteção
contra patógenos, participa da ingestão de nutrientes disponibilizados pela dieta,
metaboliza certas drogas e substâncias cancerígenas, influencia na absorção de
nutrientes, promove a homeostase da barreira intestinal e a distribuição de gordura.
A microbiota pode ser uma boa representação da história do indivíduo e pode
contribuir para diferenças individuais no risco e curso de doenças e resposta do
tratamento, pois se trata de um ambiente dinâmico, influenciada por vários fatores,
incluindo genética, dieta, metabolismo, idade, habitat, tratamento com antibióticos e
estresse (FOSTER; NEUFELD, 2013). Estas combinações de fatores podem prejudicar
ou favorecer a relação benéfica entre a microbiota intestinal e o hospedeiro
(HAWRELAK; MYERS, 2004). Por outro lado, o rompimento desta relação benéfica,
pelo resultado de perturbações causadas por infecções ou uso de antibióticos, pode
resultar em disbiose. O efeito desta no hospedeiro é determinado pela natureza e
magnitude da mudança na composição das bactérias benéficas do trato gastrointestinal
(BERCIK; COLLINS, 2009).
Um crescente número de estudos tem abordado a importância da microbiota
intestinal, no entanto, deve-se enfatizar a necessidade de rigor e controles para
formulação de conclusões coerentes. Para investigar as influências causadas pela
microbiota intestinal sobre o hospedeiro, comumente deve-se compararem animais
6
“germ-free” com àqueles colonizados com uma cepa única ou variadas de bactérias
(FALK et al., 1998). Hooper et al. (2001) ao comparar ratos “germ-free” com animais
colonizados com Bacteroides thetaiotaomicron, observaram efeitos moduladores sobre
a expressão de genes envolvidos nas funções intestinais, como
absorção de nutrientes, fortalecimento da barreira da mucosa e metabólitos.
Bactérias comensais podem ativar vias neurais e sistemas de sinalização do
sistema nervoso central, conferindo uma relação funcional entre o componente
sensorial do sistema nervoso e a microbiota intestinal (BERCIK; COLLINS, 2009).
2.1.1 Relação cérebro e intestino
Abordagens experimentais foram utilizadas para estudar o efeito modulador da
microbiota nas interações cérebro- intestino. Estudos corroboram a existência de um
sistema de comunicação neuro-humoral bidirecional, entre o sistema nervoso central e
o sistema nervoso entérico, definido até então como eixo cérebro – intestino, integrando
o cérebro e funções gastrointestinais. Este intercâmbio entre cérebro intestino ocorre
por vias hormonais, neurais e mediadores imunitários que podem ser originados no
trato digestivo, no cérebro ou ambos. Os metabólitos gerados nestas vias podem alterar
as funções intestinal e cerebral e, portanto, influenciar no comportamento do indivíduo.
Existem evidências claras da influência do cérebro sobre o conteúdo microbiano, bem
como da microbiota intestinal sobre o cérebro (BERCIK; COLLINS, 2009; COLLINS;
SURETTE; BERCIK, 2012, CRYAN; O’MAHONY, 2011; DE PALMA et al., 2014;
DESBONNET et al., 2008).
Em seus estudos Bravo et al. (2011), Bercik; Collins (2009), Desbonnet et al.
(2008) e Liu et. al. (2016) apontam evidências do efeito da microbiota do intestino sobre
o sistema nervoso central, destacando o importante papel das bactérias probióticas na
comunicação bidirecional do eixo cérebro-intestino.
Wang et al. (2016) elencam os principais efeitos do uso de probióticos
apresentados em diversos estudos sobre o sistema nervoso central por mecanismos
diretos e indiretos. Dentre esses, o efeito no eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, apontado
como responsável por alterar os níveis de hormônio adrenocorticotrófico e/ou
corticosteroides; além de ação sobre o sistema imune, limitando a produção de
citocinas pró-inflamatórias, alteração direta da bioquímica do sistema nervoso central,
como modulação nos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), de ácido
7
γ-aminobutírico (GABA), de 5-hidroxitriptamina (5-HT) e de dopamina.
Microrganismos alteram a microbiota, mudando metabólitos como ácidos graxos
de cadeia curta e aumentando níveis de triptofano, melhorando o funcionamento do
sistema nervoso central de forma indireta, bem como interage com os sistemas
endócrino, imunes e neurais (DESBONNET et al., 2008, HSIAO et. al., 2013, WANG et
al., 2016).
Neste contexto, o eixo cérebro-intestino contribui para a homeostase de vários
sistemas (BERCIK; COLLINS, 2009; COLLINS; SURETTE; BERCIK, 2012; FOSTER;
NEUFELD, 2013; RHEE; POTHOULAKIS; MAYER, et al., 2009).
2.2 Probióticos
Probióticos são microrganismos vivos que beneficiam à saúde do hospedeiro
equilibrando a microbiota intestinal (FULLER, 1989). São definidos pela Organização
das Nações Unidas para a Agricultura e a Alimentação - FAO e Organização Mundial
da Saúde – WHO (2001), como microrganismos vivos, que administrados em
quantidades adequadas, proporcionam benefícios à saúde.
De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA (BRASIL,
2016), qualquer linhagem considerada probiótico deve ser documentada quanto à
identificação e segurança do microrganismo, quanto à quantidade mínima viável na
recomendação diária para ocasionar efeito benéfico, além da alegação funcional que
deve ser baseada em estudos científicos.
Cepas probióticas dos gêneros Lactobacillus sp e Bifidobacterium sp são os
microrganismos mais comumente usados como bactérias probióticas, uma vez que
podem ser isoladas de todas as porções do trato gastrointestinal do humano saudável
(CHARTERIS et al., 1998).
Bactérias probióticas aderem ao epitélio intestinal ocupando um espaço na sua
superfície, ou seja, um sítio de colonização, estimulando a produção de mucina, uma
proteína produtora de muco. Este mecanismo pode desalojar ou dificultar instalação de
microrganismos patogênicos (DODD; GASSON, 1994; LANKAPUTHRA; SHAH, 1998;
O’SULLIVAN et al.,1992).
Publicações relacionam o consumo de probióticos à modulação da microbiota
intestinal apresentando evidências de um papel terapêutico de bactérias probióticas em
8
sintomas relacionados a transtornos do humor como ansiedade e estresse (LOGAN;
KATZMAN, 2005). Os efeitos de probióticos no eixo cérebro – intestino, evidenciam a
capacidade destes em amenizar o estresse induzido por alterações na função
gastrointestinal, melhorando sintomas de humor e ansiedade (EUTAMENE; BUENO,
2007; GAREAU; SHERMAN; WALKER, 2010)
Estudo realizado por Desbonnet et al. (2008), demonstrou evidências
encorajadoras, diante das propriedades antidepressivas apresentadas pela
bactéria Bifidobacterium infantis, em virtude de sua capacidade de atenuar o
lançamento das citocinas pró-inflamatórias interleucina-6 (IL-6) e interferão-gama (INF-
γ) e de elevar níveis de triptofano, precursor serotonérgico. Assim os probióticos podem
influenciar o humor (GHOSH; VAN HEEL; PLAYFORD, 2004).
Apesar dos mecanismos de ação não identificados o probiótico Lactobacillus
paracasei ao ser administrado em filhotes de ratos submetidos a privação materna
apresentou capacidade de melhorar a dor visceral induzida por estresse e restaurou
a permeabilidade gastrointestinal normal nos ratos estressados (EUTAMENE et al.,
2007)
Bravo et al. (2011) em recente estudo usando camundongos demonstraram que
uma dieta contendo o probiótico Lactobacillus rhamnosus, apresentou
efeito direto sobre o neurotransmissor receptor ácido gama-aminobutírico (GABA) no
sistema nervoso central de animais normais e saudáveis, sugerindo aplicações
terapêuticas para transtornos como ansiedade e depressão.
Ansiedade e depressão são comuns em pacientes com desordens intestinais.
Estudos em animais mostram que o tratamento com probiótico pode conter a
inflamação relacionada com comportamentos de ansiedade (BERCIK et al., 2011;
WALKER et al., 2008).
Bercik et al. (2011), verificou o efeito ansiolítico do Bifidobacterium longum, ao
tratar camundongos com colite, o probiótico normalizou o comportamento de
ansiedade.
2.2.1 O gênero Bifidobacterium sp
Após a colonização inicial, cepas de Bifidobacterium sp são dominantes entre o
rico ecossistema microbiano presente no trato gastrointestinal animal, estas mantém o
bom funcionamento do trato intestinal através de atividade antimicrobiana ou por
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imunomodulação via células intestinais (HARMSEN et al., 2000; SCHMIDT; ZINK,
2000).
As bifidobactérias foram isoladas e descritas pela primeira vez em 1899, por
Tissier. Caracterizam-se, em geral, como microrganismos Gram-positivos, não
formadores de esporos, desprovidos de flagelos, catalase-negativos e anaeróbios,
podem apresentar formas variadas que incluem bacilos curtos e curvados a bacilos
bifurcados (HOLT et al., 1994). A temperatura ótima de crescimento abrange de 37ºC
a 42ºC, não havendo crescimento em temperaturas abaixo de 25-28ºC e acima de 43º-
45ºC (SCARDOVI, 1986).
Bifidobacterium sp é um gênero de bactérias pertencentes a
família Actinomycetaceae. Existem cerca de trinta espécies conhecidas de
Bifidobacterium. As espécies representativas de origem humana incluem B. longum, B.
breve, B. infantis, B. bifidum, B. adoltescentis e B. pseudocatenulatum e as
espécies de origem animal incluem B. pseudolongum, B. thermophilus e B. animalis
(ISHIBASHI; YAESHIMA; HAYASAWA, 1997).
Entre as espécies de Bifidobacterium usadas como probióticos, B. animalis
apresenta maior índice de uso. Por ser de origem animal, são mais resistentes aos
ácidos (YAESHIMA et al.1996). Meile et al. (1997), ao isolarem cepas de B. animalis
a partir de iogurtes, encontraram linhagens com algumas diferenças genéticas,
essas estirpes foram reclasssificadas e atualmente, compõem a subespécie
Bifidobacterium animalis subsp. lactis.
Muitas discussões a respeito da nomenclatura correta para Bifidobacterium lactis
têm sido disponibilizadas na literatura. De fato, a similaridade molecular entre as
espécies B. animalis e B. lactis evidenciam a inclusão da B. lactis como uma subespécie
e não mais como espécie (MASCO et al., 2004; PRASAD; GOPAL; GIL, 2003). Todavia
a linhagem HN019 mantém a denominação comercial B. lactis, entretanto, sua
nomenclatura foi alterada para B. animalis subsp. lactis (MASCO et al., 2004).
B. animalis subsp. lactis HN019, provenientes de produtos lácteos, é
considerado um probiótico em potencial, tendo em vista os resultados obtidos em
estudos in vitro, apresentando a capacidade de resistir a baixo pH, bem como
sobreviver a presença de bile em concentrações presentes no duodeno (PRASAD et
al., 1998). A literatura reporta efeitos benéficos de B. lactis HN019 no sistema
imunomodulador (ARUNACHALAM; GILL; CHANDR, 2000; CHIANG et al., 2000), na
modulação da microbiota intestinal (AHMED et al., 2007), na minimização de efeitos da
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diarreia (SHU et al., 2001), redução de diferentes tipos de enterites e doenças não
gastrointestinais (SAZAWAL et al., 2004).
Apesar do interesse emergente acerca da influência de bactérias probióticas na
comunicação cérebro-intestino e seu possível papel nos transtornos do humor como
estresse, ansiedade e depressão, particularmente acompanhado por sintomas
gastrointestinais, há poucos estudos dedicados à busca de soluções terapêuticas
que abordam aspectos centrais e periféricos de tais doenças. Portanto,
este estudo visa avaliar os potenciais efeitos através da ingestão de leite probiótico
contendo B. lactis HN019 em modelo animal de depressão e ansiedade em ratos,
comparando-os à ratos tratados com leite esterilizado (placebo).
11
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
- Produzir um leite probiótico contendo Bifidobacterium lactis HN019 e um leite
esterilizado (placebo) e avaliar os potenciais efeitos do probiótico nos indicadores
comportamentais relacionados a ansiedade e depressão.
Objetivos específicos
- Produzir um leite probiótico e um leite esterilizado (placebo) e acompanhar a
viabilidade do probiótico no produto refrigerado;
- Avaliar os potenciais efeitos do probiótico sobre ratos, através de alterações
comportamentais com base nos testes de labirinto em cruz elevado, campo aberto e
natação forçada.
12
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17
4. ARTIGO – AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL DO POTENCIAL EFEITO DE
Bifidobacterium lactis HN019® EM MODELO ANIMAL DE DEPRESSÃO E
ANSIEDADE
RESUMO
No trato gastrointestinal, a microbiota mantém uma estreita relação com seu hospedeiro, exercendo funções metabólicas. Estudos em animais sugerem que perturbações de comportamento, como o estresse e depressão, podem alterar a composição e a atividade metabólica da microbiota intestinal. Neste contexto a comunicação cérebro-intestino e seu possível papel nos transtornos do humor, é um campo de pesquisa ainda pouco explorado. O objetivo deste trabalho foi produzir um leite probiótico contendo Bifidobacterium animalis subsp lactis HN019 e um leite esterilizado, dito placebo, administra-los em ratos wistar durante 30 dias e avaliar o efeito do probiótico sobre modelos animais de ansiedade e depressão. Os animais foram submetidos a 3 testes de análises comportamentais: labirinto em cruz elevado, campo aberto e natação forçada. O leite probiótico apresentou pH = 5,35, acidez titulável de 0,35% (ácido láctico) e a viabilidade do probiótico se manteve em média 5,1x108 UFC/ mL no produto pronto. Os testes revelaram que a administração de B. lactis HN019 apresentou efeito significativo (p≤0,05), aumentando o tempo (p≤0,01) e
a frequência (p≤0,01) de entrada dos animais tratados nos braços abertos do labirinto em cruz elevado em comparação com o grupo placebo, o que caracteriza redução do comportamento de ansiedade. Por outro lado, não foi observado alteração na atividade locomotora no teste de campo aberto entre os animais do grupo probiótico em comparação com o grupo placebo (p>0,05) sugerindo que não houve interferência locomotora no efeito ansiolítico. Considerando os comportamentos característicos de depressão, não houve redução no índice de imobilidade nos animais tratados em comparação com o grupo placebo (p>0,05) no teste de natação forçada. A redução nos
comportamentos de ansiedade no teste de labirinto em cruz elevado a partir da ingestão de B. lactis HN019 fornecem evidências encorajadoras para apoiar a proposta de que este probiótico pode apresentar propriedades ansiolíticas. No entanto, estes resultados são preliminares e mais investigações sobre parâmetros bioquímicos e mecanismos envolvidos, devem ser realizadas. Palavras-chave: Eixo cérebro-intestino. Microbiota. Neurociência. Probióticos.
18
ABSTRACT
In the gastrointestinal tract, the microbiota maintains a close relationship with its host,
performing metabloic functions. Studies in animals suggest that behavioral
disturbances, such as stress and depression, may alter the intestinal microbiota
composition and its metabolic activity. In this context, brain-bowel communication and
its possible role in mood disorders is a research field still little explored. The main goal
of this work was to produce a probiotic milk containing Bifidobacterium animalis subsp
lactis HN019 and a sterilized milk, said placebo, administered in wistar rats for 30 days
and to evaluate the effect of the probiotic on animal models of anxiety and depression.
The animals were submitted to three behavioral analysis tests: the elevated plus maze,
open field and the forced swimming. The probiotic milk presented pH = 5.35, titratable
acidity of 0.35% (lactic acid) and probiotic viability remained on average 5,1x108
UFC/mL in the ready product the tests revealed that the administration of B. lactis
HN019 showed a significant effect (p≤0.05), increasing the time (p≤0.0152) and the
frequency (p≤0.0052) of the animals entry treated in the open arms of the elevated plus
maze compared to the placebo group, which characterizes reduction of anxiety
behavior. On the other hand, no locomotor activity change was observed in the open
field test between the probiotic and placebo group animals (p> 0.05), suggesting that
there was no locomotor interference in the anxiolytic effect. Considering the depression
behaviors characteristic, there was no reduction in the immobility index in the treated
animals compared to the placebo group (p> 0.05) in the forced swimming test. The
reduction in anxiety behaviors in the test elevated plus maze from the ingestion of B.
lactis HN019 provide encouraging evidence to support the proposition that this probiotic
may exhibit anxiolytic properties. However, these results are preliminary and further
investigations on biochemical parameters and involved mechanisms should be
performed.
Keywords: Key words: Brain-gut axis. Microbiota. Neuroscience. Probiotics.
INTRODUÇÃO
Está se tornando cada vez mais relevante o papel dos microrganismos
probióticos na saúde do hospedeiro. Estes são comumente consumidos na forma de
produtos lácteos fermentados ou culturas liofilizadas (ROBERFROID, 2000). Ao serem
ingeridos, aumentam a diversidade da microbiota e composição de bactérias benéficas
no trato gastrointestinal (WANG et al. 2016)
Abordagens experimentais têm sido utilizadas para estudar o efeito modulador
da microbiota intestinal nas interações, não apenas do intestino, mas do cérebro.
19
Estudos corroboram a existência de um sistema de comunicação bidirecional neuro-
humoral, entre o sistema nervoso central e o sistema nervoso entérico, definido até
então como eixo cérebro - intestino, capaz de integrar o cérebro às funções
gastrointestinais (COLLINS et al., 2012; DESBONNET et al., 2008). Este intercâmbio
entre cérebro e intestino ocorre por vias hormonais, neurais e mediadores imunitários
que podem ser originados no trato digestivo, no cérebro ou em ambos. Os metabólitos
gerados nestas vias, podem, portanto, influenciar funções do cérebro (BERCIK;
COLLINS, 2009; COLLINS et al., 2012; DE PALMA et al., 2014; DESBONNET et al.,
2008).
Há muitas evidências que associam a ingestão de bactérias probióticas à
modulação de funções do sistema nervoso central, cuja ações afetam por exemplo o
eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, atenuando os níveis de hormônio adrenocorticotrófico
e corticosteroides (LIANG et al., 2015; WANG et al., 2015), influenciam o sistema
imunológico através da redução de citocinas pro-inflamatórias (LIU et al., 2016,
DESBONNET et al., 2008), podem alterar a bioquímica do sistema nervoso central,
aumentando a expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) (BERCIK
et al., 2010; LIANG et al., 2015), apresenta aumento nos níveis de ácido γ-aminobutírico
(BRAVO et al., 2011), e aumento nos níveis de dopamina (LIU et al., 2016), bem como
elevam os níveis de metabólitos como o triptofano, precursor serotoninérgico
(DESBONNET et al., 2008).
Linhagens de Lactobacillus sp e Bifidobacterium sp são as mais comumente
usados como bactérias probióticas (CHARTERIS et al., 1998). A linhagem B. animalis
subsp. lactis HN019, é considerado um probiótico em potencial, por apresentar
capacidade de resistir a baixo pH semelhantes do estômago, bem como sobreviver a
presença de bile em concentrações presentes no duodeno (PRASAD et al., 1998).
Além disso, há muitos dados evidenciando o efeito desta linhagem no sistema
imunomodulador (ARUNACHALAM; GILL; CHANDR, 2000; CHIANG et al., 2000), na
modulação da microbiota intestinal (AHMED, et al., 2007), na minimização de efeitos
da diarreia (SHU et al., 2001) e na redução de diferentes tipos de enterites e doenças
não intestinais (SAZAWAL et al., 2004). Entretanto, não existem relatos de estudos
envolvendo os efeitos comportamentais de B. lactis HN019.
Desta forma, diante do interesse emergente da influência de bactérias
probióticas e seu possível papel na fisiopatologia do estresse, ansiedade e depressão.
Este estudo visa avaliar os efeitos comportamentais da ingestão do probiótico B. lactis
20
HN019 em modelos animais de ansiedade e depressão.
MATERIAL E MÉTODOS
Microrganismo
Foi utilizado a linhagem comercial liofilizada Bífido HOWARU® - Bifidobacterium
lactis HN019® (Danisco, Cotia, Brasil), armazenado em freezer a -18ºC.
Leite probiótico e leite esterilizado
O microrganismo foi ativado utilizando 0,25% (P/V) da cultura, adicionada em
leite desnatado reconstituído (LDR) 10% (P/V) (Molico®, Nestlé, Araçatuba, Brasil),
previamente esterilizado por arraste de vapor a 110°C/10 minutos. O inóculo foi
adicionado e cultivado a 37ºC/ 8 h. Posteriormente, este cultivo foi utilizado na
proporção de 10% (V/V) para produção do leite probiótico, que foi incubado à 37ºC/16
h ou até obtenção de contagem do probiótico não inferior à 108 UFC/mL. O produto foi
resfriado, acondicionado assepticamente em frascos plásticos de 80 mL (Inplavel,
Joinvile, Brasil) e armazenado a 5ºC até o momento do uso.
O leite em pó desnatado reconstituído esterilizado foi obtido com formulação
idêntica, mas sem a adição do probiótico.
Os leites probiótico e esterilizado foram produzidos no Laboratório do Mestrado
em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados, Unopar, Unidade Piza, sob critérios de
higiene e segurança.
Viabilidade (UFC/mL) do probiótico, pH e acidez titulável no produto final foram
acompanhados semanalmente durante os 30 dias de tratamento. A contagem do
probiótico foi avaliada através do método de diluições seriadas em água peptonada
tamponada 0,1 % (P/V), seguido de plaqueamento em profundidade em ágar MRS
Lactobacillus (Acumedia - Neogen do Brasil, Indaiatuba, Brasil), enriquecido com 0,3%
L – cisteina (Labsynth, Diadema, Brasil) com incubação de 37°C/72h em anaerobiose,
conforme Van de Casteele et al. (2006) com modificações na concentração de cisteína.
Os valores de pH foram determinados em potenciômetro digital (Tecnal, modelo
Tec-5, Piracicaba, Brasil) devidamente calibrado com soluções tampão de pH 7,0 e pH
4,0.
Acidez total (% ácido lático) foi determinada através de titulação ácido-base com
solução Dornic (Merck, Darmstadt, Alemanha) na presença do indicador fenolftaleína,
21
medindo o teor de ácido lático presente em alíquota de 10 mL.
Análise microbiológica
O produto final foi submetido a testes microbiológicos para a detecção de
microrganismos patógenos (coliformes totais, termotolerantes e salmonela), conforme
preconiza a legislação brasileira (BRASIL, 2001).
Para a avaliação dos coliformes totais e termotolerantes utilizou-se a
metodologia proposta por Silva et al. (2001), através da técnica do número mais
provável (NMP) também conhecido como método de tubos múltiplos. A primeira etapa
consistiu em realizar as diluições seriadas (10-1 à 10-3) em água peptonada tamponada
0,1 % (P/V), semeou-se uma alíquota de 1 mL, em triplicata em tubos contendo Caldo
Lauril Sulfato de Sódio (Biobrás S.A., Montes Claros, Brasil) com tubos de Durhan
invertidos, os quais foram posteriormente incubados de 35 a 37ºC por 24 h. Os tubos
que apresentaram formação de gás no Caldo LSS, tiveram alíquotas semeadas em
tubos contendo Caldo Lactosado Bile Verde Brilhante (Biobrás S.A.), contendo tubos
de Durhan invertidos para o crescimento de coliformes totais. Em uma segunda etapa,
em caso de tubos positivos para Caldo LBVB foram transferidos para tubos contendo
caldo com Escherichia coli (Biobrás S.A.), meio confirmatório para coliformes
termotolerantes (E.C.) e deixados em banho maria de 44,5 a 45ºC durante 24 h.
Para a determinação de Salmonella utilizou-se o método Reveal 2.0 (AOAC, 2011).
Animais e habitação
O projeto de pesquisa foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em
Experimentação animal da Universidade Norte do Paraná - Unopar sob protocolo Nº
037/2016 (ANEXO 1).
Foram utilizados 33 ratos machos Wistar, provenientes do Biotério Central do
Centro de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Londrina e transferidos
para o Biotério do Departamento de Ciências Fisiológicas, onde foram mantidos sob
condições padronizadas, alojados em gaiolas de polipropileno (40 cm x 34 cm x 17 cm)
sendo 05 animais por gaiola. A temperatura do biotério foi mantida a aproximadamente
25°C±1°C, com ciclo claro e escuro de 12:12 h (claro das 07:00 às 19:00 h e escuro
das 19:00 às 07:00). A água e alimentação para os animais foram disponibilizadas
ad libitum durante todo o procedimento.
22
Administração do leite probiótico com B. lactis HN019 e leite esterilizado
O tratamento com B. lactis HN019 foi realizado no período de 30 dias
consecutivos, nos quais os ratos dos grupos tratados com probiótico receberam
diariamente uma dose única de 4 mL do leite probiótico, via oral (gavagem). Os animais
do grupo controle receberam diariamente uma dose única de 4 mL do leite esterilizado,
dito placebo, via oral. As administrações foram realizadas no período vespertino (13:00
– 15:00 h).
Grupo 1: protocolo de labirinto em cruz elevado e Grupo 2: protocolo de campo
aberto:
Grupos independentes de animais foram submetidos ao protocolo de labirinto
em cruz elevado e campo aberto, a fim de investigar se os tratamentos usados podem
induzir algum efeito motor interferente.
Subgrupo 1.1 e 2.1. Animais machos (n=7) receberam o probiótico B. lactis
HN019.
Subgrupo controle 2.2 e 2.2. Animais machos (n=7) receberam leite em pó
desnatado reconstituído esterilizado.
Grupo 3: Protocolo de natação forçada:
Subgrupo Probiótico 3.1. Animais machos (n=7) receberam o probiótico B. lactis
HN019.
Subgrupo controle 3.2. Animais machos (n=7) receberam leite em pó desnatado
reconstituído esterilizado.
Subgrupo controle positivo 1.3. Animais machos (n=5) receberam 15 mg/Kg de
imipramina (Phloraceae, Londrina, Paraná), via intraperitoneal.
Análises comportamentais
Teste de labirinto em cruz elevado
Desenvolvido por Handley e Mithani (1984) e validado por Pellow et al. (1985), o
teste baseia-se na utilização de um aparato de madeira elevado à 50 cm do chão,
compreendendo em dois braços abertos (50 x 10 cm) em frente a si e perpendiculares
a dois braços fechados de mesmo tamanho com paredes de 40 cm de altura. O
23
cruzamento perpendicular forma um centro de plataforma com área de 10 cm2. Os
braços abertos têm uma pequena borda (1 cm) para evitar a queda dos animais durante
o teste.
Após o período de tratamento, os animais foram colocados individualmente no
centro do labirinto com a cabeça direcionada para um dos braços fechados, o
procedimento-padrão consistiu em expor livremente cada animal por 5 minutos ao
labirinto. Entre um animal e outro, o aparato foi higienizado com álcool diluído 20%.
Os testes foram registrados através de gravação de vídeos a fim de verificar o
número de entradas nos braços fechados e nos braços abertos, bem como a
porcentagem de tempo de permanência e frequência em cada braço. Uma entrada em
um determinado braço foi considerada somente quando as quatro patas do animal
atravessaram o limite daquele braço.
Teste do campo aberto
Após o protocolo de labirinto em cruz elevado os mesmos animais foram
individualmente submetidos ao campo aberto, teste proposto por Hall (1934). Os
animais foram colocados no centro de uma arena de madeira (60 x 60 cm; 30 cm de
altura, dividida em 16 quadrados demarcados, sendo 4 quadrados centrais e 12
quadrados periféricos) para observação da atividade locomotora. Durante 5 minutos foi
registrado, através de gravação de vídeos o número de cruzamentos nos quadrantes
centrais e periféricos. Um cruzamento só foi considerado quando as quatro patas do
animal atravessaram o limite daquele quadrante. Após o teste de cada animal, o campo
aberto foi higienizado com álcool diluído 20%.
Teste de natação forçada
Após 30 dias de tratamento os animais de cada grupo foram avaliados. O teste
de natação forçada, no qual o protocolo tradicional de 15 cm foi alterado para 25 cm de
água (PORSOLT et al., 1977; LUCKI, 1997; SALES et al., 2011). Neste protocolo, os
animais foram inicialmente colocados para nadar em um cilindro plástico (30 cm de
diâmetro, 40 cm de altura, contendo 25 cm de água à 24 ± 1°C) por 15 min (pré-teste).
Em seguida, foram removidos do cilindro e secos com toalha. Ao término de todas as
sessões, a água foi trocada para evitar a influência de substâncias alarmantes, bem
como o cilindro foi higienizado com álcool etílico 70%. Decorridas 24h, os animais foram
submetidos à 5 min de sessão de nado forçado (JOCA; GUIMARÃES, 2006).
24
Para análise comportamental durante a sessão teste, os animais foram filmados
(Câmera Digital - Sony Cyber-shot DSC-W800), a fim de observar a evolução do
comportamento emocional. As categorias comportamentais observadas foi o tempo que
apresentaram comportamentos ativos como escalada com intuído de evasão pelas
bordas do tanque e movimentos natatórios e passivos como imobilidade, flutuação e
movimentos necessários apenas para manter a cabeça fora da água (ARMÁRIO;
GAVALDÁ; MERI, 1988; PORSOLT et al., 1977). Quanto menor os comportamentos
ativos e maior os comportamentos passivos, mais intenso é o comportamento
depressivo do animal.
Eutanásia
Após os testes os animais foram anestesiados com 40 mg/Kg, intraperitoneal de
thiopentax (Cristália, Itapira, São Paulo) seguida por decapitação.
Análise estatística
Os resultados dos protocolos campo aberto e labirinto em cruz elevado foram
submetidos aos testes de Shapiro-Wilk e Kolmogorov Smirnov para verificar a
normalidade dos dados. Os dados que apresentaram distribuição normal, utilizou-se da
estatística paramétrica, fazendo uso do teste T não pareado. Para os dados que não
apresentaram distribuição normal, utilizou-se da estatística não-paramétrica, fazendo
uso do teste de Mann Whitney.
Os resultados do protocolo de natação forçada foram submetidos a análise de
normalidade de dados com posterior análise de variância (One-way ANOVA) e médias
comparadas através do teste de Tukey.
Os dados foram expressos em média ±EPM, até para os dados que não
apesentaram distribuição normal para facilitar o entendimento. As diferenças foram
consideradas significativas a um nível < 5% (p < 0,05). Foi utilizado o
software estatístico GraphPadPrism versão 4.0, para Windows.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
25
Muitos são os alimentos que atuam de forma importante na modulação da saúde
e do bem-estar. Alimentos contendo probióticos, ao serem administrados em
quantidades adequadas, proporcionam diversos benefícios à saúde do hospedeiro
(FAO/WHO, 2001).
Bactérias probióticas são comumente utilizadas para fermentação láctica, os
chamados leites fermentados obtidos por diminuição do pH e coagulação do leite
(BRASIL, 2007).
O leite probiótico obtido em laboratório após 16 h de cultivo, apresentou teor de
acidez de 0.35% (ácido láctico) e pH final de 5,35. Diante da legislação brasileira não
cumpre o requisito para leite fermentado, uma vez que encontrasse abaixo do
estipulado de 0,6 – 2,0, considerado assim um leite cultivado, tendo em vista a queda
do pH do leite reconstituído (BRASIL, 2000), a baixa queda do pH de 6,7 para 5,35;
pode ser explicada pelo metabolismo típico de Bifdobacterias que produzem ácido
láctico e acético na proporção de 2:3 (SIDARENKA; AKIMOV; NOVIK, 2008).
A concentração células da bifidobactéria (UFC/mL) mantiveram estáveis durante
a estocagem, com contagem microbiológica inicial (1º dia) de 5,1x108 UFC/mL e ao
término do tratamento (30 dias) com 2,2x108 UFC/mL.
A legislação brasileira não preconiza a concentração de células, entretanto a
maioria dos dados reportados com efeitos positivos para probióticos, encontra-se em
conformidade mantendo uma faixa de 108 à 1010 UFC/dose (LIU et al. 2016; LIU et al.
2015; WANG et al. 2015; BERCIK et al. 2011; DAPOIGNY et al, 2012)
Quanto a segurança dos produtos, ambos os produtos avaliados, apresentou
ausência de microrganismos patógenos (BRASIL, 2001), um indicativo de produção e
manipulação adequada, logo os produtos foram considerados seguros e aptos para
aplicações nos animais teste.
Ações benéficas promovidas por bactérias probióticas dentro do eixo cérebro
intestino, na redução do comportamento de ansiedade, podem ser medidas através de
modelos animais. Dentre os modelos animais de ansiedade, o labirinto em cruz elevado
e o campo aberto, figuram como uns dos mais utilizados para o estudo experimental de
drogas ansiolíticas (CRYAN e O’MAHONY, 2011).
Desenvolvido por Handley e Mithani (1984) e validado por Pellow et al. (1985), o
teste de labirinto em cruz elevado consiste em analisar as porcentagens de frequência
de entradas e o tempo gasto em cada tipo de braço. Desta forma quanto maior o nível
26
de ansiedade em um determinado animal, menor a porcentagem de entradas nos
braços abertos e permanência nos mesmos.
A Figura 1A apresenta os resultados do teste de labirinto em cruz elevado para
a porcentagem de tempo de permanência dos animais do grupo probiótico e do grupo
placebo, nos braços abertos do aparato. O grupo que recebeu o probiótico apresentou
diferença significativa (p≤0,01) com relação ao grupo controle (leite esterilizado),
demonstrando que o probiótico na dose administrada durante 30 dias de tratamento,
aumentou o tempo de permanência dos animais nos braços abertos.
A Figura 1B apresenta os resultados do teste de labirinto em cruz elevado para
a porcentagem de frequência de entrada nos braços abertos. A administração de B.
lactis HN019 por trinta dias, também apresentou diferença significativa (p≤0,01),
demonstrando que os animais do grupo probiótico, tiveram maior frequência de entrada
nos braços abertos em relação ao grupo controle.
Já a Figura 1C indica a atividade locomotora no teste de labirinto em cruz
elevado em relação ao número de entradas nos braços fechados. Não apresentou
diferença significativa (p>0,05).
Figura 1. Efeito (Média±EPM) do leite probiótico com Bifidobacterium lactis HN019 após 30 dias de tratamento no comportamento exploratório de ratos wistar submetidos ao protocolo de labirinto em cruz elevado comparado ao grupo controle (leite esterilizado). * Indica diferença significativa de 5% (p < 0,05).
27
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O teste de campo aberto proposto por Hall (1934) demonstra que animais em
estado emocional alterado em comparação com animais em estado emocional normal,
apresentam uma menor frequência de entradas na parte central da arena.
Em sua revisão, Prut e Belzung (2003) elencam o teste de campo aberto, como
um importante investigador do efeito de diversas drogas, incluindo compostos com
potenciais ansiolíticos como benzodiazepínicos, ligantes de serotonina, neuropeptídios.
O aumento da locomoção nos quadrantes centrais, bem como seu tempo gasto na parte
central do aparato, pode ser interpretado como um efeito ansiolítico.
A Figura 2A apresenta os resultados do teste de campo aberto para o
cruzamento de quadrantes periféricos. A análise da administração de B. lactis HN019
por trinta dias analisados, não apresentou diferença significativa (p > 0,05) entre o grupo
controle e o probiótico.
A Figura 2B apresenta o índice de ansiedade na análise do teste de campo
aberto para o cruzamento de quadrantes centrais, no qual não apresentou diferença
significativa (p > 0,05) entre o grupo controle e o probiótico.
28
Já a Figura 2C apresenta o índice de locomoção na análise do teste de campo
aberto para o cruzamento de quadrantes totais, no qual não apresentou diferença
significativa (p > 0,05) entre o grupo controle e o probiótico.
Figura 2. Efeito (Média±EPM) do leite probiótico com Bifidobacterium lactis HN019 após 30 dias de tratamento, na atividade locomotora e ansiedade de ratos wistar submetidos ao protocolo de campo aberto comparado ao grupo controle (leite esterilizado), através do teste T não-pareado com nível de significância de 5% (p < 0,05).
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C
A ingestão de B. lactis HN019 apresentou um declínio no índice de ansiedade
em ratos, tendo em vista que os animais tratados com leite probiótico apresentaram
uma maior porcentagem de tempo (fig. 1A) e frequência (fig. 1B) nos braços abertos do
aparato do teste de labirinto em cruz elevado. A ingestão de leite probiótico não
apresentou aumento na atividade locomotora no teste de campo aberto, porém pode-
se observar uma tendência de aumento de entradas nos quadrantes centrais (fig. 2B)
do campo aberto em comparação com a ingestão apenas de leite reconstituído 10%.
A atenuação nos níveis de ansiedade causados pela ingestão de B. lactis HN019
não está relacionada a atividade locomotora.
Liu et. al. (2016), observaram que camundongos que ingeriram Lactobacillus
plantarum PS128 em concentração de 109 durante 16 dias, apresentou efeito similar ao
29
B. lactis HN019 no teste de labirinto em cruz elevado, uma vez que aumentou o tempo
nos braços abertos. A ingestão de PS128, também resultou em aumento da atividade
locomotora, bem como reduziu os comportamentos de ansiedade, tendo em vista o
aumento do tempo gasto no centro do aparato no teste de campo aberto.
Diversos outros estudos destinados a entender o papel da microbiota no eixo do
cérebro-intestino, sobre a ansiedade, exploraram o efeito de diversos probióticos tais
como cepas de B. longum NCC3001 (Bercik et al., 2011); B. longum 1714 e B. breve
1205 (Savignac et al., 2014), L. rhamnosus JB-1 (Bravo et al., 2011); L. helveticus
R0052 (Ohland et al., 2013); L. fermentum N93 (Wang et al., 2015), todos
demonstraram uma redução nos níveis de ansiedade, corroborando o envolvimento
benéfico da microbiota.
Em níveis de depressão o teste de natação forçada caracteriza-se como um dos
modelos animais mais tradicionais, por apresentar excelente resposta aos novos e já
existentes medicamentos antidepressivos. Proposto por Porsolt et al. (1977), roedores
são expostos a uma situação aversiva, nadar em um tanque cilíndrico com água, de
forma que o animal não toque o fundo ou fuja. Uma postura de imobilidade durante o
nado é considerada como ação característica de depressão.
Os resultados do teste de natação forçada são mostrados na Fig. 3. Após trinta
dias de tratamento com B. lactis HN019, não houve diferença no tempo de imobilidade
(p>0,05) dos animais. Entretanto o comportamento de imobilidade entre o grupo tratado
com leite probiótico e imipramina são muito semelhantes e muito distintos quando
comparados ao grupo controle.
Figura 3. Efeito (Média±EPM) do leite probiótico com Bifidobacterium lactis HN019 após 30 dias de tratamento, no comportamento natatório de ratos wistar submetidos ao protocolo de natação forçada comparado ao grupo controle (leite esterilizado) e ao grupo controle positivo (imipramina), através da
análise de variância ANOVA, com nível de significância de 5% (p<0,05).
30
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A avaliação dos comportamentos de depressão no recente estudo realizado por
Liu et al. (2016) através do teste de natação forçada, indicou que L. plantarum PS128
reduziu apenas a depressão em animais estressados, não apresentando efeito sobre o
tempo imóvel de camundongos, resultado análogo ao observado para B. lactis HN019,
tendo em vista que não apresentou efeito no tempo de imobilidade.
Cepas probióticas como L. rhamnosus JB-1 (Bravo et al., 2011); L. helveticus
NS8 (Liang et. al., 2015), B. infantis 35624 (Desbonnet et al. 2010); L. acidophilus LAB/
LAB FB (Singh et al., 2012); B. longum 1714 (Savignac et al., 2014), apresentaram
resultados positivos, indicando efeito anti-depressivo, fortalecendo a hipótese de que a
ingestão de probióticos pode melhorar os níveis depressão, atribuindo esse efeito ao
eixo cérebro-intestino.
A ingestão B. infantis por ratos Sprague-Dawley submetidos ao teste de natação
forçada não apresentou efeito sobre o comportamento de natação. No entanto, houve
uma atenuação significativa de citocinas IFN-γ e IL-6, bem como houve aumento nas
concentrações plasmáticas de triptofano e o ácido cinurênico fornecendo evidências
das propriedades antidepressivas (DESBONNET et al. 2008).
Cepas probióticas, tem apresentado efeitos psicotrópicos em modelos animais.
Diante dos benefícios conferidos estas foram definidas como psicóbioticos. Entretanto,
os mecanismos de ação devem ser estudos com maior rigor (DINAN, STANTON e
CRYAN, 2013).
Em resumo, a redução dos níveis de ansiedade demonstrados no teste de
labirinto em cruz elevado, a partir do tratamento baseado na ingestão de B. lactis
HN019, na concentração de 108 por 30 dias, fornece evidências preliminares, mas
encorajadoras, para apoiar a proposta de que este probiótico pode ser benéfico no
31
tratamento da ansiedade.
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36
CONCLUSÃO GERAL E PERSPECTIVAS
Neste estudo, a formulação de um leite probiótico, com posterior tratamento de
ratos wistar no período de 30, possibilitou a avaliação de alguns efeitos do probiótico:
✓ O leite probiótico apresentou acidez titulavel de 0,35%, pH final de 5,35 e
contagem bacteriana de 5,3.108 UFC/ mL.
✓ Leite probiótico e leite desnatado estéril (placebo) estavam isentos de
microrganismos patógenos.
✓ Os animais tratados por 30 dias com probiótico e submetidos ao teste de
labirinto em cruz elevado apresentou efeito significativo em relação ao
grupo controle, apresentando redução nos níveis de ansiedade.
✓ No teste de campo aberto, não apresentou efeito significativo entre o
grupo probiótico e o grupo placebo, não alterando a atividade locomotora.
✓ Já no teste de nado forçado, não houve diferença no tempo de imobilidade
entre o grupo probiótico e os grupos controle placebo e positivo
imipramina.
No entanto, estes resultados são preliminares e mais investigações sobre os
mecanismos precisos envolvidos na redução da ansiedade são necessários, uma
avaliação bioquímica se faz necessária, para identificar quais funções neuroquímicas
centrais e quais sistemas envolvidos na comunicação do eixo cérebro- intestino são
atingidos pelos probióticos, provocando alterações benéficas para o hospedeiro, bem
como as ações das propriedades ansiolíticas de probióticos, podem ser mais claras
trabalhando-se com animais ansiosos, deprimidos e estressado.
37
ANEXO I
38
Anexo 1 – Aprovação do Comitê de Ética de Uso Animal.