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Lição de Biocatálise

Hidrólise da ureia pela urease

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Velocidade de uma reacção enzimática

Para cada case do utilização de um enzima para catálise de uma dada reacção é necessário conhecer a estequiometria da reacção

aA + bB → cC

e da sua dependência com:

- Concentração enzima- Concentração do(s) substrato(s)- Presença de inibidores e sua concentração- Presença de activadores e sua concentração- Força iónica do meio reaccional- pH (actividade enzimática e estabilidade)- Temperatura (actividade enzimática e estabilidade)- Indirectamente do tempo de reacção, isto é, acumulação e concentração do(s) produto(s) da reacção.

[ ] [ ] [ ]dt

Bd

bdt

Ad

adt

Cd

cv

111−=−==

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Função da concentração de substrato

DEQB



Função da concentração do enzima

DEQB



Função do pH

v

pH óptimo

pH

DEQB



Função do pH

v

pH óptimo

pH

O pH óptimo da actividade de um enzima está próximo do pH do ambiente em que o enzima é normalmente encontrado, por exemplo:

(a)Pepsina que hidrolisa certas ligações peptídicas de proteínas durante a sua digestão no estômago tem um pHóptimo de 1,6.

(b) Glucose 6-fosfatase de células do fígado (hapatócitos) com um pHóptimo de ~ 7,8 é responsável pela libertação de glucose na corrente sanguínea. O pH normal no citosol de células de hepatócitos é ~7,2.

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Noções Gerais sobre Cinética

v, exprime-se como a velocidade de alteração da quantidade de uma substância interveniente na reacção, presente na mistura reaccional.

De um modo geral, para, aA + bB → cC tem-se;

Com a lei cinética obtêm-se uma expressão matemática que mostre como é que a velocidade medida depende das concentrações dos reagentes (e produtos, se a reacção inversa ocorrer com velocidade apreciável).

[ ] [ ] [ ]dt

Bd

bdt

Ad

adt

Cd

cv

111−=−==

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Por exemplo, se a velocidade da reacção

A + B → C variar linearmente com as concentrações de A e B, tem-se:

em que k é a constante cinética para a reacção indicada. De uma forma geral pode escrever-se

em que α e β definem a chamada ordem da reacção em relação a A e B, respectivamente.

[ ] [ ][ ]BAkdt

Cdv ==

[ ] [ ] [ ]βαBAk

dt

Cdv ==

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À soma θ = α + β chama-se ordem global da reacção. Para uma reacção de ordem global θ, as unidades da constante cinética são [concentração1-θ x tempo-1].

Tabela– Expressões cinéticas para reacções de ordem global entre zero e dois

Reacção Ordem Lei Cinética tsemi-tranformação

A → B

A → B

A + A → B

0

1ª

2ª

[ ]

− =d A

dtk [ ] [ ]A A kt= −0

[ ][ ]− =

d A

dtk A [ ] [ ]A A e

kt= −0

[ ] [ ]2Ak

dt

Ad

2

1=−

[ ] [ ]1 1

20A A

kt= +

[ ]t =

A1/2

0

2k

tk1 2

2/

ln=

[ ]0

2/1Ak2

1t =

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Velocidade de uma reacção enzimáticaFunção da temperatura

Equação de Arrhenius

- k é constante da velocidade, - R é constante da lei dos gases, - A é factor de frequência,- EA à energia de activação da reacção.

A → B[ ]

[ ]− =d A

dtk A

Actividade Enzimática: Equação de Base Experimental

PE

k

k

ES

k

k

SE +↔↔+

−− 2

2

1

1

Figura 2-1 – Curva de progressão de uma reacção enzimática

V E2

Vmáx

E1

reacção de ordem zero

1/2 Vmáx

reacção de 1ª ordem

KM

[ S]

[ ][ ]

v k CS

K Scat E

M

=+

Para [S]<< KM

, [ ]SCk

kv E

M

cat=

Para [S]>> KM, máxEcat VCkv ==

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PE

k

ES

k

k

SE +→↔+

−

2

1

1

Cinética de Michaelis-Menten

[ ][ ]

d P

dtv k ES= = 2

• Reacção inicial, a concentração de produto édesprezável e, por isso, pode ignorar-se a reacção inversa de formação de ES a partir de E+P

[ ] [ ]ESCE E −=

[ ][ ][ ]ES

ES

k

kK

1

1-

S ==

[ ][ ]

[ ]ES

C S

K S

E

S

=+

[ ][ ]SK

SCkv

S

E2+

=

• A combinação do enzima com o substrato éinstantânea para dar um complexo enzima-substrato, ES. Este passo é considerado, neste esquema, rápido e reversível (equilíbrio)

• A conversão do complexo ES em E+P é muito lenta, não alterando o equilíbrio anterior (k2 << k-1).

Vmáx

= E2Ck

KM = KS,

[ ][ ]SK

SVV

M += máx

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[ ] [ ]ESECE +=• Balanço ao enzimas

?

Determinação dos parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten

[ ] máxmáx

M

V

1

S

1

V

K

v

1+=

Pela equação de Lineweaver-Burk

resultante da inversão da Michaelis-Menten

Pela equação de Eadie-Hofstee

multiplicar anterior por Vmax

[ ]v

S

vKV Mmáx +=

[ ]S

vKVv Mmáx −=

coeficiente angular =KM

/Vmáx

abcissa = -1/KM [ ]1/ S

1/Vmáx

1/V

v

ordenada=Vmáxcoeficiente angular = - KM

Vmáx /K M v/[S]

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[ ][ ]SK

SVV

M += máx

Determinação dos parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten

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KM = 0,161 mM (o-NPG)Vmax = 178 µµµµmole o-NPG/L.min

Cinética de Briggs – Haldane

[ ] [ ]ESkvdt

Pd2==

• Briggs e Haldane examinaram o caso em que, no esquema de Michaelis-Menten, k2 era comparável a k-1,, logo a hipótese da existência de equilíbrio rápido não é válida.

Vmáx

= E2Ck

[ ][ ]SK

SVV

M += máx

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• Do balanço ao enzimas

PE

k

ES

k

k

SE +→↔+

−

2

1

1

[ ] [ ][ ] [ ] [ ]ESkESkSEkdt

ESd1210 −−−== [ ] [ ][ ] )/( 211 kkSEkES += −

KM =

1

21

k

kk +−

[ ] [ ]ESCE E −= .

• Mas, aplicando a aproximação do estado estacionário à concentração de ES:

[ ] [ ]ESECE +=

• A velocidade de formação do produto.

?

[ ] [ ][ ]Skkk

SCkES E

121

1

)( ++=

−

[ ]

[ ]Sk

kk

SCkv E

++

=−

1

21

2

Actividade Enzimática

sendo n o número de centros activos por molécula de enzima. Como regra, pode-se considerar que kcat é uma constante cinética de 1ª ordem que se refere às propriedades e reacções dos complexos enzima-substrato, enzima-composto intermediário e enzima-produto.

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Significado da constante catalítica (k2 = kcat)

No mecanismo de Michaelis Menten kcat = k2 é a constante cinética de 1ªordem para a conversão química de ES em EP. Para casos mais complexos, éuma função de todas as constantes cinéticas de 1ª ordem costume relacionar kcat com o “turnover number”, que representa o número máximo de moléculas de substrato que se podem converter em produtos por centro activo do enzima e por unidade de tempo, e é expresso em s-1.

“turnover number”nC

V

n

k

E

cat máx==

Actividade Enzimática

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“turnover number”nC

v

n

k

E

cat ==

onde

aparece como uma constante cinética aparente de segunda ordem. Este quociente relaciona a velocidade da reacção com a concentração do enzima livre. Por exemplo, para baixas concentrações de substrato, o enzima está em grande parte livre e CE ≅ [E]. A constante designa-se por constante de especificidade uma vez que este quociente traduz a especificidade para substratos que estejam em competição para se ligarem ao enzima.

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Significado da constante (kcat/KM)

No mecanismo de Michaelis Menten para baixas concentrações de substrato ([S]<<KM):

[ ]SCK

kv E

M

cat=M

cat

K

k

De facto, se tivermos dois substratos A e B competindo para o centro activo do enzima:

[ ]

[ ]BK

k

AK

k

v

v

BM

cat

AM

cat

B

A

=

o poder discriminatório do enzima em relação a dois substratos, é determinadopor kcat/KM.

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Significado da constante (kcat/KM) [ ]SCK

kv E

M

cat=

DEQB


Significado da constante (kcat/KM) [ ]SCK

kv E

M

cat=

Há uma dependência da reacção catalisada pela quimotripsina com o pH e neste caso manifesta-se ao nível dos valores de kcat e KM:

- A velocidade da reacção aumenta para pH > 7,0 devido ao aumento do kcat.

- A velocidade da reacção diminui parapH > 8,5 devido à diminuição do 1/KM.

- Esta dependência é devida à intima relação entre cinética e estrutura do centro activo, em particular ao estado de ionização da His57

envolvida na ligação do substrato.

- No pH óptimo da reacção (pH = 8,0) a His57

deve estar desprotonada (pka ~ 6,0).

Interacções do enzima com activadores e inibidores

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ActivadoresEm enzimas alostéricos o sítio de ligação do substrato (subunidadecatalítica C) e do activador (subunidadereguladora R) são diferentes:

- A ligação do activador (M) ao seu sitio específico na subunidade reguladora écomunicada à subunidade catalítica por uma alteração da sua conformação espacial.

- E é esta alteração conformação espacial que permite à sub-unidadecatalítica reconhecer o substrato com elevada afinidade.

- A dissociação do activador ao sub-unidade reguladora converte o enzima numa forma conformacional não activa ou menos activa.


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Inibidores Irreversíveis

Reacção da quimotripsina com di-isopropil fluoro fosfato (DIFP) inibe irreversivelmente a actividade do enzima e levou àconclusão de que a Ser195 é um resíduo de amino ácido chave no processo catalítico.

Inibição da Actividade Enzimática (Inibidores reversíveis)DEQB



Inibição da Actividade Enzimática na cinética Briggs-Haldane

Inibição competitiva

EI

K

I

PE

k

ES

k

k

SE

I b

+

+→↔+

−

2

1

1

[ ][ ][ ]EI

IEKI =

CE=[E]+[ES]+[EI]

[ ][ ]

11

1

1

1

21

2

+

+

+=

−

SK

I

k

kkCkv

I

E

[ ]

+=

I

M´M

K

I1KK

1/ v S + I

S

1/ [S]-1/K`M

DEQB


[ ]

[ ]Sk

kk

SCkv E

++

=−

1

21

2[ ]

[ ][ ]

1

2

1

21

2

+

=

++

=−

S

k

Ck

Sk

kk

SCkv

M

EE

Inibição da Actividade Enzimática

Inibição não competitiva

ESI

k

k

SEI

KK

II

PE

k

ES

k

k

SE

II

1

1

´

2

1

1

−

−

↔+

++

+→↔+

bb

CE=[E]+[ES]+[EI] + [ESI]

[ ][ ]SK

SCkv

M

E

+= 2

1/ vS+I

S

1/ [S ]

1/Vmáx´

DEQB


[ ][ ]

[ ]SK

S

K

I1

Ckv

M

I

E2

++

=

[ ]

I

máxmáx

K

I1

V´V

+

=

Inibição anticompetitiva

ESI

K

I

PE

k

ES

k

k

SE

I b

+

+→↔+

−

2

1

1

CE=[E]+[ES]+[ESI],

[ ][ ]

[ ][ ]S

K

I1

K

S

K

I1

Ckv

I

M

I

E2

+

+

+

=

1/ v

S+I

S

1/ [S ]-1/K`M

1/Vmáx´

DEQB


[ ][ ]SK

SCkv

M

E+

= 2

Inibição da Actividade Enzimática

Inibição pelo Substrato

PE

k

ESS

KS

ES

k

k

SE

I

+→+

↔+

−

2

1

1

b [ ][ ][ ]ESS

SESK I =

[ ]

[ ] [ ]2

I

'M

E2

K

SSK

SCkv

++

=

Para baixas concentrações de S

([S]<<KM) a equação é de 1ª

ordem em [S]:

[ ]SK

EC

2k

v'M

=

Para elevadas concentrações

de S ([S]>> KM):

[ ]

[ ] [ ] [ ]

I

E2

I

E2

K

S1

1Ck

K

S1S

SCkv

+

=

+

=

v [ ]

I'M KKS =

k2CE

ESS ES + P

ESS inactivo

[S]

DEQB

A equação de Lineweaver-Burk teria o seguinte aspecto:

Inibição pelo Substrato

declive =

máx

'

M

V

K

-1/'

MK

1/[S]

1/v

1/Vmáx

DEQB


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