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Aula de Bioquímica II – SQM04242015201Bacharelado em Ciências Físicas e Biomoleculares

Tema:

Fosforilação Oxidativa

Cadeia transportadora de elétrons

Prof. Dr. Júlio César BorgesDepto. de Química e Física Molecular – DQFM

Instituto de Química de São Carlos – IQSC

Universidade de São Paulo – USP

E-mail: [email protected]

Fosforilação oxidativa

�� Fim das rotas metabólicas de produção de energia em organismos aeróbicos

- Representa o estágio 3 do processo

�� Acoplamento da oxidação de NADH e FADH2 e síntese de ATP

- É o principal sítio de produção de ATP

- Envolve o consumo de O2 e formação de H20

�� Teoria Quimiosmótica

- Fluxo de elétrons por carreadores criam um gradiente de concentração de prótons na membrana mitocondrial

- A quebra deste gradiente está acoplada com a síntese de ATP


LOCAL: MITOCÔNDRIA

- Organela de eucariotos

�� Possui duas membranas

�� Membrana Mitocondrial externa - MME

- Permeável a pequenas moléculas

�� Membrana Mitocondrial interna - MMI

- Impermeável a maioria das moléculas

- Inclusive H+

- Necessidade de transportadores

de membrana

�� Espaço intermembranal

-Cristas membranais

�� Matriz mitocondrial

- Local de oxidações

- Ciclo de Krebs

- β-oxidação de lipídeos

- Oxidação de Aminoácidos

MitocôndriaOs carreadores que transportam os elétrons do NADH e FADH2

até O2 estão na MMI

A oxidação de NADH e FADH2 é promovida pela CTE

Alguns desses centros redox são móveis ou proteínas integrais de membrana


LOCAL: MITOCÔNDRIA

A MMI contém proteínas que acoplam processos:

Fluxo de elétrons (favorável) com o fluxo de prótons (desfavorável);

Fluxo de prótons (favorável) a fosforilação oxidativa (desfavorável).

Os elétrons passam por uma série de carreadores

MMI

-~ 75% de proteínas: mais rica em proteínas do que a

MME

-É permeável a O2, CO2 e H2O

- Contém proteínas de transporte que controlam a passagem de metabólitos,

como ATP, ADP, o piruvato, o Ca2+ e o fosfato

�A impermeabilidade da MMI para a maioria dos íons e metabólitos permite a formação de um gradiente de íons

através dessa barreira

�Resulta na compartimentalização das funções metabólicas entre o citosol e a mitocôndria


LOCAL: MITOCÔNDRIA


CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA

� Os carreadores que transportam os elétrons do NADH e FADH2 até O2 estão na MMI

- A oxidação de NADH e FADH2 é promovida pela cadeia de transporte de elétrons

- Alguns desses centros redox são móveis ou proteínas integrais de membrana

- Dependem dos grupos protéticos associados

� A sequência de carreadores de elétrons reflete seus potenciais de redução relativos

� O processo é exergônico

Transporte de e’1) 1 e’ �� Fe3+ para Fe2+

2) 1 e’ + 1 H+

3) 2 e’ na forma de :H-



Par redox

0E

Potencial de transferência de elétrons

= potencial de redução= potencial redox= potencial de oxidorredução

Forma oxidada (oxidante) →

Forma reduzida (redutor) → X

−

X

H+ : H2

Potencial de redução = E 0 = 0 VPotencial de redução = E’ 0 = -0,414 V



Potencial de transferência de elétrons

Potencial de redução ˂ 0A forma oxidada tem menor afinidade por elétrons do que o H2

Potencial de redução ˃ 0A forma oxidada tem maior afinidade por elétrons do que o H2

Um agente redutor forte (como o NADH) tem a tendência de doar elétrons (E’0 < 0); um agente oxidante forte (como o O2) está pronto

para aceitar elétrons (E’0 > 0)

A força impulsora da fosforilação oxidativa é o potencial de transferência de elétrons de NADH e FADH2 em

relação ao do O2

- O ∆E0‘ representa o potencial de redução padrão nas condições padrões para bioquímica

- Um Valor positivo para o ∆E (potencial de redução ou força eletromotiva) sugere espontaneidade da reação

- um valor positivo para o ∆E representa um valor negativo para o ∆G


CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS

NADH + H+ + ½ O2 �� NAD+ + 1 H2O

A ∆G da reação pode ser medida a partir da diferença de voltagem entre meias células

- Se referente ao trabalho elétrico realizado a pressão e volume constante

-Se o onde f é a constante de Faraday (96.485 Cmol-1) e

- n é o número de e’/mol, portanto:

+∆=∆ +

+

nred

nox

noxred

BA

BARTGG

]][[

]][[ln'0

elwwG −=−=∆ '

Enfwel ∆=

EnfG ∆−=∆

−∆=∆ +

+

nred

nox

noxred

BA

BA

nf

RTEE

]][[

]][[ln'0 Equação

de Nernst�� Reorganizando

��+�� ⇋ �� + ��

��



Flu

xo d

e e

’

Acetaldeído + NADH + H+ �� NAD+ + 1 Etanol

NAD+ + 2H+ + 2e’�� NADH + H+ E’0 = -0,320 V

Acetaldeído + 2H+ + 2e’�� 1 Etanol E’0 = -0,197 V

doadoraceptor EEE '0'0'0 −=∆

V 0,123)320,0(197,0'0 =−−−=∆E

0'0' EnfG ∆−=∆

molkJG

VmolVkJG

/7,23

)123,0)(./5,96(20'

0'

−=∆

−=∆



Os carreadores de e´

NAD(P)H

São carreadores de elétrons solúveis em água, que se associam reversivelmente

a desidrogenases

Substrato reduzido + NAD(P)+ ↔ Substrato oxidado + NAD(P)H + H+

**Desidrogenases �� remoção de 2 átomos de H do substrato

:H- → NAD+

H+ → Liberado do meio

NADH → carreador de elétrons das vias catabólicas até a entrada na CTE

NADPH → geralmente supre elétrons para reações anabólicas

][][

+NADNADH

][][

+NADPNADPH

NADPHRazão alta�� Poder redutor a reações

anabólicas

NADHRazão baixa �� carreador de e- no

catabolismo

Nas células




FlavoproteínasContêm um nucleotídeo de flavina (FMN ou FAD) → parte do sítio ativo da

flavoproteína

� Pode aceitar 1 elétron → semiquinona ou 2 elétrons → FADH2 FMNH2

A forma oxidada (FMN) reage com um próton e um elétron, convertendo-se na forma semiquinona (FMNH●); a incorporação de mais um próton e um elétron resulta na forma totalmente reduzida (FMNH2).

Flavoproteínas� podem participar da transferência de 1 ou 2 e- → intermediários entre reações

onde 2e- são doados (desidrogenações) e onde 1 e- é doado (redução de uma quinona a hidroquinona).




Ocorrem 3 tipos de transferência de elétrons na CTE

①①①① Transferência direta como na redução de Fe3+ a Fe2+

②②②② Transferência na forma de um átomo de hidrogênio (H+ + e-)

③③③③ Transferência como íon hidreto (:H+) que tem 2 elétrons

+ 3 tipos de moléculas carreadoras de elétrons atuam na CTE:

①①①① Ubiquinona (quinona hidrofóbica)

②②②② Citocromos

③③③③ Proteínas ferro- enxofreProteínas (diferentes) que contêm ferro

Carreadores não podem atravessar a MMI, MAS os equivalentes redutores podem ser lançados através da membrana indiretamente

Equivalentes redutores �� termo geral para um elétron ou equivalente de elétron na forma de um átomo de hidrogênio ou de um íon hidreto.



� Os carreadores de elétrons na mitocôndria COENZIMA UBIQUINONA (Q)- Pequena e Lipossolúvel

Quinona → composto benzênico com duas funções cetona

Constituída de unidades isoprenóides (cada uma com 5C)

A coenzima Q10 é a mais comum em mamíferos (10

unidades de isopreno)

Fácil de desprotonar, formando um radical

aniônico de semiquinona

Forma que fixa mais firmemente seus prótons

Aceita 1 elétron

Aceita 2 elétrons

Lipossolúvel→ se difunde livremente no espaçointermembranas→ Capaz de fazer a junção entre o doadorde 2e- e um aceptor de 1e- (como asflavoproteínas)→ Carrega tanto elétrons como prótons** acopla fluxo de e- com o movimento de

prótons



� Os carreadores de elétrons na mitocôndria

PROTEÍNAS COM CENTROS DE FERRO-ENXOFRE

- Estrutura variável simples a complexas- O íon Fe sofre reações de óxido-redução

Os átomos de ferro estão ligados a átomos de enxofre inorgânico ou com átomos de enxofre

em resíduos de cisteína ou com ambos

Podem ter de 1 a 4 átomos de ferro

*** Proteínas ferro-enxofre de Rieske1 Fe está associado com dois resíduos de His ao

invés de Cys



� Os carreadores de elétrons na mitocôndria

Citocromos a, b e cSeus grupos prostéticos – grupos Heme

Citocromo c �� solúvel no espaço intermembranaPodem interagir com a MMI



� O fluxo de elétrons pelos carreadores vai daquele com menor potencial para o maior potencial

NADH �� Q �� Cit b �� Cit c1 �� Cit c �� Cit a �� Cit a3 �� O2



� Os carreadores de elétrons na MMI: 4 complexos

Complexo I �� é do NADH para formar UbiquinolNADH:Ubiquinona-oxidoreductase ou NADH-desidrogenase

Complexo II �� é do FADH2 para formar UbiquinolSuccinato-desidrogenase

Complexo III �� é do Ubiquinol para o Citocromo cUbiquinona:Citocromo c-oxidoreductase

Complexo IV �� é do Citocromo c para o O2

Citocromo c-oxidase


COMPLEXO I: NADH:UBIQUINONA-OXIDOREDUTASE OU NADH-DESIDOGENASE

Porta de entrada dos e’ do NADH produzidos dentro da mitocôndria

-O Complexo catalisa 2 processos simultâneos e acoplados

1) NADH + H+ + Q �� NAD+ + QH2

�� Exergônico

2) Transferência de 4 H+ para o espaço intermembrana

�� Endergônica

Grupos prostéticos: FMN e Fe-S


COMPLEXO II: SUCCINATO-DESIDOGENASE

� Porta de entrada dos e’ do FADH2 produzidos no ciclo do ácido cítrico

�Porta de entrada dos e’ do NADH produzidos no citoplasma

- Canaliza diretamente os e’ do succinatopara a cadeia transportadora de e’

� FADH2 + Q �� FAD + QH2

�� Exergônico

� Sem transferência de H+ para o espaço intermembrana

� Porta de entrada de e’ de outras vias oxidativas

- β-oxidação de ácidos graxos


COMPLEXO I E COMPLEXO II

� Vias de entrada de e’ para a

ubiquinona:

1) NADH mitocondrial,

2) Succinato do ciclo do ácido

cítrico,

3) e’ da β-oxidação de ácidos

graxos via Acil-CoA-

desidrogenase e do glicerol dos

triacilglicerois

4) NADH citosólico via glicerol

3-fosfato

1)

2) 3)

4)

A ubiquinona é o ponto de convergência dos e- (Fontes 1 a 4)

O ubiquinol de todas essas reações (pool de QH2) é oxidado no Complexo III


COMPLEXO III: UBIQUINONA:CITOCROMO C-OXIDOREDUTASE

� Canaliza os 2 e’ do Ubiquinol (QH2) para o Citocromo C com a transferência de H+ da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana

- possui duas unidades de Citocromo b enterrados em 1 fenda na membrana

QH2 + 2 Citc1 (Oxi) + 2 H+N �� Q + 2 Citc1 (Red) + 4 H+

P


COMPLEXO III: UBIQUINONA:CITOCROMO C-OXIDOREDUTASE

2 e’ do Ubiquinol são afunilados no Citc �� carreador de 1 e’

�� 2 ciclos de redução do Citc com a formação da Semiquinona (.Q-)

� 1º Ciclo-1 e’ do QH2 é passado para o

Citc no primeiro ciclo e o outro e’ (via citocromo b)

para a Q formandoSemiquinona

- 2 H+ transportados para o espaço intermembrana

� 2º Ciclo-1 e’ do QH2 é passado para o

Citc e o outro e’ (via citocromo b) para a

Semiquinona formando outraQH2

- 2 H+ transportados para o espaço intermembrana

- 2 outros H+ são retirados damatriz

� 1º Ciclo � 2º Ciclo


COMPLEXO IV: CITOCROMO OXIDASE

� Os e’ do Citocromo c são entregues ao O2

4 Citc (Red) + 8 H+N + O2 �� 4 Citc (Oxi) + 4 H+

P + 2 H2O

Os e- do citocromo c são entregues ao O2 (reduzindo-o a H2O)

Composto por 13 subunidades �� aparentemente 3 são essenciais

Sub. II: 2 Cu ligados a resíduos de Cys (centro binuclear CuA)

Sub. I: 2 grupos heme (a e a3) e outro íon Cu (CuB)

Heme a3 e CuB forma outro centro binuclear


COMPLEXO IV: CITOCROMO OXIDASE

� Os e’ do Citocromo c são entregues ao O2

4 Citc (Red) + 8 H+N + O2 �� 4 Citc (Oxi) + 4 H+

P + 2 H2O

Envolve a participação de:Ion CuA

Citocromo aCitocromo a3-CuB (Centro Fe-Cu)

O2

�� 4 ciclos são necessários para reduzir 1 O2 a 2 H2O

�� 4 H+ transportados para o E.I.

�� 4 outros H+ são retirados da matriz para formar as 2 H2O

�� 2 H+ por par de e-



�Resumo do processo

Equação Vetorial do transporte de Prótons pela cadeia

NADH + 11 H+N + ½ O2 �� NAD+ + 10 H+

P + 1 H2O

FADH2 + 6 H+N + ½ O2 �� FAD+ + 6 H+

P + 1 H2O


CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS �� TEÓRICO

NADH + H+ + ½ O2 �� NAD+ + 1 H2O

NADH/NAD+ �� E0’ = + 0,320 V

O2/H2O �� E0’ = +0,816 V

Succinato + ½ O2 �� Fumarato + 1 H2O

�� A razão da [NADH]/[NAD+] >1 o que sugere que a ∆G é mais negativa do que -220 kJ/mol!

∆E0’= E0’Red + E0’

oxi = + 1,14 V

)(/22014,1)./5,96(2'0'0 deNADHmolkJVmolVkJEnfG −=−=∆−=∆

)(/150785,0)../5,96(2'0'0 odeSuccinatmolkJVmolVkJEnfG −=−=∆−=∆

E energia liberada é usada para gerar um gradiente de prótons que é então utilizado para a síntese de ATP e para o transporte de metabólitos pela

membrana mitocondrial


CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS �� EFETIVO

� A energia da transferência de e’ é eficientemente conservada em um gradiente

- Gradiente de prótons - Gradiente eletroquímico



FORÇA PROTON-MOTRIZ �� ENERGIA ELETROQUÍMICA

A ∆G associada ao processo de criação dos 2 gradientes é:

C2 = H+p ��Lado positivo da MMI �� Espaço intermembrana

C1 = H+n ��Lado negativo da MMI �� Matriz mitocondrial

Z = valor absoluta da carga elétrica �� 1 para 1 H+

∆Ψ = Diferença do potencial transmembrana

Logo:

ψzfCC

RTG ∆+=∆ )12

ln(

pHpHpHHHCC

pnnp ∆=−=−= ++ 3,2)(3,2)]log[](log[3,212

ln

]log[ +−= HpH

ψmolkJpHmolkJψzfpHRTG ∆+∆=∆+∆=∆ )./6,95()./7,5(3,2



�� A ∆pH da MMI é de 0,75 unidades de pH

�� A ∆Ψ da MMI é de 0,15-0,20 V

A ∆G associada à oxidação de 1 mol de NADH é:

Equação Vetorial do transporte de Prótons pela cadeia

NADH + 11 H+N + ½ O2 �� NAD+ + 10 H+

P + 1 H2O

Logo:

∆G = 19 kJ/mol*10 = ~190 kJ/mol

∆G0’ = 220 kJ/mol

molkJmolkJmolkJG /1915,0)./6,95(75,0)./7,5( =+=∆


SISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL

�Espaço intermembrana: entre a MME e MMI

- equivalente ao citosol no que se refere às concentrações em metabólitos e íons

�� A MMI é composta por cerca de 75% de proteínas mais rica em proteínas

MME

- A MMI é permeável a O2, CO2 e H2O

- Contém proteínas de transporte que controlam a passagem de metabólitos, como ATP, ADP, o piruvato, o Ca2+ e o

fosfato

�� A impermeabilidade da MMI para a maioria dos íons e metabólitos permite

a formação de um gradiente de íons através dessa barreira

�� Resulta na compartimentalizaçãodas funções metabólicas entre o citosol

e a mitocôndria



� Transporte seletivo de elétrons produzidos no citoplasma para a mitocôndria

- O NADH produzido no citosol pela glicólise deve ter acesso à cadeia transportadora de elétrons para a oxidação aeróbica

- Não há uma proteína transportadora de NADH

na MMI

- Somente os elétrons do NADH citosólico são transportados para a

mitocôndria por um dos vários sistemas de

transporte

LANÇADEIRA DE MALATO-ASPARTATO



LANÇADEIRA DE GLICEROL-3-P

�� A glicerol-3-fosfato desidrogenase

catalisa a oxidação do NADH

citosólico pela DHAP para produzir

NAD+, o qual retorna à glicólise

�� Os elétrons do glicerol-3-fosfato

são transferidos para a

Flavoproteína-desidrogenase da

MMI, formando FADH2,

�� O FADH2 fornece elétrons

diretamente para Cadeia

Transportadora de Elétrons



TRANSLOCADOR DE ATP/ADP-PI

�� A maior parte do ATP gerado na matriz

mitocondrial pela fosforilação oxidativa é

utilizado no citosol

�A MMI contém um translocador de ADP-

ATP (ou adenina-nucleotídeo translocase)

- Transporta o ATP para fora da matriz

mitocondrial acoplado à importação de

ADP e Pi produzidos no citoplasma a

partir de ATP

- Sistema antiporte

- Mantém balanço eletrolítico pelo gasto

de energia quimiosmótica

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