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Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas Curso de Ciências Biológicas Aula 2: Estrutura e Função de Proteínas Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected] Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

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Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

Aula 2: Estrutura e Função de

Proteínas

Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected]

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

mailto:[email protected]
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Aminoácidos

Classificação baseada no grupo R:

Apolares, alifáticos (hidrofóbicos)

Aromáticos (hidrofóbicos)

Polares, não-carregados

Carregados positivamente

Carregados negativamente

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Aminoácidos

Apolares, alifáticos (hidrofóbicos)

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Aminoácidos

Aromáticos (hidrofóbicos)

Polares, não carregados

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Aminoácidos

Carregados positivamente Carregados

negativamente

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Aminoácidos Bases ou ácidos?

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aminoácido + aminoácido + aminoácido

= peptídeo (proteína)

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Proteínas

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Proteínas A ligação peptídica é rígida e planar

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Proteínas

Estrutura secundária:

Conformação local de alguma parte do polipeptídeo

Padrões de enovelamentos mais regulares do esqueleto

polipeptídico

α-hélices conformação β dobras β

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Proteínas

Estrutura secundária: α-helices

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Proteínas

Estrutura secundária: folhas β

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Proteínas

Estrutura secundária: dobras β

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Proteínas

Bernstein et al. PNAS 2004;101:8575-8580

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Proteínas

Estrutura terciária e quaternária

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Proteínas Fibrosas

queratina

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Proteínas Fibrosas

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Proteínas

Fibrosas

colágeno

G-X-Y

Prolina ou Hidroxiprolina

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Proteínas

Fibrosas

colágeno

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Proteínas

Fibrosas

escorbuto

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Proteínas Fibrosas

fibroína da seda

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Proteínas Fibrosas

resumo

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Proteínas Globulares

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Proteínas Globulares

mioglobina

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Proteínas Globulares

protoporfirina + Fe2+ = heme

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Proteínas Globulares

mioglobina

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Proteínas Globulares

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Proteínas Globulares

motivos

estruturais

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Proteínas Globulares

motivos

estruturais

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Proteínas Globulares

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Estrutura Quaternária

múltiplas subunidades = multímero

poucas subunidades = oligômero

dímeros, trímeros, tetrâmeros, etc...

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Desnaturação Protéica

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Renaturação Protéica

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Problemas de Dobramento – Prion

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Interação Proteína-Ligante

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Interação Proteína-Ligante

mioglobina

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Interação Proteína-Ligante

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Interação Proteína-Ligante

concentração do ligante

porcentagem dos sítios de ligação ocupados

concentração constante da proteína

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Interação Proteína-Ligante

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Interação Proteína-Ligante

a mioglobina e o

oxigênio

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Interação Proteína-Ligante

a mioglobina e o

oxigênio

Complete a frase: um Kd alto indica _________________

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Interação Proteína-Ligante

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Interação Proteína-Ligante

Page 44: Aula 2: Estrutura e Função de Proteínas · Modelo chave-fechadura Nesse modelo, o sítio ativo da enzima é pre-formado e tem a forma complementar à molécula do Substrato, de

Interação Proteína-

Ligante

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Interação Proteína-Ligante

hemoglobina

(desoxihemoglobina)

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Interação Proteína-Ligante

hemoglobina

(desoxihemoglobina)

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Interação Proteína-

Ligante

ligação cooperativa

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Interação

Proteína-

Ligante

ligação cooperativa

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Interação Proteína-Ligante

afinidade dependente de pH

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Anemia falciforme

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Enzimas

GRANDE maioria formada por proteínas

(algumas enzimas são formadas por RNA)

Função:

CATALIZADORES de reações químicas

(aceleração das reações químicas,

especificidade pelo substrato,

funcionam em diversas condições de temperatura e pH)

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Enzimas

+ +

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Enzima holozima

Apoenzima parte proteica

Parte Não proteica (cofator)

metal

coenzima

.

Enzimas

apoenzima holoenzima

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Coenzimas participam do ciclo catalítico das enzimas recebendo ou fornecendo grupos químicos para a reação

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Enzimas

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Como Enzimas Funcionam...

enzima

sítio ativo

(catalítico)

substrato

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Como Enzimas Funcionam...

como a reação progride

mudança de

energia durante

a reação

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Como Enzimas Funcionam...

variação de energia livre

padrão (bioquímica)

energias de

ativação

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Como Enzimas Funcionam...

... e não aqui!

É aqui que as enzimas

agem!!!

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Como Enzimas Funcionam...

energia de

ativação SEM

catalizador

energia de

ativação COM

catalizador

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Como Enzimas Funcionam...

intermediários da

reação

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Como Enzimas Funcionam...

passo limitante

da reação

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Enzimas

+ +

A energia de ativação é monstruosa!!!

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Enzima

Velocidade na

ausência de enzima

“Reações/segundo”

Velocidade da

reação catalisada

“Reações/segundo”

Poder

catalítico

Anidrase carbônica

Triosefosfato isomerase

Carboxipeptidase A

AMP nucleosidase

Nuclease de estafilococos

1.3 X 10 –1

4.3 X 10 –6

3.0 X 10 –9

1.0 X 10 –11

1.7 X 10 -13

1.0 X 106

4.300

578

60

95

7.7 X 106

1.0 X 109

1.9X 1011

6.0 X 1012

5.6 X 1014

Compare esses números !

Como Enzimas Funcionam...

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Como Enzimas Funcionam...

enzima

sítio ativo

(catalítico)

substrato formação de

ligações

covalentes

transientes

com o

substrato!

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Como Enzimas Funcionam...

Intermediário

ES

(E e S ligados

covalentemente)

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Como Enzimas Funcionam...

enzima

sítio ativo

(catalítico)

substrato

formação de

várias ligações

fracas dão

especificidade

para ES!

sítio de ligação

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Como Enzimas Funcionam...

energia de

ligação

Maior fonte

de energia

livre usada

por enzimas

para abaixar

as energias de

ativação das

reações

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Como Enzimas Funcionam...

+

formação de

várias ligações

fracas dão

especificidade

para ES!

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Modelo chave-fechadura Nesse modelo,

o sítio ativo da enzima é pre-formado e

tem a forma complementar à molécula

do Substrato, de modo que outras

moléculas não teriam acesso a ela.

Modelo de encaixe induzido Nesse

modelo, o contacto com a molécula do

substrato induz mudanças

conformacio-nais na enzima, que

otimizam as intera-ções com os resíduos

do sítio ativo. Esse é o modelo aceito hoje

em dia.

Modelo Chave-Fechadura

Modelo de encaixe induzido

Como as Enzimas Funcionam...

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Em B: A ligação do substrato dipeptídico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profunda mudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.

Em A: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos (em vermelho) de Tyr248 (acima, à direita) e de Glu270 (centro), e um átomo de Zn2+, que está acima do Glu270.

A B

Exemplo do modelo de encaixe induxido

(Carbopeptidase)

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Como Enzimas Funcionam...

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Como Enzimas Funcionam...

substrato

estado de

transição

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Determinar a taxa (velocidade) da reação e como esta

muda em resposta a mudanças nos parâmetros

experimentais – abordagem central para estudar o

mecanismo de reações catalisadas por enzimas.

Cinética Enzimática

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Praticamente linear; ou

seja, quanto mais

substrato, maior a V0

Cinética Enzimática

Saturação! Não adianta

adicionar substrato, a V0 não

muda significativamente.

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Equação de Michaelis-Menten:

Cinética Enzimática

V0 = Vmax [S]

Km + [S]

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Cinética Enzimática

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Cinética Enzimática

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Cinética Enzimática

Km = k-1 = Kd

k1

Nesta condição, Km mede a afinidade da

enzima pelo substrato

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Cinética Enzimática

kcat

descreve a taxa do passo limitante da reação

equivalente ao número de moléculas de

substrato convertidas a produto em uma

unidade de tempo em uma molécula de enzima,

quando a enzima está saturada com substrato

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Cinética Enzimática

moles de S catalisado por segundo

moles de enzima

Número

de

turnover

=

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Eficiência catalítica

kcat/Km Parâmetro mais adequado para

comparações cinéticas

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Condições do meio que afetam estabilidade protéica

• pH

• temperatura

% a

tivid

ad

e e

nzim

áti

ca

má

xim

a

pH ótimo=1,5 pH ótimo=6,8 pH ótimo=9,9

O pH ótimo de uma enzima reflete

variações no estado de ionização de

resíduos de aminoácidos do sítio

ativo.

Fatores que afetam a atividade enzimática

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1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas

• Variações de pH: pH ótimo

• Variações de temperatura: temperatura ótima

100-

50-

0-

% a

tivid

ad

e e

nzim

áti

ca

má

xim

a

Temperatura

ótima

Desnaturação

térmica da

proteína

Pouca energia

para a reação

acontecer Ao contrário da curva em

forma de sino no caso da

atividade enzimática versus

pH, a enzima só está

desnaturada em temperaturas

acima da temperatura ótima.

Fatores que afetam a atividade enzimática

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Enzimas Reguladoras

geralmente possuem

subunidades múltiplas...

sítio ativo e sítio(s) regulador(es)

em subunidades separadas

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Enzimas Alostéricas

formas mais ou menos

ativas são geradas por

alterações de

conformação induzidas

por um ou mais

moduladores...

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Enzimas Alostéricas

formas mais ou menos ativas são

geradas por alterações de

conformação induzidas por um ou

mais moduladores...

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Enzimas Alostéricas

X

hiperbólica sigmóide

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Enzimas Alostéricas

alteração no K0.5

alteração na Vmax

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Modificações Covalentes Reversíveis

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Modificações Covalentes Reversíveis

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Proproteínas, Proenzimas e Zimogênios

precursor inativo que precisa ser clivado para gerar a

forma ativa...

modificações irreversíveis

pró-colágeno → colágeno

fibrogênio → fibrina

protrombina → trombina

pró-insulina → insulina

quimotripsinogênio → quimotripsina

tripsinogênio → tripsina

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Disciplina de M.P.A.P

Curso de Ciências Biológicas

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