atividade biolÓgica de cÉlulas-tronco da polpa … · agradeço também por ter sido meu...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM ODONTOLOGIA
ATIVIDADE BIOLÓGICA DE CÉLULAS-TRONCO DA POLPA DE
DENTES DECÍDUOS HUMANOS SUBMETIDAS À
CRIOPRESERVAÇÃO
Fernanda Ginani Antunes
Natal/RN
2013
1
Fernanda Ginani Antunes
ATIVIDADE BIOLÓGICA DE CÉLULAS-TRONCO DA POLPA DE
DENTES DECÍDUOS HUMANOS SUBMETIDAS À
CRIOPRESERVAÇÃO
Dissertação apresentada ao Colegiado do
Programa de Pós-Graduação em Saúde
Coletiva, Área de Odontologia, da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza
Natal– 2013
2
Antunes, Fernanda Ginani.
ATIVIDADE BIOLÓGICA DE CÉLULAS-TRONCO DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS HUMANOS SUBMETIDOS À CRIOPRESERVAÇÃO / FERNANDA GINANI ANTUNES.– NATAL, RN, 2013.
60f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza.
Dissertação (Mestrado em Saúde Coletiva) – Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em
Saúde Coletiva.
1.Polpa Dentária - Dissertação. 2. Células-tronco -Dissertação.
3.Criopreservação-Dissertação. I.Barboza, Carlos Augusto Galvão.II. Título.
RN/UF/BSO Black D242
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
3
Dedico este trabalho
Ao meu voinho, Jonas Floripe Ginani.
Por sempre se fazer presente em minha vida, mesmo que agora espiritualmente. O amor que sinto nem o tempo, nem a distância serão capazes de apagar.
Meu anjo da guarda,cuida sempre de mim!!
4
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À DEUS, pela sua presença em minha vida, por sempre me mostrar
um caminho nos momentos difíceis, não deixando o desânimo tomar conta
de mim e por me mostrar toda a força, a fé e o potencial existentes em
mim.
À minha família – minha mãe Viviani Ginani e minha irmã Amanda
Ginani, pelo amor incondicional, amizade eterna e por sempre me
apoiarem. Agradeço de coração toda a paciência que tiveram durante este
período... Serei sempre grata por tudo. Amo vocês!!
Ao meu orientador, chefe querido, Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão
Barboza, meu agradecimento por todas as orientações recebidas, por
acreditar e confiar no meu trabalho desde o início e pela grande amizade.
Você é um exemplo para mim... O grande responsável pelo meu encanto
com a pesquisa científica; obrigada por me conduzir de forma segura neste
caminho.
5
AGRADECIMENTOS
Ao meu amigo e namorado, André Cavalcanti, pelo incentivo constante e por
compartilhar todos os momentos de alegria, dúvida e conquista como se fossem seus.
Agradeço também por ter sido meu motorista em todas as “viagens” da “fada do
dente”.
Ao amigo Diego Moura Soares, meu irmão de coração. Obrigada por estar
sempre ao meu lado e por dividir os problemas e as alegrias. Sentirei muita saudade de
todos os momentos vividos, mas tenho certeza que nossa amizade será eterna! Você é
muito especial pra mim... E desculpa todos os abusos tá?!? Mas talvez não tivesse sido
tão bom se não fosse assim!!
Ao Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, por ter me acolhido em seu
laboratório como um dos seus, sempre preocupado comigo. Serei eternamente grata
por todo o aprendizado que você me proporcionou e pela amizade sincera. Agradeço
também a sua participação na banca de qualificação, colaborando imensamente para
este trabalho.
Aos amigos, Luciana Rabêlo, Ruth Medeiros, Rafael Câmara e Anderson
Felipe, por toda contribuição na realização dos experimentos, pela disponibilidade e
pelo socorro sempre que necessário. Obrigada também por todos os reagentes
“emprestados”, pelos momentos de descontração e por todos os apelidos carinhosos
que vocês me deram.
A minha amiga Águida Henriques, pela admiração, consideração e
demonstrações de carinho. Você é muito especial e terá sempre um lugar no meu
coração.
A todos os colegas do BIOPOL - UFRN, por sempre me receberem de forma
tão gentil no laboratório sendo eu apenas uma “agregada” e por estarem sempre
dispostos a ajudar. Vocês deixaram mais divertidos meus dias no laboratório. Obrigada
pelos agradáveis momentos de convivência.
6
As amigas e técnicas do laboratório de histologia do Departamento de
Morfologia da UFRN, Lurdinha, Socorro, Melina e Sara, meus sinceros
agradecimentos pelo companheirismo, eficiência, disponibilidade, paciência por
agüentar minhas agonias e colaboração sempre que precisei.
Aos colegas do laboratório de Imunogenética - UFRN, que abriram um milhão
de vezes a porta do laboratório para mim. Em especial, agradeço ao farmacêutico
bioquímico Francisco Paulo Freire Neto, por toda sua disponibilidade e prontidão na
realização dos experimentos em citometria de fluxo, além do otimismo transmitido
durante meus momentos de angustia.
A Profa. Dra. Halissa Simplício e ao dentista Sérgio Siqueira, pelo auxílio na
obtenção dos dentes.
Ao amigo Mardem Portela, obrigada pela amizade sincera e por sempre
acreditar no meu potencial.
Aos amigos do grupo de pesquisa em Biologia Crânio-Facial, em especial
Gabriel Lamak e Haroldo Gurgel, pelas boas energias transmitidas em todos os
momentos e pela disponibilidade de ajudar sempre.
À Profa. Dra. Naisandra Bezerra, pela participação na banca da qualificação,
contribuindo para o aprimoramento deste trabalho de dissertação.
À todos os que trabalham no Laboratório de Cultivo de Células, em
especial Ana Katarina Soares e Raphael Serquiz, pela disponibilidade em me ajudar,
pela troca de experiências e por todos os momentos engraçados vivenciados no
laboratório.
Aos colegas do curso de mestrado por compartilharem suas experiências, em
especial aos amigos Kerlison Paulino, Pryscyla Pascally, Haroldo Abuana e Anna
Angélica. Obrigado pelo companheirismo e ajuda durante todo esse tempo.
Aos amigos que a Biomedicina me deu, Juliana Alves, Hudson Bezerra,
Jannyce Guedes, Bruno Tardelli, Gabriela Diniz, Hermany Munguba, Hylarina
7
Diniz, obrigada por fazerem parte do início da minha jornada pela vida científica, por
sempre acreditarem na minha capacidade e pela amizade.
Á Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em especial ao
Departamento de Morfologia e ao Departamento de Bioquímica por ter
proporcionado as condições necessárias para a realização deste trabalho e por serem a
extensão da minha casa.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e
ao REUNI pelo suporte financeiro na forma de bolsa de mestrado.
À toda minha família e amigos, que torceram para o sucesso deste trabalho e
pela compreensão em todos os momentos de ausência.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho, meu sincero agradecimento!
8
"Impossível é uma palavra muito grande
que gente pequena usa pra tentar nos derrubar”.
(Autor desconhecido)
9
RESUMO Células-tronco da polpa dental humana têm sido amplamente investigadas em
razão da sua capacidade de diferenciar-se tanto em células dentais quanto não
dentais, com potencial de utilização em terapias envolvendo a engenharia de
tecidos. A técnica de criopreservação celular representa uma alternativa viável
para a conservação dessas células, já que cessa reversivelmente, de forma
controlada, todas as suas funções biológicas em uma temperatura ultra-baixa.
O presente estudo teve como objetivo avaliar, através de experimentos in vitro,
a influência de um protocolo de criopreservação na atividade biológica de
células-tronco da polpa de dentes humanos decíduos esfoliados (SHED).
Células obtidas da polpa de três dentes decíduos em estágio final de esfoliação
ou com exodontia indicada foram expandidas em meio de cultivo α-MEM
suplementado com antibióticos e 15% de soro fetal bovino. No segundo
subcultivo (P2), um grupo de células foi submetido a criopreservação por 30
dias em DMSO diluído a 10% em soro fetal bovino, a 80ºC negativos, enquanto
o restante seguiu em condições normais de cultivo. A proliferação celular em
ambos os grupos (criopreservado e não criopreservado) foi avaliada através do
método de coloração por azul de Tripan nos intervalos de 24, 48 e 72 horas
após o plaqueamento. Nestes mesmos intervalos foi realizada a análise do
ciclo celular das SHEDs submetidas ou não ao protocolo de criopreservação.
Os eventos relacionados à morte celular foram analisados através da
expressão de Anexina V e PI em citometria de fluxo, nos intervalos de 24 e 72
horas. A presença de alterações morfológicas nucleares foi avaliada através da
marcação por DAPI no intervalo de 72 horas. Observou-se que ambos os
grupos exibiram uma curva de proliferação celular ascendente, sem alterações
consideráveis na viabilidade celular ao longo do experimento. A distribuição
das células nas fases do ciclo celular foi coerente com células em proliferação
nos dois grupos. Não foram observados danos morfológicos nucleares no
intervalo final do experimento. Deste modo, conclui-se que o protocolo de
criopreservação proposto é eficiente para o armazenamento do tipo celular
estudado, permitindo a sua utilização em futuros estudos experimentais.
Palavras-chave: Polpa dental; células-tronco; criopreservação; cultivo celular.
10
ABSTRACT Dental pulp stem cells have been widely investigated because of their ability to
differentiate into both dental and non-dental cells, with potential use in therapies
involving tissue engineering. The technique of cell cryopreservation represents
a viable alternative for the conservation of these cells, since it stops reversibly,
in a controlled manner, all of cell biological functions in an ultra low
temperature. The present study aimed to evaluate, using in vitro experiments,
the influence of a cryopreservation protocol on the biologic activity of stem cells
from human exfoliated deciduous teeth (SHED). Cells obtained from the pulp of
three deciduous teeth on end-stage exfoliation or with indicated extraction were
expanded in α-MEM culture medium supplemented with antibiotics and 15%
fetal bovine serum. At second subculture (P2), a group of cells were submitted
to cryopreservation for 30 days in 10% DMSO diluted in fetal bovine serum, at -
80º C, while the remind cells continued under normal conditions of cell culture.
Cell proliferation was evaluated in both groups (not cryopreserved or
cryopreserved) by Trypan blue stain essay at intervals of 24, 48 and 72h after
plating. Cell cycle analysis of SHEDs submitted or not to the cryopreservation
protocol was performed in the same intervals. Events related to cell death were
studied by Annexyn V and PI expression under flow cytometry at the intervals of
24 and 72h. The presence of nuclear morphological changes was evaluated by
DAPI staining at 72h interval. It was observed that both groups exhibited an
upward cell proliferation curve, without considerable changes in cell viability
throughout the experiment. The distribution of cell in the cell cycle phasis was
consistent with cell proliferation in both groups. There were no nuclear
morphological damages in the end range of the experiment. therefore, it is
concluded that the proposed cryopreservation protocol is efficient for storing
the studied cell type, allowing its use in future experimental studies.
Key-words: Dental pulp; Stem cells; Cryopreservation; Cell culture
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Desenho experimental. P35 – placa com 35 mm de diâmetro; P1
– primeiro subcultivo; P2 – segundo subcultivo; P3 – terceiro subcultivo;
P4 – quarto subcultivo ................................................................................... 32
Figura 2. Remoção do tecido pulpar ............................................................ 33
Figura 3. Curva de crescimento das SHEDs submetidas ou não à
criopreservação durante os intervalos de tempo analisados........................ 38
Figura 4. Imunomarcação das SHEDs com Anexina V/PI. Q1: Anexina V
negativo/PI positivo; Q2: Anexina V/PI positivos; Q3:Anexina V positivo/PI
negativo; Q4: Anexina V/PI negativos. (A) Grupo não-criopreservado,
intervalo de 24 horas; (B) Grupo criopreservado, intervalo de 24 horas; (C)
Grupo não-criopreservado, intervalo de 72 horas; (D) Grupo
criopreservado, intervalo de 72 horas............................................................
40
Figura 5. Distribuição das SHEDs nas fases do ciclo celular para os
diferentes grupos estudados, nos intervalos de tempo analisados. Os
valores da porcentagem de cada fase do ciclo representam as medias de
3 triplicatas ....................................................................................................
41
Figura 6. Fotomicrografia das células-tronco da polpa de dente decíduo
humano coradas com DAPI. A – grupo não-criopreservado; B – grupo
criopreservado (Imunofluorescência, 40x).....................................................
43
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Análise do crescimento das SHEDs em cada intervalo de tempo
nos diferentes grupos estudados................................................................... 39
Tabela 2. Percentual de viabilidade das SHEDs nos grupos estudados,
nos diferentes intervalos de tempo................................................................ 39
Tabela 3. Distribuição percentual das células em cada fase do ciclo celular
nos diferentes grupos estudados, em cada intervalo de tempo .................... 42
13
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ASC – do inglês adult stem cell– célula-tronco adulta
CD – marcador de superfície celular
CEP – Comitê de Ética em Pesquisa
CNPase –enzima 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase
CO2 – gás carbônico
CTM – célula-tronco mesenquimal
DAPI – corante fluorescente 4'-6-Diamidino-2-phenylindole
DMSO – dimetilsulfóxido
DNA – ácido desoxirribonucléico
DP – desvio-padrão
DPSC – do inglês postnatal dental pulp stem cells - células-tronco da polpa de
dente permamente
EDTA – ácido etileno diamino tetracético
ESC – do inglês embrionic stem cell - célula-tronco embrionária
FITC – Fluorescina isoticianato
GFAP –do inglês glial fibrillary acidic protein – proteína ácida fibrial gliar
HA/TCP – hidroxiapatita associada a fosfatotricálcio
HLA-DR – do inglês human leukocyte antigen–DR – antígeno de leucócitos
humanos.
ISCT – do inglês International Society for Cellular Therapy – Sociedade
Internacional de Terapia Celular
MEM – do inglês minimum essential media– meio essencial mínimo
mg/mL – miligrama por mililitro
mL – mililitro
mM – milimolar
NeuN– do inglês neuronal nuclear antigen – antígeno nuclear neuronal
NFM – Neurofilamento M
nm – nanômetro
PBS – do inglês Phosphate-Buffered saline – solução salina tamponada com
sais de fosfato
14
PDLSC – do inglês periodontal ligament stem cells – células-tronco do
ligamento periodontal
PE – Ficoeritrina
pH – potencial de hidrogênio iônico
PI – iodeto de propídeo
P1 – primeiro subcultivo
P2 – segundo subcultivo
P3 – terceiro subcultivo
P4 – quarto subcultivo
rpm – rotações por minuto
SFB – soro fetal bovino
SHED – do inglês stem cells from human exfoliated teeth - células-tronco da
polpa de dentes decíduos humanos esfoliados
TCLE – termo de consentimento livre e esclarecido
T24 – intervalo de tempo de 24 horas
T48 – intervalo de tempo de 48 horas
T72 – intervalo de tempo de 72 horas
UI/mL – unidades internacionais por mililitro
UV – ultravioleta
μg/mL – micrograma por mililitro
μm– micrometro
ºC – grau Celsius
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 17
2 REVISÃO DE LITERATURA ..................................................................... 19
2.1 Características gerais das células-tronco ......................................... 19
2.2 Célula-tronco da polpa de dente decíduo humano – SHED ............. 21
2.3 Criopreservação................................................................................. 24
3 OBJETIVOS ............................................................................................... 29
3.1 Objetivo Geral ................................................................................... 29
3.2 Objetivos Específicos......................................................................... 29
4 METODOLOGIA ........................................................................................ 30
4.1 Implicações éticas ............................................................................. 30
4.2 Tipo de Estudo................................................................................... 30
4.3 Amostra ............................................................................................. 30
4.3.1 Critérios de inclusão e exclusão da amostra ........................... 30
4.4Local..................................................................................................... 31
4.5 Delineamento do Estudo ................................................................... 31
4.6 Obtenção das SHEDs........................................................................ 32
4.6.1 Obtenção e processamento dos dentes .................................. 32
4.6.2 Cultivo das células pulpares .................................................... 32
4.6.3 Confirmação da multipotencialidade celular ............................. 33
4.7 Criopreservação das SHEDs ............................................................ 33
4.8 Análise da proliferação celular .......................................................... 34
4.9 Avaliação da viabilidade e morte celular por Anexina V-FITC/PI ..... 35
4.10 Análise do ciclo celular ................................................................... 36
4.11 Análise de danos morfológicas nucleares ...................................... 36
4.12 Análise estatística ........................................................................... 37
5 RESULTADOS .......................................................................................... 38
5.1 Proliferação e viabilidade celular ...................................................... 38
5.2 Efeitos do protocolo de criopreservação sobre a viabilidade e
morte celular por Anexina V-FITC/ Iodeto de Propídeo ................................
39
5.3 Efeitos do protocolo de criopreservação sobre o ciclo celular .......... 40
16
5.4 Efeitos do protocolo de criopreservação no núcleo celular .............. 42
6 DISCUSSÃO .............................................................................................. 44
7 CONCLUSÃO ............................................................................................ 49
REFERÊNCIAS ............................................................................................ 50
ANEXOS ....................................................................................................... 57
17
1 INTRODUÇÃO
As células-tronco adultas são responsáveis pela reposição das células
dos tecidos onde se encontram ao longo de toda vida, tendo sido isoladas de
vários órgãos, incluindo diferentes porções do dente, como a polpa de dentes
permanentes (post natal human dental pulp stem cells – DPSCs), polpa de
dentes decíduos (stem cells from human exfoliated deciduous teeth – SHED)
(GRONTHOS et al., 2000; MIURA et al., 2003) e ligamento periodontal (human
periodontal ligament stem cells – PDLSC) (SEO et al., 2004; KRAMER et al.,
2004).
O uso de tecido pulpar de dentes humanos como fonte de células-tronco
multipotentes tem sido amplamente investigado, já que essas células
apresentam eficiência clonogênica quando orientadas e estimuladas com
fatores de diferenciação, tanto para formação de tecidos relacionados com as
estruturas dentárias, como para outras estratégias e terapias em engenharia de
tecidos. Essas células possuem a capacidade de se diferenciar em várias
linhagens celulares distintas in vitro, além de serem capazes de se diferenciar
em odontoblastos e direcionar a formação de um complexo semelhante à
dentina quando transplantadas em camundongos imunocomprometidos
(GRONTHOS et al., 2000; GRONTHOS et al., 2002; SHI, ROBEY,
GRONTHOS, 2001; BATOULI et al., 2003; MIURA et al. 2003; SEO et al. 2004;
BOWEN et al., 2006; KERKIS et al., 2006).
As células-tronco de origem dentária representam uma alternativa viável
para regeneração tecidual e a obtenção de células provenientes de dentes
decíduos esfoliados não apresenta implicações éticas e legais, por serem
obtidas a partir de um tecido que é “descartável” e facilmente acessível em
pacientes jovens (CORDEIRO et al., 2008), o que torna esses tecidos uma
fonte ideal de células-tronco para reparar estruturas dentais ou crânio-faciais
comprometidas por traumas ou outros processos patológicos, ou ainda induzir
a regeneração óssea dos maxilares.
O fato das crianças perderem, em média, 20 dentes decíduos, permite
múltiplas oportunidades para formação de um banco com essas células, o que
não ocorre com o sangue do cordão umbilical, por exemplo (VOLPONI, PANG,
18
SHARPE, 2010). Assim, essas células precisam ser armazenadas para permitir
seu uso clínico posterior.
A necessidade de manter as células viáveis por um longo período de
tempo sem a perda de suas funções levou ao desenvolvimento de técnicas de
criopreservação, que têm como objetivo cessar reversivelmente, de forma
controlada, todas as funções biológicas dos tecidos vivos em uma temperatura
ultra-baixa, geralmente por volta de -196°C (DE SANTIS, PRATA, 2009).
Entretanto, é extremamente necessário determinar se o processo de
criopreservação afeta tanto a capacidade proliferativa das células
criopreservadas, como também o seu potencial de diferenciação.
Assim, considerando-se a possibilidade de criopreservação das células-
tronco da polpa de dentes decíduos para estudos futuros e ainda as
perspectivas clínicas de utilização destas células nos processos de reparo
tecidual, torna-se extremamente necessário determinar se o processo de
criopreservação afeta a viabilidade e a capacidade proliferativa destas células,
sendo este o objetivo do presente trabalho.
19
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Características gerais das células-tronco
Nos organismos pluricelulares, vários tecidos apresentam capacidade de
renovação fisiológica que pode ser mantida durante toda a vida do indivíduo,
como a pele e o sangue. A manutenção do número de células, da matriz
extracelular, da arquitetura e da função dos órgãos ocorre devido à renovação
celular que depende, basicamente, da existência de células com capacidade de
auto-renovação e de diferenciação que são denominadas células de reserva ou
células-tronco (PERES, CURI, 2005; ZAGO, COVAS, 2006).
As células-tronco são definidas como células indiferenciadas que,
quando induzidas corretamente, apresentam grande capacidade de auto-
renovação e de diferenciação em tipos celulares especializados (BARRY, 2003;
HOFFMAN, CARPENTER, 2005; FRESHNEY, STACEY, AUREBACH, 2007).
Elas podem ser classificadas em dois tipos: células-tronco embrionárias e
células-tronco adultas. Outra forma de caracterização de tais células é pelo seu
potencial de originar um ou mais tipos de progênie especializada: totipotentes,
pluripotentes, multipotentes e unipotentes (KRABBE, ZIMMER, MEYER, 2005;
SERAKINCI, KEITH, 2006).
As células-tronco embrionárias (Embryonic Stem Cell – ESC) são
encontradas na fase embrionária, na massa celular interna do blastocisto
(embrioblasto) e vão dar origem aos mais de 200 tipos celulares diferentes dos
tecidos adultos. A capacidade dessas células de se multiplicarem em cultura
sem perder a pluripotência, assim como a possibilidade de diferenciação em
tipos celulares específicos, tornou as células-tronco embrionárias uma
poderosa ferramenta de pesquisa e uma promissora fonte de tecidos para
transplantes (ZAGO, COVAS, 2006). Todavia, as pesquisas com esse tipo
celular têm gerado conflitos de ordem política, moral e religiosa, o que vem
restringindo os avanços de estudos com esta fonte primária de células
totipotentes e pluripotentes. Além da questão ética – pela falta de consenso
sobre a origem da vida e a moralidade do seu uso –, estas células apresentam
20
como desvantagens a dificuldade de controlar o potencial proliferativo e de
diferenciação, o que pode resultar na formação de teratomas justamente por
descontrole destas propriedades (THOMSON et al., 1998; SHAMBLOTT et al.,
1998; GRONTHOS et al., 2000; GOLDBERG, SMITH, 2004; MURRAY,
GARCIA-GODOY, HARGREAVES, 2007).
Já as células-tronco adultas ou somáticas (Adult Stem Cell– ASC),
também denominadas de células-tronco mesenquimais (CTM) são células
indiferenciadas, encontradas em tecidos especializados como a medula óssea
e tecido adiposo e ultimamente vêm sendo pesquisadas na polpa dental de
animais e de humanos, com evidência de se reprogramarem geneticamente
(HARADA et al., 1999; GRONTHOS et al., 2000; BIANCO et al., 2001). São
classificadas como células-tronco multipotentes por poderem se diferenciar em
diversas linhagens células e apresentarem um controle melhor dos processos
de diferenciação e proliferação in vitro. Essas células são autogênicas e
responsivas aos fatores de crescimento inerentes ao hospedeiro e sua
manipulação não implica em conflitos éticos ou morais. No entanto, o fato de
não serem pluripotentes e a sua presença em menor quantidade nos tecidos
representam suas principais desvantagens (SONG, BAKSH, TUAN, 2004;
SOARES et al., 2007).
As células-tronco praticamente não expressam ou expressam poucos
marcadores de superfície específicos, por isso sua caracterização não é tão
simples. Em 2006, a Sociedade Internacional de Terapia Celular (ISCT) propôs
um painel de marcadores de superfície celular para identificação de células-
tronco mesenquimais (CTM). Pelo menos 95% da população de CTMs devem
ser positivas para os seguintes marcadores: CD73, CD90 e CD105; e negativas
para CD34, CD45, CD11b ou CD14, CD19 ou CD79α, e HLA-DR. Outro
aspecto importante que caracteriza as células-tronco é a capacidade de
diferenciação em osteoblastos, condroblastos e adipócitos em condições de
cultivo celular (DOMINICI et al., 2006).
21
2.2 Célula-tronco da polpa de dente decíduo humano – SHED
As células-tronco da polpa de dente decíduo humano esfoliado (SHED)
são células imaturas, não especializadas e que são capazes de se
diferenciarem em tipos celulares especializados. A obtenção destas células é
um processo simples, conveniente e com pouco ou nenhum trauma. Toda
criança perde os dentes decíduos, sendo esta uma oportunidade perfeita para
recuperar e armazenar células-tronco para tratar doenças ou lesões futuras.
Além disso, o uso autógeno destas células reduz o risco de reações
imunológicas ou rejeição de transplantes e também elimina a possibilidade de
contrair doenças de outro doador (ARORA, ARORA, MUNSHI, 2009).
GRONTHOS et al. (2000) foram os primeiros a isolar e expandir células
progenitoras odontogênicas de uma população de polpa de dente permanente
humano in vitro e observaram que elas eram capazes de auto-renovação e
diferenciação, in vitro e in vivo, denominando-as de DPSC (Dental Pulp Stem
Cell – células-tronco da polpa dental). Outros estudos têm isolado células
altamente proliferativas derivadas da polpa dentária mesmo após subcultivo
extensivo (BATOULI et al., 2003; NAKASHIMA, AKAMINE, 2005; SHI et al.,
2005).
SHEDs foram identificadas por MIURA et al. (2003) como sendo uma
população de células clonogênicas com alta capacidade proliferativa, capaz de
formar uma variedade de tipos celulares. Experimentos com este tipo celular
mostraram que há diferenças significativas entre a biologia de dentes decíduos
e de permanentes; e quando comparadas às células-tronco provenientes da
medula óssea e da polpa de dentes permanentes, notou-se que as SHEDs
apresentaram uma taxa de proliferação maior (NAKAMURA et al., 2009), maior
número de divisões celulares – o que pode facilitar sua expansão in vitro –
formação de colônias, capacidade de osteoindução in vivo e a formação de
tecido diferente do complexo dentina-polpa (MIURA et al., 2003). Esses autores
acreditam que as SHEDs representam uma população de células multipotentes
que se encontra em um estágio de maturidade inferior aquele verificado para
as DPSCs.
22
As SHEDs aparecem por volta da sexta semana do desenvolvimento
pré-natal humano. Os cientistas acreditam que estas células-tronco se
comportam diferentemente das células-tronco adultas por se multiplicarem
rapidamente e se diferenciarem muito mais rápido do que as células estaminais
adultas, sugerindo que elas são menos maduras (diferenciadas), e
consequentemente, com potencial para se diferenciar em uma ampla variedade
de tipos teciduais (MIURA et al., 2003; SEO et al., 2008; ARORA, ARORA,
MUNSHI, 2009).
As células-tronco da polpa dental compartilham diversos marcadores
com células derivadas da medula óssea, como CD146, α-actina de músculo
liso, fosfatase alcalina, colágeno tipo I, osteonectina, osteopontina,
osteocalcina, colágeno tipo III e fator de crescimento de fibroblasto II. No
entanto, não foram identificados marcadores hematopoéticos como CD14,
CD45 e CD34 nessas células (GRONTHOS et al., 2000). Além desses
marcadores, há também a expressão de marcadores neurais (Nestina, βIII-
tubulina, NeuN, GFAP, NFM e CNPase) por ambas as linhagens, DPSC e
SHED, o que sugere a origem mesenquimal dessas células, fortalecendo a
hipótese de serem originadas das cristas neurais (GRONTHOS et al., 2002;
MIURA et a., 2003). Outro aspecto que aponta para uma origem dessas células
a partir das cristas neurais é a sua morfologia fibroblastóide. Quando células da
crista neural de embriões humanos foram isoladas, observou-se que elas
apresentaram morfologia semelhante à de fibroblastos, o que também se
verifica nas células-tronco embrionárias (THOMAS et al., 2008).
VOLPONI, PANG, SHARPE (2010) investigaram a crista neural como
possível origem das SHEDs. As células da crista neural são células
multipotentes que apresentam potencial de auto-renovação e de diferenciação
em várias linhagens celulares além de desempenharem um importante papel
no desenvolvimento dentário, pois originam os componentes mesenquimais
dos dentes, incluindo odontoblastos, tecido pulpar, ligamento periodontal e
vascularização apical. Os autores verificaram que as SHEDs são uma
população heterogênea e que apresentam características moleculares in vitro
semelhantes às demais células-tronco adultas e às células da crista neural.
23
Estudos experimentais demonstram que células-tronco da polpa
requerem um meio indutor apropriado e um arcabouço composto por
hidroxiapatita e fosfato tricálcico (HA/TCP) para induzir a formação de osso,
cemento e dentina in vivo (GRONTHOS et al., 2000; BATOULI et al., 2003). As
células-tronco dos dentes decíduos demonstraram uma forte capacidade de
induzir formação óssea in vivo; apesar de não se diferenciarem diretamente em
osteoblastos nos transplantes, essas células foram capazes de induzir nova
formação óssea atraindo células osteogênicas hospedeiras (MIURA et al.,
2003).
SHI et al. (2005) realizaram um estudo utilizando células-tronco da polpa
dentária permanente humana, polpa de dentes decíduos humanos esfoliados e
do ligamento periodontal. O experimento in vitro demonstrou que as três
linhagens celulares formaram uma variedade de tecidos associados ao
complexo dentina/polpa, osso, músculo liso, tecido neural, e endotélio.
Transplantes xenógenos com carreador HA/TCP com DPSC ou SHED
geraram, no leito receptor, tecidos com diferentes camadas odontoblásticas e
uma estrutura de matriz dentinária mineralizada. Os autores concluíram que a
presença de populações distintas de células-tronco dentárias associada a
carreadores têm o potencial para regenerar estruturas dentárias.
CORDEIRO et al. (2008) avaliaram as características morfológicas dos
tecidos que se formaram quando fragmentos de dente humano (arcabouços
biodegradáveis) semeados com SHEDs foram transplantados em ratos
imunossuprimidos. Os autores observaram que os tecidos resultantes
apresentaram arquitetura e celularidade bem semelhantes ao de um tecido
pulpar. Assim, as SHEDs poderiam ser implantadas diretamente na câmara
pulpar de um dente severamente danificado para regenerar a polpa em seu
interior, evitando a necessidade de tratamento endodôntico (Arora, Arora,
Munshi, 2009).
SAKAI et al. (2010), objetivando estabelecer se os vasos sanguíneos da
papila dental são recrutados a partir do mesênquima vizinho, ou se as
populações locais de células-tronco são capazes de formarem estruturas
vasculares (angiogênese), utilizaram SHEDs semeadas em fragmentos de
24
elementos dentários (arcabouço celular) e implantaram subcutaneamente em
camundongos imunocomprometidos. Os autores concluíram que as SHEDs se
diferenciam em células endoteliais, promovendo o processo de angiogênese, e
em odontoblastos capazes de gerarem dentina tubular.
2.3 Criopreservação
A criopreservação compreende uma técnica existente há várias
décadas, com objetivo de cessar reversivelmente, de forma controlada, todas
as funções biológicas dos tecidos vivos em uma temperatura ultra-baixa
(geralmente 196°C negativos). Durante este processo, é essencial que não se
formem cristais de gelo no interior das células. O processo de congelamento-
descongelamento é potencialmente prejudicial para a viabilidade celular, pois
durante o congelamento convencional a água precipita-se na forma de gelo e,
muitas vezes, leva a danos teciduais no citoplasma, influenciando o
citoesqueleto e até mesmo estruturas relacionadas ao genoma (MARTIN et al.,
2004).
A viabilidade das células submetidas ao processo de criopreservação
depende basicamente de sua capacidade de resistir a dois tipos de lesões: a
desidratação e o dano mecânico decorrente da formação de cristais de gelo no
seu interior (MAZUR, 1963). Esses dois tipos de lesões estão relacionados à
velocidade com que a suspensão celular é congelada: a primeira, em baixas
velocidades, enquanto a segunda, em altas velocidades. Portanto, o processo
de congelamento ideal deve evitar a formação de cristais de gelo no interior
das células, a fim de evitar lesões celulares, devendo-se aplicar uma
velocidade de congelamento ideal e controlada. Este processo deve levar em
consideração o tipo celular em questão, como também, o uso de agentes
crioprotetores que minimizem a formação de cristais de gelo e diminuam a
intensidade da desidratação celular (HUBEL, 1997; DE SANTIS, PRATA,
2009).
Mesmo com o controle da temperatura, podem ocorrer danos celulares
no processo de criopreservação. Esses danos podem ser explicados por três
fatores principais: o dano osmótico devido ao influxo e efluxo de água durante a
25
adição e remoção de agentes crioprotetores (por exemplo, Dimetilsulfóxido -
Me2SO4); o dano mecânico, devido à formação de cristais de gelo intracelular;
e os efeitos dos solutos, geralmente descritos como danos químicos que
ocorrem devido a um aumento na concentração intracelular de íons como
consequência do congelamento. O grau dos danos causados por esses fatores
varia de acordo com a concentração dos agentes crioprotetores, da forma de
resfriamento e do perfil de aquecimento (KASHUBA BENSON, BENSON,
CRITSER, 2008).
O dimetilsulfóxido (DMSO) é o crioprotetor mais usado para a
criopreservação de células, em concentrações entre 5 e 10%, e atua reduzindo
ou neutralizando a formação de cristais de gelo intracelular e reduzindo
também a osmolaridade das membranas celulares. No entanto, o próprio
crioprotetor é tóxico para as células, podendo causar danos celulares de
acordo com a sua concentração (TEMMERMAN et al., 2008).
A fim de aperfeiçoar os protocolos de criopreservação, WOODS et al.
(2009) verificaram em seus estudos que o agente crioprotetor DMSO nas
concentrações de 0,5 M, 1,0 M e 1,5 M produziram melhores resultados em
relação a viabilidade celular do que os crioprotetores Propilenoglicol (PG) e
Etileno Glicol (EG), nas mesmas concentrações indicadas. O presente estudo
ainda demonstrou que é melhor criopreservar o extrato tecidual do que as
células já submetidas ao processo de digestão enzimática prévia em 10% de
DMSO, pois se acredita que o tecido submetido à digestão enzimática antes da
criopreservação sofre certo grau de comprometimento primário na estrutura da
membrana celular, além do potencial estresse sofrido por essa membrana, pelo
agente crioprotetor.
OH et al. (2005) verificaram que a criopreservação parece não exercer
influência negativa sobre a viabilidade e a capacidade de diferenciação de
fibroblastos do ligamento periodontal quando combinada com uma taxa de
congelamento controlada. O uso do DMSO garantiu a sobrevivência da maioria
das células periodontais. Nesse estudo, análise imuno-histoquímica para a
atividade da fosfatase alcalina foi utilizada para avaliar a capacidade de
diferenciação dessas células após congelamento e descongelamento. Como
26
resultado, tanto no grupo controle quanto no grupo experimental
(criopreservado), foi possível observar positividade celular de mesma
intensidade para a fosfatase alcalina, não havendo, portanto, divergências
significativas entre os dois grupos estudados.
Outro estudo, também realizado em fibroblastos do ligamento
periodontal obtidos a partir de terceiros molares humanos, avaliou o efeito de
um protocolo de criopreservação com decréscimo controlado da temperatura
de congelamento (TEMMERMAN et al., 2008). Os resultados mostraram que a
integridade da membrana, a capacidade de proliferação celular e a expressão
de fosfatase alcalina não foram influenciados pela criopreservação. Não houve
diferença estatisticamente significante entre as células criopreservadas (grupo
experimental) e as não-criopreservadas (grupo controle).
BRUDER, JAISWAL, HAYNESWORTH (1997), utilizando células-tronco
mesenquimais derivadas da medula óssea humana, compararam células que
foram submetidas à criopreservação com células não-criopreservadas e
descobriram que estas células poderiam ser descongeladas e cultivadas por
várias passagens, sem nenhuma influência perceptível em suas características
biológicas.
Em estudo para verificar se as células-tronco de polpa dentária de ratos
e sua linhagem de osteoblastos, diferenciados em cultura in vitro, mantinham
suas propriedades morfofuncionais e de diferenciação após serem
criopreservadas por um período de dois anos, PAPACCIO et al. (2006)
observaram que as células-tronco descongeladas voltaram a formar colônias
aderentes após 12 horas de cultivo e recomeçaram a proliferar após 48 horas.
Esses resultados fornecem evidências de que essas células podem ser
facilmente criopreservadas e recuperadas, revelando ainda que não houve
nenhuma diferença significativa na proliferação entre as células mantidas a
uma temperatura convencional e as criopreservadas.
Utilizando células-tronco isoladas a partir da polpa dentária de terceiros
molares humanos, ZHANG et al. (2006) demonstraram que a criopreservação
dessas células em nitrogênio líquido, por um período de 30 dias, não alterou a
sua capacidade de diferenciação celular. Após o período de criopreservação,
27
todas as culturas de células da polpa dentária foram recuperadas e cultivadas
em meios indutores de diferenciação neurogênica, osteogênica/odontogênica,
adipogênica, miogênica e condrogênica. Os resultados mostraram que sob a
influência destes cinco diferentes meios, as células submetidas à
criopreservação mantiveram o potencial de proliferação e diferenciação.
Com o objetivo de avaliar a capacidade multipotencial e proliferativa das
células-tronco derivadas de tecido adiposo humano criopreservadas, GONDA
et al. (2008) mantiveram essas células em baixas temperaturas (-196ºC) por 6
meses. Após esse período, observaram que o grupo de células
criopreservadas demonstrou potencial de proliferação e diferenciação
osteogênica, adipogênica e condrogênica, semelhante ao grupo de células não
criopreservadas. Uma diferença destacada pelos autores foi a maior
variabilidade no potencial de diferenciação condrogênica para as células
criopreservadas.
DING et al (2010) avaliaram o efeito da criopreservação em células
mesenquimais indiferenciadas da papila apical de terceiros molares humanos
sob a taxa de proliferação celular, na eficiência de formação de colônias, no
potencial de diferenciação celular, na expressão de marcadores de superfície
de CTM, na cariotipagem e em ensaios imunológicos. Este estudo demonstrou
que as propriedades biológicas e imunológicas das células mesenquimais
indiferenciadas da papila apical criopreservadas não foram afetadas, apoiando
a viabilidade destas células quando submetidas à criopreservação em
nitrogênio líquido.
TEMMERMAN et al. (2010) avaliaram a viabilidade in vitro de tecidos
pulpares humanos isolados de terceiros molares após serem submetidos à um
processo de criopreservação. Em seus experimentos, não foi demonstrado
diferença significativa na capacidade de crescimento entre os fibroblastos
criopreservados e não criopreservados isolados dos tecidos pulpares. Assim, a
viabilidade do tecido pulpar isolado pode ser mantida durante a
criopreservação, desde que os procedimentos padrões sejam utilizados – por
exemplo, o uso de um agente crioprotetor e o controle da temperatura de
congelamento.
28
VASCONCELOS et al. (2012), estudando o efeito de um protocolo de
criopreservação com controle de temperatura (2h, a 4oC, 18h a -20ºC e
armazenamento a 80°C negativos), durante um período de 30 dias, em células
mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal humano, observaram
que não houve diferença significativa entre as células criopreservadas e não
criopreservadas em relação à capacidade proliferativa dessas células. Desse
modo, o protocolo utilzado não exerceu influência negativa no crescimento in
vitro do tipo celular estudado.
Um novo protocolo de criopreservação vem sendo aplicado em bancos
de dentes. A criopreservação a partir de freezer programando com um campo
magnético ainda é uma técnica recente e com um custo mais elevado, mas
com resultados bastante satisfatórios no momento da implantação do dente,
sugerindo uma criopreservação de qualidade das células do ligamento
periodontal (KAKU et al., 2010). LEE et al. (2012), objetivando avaliar o uso
desse método de criopreservação em células-tronco da polpa dentária,
submeteram essas células ao congelamento convencional (slowfreezing) e ao
congelamento magnético. Foi avaliado, após o descongelamento das células, a
viabilidade, a adesão e a proliferação celular, como também a expressão de
marcadores para CTM, a capacidade de diferenciação e a estabilidade do
DNA. Os resultados indicaram que as células submetidas ao congelamento
magnético tiveram uma melhor adesão e proliferação celular quando
comparado as células congeladas convencionalmente. Em relação ao potecial
de diferenciação adipogênica, não houve diferença em relação aos grupos; já
quando as células foram submetidas a diferenciação osteogênica, o grupo
congelado magneticamente respondeu melhor a indução em relação ao grupo
convencional. Por fim, ao avaliar a estabilidade do DNA a partir do teste
cometa, não foi observada uma cauda longa em nenhum dos grupos, indicando
que os protocolos não causaram danos ao DNA.
29
3 OBJETIVO
3.1 Objetivo geral
O presente estudo teve como objetivo avaliar, através de
experimentos in vitro, a influência de um protocolo de
criopreservação, após 30 dias, na atividade biológica das células-
tronco da polpa de dente decíduo humano esfoliado (SHED).
3.2 Objetivos específicos
Avaliar a influência do protocolo de criopreservação proposto na
viabilidade e na capacidade de proliferação das SHEDs, durante os
intervalos de 24, 48 e 72 horas;
Identificar a possível presença de danos morfológicos nucleares nas
células submetidas ao protocolo de criopreservação proposto.
30
4 METODOLOGIA
4.1 Implicações Éticas
O presente trabalho foi aprovado pelo comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP/UFRN – parecer nº
232/2011) (Anexo I). Todos os responsáveis pelos voluntários da pesquisa
receberam um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo II),
explicando a realização do estudo, os objetivos, os riscos e os benefícios aos
quais estariam expostos, de acordo com as Diretrizes e Normas
Regulamentadoras do Conselho Nacional de Saúde (Resolução n° 196/96).
4.2 Tipo de Estudo
Estudo experimental in vitro.
4.3 Amostra
Foram utilizados no experimento 3 (três) dentes decíduos em estágio
final de esfoliação ou com exodontia indicada, obtidos de crianças com idade
entre 06 e 12 anos, para a obtenção das SHEDs. Os dentes foram coletados
após a assinatura do TCLE por parte dos respectivos responsáveis.
4.3.1 Critérios de inclusão e exclusão da amostra
Foram incluídas na amostra polpas dentárias de pacientes de ambos os
sexos, independente de raça, com idade entre 06 e 12 anos, com bom estado
de saúde sistêmica e bucal, apresentando dentes decíduos com mobilidade e
com diagnóstico radiográfico de rizólise dos terços apical e médio da raiz e que
desejaram contribuir para o estudo (com autorização do responsável) doando
os dentes extraídos através da assinatura do TCLE.
31
Foram excluídas do estudo as polpas dentárias de paciente que
apresentaram alguma alteração sistêmica ou local (ex: gengivite severa,
abscessos, infecção fúngica, bacteriana).
4.4 Local
A extração dos dentes e o seu processamento inicial (acondicionamento
em meio de cultura apropriado após as exodontias) foram executados na
Clínica de Odontopediatria do Departamento de Odontologia da UFRN. O
estudo experimental foi conduzido no laboratório de cultura de células do
Departamento de Bioquímica da UFRN.
4.5 Delineamento do Estudo
Nos experimentos foram utilizadas células extraídas de polpas dentárias
de três dentes decíduos, divididas em dois grupos:
Grupo I (controle): cultivo imediato das SHEDs.
Grupo II: criopreservação, durante 30 dias, das SHEDs para posterior
cultivo de maneira semelhante ao grupo I.
As células dos dois grupos foram utilizadas em experimentos para
avaliar a capacidade proliferativa e identificar eventos relacionados ao ciclo
celular, à morte celular e à integridade nuclear como mostra a figura 1.
32
Figura 1. Desenho experimental. P35 – placa com 35 mm de diâmetro; P1 – primeiro
subcultivo; P2 – segundo subcultivo; P3 – terceiro subcultivo; P4 – quarto subcultivo.
4.6 Obtenção das SHEDs
4.6.1 Obtenção e processamento dos dentes
Após a exodontia, cada dente foi imediatamente mantido em tubo tipo
Falcon de 15mL contendo 5mL de meio alfa-MEM. Os tubos foram mantidos
em condição hipotérmica (em isopor contendo gelo), para serem transportados
ao laboratório de cultura de células do Departamento de Bioquímica do Centro
de Biociências da UFRN, onde foram adequadamente processados.
Em câmara de fluxo laminar, os dentes foram submetidos a três
lavagens de 10 minutos cada, com uma solução contendo meio alfa-MEM
enriquecido com 10.000 U.I./mL de Penicilina, 10.000 µg/mL de Estreptomicina,
100 mg/mL de Gentamicina e 250 µg/mL de Anfotericina B, objetivando
eliminar possível contaminação. Depois de processados, os dentes estavam
aptos para a obtenção e cultivo das SHEDs.
4.6.2 Extração das células pulpares
O tecido pulpar foi cuidadosamente retirado por curetagem (Figura 2) e,
em seguida, o extrato foi submetido à digestão enzimática com 3 mg/mL de
33
colagenase I (Gibco,USA) e 4mg/mL de dispase (Gibco, USA), por 1 hora a
37°C. Em seguida a solução foi aspirada e processada em filtro de 70 µm (BD
Falcon, USA); a suspensão foi centrifugada a 1200 rpm durante 8 minutos e o
sobrenadante retirado. As células precipitadas foram então ressuspensas e
cultivadas em placas de Petri de 35 mm de diâmetro (TTP®, USA), contendo
meio básico α-MEM (Cultilab, Brasil) suplementado com 15% de soro fetal
bovino – SFB (Cultilab, Brasil). As culturas foram mantidas a 37ºC em 5% de
CO2 até atingirem 70 – 90% de confluência, com troca de meio a cada três
dias.
Figura 2. Remoção do tecido pulpar.
4.6.3 Confirmação da multipotencialidade celular
Com o objetivo de caracterizar as células pulpares como células-tronco
multipotentes, uma alíquota de células foi cultivada, em P1, em meios de
diferenciação osteogênico e adipogênico (StemPro® Differentiation Kits,
InvitrogenCorp., Carlsbad, CA, USA) por até 21 dias. Após este período, as
células foram analisadas em microscopia de luz e exibiram características
morfológicas de células osteoblásticas (deposição de matriz mineralizada) e de
adipócitos (vacúolos de lipídeos no citoplasma), comprovando a natureza
multipotencial dessas células.
4.7 Criopreservação das SHEDs
Na segunda passagem (P2), uma alíquota de 1 x 106 células de cada
dente passou pelo processo de criopreservação. As SHEDs foram imersas em
soro fetal bovino com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) em criofrascos de 2 mL
34
e submetidas ao seguinte protocolo de criopreservação: 2 horas à 4º C, 18
horas à -20ºC, e então mantidas à 80ºC negativos. Essas células foram
mantidas criopreservadas por um período de 30 dias, e, após esse período, as
mesmas foram descongeladas para seguir com o protocolo de cultivo celular
semelhante ao grupo I.
Os criofrascos contendo as SHEDs foram descongelados através do
contato imediato em água a 37°C em banho-maria. As células obtidas foram
cuidadosamente lavadas para remover todo o crioprotetor e em seguida foram
centrifugadas a 1200 rpm por 8 minutos; o sobrenadante foi aspirado e as
células ressuspendidas em meio de cultura e cultivadas.
4.8 Análise da proliferação celular
Na terceira passagem (P3), as SHEDs de cada grupo foram cultivadas em
placas de 24 poços, na densidade de 3 x 104 células/poço. Para análise da
proliferação celular e obtenção da curva de crescimento nos diferentes grupos
foram utilizados os dados obtidos das contagens de células aderidas às
superfícies plásticas de quatro poços de cultivo celular (n=4), para cada polpa
obtida, nos intervalos de 24, 48 e 72 horas após o plaqueamento.
Para isso, o meio foi removido dos poços e as células lavadas com PBS.
Em seguida foi adicionado aos poços 500 µL de tripsina/EDTA (Gibco, USA)
por 5 minutos. A suspensão celular foi colocada em tubo cônico tipo falcon com
o mesmo volume de meio α-MEM com o objetivo de inativar a tripsina. A
suspensão foi centrifugada a 1200 rpm durante 8 minutos, sobrenadante
retirado e as células ressuspensas em 1 mL de meio. Uma alíquota dessa
suspensão foi separada para a contagem celular.
O número de células colhidas de cada poço foi obtido pela contagem de
células viáveis através do uso de hemocitômetro e do corante azul de tripan,
obedecendo-se a seguinte equação matemática:
Número de células viáveis contadas x diluição x 104
Número de quadrantes usados para contagem
35
O percentual de viabilidade da população celular foi obtido através do
seguinte cálculo:
Número de células viáveis x 100 Número total de células contadas
Para controlar possíveis vieses de aferição que poderiam acontecer,
apenas um pesquisador realizou a contagem celular em todos os intervalos de
tempo, em ambos os grupos.
4.9 Avaliação da viabilidade e morte celular por Anexina V-FITC/ Iodeto de
Propídeo
Para avaliar os efeitos do protocolo de criopreservação utilizado sobre a
morte celular, foi utilizado o kit FITC/Annexin V Dead Cell Apoptosis Kit with
FITC Annexin and PI, for Flow Cytometry (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA,
USA). O marcador anexina V-FITC permite detectar os estágios iniciais de
apoptose devido ao fato de se ligar preferencialmente a fosfolipídios
negativamente carregados (fosfatidilserina) expostos no início do processo
apoptótico, enquanto o iodeto de propídeo (PI) permite avaliar os momentos
finais deste processo de morte celular, por ser um marcador que interage com
o DNA, mas não é capaz de atravessar a membrana plasmática, devido ao seu
alto peso molecular. Assim, a marcação positiva para PI indica que há poros na
membrana, fenômeno característico de processos de necrose ou estágio final
de apoptose.
Para isso, as células foram cultivadas em triplicata, em placas de 6
poços na densidade de 2 x 105 células/poço. Após 24 e 72 horas de cultivo, as
células foram tripsinizadas, coletadas e lavadas com tampão PBS gelado. O
sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em 200 µL de
Binding Buffer 1X. Foi adicionado 3 µL de Annexin V – FITC e 1 µL da solução
de PI a 100 µg/mL. As células foram incubadas por 15 minutos em temperatura
ambiente e mantidas sob proteção de luz. Após o período de incubação, foram
adicionados 400 µL de tampão de ligação para anexina V 1X e as células foram
36
analisadas em citômetro de fluxo, medindo a emissão de fluorescência a 530
nm e 575 nm. A população foi separada em três grupos: células viáveis (baixos
níveis de fluorescência), células apoptóticas (fluorescência verde) e células em
necrose (fluorescência em verde e vermelho). Os dados foram analisados a
partir do software FlowJo v. 7.6.3 (Tree Star, Inc.).
4.10 Análise do Ciclo Celular
Para a avaliação dos efeitos do protocolo de criopreservação sobre o
ciclo celular, os tubos de citometria utilizados no ensaio anterior foram
reutilizados. Após a análise com Anexina V-FITC/ PI, as células foram lavadas
com tampão PBS gelado e o sobrenadante descartado. O pellet com as células
foi então incubado com paraformaldeído 2% por 30 minutos, lavado com PBS
gelado e permeabilizado com saponina 0,01% por 15 minutos. Após este
procedimento, as células foram incubadas com 10 µL de RNAse (4 mg/mL) a
37ºC por 30 minutos. Foram adicionados 5 µL de Iodeto de Propídeo (25
mg/mL), juntamente com 200 µL de PBS gelado às células e levadas ao
citômetro de fluxo para análise do ciclo celular (585/42 nm). Para análise dos
dados, o software FlowJo v. 7.6.3 (Tree Star, Inc.) foi utilizado.
4.11 Análise de danos morfológicas nucleares
Mudanças na morfologia celular indicativas de apoptose (condensação
de cromatina e fragmentação nuclear) foram avaliadas utilizando o corante
DAPI (4’,6’-diamidino-2-fenilindol).
As SHEDs foram cultivadas em lamínulas circulares de 13 mm em uma
placa de 24 poços, na densidade de 3 x 104 células/poço. Após 72 horas de
cultivo, as células foram lavadas com tampão fosfato gelado (PBS), fixadas
com 4% de paraformaldeído por 20 minutos e permeabilizadas em Triton X-100
0,1% por cerca de 20 minutos. Posteriormente, as células foram lavadas
novamente com PBS e incubadas com DAPI na concentração de 1 µg/mL por
30 minutos, protegidas da luz, em temperatura ambiente. Após a incubação
37
com o DAPI, as células foram colocadas sobre lâminas e mantidas em
Fluoromount-G/PBS na proporção de 2:1 v/v, com intuito de preservar a
morfologia das células. As células foram visualizadas por microscopia de
fluorescência utilizando o filtro de fluorescência 330-380 nm. O experimento foi
realizado em duplicata.
4.12 Análise estatística
Para o estudo da proliferação in vitro, cada dado das contagens
corresponde à média dos 12 poços de cultura em cada intervalo de tempo,
para cada grupo experimental. Já nos experimentos que identificam eventos
relacionados ao ciclo e à morte celular, cada dado corresponde a média dos 9
poços de cultura em cada intervalo de tempo, para cada grupo experimental.
Tais médias foram submetidas à análise não paramétrica. A diferença
entre os grupos para cada um dos tempos estudados (24, 48 e 72 horas) foi
analisada pelo teste estatístico de Mann-Whitney, considerando-se um nível de
significância de 5% (p<0,05).
38
5 RESULTADOS
5.1 Proliferação e viabilidade celular
O potencial proliferativo das células-tronco da polpa de dentes decíduos
(SHED) foi avaliado através da construção de curvas de proliferação, utilizando
o azul de tripan. Ainda utilizando o azul de tripan foi possível avaliar a
viabilidade das SHEDs submetidas ou não ao protocolo de criopreservação
proposto.
A curva de crescimento das SHEDs nos diferentes grupos estudados
(não-criopreservado e criopreservado) é ilustrada na figura 3. Ambos os grupos
apresentaram um aumento no número de células no decorrer do experimento,
sendo o grupo não submetido ao protocolo de criopreservação, aquele que
exibiu maior índice proliferativo, a partir do intervalo de 48 horas.
Figura 3. Curva de crescimento das SHEDs submetidas ou não à criopreservação durante os
intervalos de tempo analisados.
Comparando-se a media dos grupos estudados, observa-se que, apesar
de não haver diferenças estatisticamente significativas em nenhum dos
intervalos de tempo estudados (p>0,05), o grupo não-criopreservado mostrou
uma tendência a proliferar mais evidente do que no grupo submetido ao
protocolo de criopreservação, nas ultimas 24 horas do experimento (Tabela 1).
0
2
4
6
8
10
12
T24 T48 T72
Nº
de c
élu
las
(x10
4)
Não-crio
Crio
39
Tabela 1. Análise do crescimento das SHEDs em cada intervalo de tempo nos diferentes
grupos estudados.
DP = desvio-padrão.
*Mann-Whitney
A tabela 2 mostra que o percentual de viabilidade das SHEDs não sofreu
alterações significativas durante o experimento, independente do grupo
analisado.
Tabela 2. Percentual de viabilidade das SHEDs nos grupos estudados, nos diferentes
intervalos de tempo.
VIABILIDADE (%)
T24 T48 T72
Não-crio 100 100 97,7
Crio 98,8 99,4 99,4
5.2 Efeitos do protocolo de criopreservação sobre a viabilidade e morte
celular por Anexina V-FITC/ Iodeto de Propídeo
A partir dos dot-plots obtidos na citometria é possível observar que tanto
no intervalo de 24 horas, quanto no de 72 horas, as células de ambos os
grupos representavam 99% de células viáveis (figura 4). Por esta razão, as
células não tiveram marcação positiva nem para a Anexina V, nem para o
Iodeto de Propídeo (PI) já que ambos são marcadores de morte celular.
Não-crio Crio
p* Média ± DP Média ± DP
T24 2,5 ± 0,1 2,5 ± 0,1 0,7950
T48 5,2 ± 1,2 4,8 ± 0,6 0,4747
T72 10,0 ± 2,1 7,1 ± 1,2 0,0690
40
Figura 4. Imunomarcação das SHEDs com Anexina V/PI. Q1:Anexina V negativo/PI positivo;
Q2: Anexina V/PI positivos; Q3:Anexina V positivo/PI negativo; Q4: Anexina V/PI negativos. (A)
Grupo não-criopreservado, intervalo de 24 horas; (B) Grupo criopreservado, intervalo de 24
horas; (C) Grupo não-criopreservado, intervalo de 72 horas; (D) Grupo criopreservado, intervalo
de 72 horas.
5.3 Efeitos do protocolo de criopreservação sobre o ciclo celular
A análise do ciclo celular para as SHEDs nos diferentes grupos e
intervalos de tempo encontra-se representada na figura 5, que ilustra a
porcentagem de células em cada fase do ciclo.
(A)
(C)
(B)
(D)
PerC
P-C
y5-5
-A
PerC
P-C
y5-5
-A
FITC-A
PerC
P-C
y5-5
-A
PerC
P-C
y5-5
-A
FITC-A
FITC-A FITC-A
41
Figura 5. Distribuição das SHEDs nas fases do ciclo celular para os diferentes grupos
estudados, nos intervalos de tempo analisados. Os valores da porcentagem de cada fase do
ciclo representam as medias de 3 triplicatas.
Como demonstrado na tabela 3, 24 horas após o plaqueamento, ambos
os grupos experimentais estavam com a porcentagem de células em G0/G1
praticamente idênticas; já na fase S e G2/M, o grupo de células
criopreservadas apresentou, respectivamente, um percentual menor e maior de
células nestas fases, porém sem diferença estatística significante quando
comparado ao controle (não-criopreservado) (p>0,05). No intervalo de 48 horas
(T48), o percentual de células em S aumentou em ambos os grupos
demonstrando que as células estavam em fase de duplicação de material
genético, ou seja, proliferando. Por fim, no último intervalo de tempo analisado
foi possível observar diferença estatisticamente significante na fase G0/G1
(p=0,0270). No grupo controle, aproximadamente 65% das células estavam
distribuídas nas fases S e G2/M, enquanto no grupo onde as SHEDs tinham
G0/G1
S
G2/M
42
sido submetidas ao protocolo de criopreservação proposto apenas cerca de
50% das células se encontravam nestas fases.
Tabela 3. Distribuição percentual das células em cada fase do ciclo celular nos diferentes
grupos estudados, em cada intervalo de tempo.
Não-crio Crio
p* Média ± DP Média ± DP
G0/G1 46,2 ± 8,4 44,9 ± 10,4 >0,999
24 horas S 40,8 ± 12,8 35,3 ± 15,1 0,5714
G2/M 13,1 ± 8,6 19,8 ± 8,0 0,1626
G0/G1 43,1 ± 6,7 45,0 ± 8,0 0,9648
48 horas S 51,4 ± 3,0 49,1 ± 6,4 0,5187
G2/M 5,4 ± 3,9 5,9 ± 6,1 0,6088
G0/G1 37,5 ± 13,5 50,4 ± 4,2 0,0270
72 horas S 44,2 ± 15,4 37,2 ± 8,8 0,4470
G2/M 18,3 ± 21,2 12,4 ± 8,3 0,9517
DP = desvio-padrão
*Mann-Whitney; os números em negrito indicam diferença estatística (p<0.05).
De uma forma geral, a porcentagem de células na fase G0/G1 se
manteve constante durante todo o experimento em ambos os grupos e a
diferença do percentual de células distribuídas nas fases proliferativas do ciclo
entre os grupos, no último intervalo de tempo, confirma os resultados
encontrados utilizando o azul de tripan.
5.4 Efeitos do protocolo de criopreservação no núcleo celular
Na análise em microscopia de fluorescência não foram observadas
alterações morfológicas, como fragmentações nucleares e núcleos picnóticos,
tanto nas células do grupo controle (não-criopreservado) quanto no grupo
criopreservado (Figura 6).
43
Figura 6. Fotomicrografia das células-tronco da polpa de dente decíduo humano coradas com
DAPI, no intervalo de 72 horas. A – grupo não-criopreservado; B – grupo criopreservado
(Imunofluorescência, x40).
44
6 DISCUSSÃO
Os dentes decíduos humanos têm sido relatados na literatura como uma
fonte promissora para obtenção de células-tronco mesenquimais, que poderão
ser usadas para diversas aplicações clínicas, incluindo a engenharia de tecido
dentário (MIURA et al., 2003), reparo de defeitos ósseos (ZHENG et al., 2009)
e até mesmo no tratamento de lesões do tecido neural e doenças
degenerativas (HUANG, GRONTHOS, SHI, 2009; MORSEZECK et al., 2010),
por esta razão a importância de estudos mais avançados nesta área.
O potencial de aplicação clínico das células-tronco da polpa de dentes
decíduos (SHED) é atribuído principalmente ao seu isolamento simples e
conveniente e ainda à sua imunogenicidade insignificante – permitindo, assim,
seu uso em transplantes alogênicos sem a utilização de imunossupressores
(PIERDOMENICO et al., 2005; NOEL et al., 2007; HUANG, GRONTHOS, SHI,
2009). Por conseguinte, estas células são consideradas importantes para
criação de bancos celulares, o que requer a sua conservação por longos
períodos de tempo (ARORA, ARORA, MUNSHI, 2009; PETROVIC,
STEFANOVIC, 2009; SLOAN, WADDINGTON, 2009).
As técnicas de criopreservação vêm sendo amplamente investigadas,
com o intuito de proporcionar o armazenamento de células e tecidos a longo
prazo, minimizando os danos celulares, com a finalidade de disponibilizá-los
para uso posterior (XU et al., 2012). Neste sentido, tanto o procedimento de
criopreservação quanto o descongelamento das células-tronco mesenquimais
podem exercer importantes efeitos sobre a viabilidade e a capacidade de
proliferação e de diferenciação destas células (MAMIDI et al., 2012), o que
reforça a busca de protocolos simples, eficientes e seguros para a
criopreservação de cada tipo celular, através de experimentos como os
realizados no presente estudo.
Vários estudos têm demonstrado que células-tronco isoladas de dentes,
seja do ligamento periodontal, da polpa dental e/ou da papila apical, podem ser
criopreservadas com sucesso, mantendo a viabilidade após o processo de
descongelamento (TEMMERMAN et al., 2008; WOODS et al., 2009; DING et
45
al., 2010). No presente trabalho foi possível observar que as SHEDs
submetidas ao protocolo de criopreservação proposto não sofreram alteração
na capacidade proliferativa, nem na viabilidade, corroborando com o proposto
na literatura.
No presente estudo, a análise da proliferação celular nos grupos
estudados (células não-criopreservadas e criopreservadas) demonstrou uma
tendência à proliferação nos três intervalos de tempo (24, 48 e 72 horas),
confirmando que as SHEDs, quando submetidas ao protocolo de
criopreservação proposto, mantiveram sua capacidade proliferativa. Estes
resultados são concordantes com os encontrados na literatura (OH et al, 2005;
SEO et al., 2005; PERRY et al., 2008, TEMMERMAN et al., 2010; MA et al.,
2012; MAMIDI et al., 2012), indicando que o processo de congelamento e
descongelamento não exerce influências negativas sobre a proliferação de
células-tronco mesenquimais. De fato, a curva de proliferação do presente
estudo, obtida pelo método do azul de tripan, demonstra que o grupo não-
criopreservado exibiu uma média maior quando comparado ao grupo
criopreservado no último tempo experimental, porém sem diferença
estatisticamente significante. Este dado foi confirmado nos experimentos de
citometria de fluxo que avaliaram o ciclo celular, já que no intervalo de 72
horas, o percentual de células do grupo não-criopreservado que se
encontravam nas fases proliferativas do ciclo (S, G2/M) era superior ao do
grupo criopreservado. Observou-se que, apesar de não existirem diferenças
estatisticamente significativas entre os grupos, os resultados demonstraram
uma tendência de proliferação maior no grupo controle, a partir de 72 horas.
Em relação ao tempo de criopreservação adotado, os estudos
disponíveis na literatura relatam tempos distintos que variam desde um dia (24
horas) até intervalos maiores de tempo (PAPACCIO et al., 2006; GONDA et al.,
2008). O tempo de avaliação utilizado neste trabalho baseou-se em estudos
mais recentes, que avaliaram o processo de criopreservação após 30 dias
(WOODS et al., 2009, TEMMERMAN et al., 2010; VASCONCELOS et al.,
2012). Os resultados encontrados corroboram os destes últimos trabalhos, sem
diferenças significativas na proliferação e na capacidade de diferenciação
46
celular das células criopreservadas quando comparadas com as não
criopreservadas.
MA et al. (2012) observaram que SHEDs obtidas de tecidos pulpares
criopreservados por mais de 2 anos (25-30 meses) mantinham as
características de células-tronco como a capacidade de auto-renovação,
multipotêncialidade, capacidade de regenerar tecidos in vitro e efeito
imunomodulatório in vivo. É possível que o tempo em que as células
permanecem criopreservadas possa afetar a sua viabilidade, porém períodos
mais curtos como o utilizado neste estudo (30 dias) ou mais longos (25-30
meses) como o estudado por MA et al. (2012), demonstraram não serem
capazes de alterar a proliferação celular.
A maioria dos protocolos de criopreservação para as células-tronco
mesenquimais apresentado na literatura conserva as células em uma
temperatura de -196oC (nitrogênio líquido) (GONDA et al., 2008; MARTINELLO
et al., 2011; MIYAMOTO et al., 2012). Todavia, isso gera um alto custo de
manutenção e não está acessível a todos os laboratórios de pesquisa. No
presente estudo, utilizou-se um protocolo mais simples, mais acessível e de
baixo custo, mantendo as células a uma temperatura de -80oC e ainda assim
preservando a sua viabilidade.
WOODS et al. (2009) congelaram células-tronco da polpa de dentes
permanentes por 1 semana, 1 mês e 6 meses em temperaturas de -196ºC
(nitrogênio líquido) e -85ºC, e observaram que não houve diferença na taxa
proliferativa, nem na capacidade de diferenciação celular entre os grupos
estudados, em nenhum dos intervalos de tempo. Com isso, conclui-se que
células expandidas em cultura podem ser armazenadas a -80/-85ºC por pelo
menos seis meses e, provavelmente, por períodos de tempo maiores, sem
causar danos às células, fato também comprovado neste trabalho.
A criopreservação sucessiva de células-tronco mesenquimais da
medula óssea tem sido investigada por MAMIDI et al. (2012) a fim de
determinar se é prejudicial para o fenótipo da célula, bem como para a
capacidade de diferenciação desta célula. Para isso, CTMs de medula óssea
criopreservadas na terceira passagem foram descongeladas, expandidas até a
47
quarta passagem, criopreservadas novamente, descongeladas e expandidas
até a sexta passagem. Para o grupo controle, as células foram descongeladas
e mantidas em cultura sem passar pelos processos de congelamento e
descongelamento até a sexta passagem. A taxa de proliferação de ambos os
grupos (controle e experimental) e a expressão de marcadores de pluripotência
foram determinados e em ambas as condições de cultura, as CTMs exibiram
resultados semelhantes, demonstrando que a criopreservação sucessiva não
altera as características fundamentais destas células.
Entre os vários parâmetros relativos a criopreservação de células, os
agentes crioprotetores também podem afetar significativamente a taxa de
sobrevivência e o potencial de proliferação após o descongelamento. Optou-se
por utilizar o dimetilsulfóxido (DMSO) por este ser amplamente utilizado para a
criopreservação de diversos tipos celulares (PAPACCIO et al., 2006;
MARTINELLO et al., 2011). Como pôde ser visto neste trabalho, esse agente
forneceu resultados favoráveis em termos de viabilidade celular e capacidade
proliferativa após a criopreservação das SHEDs por um período de 30 dias.
O efeito da velocidade de diminuição da temperatura no congelamento
pode ser outro fator crucial para a viabilidade celular após a criopreservação e
deve ser determinada para cada célula específica, afim de evitar a formação de
cristais de gelo intracelular (HUBEL, 1997). Foi adotado neste estudo um
protocolo padrão para outros tipos celulares em cultura, como relatado por
VASCONCELOS et al. (2012): 2h a 4oC, 18h a -20ºC e armazenamento
posterior a -80°C durante um período de 30 dias, protocolo este que
demonstrou ser bastante efetivo para a manutenção da viabilidade das SHEDs
após o descongelamento.
XU et al. (2012), utilizando células-tronco mesenquimais humanas,
avaliaram os efeitos osmóticos e do choque térmico provocado pelos
procedimentos de criopreservação sobre a viabilidade e recuperação celular
pós-descongelamento. Os resultados demonstraram que houve um decréscimo
significativo na viabilidade das células quando utilizadas velocidades de
congelamento distintas (1, 5 e 10ºC/min), sendo a velocidade de 1ºC/min a
melhor para manter a morfologia e a integridade celular, como também, para
48
uma melhor recuperação das células após a criopreservação. Este fato
contribui para a escolha de uma protocolo com decréscimo gradual e lento da
temperatura de congelamento, como o utilizado neste trabalho.
THIRUMALA et al. (2005a e 2005b) estudando a criopreservação de
células estaminais de tecido adiposo, comentam principalmente sobre o efeito
físico que o processo de congelamento e descongelamento podem causar na
integridade destas células. A partir da marcação pelo DAPI, pode-se afirmar
que o protocolo de criopreservação utilizado no presente estudo manteve
íntegras as membranas nucleares, bem como a morfologia do núcleo.
Os resultados obtidos através da análise em citometria de fluxo para os
eventos relacionados a morte celular (apoptose e necrose) comprovam que a
maioria das células manteve-se viável após os 30 dias de criopreservação.
PAPACCIO et al. (2006) estudaram a influência da criopreservação de células-
tronco da polpa dental por períodos mais longos (dois anos) e não identificaram
morte celular por apoptose nas células submetidas à criopreservação, embora
um número de células tenha sofrido necrose em virtude da formação de gelo
intracelular. Este último fato não foi observado no presente estudo, já que não
foram identificadas células marcadas positivamente para o iodeto de propídeo
(PI). Este marcador interage com o DNA, mas não é capaz de atravessar a
membrana plasmática e, quando a marcação está presente, caracteriza
processos de necrose ou estagio final de apoptose.
Em geral, os resultados relacionados ao protocolo de criopreservação
utilizado no presente estudo demonstram que o mesmo pode ser utilizado
como uma ferramenta adequada para o armazenamento de células-tronco da
polpa de dentes decíduos humanos. Estudos futuros são necessários para
avaliar o potencial de diferenciação das células criopreservadas e ainda a
capacidade de integração destas células com biomaterias, permitindo o seu
uso posterior em experimentos in vivo, na busca por futuras aplicações clínicas
em terapias de regeneração tecidual.
49
7 CONCLUSÃO
O protocolo de criopreservação proposto é eficiente para o
armazenamento das células-tronco da polpa de dentes decíduos humanos
(SHED), tendo em vista a manutenção da taxa proliferativa e da viabilidade
celular, além da ausência de danos morfológicos nucleares, nos intervalos de
tempo analisados.
50
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57
ANEXO I – Aprovação do comitê de Ética em Pesquisa (CEP/UFRN)
58
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ANEXO II – Termo de consentimento livre e esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DESPORTO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Convidamos seu filho para participar da pesquisa sobre “Atividade
biológica de células-tronco da polpa de dentes decíduos humanos
submetidos â criopreservação”, que tem por objetivo estudar a influência do
congelamento no comportamento dessas células, o que pode no futuro
representar um avanço no tratamento de doenças e perdas ósseas.
A participação do seu filho não trará nenhum risco previsível ou
desconforto. Seu filho não será submetido a nenhum procedimento (extra) além
da extração do dente decíduo (de leite), porém você deve autorizar os
pesquisadores a examinarem os fragmentos teciduais do seu filho (dentes
removidos), que seriam tirados da boca dele e desprezados após a cirurgia. As
informações confidenciais serão guardadas em local seguro e somente usadas
com o propósito científico, sem divulgação do nome do seu filho.
A participação do seu filho é voluntária, caso queira, você poderá
desistir a qualquer momento, sem que isso lhe traga prejuízo ou penalidade,
basta que retire o seu consentimento em participar.
A pesquisa deverá contribuir para o aumento do conhecimento na área
do tratamento de doenças usando células-tronco para recuperar a função de
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tecidos danificados. Portanto, a importância dessa pesquisa está na
necessidade de um melhor entendimento da funcionalidade das células do
dente de leite depois de congeladas, para facilitar na escolha de tratamentos
mais eficientes, que podem trazer benefícios para a sociedade de um modo
geral.
Você não terá nenhum gasto financeiro por qualquer procedimento
executado por essa pesquisa e terá direito a reembolso (ressarcimento) de
qualquer gasto comprovadamente que você tenha feito para a realização desse
estudo, bem como será indenizado em caso de dano comprovadamente
ocorrido pela participação de seu filho na mesma.
Você receberá uma cópia desse termo no seu endereço via correio com
aviso de recebimento e qualquer dúvida a respeito da pesquisa poderá
perguntar a Carlos Augusto Galvão Barboza, no Camus Universitário S/N no
Departamento de Morfologia do Centro de Biociências da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, Lagoa Nova, Natal/RN fone (84) 3215-3431 E-mail:
Consentimento Livre e Esclarecido
Declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será
realizada, os riscos e benefícios envolvidos e concordo em autorizar a
participação do meu filho voluntariamente na pesquisa “Atividade biológica
de células-tronco da polpa de dentes decíduos humanos submetidos â
criopreservação”.
Assinatura ou impressão
Digital do participante: _____________________________ Data:___/___/___
Assinatura do responsável:___________________________Data:___/___/___
Assinatura do pesquisador: __________________________ Data:___/___/___
Quanto à ética dessa pesquisa poderá ser questionada ao Comitê de
Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pelo
telefone 3215-3135.