atividade anti-inflamatÓria intestinal do extrato …

MARIANE CAROLINE MEURER

ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA INTESTINAL DO

EXTRATO SECO DE Tagetes erecta L. EM MODELO DE

COLITE ULCERATIVA INDUZIDA POR DEXTRAN

SULFATO DE SÓDIO (DSS) EM CAMUNDONGOS

Itajaí (SC)

2018

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

MARIANE CAROLINE MEURER





Dissertação submetida à Universidade do

Vale do Itajaí como parte dos requisitos

para a obtenção do grau de Mestre em

Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Prof.ª Drª. Luísa Mota da

Silva.

Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de

Andrade.

Itajaí (SC)

Julho de 2018

“Dedico esse trabalho à minha família,

que nunca mediu esforços para que

todos os meus sonhos se tornassem

realidade.”

“Entregue o seu caminho ao Senhor,

confie nele e Ele agirá.” Salmos 37:5.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por estar em todos os momentos ao meu lado me mostrando os

caminhos corretos, me levantando em cada tropeço e me dando forças para

seguir sempre em frente.

Aos meus pais, Rosane e Vilmar, que sempre foram dedicados e

companheiros em todas as etapas dessa longa caminhada até aqui. Por todas

as palavras de incentivo, por sempre apoiarem meus sonhos. Obrigada por

acreditarem em mim. Obrigada por toda proteção e amor dedicados a mim.

À minha irmã, por ser amiga e companheira durante essa caminhada. Por

me ajudar a enxergar as coisas de outras formas e por todo amor e carinho

dedicados a mim.

Ao meu namorado, Kalil Mussi, por toda paciência nos incontáveis finais de

semana nos quais precisava me dedicar ao desenvolvimento deste trabalho.

Obrigada por todo amor, carinho, pelos sonhos compartilhados e palavras

de incentivo ao longo dessa caminhada.

À minha família, que mesmo longe sempre tiveram uma palavra de

incentivo e carinho.

À minha orientadora, Profª Luísa Mota da Silva, que acreditou em mim

desde o início e que mesmo entre troca de projeto, de orientador e correrias

sempre transmitia paciência e pedia para que eu confiasse nela, que tudo

daria certo. E deu mesmo, prof! Você tinha razão! Obrigada por todos os

ensinamentos, por todos os puxões de orelha, por toda a paciência e carinho

dedicados a mim.

Ao meu co-orientador, Sérgio Faloni de Andrade, que aceitou me orientar

no início, acreditando em meu potencial e depois me entregou nas ótimas

mãos da profª Luísa. Obrigada por acreditar em mim, prof Sérgio. Obrigada

pelos ensinamentos durante o pouco tempo que estivemos juntos.

Agradeço a doutoranda Luísa Nathália Bolda Mariano, que com toda

paciência do mundo me ensinou tudo, sem medir esforços. Cuidou dos

animais para mim nos dias em que eu não estava presente, dividiu muitas

risadas no laboratório. Obrigada.

À doutoranda Thaise Boeing, que realizou os experimentos com células

para enriquecer ainda mais essa pesquisa e por toda ajuda dedicada no

laboratório, nas análises, e na interpretação dos resultados. Obrigada.

À mestranda, Mariéli Mees, por toda parceria nesses quase dois anos. Por

todas as risadas, confidências e piadas, por toda palavra de apoio e força.

Obrigada por sua amizade.

Ao professor, Luiz Carlos Klein Junior, que realizou a análise química do

extrato e por todo conhecimento dividido nas aulas de Análise fitoquímica.

Ao grupo de Gastro/Cardio, por me acolherem, me ensinarem e me

ajudarem a realizar esse trabalho. Sem vocês não teria sido possível.

Obrigada, de coração.

Aos técnicos dos laboratórios de Farmacologia in vitro, Farmacologia in

vivo e Fitoquímica. Muito obrigada por todo apoio.

À banca, Tania Mari Bellé Bresolin, Márcia Maria de Souza e Geisson

Marcos Nardi, por todas as contribuições para melhorar ainda mais o meu

trabalho.

Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas pela

oportunidade e estrutura para desenvolver as pesquisas em pról da ciência.

À CAPES pelo auxílio financeiro durante esse período.





Mariane Caroline Meurer

Agosto de 2018

Orientador: Profª. Drª. Luísa Mota da Silva

Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade

Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas

Número de Páginas: 152

Palavras-chave: Colite. Inflamação Intestinal. Intestino Grosso. Luteína.

Resumo: A Tagetes erecta, conhecida popularmente como Marigold,

calêndula africana ou cravo de defunto, é fonte de inúmeros corantes

naturais e outros produtos bioativos de bastante interesse. A infusão das

flores de T. erecta é popularmente utilizada para tratar doenças

gastrointestinais, incluindo estomatites, dispepsia, cólica e diarreia. As

Doenças Inflamatórias Intestinais (DII) são caracterizadas por inflamação

intestinal crônica em decorrência de uma resposta imunológica exacerbada.

A Colite Ulcerativa (CU) é uma doença inflamatória intestinal difusa, não

específica, de causa desconhecida que afeta continuamente a mucosa

colônica proximal do reto e muitas vezes forma úlceras. O tratamento atual

gera inconvenientes, como: baixo índice de remissão, efeitos adversos

apresentados pelo uso prolongado de anti-inflamatórios esteroidais, além do

custo associado à terapia, tornando evidente a necessidade de pesquisas por

novos tratamentos ou terapias para as DII. O presente estudo teve como

objetivo investigar o potencial do extrato seco de T. erecta, no modelo de

CU induzida por dextran sulfato de sódio (DSS) em camundongos.

Inicialmente, foi determinada a quantidade de luteína no extrato através de

espectroscopia por ressonância magnética nuclear e a quantidade de fenóis

totais. A atividade sequestradora de radicais livres foi realizada pelo método

de DPPH, a citotoxicidade em enterócitos murinos (linhagem IEC-6)

através de MTT, bem como os efeitos do extrato na produção de espécies

reativas de oxigênio (EROs) e óxido nítrico em células IEC-6 expostas ao

LPS foram quantificados in vitro. Nos testes in vivo, a CU foi induzida por

DSS a 5% na água dos camundongos, por 7 dias. Os animais foram tratados

com o extrato seco de T. erecta (ESTE) nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg

via oral. No 10° dia o cólon dos animais foi retirado para posterior análise

histológica (dano histológico e quantificação de mucinas), avaliação de

parâmetros bioquímicos (GSH, LOOH, SOD, CAT, GST, MPO, TNF- α,

IL-6 e proteínas). Em paralelo, os efeitos do extrato (300 mg/kg, v.o) no

trânsito intestinal e na diarreia induzida por óleo de rícino também foram

mensurados em camundongos. A concentração de luteína no ESTE foi de

8,2% e de fenóis totais de 239,3 ± 19,6 mg/g de extrato em termos de ácido

tânico. Entretanto, no teste de DPPH, o ESTE sequestrou o radical apenas a

1000 µg/ml. Nos testes in vitro, a incubação com ESTE não alterou a

viabilidade celular de células epiteliais intestinais murinas, porém reduziu

os níveis de EROs produzidas após estimulo por LPS. Nos ensaios in vivo, a

administração de ESTE (300 mg/kg) atenuou a perda de peso, o índice de

atividade da doença, o encurtamento do cólon e as alterações

histopatológicas promovidas pela CU. Em paralelo, a administração do

ESTE (300 mg/kg) aumentou a marcação para mucinas colônicas e

aumentou níveis de GSH e a atividade de CAT, normalizou os níveis de

SOD e GST, e reduziu os níveis de MPO, TNF e IL-6 no tecido colônico de

animais expostos ao DSS. Apesar da redução da diarreia em animais com

CU, a administração de ESTE (300 mg/kg) não alterou o trânsito intestinal

de camundongos saudáveis e não preveniu a diarreia induzida por óleo de

rícino. Em conclusão, os dados demonstram o potencial anti-inflamatório

intestinal do ESTE atribuído à luteína presente no extrato. Além disso,

ainda que pré-clinicamente, este estudo contribui para a validação do uso

deste extrato como suplemento nutricional para o tratamento adjuvante de

desordens inflamatórias intestinais.

Palavras-chave: Colite. Inflamação Intestinal. Intestino grosso. Luteína

INTESTINAL ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY OF DRIED

EXTRACT OF Tagetes erecta L. IN A MOUSE MODEL OF

DEXTRAN SODIUM SULFATE (DSS)-INDUCED COLITIS

Mariane Caroline Meurer

August 2018

Advisor: Dr. Luisa Mota da Silva

Co-advisor: Dr Sérgio Faloni de Andrade

Area of concentration: Natural products and bioactive synthetic compounds

Number of pages: 149

Keywords: Colitis. Inflammation Intestinal. Large Intestine. Lutein.

ABSTRACT: Tagetes erecta L, popularly known as Marigold, African

marigold or marigold, is a source of numerous natural dyes and other

bioactive products of considerable interest. The infusion of T. erecta flowers

is popularly used to treat gastrointestinal diseases, including stomatitis,

dyspepsia, stomachache and diarrhea. Inflammatory Bowel Diseases (IBD)

are characterized by chronic intestinal inflammation as a result of an

exacerbated immune response. Ulcerative Colitis (UC) is a non-specific

diffuse inflammatory bowel disease of unknown cause that continually

affects the proximal colonic mucosa of the rectum, often forming lesions

and/or ulcers. Current treatment shows some drawbacks, such as low

remission rates, adverse effects due to prolonged use of steroid anti-

inflammatory drugs, and the cost associated with the therapy, making the

need for research on new treatment options or adjunctive or complementary

therapies for IBD evident. The present study aimed to investigate the

potential of the dry extract of T.erecta in dextran sodium sulfate-induced

ulcerative colitis (DSS) in mice. The amount of lutein in the extract was

determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy, and total phenols,

radical scavenger capability, cytotoxicity and effects on reactive oxygen

species and nitric oxide production were evaluated in vitro. UC was induced

by DSS (a sulfated polysaccharide inducer of intestinal inflammation) at 5%

in the water served to mice for 7 days. The animals were treated with the

dry extract of T. erecta (DETE) at oral doses of 30, 100 and 300 mg/ kg. At

the tenth day, the colon of the animals was removed for histological analysis

(histological damage and quantification of mucins), and measurement of

biochemical parameters (GSH, LOOH, SOD, CAT, GST, MPO, TNF-α, IL-

6). Further, the effects of DETE (300 mg/kg, p.o) on intestinal transit and

diarrhea induced by castor oil in mice were also evaluated. Lutein

concentration in ESTE was 8.2%, with total phenols of 239,3 ± 19,6 mg/g.

However, ESTE sequestered the radical DPPH only at the highest

concentration (1000 µg/mL). In the in vitro trials, the incubation with DETE

did not alter the cell viability of murine intestinal epithelial cells, but

reduced the production of ROS stimulated by LPS. In the in vivo trials,

administration of DETE (300 mg/kg) attenuated weight loss, disease

activity index, colon shortening and histopathological changes promoted by

UC in mice. Concurrently, administration of DETE (300 mg / kg) increased

marking for colonic mucins and increased GSH levels and CAT activity,

regularized SOD and GST levels, and reduced levels of MPO, TNF and IL-

6 in the colonic tissue of animals exposed to DSS. Despite the reduction of

diarrhea in animals with UC, the administration of DETE (300 mg / kg) did

not alter the intestinal transit of healthy mice and did not reduce the diarrhea

induced by castor oil in mice. It can be concluded from the data that DETE

exhibits intestinal anti-inflammatory potential. The levels of lutein present

in the extract may justify such an effect. In addition, although still

preclinical, this study contributes to the validation of the use of this extract

as a nutritional supplement for the adjuvant treatment of inflammatory

bowel disorders.

Keywords: Colitis. Intestinal Inflammation. Large intestine. Lutein.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Localização anatômica de segmentos teciduais na cavidade

abdominal. ................................................................................................... 34 Figura 2 - Representação da organização celular do epitélio intestinal. .... 35 Figura 3 - Ação dos AGCC no sistema imunológico. ................................ 39 Figura 4 - Esquema representativo do envolvimento da microbiota

intestinal na homeostasia intestinal e nas DII. ............................................ 41 Figura 5 - Tagetes erecta L. ....................................................................... 65 Figura 6 – Estrutura química da luteína. .................................................... 66 Figura 7 – Danos causados por DSS no epitélio intestinal de camundongos.

.................................................................................................................... 72 Figura 8 – Desenho experimental do modelo de colite ulcerativa induzida

por DSS. ...................................................................................................... 81 Figura 9 – Efeito do ESTE nos níveis de radicais 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

(DPPH). ....................................................................................................... 90 Figura 10 – Efeito do ESTE na viabilidade celular em células IEC-6. ...... 91 Figura 11 – Efeito do ESTE (100 μg/ml) no dano celular em células IEC-6.

.................................................................................................................... 92 Figura 12 – Efeito do ESTE (100 μg/ml) nos níveis de nitrito em células

IEC-6. .......................................................................................................... 93 Figura 13 – Efeito do ESTE na evolução da perda de peso em

camundongos com colite ulcerativa induzida por DSS. .............................. 94 Figura 14 – Efeito do ESTE no IAD em camundongos com colite

ulcerativa induzida por DSS........................................................................ 95 Figura 15 – Efeitos do ESTE no comprimento do cólon de camundongos

com colite ulcerativa induzida por DSS. ..................................................... 96 Figura 16 – Efeito do ESTE no escore histológico associado a colite

ulcerativa induzida por DSS em camundongos. .......................................... 98 Figura 17 – Efeito do ESTE nos níveis de mucina do cólon de

camundongos com colite ulcerativa induzida por DSS. .............................. 99 Figura 18 – Efeito do ESTE nos níveis de MPO no cólon de camundongos

com colite ulcerativa induzida por DSS. ................................................... 101 Figura 19 – Efeito do ESTE nos níveis de TNF no cólon de camundongos

com colite ulcerativa induzida por DSS. ................................................... 102

Figura 20 – Efeito do ESTE sobre os níveis de IL-6 no cólon de

camundongos com colite ulcerativa induzida por DSS. ............................ 103 Figura 21 – Efeito do ESTE no trânsito intestinal de camundongos

saudáveis. .................................................................................................. 104 Figura 22 - Efeito do ESTE na diarreia induzida por óleo de rícino em

animais saudáveis. ..................................................................................... 105

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Características clínicas e epidemiológicas dos dois principais

subtipos de doenças inflamatórias intestinais, doença de Crohn e colite

ulcerativa. .................................................................................................... 49 Tabela 2 – Evidências clínicas do uso de plantas medicinais na Colite

Ulcerativa. ................................................................................................... 62 Tabela 3 – Teor de luteína nos alimentos. .................................................. 70 Tabela 4 – Escore histológico. ................................................................... 86 Tabela 5 – Quantificação de fenóis totais do ESTE. .................................. 89 Tabela 6 – Efeitos de ESTE sobre o peso do cólon, baço e fígado de

camundongos com colite ulcerativa induzida por DSS. .............................. 97 Tabela 7 – Efeitos do ESTE nos parâmetros oxidativos no colon de

camundongos com colite ulcerativa induzida por DSS. ............................ 100

LISTA DE ABREVIATURAS

5-ASA – ácido 5-aminossalicílico

6-MP – 6-mercaptopurina

6-TNG - 6-tioguanina nucleotídeo

AGCC – Ácidos graxos de cadeia curta

AINEs – Anti-inflamatórios não-esteroidais

ALFAC – 85% álcool etílico 80%, 10% formaldeído e 5% de ácido acético

glacial

AMPK - proteína quinase ativada por adenosina monofosfato

ANVISA – Agência de vigilância sanitária

AZA – Azatioprina

Breg – Células B regulatórias

CAT – catalase

CCK – Colecistocinina

CGRP – peptídeo relacionado ao gene da calcitonina

COX-2 – Ciclo-oxigenase 2

CSA – Ciclosporina

CU – Colite Ulcerativa

DC – Células dendríticas

DC – Doença de Crohn

DHA – ácido graxo docosaexaenóico

DII – Doenças Inflamatórias Intestinais

DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DPPH – 2,2-difenil-1- picrylhydrazyl

DSS – Dextran sulfato de sódio

E.A.T – equivalente ácido tânico

EGFR – do inglês Epidermal growth factor receptor

EPA – ácido graxo eicosapentaenoico

ERO – Espécies reativas de oxigênio

ESTE – Extrato seco de Tagetes erecta L.

EUA – Estados Unidos da América

FBS – soro fetal de bovino

FDA – do inglês Food and Drug Administration

GAE – equivalente de ácido gálico

GALT – do inglês gut-associated lymphoid tissue

GPx – glutationa peroxidase

GR – Receptor glicocorticoide

GSH – glutationa reduzida

GST – glutationa S-transferase

H2O2 – peróxido de hidrogênio

HFD – do inglês high fat diet

HLA – Antígeno leucocitário humano

HO-1 – heme oxigenase 1

IAD – Índice de atividade da Doença

IEC-6 – epitélio intestinal murinho

IFN-γ – Interferon gama

IFX – Infliximab

IgG – Imunoglobulina G

IKK – IκB quinase

IL-10 – Interleucina 10



IL-1β – Interleucina-1 beta

IL23r – receptor de interleucina 23



ILC – Células linfoides inatas

iNOS – Óxido nítrico sintase induzida

JECFA – Joint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives

LOOH - hidroperóxidos lipídicos

LPS – Lipopolissacarídeo

MAdCAM-1 - Sítio da mucosa na molécula de adesão celular 1

MAIT – do inglês mucosal-associated invariant T

MAPK – Proteínas quinases ativadas

MDP – Muramildipeptidio

MPO – mieloperoxidase

MTX – Metotrexato

NaNO2 – nitrito de sódio

NF-kB – do inglês factor nuclear kappa B

NK – Células natural killers

NOD2 – Domínio de oligomerização de nucleotídeo 2

OCl- – Hipoclorito

OH• – Radical hidroxila

ONO2- – Peroxinitrato

PAR – do inglês protease activated receptors

PAS – periódico de Schiff

PCR – Proteína C reativa

PRR – Receptor de reconhecimento de padrão citosólico

RMN – ressonância magnética nuclear

RXR - Receptor de ácido retinoico

SIRT1 – Sirtuína 1

SNC – Sistema Nervoso Centra

SNE – Sistema Nervoso Entérico

SOD – superóxido dismutase

TGI – Trato Gastrointestinal

Th – do inglês T helpers

TJ – do inglês Tight Junctions

TMAO – do inglês trimethylamine N-oxide

TNBS - Ácido Trinitrobenzeno Sulfônico

TNF – do inglês Tumor Necrosis Factor

Tregs – Células regulatórias do tipo Treg

TRP – Potencial de receptor transitório

VIP – Peptídeo intestinal vasoativo

ZO – do inglês Zonula Occludens

SUMÁRIO

2 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 27

3 OBJETIVOS ........................................................................................... 31

3.1Objetivo geral ................................................................................. 31

3.2 Objetivos específicos ...................................................................... 31

4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................. 33

4.1 Anatomia e fisiologia intestinal .................................................... 33

4.2 Doenças Inflamatórias Intestinais (DIIs): Aspectos Gerais ....... 41

4.2.1 Diagnóstico ............................................................................. 47

4.2.2 Doença de Crohn ................................................................... 47

4.2.3 Colite ulcerativa ..................................................................... 50

4.2.4 Tratamento da Doença Inflamatória Intestinal .................... 51

4.3 Tagetes erecta L. ............................................................................. 63

4.3.1 Luteína ................................................................................... 65

4.4 Modelos experimentais de doença inflamatória intestinal ......... 71

4.4.1 Colite induzida por dextrano sulfato de sódio (DSS) ............ 71

4.4.2 Colite induzida por Oxazolona .............................................. 73

4.4.3 Colite induzida por ácido acético ........................................... 74

4.4.4 Colite induzida por Salmonella ............................................. 74

4.4.5 Colite Induzida por Escherichia coli aderente e invasiva ..... 74

4.4.6 Colite Induzida por administração de Ácido Trinitrobenzeno

Sulfônico (TNBS) ....................................................................................... 74

4.4.7 Colite induzida por modificação genética – modelos

knockout..................... ................................................................................ 75

5 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 77

5.1 Obtenção do extrato ...................................................................... 77

5.2 Análise fitoquímica ........................................................................ 77

5.2.1 Determinação de luteína através de espectroscopia por

ressonância magnética nuclear ................................................................. 77

5.2.2 Determinação de fenois totais ................................................ 78

5.3 Ensaio in vitro da atividade sequestradora de radicais 2,2-

difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) ............................................................... 78

5.4 Cultura celular ............................................................................... 78

5.4.1 Viabilidade celular ................................................................. 79

5.4.2 Determinação de espécies reativas de oxigênio (EROs) em

células expostas ao LPS ............................................................................. 79

5.4.3 Determinação de nitrito em células expostas ao LPS ........... 79

5.5 Ensaios in vivo ................................................................................ 80

5.5.1 Animais ................................................................................... 80

5.5.2 Grupos experimentais ............................................................ 80

5.5.3 Indução da colite ulcerativa por dextran sulfato de sódio

(DSS) 5%............................. ........................................................................ 80

5.5.4 Avaliação do trânsito intestinal ............................................. 82

5.5.5 Diarreia induzida com óleo de rícino .................................... 83

5.6 Ensaios ex vivo ................................................................................ 83

5.6.1 Quantificação de glutationa reduzida (GSH) no colón ........ 83

5.6.2 Determinação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) no

colón.......................... .................................................................................. 84

5.6.3 Determinação da atividade da Superóxido Dismutase (SOD)

no colón....................... ................................................................................ 84

5.6.4 Determinação da atividade da Catalase (CAT) no colón ...... 84

5.6.5 Determinação da atividade da glutationa S-transferase (GST)

no cólon.................... ................................................................................... 84

5.6.6 Atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) no colón ........ 85

5.6.7 Dosagem de citocinas ............................................................. 85

5.6.8 Dosagem de proteínas ............................................................ 85

5.6.9 Avaliação histológica ............................................................. 86

5.6.10 Quantificação dos níveis de mucinas .................................. 87

5.7 Análise estatistica .......................................................................... 87

6 RESULTADOS ...................................................................................... 89

6.1 Análise fitoquímica ........................................................................ 89

6.1.1 Teor de luteina ....................................................................... 89

6.1.2 Fenois totais ........................................................................... 89

6.2 Ensaio in vitro da atividade sequestradora de radicais 2,2-

difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) ............................................................... 89

6.3 Cultura celular ............................................................................... 90

6.3.1 Efeito do ESTE na viabilidade celular de enterócitos murinos

(células IEC-6)........... ................................................................................ 90

6.3.2 Efeito do ESTE na produção de espécies reativas de oxigênio

(EROs) em células expostas ao LPS .......................................................... 91

6.3.3 Efeito do ESTE nos níveis de nitrito em células expostas ao

LPS.................... ......................................................................................... 93

6.4 Análise in vivo ................................................................................ 93

6.4.1 Efeito sobre a perda de peso .................................................. 93

6.4.2 Efeito sobre o Índice de atividade da doença (IAD) ............. 94

6.4.3 Efeito sobre o encurtamento do cólon ................................... 95

6.4.4 Efeito do ESTE sobre o peso do cólon, do baço e do fígado de

camundongos com colite induzida por DSS .............................................. 97

6.5 Análise ex vivo ................................................................................ 97

6.5.1 Efeito do ESTE sobre o escore histológico ........................... 97

6.5.2 Efeito do ESTE sobre os níveis de mucinas quantificadas

histoquimicamente ..................................................................................... 99

6.5.3 Efeitos do ESTE sobre parâmetros oxidativos .................... 100

6.5.4 Efeitos do ESTE em parâmetros inflamatórios .................. 101

6.6 Efeito do ESTE sobre o trânsito intestinal de camundongos

saudáveis....................................................................................................103

6.6.1 Efeito do ESTE na diarreia induzida por óleo de rícino. .... 104

7 DISCUSSÃO ......................................................................................... 107

CONCLUSÃO ......................................................................................... 119

REFERÊNCIAS ...................................................................................... 121

ANEXO A - Aprovação da Comissão de Ética no uso de animais –

CEUA/UNIVALI. .................................................................................... 149

27

2 INTRODUÇÃO

As Doenças Inflamatórias Intestinais (DII) são caracterizadas por

inflamação intestinal crônica em decorrência de uma resposta imunológica

exacerbada. Sabe-se que essa resposta imunológica sofre influência de

fatores ambientais e genéticos (ZHANG et al., 2014).

Dentre as DII pode-se citar a Doença de Crohn (DC) e a Colite

Ulcerativa (CU), as quais diferem pelo segmento intestinal acometido

(ABRAHAM; CHO, 2009). A DC é classificada como doença inflamatória

transmural, o que significa que lesiona todas as camadas em praticamente

toda a extensão do intestino, diferente da colite ulcerativa, cuja lesão se

restringe a algumas regiões do cólon e ocorre apenas na camada mais

superficial denominada mucosa. Os sintomas da colite ulcerativa consistem

em diarreia sanguinolenta, dor abdominal e eliminação de pus e/ou muco

durante as evacuações (VITOR et al., 2009; WEYLANDT et al., 2007).

A inflamação causada pelas DIIs está relacionada às disfunções na

resposta imune, especialmente das células T presentes na mucosa intestinal,

além do desequilíbrio entre as citocinas pró-inflamatórias, tais como o fator

de necrose tumoral (TNF, do inglês Tumor Necrosis Factor), interleucina-1

beta (IL-1β), IL-6 e IL-12, e citocinas anti-inflamatórias, tais como IL-4,

IL-10, IL-11 e de expressão de proteínas inflamatórias que incluem ciclo-

oxigenase 2 (COX-2) e óxido nítrico sintase induzida (iNOS), os quais

desempenham um papel importante no processo inflamatório

(SAKTHIVEL; GURUVAYOORAPPAN, 2014).

Em todo o mundo, a CU é mais comum do que a DC, ambas são

doenças características do mundo industrializado atingindo particularmente

a América do Norte e Europa Ocidental, com crescimento na Ásia. A

incidência global gira em torno de 1,2 a 20,3 casos por 100.000 pessoas por

ano, enquanto a prevalência é de 7,6 a 245 casos por 100.000 pessoas por

ano (LOFTUS, 2004; DANESE; FIOCCHI, 2011; FEUERSTEIN;

CHEIFETZ, 2014). As incidências mais elevadas foram notificadas no norte

da Europa (24,3 por 100.000), Canadá (19,2 por 100.000) e Austrália (17,4

por 100.000). Já as taxas de prevalência são mais elevadas na Europa (505

por 100.000), no Canadá (248 por 100.000) e nos EUA (214 por 100.000)

(MOLODECKY et al. 2012).

A estimativa é que nos Estados Unidos são gastos cerca de mais de

US$ 2 bilhões de dólares com hospitalização, medicação e colectomia em

28

decorrência da CU (DULAI; LEVESQUE; FEAGAN et al., 2015; MEHTA,

2016). A idade máxima do início da doença é entre 30 e 40 anos (SHAPIRO

et al., 2016).

O impacto da doença durante os períodos de exacerbação afeta de

forma efetiva a qualidade de vida do indivíduo, como suas atividades

cotidianas, vida social, sexual, a capacidade de trabalhar e sua auto

percepção e imagem corporal (UMANSKIY; FICHERA, 2010; COSNES;

GOWER-ROUSSEAU; SEKSIK, 2011). Isso tudo leva a mudanças

emocionais, cognitivo-comportamentais associados à dor causada pela DII.

A literatura estima que 15% - 20% de indivíduos com DII apresentam

ansiedade e depressão, os quais estão associados a uma maior

intensidade/severidade da dor na fase ativa da doença (NEUENDORF et al.,

2016).

Essa patologia tem seu manejo primariamente medicamentoso embora

10% a 15% dos pacientes necessitem de uma colectomia. Os objetivos

terapêuticos são induzir e manter a remissão, reduzir o risco de

complicações e melhorar a qualidade de vida desses indivíduos

(FEUERSTEIN; CHEIFETZ, 2014).

Considerando, os inconvenientes do tratamento atual, tais como, baixo

índice de remissão quando utilizado aminossalicilatos, efeitos lesivos

apresentados pelo uso ou dependência de anti-inflamatórios esteroides, ou

ainda o custo associado à terapia, torna-se evidente a necessidade de

pesquisas por novos tratamentos ou terapias adjuvantes ou complementares

para as DII (AWAADI; EL-MELIGY; SOLIMAN, 2013).

Existem diferentes tipos de terapias alternativas e/ou complementares

envolvendo plantas medicinais, relevantes para o tratamento da inflamação

intestinal (HILSDEN et al., 2011). Relaciona-se o uso dessas plantas à sua

segurança, além da eficácia comprovada devido à presença de diversos

componentes ativos que atuam em diferentes vias da resposta inflamatória.

Porém, o uso de plantas tem uma base empírica, sendo necessário avaliá-las

adequadamente a fim de considerá-las estratégias apropriadas para o

tratamento da DII (ALGIERI et al., 2015).

Dentre as plantas com uso empírico, as flores da Tagetes erecta L.,

vem sendo usada na medicina popular há muito tempo (BREITHAUPT;

WIRT; BAMEDI, 2002) para distúrbios gastrintestinais (diarreia,

indigestão, cólica, acidez, constipação, inchaço, falta de apetite, dor de

estômago), problemas renais, cicatrização de feridas (redução de

29

sangramento e infecções), diurética, problemas de pele (eczema, acne,

coceira, dermatite, entre outras), sedativo e adstringente (MOLLIK et al.,

2010). Além disso, tem sido cultivada com o propósito de extração de

carotenoides, visto que é uma fonte de luteína de baixo custo

(BREITHAUPT; WIRT; BAMEDI, 2002).

Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo investigar o

potencial uso do extrato seco de T. erecta L., no tratamento da colite

ulcerativa induzida por DSS em camundongos.

31

3 OBJETIVOS

3.1Objetivo geral

Investigar o potencial anti-inflamatório e curativo do extrato seco de

Tagetes erecta, no modelo de colite ulcerativa induzida por dextran sulfato

de sódio (DSS) em camundongos.

3.2 Objetivos específicos

Avaliar o potencial sequestrador de radicais livres in vitro do

extrato seco de T. erecta;

Quantificar os níveis de fenóis totais e luteína no extrato seco de T.

erecta;

Avaliar os efeitos do extrato seco de T. erecta. na viabilidade

celular de células epiteliais intestinais e na produção de espécies

reativas de oxigênio e nitrogênio por estas células;

Avaliar no modelo de colite induzida por DSS, a capacidade

curativa do extrato seco de T. erecta, por meio da avaliação da

perda de peso, do índice de atividade da doença e de análises

histopatológicas de amostras colônicas;

Avaliar os parâmetros de estresse oxidativo no efeito anti-

inflamatório do extrato seco de T. erecta no modelo de indução de

colite ulcerativa por DSS;

Avaliar a participação da migração neutrofílica no efeito anti-

inflamatório do extrato seco de T. erecta no modelo de indução de

colite ulcerativa por DSS.

Avaliar efeitos do extrato seco de T. erecta nos níveis de citocinas

inflamatórias (TNF e IL-6) no modelo de indução de colite

ulcerativa por DSS.

Avaliar o efeito do ESTE no trânsito intestinal de animais

saudáveis.

33

4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

4.1 Anatomia e fisiologia intestinal

A principal função do trato gastrointestinal (TGI) é o transporte e

absorção de água, eletrólitos e nutrientes. O TGI sofre desafios intensos

para evitar que agentes patogênicos no lúmen gastrointestinal tenham

acesso aos tecidos internos. Diante disso, as células epiteliais do TGI

formam uma barreira seletivamente permeável rigidamente regulada e

especializada (SHEN, 2009).

O primeiro segmento do intestino (Figura 1) é o duodeno, o qual

regula a digestão e a absorção. Suas células, terminações nervosas quimio e

mecanossensíveis monitoram as características do conteúdo luminal e

coordenam funções distantes do TGI, preparando-as para a chegada da

refeição ou retardando o fluxo de conteúdo vindo do estômago. No duodeno

também ocorre a chegada das secreções advindas do pâncreas exócrino e

bile da vesícula biliar (BARRET, 2015a).

O intestino delgado também é composto pelo jejuno e pelo íleo. No

jejuno ocorre a absorção de nutrientes devido às pregas e vilosidades. O

íleo, mais distante, apresenta menos pregas e vilosidades e atua absorvendo

exclusivamente os ácidos biliares, que são recuperados por transportadores

expressos no íleo terminal (BARRET, 2015a).

O intestino grosso recebe esse nome pelo seu diâmetro ser maior que o

do intestino delgado e, tem função de reservatório de armazenamento de

produtos de degradação e materiais não digeríveis antes de sua eliminação

pelas fezes. É segmentado em colo ascendente, transverso, descendente e

sigmoide, os quais desempenham diferentes funções. Os colos ascendentes

e transversos desempenham o papel de absorção de líquidos que

permaneceram do processo de digestão, bem como ácidos graxos de cadeia

curta produzidos pela fermentação bacteriana. A parte mais distal do colo é

onde o material fecal é lançado. Além disso, no intestino grosso é onde se

localiza a maioria das bactérias intestinais, as quais contribuem de maneira

significativa para a saúde dos indivíduos (BARRET, 2015a).

34

Figura 1 - Localização anatômica de segmentos teciduais na cavidade abdominal.

Fonte: adaptado de Tortora; Derrickson (2017).

A parede do TGI começa no esôfago e termina no ânus e sofre

alterações ao longo das várias regiões do TGI. É composta por quatro

camadas (túnicas) com uma rede de nervos interconectadas. As túnicas são

chamadas de: túnica mucosa, túnica submucosa, túnica muscular e túnica

serosa ou adventícia, constituindo assim o tecido epitelial (SPENCE, 1991). Os tecidos epiteliais são essenciais para o corpo humano, fazendo sua

cobertura e proteção, bem como formando glândulas que desempenham

funções, realizam secreção e absorção de substâncias necessárias e

protegem contra agentes físicos, químicos e patogênicos (VASILEVA et al.,

2017).

No intestino, o epitélio, consiste em uma única camada de diferentes

células especializadas (Figura 2), dentre as quais se destacam: enterócitos,

células caliciformes, células neuroendócrinas, células de Paneth, células de

imunidade, como linfócitos intra epiteliais e células dendríticas

(BISCHOFF et al., 2014; COSKUN, 2014). Todas essas células formam as

conhecidas criptas intestinais, com um único revestimento celular,

organizadas de forma colunar e possuindo “junções fortes ou apertadas”

(TJ, do inglês Tight Junctions), junções de aderência e desmossomos. Os

complexos juncionais promovem uma coesão entre as células, regulam a

35

permeabilidade paracelular de íons e moléculas pequenas além de secretar

muco protetor contra agentes microbianos (ANTONI et al., 2014;

GROSCHWITZ; HOGAN, 2009; RODA et al., 2010). Esse arranjo celular

e estrutural promove a separação dos agentes patogênicos presentes no

lúmen intestinal da lâmina própria sub epitelial (CADER; KASER, 2013;

FLIER; CLEVERS, 2009; GEREMIA et al., 2014; KIM; CHEON, 2017).

Figura 2 - Representação da organização celular do epitélio intestinal.

Fonte: adaptado de Antoni et al., 2014.

As tight junctions, fazem a manutenção e regulação da barreira

intestinal, localizam-se na parte superior das células epiteliais adjacentes

(HERING et al., 2017), são numerosas e organizadas horizontalmente

envolvendo as células epiteliais, e dependem das junções de aderência para

serem montadas (TURNER, 2009), são compostas por proteínas

transmembranares, onde cada uma contribui de forma diferente com a

função de barreira (FURUSE et al., 2002).

36

A barreira intestinal tem sua função estabelecida na membrana

plasmática celular epitelial, a qual é impermeável à substâncias hidrofílicas

na ausência de transportadores específicos. O “selo” entre as células

epiteliais requer as tight junctions, as quais realizam uma adesão

especializada preenchendo o espaço paracelular, tendo como função o

controle do fluxo de íons através do tecido e mantendo a polaridade das

células (FARQUHAR; PALADE, 1963; SCHMITZ et al., 1999). Agentes

irritantes de mucosa ou agentes citotóxicos, como medicamentos, podem

promover danos nas células epiteliais resultando em perda de função de

barreira. Sendo assim, as tight junctions funcionam como uma barreira aos

agentes irritantes protegendo as proteínas da membrana plasmática apical

(CAPALDO; POWELL; KALMAN, 2017).

As junções de aderência e os desmossomas fornecem ligações adesivas

fortes que mantem as células próximas promovendo uma comunicação

intercelular. As junções aderentes são compostas por caderinas, uma família

de proteínas transmembranares que promovem fortes interações celulares

adjacentes (HERMISTON; GORDON, 1995; TURNER, 2009).

As proteínas mais importantes presentes nas tight junctions são as da

família das claudinas, que estabelecem vários aspectos da permeabilidade.

As claudinas são uma família de proteínas de junção apertada que consiste

em moléculas de vedação e poros que facilitam a passagem de água e

eletrólitos. As proteínas de Zonula Occludens (ZO-1, ZO-2 e ZO-3) são

proteínas de junção intracelulares importantes, ligando o citoesqueleto

celular às proteínas de junção apertada transmembranares (BISCHOFF et al,

2014).

Essa proteína é expressa de maneira específica no tecido e a sua

mutação ou remoção pode consequentemente produzir efeitos nas funções

orgânicas. A zona occludens 1 (ZO-1) e zona occludens 2 (ZO-2) e

proteínas da membrana periférica, exercem extrema importância na

manutenção e montagem das tight junctions, por promoverem inúmeras

interações com outras proteínas (claudinas, occludinas e actina). Quando há

um funcionamento inadequado das tight junctions ocorre a passagem de

lipopolissacarídeos (LPs), toxinas, bactérias e outros micro-organismos,

promovendo um fluxo desordenado por entre as células intestinais,

prejudicando a permeabilidade da mucosa (PELASEYED et al., 2014).

Como citado anteriormente, a barreira física inclui um componente

celular constituído pelo endotélio vascular, o revestimento das células

37

epiteliais e a camada de muco. Ao lado desta barreira física, substâncias

químicas também participam da função de barreira. Essas substâncias

consistem em secreções digestivas, moléculas imunes, produtos celulares

como citocinas, mediadores inflamatórios e peptídeos antimicrobianos,

produzidos principalmente por células de Paneth nas criptas do intestino

delgado. A microbiota intestinal está envolvida em processos metabólicos e

modula a barreira, mas não representa uma função de barreira per se.

(BISCHOFF, 2011).

As células caliciformes, distribuídas ao longo do intestino, são

responsáveis pela secreção de glicoproteínas chamadas mucinas que

formam a barreira mucosa intestinal, sendo a principal delas a MUC2

(ZHANG; EICHER; APPLEGATE, 2015). As mucinas são classificadas

como mucinas ligadas a membrana ou secretadas, bem como em como

ácidas ou básicas, sendo a ácida responsável na proteção contra a

translocação bacteriana. A camada de muco possui diferentes espessuras,

sua depleção está associada a infecções entéricas e seu espessamento com

menor desempenho por ocorrer menor disseminação de enzimas digestivas

e nutrientes (WLODARSKA et al., 2011). O muco exerce a função de

absorver as bactérias invasivas e promover sua expulsão através do fluxo

luminal, proporcionar lubrificação e servir como nutrientes para bactérias

comensais. Porém, diversos fatores estão associados com a síntese de

mucina como: dieta e suplementos que podem afetar a interação entre

bactérias intestinais e epitélio intestinal (LILBURN; LOEFFLER, 2015;

BROOM, 2018).

Sluis et al. (2006) avaliando a mucosa de camundongos verificaram

que a deficiência ou perda de MUC2 ocasiona brechas na barreira epitelial,

leva a uma morfologia anormal por um aumento de espessura da mucosa

intestinal, achatamento e ulceração de células epiteliais, perda geral de

arquitetura, aumento de células inflamatórias, da proliferação e

diferenciação celular no cólon. Além disso, mudanças na composição do

muco, causadas pela deficiência de MUC2, levam à inflamação do cólon e

que a deficiência de MUC2 contribui para o início e /ou piora da DII.

O corpo humano é colonizado por bactérias, fungos e vírus

coletivamente, essa colonização é conhecida como microbiota comensal.

Esses micro-organismos estão distribuídos em toda a superfície do corpo,

porém o local de maior variedade é no intestino (QIN et al., 2010).

38

O TGI é adaptado à colonização por bactérias comensais que ajudam

na digestão e influenciam no desenvolvimento do sistema imunológico de

mucosa. Porém, a colonização bacteriana pode ser benéfica ou patogênica

dependendo do tipo de bactéria presente e do comprometimento das células

epiteliais de barreira ou imune (PETERSON; ARTIS, 2014).

Estudos em animais têm feito importantes descobertas sobre o papel

da microbiota no desenvolvimento do tecido linfoide associado ao intestino

(GALT, do inglês gut-associated lymphoid tissue) e na presença de células

imunes na parede intestinal (linfócitos intraepiteliais, neutrófilos da lâmina

própria, células dendríticas, ILC3s, células invariante T associado a mucosa

(MAIT, do inglês mucosal-associated invariant T), células TCR αβ Th17,

células regulatórias do tipo Treg (Tregs), imunoglobulinas A). Além disso,

há a hipótese de que há a necessidade de bactérias para a maturação de

células específicas do hospedeiro, como as ligadas ao desenvolvimento das

células Th17. Outra questão importante é que a microbiota protege o

hospedeiro contra agentes patogênicos, por produzirem bacteriocinas e

ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) que são capazes de inibir o

crescimento de bactérias patogênicas (GONÇALVES; ARAÚJO; SANTO,

2018).

O metabolismo microbiano comensal, produz vitaminas essenciais

(vitaminas do complexo B e K), AGCC e metabolizam compostos como os

ácidos biliares, esteróis e xenobióticos. Além disso, a produção desses

compostos favorece o desenvolvimento das células imunológicas

influenciando na homeostase do organismo, sendo as substâncias de mais

destaque nesse papel os AGCC como acetato, propionato e butirato (Figura

3) (GONÇALVES; ARAÚJO; SANTO, 2018).

39 Figura 3 - Ação dos AGCC no sistema imunológico.

Fonte: adaptado de Gonçalves, Araújo e Santo (2018).

Legenda: HDACi (do inglês, histone deacetylases inhibitor - inibidor de histonas

desacetilases); GPR (do inglês, G-protein-coupled receptor – receptor G de proteína

acoplada); Th (do inglês, T-helper); IL-10 (interleucina 10); IgA (imunoglobulina

A); IL-18 (interleucina 18); Tregs (células regulatórias do tipo T); TGF-β ( do

inglês, transforming growth factor beta - fator de transformação do crescimento

beta).

Indivíduos que possuem DII apresentam disbiose pelo número

reduzido de bactérias produtoras de AGCC, consequentemente com

concentrações de butirato reduzidas no intestino. Esse AGCC promove o

aumento das células anti-inflamatórias (Tregs, Tr1 e Bregs) e diminui os

fatores pró-inflamatórios (células natural killers, macrófagos e outras) no

intestino. Sendo essa uma hipótese de correlação entre disbiose intestinal e

DII (GONÇALVES; ARAÚJO; SANTO, 2018).

40

Outra hipótese da relação entre microbiota e DII é que a microbiota

intestinal desempenha importante papel no desenvolvimento da imunidade

intestinal, por bactérias comensais desenvolverem atividades anti-

inflamatórias. Bactérias patogênicas, que podem favorecer o

desenvolvimento da colite ulcerativa, por exemplo, são suprimidas por

bactérias benéficas, através da indução de uma resposta imunológica

regulatória que envolve as células T regulatórias (Tregs), IL-10 e proteína

3γ regenerada (REGIIIγ). Quando ocorre a DII, uma combinação de fatores

genéticos (mutação no domínio de oligomerização de nucleotídeo 2 –

NOD2, gene 16 relacionado à autofagia (Atg16l1), receptor de interleucina

23 (IL23r)), dieta e estresse podem resultar em um desequilíbrio

microbiano, chamado de disbiose. Esse processo acarreta em uma

inflamação crônica envolvendo as células T helpers (Th1 e Th17), isso pode

desencadear uma translocação bacteriana causando diversas patologias ao

hospedeiro (Figura 4) (KAMADA et al., 2013).

41 Figura 4 - Esquema representativo do envolvimento da microbiota intestinal na

homeostasia intestinal e nas DII.

Fonte: Kamada et al. (2013).

Legenda: GALT (tecido linfoide associado ao intestino, do inglês, gut-associated

lymphoid tissue).

4.2 Doenças Inflamatórias Intestinais (DIIs): Aspectos Gerais

A inflamação crônica é caracterizada pela persistência do agente

inflamatório, exposição prolongada a agentes tóxicos ou aparecimento de

fenômenos autoimunitários, onde o processo se mantém por um tempo

maior. Não existem critérios, mas se considera uma inflamação crônica

aquela que persiste por mais de seis meses (PEREIRA, 2012).

Sabe-se que as células do epitélio intestinal são frequentemente

vulneráveis a proteases. Essas proteases podem ser de origem endógena

(proteases pancreáticas), de bactérias ou de partículas alimentares presentes

no lúmen intestinal. A capacidade proteolítica dessas enzimas pode causar

danos à camada epitelial, ao muco e as proteína de junção, prejudicando a

atividade de barreira, por promoverem a abertura do complexo das tight

junctions alterando a permeabilidade paracelular em decorrência da

proteólise e ativação dos receptores ativados por proteinases (PAR, do

42

inglês protease activated receptors) nas células epiteliais. Quando há o

processo inflamatório, como é o caso das DIIs, citando aqui a colite

ulcerativa, as células imunes conseguem se infiltrar na lâmina própria,

produzindo proteases e citocinas amplificando ainda mais o processo e o

ambiente inflamatório, exacerbando a doença (VAN SPAENDONK et al.,

2017).

Sugere-se que a histologia do tecido intestinal de portadores das DII

apresenta uma característica de influxo de células imunes inatas

(neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e Natural killer) e células

adaptativas (células B e T) na lâmina própria. A resposta imune inata

representa a primeira linha de defesa contra patógenos, não é específica e

não produz células de memória (imunidade duradoura). A reação

inflamatória é consequência de um defeito, provavelmente genético, do

indivíduo na regulação imunológica, promovendo assim uma resposta

imunológica inadequada à microbiota intestinal inócua. Sendo assim, se

forma um ciclo onde a lesão epitelial favorece o acesso de produtos

bacterianos na lâmina própria estimulando ainda mais o sistema

imunológico (BARRET, 2015, p. 125-126b).

Quando ocorre a ativação dessas células imunes, simultaneamente há a

elevação de TNF-α, IL-1β, IFN-γ e citocinas. Além disso, há a hipótese de

que ocorra uma resposta inata na mucosa, uma sensibilidade microbiana

inata, autofagia e respostas de proteínas desdobradas como uma possível via

no desenvolvimento da DII (GEREMIA et al., 2014).

Ueno e colaboradores (2017) enfatizam que inúmeros fatores como

genética, epigenética e microbiota influenciam o desenvolvimento e

plasticidade das células Th17 no intestino. As células Th17 são uma defesa

do hospedeiro contra agentes patogênicos invasores e permite uma

tolerância simultânea entre comensais e fatores alimentares. Essas múltiplas

funções do Th17 depende de sua flexibilidade e é indispensável para a

homeostase do trato gastrointestinal.

A transdiferenciação do Th17 em Treg, IFN- γ secretor de Th1, IL-22

secretora de células Th22-like em respostas às condições ambientais permite

ajustes da resposta imune tornando as células Th17 importantes para o

equilíbrio imune. Porém, isso parece não acontecer nos pacientes com

doença inflamatória intestinal (UENO et al., 2017).

A patogênese da DII é complicada e envolve muitos mediadores pró-

inflamatórios, entretanto, é clara a importância do Th17 na indução e

43

manutenção da inflamação intestinal crônica. Pesquisas demonstram que a

redução da inflamação deve ter como alvo estas células, porém é necessária

uma melhor compreensão e sua segmentação para uma terapia efetiva.

Estudos sugerem também uma consideração das células linfoides inatas, as

quais têm alvos terapêuticos comuns com o Th17 e são abundantes em

pacientes com DII (LEE; KWON; CHO, 2018).

A DII é caracterizada como um distúrbio idiopático, onde os processos

envolvidos com essa doença estão sendo investigados. Como já citado,

sabe-se que há uma associação entre a autoimunidade, porém nenhuma das

DII (doença de Crohn ou colite ulcerativa) são caracterizadas como

autoimunes. Nos últimos tempos, houve um esforço da comunidade

científica a fim de compreender a patogênese da DII, e tem havido

progressos. É bem discutido que a DII sofre influência de diversos fatores,

sugerindo uma confluência entre genética, fatores ambientais e alterações na

microbiota, todos esses acarretando em um sistema imune da mucosa

desregulado, o que permeia os achados clínicos e endoscópicos observados

nos indivíduos acometidos com tais patologias (SHOUVAL; RUFO, 2017).

Avanços nos estudos relacionando a genética e sua contribuição na DII

têm ocorrido nas últimas décadas, devido aos avanços tecnológicos em

testes e análises genéticas (GAYA et al., 2006). Estudos têm relacionado

163 locus de genes com a DII, dos quais 110 estão associados a ambas as

doenças, 30 específicos para doença de Crohn e 23 específicos para Colite

ulcerativa (DUERR, 2007; JOSTINS et al., 2012; ZHANG, 2014).

Estudos relacionados a Doença de Crohn detectaram diversos locus

genômicos associados a esta patologia. Além de confirmar a associação

NOD2. O NOD2 é um receptor de reconhecimento de padrão citosólico

(PRR) desempenha um papel chave na imunidade a bactérias intracelulares

e respostas inflamatórias. NOD2 reconhece muramildipeptidio (MDP), um

componente das paredes de células bacterianas, e sua estimulação leva à

indução de autofagia em células humanas (PHILPOTT et al., 2013).

Esses primeiros estudos identificaram quatro locus genéticos em níveis

de significância estatística de todo o genoma. Houve então o estudo de uma

variante protetora no IL23R, que codifica uma proteína receptora

incorporada na membrana celular de muitos tipos diferentes de células

imunes e, após a ligação da IL23, inicia uma cascata de sinalização que

promove a inflamação e coordena uma resposta imune adaptativa. Além

disso, a associação a uma variante de codificação de proteína em ATG16L1,

44

que codifica uma proteína envolvida na via autofagosoma afirma a

importância da autofagia na DC, sendo esta via responsável por processar

bactérias intracelulares contribuindo para a compreensão da disfunção de

barreira na DC (LANGE; BARRETT, 2015).

Na CU os estudos sugerem a participação de três locus genéticos no

seu desenvolvimento como o HNF4A, que codifica um fator de transcrição

que rege a expressão de componentes CDH1 que produz uma glicoproteína

transmembranar importante para as junções de aderência localizadas nas

células intestinais; o LAMB1 que codifica a subunidade b1 de uma

laminina, os principais componentes não colágenos das membranas basais;

e o clássico HLA (antígeno leucocitário humano), que contém genes que

codificam proteína que representam antígenos na superfície da célula e

regulam o sistema imune adaptativo (LANGE; BARRETT, 2015).

Dentre os fatores ambientais que desempenham um importante papel

na patogenia da DII, pode-se citar: tabagismo, dieta, estresse social e

psicológico.

O tabagismo está associado à complicações intestinais mais

frequentes, aumentando o risco de necessidade cirúrgica durante o curso da

doença inflamatória intestinal. O tabagismo nas DII, mais especificamente

na CU, deve ser desencorajado. Pacientes que possuem CU e desejam parar

de fumar devem ser alertados sobre o potencial risco do aumento da

atividade da doença, bem como o fortalecimento do tratamento

medicamentoso o qual se não suprir a necessidade pode ser evoluído para o

uso de imunossupressores ou biológicos (COSNES, 2016).

Estudos sugerem uma relação entre o tabagismo com as proteínas do

potencial de receptor transitório (TRP), os quais promovem a

despolarização da membrana (influxo de Ca2+

). Os canais de TRP da família

akirina e vanilóide são expressos pelos neurônios sensoriais do sistema

nervoso central (SNC) e entérico (SNE) os quais tem sido relacionados ao

contexto da inflamação intestinal. Portanto, o que se tem sugerido é que o

tabagismo pode afetar os TRPs no intestino de forma semelhante ao

pulmão, promovendo uma imunomodulação através da indução de citocinas

como a IL-8. Esta interação pode elucidar o vínculo mecanicista entre

tabagismo e TRP. Estudos adicionais devem ser realizados para maiores

esclarecimentos das diferenças no íleo e cólon a fim de desvendar o papel

dos canais TRP na patogênese da DII (ALLAIS et al., 2016).

45

A dieta ocidental mudou consideravelmente em paralelo ao

surgimento da DII (HOU; ABRAHAM; EL-SERAG, 2011; ANDERSEN et

al., 2012). Nos últimos anos, o padrão dietético dominado pelo alto

consumo de açúcar refinado, frutose, desequilíbrio entre o balanço ômega-

6:ômega-3, aumento do consumo de fast foods (lanches, pizzas, cereais e

bebidas açucaradas), alta ingestão de carne vermelha, margarina

(RICHMAN; RHODES, 2013), gordura trans, diminuição do consumo de

frutas e legumes (fibras), favoreceram consideravelmente a incidência de

DII (CHAPMAN-KIDDELL et al., 2012; HOU; ABRAHAM; EL-SERAG,

2011).

Bibi et al. (2017) investigaram o impacto da dieta alta em gordura

(HFD, do inglês high fat diet) materna na saúde intestinal da prole usando

um modelo em camundongo de colite induzida por dextran sulfato de sódio

(DSS). Os pesquisadores concluíram que a exposição materna à HFD

acelerou o ganho de peso, mas aumentou a perda de peso corporal induzida

por DSS e os sintomas de colite ativando a sinalização de fator nuclear

kappa B (NF-kB) e estimulando a expressão de IL1b, IL-6 e IL-17 bem

como a indução de neutrófilos nos tecidos do cólon. Além disso, a

exposição materna à HFD suprimiu a atividade da proteína quinase ativada

por adenosina monofosfato (AMPK) e regulou negativamente a sirtuína 1

(SIRT1) e a p53, o que agravou ainda mais a colite DSS na prole. Este

estudo sugere que o consumo materno de HFD predispõe camundongos

descendentes à DII e doenças relacionadas. Além disso, estudos que

promoveram a análise do consumo de proteína de origem animal versus

proteína de origem vegetal identificaram que as proteínas de origem vegetal

aumentam o conteúdo de bactérias benéficas ao hospedeiro e reduz as

patogênicas, aumentando consequentemente a produção de ácidos graxos de

cadeia curta (AGCC), melhorando a barreira intestinal, as células

reguladoras tregs do tipo T (TREGs, do inglês Tregs T regulatory cells) e

reduzindo a inflamação intestinal. Já o consumo de proteína de origem

animal aumenta o conteúdo de bactérias patogênicas e reduz os probióticos,

impactando em uma diminuição da produção de AGCC e aumentando a

produção de N-óxido de trimetilamina (TMAO, do inglês trimethylamine N-

oxide) favorecendo o aparecimento de doenças cardiovasculares e doença

inflamatória intestinal (SINGH et al., 2017).

Os pacientes com DII têm uma alta tendência em apresentar uma

diversidade microbiana intestinal menor, refletindo em menores números de

46

bactérias benéficas o que pode gerar redução das concentrações de butirato,

o qual junto com outros AGCC promove um efeito anti-inflamatório

intestinal (LÓPEZ et al., 2016).

A microbiota intestinal, através da fermentação de prebióticos, tem a

capacidade de produzir AGCC como acetato, propionato e butirato.

Pacientes com DII apresentam conteúdos fecais de AGCC reduzidos.

Dentre os benefícios dos AGCC pode-se citar: 1) inibição da adesão de

micro-organismos patogênicos nas células intestinais; 2) favorecimento de

secreção de bacteriocinas (substância antimicrobiana) por células epiteliais

do cólon; 3) favorecer o crescimento de bactérias benéficas; 4) proporciona

efeitos anti-inflamatório para as células epiteliais através da inibição da

ativação de NF-kB e PPARγ e limitando a produção de IL-1β, IL-6 e TNF-

α; 5) aumento da síntese de mucina através do estímulo do fator de

crescimento epidérmico (EGFR, do inglês do inglês Epidermal growth

factor receptor) favorecendo a homeostase intestinal (EOM et al., 2018).

Outro fator achado na literatura é a relação entre a vitamina D e a

incidência de DII, sendo a hipovitaminose D comum entre pacientes

diagnosticados com tal patologia (LESLIE et al., 2008). Em modelos

experimentais de camundongos a deficiência de vitamina D foi associada

com uma susceptibilidade aumentada a CU induzida por dextran sulfato de

sódio (DSS), sendo que a suplementação, promove melhoras na gravidade

da DII (CARTORNA et al., 2000; LAGISHETTY et al., 2010).

Intervenções dietéticas foram estudadas na DII na tentativa de

controlar e manter sua remissão. Algumas opções se mostraram efetivas,

porém, os mecanismos e componentes precisos sobre o que é importante

para cada intervenção dietética não são bem delineados e muitas vezes

sugerem contradições. Portanto, não há uma intervenção dietética padrão

ouro, sendo assim, os profissionais de saúde promovem as que julgam

melhores, baseadas nas evidências científicas disponíveis (HASKEY;

GIBSON, 2017).

O papel da nutrição na prevenção e melhoria dos sintomas das DII é

amplamente demonstrado. Comparado com a dieta ocidental (rica em

alimentos industrializados – refinados, gordura trans, conservantes), há

benefícios claros em dietas ricas em frutas, legumes, óleo de peixe (rico em

ômega-3), grãos integrais e azeite de oliva, que fornecem nutrientes como

vitamina D, ácidos graxos essenciais, vitaminas, minerais e fibras. Estes

47

alimentos mantêm uma microbiota intestinal saudável, bem como promove

a ingesta de nutrientes diversificados (TOMASELLO et al., 2016).

4.2.1 Diagnóstico

Como já citado, a DII resulta em uma resposta inflamatória

imunológica inapropriada à microbiota intestinal normal em indivíduo

suscetível. O principal método de diagnóstico e acompanhamento dos

indivíduos acometidos por essa patologia é a endoscopia digestiva, um

método invasivo, porém seguro, realizado sob sedação consciente a fim de

gerar o menor desconforto. Além disso, testes sorológicos (marcadores

inflamatórios) e exames radiológicos complementam o diagnóstico e o

acompanhamento (CURY, 2015, p. 41).

Entre os exames de imagem sugeridos para o diagnóstico da CU estão

a endoscopia com biópsia a qual é suficiente para confirmar o diagnóstico e

dar início a terapia medicamentosa em pacientes que apresentam a primeira

crise de CU (OSTERMAN; LICHTENSTEIN, 2010, p. 1985).

Já a colonoscopia não é indicada em pacientes com CU ativa, devido

ao risco de perfuração. Porém, quando passada a fase ativa se torna uma

ferramenta interessante para estabelecer a extensão da doença e excluir a

possibilidade de Doença de Crohn ou outras que possam complicar a CU

(OSTERMAN; LICHTENSTEIN, 2010, p. 1985).

4.2.2 Doença de Crohn

Trata-se de uma doença inflamatória crônica de tipo desconhecida,

caracterizada por áreas descontínuas afetadas com inflamação

granulomatosa transmural (que afeta todas as camadas que constituem a

parede da área doente – da mucosa até a serosa) e/ ou fístula. Pode afetar

qualquer região do trato digestivo da boca ao ânus, mas é mais comum o

envolvimento do intestino grosso e delgado e a região perianal

(MATSUOKA et al., 2018).

Com relação ao gênero de prevalência de acometimento, não há uma

distribuição específica. O que se sabe é que o início da doença ocorre na

segunda a quarta década de vida com um pico menor descrito de 50 a 60

anos (MOLODECKY et al., 2012). Acredita-se ser resultado da interação

entre susceptibilidade genética, fatores ambientais e microflora intestinal

resultando em uma resposta imunológica da mucosa anormal e

comprometimento da função de barreira epitelial (TORRES et al., 2017).

48

Em decorrência da inflamação se formam úlceras profundas, fissuras

que chegam a dar origem a trajetos fistulosos, comunicando o intestino ou o

cólon com outros órgãos, vísceras e estruturas, ou até mesmo terminando no

meio exterior na região perianal ou parede abdominal, causando abscessos

intracavitários. Essas úlceras quando cicatrizadas deformam e causam

estenose do segmento doente (MISZPUTEN; CURY, 2015, p. 24).

Há hipótese de susceptibilidade genética e histórico familiar, onde

12% dos pacientes tem histórico de DC na família (MOLLER et al., 2015).

Estudos genéticos tem identificado mais de 200 alelos associados a DII,

sendo 37 específicos para DC (JOSTINS et al., 2012). Os genes associados

a detecção bacteriana e imunidade inata estão relacionados a função celular

de Th17 (NOD2, vias ATG16L1, LRRK2, IRGM, Il23R, HLA, STAT3,

JAK2 e Th17) e mucosa alterada (MUC2), elucidando importantes

mecanismos envolvidos na patogênese desta doença (LIU et al., 2015;

MCGOVERN; KUGATHASAN; CHO, 2015).

Sobre os fatores ambientais, evidências apontam para a exposição ao

tabaco, exposição à antibióticos na infância, contraceptivos orais, anti-

inflamatórios não-esteroidais (AINEs), fatores dietéticos, estão relacionados

com risco aumentado para o desenvolvimento da DC (TORRES et al.,

2017).

Há crescentes evidências de que os fatores dietéticos desempenham

um papel importante nas DII, especialmente na DC. A exposição a

alimentos ricos em gorduras, glúten, emulsionantes e maltodextrina pode

estar associados aos mecanismos envolvidos na DC. Alguns estudos já

mostram que intervenções dietéticas de exclusão podem favorecer o

tratamento e induzir a remissão da DC, porém com níveis de evidências

baixos (SARBAGILI-SHABAT; SIGALL-BONEH; LEVINE, 2015).

As intensidades das lesões inflamatórias nos exames de imagem

possibilitam classificar a gravidade da doença. Indivíduos que apresentam

suspeita de DC devem ser avaliados com endoscopia digestiva mais baixa e

imagens transversais para avaliar a extensão da doença. O íleo terminal é a

porção frequentemente mais afetada, sendo assim o diagnóstico por imagem

deve ser capaz de fornecer imagens precisas de todo o intestino delgado

para uma avaliação coerente e correta da doença, uma vez que a mesma

pode afetar diversas áreas do trato gastrointestinal superior, as quais

possuem implicações prognósticas e terapêuticas (PITA; MAGRO, 2018).

49

A DC e CU compartilham uma série de características clínicas, porém

existem importantes distinções que sugerem diferenças nas vias subjacentes

que direcionam cada doença (Tabela 1) (BAUMGART; SANDBORN,

2007; BERNSTEIN et al., 2010).

Tabela 1 - Características clínicas e epidemiológicas dos dois principais subtipos de

doenças inflamatórias intestinais, doença de Crohn e colite ulcerativa.

Doença de Crohn Colite ulcerativa

Padrões de incidência Sexo

Mais comum em mulheres

do que em homens

Taxas iguais entre homens e

mulheres

Taxas de

prevalência

DC é mais prevalentes do

que a CU em países

desenvolvidos.

CU surgiu antes da DC em

países desenvolvidos e é

mais prevalente em países

ainda em desenvolvimento.

Localização da doença

Áreas afetadas

Todo o trato gastrointestinal

(da boca ao ânus)

Cólon, e uma potencial

ileíte.

Padrões de

inflamação

Pode ocorrer inflamação

desigual, inflamação

descontínua

Inflamação contínua na área

afetada (embora as vezes um

trecho cecal separado).

Histopatologia

Penetrância Inflamação transmural em

toda a parede

gastrointestinal

Inflamação restrita a camada

mucosa e submucosa (exceto

na colite fulminante)

Aparência

Parede de cólon espessada

com granulomas, fissuras

profundas e aparência de

paralelepípedos

Arquitetura de cripta

distorcida, com erosões

superficiais e úlceras;

granulomas, se presente,

apenas em torno de criptas

Marcadores

sorológicos

Anticorpos Anti-

Saccharomyces cerevisiae

Anticorpos citoplasmáticos

anti-neutrófilos

Complicações Fístulas, massa abdominal

(tipicamente quadrante

inferior direito), obstruções

colônicas e do intestino

delgado, estomatite

Hematoquezia, passagem de

muco ou pus, colite

fulminante e megacólon

tóxico

Fonte: adaptado de Lange e Barrett (2015).

50

4.2.3 Colite ulcerativa

A CU é uma doença inflamatória difusa não específica de causa

desconhecida que afeta continuamente a mucosa colônica proximal do reto

e muitas vezes forma erosões e/ ou úlceras. (MATSUOKA et al., 2018).

Ocorrem frequentemente ciclos de recidiva e remissão e podem ser

acompanhados de complicações extra-intestinais. Quando ele afeta

amplamente o intestino grosso durante um longo período de tempo,

aumenta o risco de desenvolver câncer (KORNBLUTH; SACHAR, 2010).

Pode variar dependendo da intensidade com que ocorrem, da extensão

e da fase da doença, podendo acometer o cólon de maneiras diferentes ao

longo de sua extensão, simulando um comprometimento segmentar do

órgão (BARBOSA; RODRIGUES, 2012). Na fase inicial, a mucosa é

hiperêmica, apresenta grânulos, com coloração avermelhada e friável,

sangra com facilidade, pouco muco, pode apresentar pontos hemorrágicos

que se tornam purulentos e posteriormente formam ulcerações. As úlceras

estão alinhadas ao eixo do cólon, ilhas isoladas de mucosa formam

protuberâncias criando pseudopólipos, os quais podem se unir e formar

pontes mucosas (BARBOSA; RODRIGUES, 2012; TURNER, 2010).

Na fase aguda, por exemplo, é possível observar a presença de células

inflamatórias como mastócitos, macrófagos, neutrófilos e linfócitos dos

tipos CD4+ e CD8+, os quais pela sua citotoxicidade estão relacionados ao

dano de mucosa (NEUMAN, 2007).

Histologicamente a CU pode ser definida como ativa pela

apresentação de um epitélio danificado, aparecimento de abscessos que

se formam a partir de inflação das glândulas anais de Chiari na região da

criptoglandular pela infiltração de neutrófilos (criptite). Sua cronicidade

pode ser definida pela alteração na morfologia das criptas intestinais,

infiltrado linfoplasmocitário basal e metaplasia das células de Paneth no

cólon (DEROCHE et al., 2014).

Sabe-se que o agravamento da doença ou sua cronicidade pode gerar

uma atrofia de mucosa, tornando-a achatada e lisa, o espessamento mural e

as estenoses não ocorrem, a superfície serosa é normal, porém os

mediadores inflamatórios presentes podem danificar a musculatura e

perturbar a função neuromuscular levando à uma dilatação do cólon e ao

megacólon tóxico (TURNER, 2010).

No estágio inicial da doença ocorre congestão, microabscessos nas

criptas e redução das células caliciformes, as quais são substituídas por

51

células imaturas, devido à agressão e aumento da renovação celular. Sendo

assim as criptas se degeneram, os microabscessos se unem e formam as

ulcerações. Nesse tempo formam-se infiltrados de neutrófilos, linfócitos,

plasmócitos, macrófagos, eosinófilos e mastócitos, esses infiltrados

contribuem para o espessamento da mucosa formando abscessos pericólicos

nos casos exacerbados (BARBOSA; RODRIGUES, 2012).

Hipóteses de que pacientes com CU apresentam um aumento na

permeabilidade do epitélio intestinal, consequência das ulcerações, que

levam a uma diminuição da função de barreira já são descritos na literatura.

Essa diminuição da função de barreira somada a inflamação, contribuem

para a patogênese das DII, por permitirem maior exposição à antígenos e

ativação do sistema imunológico (liberação de citocinas pró-inflamatórias,

como TNF, que induz uma disfunção na barreira epitelial por desregular as

junções oclusivas) (EDELBLUM, 2009; HYUN, 2007).

A homeostase intestinal é delicada, e envolve hospedeiro e microbiota.

O hospedeiro possui mecanismos para controlar o microbioma intestinal e

evitar o desenvolvimento inadequado de inflamação, porém, o sistema

imunológico intestinal requer estimulação dessa microbiota para o

desenvolvimento adequado. Por outro lado, enquanto agentes patogênicos

ativam o sistema imune de mucosa do hospedeiro essas respostas impedem

o excesso de crescimento inadequado e translocação de agentes patogênicos

ou até mesmo micro-organismos do próprio do microbioma, além de

impedir o desenvolvimento de inflamações inapropriadas, resultando e um

estado de equilíbrio que favorece o crescimento de micro-organismos

benéficos e impedindo uma inflamação desnecessária (MCDERMOTT;

HUFFNAGLE, 2014).

4.2.4 Tratamento da Doença Inflamatória Intestinal

Sabendo que a colite ulcerativa é uma doença crônica, a abordagem

terapêutica mais favorável é a terapia piramidal, na qual é utilizado como

base o ácido 5-aminossalicílico (5-ASA) e posteriormente, se necessário,

esteroides e imuno-moduladores, que intensificam a eficácia do tratamento,

tais como o infliximab (IFX), inibidores da calcineurina (ciclosporina A,

tacrolimus) ou procedimentos cirúrgicos, dependendo do grau da doença

(KORNBLUTH; SACHAR, 2010).

O tratamento medicamentoso é focado em induzir a remissão, mantê-

la e favorecer uma nutrição adequada para minimizar as doenças e os efeitos

52

colaterais quem surgem durante o tratamento, a fim de melhorar a qualidade

de vida do paciente. As terapias de manejo tem um enfoque em utilizar a

terapia medicamentosa de forma apropriada otimizando o tempo de cirurgia

(OSTERMAN; LICHTENSTEIN, 2010, p. 1992) (Quadro 1).

Quadro 1 – Terapias medicamentosas na colite ulcerativa conforme o grau da

doença.

Doença grau leve

5-aminosalicilatos

Tópico (colite distal)

Oral (colite distal/ colite extensiva)

Combinação

Doença grau moderado

5-aminosalicilatos



Combinação

Glicocorticoides



Combinação

Azatioprina ou 6-mercaptopurina

Doença grau severo

Glicocorticoides IV

Ciclosporina IV

Infliximab IV

Legenda: IV – intravenoso.

Fonte: adaptado de Osterman; Lichtenstein, 2010, p. 1992.

Existem duas abordagens terapêuticas diferentes conhecidas como

estratégias step-up ou top-down. A primeira tem como método aumentar a

intensidade do tratamento juntamente com a gravidade da doença. A outra,

na tradução literal “de cima para baixo” inclui o início precoce do

tratamento intensivo com terapias biológicas para evitar complicações

futuras (LEE, 2012).

O uso de terapia medicamentosa tem como objetivo atuar no bloqueio

ou ativação de diferentes células, receptores e mediadores que participam da

reação inflamatória, a fim de interromper a inflamação ou até mesmo

manter a remissão da doença, podendo ser usadas as estratégias step-up ou

top-down citadas anteriormente. Seis classes distintas de medicamentos

estão disponíveis para o tratamento das DII: aminossalicilatos, antibióticos,

53

corticoides, tiopurinas, antagonistas do ácido fólico como o metotrexato e

imunobiológicos (SALES-CAMPOS et al., 2015).

Entre os medicamentos mais utilizados estão os aminosalicilatos, mais

conhecidos como ácido 5-aminosalicílico (5-ASA) são utilizados no

tratamento da colite ulcerativa leve a moderada. Inicialmente foi

desenvolvido como terapêutica para a artrite reumatoide e posteriormente

foi descoberta a melhora clínica de pacientes com UC (ABRAHAM;

AHMED; ALI, 2017).

A segurança e eficácia clínica do 5-ASA já são bem conhecidas,

porém seus mecanismos de ação não foram completamente elucidados. A

literatura propõe várias ações anti-inflamatórias dessa classe de

medicamentos, dentre elas a inibição do fator nuclear kappa B (NF-kB) e

redução da biossíntese de prostaglandinas e leucotrienos, além de apresentar

propriedades semelhantes aos anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs).

Alguns autores discutem os efeitos anti-inflamatórios do 5-ASA através da

ativação do receptor-γ ativado por proliferador de peroxisoma do receptor

nuclear (PPARγ), já que este quando expresso em níveis elevados no

epitélio intestinal favorece a manutenção da integridade da mucosa e regula

a resposta inflamatória epitelial (SHIMADA et al., 2004; WANG et al.,

2018).

Devido ao aparecimento de efeitos colaterais (alergias, náuseas entre

outros) foram aperfeiçoados os sistemas de liberação, para liberação do

fármaco e atuação em diferentes áreas do TGI (Quadro 2) (ABRAHAM;

AHMED; ALI, 2017).

54

Quadro 2 – Formulações de administração oral de derivados do Ácido 5-

aminosalicílico

Nome

genérico

Nome

comercial

Formulação Local de

ação

Mesalazina Mezavant® Sistema multi-matriz (MMX)

(liberação a pH ≥ 7.0)

Cólon

Mesalazina Asacol® Comprimidos revestidos com

Eudragit-S (liberação a pH ≥ 7,0)

Íleo terminal,

cólon

Mesalazina Salofalk® Comprimidos revestidos com

Eudragit-S (liberação a pH ≥ 6,0)

Íleo distal,

cólon

Mesalazina Pentasa® Microgrânulos revestidos com

etilcelulose (liberação dependente

do tempo)

Duodeno,

jejuno, íleo,

cólon

Mesalazina Rowasa® Enema Cólon distal

Mesalazina Canasa® Supositório Reto

Mesalazina Pentasa® Microgrânulos revestidos com

etilcelulose de liberação

controlada.

Duodeno ao

cólon

Mesalazina Lialda® Sensível ao pH, revestido com

matriz múltipla e polimetacrilato;

com liberação prolongada.

Íleo distal e

cólon

Olsalazina Dipentum® Dímero de 5-ASA ligado por

ligação azo

Cólon

Sulfasalazina Salazopyrin® 5-ASA ligado a sulfapiridina por

ligação azo

Cólon

Balsalazida - 4-aminobenzoyl β-alanina + 5-

ASA

Cólon

Legenda: 5-ASA – ácido 5-aminosalicílico.

Fonte: adaptado de HAUSO; MARTINSEN; WALDUM, 2015; OSTERMAN;

LICHTENSTEIN, 2010.

Aproximadamente 90% da Sulfasalazina atinge o cólon, e apenas uma

pequena quantidade é absorvida no intestino delgado. Quando atinge o

cólon, a enzima azoredutase, a qual é produzida pelas bactérias colônicas,

quebram a ligação azo para liberar a porção do constituinte ativo 5-ASA.

Quando este é absorvido pelo cólon, 20% do composto passam por uma

acetilação hepática, formando N-acetil 5-ASA e é excretado pela urina. A

sulfasalazina é considerada a primeira linha de terapia por induzir remissão

em pacientes com colite ulcerativa grau leve a moderado (OSTERMAN;

LICHTENSTEIN, 2010).

Porém, o tratamento com a sulfasalazina apresenta efeitos adversos em

cerca de 20% dos indivíduos provocados pelo componente sulfamídico da

molécula. Entre esses efeitos pode-se citar: rash cutâneo, cefaleia, febre,

55

intolerância gástrica, náuseas, hepatotoxicidade, hemólise, agranulocitose,

metahemoglobulinemia, azospermia e deficiência de folato. Alguns desses

efeitos são logo diagnosticados, porém outros necessitam de observação

laboratorial, como é o caso do desenvolvimento de anemia por deficiência

de folato, por exemplo (MISZPUTEN, 2006. p. 125).

Como a sulfassalazina trazia consigo efeitos adversos, os

pesquisadores buscaram nova alternativa de tratamento e criaram um

medicamento somente a base de 5-ASA (mesalazina), porém sua absorção

quase total no intestino delgado proximal obrigou o encapsulamento

acidorresistente que permitisse a chegada ao íleo e cólon. A mesalazina,

assim com a sulfassalazina alcança sua atividade máxima 3 a 4 semanas

após o início do tratamento e também está disponível para uso tópico por

meio de supositórios que fazem com que a substância entre em contato

diretamente com a mucosa auxiliando na inflamação local. Em alguns

pacientes com queixas de grande número de evacuações de muco e/ou

sangue há a indicação de terapia combinada de mesalazina oral e tópica

(MISZPUTEN, 2006. p. 112 e 113).

Os glicocorticoides são divididos em primeira e segunda geração. Na

primeira geração há a prednisona, metilprednisolona e hidrocortisona, que

foram usados para induzir uma remissão inicial na DII. Porém, efeitos

adversos associados a essa classe foram ocorrendo e levaram ao

desenvolvimento da segunda geração de glicocorticoides como a

budesonida, budesonida MMX, dipropionato de beclometasona (DUBOIS-

CAMACHO et al., 2017).

Seu modo de ação é estabelecido por sua capacidade de modular a

resposta imune, isso ocorre pela interação com receptores de

glicocorticoides no núcleo celular inibindo assim a expressão de moléculas

de adesão e a migração de células inflamatórias para o intestino (FORD;

BERNSTEIN, KHAN, 2011).

Os corticóides exógenos são lipofílicos, aumentando assim sua

biodisponibilidade. São ligados à globulina de ligação aos corticosteroides

ou à albumina (em menor grau) e transportados pela corrente sanguínea,

tem a capacidade de se difundir passivamente através das membranas

celulares e interagir com o receptor glicocorticoide (GR). Quando ocorre a

interação com o receptor, o corticosteroide promove sua ação de inibição de

proteínas pró-inflamatórias (NF-kB), regulando a expressão de citocinas e

quimiocinas pró-inflamatórias (IL1-α, IL-1β e IL-8), além de promover a

56

regulação de citocinas suprimem a expressão de mediadores inflamatórios

como TGF-β e IL-10, aumentando a função anti-inflamatória. Além de

inibir a proliferação de linfócitos T e B e promover o perfil de macrófagos

tolerantes (M2) (DUBOIS-CAMACHO et al., 2017).

Já é bem elucidado que uso de corticoides continuamente, mesmo

em baixas doses, causa efeitos adversos como: osteoporose, síndrome

metabólica, doença cardiovascular e aumento de susceptibilidade para

infecções (FORD et al., 2011).

Os imunomoduladores incluem tiopurinas [6-mercaptopurina (6-

MP) e azatioprina (AZA), metotrexato (MTX) e ciclosporina (CSA)]. Há

hipóteses de que essa classe de medicamentos atue inibindo a proliferação

de linfócitos através da agregação de fármacos ativos em nucleotídeos

celulares, resultando em um efeito anti-inflamatório pela supressão das

células T e atividade das células natural killers (REGUEIRO, 2000;

SAHASRANAMAN; HOWARD; ROY, 2008).

As tiopurinas como 6-MP e AZA são fármacos utilizados para manter

a remissão da DC e CU. O AZA é um pró-fármaco de 6-MP, pois é

metabolizado em 6-MP. Ambos são fármacos análogos da tiopurina e

funcionam através do metabolito ativo de 6-tioguanina nucleotídeo (6-

TNG), o qual causa inibição da síntese de DNA e RNA e apoptose das

células T (FREI, 2013). Efeitos colaterais são causados por esses fármacos,

como náuseas, vômitos e dor abdominal, febre, erupção cutânea e artralgia,

sendo o mais severo a supressão da medula óssea (ABRAHAM; AHMED;

ALI, 2017).

O MTX funciona através da inibição de enzimas envolvidas na via

metabólica do ácido fólico. Acredita-se que os efeitos do MTX se dá devido

à inibição da enzima diidrofolato redutase importante na síntese de purinas

e pirimidinas. As doses de MTX utilizada na DII é baixa, resultando na

inibição de vias folato dependentes e independentes causando

imunomodulação e efeitos anti-inflamatório na DII, como o bloqueio na

produção de IL-1, IL-2, IL-6 e IL-8 (VAN DIEREN et al., 2006).

Como efeito colateral o consumo de MTX inclui náusea, vômito,

fadiga, diarreia, leucopenia, fibrose hepática, pneumonia por

hipersensibilidade e teratogenicidade. A suplementação diária de ácido

fólico (1mg/dia) auxilia na redução dos efeitos colaterais. Além disso, é

importante o monitoramento das funções hepáticas durante o tratamento,

bem como rastreamento para hepatite B e C, contagem sanguínea completa,

57

radiografia do tórax, antes do início do tratamento (ABRAHAM; AHMED;

ALI, 2017).

Já a terapia biológica é utilizada em pacientes com doença grave-

moderada que não respondem mais às outras terapias convencionais

(aminossalicilatos, corticosteroides de imunomoduladores) (RUTGEERTS,

et al., 2005; FEAGAN et al., 2013).

O TNF-α é produzido por linfócitos T e macrófagos. A ligação do

TNF-α ao seu receptor leva ao aumento da expressão de citocinas pró-

inflamatórias (OLESEN et al., 2016). Mecanismos como a neutralização

dos anti-TNFs circulante, inibição do TNF ao seu receptor e sinalização

reversa estão envolvidos na eficácia do tratamento com anti-TNF (agentes

biológicos) (BEN-HORIN et al., 2016).

O uso de fármacos que bloqueiam essas citocinas melhorou o

tratamento dessas patologias. Quatro tipos de fármacos anti-TNF-α estão

disponíveis para o tratamento da DII, sendo eles: infliximab, adalimumab e

certolizumab, na DC e infliximab, adalimumab e golimumab, na CU. Com

exceção do certolizumab, os outros são moléculas de imunoglobulina G

(IgG) que se ligam ao TNF- α solúvel e ligado. Já o certolizumab é um

fragmento Fab da imunoglobulina (que se liga ao TNF- α) ligado a uma

molécula de PEG que melhora sua meia-vida (ABRAHAM; AHMED; ALI,

2017).

O TNF-α tem papel fundamental na morte de patógenos intracelulares,

e está associado ao risco de ativação de tuberculose, histoplasmose e

patógenos similares, por tanto são contraindicados em infecções

importantes como pneumonia. Além disso, o nível de clearance dessa classe

de medicamentos se dá a nível reticuloendotelial e sofre influência de

fatores que aumentam o clearance como sexo, índice de massa corporal

(IMC) e a gravidade da inflamação (que pode ser mensurada pelos níveis de

TNF no sangue e no tecido, proteína C reativa (PCR) e calprotectina fecal),

concentrações de albumina, esteroides e imunossupressores concomitantes e

a presença de anticorpos antidroga (MOULD, 2015).

O infliximab (IFX) demonstra benefícios no tratamento da CU,

especialmente quando refratária a terapias convencionais. A utilização de

IFX é feita como terapia de terceira linha ou terapia de resgate

(RUTGEERTS et al., 2005; SANDBORN et al., 2009). É seguro e

tolerável, mas deve-se analisar o risco-benefício devido ao potencial risco

de sérias complicações, entre elas o desenvolvimento de infecções como

58

tuberculose. Sua administração é via intravenosa na dose de indução de 5 –

10mg/kg (semana 0, 2 e 6), passando para 5 – 10 mg/kg (sempre 4 – 8

semanas) na fase de manutenção (CHANG; HANAUER, 2017).

Thorlund e colaboradores (2014), usando uma meta-análise de

comparação de tratamento indireto, compararam a eficácia do adalimumab e

infliximab e concluíram que o infliximab é estatisticamente mais eficaz que

o adalimumab na indução de remissão, resposta e cicatrização da mucosa às

8 semanas de tratamento, o infliximab e o adalimumab são comparáveis em

eficácia às 52 semanas de tratamento de manutenção.

O adalimumab é um anticorpo monoclonal IgG1 recombinante

humano, que quando administrado se liga ao TNF-α solúvel ligado à

membrana. Quando o adalimumab se liga ao TNF- α solúvel e ligado a

membrana ocorre uma citotoxicidade mediada por células anti-dependente,

fixa o complemento e induz apoptose de células T, ocorrendo então melhora

na inflamação envolvida na DII (BILLMEIER et al., 2016; SPARROW,

2017). Administrado subcutâneo com dose de indução de 160 mg na

semana zero e 80 mg na semana 2 e 40 mg na fase de manunteção (sempre

7 – 14 semanas) (CHANG; HANAUER, 2017).

Estudos randomizados controlados colocam que o adalimumab é um

fármaco eficaz na CU, por induzir a remissão e cicatrização da mucosa

(DANESE, 2013). É bem tolerado, mesmo em pacientes que apresentaram

reações de hipersensibilidade ou reações tardias de hipersensibilidade com o

infliximab. A literatura também relata alguns efeitos adversos como

dermatite fúngica e erupção cutânea leve (PEYRIN-BIROULET et al.,

2007).

O golimumab também é um anticorpo monoclonal IgG1 humano. É

utilizado/indicado em casos de CU moderada a severa ativa em pacientes

que não responderam ou tiveram uma resposta inadequada à terapia

convencional (corticosteroides, 6-mercaptopurina ou azatioprina), ou que

são intolerantes ou possuem contraindicações médicas para tais terapias

(FLAMANT; PAUL; ROBLIN, 2017). Esse fármaco é administrado via

subcutâneo, na fase de indução utiliza-se doses de 200 mg na semana zero,

100 mg na semana 2 e 100 mg na fase de manunteção após 4 semanas

(CHANG; HANAUER, 2017).

O tratamento com golimumab é seguro e bem tolerado, o efeito

adverso frequentemente relatado é o eritema no local da aplicação. Outros

como infecções oportunistas, tuberculose, adenocarcinomas do reto, tireoide

59

e pulmão foram relatados na literatura e precisam de maiores investigações

(SANDBORN et al., 2014).

Kawalec e Pilc (2016) realizam uma revisão sistemática da literatura

de comparação do infliximab com adalimumab ou golimumab e relataram

que infliximab e golimumab tiveram eficácias semelhantes e até mesmo

foram mais eficaz que o adalimumab na fase de indução, mas na fase de

manutenção não se observou diferença significativa entre esses três

fármacos anti-TNF-α.

Um ponto importante para se levar em consideração na terapia

biológica é seu custo. Há a necessidade de se verificar a relação custo-

benefício dessa terapia em comparação a uma terapia convencional

(DANESE, 2013).

Além disso, a escolha do tratamento deve ser feita junto com o

paciente, pois pode depender da via de administração e sua preferência. É

importante um monitoramento do indivíduo, através de exames sanguíneos

prévios para se determinar a terapia mais adequada, já que uma grande

parcela não se beneficia de alguns fármacos envolvidos na terapia da DII,

podendo então se beneficiar de terapias novas como as anti-integrinas

(FLAMANT; PAUL; ROBLIN, 2017).

As DII como já bem elucidado, envolvem o recrutamento persistentes

de leucócitos no tecido intestinal, bem como uma ativação desregulada da

função das células imunes. As integrinas (a4) são moléculas que medeiam a

infiltração do TGI pelas células T de memória, que se ligam no sítio da

mucosa na molécula de adesão celular 1 (MAdCAM-1) nas células

endoteliais. Sendo assim, o bloqueio dessa via parece promissor na

diminuição da inflamação intestinal, tornando-se assim um alvo terapêutico

para a DII (XAVIER; PODOLSKY, 2007). Essa classe é utilizada em

pacientes que não responderam as terapias anteriores de imunomoduladores

ou anti-TNF-α, por intolerância, não resposta ou perda de resposta a terapia

(ABRAHAM; AHMED; ALI, 2017).

Dentre as anti-integrinas estão o Natalizumab e o Vedolizumab, sendo

diferentes em modo de ação. O natalizumab é um anticorpo monoclonal

IgG4 humano que bloqueia a adesão e migração de leucócitos para o

intestino pela ligação da integrina a4 (SOLER et al., 2009). Os efeitos

colaterais envolvidos incluem cefaléias, náuseas, dor abdominal,

nasofaringite, tonturas e fadiga (TARGAN et al., 2007).

60

O Vedolizumab é um anticorpo monoclonal humano IgG. Ele faz a

ligação com a integrina α4β7, bloqueando sua interação com a molécula de

adesão celular-1 da mucosa (MAdCAM-1), ao inibir essa ligação o fármaco

bloqueia a migração de um subgrupo de linfócitos T gut-homing de

memória para o intestino inflamado (SOLER et al., 2009; ABRAHAM;

AHMED; ALI, 2017). Entre os efeitos colaterais desenvolvidos no uso de

Vedolizumab estão nasofaringite, artralgia, cefaleia, febre, náusea, dor

abdominal, infecções do trato respiratório superior e fadiga (WANG et al.,

2014).

Por outro lado, a utilização de plantas para fins terapêuticos é antiga, e

por muitos anos os produtos minerais oriundo de plantas e animais foram a

base do tratamento para diversas enfermidades. Historicamente, as plantas

medicinais são importantes na descoberta de novos fármacos (BRASIL,

2012).

O termo fitoterapia foi utilizado para caracterizar a prática de uso de

medicamentos cujos consitutuíntes ativos são plantas ou derivados vegetais

e tem como base o conhecimento popular (DE PASQUALE, 1984;

BRASIL, 2012).

No Brasil, a utilização de plantas para fins medicinais iniciou com os

povos indígenas e foi influenciada pelas culturas portuguesas e africanas

tornando-se assim uma cultura popular. Com isso, houve a necessidade de

regulamentação do uso de plantas medicinais e fitoterápicos (TEIXEIRA et

al., 2018).

A Organização Mundial da Saúde (OMS) criou o Programa de

Medicina Tradicional nos anos 70, a fim de incentivar políticas públicas

nacionais e internacionais no uso da Medicina Tradicional e Medicina

Complementar e Alternativa (MT/MCA). No Brasil, em acordo com as

recomendações da OMS, foi aprovada em 2006, a Política Nacional de

Práticas Integrativas e Complementares no Sistema Único de Saúde (SUS)

(PNPIC), a qual define diretriz e responsabilidades institucionais para

implantar/adequar as ações e serviços de medicina tradicional

chinesa/acupuntura, homeopatia, plantas medicinais e fitoterapia, entre

outras terapias, sendo que o uso de plantas medicinais e fitoterapia são as

práticas mais presentes no SUS (BRASIL, 2012).

Nesse processo, a indústria farmacêutica foi beneficiada pelo

conhecimento e uso popular de plantas, elaborando diversos tipos de

produtos, como os medicamentos fitoterápicos e os produtos tradicionais

61

fitoterápicos. Os medicamentos fitoterápicos (MF) são obtidos empregando

exclusivamente matérias-primas ativas vegetais, onde sua eficácia e riscos

de seu uso são conhecidos e pela constância de sua qualidade. Não se

considera MF aquele que inclui substâncias ativas isoladas na sua

composição e nem associação destas com extratos vegetais. É considerado

produto tradicional fitoterápico (PTF), aquele que emprega exclusivamente

matérias-primas vegetais, e que sua segurança e efetividade esteja baseada

no longo histórico de utilização demonstrado em documentação técnico-

científica, sem evidências conhecidas ou informadas de risco à saúde e que

seja caracterizado pela constância de sua qualidade (BRASIL, 2014).

A identificação de substâncias que podem promover a resolução de

inflamação, por exemplo, que seja eficiente e bem tolerada pelo organismo

é de fundamental importância. Medicinas tradicionais, como a Ayurveda e a

Medicina Tradicional Chinesa utilizam há séculos extratos medicinais, os

quais fornecem um excelente potencial terapêutico para a indústria

farmacêutica. O uso de plantas medicinais para tratar doenças crônicas,

como a DII, está em ascensão, pois as plantas são fontes de produtos

bioativos, fácil acesso e baixo custo (BALUNAS; KINGHORN, 2005;

RECIO; ANDÚJAR; RÍOS, 2012).

Estudos demonstraram os efeitos benéficos de vários compostos com

propriedades antioxidantes presentes em alimentos e plantas medicinais em

modelos experimentais de colite, incluindo flavonoides como a quercetina,

rutosídeo, silimarina, morina, diosmina, hesperidina, além do tempol e da

vitamina E (CRESPO et al, 1999; GÁLVEZ et al, 2001; GONZÁLEZ et al,

2001; SANCHEZ et al, 2002).

A atividade antioxidante destes produtos se dá devido à sua

capacidade de eliminar os radicais livres, tais como o hidroxil e superóxido,

e quelar os íons metálicos (BAZYLKO et al., 2014). As propriedades

antioxidantes de alimentos e bebidas têm atraído intensa pesquisa e

interesse comercial devido à importância amplamente aceita de

antioxidantes dietéticos no repertório de defesa contra dano oxidativo

tecidual e celular, juntamente com complexos mecanismos de defesa

enzimática (CASTRO; FREEMAN, 2001).

Considerando, os inconvenientes do tratamento da DII atualmente, tais

como, baixo índice de remissão quando utilizado aminossalicilatos e efeitos

lesivos apresentados pelo uso ou dependência de esteroides, torna-se

evidente a necessidade de pesquisa por novos tratamentos para as DII, mais

62

efetivos e apresentando menos efeitos colaterais (AWAADI; EL-MELIGY;

SOLIMAN, 2013).

Estudos clínicos, envolvendo plantas medicinais como Aloe vera,

Artemisia absinthium e Triticum aestivum, revelaram remissão e melhora

clínica em pacientes com DII, com redução no índice de atividade da

doença e escores histológicos (Tabela 2).

Tabela 2 - Evidências clínicas do uso de plantas medicinais na Colite Ulcerativa.

Planta Parte

utilizada

Número

de

pacientes

Resultados Referências

Aloe vera Gel 44 Remissão clínica, índice

de atividade da doença e

escore histológico.

Langmead et

al. 2004.

Angelica

sinensis Extrato 64 Ativação plaquetária,

alívio da lesão de

células endoteliais

vasculares, melhora da

microcirculação em

comparação com a

terapia de rotina.

Dong et al.

2004.

Triticum

aestivum Suco da

grama

23 Redução significativa

do índice de atividade

da doença, redução da

severidade do

sangramento retal, sem

efeitos colaterais.

Ben-Arye et

al., 2002.

Boswellia

serrata Goma-

resina

30 Eficácia comparada

com a sulfasalazina na

taxa de remissão,

melhora da qualidade

das fezes e

histopatologia.

Gupta et al.

2001.

Plantago

ovata Sementes 105 Tão eficaz quanto a

mesalazina na

manutenção da

remissão.

Fernandez-

banares et al.

1999.

Oenothera

biennis Óleo 43 Melhora na consistência

das fezes, mas não na

frequência, sangramento

retal, recidiva da

doença, aparência

sigmoidoscópica ou

histologia retal.

Greenfield et

al., 1993.

Fonte: adaptado de Rahimi, Mozaffari e Abdollahi (2008).

63

Mundialmente, as terapias alternativas como as plantas medicinais são

conhecidas e seu uso bem aceito. Os benefícios potenciais dos

medicamentos fitoterápicos envolvem a sua eficácia, segurança e baixo

custo. As evidências que sugerem benefícios do uso de fitoterápicos no

manejo das DII, em especial a CU, ainda são parciais. Primeiramente deve-

se conhecer muito bem a composição da planta, compostos ativos que

conferem propriedades, efeitos colaterais e toxicidade. Outro ponto

importante é a colheita da planta correta, qualidade e processamento para

garantir a preservação de tais compostos. Há também a necessidade de

ensaios clínicos controlados, com um número de indivíduos maior para se

avaliar eficácia e toxicidade do fitoterápico a ser estudado (ALGIERI et al.,

2015).

Com relação à planta desta pesquisa, a OMS aponta no relatório de

avaliação de certos aditivos alimentares que o extrato de T. erecta apresenta

baixa toxicidade em estudos em animais, os ésteres de luteína presentes no

extrato não apresentam atividade mutagênica ou genotóxicas em ensaios

celulares, e não apresentou efeitos adversos em humanos (OMS, 2014).

4.3 Tagetes erecta L.

O gênero Tagetes pertence à família Compositae, conhecido como

Asteraceae, e compreende cerca de trinta espécies de plantas anuais ou

perenes fortemente perfumadas. Tagetes são nativas do Arizona e Novo

México até a Argentina. Os gêneros cultivados incluem T. erecta, conhecida

por calêndula africana, T. patula, popularmente conhecida por calêndula

francesa, T. erecta×patula, comumente conhecida como calêndula

triplóides, e T. tenuifolia também conhecido como T. signata ou calêndula

sinete (HAUPTMANN; WINNER; BLOWERS, 2001), já no Brasil é

conhecida como cravo de defunto.

Essas plantas podem chegar até 180 cm de altura, glabra, com caule e

galhos angulares para arredondados. A inflorescência tem uma cabeça

terminal solitária, 2-12 cm em diâmetros, com pedúnculo 3-12 cm de

comprimento, ápice mais ou menos inchado, oco. Em alguns locais a T.

erecta e a T. patula são sinônimos, porém são espécies distintas

(SETSHOGO, 2005) (Figura 5).

64

A T. erecta é muito usada como planta ornamental mundialmente,

sendo fonte de inúmeros corantes naturais e outros produtos bioativos de

bastante interesse (PICCAGLIA; MAROTTI; GRANDI, 1998).

Na medicina popular, algumas espécies de Tagetes tem sido

amplamente usadas em infusões e unguentos de suas pétalas devido à

atividades terapêuticas como anti-mutagênica, anti-inflamatória, antiviral e

imunoestimulante (GONZALES DE MEJIA; LOARCA-PINA; RAMOS-

GOMEZ, 1997; HAMBURGUER et al., 2003). Mollik et al. (2010)

levantaram o uso de diversas plantas medicinais no distrito de Bargerhat em

Bangladesh e citam o uso popular da T. erecta L. para distúrbios

gastrintestinais (diarreia, indigestão, cólica, acidez, constipação, inchaço,

falta de apetite, dor de estômago), problemas renais, cicatrização de feridas

(redução de sangramento e infecções), diurética, problemas de pele

(eczema, acne, coceira, dermatite, entre outras), sedativo e adstringente.

De fato, a planta inteira de T. erecta tem sido considerada

medicinal devido ao uso popular relatado em literatura como anti-

helmíntica, digestiva, diurética e sedativa. Desta forma a infusão da planta é

indicada para tratar, indigestão, cólica, constipação severa e desinterias.

Além disso, em países como a África as raízes são consumidas com outra

planta, conhecida como Telfairia pedata (Sm, ex Sims) Hook.), para alívio

de dores no órgãos sexuais. Nas Ilhas Maurícios a decocção das flores é

utilizada contra icterícia (SETSHOGO, 2005).

Um estudo pré-clinico relatou as propriedades antioxidantes (in vitro)

e analgésicas (in vivo) do extrato bruto comercialmente disponível de flores

de T. erecta, e concluíram que há uma atividade antioxidante significativa

em vários sistemas oxidativos in vitro. Vários mecanismos antioxidantes

podem ser atribuídos, como a inibição de produção de radicais livres, a

capacidade redutora e a forte capacidade de doação de hidrogênio. O estudo

também reforça o uso da planta como analgésico (BASHIR; GILANI,

2008).

Com relação aos aspectos fitoquímicos das espécies de Tagetes, a

literatura cita classes de metabólitos secundárias como flavonoides, esteróis,

carotenoides, saponinas, álcoois triterpenos, polissacarídeos, princípios

amargos, mucilagem e resina (JACOBS et al., 1994; PICCAGLIY;

MAROTTI; GRANDI, 1998).

65

Suas pétalas são ricas em luteína e ésteres de luteína, sendo usada

como aditivos alimentares devido à sua capacidade de pigmentação

(PICCAGLIA; MAROTTI; GRANDI, 1998).

Figura 5 - Tagetes erecta L.

Fonte: adaptado de Jardim de Calateia. <http://jardimdecalateia.com.br/acervo-

botanico/tagetes-erecta-cravo-de-defunto/>. Acesso em: 27/03/2018.

Os carotenoides, como a luteína e zeaxantina, são os compostos de

interesse no extrato da flor de T. erecta L. Os ésteres de luteína do extrato

seco de T. erecta são eficientemente absorvidos de forma sistêmica

desempenhando importantes funções biológicas (HADDEN et al., 1999).

Sobre patentes, a T. erecta possui um pequeno número de patentes

relacionadas, sendo que os Estados Unidos e o México detêm o maior

número de patentes publicadas e o Brasil apenas três. Isso traz uma boa

relevância na inovação tecnológica na aplicação dessa planta para saúde

(EVANGELISTA et al., 2015).

4.3.1 Luteína

A luteína é um dihidroxi carotenoide, ou também xantofila. Sua

estrutura é composta por uma longa cadeia de carbonos, com ligações

simples e duplas entre carbonos alternados e com grupos metis laterais. Nas

extremidades do esqueleto de carbono a molécula contem estruturas cíclicas

de hexenos com um grupo hidroxil ligado. Sua fórmula molecular é

C40H52O2. Esse sistema conjugado de dupla ligação determina as

propriedades fotoquímicas e a reatividade química que dão as funções

66

biológicas básicas dos carotenoides, como atividades antioxidantes

(BRITTON, 1995; KIJLSTRA et al., 2012) (Figura 6).

Figura 6 – Estrutura química da luteína.

OH

OH

17'

Fonte: o autor.

O poder antioxidante da luteína é atribuído à dupla ligação de

carbonos conjugados, a qual permite a eliminação de radicais livres, como o

oxigênio singlete. A reação transfere energia, ou seja, a energia liberada do

oxigênio singlete é absorvida pela cadeia de carotenoides o que resulta na

formação do estado triplete de carotenoides, o qual pode retornar para seu

estado fundamental estável liberando o excesso de energia proveniente do

oxigênio singlete na forma de calor (SUN et al., 2015).

A síntese de xantofilas só ocorre em plantas, algas, bactérias e certos

fungos. Os seres humanos não conseguem sintetizá-las e sua absorção

depende do consumo via alimento (frutas, vegetais, ovos) (CALVO, 2005).

Esses compostos tem chamado atenção da ciência devida sua atividade

antimutagênica, efeito sobre a degeneração macular, a qual causa cegueira

irreversível em idosos, e também por sua função no aumento da imunidade

(TSAO, 2004).

Há muitos anos os estudos elucidam os diferentes tipos de alimentos e

seus potenciais antioxidantes. Esses antioxidantes dietéticos desempenham

ações importantes no corpo humano, combatendo o estresse oxidativo e

auxiliando na prevenção de doenças crônicas. Muitas dessas substâncias

foram descobertas e isoladas a partir de ervas, especiarias e vegetais. O

tecido das plantas contém diferentes tipos de compostos antioxidantes

(tocoferóis, carotenoides e compostos fenólicos) (CÖMERT; GÖKMEN,

2018). Os antioxidantes foram agrupados como vitaminas (ácido ascórbico,

tocoferóis), carotenoides (taninos condensados, xantofilas e carotenos),

flavonoides (flavonas, isoflavonas, flavonóis, flavanois, flavanonas), ácidos

67

fenólicos (ácido hidroxil-benzoixo e hidroxil-ácido cinâmico), álcoois

fenólicos, stilbenos, lignanas, taninos, antioxidantes contendo enxofre e

compostos neoformados (melanoidinas) (CÖMERT; GÖKMEN, 2018).

Os carotenoides são responsáveis pelas cores amarelo e laranja em

plantas, animais, bactérias e fungos. A biossíntese desses carotenoides tem

sido amplamente estudada (BENÍTEZ-GARCÍA et al., 2014), por

exercerem diversas funções biológicas. São componentes essenciais para a

fotossíntese, proteção e produção de fito hormônios. Nos animais

promovem a saúde em função da sua atividade antioxidante, anti-

inflamatória e melhora da resposta imunológica (RAO; RAO, 2007; RUIZ-

SOLA; RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, 2012; WOODSIDE et al., 2015).

No organismo, após sua ingestão, os carotenoides são incorporados

nas micelas e absorvidas prontamente pelas células da mucosa do intestino

delgado. Na mucosa intestinal o β-caroteno e outros carotenoides pró-

vitamina A são parcialmente convertidas em vitamina A e parcialmente

como ésteres retinílicos. Após, ambos são “embalados” em quilomícrons

para alcançarem o sistema linfático e serem transportado para a corrente

sanguínea para desempenhar seu papel anti-inflamatório e antioxidante

(PARKER, 1996; WOODSIDE et al., 2015).

A inflamação, sob condições normais, é um mecanismo tecidual de

proteção contra danos endógenos e exógenos. Durante esse processo,

diversas células do sistema imunológico são recrutadas (macrófagos e

leucócitos), isso resulta em uma produção exacerbada de espécies reativas

de oxigênio (EROS ou ROS, do inglês Reactive Oxygen Species), gerando

um estresse oxidativo e dano de biomoléculas importantes (proteínas,

DNA). Esse processo gera também mediadores como citocinas, quimiocinas

e metabólitos do ácido araquidônico (prostaglandinas) que recrutam ainda

mais macrófagos que são importantes componentes na ativação de cascatas

de transdução de sinal e fatores de transcrição como NF-kB ou Nrf2. Essa

ativação resulta em respostas ao estresse celular, e como consequência a

produção de ciclooxigenase 2 (COX-2), óxido nítrico sintase induzível

(iNOS), quimiocinas e citocinas (KAULMANN; BOHN, 2014).

Estudos demonstram que os carotenoides podem influenciar vias

envolvidas no processo inflamatório, através da interação com resíduos de

cisteína das subunidades IKK ou NF-kB e inativar a via NF-κB; interagir

com Keap1 ao mudar suas propriedades físicas; e ainda não bem

68

esclarecidos com a vias das proteínas quinases ativadas (MAPK)

(KAULMANN; BOHN, 2014).

Por esse motivo, há um interesse da indústria farmacêutica para seu

uso não apenas como corantes alimentares naturais, mas em prol da nutrição

e melhora da saúde humana, sendo sua ingestão associada à menor

incidência de câncer e doenças cardiovasculares, as quais tem a inflamação

crônica como fator importante (BENÍTEZ-GARCÍA et al., 2014).

Além de ser encontrada em frutas e vegetais a luteína está presente

também em flores, sendo as flores da Marigold a fonte natural mais

abundante de luteína comercial. Porém a forma de apresentação da luteína

nessa espécie é esterificada com metade do peso correspondente a ácidos

graxos (CAMPO; GARCÍA-GONZÁLEZ; GUERRERO, 2007) e, portanto,

a saponificação química é necessária no processo de extração. Nas pétalas

de Marigold, os ésteres de ácidos graxos se acumulam em concentrações de

3 – 6 mg/ g (PICCAGLIA; MAROTTI; GRANDI, 1998).

A extração de luteína para a comercialização envolve quatro etapas:

cultivo, pré-tratamento, processamento e processamento fino das flores de

T. erecta anualmente de julho a outubro, e varia de acordo com a região. As

flores frescas, que são matérias-primas para luteína, são colhidas e enviadas

para fábricas de processamento. O método de ensilagem (fermentação

anaeróbica) foi aplicado pela primeira vez para preservar as flores frescas

por um ano inteiro. Após a ensilagem, as flores são desidratadas, secas e

trituradas para fazer grânulos de calêndula, que é o primeiro produto bruto

de luteína. Os grânulos de marigold são então extraídos para produzir um

segundo produto: oleoresina de marigold ou oleoresina de luteína.

Finalmente, a luteína com pureza requerida é obtida por meio de

saponificação e purificação de oleoresina de marigold (LIN; LEE; CHANG,

2015).

O pó de óleoresina ou os extratos das flores são usados como

alimentação de frangos para melhoramento da cor da gema dos ovos

(TYCZKOWSKI; HAMILTON, 1986), mas também são utilizados como

nutracêuticos (SANDMANN, 2014). Além disso, a extração a partir da

Marigold torna-se cara, por ser limitada as estações do ano, área de plantio

e mão de obra de alto custo (TSAO, 2004; SUN et al., 2015).

A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) define

alimento funcional como alimentos ou ingredientes que produzem efeitos

benéficos à saúde, além de suas funções nutricionais básicas (ANVISA,

69

2018). É importante ressaltar que alimentos funcionais não curam doenças,

mas sim auxiliam no tratamento e na prevenção, sendo de extrema

importância a inclusão dos mesmos na rotina alimentar diária (VIDAL et

al., 2012).

Dentre os alimentos funcionais, destacam-se os ácidos graxos ômega –

3 (ácido graxo eicosapentaenóico (EPA) e docosaexaenóico (DHA), fibras

alimentares (beta glucana, dextrina resistente, frutooligossacarídeos, goma

guar, inulina, lactulose, polidextrose, psyllium, quitosana), fitoesterois,

poliois, probióticos, proteína da soja e os carotenoides (luteína e

zeaxantina). A luteína é considerada um alimento funcional por ter ação

antioxidante que protege as células contra os radicais livres, sendo que seu

consumo deve estar associado a uma alimentação equilibrada e hábitos de

vida saudáveis (ANVISA, 2018) (Quadro 16).

Quadro 3 - Luteína com alegação de propriedade funcional.

Fonte: ANVISA. Disponível em: < goo.gl/AtV5P6>. Acesso em: 28/03/2018.

Há sessenta e seis registros no site da ANVISA (2018), todos

registrados como alimento com alegação de propriedade funcional, sempre

combinados com outros componentes (vitaminas, minerais, óleo de peixe) e

apresentados na forma de cápsulas, comprimidos e pós.

70

Como já citado, essa xantofila é encontrada em frutas e vegetais de

coloração alaranjados, amarelados e esverdeados como couve, espinafre,

brócolis, ervilha, alface e também na gema do ovo (Quadro 17). Esta última

é considerada a melhor fonte de luteína, em comparação com os vegetais,

devido a sua melhor biodisponibilidade pelo alto teor de gordura presente

nos ovos. É encontrada na forma esterificada com quantidades mínimas de

licopeno e β-caroteno (ABDEL-AAL et al., 2013).

Tabela 3 – Teor de luteína nos alimentos.

Alimento Luteína (mg.100g-1

)

Couve 15,0

Salsa 10,82

Espinafre 9,20

Abóbora 2,40

Brócolis 1,50

Gema de ovo 1,274 – 2,478

Ervilha 0,72

Vagem 0,42

Laranja 0,35

Alface 0,17

Tangerina 0,07

Milho 0,02

Nectarina 0,02

Papaia 0,02

Pêssego 0,02 Fonte: adaptado de Stringheta et al. (2006) e Schlatterer e Breithaupt (2006).

A absorção dos carotenoides via alimentação depende de alguns

fatores como: a natureza da matriz alimentar (se é in natura, cozido ou em

forma de suplemento); a quantidade e qualidade da gordura dietética (que

vai auxiliar na solubilização de carotenoides); os fosfolipídios; presença de

fibra alimentar. Além disso, a absorção do carotenoide liberado do alimento

inclui etapas como emulsão gástrica a ser incorporado em gotículas

lipídicas; transferência para micelas mistas envolvendo sais biliares,

fosfolipídios biliares, lipídios dietéticos e outros. Os carotenóides

solubilizados são então absorvidos pela célula intestinal para serem

transportados para a corrente sanguínea. Estas etapas podem incluir difusão

simples, captação por micelas e receptor mediada e outro transportador. A

maior concentração de carotenóides nas micelas (ou seja, solubilização),

71

corresponde a maior absorção e transporte para o plasma (ABDEL-AAL et

al., 2013).

Nos alimentos in natura, como frutas e hortaliças, a estrutura celular e

a complexação com proteínas conferem a luteína e outros carotenoides

alguma estabilidade. Já quando esses alimentos sofrem algum tipo de

processamento essa estrutura pode ser rompida e então a luteína é exposta

aos produtos da peroxidação lipídica e as lipoxigenases, podendo ocorrer

rápida perda de coloração e função biológica (STRINGHETA et al. 2006).

A degradação de carotenoides em frutas e vegetais é uma questão

importante devido à perda. Mais atenção deve ser dada ao controle da

degradação dos isômeros da geometria dos carotenoides, e para melhorar a

qualidade dos mesmos da dieta. As mudanças de cor durante a isomerização

geométrica dos carotenoides, o processamento térmico e até mesmo o

amadurecimento dos frutos têm sido amplamente estudados. No entanto,

ainda há falta de informação sobre as rotas químicas e cinéticas das

mudanças de cor durante a degradação e isomerização dos carotenoides.

(KHOO et al., 2011). Sendo assim, o consumo de carotenoides deve ser

diário, fazendo parte de uma dieta saudável e prática regular de atividade

física.

4.4 Modelos experimentais de doença inflamatória intestinal

Modelos experimentais animais são ferramentas indispensáveis para

elucidar os mecanismos envolvidos na patogênese das DII. Além disso, as

pesquisas em animais auxiliam em buscas de novas estratégias terapêuticas,

bem como a definição de segurança e eficácia de novos fármacos e

compostos bioativos. Existem diversos modelos experimentais, cada um

possui vantagens e desvantagens, elucidam questões diferentes e podem ser

usados em diferentes estudos conforme os objetivos buscados

(MIZOGUCHI; NGUYEN; LOW, 2013).

4.4.1 Colite induzida por dextrano sulfato de sódio (DSS)

O DSS é um polissacarídeo sulfatado com carga negativa, solúvel em

água, com um peso molecular altamente variável variando de 5 a 1400 kDa.

A colite, em camundongos, mais grave, que se parece mais à UC humana,

resulta da administração de DSS 40-50 kDa em água. O mecanismo pelo

qual o DSS induz inflamação intestinal não é claro, mas provavelmente é o

resultado de danos à camada monoclonal epitelial que reveste o intestino

72

grosso, permitindo a disseminação de conteúdos intestinais pró-

inflamatórios (por exemplo, bactérias e seus produtos) no tecido subjacente

(Figura 7). O modelo de colite DSS é muito popular na pesquisa de DII

devido à sua rapidez, simplicidade, reprodutibilidade e controle. Modelos

agudos, crônicos e recidivantes de inflamação intestinal podem ser

alcançados modificando a concentração de DSS e a frequência de

administração (CHASSAING et al., 2014).

Figura 7 – Danos causados por DSS no epitélio intestinal de camundongos.

Fonte: adaptado de Chassaing et al. (2014).

73

Após o primeiro dia de tratamento com o DSS, já há a indução de

sinais clínicos de doença por alterações na expressão de proteínas de junção

apertada e aumento na expressão de citocinas pró-inflamatórias. Com o

passar dos dias, segue-se sintomas mais graves como aumento da

permeabilidade intestinal, sangramento intestinal e até óbito (CHASSAING

et al., 2014).

Por possuir carga altamente negativa, contribuída por grupos de

sulfato, gera toxicidade para o epitélio colônico e induz erosões que

comprometem a integridade da barreira resultando, consequentemente, em

aumento da permeabilidade epitelial do cólon. Por também possui

propriedade anticoagulante agrava o sangramento intestinal. O mecanismo

pelo qual o DSS passa através das células epiteliais da mucosa permanece

obscuro, mas sugere-se que o DSS induz colite em camundongos formando

nano-lipocomplexos com ácidos graxos de cadeia média no cólon

(LAROUI et al., 2012). A especificidade do DSS para o cólon pode ser uma

função da absorção de água e eletrólitos na presença de numerosas bactérias

(CHASSAING et al., 2014).

A migração transepitelial de neutrófilos (criptite) e a migração

extensiva de neutrófilos através do epitélio da mucosa e no lúmen da cripta

são comumente associadas à DII humana, mas ocasionalmente relatadas em

patologia induzida por DSS. A colite DSS crônica resulta em infiltração de

leucócitos mononucleares, desordem da arquitetura cripta e um alargamento

do fosso entre a base da cripta e muscular com linfocitose mucosa profunda

também sendo comumente associada. (CHASSAING et al., 2014).

4.4.2 Colite induzida por Oxazolona

A administração via retal de oxazolona com etanol em animais resulta

em colite aguda. A condição é caracterizada por uma resposta imune T-

helper2 (Th2) com aumento da produção de interleucina 4 (IL-4) e

interleucina 5 (IL-5), bem como células natural killer (NK) e suas citocinas,

principalmente a IL-13. Esse processo acompanha perda de peso corporal,

diarreia, úlceras e perda de células epiteliais no intestino grosso

(MIZOGUCHI; NGUYEN; LOW, 2013).

As células NK são ativadas por glicolipídios, e medeiam a toxicidade

por meio da atividade citotóxica dirigida a células epiteliais que são alvos e

portadoras de antígeno glicolipídico. Em uma via alternativa, as NL mediam

o dano tecidual pela produção de IL-13, a qual afeta as tight junctions e

74

consequentemente causando danos na barreira epitelial (KIESLER; FUSS;

STROBER, 2015).

4.4.3 Colite induzida por ácido acético

A indução de colite ulcerativa por ácido acético tem por objetivo criar

um dano químico ao epitélio da mucosa, induzindo um fenótipo transitório

mimetizando a DII, através de ulceração do cólon distal e criptas anormais.

É feita por meio de enemas com concentração de ácido acético em torno de

4% por 15 a 30 segundos de exposição, após isso é realizada a lavagem com

solução salina três vezes. Suas vantagens estão o baixo custo e facilidade de

administração (MACPHERSON; PFEIFFER, 1978; ELSON et al., 1995).

4.4.4 Colite induzida por Salmonella

A Salmonella typhimurium e a Salmonella dublin são bactérias gram-

negativas, consideradas patógenos bacterianos entéricos, tem origem

alimentar e podem causar doenças intestinais. Esses patógenos, causam uma

inflamação inicial com características histopatológicas semelhantes à CU

humana, incluindo perda de cripta epitelial, erosão e infiltração neutrofílica.

Essa metodologia geralmente resulta em infecção sistêmica dentro de 5 a 7

dias após a infecção, sendo um modelo interessante para estudar a fase

aguda, mas não crônica, da colite ulcerativa (MIZOGUCHI; NGUYEN;

LOW, 2013).

4.4.5 Colite Induzida por Escherichia coli aderente e invasiva

A bactéria comensal Escherichia coli aderente-invasiva, pode se aderir

tanto nas células epiteliais do intestino delgado quanto do grosso. A indução

utilizando essa metodologia requer danos epiteliais leves, com o uso de DSS

em doses baixas, durante todo o curso da infecção. A mimetização da CU

humana se dá pela perda de peso corporal, presença de sangue nas fezes e

infiltração neutrofílica no cólon (BOUDEAU et al., 1999; MIZOGUCHI ,

2006; JENSEN et al., 2011; LOW et al., 2013; NAGATANI; WANG;

LLADO, 2012).

4.4.6 Colite Induzida por administração de Ácido Trinitrobenzeno

Sulfônico (TNBS)

A administração intrarretal de TNBS induz colite causada por resposta

imune mediada por Th1 e por infiltração na lâmina própria por células T

75

CD4+, neutrófilos e macrófagos, isso ocorre devido ao TNBS tornar as

proteínas colônicas imunogênica ao sistema imune do hospedeiro. Mimetiza

a DII por desencadear sintomas como perda de peso, diarreia grave e

prolapso retal (KIESLER; FUSS; STROBER, 2015; NEURATH et al.,

1995).

4.4.7 Colite induzida por modificação genética – modelos knockout

A colite ulcerativa induzida em modelos konckout se deu pela

importância de vários fatores genéticos na patogênese da doença. O modelo

mais estudado é o da deficiência da IL-10, devido à importância anti-

inflamatória dessa citocina. Com o avanço das pesquisas, pode-se

identificar que polimorfismos genéticos no locus IL-10 aumentam o risco

do desenvolvimento de CU. Camundongos knockout em IL-10 (IL-10-/-

)

desenvolvem uma inflamação espontânea no cólon caracterizada pela

presença de linfócitos, macrófagos e neutrófilos. Inicialmente, essa

inflamação é causada uma resposta pró-inflamatórias de células como Th1

(KIESLER; FUSS; STROBER, 2015).

77

5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1 Obtenção do extrato

O extrato seco de T. erecta. (ESTE) foi obtido comercialmente da

empresa fornecedora de insumos farmacêuticos Pharmanostra (Lote n0

16E10-B019-005810).

5.2 Análise fitoquímica

5.2.1 Determinação de luteína através de espectroscopia por ressonância

magnética nuclear

O extrato hidroetanólico de T. erecta (50 mg) foi submetido à

microextração assistida por um banho de ultrassom, utilizando-se CDCl3 -

TMS (2,2 µmol/ml) como solvente (4 x 250 µl, 5 min cada). Todos os

extratos foram combinados e filtrados através de um filtro de membrana de

0,22 µm para um tubo de RMN de 5 mm. O espectro de 1H RMN foi

adquirido num espectro Brucker AC 300 a 25 °C, operando a 300 MHz. Os

dados foram processados usando o software BRUKER TopSpin 2.1. O

espectro foi manualmente defasado e corrigido na linha de base. TMS

(tetrametilsilano) foi usado como padrão interno. No total, 32 varreduras

foram acumuladas com pulso de 90°, usando um tempo de relaxamento de

300 s. As análises de extração e RMN foram realizadas em triplicata.

Para a estimativa da luteína, o sinal em δ 0,99 (3H) foi selecionado,

correspondendo aos hidrogênios de metila na posição 17 'da luteína

(PUTZBACH et al., 2005; MAULIDIANI et al., 2018). Sua integral foi

determinada manualmente e comparada ao sinal TMS em δ 0,00,

correspondendo a 12H. A concentração de luteína foi estimada pela

seguinte equação:

[𝑙𝑢𝑡𝑒𝑖𝑛] = [𝑇𝑀𝑆]𝑥 (𝐼𝑙𝑢𝑡𝑒𝑖𝑛𝐼𝑇𝑀𝑆

𝑥𝑁𝑇𝑀𝑆

𝑁𝑙𝑢𝑡𝑒𝑖𝑛

)

onde [luteína] e [TMS] são a concentração de luteína e TMS (µmol/mL),

Iluteína e ITMS são a integral da luteína e TMS, e NTMS e Nluteína são o número

de hidrogênios de cada sinal.

78

5.2.2 Determinação de fenois totais

O conteúdo fenólico total foi verificado pelo reagente de Folin-

Ciocalteu, de acordo com o método descrito por Arnous, Makris, e Kefalas

(2001). O ESTE padronizado a 10% de luteína (50, 100, 150 e 200 μg/ml)

foi misturado com 0,5 mL de água destilada e 2,5 ml de reagente de Folin-

Ciocalteu (diluição 1: 10) e 2,0 ml de carbonato de sódio (7,5%) foram

adicionados nos tubos. Além disso, os tubos foram incubados a 45 °C

durante 15 min. A absorbância foi determinada a 760 nm em

espectrofotômetro. A concentração total de polifenol foi calculada a partir

de uma curva de calibração, utilizando o ácido tânico como padrão em

intervalo de (10 - 1000 µg/ml). Os resultados foram expressos como

equivalentes de ácido tânico (TAE) em μg ou mg/g de extrato.

5.3 Ensaio in vitro da atividade sequestradora de radicais 2,2-difenil-1-

picrilhidrazil (DPPH)

A capacidade de eliminação de radicais livres do ESTE foi avaliada

pela diminuição da absorbância do DPPH, conforme descrito por Blois

(1958) e Chen, Wu e Chen (2004), com algumas modificações. Amostras do

ESTE (1, 10, 100 e 1000 µg/ml) foram solubilizadas em metanol e após

foram misturadas com solução metanólica de DPPH (40 µg/ml). Utilizou-se

ácido ascórbico (50 µg/ml) como controle positivo e água destilada como

controle negativo. As soluções foram misturadas e incubadas durante 5 min

à temperatura ambiente e a absorbância foi lida a 520 nm. Os valores

individuais foram interpolados para uma curva padrão do DPPH (0-60 mM)

e expressos como μM de DPPH. Todas as mensurações foram realizadas em

triplicata.

5.4 Cultura celular

A linhagem celular de epitélio intestinal murino (IEC-6) foi comprada

do banco de células do Rio de Janeiro. As células foram cultivadas em meio

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 20% de

soro fetal de bovino (FBS) em 5% de CO2, com atmosfera umidificada, a 37

°C. Os experimentos foram realizados quando o as células atingiram cerca

de 90% da confluência.

79

5.4.1 Viabilidade celular

Células IEC-6 (5 ×104) foram cultivadas em placas de 96 poços (em

triplicatas) na presença de um veículo (meio de cultura com 0,1% de

DMSO), 10% de DMSO ou ESTE a 10% de luteína (1, 10 e 100 µg/ml) a

37 °C durante 24 h. 21h após o tratamento foi adicionado 10 µl de MTT (5

mg/ml) às células, as quais foram incubadas por 3h a 37 °C, após a

solubilização de cristais de formazan reduzidos com DMSO puro (CHEN;

WANG; ZHANG, 2003) e a absorbância foi analisada a 570 nm. A

porcentagem de viabilidade celular foi calculada como a relação (Abs do

tratamento x 100/ média do basal).

5.4.2 Determinação de espécies reativas de oxigênio (EROs) em células

expostas ao LPS

O dano celular foi induzida com LPS para avaliar o efeito protetor da

luteína in vitro. Resumidamente, células (1 x 106) foram semeadas em

placas de 12 poços, 8 horas antes da estimulação, o DMEM foi substituído

por meio DMEM livre de soro para sincronizar as células. Os tratamentos

(300 μl), incluindo basal (DMEM + DMSO 0,1%), LPS (10 μg/ml), ESTE

(100 μg/ml) ou ESTE + LPS foram incubados por 24 h, após o sobrenadante

foi obtido para quantificar EROS incubando 250 µl de amostras com 30 µl

de diacetato de 2',7'-Diclorodidrofluoresceína (DCFH-DA) por 40 min. A

fluorescência foi lida a um comprimento de onda de 480 nm e a uma

emissão de 530 nm. Os experimentos foram realizados em triplicata, cada

vez contendo no mínimo quatro pontos por grupo.

5.4.3 Determinação de nitrito em células expostas ao LPS

O restante das células foram lavadas com PBS e separadas com

tripsina. A suspensão obtida foi centrifugada (5 min a 5.000 RPM a 4 °C), o

sobrenadante foi eliminado e o sedimento foi lisado com 100 µl de tampão

de lise. Após 30 min no gelo, as amostras foram novamente centrifugadas

(30 min a 13.000 RPM sob 4 °C) e o sobrenadante foi usado para medir os

níveis de nitrito usando a reação de Griess (TSIKAS, 2007). Para isso, o

sobrenadante foi desproteinizado e 100 µl foram incubados com 500 µl de

reagente de Griess (HCl a 0,5 M, sulfanilamida a 2% e N-1-

naftaliletilenodiamida a 0,2%) por 24 h. A absorbância foi medida a 570 nm

usando um espectrofotômetro. As concentrações de nitrito foram

interpoladas em uma curva padrão variando de 0 - 100 µM de nitrito de

80

sódio (NaNO2). Os experimentos foram realizados três vezes, cada vez

contendo no mínimo quatro pontos por grupo.

5.5 Ensaios in vivo

5.5.1 Animais

Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss (30 a 40 g

aproximadamente), provenientes do biotério da UNIVALI, aclimatados às

condições do mesmo por pelo menos sete dias antes da manipulação

experimental, sob a temperatura de aproximadamente 23°C e ciclo claro

escuro de 12 horas controlado. Os animais foram alimentados com ração e

água ad libitum. Todos os experimentos obedeceram a protocolos

experimentais previamente aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa

da Universidade do Vale do Itajaí, sob o parecer nº 054/17 (Anexo A).

5.5.2 Grupos experimentais

Foram utilizados 36 camundongos, os animais foram alimentados com

ração e água ad libitum e distribuídos randomicamente em 5 grupos

contendo 6 animais cada.

Grupo 1: Naive - formado por animais que não receberam DSS

diluído em água;

Grupo 2: Veículo - formado por animais que receberam DSS

diluído em água e foram tratados com veículo (10 ml/kg, água +

Tween 80 1%);

Grupo 3: 5-ASA: formado por animais que receberam DSS

diluído em água e foram tratados com 5-ASA na dose de 100

mg/kg (10 ml/kg);

Grupo 4 à 6: ESTE - formado por animais que recebram DSS

diluído em água e foram tratados com doses de 30, 100 ou 300

mg/kg/dia de extrato em um volume de 10 ml/kg.

5.5.3 Indução da colite ulcerativa por dextran sulfato de sódio (DSS) 5%

Após aclimatização dos animais, a indução da colite foi feita por DSS

5% em água ad libitum por 7 dias, como descrito por Chassaing et al.

(2014). Os animais foram tratados 1 vez ao dia, durante 9 dias, por via oral

com veículo (água, 10 mL/kg, v.o), ESTE (30, 100 e 300 mg/kg, v.o) e

ácido 5-aminossalicílico (5-ASA na dose de 100 mg/kg (v.o). Os

81

tratamentos foram realizados simultaneamente com a adição do DSS na

água conforme observado na Figura 8.

Durante todo o período experimental, os animais foram pesados

diariamente e a presença de sangue retal e da consistência das fezes foram

analisadas individualmente. Para tais parâmetros foi atribuído uma

pontuação de acordo os critérios previamente propostos por Utrilla, Peinado

e Ruiz (2015) e Camuesco, Comalada e Rodríguez-Cabezas (2004) para

mensuração do índice de atividade da doença (IAD) (Quadro 4).

Os animais foram eutanasiados no décimo dia, o cólon foi

imediatamente extraído para mensuração do comprimento (cm) e peso. Um

segmento de 0,5 cm foi retirado e fixados em solução de ALFAC (composta

de: 85% álcool etílico 80%, 10% formaldeído e 5% de ácido acético glacial)

para fazer análise histológica. Além disso, o fígado e o baço também foram

pesados.

Figura 8 – Desenho experimental do modelo de colite ulcerativa induzida por DSS.

Fonte: a autora.

82

Quadro 4 - Itens que compõem o índice de atividade da doença (IAD).

Pontuação Perda de peso Consistência das

fezes

Sangramento Retal

0 Nenhuma Normal Normal

1 1-5% --- ---

2 5-10% Fezes amolecidas ---

3 10-20% --- ---

4 >20% Diarreia Sangramento severo

O valor do índice de atividade da doença é composto pela soma da pontuação

da perda de peso, consistência das fezes e sangramento retal. O escore máximo

é 12.

Legenda: --- = nulo.

Fonte: Utrilla, Peinado e Ruiz (2015) e Camuesco, Comalada e Rodríguez-

Cabezas (2004).

5.5.4 Avaliação do trânsito intestinal

O trânsito intestinal dos animais saudáveis foi avaliado como descrito

por da Silva et al. (2016a). Os camundongos foram divididos

randomicamente em três grupos (n=6). O grupo controle negativo recebeu

água destilada (10 mL/kg) e o grupo controle positivo recebeu loperamida

(4 mg/kg), a qual diminui a motilidade intestinal. Enquanto o outro grupo

foi tratado oralmente com ESTE na dose de 300 mg/kg. Após 30 minutos

receberam 0,2 ml de vermelho de fenol. Transcorridos 20 minutos, todos os

animais foram eutanasiados e os intestinos foram removidos para a

quantificação do marcador. A porcentagem de trânsito intestinal foi

determinada utilizando a equação 1:

Ti = 𝑿

𝒀 . 100 (1)

83

Onde: X é o comprimento percorrido pelo marcador vermelho de fenol

e Y é o comprimento total do intestino.

5.5.5 Diarreia induzida com óleo de rícino

Em outro experimento a administração do óleo de rícino via oral foi

administrado para induzir diarreia nos animais como previamente descrito

por Banji et al. (2010). Animais foram distribuídos randomicamente em três

grupos, com 6 por grupo. O grupo controle negativo foi tratado com água

destilada (10 ml/kg). O grupo de controle positivo foi tratado com

loperamida (4 mg/kg) e o terceiro grupo recebeu o ESTE (300 mg/kg).

Trinta minutos mais tarde foi administrado oralmente óleo de rícino (20

ml/kg a cada animal. Em seguida, cada camundongo foi alojado em uma

gaiola individual com o chão revestido com papel absorvente. As grades de

arame foram colocadas a 3 cm do fundo da caixa para separar os animais do

papel absorvente. Posteriormente, foram observados durante 4 horas para os

seguintes parâmetros: tempo até às fezes semissólidas iniciais, número de

fezes sólidas, semissólidas e líquidas. A pontuação numérica foi atribuída

da seguinte forma: fezes sólidas = 1, fezes semissólidas = 2 e fezes líquidas

= 3. O índice de evacuação (EI) será utilizado para avaliar a gravidade da

diarreia como indicado na equação 2:

EI = fezes sólidas × 1 + fezes semissólidas × 2 + fezes líquidas × 3

(2)

5.6 Ensaios ex vivo

Os intestinos (cólon) foram homogeneizados com tampão fosfato de

potássio 200 mM (pH 6,5). O homogeneizado foi usado para determinar a

glutationa redutase (GSH) e depois centrifugado a 9000 g por 20 min. O

sobrenadante foi utilizado para determinar a atividade das enzimas:

glutationa S-transferase (GST), superóxido dismutase (SOD) e catalase

(CAT), além dos níveis de algumas citocinas; o precipitado foi usado para

determinar a atividade da mieloperoxidase (MPO).

5.6.1 Quantificação de glutationa reduzida (GSH) no colón

Foi adicionado 50 µl do homogenato e mais 40 µl de ácido

tricloroacético (ATC) 12% em um tubo de eppendorf, em seguida o tubo foi

homogeneizado em vórtex e centrifugado por 15 min a 4000 rpm na

temperatura de 4 ºC. Em uma placa de 96 poços foram adicionados10ul do

84

sobrenadante, 290 µl de tampão TRIS 0,4M (pH 8,9) e 5 µl de solução 3,96

mg/mL de 5,5’-ditiobis 2-ácido nitrobenzoico (DTNB) em metanol. As

amostras foram incubadas por 15 minutos pra a reação e foi realizada a

leitura espectrofotométrica em 420 nm (SEDLAK; LINDSAY, 1968).

5.6.2 Determinação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) no colón

Em um tubo de eppendorf foi adicionado 10ul de metanol e 100 µl do

homogenato, em seguida agitado em vórtex e centrifugar a 9000 g por 20

minutos na temperatura de 4 ºC. Em uma placa de 96 poços foi colocado 30

µl do sobrenadante e 140 µl de meio reacional (Xilenol laranja, Ferro II,

hidroxitoluenobutilado solubilizados em metanol) após, incubado por 30

minutos em temperatura ambiente. Ao fim da incubação realizou-se a

leitura em espectrofotômetro a 560 nm (JIANG et al., 1992).

5.6.3 Determinação da atividade da Superóxido Dismutase (SOD) no

colón

A atividade da SOD foi medida com base na capacidade da enzima de

inibir o processo de autoxidação do pirogalol, de acordo com Marklund e

Marklund (1974) e Gao et al. (1998). Alíquotas de sobrenadante foram

adicionadas à solução tampão (200 mM Tris HCl-EDTA, pH 8,5) e

pirogalol (1 mM), e depois misturadas por 1min. A reação foi incubada

durante 20 min à temperatura ambiente, interrompida. A absorbância do

sobrenadante resultante foi medida a 405 nm. A quantidade de SOD que

inibiu a oxidação do pirogalol em 50%, em relação ao controle, foi definida

como uma unidade de atividade da SOD. A atividade da SOD foi expressa

em U/ mg de proteína.

5.6.4 Determinação da atividade da Catalase (CAT) no colón

Em uma cubeta de quartzo, 10 μl de homogenato da mucosa gástrica

foi diluída com 990 μl de solução reativa 20 mM (Tampão Tris/ EDTA 5

mM, pH 8,0 + peróxido de hidrogênio 30% + água miliQ). A absorbância

foi medida em comprimento de onda de 240 nm (AEBI, 1984).

5.6.5 Determinação da atividade da glutationa S-transferase (GST) no

cólon

A atividade total da GST foi determinada conforme descrito por

Habig, Pabst e Jakoby (1974). Resumidamente, para as reações foi utilizado

85

o sobrenadante, 1 mM 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB), 1 Mm de GSH

e 100 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 6,5) a temperatura

ambiente. A reação do CDNB com GSH foi monitorada a 340 nm por 90 s.

A atividade específica foi calculada usando um coeficiente de extinção de

9,6/mM/cm para GSH, e os resultados foram expressos em mmol/ min/ mg

de proteína.

5.6.6 Atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) no colón

O tecido do colón foi pesado e imerso em tampão fosfato (pH 6,2

contendo 0,5% de brometo de hexadecil-trimetilamônio e 5 mM EDTA) na

concentração de 3 ml/g de tecido. A seguir, as amostras foram

homogeneizadas duas vezes consecutivas, por período de 30 segundos cada.

Os homogenatos resultantes foram centrifugados a 17.500 rpm durante 15

min à temperatura de 4 ºC e o sobrenadante foi utilizado para determinação

da atividade de MPO. A atividade da MPO colônica foi medida de acordo

com Silva et al. (2016a). O precipitado do homogeneizado reparado como

descrito acima foi misturado em tampão de fosfato de potássio 80 mM (pH

5,4) contendo 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamónio (HTAB) e

centrifugado (12000 rpm durante 20 min a 4 °C). A atividade da MPO foi

determinada a 620 nm no sobrenadante na presença de H2O2 e 3,3’, 5,5'-

tetrametilbenzidina (TMB). A atividade da MPO foi expressa como

unidades de milli densidade óptica (mO.D)/mg de proteína.

5.6.7 Dosagem de citocinas

Homogeneizados colônicos foram usados para estimar os níveis de

TNF-α, IL-6, usando kits de ensaio imunoenzimáticos (ELISA) para

citocinas de camundongos da BD Biosciences (Franklin Lakes, Nova

Jersey, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. A absorbância foi

medida a 450 e 550 nm e os resultados foram expressos em pg/mL.

5.6.8 Dosagem de proteínas

As concentrações de proteína foram determinadas pelo método de

Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), utilizando albumina de soro

bovino (0,125 a 1,0mg/ml) como padrão, de acordo com as instruções do

fabricante.

86

5.6.9 Avaliação histológica

Após a eutanásia as amostras do cólon dos animais foram fixadas em

ALFAC por 24 horas foram desidratadas em séries alcoólicas crescentes,

diafanizadas em xilol, para posteriormente serem incluídas em parafina e

preparadas para a microtomia. Os cortes, com aproximadamente 5 μm de

espessura, foram desparafinizados e reidratados utilizando série alcoólica

etílica decrescente. Em seguida, as amostras foram submetidas à coloração

em eosina-hematoxilina para a análise morfológica das lesões. Todos os

procedimentos de preparo de amostra para avaliação histopatológica foi

realizado pela empresa Histocell (São Paulo, Brasil).

O dano histológico foi avaliado segundo os critérios previamente

descritos por Utrilla, Peinado e Ruiz (2015) e Camuesco, Comalada e

Rodríguez-Cabezas (2004), com poucas modificações, levando em

consideração a presença de perda epitelial, infiltração celular, edema e

condição das criptas e células caliciformes. O tecido colônico foi avaliado

com foco nas características anteriores e um escore variando de 0 (tecido

saudável) a 3 ou 4 (dano grave), dependendo do item, foi atribuído a cada

um (Tabela 4). A soma dá a pontuação total para cada amostra.

Tabela 4 – Escore histológico.

Características Score Critério

Epitélio de mucosa 0

1

2

3

Sem inflamação de mucosa

Perda de <5% da superfície epitelial

Perda de 5 – 10% da superfície epitelial

Perda de >10% da superfície epitelial

Integridade das criptas 0

1

2

3

Criptas intactas

Perda <10% das criptas

Perda <10 - 20% das criptas

Perda >20% das criptas

Infiltrado celular e edema 0

1

2

3

Nenhum

Brando

Moderado

Severo

Depleção das células de

goblet

0

1

Ausente

Presente

Fonte: Utrilla, Peinado e Ruiz (2015) e Camuesco, Comalada e Rodríguez-Cabezas

(2004).

87

5.6.10 Quantificação dos níveis de mucinas

A análise histoquímica para mucina foi realizada nos cortes

histológicos obtidos, os quais foram oxidados em ácido periódico 0,5% por

5 min, lavados em água destilada, corados com reativo de Schiff por 20 min

e lavados em água sulfurosa e em água corrente. As lâminas foram contra

coradas com hematoxilina por 20 s, desidratadas em uma série ascendente

de álcoois, diafanizadas em xilol e montadas entre lâmina e lamínula. As

lâminas foram observadas em microscópio óptico em aumento de 400 × e

fotografadas. As glicoproteínas (mucinas) coradas pelo ácido periódico de

Schiff (PAS) foram quantificados com o programa ImageJ® de acordo com

descrito por Silva et al. (2016a).

5.7 Análise estatística

Os resultados expressos serão apresentados em média ± erro padrão. A

análise estatística foi efetuada utilizando análise de uma ou duas vias da

variância (ANOVA), quando aplicável, seguida pelo post teste de

Bonferroni e Dunnet. O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para avaliação

dos testes não-paramétricos, seguido pelo post teste de Dunns As análises

foram realizadas utilizando o programa GraphPad Prism 5.0 (San Diego,

EUA). Valores de p<0,05 foram considerados significativos.

89

6 RESULTADOS

6.1 Análise fitoquímica

6.1.1 Teor de luteína

Pela quantificação de RMN 1H, utilizando TMS como padrão, foi

possível estimar uma concentração de 8,2 ± 0,3% (m/m) para a luteína no

ESTE.

6.1.2 Fenois totais

A quantificação dos fenóis totais presentes no extrato está descrito na

tabela 5 e pode ser quantificada em 239,3 ± 19,5 mg/g de extrato.

Tabela 5 – Quantificação de fenóis totais do ESTE.

ESTE (µg/ml) E.A.T ± EPM

150 33,6 ± 2,4

100 21,6 ± 1,0

50 13,9 ± 0,6

E.A.T: equivalentes de ácido tânico em µg .

A concentração de 200 µg/ml ficou fora da linearidade.

6.2 Ensaio in vitro da atividade sequestradora de radicais 2,2-difenil-1-

picrilhidrazil (DPPH)

Como descrito na figura 9, o extrato sequestrou o radical livre estável

DPPH em 29% somente na maior concentração testada. Como esperado, a

incubação com ácido ascórbico reduziu o radical em 66%.

90

Figura 9 – Efeito do ESTE nos níveis de radicais 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

(DPPH).

VEI – veículo (25% metanol); AA – ácido ascórbico (50 µg/ml); ESTE – extrato

seco de Tagetes erecta L. Os dados estão representados como média ± E.P.M (n=3).

Experimento feito em triplicata. Anova de uma via seguido pelo teste de Dunnett,

*p<0,05;**p<0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo veículo.

6.3 Cultura celular

6.3.1 Efeito do ESTE na viabilidade celular de enterócitos murinos

(células IEC-6)

Como é possível verificar na figura 10, a incubação de enterócitos

murinos da linhagem IEC-6 com DMSO 10% reduziu a viabilidade celular

em 52,48%. De forma interessante, o tratamento com ESTE (1µg/ml) não

alterou a viabilidade das células, porém é possível que nas concentrações de

10 e 100 µg/ml favoreça a proliferação celular.

91 Figura 10 – Efeito do ESTE na viabilidade celular em células IEC-6.

As células foram tratadas com veículo (meio de cultura com 0,1% de DMSO),

DMSO (10%) e ESTE (1; 10 e 100 µg/ml). Após a incubação por 24h o ensaio de

MTT foi realizado. Os dados estão representados como média ± E.P.M (n=3).

Experimento feito em triplicata. Anova de uma via seguido pelo teste de Dunnett,

**p<0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo basal.

6.3.2 Efeito do ESTE na produção de espécies reativas de oxigênio

(EROs) em células expostas ao LPS

Quando as células foram estimuladas com LPS (10 µg/ml), a

quantidade de EROs detectadas com DCFH-DA aumentou em 48% em

relação ao grupo basal, porém a incubação com ESTE (100 μg/ml) reverteu

este aumento induzido por LPS (figura 11).

92

Figura 11 – Efeito do ESTE (100 μg/ml) no dano celular em células IEC-6.

LPS – lipopolissacarídeos; ESTE – Extrato seco de Tagetes erecta L. As células

foram tratadas com veículo (meio de cultura com 0,1% de DMSO), LPS (10 µg/ml),

ESTE (100 µg/ml) e ESTE com LPS (100 µg/ml e 10 µg/ml, respectivamente).

Após o sobrenadante foi obtido para quantificar espécies reativas de oxigênio (ROS)

incubando 250 µl de amostras com 30 µl de diacetato de 2',7'-

diclorodidrofluoresceína (DCFH-DA) por 40 min. #p<0,05 quando comparado ao

grupo basal, **p<0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo LPS.

93

6.3.3 Efeito do ESTE nos níveis de nitrito em células expostas ao LPS

Os níveis intracelulares de nitrito também foram aumentados após

incubação com LPS; entretanto a incubação das células com ESTE (100

μg/ml) não reverteu esse efeito (Figura 12).

Figura 12 – Efeito do ESTE (100 μg/ml) nos níveis de nitrito em células IEC-6.

LPS – lipopolissacarídeos; ESTE – Extrato seco de Tagetes erecta L. #p<0,05

quando comparado ao grupo basal. O sobrenadante celular foi usado para medir os

níveis de nitrito usando a reação de Griess. As concentrações de nitrito foram

interpoladas em uma curva padrão variando de 0 - 100 µM de nitrito de sódio

(NaNO2).

6.4 Análise in vivo

Na análise do efeito anti-inflamatório intestinal do ESTE foi utilizado

o modelo de colite ulcerativa induzida por DSS conforme descrito por Silva

et al. (2016a), a qual assemelha-se a colite ulcerativa aguda desenvolvida

em humanos. Sinais clínicos foram verificados e quantificados conforme

sistema de escore como o índice de atividade da doença (IAD), perda de

peso, peso dos órgãos (baço fígado e cólon).

6.4.1 Efeito sobre a perda de peso

94

A figura 13 demonstra a evolução da variação do peso corporal dos

animais. O grupo colítico tratado com veículo demonstrou uma perda de

peso de 19% em relação ao primeiro dia do experimento. Em contrapartida,

o grupo colítico tratado ESTE 300 mg/kg v.o, uma vez ao dia, durante sete

dias, apresentou uma perda de peso de 11% em relação ao primeiro dia

experimental.

Figura 13 – Efeito do ESTE na evolução da perda de peso em camundongos com

colite ulcerativa induzida por DSS.

Os animais foram divididos em grupos não-colítico (Naive), colítico tratado com

veículo (10 ml/kg, água + Tween 80 1%, colítico-veículo) e colítico tratado com

ESTE (300mg/kg, colítico-ESTE). Anova de duas vias seguida pelo teste

Bonferroni. *p<0,05; ** p<0,01 e *** p<0,001 quando comparado ao grupo

colítico-veículo. ESTE – Extrato Seco de Tagetes erecta L.

6.4.2 Efeito sobre o Índice de atividade da doença (IAD)

O índice de atividade da doença é medido através de escores, os quais

são: perda de peso, consistência das fezes (normal, fezes amolecidas e

95

diarreia) e presença de sangue retal. A figura 14 apresenta que o grupo

colítico tratado com o veículo atingiu um escore de 10,0 ± 0,7

(correspondente à diarreia grave com sangramento anal). Já o grupo tratado

com o ESTE 300 mg/kg (v.o) apresentou uma diminuição nesse escore

alcançando níveis iguais a 5,0 ± 0,9.

Figura 14 – Efeito do ESTE no IAD em camundongos com colite ulcerativa

induzida por DSS.



ESTE (300mg/kg, colítico-ESTE). Anova de duas vias seguida pelo teste

Bonferroni. ** p<0,01 e *** p<0,001 quando comparado ao grupo colítico-veículo.

ESTE – Extrato Seco de Tagetes erecta L.

6.4.3 Efeito sobre o encurtamento do cólon

Como esperado, o consumo de DSS reduziu em 32% o comprimento

do cólon dos camundongos do grupo veículo em relação ao grupo não-

colítico (10,72 ± 0,26 cm), Por outro lado, como é possível verificar na

figura 15, a administração oral do ESTE na dose de 300 mg/Kg evitou a

96

redução do comprimento do cólon dos animais expostos ao DSS quando

comparado ao grupo colítico tratado com veículo em 16%.

Figura 15 – Efeitos do ESTE no comprimento do cólon de camundongos com colite

ulcerativa induzida por DSS.



ESTE (300mg/kg, colítico-ESTE). Painel A: Resultados são expressos como média

97 ± E.P.M. Anova de uma via seguida pelo teste Bonferroni. ** p<0,01 quando

comparado ao grupo colítico-veículo e ### p<0,001 quando comparado ao grupo

não-colítico (naive). Painel B: imagens representativas do aspecto macroscópico do

cólon dos diferentes grupos experimentais.

6.4.4 Efeito do ESTE sobre o peso do cólon, do baço e do fígado de

camundongos com colite induzida por DSS

Como observado na tabela 6, o peso do cólon, fígado e baço não

apresentou diferença estatística significativa entre os grupos experimentais.

Tabela 6 – Efeitos de ESTE sobre o peso do cólon, baço e fígado de camundongos

com colite ulcerativa induzida por DSS.

Tratamento Peso do cólon

(g/100g)

Peso do fígado

(g/100g)

Peso do baço

(g/100g)

Não-colítico Veículo 0,08 ± 0,01 0,36 ± 0,01 0,03 ± 0,01

Colítico Veiculo 0,09 ± 0,01 0,45 ± 0,02 0,03 ± 0,01

Colítico 5-ASA 0,08 ± 0,01 0,38 ± 0,03 0,04 ± 0,01

Colítico ESTE 0,10 ± 0,01 0,41 ± 0,03 0,04 ± 0,01

Veículo - 10 ml/kg, água + Tween 80 1%, 5-ASA – ácido 5-aminosalicílico (100

mg/kg, v.o); ESTE – Extrato Seco de Tagetes erecta L (300 mg/kg, v.o).

6.5 Análise ex vivo

6.5.1 Efeito do ESTE sobre o escore histológico

A organização histológica do cólon dos camundongos foi analisada

nos cortes histológicos corados pela técnica HE e, recebeu as pontuações de

escore conforme Utrilla, Peinado e Ruiz (2015).

Como observado na figura 16A as alterações patológicas do cólon

foram atenuadas com o tratamento do ESTE (300 mg/kg v.o), como

demonstra o escore histológico em relação ao grupo colítico tratado com

veículo.

A figura 16B reforça esse resultado, pois o grupo colítico tratado com

ESTE apresentou as estruturas da parede do cólon, submucosa e criptas

muito próximas da normalidade, ou seja, do grupo não colítico.

98

Figura 16 – Efeito do ESTE no escore histológico associado a colite ulcerativa

induzida por DSS em camundongos.

Painel A: Valores são expressos como mediana ± intervalo interquartil do valor de

escore das alterações histológicas. Análise estatística realizada pelo teste de Kruskal-

Wallis seguido pelo pós teste de Dunns, ** p<0,01 quando comparado ao grupo

colítico-veículo; Painel B: Imagem representativa do aspecto histológico do cólon de

animais dos diferentes grupos experimentais.

99

6.5.2 Efeito do ESTE sobre os níveis de mucinas quantificadas

histoquimicamente

A coloração histoquímica PAS é utilizada na detecção da presença de

glicoproteínas, com a mucina, que desempenha papel protetor da mucosa

intestinal. Analisando a figura 17 a coloração PAS no grupo colítico tratado

com veículo apresentou 92% de redução quando comparado ao grupo naive

(não-colítico, 14,27 ± 1,5). O grupo colítico tratado com ESTE (300mg/kg)

apresentou aumento de 311% na marcação para mucinas, quando

comparado com o grupo colítico tratado com veículo.

Figura 17 – Efeito do ESTE nos níveis de mucina do cólon de camundongos com


Painel A: Quantificação nos níveis de mucina. Resultados foram expressos como

média ± E.P.M. Anova de uma via seguida pelo teste Bonferroni. * p<0,05 quando

comparado ao grupo colítico-veículo e ### p<0,001 quando comparado ao grupo

não-colítico (naive). Painel B: imagens representativas dos níveis de mucina do

cólon dos diferentes grupos experimentais. Setas indicam mucinas coradas em rosa

pink. ESTE – Extrato Seco de Tagetes erecta L. (300 mg/kg, v.o).

100

6.5.3 Efeitos do ESTE sobre parâmetros oxidativos

Como descrito na tabela 7 pode-se perceber que os níveis de GSH no

grupo colítico-veículo foram reduzidos em 24,9% quando comparado com o

grupo não-colítico (662,1 ± 34,14 µg/mg de tecido). Já o grupo colítico-

ESTE apresentou um aumento em 22,37% no GSH quando comparado ao

grupo colítico-veículo. Além disso, de forma não esperada, a análise dos

níveis de LOOH não apresentou diferença estatística significativa entre os

grupos experimentais.

Na análise da atividade da SOD, o grupo colítico tratado com veículo

apresentou uma redução de 56% neste parâmetro, quando comparado ao

grupo não-colítico. Por outro lado, os níveis de atividade da SOD foram

mantidos semelhantes aos basais no grupo colítico tratado com ESTE,

quando comparado ao grupo não-colítico (p>0,05).

Como esperado a atividade da enzima catalase foi reduzida em 63% no

grupo colítico tratado somente com veículo, quando comparado ao grupo

não colítico tratado com veículo (96,9 ± 7,6 µmol H2O2/min)). Entretanto,

surpreendentemente, a atividade de CAT no grupo colítico tratado com o

ESTE aumentou consideravelmente para níveis com média de 785,1 ± 65,0

mmol H2O2/min/mg de proteína). Por fim, a avaliação da atividade da

enzima detoxificante GST nos diferentes grupos experimentais revelou que

o grupo colítico-veículo apresentou uma atividade reduzida em 59,58%,

quando comparado ao grupo não-colítico (2175 ± 419 mmol de GSH/mg de

tecido). Em contra partida, o grupo colítico-ESTE apresentou níveis de

atividade de GST similares aos encontrados no grupo não-colítico (p>0,05).

Tabela 7 – Efeitos do ESTE nos parâmetros oxidativos no cólon de camundongos

com colite ulcerativa induzida por DSS.

Parâmetro Não-colítico Colítico-veículo Colítico-ESTE

GSH 662,1 ± 34,1 496,6 ± 27,7b 607,7 ± 30,9c

LOOH 5,0 ± 0,2 4,7 ± 0,2 3,5 ± 0,7

SOD 7,53 ± 1,11 3,30 ± 1,06a 8,40 ± 0,50d

CAT 96,9 ± 7,6 36,0 ± 6,7 785,1 ± 65,0e

GST 2175 ± 419 880 ± 145b 2432 ± 280d

GSH – Glutationa (µg/g tecido); LOOH - hidroperóxidos lipídicos (mmol

hidroperóxidos/mg de tecido; SOD – Superóxido dismutase (U/mg de proteína);

CAT – Catalase (µmol H2O2/min); GST - Glutationa S-transferase (mmol de

101 GSH/mg de tecido); ESTE - Extrato Seco de Tagetes erecta.. A análise estatística

foi realizada utilizando Anova de uma via seguida pelo teste Bonferroni. ap<0,01 e bp<0,001 quando comparado ao grupo não-colítico (naive).cp<0,05, dp<0,01 e ep<0,001 quando comparado ao grupo colítico-veículo.

6.5.4 Efeitos do ESTE em parâmetros inflamatórios

Na análise de MPO, demonstrada na figura 18, o grupo colítico tratado

com o ESTE reduziu em 82,35% a atividade desta enzima, quando

comparado o grupo colítico tratado com o veículo (17,59 ± 2,2 m D.O/ mg

de proteína).

Figura 18 – Efeito do ESTE nos níveis de MPO no cólon de camundongos com



veículo (Vei, 10 ml/kg, água + Tween 80 1%) e colítico tratado com ESTE

(300mg/kg). A análise estatística foi realizada utilizando Anova de uma via seguida

pelo teste Bonferroni. Sendo *** p<0,001 quando comparado ao grupo colítico-

veículo e ### p<0,001 quando comparado ao grupo não colítico (naive).

102

Observando a figura 19, pode-se perceber que o grupo veículo

apresentou um aumento de 52% nos níveis de TNF, quando comparado ao

grupo naive (296,3 ± 41,2 pg/ml). Porém, quando se observa o grupo ESTE

é possível perceber uma diminuição em 26% nos níveis desta citocina,

quando comparado ao grupo colítico tratado com veículo.

Figura 19 – Efeito do ESTE nos níveis de TNF no cólon de camundongos com





pelo teste Bonferroni.Sendo ** p<0,01 quando comparado ao grupo colítico-veículo

e ## p<0,01 quando comparado ao grupo não colítico (naive).

Como demonstrado na figura 20, o grupo veículo apresentou uma

elevação de 465% nos níveis de IL-6 no cólon, quando comparado ao grupo

naive (269,5 ± 11,4 pg/mL). Por outro lado, o tratamento oral com ESTE

teve a capacidade de reduzir em 26% os níveis desta citocina quando

comparado ao grupo colítico tratado com veículo.

103 Figura 20 – Efeito do ESTE sobre os níveis de IL-6 no cólon de camundongos com





pelo teste Bonferroni. Sendo * p<0,05 quando comparado ao grupo colítico-veículo

e ### p<0,001 quando comparado ao grupo não colítico (naive).

6.6 Efeito do ESTE sobre o trânsito intestinal de camundongos

saudáveis

Como mostra a figura 21 o grupo tratado com loperamida (4 mg/kg)

teve uma redução no trânsito intestinal em 49% em comparação ao grupo

veículo (40,5 ± 3,8%). Já o grupo tratado com ESTE não apresentou

alteração significativa no trânsito intestinal quando comparado ao veículo

(p>0,05).

104

Figura 21 – Efeito do ESTE no trânsito intestinal de camundongos saudáveis.

VEI LOP ESTE0

10

20

30

40

50

#

300 mg/kg

Trâ

nsit

o I

nte

sti

nal

(%)

Os animais foram divididos em grupo controle negativo (água destilada 10 mL/kg),

grupo controle positivo recebeu loperamida (4 mg/kg) e grupo ESTE (300 mg/kg).

Os resultados foram expressos como média ± EPM. A análise estatística foi

realizada utilizando Anova de uma via seguida pelo teste Dunnett. #p<0,05 quando

comparado ao grupo veículo.

6.6.1 Efeito do ESTE na diarreia induzida por óleo de rícino.

Como mostra a figura 22 o grupo tratado com loperamida (4 mg/kg)

teve uma redução no score de diarreia em comparação ao grupo veículo

(p<0,01). Já o grupo tratado com ESTE não apresentou alteração

significativa no trânsito intestinal quando comparado ao veículo (p>0,05).

105 Figura 22 - Efeito do ESTE na diarreia induzida por óleo de rícino em animais

saudáveis.

Os animais foram divididos em grupo controle negativo (água destilada 10 mL/kg),

grupo controle positivo recebeu loperamida (4 mg/kg) e grupo ESTE (300 mg/kg).

Os resultados foram expressos como mediana ± intervalo interquartis. A análise

estatística foi realizada utilizando Kruskal-wallis seguida pelo teste Dunns. **p<0,01

quando comparado ao grupo veículo.

107

7 DISCUSSÃO

A prevenção ou atenuação das doenças inflamatórias intestinais por

terapias alternativas e/ou adjuvantes, em especial fitoterápicos ou

nutracêuticos, com menos efeitos colaterais e mais economicamente

acessíveis nos dias atuais é desejável. O extrato seco de T. erecta L. (ESTE)

é prescrito como suplemento alimentar pelo teor de luteína, um carotenoide

com variado potencial biológico. Por conseguinte, este estudo descreveu o

efeito do ESTE no modelo de colite ulcerativa induzida por DSS em

camundongos para contribuir com evidências experimentais acerca da

aplicabilidade desse extrato no tratamento de DII.

Os efeitos biológicos de carotenoides como a luteína tem se tornado

objeto de investigação e agências regulatórias como United States Food and

Drug Administration (U.S FDA) e Joint FAO/ WHO Expert Committee on

Food Additives (JECFA) os quais revisaram a segurança do uso dessa

substância como um suplemento fitoterápico ou dietético

(RAVIKRISHNAN et al., 2011).

Dado as limitações, em grande escala, nos procedimentos de

isolamento e purificação de carotenoides a partir de extratos vegetais, e o

impacto deste custo na comercialização, o ESTE padronizado em 10% de

luteína tem sido prescrito, em especial por nutricionistas, com o intuito de

suplementação de luteína como antioxidante, fotoprotetor oral, redução da

degeneração macular.

Nesse interim, o extrato empregado neste estudo foi obtido

comercialmente pela empresa fornecedora de insumos farmacêuticos

Pharmanostra (Lote n0 16E10-B019-005810). Após avaliação quantitativa

por RMN foi possível confirmar a presença de luteína no ESTE na

concentração de 8,2%. Corroborando, Hadden et al. (1999) apresentaram

evidências de que extratos comerciais de flores de T. erecta contêm trans-

luteína como o principal componente carotenoide com vários isômeros cis-

luteínicos como componentes menores.

Popularmente as flores de T. erecta são utilizadas como adstringente, e

para o tratamento de distúrbios gastrointestinais como desinteria, diarreia,

cólica, constipação, dores estomacais. Além disso, podem ser sedativa, para

tratar desordens de pele (acne e eczema, por exemplo), diurética, problemas

renais, infecções e cicatrização de feridas (MOLLIK et al., 2010). Como

reportado por Gong et al. (2011), a diversidade de efeitos biológicos

108

descritos para preparações de T. erecta pode ser devido à presença de

compostos antioxidantes, como ésteres de luteína e tocoferol (GONG et al.,

2011).

Na literatura há relatos de que a suplementação com antioxidantes

apresenta diferentes ações em modelos animais de colite, através de alguns

mecanismos, sendo eles: redução do estresse oxidativo, bloqueio de sinais

inflamatórios e supressão da resposta imune. Assim, os tratamentos

baseados em fitoquímicos e outros compostos antioxidantes podem ser uma

estratégia terapêutica interessante e eficaz para a CU, já que essa doença é

caracterizada por infiltrado inflamatório na lesão da mucosa, onde espécies

reativas de oxigênio como o superóxido, peróxido de hidrogênio e óxido

nítrico são liberados de leucócitos ativados causando a lesão tecidual

(SETHURAMAN et al., 2015). Sendo assim, seu início e progresso podem

ser controlados por fatores dietéticos, onde a modulação nutricional

adequada pode não apenas prevenir o aparecimento ou a recaída da doença

como também manter o período de sua remissão (SUNG, 2013).

Já se sabe que as pétalas de plantas do gênero Tagetes contêm várias

classes de metabólitos secundários, além dos carotenoides como a luteína,

tais como os compostos fenólicos, flavonídeos, triterpenos, álcoois, esteróis,

saponinas, taninos, polissacarídeos e resinas, os quais são conhecidos por

mediar seus efeitos farmacológicos. Especificamente as flores de T. erecta

L. possuem ácido cafeico, sinápico, ferúlico, m-cumárico e quercetina

(AYUB et al., 2017).

No presente estudo, a quantificação de fenois totais no ESTE foi

realizada demonstrando a presença de 239,3 ± 19,6 mg/g de extrato em

termos de ácido tânico. Corroborando com o achado, Gong et al. (2012)

quantificaram fenois totais em extratos hidroetanólicos de T. erecta L. em

diferentes proporções e identificaram que no extrato na proporção de

etanol:água de 5:5 havia 46,36 ± 0,26 mg GAE/g e na proporção 7:3

62.33±1.81 mg GAE/g. Outro achado interessante foi o de Ayub et al.

(2017) em que o extrato metanólico de T. erecta L. apresentou 35,6 ± 1.4

mg/g de fenóis totais, em pétalas secas, também mensurados como

equivalente de ácido gálico (GAE).

Além disso, no ensaio de sequestro do radical estável DPPH, a

incubação com ESTE na maior concentração (1000 µg/ml) reduziu os níveis

radicalares em 29%. Gong et al. (2012) verificaram que o extrato

hidroetanólico desengordurado de T. erecta L. (preparado com solução

109

extrativa de etanol e água na proporção de 7:3) incubado por 20 segundos

com DPPH na concentração de 0,0017 mmol/l, apresentou maior ação

sequestrante do radical livre estável. Esses dados contrastam com os

achados deste estudo, porém é possível que diferenças metodológicas para

determinar o potencial antioxidante de extratos vegetais, incluindo o tempo

de reação e a complexidade cinética da reação possa justificar o resultado

aqui obtido.

O tratamento da CU tem vários objetivos importantes além da

remissão. A cicatrização da mucosa é um deles e pode prevenir ou reduzir o

risco de câncer colorretal. Além disso, a qualidade de vida do paciente deve

ser melhorada, como a possibilidade de cessação de sintomas como

sangramento retal (PROBERT et al., 2014). A cicatrização da mucosa

intestinal está intimamente associada à proliferação e integridade das

células epiteliais intestinais. Por conseguinte, o efeito do ESTE na

viabilidade de células IEC-6 foi mensurado, e a incubação com o extrato

(1µg/ml) não alterou a viabilidade destas células. É provável, que a

incubação com ESTE nas concentrações de 10 e 100 µg/ml favoreça a

proliferação celular in vitro, porém novos experimentos são necessários

para verificar a veracidade dessa hipótese.

Similarmente, Chang et al. (2013) incubaram 0,1 a 10 µM de luteína

em IEC-6 e também não observaram efeitos deletérios sobre a viabilidade

dessas células. Vale a pena ressaltar, que as concentrações de 10 e 100

µg/ml de ESTE empregadas nos testes de cultivo celular deste estudo

equivalem a 1,44 µM e 14,41 µM de luteína, respectivamente, calculadas a

partir do teor deste carotenoide no extrato, reforçando e estendendo os

dados descritos por Chang et al. (2013).

O epitélio intestinal é de extrema importância, pois desempenha uma

barreira física entre o lúmen e o meio interno do organismo, e sua

manutenção é regulada criteriosamente por proliferação e morte celular

epitelial, além de diferenciação celular e resposta equilibrada aos antígenos

luminais. O epitélio colônico protege o intestino de inflamações, pelo fato

de suas células se organizarem e se conectarem através das junções

firmemente aderidas, assegurando a permeabilidade celular e também

promoverem a produção de muco, impedindo a aderência de bactérias à

superfície do mesmo. Uma disfunção epitelial pode promover aumento da

permeabilidade da barreira à micro-organismos e outros antígenos

110

provocando uma resposta inflamatória nas células subjacentes da mucosa e

consequentemente promovendo a DII (SEIDELIN, 2015).

O estresse oxidativo, entre outros fatores, é citado como um dos

principais mecanismos envolvidos na fisiopatologia da DII. A inflamação

intestinal crônica está associada à produção exacerbada de espécies reativas

de oxigênio (EROS), sugerindo um desequilíbrio entre oxidantes e

mecanismos antioxidantes. As EROS interagem com complexos

moleculares induzindo dano celular (BALMUS et al., 2016).

O lipopolissacarídeo (LPS) é importante na monocamada externa da

membrana externa da maioria das bactérias Gram-negativas, como forma de

proteção. O LPS atua induzindo células a produzir enzimas pró-

inflamatórias, como TNF-α, a ciclooxigenase-2 (COX-2), interleucinas,

NOS-2. O TGI humano é colonizado por um grande número de bactérias

comensais e esta susceptível a ação do LPS. Indivíduos com DII apresentam

um aumento de bactérias gram-negativas no intestino e consequentemente

de LPS, produzindo aumento e perpetuação da inflamação (RHEE, 2014

O óxido nítrico (ON) exerce múltiplos efeitos moduladores sobre a

inflamação e desempenha um papel fundamental na regulação das respostas

imunes, afetando praticamente todas as etapas do desenvolvimento da

inflamação, podendo inibir a expressão de moléculas de adesão, síntese de

citocinas e quimiocinas e adesão e transmigração de leucócitos. Grandes

quantidades de ON, geradas principalmente pela iNOS, podem ser tóxicas e

pró-inflamatórias (GUZIK; KOBUT; ADAMEK-GUZIK, 2003).

A incubação de ESTE na concentração de 100 µg/ml em células IEC-6

reduziu a produção de EROs induzidos por LPS, porém não reduziu os

níveis de nitrito. Corroborando com o achado, Chang et al. (2013)

verificaram que o tratamento das células IEC-6 com metotrexato (MTX)

(utilizado no tratamento do câncer e doenças autoimunes) exacerba a

geração de EROS e que esse parâmetro é suprimido pela pré-incubação com

luteína. Estes achados sugerem que a luteína pode atuar na mucosite

intestinal, que é um efeito adverso do uso de quimioterápicos, e também em

uma possível disbiose, a qual eleva os níveis de LPS intestinal, ocasionada

pelo desequilíbrio no balanço de bactérias gram-positivas e gram-negativas.

Assim, tais achados também reforçam a hipótese do efeito benéfico de

ESTE em doenças inflamatórias intestinais.

A colite ulcerativa induzida por DSS nos animais mimetiza a colite

humana em fase aguda, pois o dextran sulfato de sódio, que é administrado

111

na água dos animais provoca uma inflamação colônica dependendo da dose

e tempo de exposição. Em camundongos, a administração de DSS é

caracterizada por sangramento intenso presente nas fezes, diarreia e perda

de peso, especialmente após a administração cíclica, compreendendo

geralmente de 5 a 7 dias. A patologia estabelecida no cólon dos animais é

semelhante à observada na colite ulcerativa humana, consistindo em

ulcerações, erosão da barreira epitelial e infiltração extensiva de linfócitos e

granulócitos (OKAYASU et al., 1990; COOPER et al., 1993).

De fato, no presente estudo, o consumo de DSS na água de beber dos

animais experimentais promoveu alterações fenotípicas características à

instalação de inflamação colônica, incluindo a perda de peso, diarreia e a

presença de sangue nas fezes. Por outro lado, a administração de ESTE (300

mg/kg, v.o) por sete dias reduziu significativamente esses sinais. Para

demonstrar o mecanismo envolvido nos efeitos observados, também foi

avaliada a atividade do extrato em parâmetros oxidativos e inflamatórios.

Considerando a utilização de aminosalicilatos, como o 5-ASA, na

farmacoterapia da CU, este fármaco foi utilizado como controle positivo

nos experimentos deste estudo. Entretanto, similarmente a estudos prévios

(SILVA et al., 2016a; SILVA et al., 2016b; BOEING et al., 2018;

MARIANO et al., 2018), o efeito observado foi insuficiente e não

minimizou os sinais da inflamação colônica. Esse efeito pode ser justificado

pela diferença na forma de administração utilizada em relação à clínica, o

qual é administrado na forma de comprimidos revestidos, enemas e

supositórios.

A migração transepitelial de neutrófilos (criptite) e a migração

extensiva de neutrófilos através do epitélio da mucosa e no lúmen da cripta

são comumente associadas à DII humana, mas ocasionalmente relatadas em

patologia induzida experimentalmente por DSS. Como descrito por

Chassaing et al. (2014), a colite induzida por DSS resulta em infiltração de

leucócitos mononucleares, desordem da arquitetura cripta e um alargamento

do fosso entre a base da cripta e camada muscular com linfocitose mucosa

profunda comumente associada. De fato, nesse estudo severas alterações

estruturais nas criptas também foram observadas nos animais expostos ao

DSS e tratados com veículo.

Em concordância com os achados macroscópicos, a administração do

ESTE (300 mg/kg), uma vez ao dia durante sete dias, reduziu as alterações

patológicas do cólon, com base no escore histológico em relação ao grupo

112

colítico tratado com veículo. Os resultados demonstraram que o grupo

colítico tratado com ESTE apresentou as estruturas da parede do cólon,

submucosa e criptas muito próximas da normalidade, ou seja, do grupo não

colítico tratado com veículo.

O muco do cólon é composto por duas camadas, a de muco interno

formada pelas células de Goblet (caliciformes) e uma camada externa onde

as bactérias comensais podem se fixar e usufruir dos glicanos fornecidos

pelas mucinas. Em paralelo à melhora na organização histológica, os

animais tratados com ESTE apresentaram um aumento na marcação para

mucinas quando comparado ao grupo colítico tratado com veículo. No

modelo de colite ulcerativa induzida por DSS há um desequilíbrio na

camada mucosa composta por mucinas, em decorrência da depleção de

células de Goblet, o que favorece a penetração de bactérias e seus produtos

em túnicas como a lâmina própria colônica (JOHANSSON; HANSSON,

2013). Desta forma, ainda que parcialmente, é possível sugerir que a

preservação dos níveis de mucina na mucosa colônica seja um evento

primário no mecanismo de ação do ESTE.

Como descrito por Johansson e Hansson (2013), a infiltração de

células imunes é observada a partir do terceiro dia de consumo de DSS, e

uma inflamação severa é verificada a partir do quinto dia. Sendo assim, há

uma exposição suficientemente grande de bactérias ao epitélio sendo que o

sistema imunológico subjacente desencadeará uma forte reação imunológica

e inflamatória. Durante reações inflamatórias os leucócitos geram EROs a

fim de combater os patógenos, e por outro lado, atacando os ácidos graxos

poli-insaturados de membranas biológicas do hospedeiro. Antioxidantes,

como os carotenoides, possuem uma importante interação no combate as

EROs pois são componentes das membranas celulares (SELVARAJ;

SHANMUGASUNDARAM; KLASING, 2010). Assim a atividade

antioxidante da luteína também é interessante no combate a produção de

EROs advindas de leucócitos recrutados durante a reação inflamatória

promovida pelo DSS no cólon.

Em contrapartida à produção de EROs, os tecidos possuem um sistema

antioxidante que conta com enzimas que catalisam, após uma reação em

cadeia, a transformação das mesmas em produtos menos reativos, dentre

tais enzimas encontram-se a superóxido dismutase (SOD) e a catalase

(CAT).

113

A SOD é uma enzima que promove um papel importante na

metabolização do O2 • -

a fim de evitar reações oxidantes que podem causar

danos e formação de EROs, incluindo peróxido de hidrogênio (H2O2),

hipoclorito (OCL-), peroxinitrato (ONO2

-) e radical hidroxila (OH

•)

(MILLER, 2011). A enzima CAT promove o controle da concentração de

H2O2 e outros radicais, sendo um fator importante na inflamação (GOYAL;

BASAK, 2010).

De forma interessante, a administração de ESTE normalizou a

atividade da SOD em níveis próximos aos basais, porém aumentou

significativamente a atividade da CAT. A regulação da expressão de CAT é

feita nos níveis de transcrição, pós-transcrição e pós-tradução, sendo

regulada pelo PPARγ que controla a expressão do gene CAT pela ligação a

um elemento de resposta PPARγ distal (PPRE) (KODYDKOVÁ et al.,

2014). A luteína, presente no ESTE, pode estra interagindo na transdução de

sinal através do PPAR e do receptor de ácido retinoico (RXR) modificando

assim as respostas inflamatórias (SELVARAJ;

SHANMUGASUNDARAM; KLASING, 2010). Assim, é possível que a

ativação de receptores PPAR por carotenoides presentes no ESTE possa

justificar, através da ativação de peroxissomos, o aumento significativo da

atividade da CAT descrita nesta pesquisa. Entretanto, experimentos

adicionais ainda são necessários para confirmar tal hipótese.

A enzima glutationa-S-transferase (GST) desempenha um importante

papel na detoxificação de inúmero xenobióticos como carcinógenos,

poluentes ambientais e quimioterápicos (SHEEHAN et al., 2001).

Desenvolve importante papel também a nível celular, removendo as EROS,

induzindo a apoptose, promovendo a síntese de esteroides e prostaglandinas

e o catabolismo da tirosina. Estudos tem demonstrado que níveis

diminuídos de GST estão associados a tumores, principalmente o carcinoma

colorretal (BEYERLE et al., 2015).

Indivíduos que apresentam a CU são grandes candidatos a

desenvolverem carcinoma colorretal. O processo inflamatório associado às

EROS e alguns radicais livres são causadores de danos genéticos ao epitélio

colônico (YASHIRO, 2014). As enzimas de biotransformação na mucosa

colônica são geralmente baixas e, em combinação com exposição crônica a

compostos carcinogênicos aumentam as chances de risco de câncer

colorretal. A atividade alta de GST no cólon de indivíduos saudáveis está

relacionada com uma maior capacidade de detoxificar carcinógenos e

114

favorecer uma proteção contra danos citogenéticos, porém se a atividade

aumentada da GST contribui ou não para a prevenção do câncer não foi

demonstrada em humanos, e necessita de mais pesquisas (BEYERLE et al.,

2015). O presente estudo demonstrou que a administração de ESTE (300

mg/kg v.o) normalizou os níveis de GST quando comparada ao grupo não-

colítico, indicando que o favorecimento do arsenal enzimático detoxificante

também faz parte dos efeitos benéficos da administração do extrato, o que

poderá ser promissor na prevenção do aparecimento de lesões neoplásicas à

partir da inflamação colônica.

Além das defesas enzimáticas, antioxidantes não enzimáticos como o

GSH, um tiol não proteico abundante composto pelos aminoácidos

glutamina, cisteína e glicina, também são fundamentais para a defesa

colônica frente ao estresse oxidativo. Esse tripeptídeo pode ser encontrado

na forma oxidada (GSSH) ou na forma reduzida (GSH). Tem como função

principal a regulação através de alguns mecanismos, como: GSH não

enzimaticamente reage com O2• e •OH; é cofator para algumas enzimas

como a GPx; modula uma variedades de funções proteicas via S-

glutationilação; serve como armazenamento de cisteína. Em condições

saudáveis é importante haver um balanço ideal entre GSH/GSSH

intracelular (PATLEVIč et al., 2016).

Rana et al. (2014) avaliaram o papel do estresse oxidativo e dos níveis

de antioxidantes em eritrócitos de pacientes com CU do norte da Índia. Os

autores concluíram que os pacientes com CU apresentam um aumento do

estresse oxidativo e diminuição dos níveis de GSH e sugerem, que os

mesmos podem ser tratados com antioxidantes além da terapia

medicamentosa tradicional. Corroborando com o dados discutidos até aqui,

a administração do ESTE (300 mg/kg v.o) promoveu aumento na

disponibilidade de GSH quando comparado ao grupo colítico-veículo, o que

indica preservação de agentes redutores endógenos e por conseguinte reflete

redução da produção ou sequestro de EROs.

Bashir e Gilani (2008) demonstraram em estudo in vitro que o extrato

de Tagetes erecta possui uma atividade antioxidante significativa em vários

sistemas oxidativos, os quais podem ser atribuídos à inibição dos radicais

livres e a capacidade redutora e de doação de hidrogênio. Esse achado

corrobora com o resultado obtido da administração de ESTE em evitar a

depleção de GSH, pois se há sequestro de radicais livres por ação de

fitoconstituintes, o GSH será menos degradado e ficará mais disponível.

115

Rajendran et al. (2014) explicam que no processo inflamatório, as

ERRO são produzidas através da ativação de neutrófilos e macrófagos e é

dosada pelos níveis de lipoperoxidação (LOOH). Trata-se de um processo

ocorrente quando a cadeia de ácidos graxos poli-insaturados dos

fosfolipídeos da membrana celular é agredida por EROS degradando a

membrana. A fosfolipase A2 ativada pelas EROS desintegra os

fosfolipídeos, liberando os ácidos graxos não saturados ocasionando em

diversos fatores lesivos. Surpreendentemente, a análise dos níveis de

LOOH, no presente estudo, não apresentou diferença estatística significativa

entre os grupos experimentais.

A mieloperoxidase (MPO) faz parte das enzimas heme peroxidase,

presente principalmente nos grânulos azurófilos dos neutrófilos, os quais

são células fagocíticas móveis e constituem o tipo de célula efetoras

primárias do sistema imune inato, que tem como papel principal encontrar,

ingerir e destruir uma ampla gama de patógenos invasores. Por muito

tempo, a enzima MPO foi considerada uma enzima bactericida, tendo como

função principal gerar EROs para favorecer a morte de patógenos. Ela está

intimamente ligada na homeostase celular e é um fator importante no início

e progressão de várias doenças inflamatórias, tendo um interesse em várias

doenças inflamatórias crônicas, desempenhando um papel importante tanto

na saúde quanto na doença. Especificamente na saúde ela é um componente

importante dos neutrófilos e monócitos necessários para matar e digerir

patógenos fagocitados. Em doenças inflamatórias, a MPO participa de

eventos que contribuem para a iniciação e propagação da resposta

inflamatória (VEEN; WINTHER; HEERINGA, 2009).

Em pacientes com DII é comum o acúmulo de neutrófilos em conjunto

com o aumento da atividade da MPO observado nas lesões da mucosa

intestinal. Resultados obtidos em modelos animais reforçam a suposição

que os neutrófilos contribuem para a lesão tecidual na DII. A administração

oral de DSS em animais, como a realizada no presente trabalho, está

associada a uma abundante infiltração de neutrófilos, indicando um papel

importante na inflamação mediada por neutrófilos no desenvolvimento da

colite, reforçando a importância da pesquisa de antioxidantes que atuem

nesse mecanismo, reduzindo a infiltração neutrofílica e consequentemente

os níveis de MPO (NATSUI et al., 1997; ROBINSON et al., 1997;

KRUIDENIER et al., 2003; MOROHOSHI et al., 2006; NAITO; TAKAGI;

YOSHIKAWA, 2007). Comprovando redução do processo inflamatório, a

116

administração do ESTE na dose de 300 mg/kg (v.o) reduziu a atividade da

MPO.

Ainda relacionando os marcadores inflamatórios da DII, temos o

TNF-α o qual é uma citocina pró-inflamatória e imunorreguladora que

aumenta a migração de leucócitos, promove a transcrição de vários genes

inflamatórios e causa apoptose de células epiteliais intestinais, envolvida no

metabolismo ósseo e no desenvolvimento de órgãos linfoides. Trata-se da

citocina mais importante da cascata inflamatória do trato gastro intestinal e

está aumentada no soro, cólon e fezes de pacientes com CU (AFZALI;

FAUSEL, 2015; PARK; JEEN, 2015). Reforçando o efeito anti-

inflamatório intestinal do ESTE (300 mg/kg v.o), os níveis de TNF colônico

foram reduzidos em animais tratados com o extrato.

A IL-6, é uma citocina que desempenha diferentes papéis regulatórios

da resposta imune adaptativa na inflamação crônica, como é o caso da DII.

Tem importância central na regulação e equilíbrio de células T pró-

inflamatórias como Th1, Th17 e Tregs imunossupressoras. A IL-6 tem sido

considerada importante na correlação entre inflamação e desenvolvimento

de câncer. A inibição ou atenuação dessa citocina parece ser uma opção de

tratamento para patologias envolvidas na inflamação, como é o caso da CU

(WALDNER; NEURATH, 2014). De forma interessante, o tratamento com

ESTE (300 mg/kg v.o) também foi capaz de reduzir os níveis de IL-6,

reforçando ainda mais seu potencial anti-inflamatória na CU.

Corroborando com os resultados de TNF- α e de IL-6 nos tecidos

colônicos de animais tratados com ESTE, Trivedi e Jena (2014) verificaram

que o tratamento com β-caroteno reduziu significativamente os níveis de

marcadores inflamatórios como IL-6 e TNF- α no cólon de camundongos

com CU, confirmando as propriedades anti-inflamatória de carotenoides.

A motilidade gastrointestinal é regulada através de ação hormonal,

tanto de forma circulante quanto local, além de neurotransmissores,

principalmente do sistema nervoso entérico. A liberação dessas substâncias

é regulada pelo sistema nervoso central (SNC), onde os hormônios

intestino-cérebro como colecistocinina (CCK), peptídeo intestinal vasoativo

(VIP) e peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) são

mediadores na regulação gastrointestinal. Estresse (trauma, frio e dor, por

exemplo) podem induzir a liberação desses peptídeos do SNC e desregular a

motilidade intestinal (PEUHKURI, 2010).

117

Um dos principais sintomas da CU é a diarreia sanguinolenta. Desta

forma, o número de evacuações e a composição diária das fezes são

parâmetros importantes na avaliação da atividade da doença por meio de

diferentes classificações (ou escores) clínicos (HAASE et al., 2016). A

citocinas envolvidas na inflamação intestinal podem promover um aumento

da permeabilidade intestinal, além de afetar a contratilidade das células

musculares lisas intestinais aumentando a dismotilidade gastrointestinal e

possivelmente afetando o trânsito gastrointestinal. Adicionalmente, em

pacientes que apresentam CU se observa anormalidades estruturais no

sistema nervoso entérico, as quais podem, provavelmente, afetar a

motilidade gastrointestinal e o padrão de trânsito intestinal, não somente

restrito ao local da inflamação e, consequentemente, a inflamação pode

causar dismotilidade do trato gastrointestinal dentro e fora das regiões

inflamadas (VILLANACCI et al., 2008; AKIHO et al. 2011; BASSOTTI,

2014; HAASE et al., 2016).

Em animais saudáveis a administração de ESTE (300 mg/kg v.o) não

alterou o trânsito intestinal quando comprado ao grupo veículo. Também

não houve alteração no índice de diarreia nos animais que receberam óleo

de rícino. Porém, observando os animais colíticos tratados com o ESTE

durante o experimento, foi possível observar redução da diarreia nos

mesmos, fato este observado nos resultados de índice de atividade da

doença (IAD).

Porém, Ventura-martínez et al. (2018) relatam que o extrato aquoso

das flores de T. erecta exibiu uma atividade espasmolítica, possivelmente

envolvendo a participação dos canais de cálcio, corroborando com os

achados de uso popular da infusão das flores para aliviar cólicas

abdominais. Contraditoriamente, o extrato aquoso pode induzir contrações

abdominais, como um efeito adverso, quando utilizado para outras queixas

como anti-helmíntico, diurético, tranquilizante, hipoglicemiante,

hipolipidêmico ou antitussígeno (VENTURA-MARTÍNEZ et al., 2018).

Diferentemente, o ESTE é um extrato hidroetanolico, e sua ação na

motilidade intestinal, ou seja, em reduzir a diarreia de animais colíticos, mas

não de reduzir o transito intestinal de animais saudáveis, possivelmente, se

dê pelo fato de propriedades anti-inflamatórias e não por possuir

propriedades inibitórias da motilidade intestinal.

Os dados demonstram o potencial anti-inflamatório intestinal do ESTE

na atenuação das alterações patológicas decorrentes da colite ulcerativa

118

induzida por DSS em camundongos. Vale ressaltar, que os níveis de luteína

presentes no extrato podem justificar tal efeito, dado que o potencial

farmacológico deste carotenoide em desordens inflamatórias e oxidativas

têm sido descrito. Por conseguinte, ainda que pré-clinicamente, este estudo

contribui para a validação do uso deste extrato como suplemento nutricional

para o tratamento adjuvante de desordens inflamatórias intestinais. Assim,

os dados obtidos indicam que a melhora nos parâmetros de estresse

oxidativo e a atenuação de secreção de citocinas inflamatórias participam do

modo de ação do ESTE em reduzir a CU.

Entretanto, vale ressaltar que outros fitoconstituintes do ESTE também

podem participar dos efeitos obtidos, assim a complexidade do extrato em

detrimento à suplementação de luteína pura, pode ser um recurso

interessante em se tratando da diversidade de moléculas e mecanismos

bioativos.

119

CONCLUSÃO

Há um potencial anti-inflamatório intestinal do ESTE na atenuação

das alterações patológicas decorrentes da colite ulcerativa;

Os níveis de luteína presentes no extrato podem justificar tal efeito;

Pré-clinicamente, este estudo contribui para a validação do uso

deste extrato como suplemento nutricional para o tratamento

adjuvante de desordens inflamatórias intestinais;

A melhora nos parâmetros de estresse oxidativo e a atenuação de

secreção de citocinas inflamatórias participam do modo de ação do

ESTE em reduzir a CU;

Outros fitoconstituintes do ESTE também podem participar dos

efeitos obtidos.

121

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ANEXO A

Aprovação da Comissão de Ética no uso de animais –

CEUA/UNIVALI.

atividade anti-inflamatÓria intestinal do extrato …

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