ativaÇÃo microbiana em compostagem de resÍduo … araujo... · 2 então a nossa boca se encheu...
TRANSCRIPT
Universidade Federal do Tocantins
Câmpus de Gurupi Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal
GILSON ARAUJO DE FREITAS
ATIVAÇÃO MICROBIANA EM COMPOSTAGEM DE RESÍDUO RUMINAL BOVINO
GURUPI - TO 2016
Universidade Federal do Tocantins
Câmpus de Gurupi Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal
GILSON ARAUJO DE FREITAS
ATIVAÇÃO MICROBIANA EM COMPOSTAGEM DE RESÍDUO
RUMINAL BOVINO
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal da Universidade Federal do Tocantins como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Produção Vegetal.
Orientador: Prof. Dr. Rubens Ribeiro da Silva
Co-orientador: Prof. Dr. Alex Fernando de Almeida
GURUPI - TO 2016
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca da Universidade Federal do Tocantins
Campus Universitário de Gurupi
F866a Freitas, Gilson Araujo de Ativação microbiana em compostagem de resíduo ruminal bovino /
Gilson Araujo de Freitas - Gurupi, 2016. 88f.
Tese de Doutorado – Universidade Federal do Tocantins, Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, 2016. Linha de pesquisa: Manejo do Solo e Água. Orientador: Prof. Dr. Rubens Ribeiro da Silva.
1. fungos celulolíticos. 2. resíduo ruminal bovino. 3. farinha de carne e osso. 4. cultura mista. I. Silva, Rubens Ribeiro da II. Universidade Federal do Tocantins. III. Título.
CDD 635
TODOS OS DIREITOS RESERVADOS – A reprodução total ou parcial, de qualquer forma ou por qualquer meio deste documento é autorizado desde que citada a fonte. A violação dos direitos do autor (Lei nº 9.610/98) é crime estabelecido pelo artigo 184 do Código Penal.
Universidade Federal do Tocantins Câmpus de Gurupi Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal
Defesa nº 4
ATA DA DEFESA PÚBLICA DA TESE DE DOUTORADO DE GILSON ARAUJO DE FREITAS, DISCENTE DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO
VEGETAL DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
Aos 28 dias do mês de março do ano de 2016, às 8:00 horas, na Sala 15 do Bloco BALA II, reuniu-se a Comissão Examinadora da Defesa Pública, composta pelos seguintes membros: Prof. Orientador Dr.Rubens Ribeiro da Silva do Câmpus Universitário de Gurupi/ Universidade Federal do Tocantins, Prof. Dr. Alex Fernando de Almeida do Câmpus Universitário de Gurupi/ Universidade Federal do Tocantins, Prof. Dr. Rodrigo Ribeiro Fidelis do Câmpus Universitário de Gurupi/ Universidade Federal do Tocantins, Prof. Dr. Aloísio Freitas Chagas Júnior do Câmpus Universitário de Gurupi/ Universidade Federal do Tocantins, Prof. Dr. Antônio Clementino dos Santos do Câmpus Universitário de Araguaína/ Universidade Federal do Tocantins, sob a presidência do primeiro, a fim de proceder a arguição pública da TESE DE DOUTORADO de GILSON ARAUJO DE FREITAS , intitulada
" Ativação microbiana em compostagem de resíduo ruminal bovino ". Após a
exposição, o discente foi arguido oralmente pelos membros da Comissão Examinadora, tendo parecer favorável à aprovação, habilitando-o ao título de Doutor em Produção Vegetal. Nada mais havendo, foi lavrada a presente ata, que, após lida e aprovada, foi assinada pelos membros da Comissão Examinadora.
Dr. Alex Fernando de Almeida
Primeiro examinador
Dr. Rodrigo Ribeiro Fidelis
Segundo examinador
Dr. Aloísio Freitas Chagas Júnior Terceiro examinador
Dr. Antônio Clementino dos Santos Quarto examinador
Dr. Rubens Ribeiro da Silva
Universidade Federal do Tocantins Orientador e presidente da banca examinadora
Gurupi, 28 de março de 2016.
Dr. Rodrigo Ribeiro Fidelis
Coordenador do Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal
5
DEDICATÓRIA
Dedico esta Tese de Doutorado a Deus Pai, Filho e Espírito Santo, à minha
esposa Miréia Aparecida Bezerra Pereira de Freitas, à minha filha Isabela Bezerra
de Freitas e aos meus pais Raimundo Nonato de Freitas e Maria Antônia de Araujo.
Salmos 126
1 Quando o SENHOR trouxe do cativeiro os que voltaram a Sião, estávamos
como os que sonham.
2 Então a nossa boca se encheu de riso e a nossa língua de cântico; então
se dizia entre as nações: Grandes coisas fez o Senhor a estes.
3 Grandes coisas fez o Senhor por nós, pelas quais estamos alegres.
5 Os que semeiam em lágrimas segarão com alegria.
6 Aquele que leva a preciosa semente, andando e chorando, voltará, sem
dúvida, com alegria, trazendo consigo os seus molhos.
6
AGRADECIMENTOS
À DEUS, o criador do céu e da terra, que conduz minha vida com infinita
bondade e amor;
Ao meu orientador Rubens Ribeiro da Silva, que é o responsável pela minha
permanência na pesquisa, pela amizade, agradável convívio e paciência em todos
os momentos. Pela confiança, apoio, ajuda e ensinamentos durante a minha vida
acadêmica e que servirão para a minha vida profissional. A você, meus sinceros
agradecimentos!
Ao meu co-orientador Alex Fernando de Oliveira, pela atenção dispensada,
apoio, ajuda e valiosas sugestões neste trabalho;
À banca examinadora composta pelos professores Rodrigo Ribeiro Fidelis,
Aloísio Freitas Chagas Júnior e Antônio Clementino dos Santos, por prontamente
aceitar ao convite;
À Universidade Federal do Tocantins, pela oportunidade para a realização
do curso e por minha formação profissional;
Ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal da UFT de Gurupi,
pelo apoio institucional. À secretária da Pós-Graduação Érika;
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudos;
Ao Laboratório de Microbiologia na pessoa do professor Aloísio Freitas
Chagas Júnior e ao Laboratório de Análise de Alimentos e Purificação dos
Bioprodutos na pessoa do professor Alex Fernando de Oliveira;
Aos meus pais Raimundo Nonato de Freitas e Maria Antônia de Araújo, que
com muito amor se empenharam para que eu alcançasse meus objetivos. Aos meus
irmãos James, Mayane, Dayane, Jailson e João;
À minha esposa, Miréia Aparecida, agradeço pelo companheirismo,
paciência e carinho. Que contribuiu tanto neste trabalho, você sabe disso, eu só
tenho a agradecer a Deus pela sua vida, que você continue sendo essa pessoa tão
amável.
Aos colegas do grupo de pesquisa, Antônio Carlos, Jefferson, Rubson,
Álvaro, Paulo, Moisés, Ângela, Andrei, Mohamede, Bruno, pela ajuda na condução
deste trabalho;
Aos técnicos do laboratório de solos Túlio Teixeira e Ângela pelo apoio.
7
RESUMO GERAL
O estudo foi dividido em três capítulos, dos quais o primeiro é uma revisão de literatura sobre fungos com potencial celulolítico, metodologias para isolamento, triagem e desenvolvimento de inóculo. Aborda os fungos com potencial de degradação da celulose, como os gêneros Aspergillus e Trichoderma, bem como os procedimentos para o isolamento, purificação e triagem dos fungos com potencial celulolítico e de suas respectivas atividades enzimáticas. O segundo capítulo objetivou avaliar efeito ativador da farinha de carne e osso na sucessão microbiana e decomposição de resíduo ruminal bovino. Os tratamentos foram obtidos em um arranjo fatorial (4 x 6), sendo o fator um composto por quatro épocas sucessionais de amostragens ao longo do processo de compostagem, aos 7, 21, 39 e 62 dias e o fator dois por seis doses de farinha de carne e osso (FCO). Durante o processo de compostagem foram isoladas e purificadas 263 bactérias e 116 fungos. O efeito ativador pelo uso de doses crescentes da FCO a partir dos 39 dias passa a ser significativamente positivo em função do aumento das doses de FCO e também indicaram aumento na degradação do resíduo ruminal bovino com a alteração nos indicadores temperatura, umidade, açúcares redutores totais, condutividade elétrica, pH e proteína. O terceiro capítulo teve como objetivo avaliar a compatibilidade de cultura mista de fungos celulolíticos para bioconversão de resíduos ruminal em pilhas de compostagem. A triagem dos fungos celulolíticos aos 7, 21, 39 e 62 dias foi realizada em meio de Vogel, suplementado com 1% da fonte de carbono carboximetilcelulose e os isolados com potencial enzimático foram testados em cultivos submersos para a produção das enzimas FPase, endoglicanase, exoglicanase e xilanase. Os fungos com as maiores produções enzimáticas foram testados em cultura mista por fermentação em estado sólido. Dos 116 fungos isolados ao longo da compostagem, 41% apresentaram halo indicador da degradação da carboximetilcelulose. A triagem desses fungos revelou que 50% dos maiores índices enzimáticos e 78,12% dos halos de degradação foram obtidos aos 7 dias. Os fungos (1T5501 - 0,203 U ml-1), (1T5501 - 42,563 U mL-1) e (2T5501 - 20,122 U mL-1) apresentam potencial para produção das enzimas FPase,
endoglucanase e xilanase e quando em cultura mista, ocorrem interações mutualísticas em três combinações. Diante disso, o enriquecimento do resíduo ruminal com a farinha de carne e osso potencializa a decomposição e a sucessão microbiana e a obtenção de combinações mutualísticas de fungos celulolíticos o que tornar-se possível fonte de inóculo para futuros processos de compostagem.
Palavras-chave: fungos celulolíticos; biotransformação; farinha de carne e osso; cultura mista.
8
GENERAL ABSTRACT
The study was divided into three sections, the first of which is a review of literature on lifting with cellulolytic fungi potential methodologies for the isolation, screening and development of inoculum. Addresses fungi with pulp degradation potential as the genera Aspergillus and Trichoderma, as well as procedures for isolation, purification and screening of cellulolytic fungi with potential and their respective enzymatic activities. The second chapter aimed to evaluate activating effect of meat and bone meal in microbial succession and decomposition of bovine rumen waste. The treatments were obtained in a factorial arrangement (4 x 6), the one factor comprises four successional sampling dates over the composting process, after 7, 21, 39 and 62 days and the two factor of six flour doses meat and bone (FCO). During the composting process were isolated and purified 263 and 116 bacteria fungi. The activating effect by using increasing doses of FCO from 39 days happens to be significantly positive in terms of increased FCO doses and also indicated an increase in the degradation of rumen bovine residue with the change in indicators temperature, humidity, total reducing sugars , electrical conductivity, pH and protein. The third chapter aimed to evaluate the mixed culture compatibility cellulolytic fungi for bioconversion rumen waste in compost piles. The screening of cellulolytic fungi at 7, 21, 39 and 62 days was conducted in the middle of Vogel, supplemented with 1% carboxymethylcellulose carbon source and isolated by enzymatic potential were tested in submerged culture for the production of FPase enzymes, endoglucanase, exoglicanase and xylanase. Fungi with the highest enzyme productions were tested in mixed culture by solid state fermentation. Of the 116 fungi isolated over compost, 41% showed halo indicator of carboxymethyl cellulose degradation. The screening of these fungi showed that 50% of the largest indices and 78.12% enzymatic degradation halos were obtained after 7 days. Fungi (1T5501 - 0.203 U ml-1) (1T5501 - 42.563 U mL-1) and (2T5501 - 20.122 U mL-1) have potential for the production of FPase enzymes, endoglucanase and xylanase and when in mixed culture, mutualistic interactions occur in three combinations. Thus, the enrichment of ruminal residue with meat and bone meal enhances decomposition and microbial succession and achieving mutualistic combinations of cellulolytic fungi which become possible source of inoculum for future composting processes. Key words: cellulolytic fungi; biotransformation; meat and bone meal; mixed culture.
9
SUMÁRIO
Introdução Geral......................................................................................................15
Capítulo 1 - Fungos com potencial celulolítico, metodologias para isolamento,
triagem e desenvolvimento de inóculo: revisão...................................................18
Resumo................................................................................................................18
Abstract................................................................................................................18
1. Introdução.....................................................................................................19
2. Fungos celulolíticos......................................................................................20
3. Isolamento e triagem de fungos com potencial celulolítico.....................27
3.1. Isolamento de microrganismos celulolíticos ........................................27
3.2. Triagem de microrganismos celulolíticos .............................................28
3.3. Avaliação da produção da atividade celulolítica...................................29
3.4. Cálculo do índice enzimático (IE).........................................................29
3.5. Determinação do potencial enzimático................................................29
3.6. Avaliação da atividade enzimática em fermentação submersa...........30
3.7. Avaliação da atividade enzimática por fermentação estado
sólido...............................................................................................................31
3.8. Atividade de celulases totais (FPase)..................................................31
3.9. Atividade de endoglicanase, exoglicanase e xilanase.........................31
3.10. Microrganismos celulolíticos como fonte de inóculo.............................32
4. Considerações finais.....................................................................................33
5. Referências Bibliográficas ..........................................................................33
Capítulo 2 - Efeito ativador da farinha de carne e osso na sucessão microbiana
e decomposição de resíduo ruminal bovino.........................................................40
Resumo .............................................................................................................40
10
Abstract..............................................................................................................40
1. Introdução............................................................................................41
2. Material e Métodos..............................................................................42
2.1 Caracterização do experimento...........................................................42
2.2 Características físico-química da biomassa.........................................43
2.3. Dinâmica físico-química no processo de compostagem do resíduo
ruminal...............................................................................................................44
2.4. Dinâmica microbiana do processo de compostagem do conteúdo
ruminal...........................................................................................................45
2.5 Estatística................................................................................................46
3. Resultados e Discussão.....................................................................46
3.1. Dinâmica físico-química no processo de compostagem do resíduo
ruminal...............................................................................................................46
3.2. Dinâmica microbiana do processo de compostagem do conteúdo
ruminal...............................................................................................................52
3.2.1. Número de colônias........................................................52
3.2.2. Diversidade de colônias..................................................55
4. Conclusões..........................................................................................58
5. Referências..........................................................................................58
Capítulo 3 - Compatibilidade de cultura mista com fungos celulolíticos para
degradação de resíduo ruminal em pilhas de compostagem..............................64
Resumo...............................................................................................................64
Abstract…………………………………………………………...............................64
1. Introdução......................................................................................................65
2. Material e Métodos.........................................................................................67
2.1 Seleção de Microrganismos Produtores de Enzimas Extracelulares....67
2.2. Isolamento dos microrganismos...........................................................68
2.3. 1ª Triagem: microrganismos celulolíticos..............................................68
11
2.4. Seleção de fungos filamentosos celulolíticos.......................................69
2.4.1. 2ª Triagem: cultivo submerso.........................................69
2.5. Análise enzimática................................................................................69
2.5.1. Atividade de celulases totais (FPase).............................69
2.5.2. Atividade de endoglucanase, exoglucanase e
xilanase.............................................................................................70
2.5.3. Desenvolvimento de cultura mista..................................70
2.5.4. Desenho experimental para os testes de
compatibilidade.................................................................................71
2.5.5. Teste de compatibilidade entre fungos filamentosos em
cultivos em estado sólido..................................................................72
2.6 Estatística..............................................................................................72
3. Resultados e Discussão..............................................................................72
3.1. Etapa 1: Seleção de microrganismos produtores de enzimas
extracelulares..................................................................................................72
3.2. Etapa 2: Seleção de fungos celulolíticos em cultivo submerso..........74
3.3. Desenvolvimento de cultura mista para produção de enzimas............76
3.4. Cultivo de fungos filamentosos em conteúdo ruminal bovino..............80
4. Conclusões.........................................................................................82
5. Referências.........................................................................................82
Considerações finais...............................................................................................87
12
LISTA DE TABELAS
Capitulo 3 - Compatibilidade de cultura mista com fungos celulolíticos para
degradação de resíduo ruminal em pilhas de compostagem
Tabela 1. Modelos de interação entre fungos filamentosos. Gurupi – TO,
2016............................................................................................................................70
Tabela 2. Atividade celulase de fungos filamentosos isolados da compostagem de
resíduos de frigorifico, cultivados em meios sintéticos com carboximetilcelulose por 5
dias a 30°C. Gurupi – TO, 2016.................................................................................73
Tabela 3. Produção de FPase, endoglicanase, exoglicanase e xilanase por fungos
filamentosos provenientes de conteúdo ruminal bovino em fonte de carbono farelo
de trigo. Gurupi – TO, 2016........................................................................................75
Tabela 4. Tipos de interações entre quatro fungos obtidos pra FPase e entre quatro
fungos obtidos pra xilanase em meio BDA. Gurupi – TO, 2016.................................77
Tabela 5. Tipos de interação entre fungos FPase x xilanase em meio BDA. Gurupi –
TO, 2016.....................................................................................................................78
Tabela 6. Diâmetro máximo das colônias de fungos com interações mutualísticas no
2º e 6º dia. Gurupi – TO, 2016...................................................................................79
Tabela 7. Produção de FPase e xilanase por fungos filamentosos em substrato de
conteúdo ruminal bovino enriquecido com farinha de carne e osso. Gurupi – TO,
2016............................................................................................................................81
13
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 1- Fungos com potencial celulolítico, metodologias para isolamento,
triagem e desenvolvimento de inóculo: revisão
Figura 1. Estrutura da parede celular vegetal...........................................................20
Figura 2. Representação esquemática de alongamento e ramificação das hifas em
resíduos .....................................................................................................................21
Figura 3. Representação da estrutura linear da celulose, formada pelas unidades de
celobiose....................................................................................................................22
Figura 4. Micrografia eletrônica do Trichoderma reesei............................................23
Figura 5. Micrografia eletrônica do Aspergillus Níger.................................................24
Figura 6. Micrografia eletrônica do Penicillium echinulatum......................................25
Figura 7. Micrografia eletrônica do micélio do Phanerochaete chrysosporium..........26
Figura 8. Micrografia eletrônica do micélio do Ganoderma lucidum..........................27
Capítulo 2 - Efeito ativador da farinha de carne e osso na sucessão microbiana
e decomposição de resíduo ruminal bovino
Figura 1. Pilhas de compostagem com conteúdo ruminal bovino enriquecido com
farinha de carne e osso em diferentes concentrações (1A) e pontos de amostragem
(1B) ao longo do processo de compostagem. Gurupi – TO, 2016.............................43
Figura 2. Dinâmica da temperatura (ºC) durante o período de compostagem em
função dos diferentes tratamentos. Gurupi – TO, 2016.............................................47
Figura 3. Dinâmica da umidade durante o processo de compostagem. Gurupi – TO,
2016...........................................................................................................................48
Figura 4. Teores de açúcares redutores totais durante período de compostagem.
Gurupi – TO, 2016......................................................................................................49
Figura 5. Condutividade elétrica durante período de compostagem. Gurupi – TO,
2016............................................................................................................................50
Figura 6. pH durante período de compostagem. Gurupi – TO, 2016.........................51
Figura 7. Teores de proteína durante período de compostagem. Gurupi – TO,
2016............................................................................................................................52
14
Figura 8. Número de colônias de bactérias (log UFC ml-1) em função de diferentes
compostos (tratamentos) e épocas de coleta do material em compostagem para
isolamento de microrganismos, Gurupi – TO, 2015...................................................53
Figura 9. Número de colônias de fungos (log UFC ml-1) em função de diferentes
compostos (tratamentos) e épocas de coleta do material em compostagem para
isolamento de microrganismos, Gurupi – TO, 2015...................................................54
Figura 10. Diversidade de colônias de bactérias em função de diferentes compostos
(tratamentos) e épocas de coleta do material em compostagem para isolamento de
microrganismos, Gurupi – TO, 2016..........................................................................55
Figura 11. Diversidade de colônias de fungos em função de diferentes compostos
(tratamentos) e épocas de coleta do material em compostagem para isolamento de
microrganismos, Gurupi – TO, 2016..........................................................................57
Capitulo 3 - Compatibilidade de cultura mista com fungos celulolíticos para
degradação de resíduo ruminal em pilhas de compostagem
Figura 1. Pontos de amostragens em pilhas de compostagem de conteúdo ruminal
bovino. Gurupi – TO, 2016.........................................................................................67
Figura 2. Diagrama esquemático das interações entre duas linhagens diferentes de
fungos filamentosos crescidos em ágar batata dextrose (Modificado de Stahl e
Cristensen, 1992).......................................................................................................71
15
INTRODUÇÃO GERAL
O interesse na utilização adequada e eficiente dos resíduos agroindustriais
tem sido crescente. Dentre os resíduos destaca-se o resíduo ruminal bovino. É o
resíduo de maior relevância nas indústrias frigoríficas, requerendo assim, especial
atenção no que se refere a seu gerenciamento, devido à elevada umidade do
material e dificuldade de destino. A produção mundial de resíduo ruminal em
frigoríficos e abatedouros bovinos é entorno de 5,9 bilhões de toneladas por ano e o
Brasil contribui com 847 milhões de toneladas desse resíduo (USDA, 2013; IBGE,
2015).
A transformação desse resíduo ocorre na sua maioria por processo de
compostagem que é controlado por fatores abióticos e bióticos. Durante o processo
de compostagem, a matéria orgânica passa por três diferentes fases (mesofílica,
termofílica e de maturação do composto) realizadas principalmente pela ação de
bactérias e fungos. Os fungos são os organismos mais importantes durante a fase
termofílica da compostagem aeróbica (BIALOBRZEWSKI et al., 2015).
Apesar da elevada carga microbiológica presente na matéria orgânica
destinada à compostagem, o processo total pode demorar até 120 dias, o que,
acrescido aos custos de instalações, máquinas e mão de obra, tornam o processo
desinteressante economicamente. Dessa forma, o conhecimento e seleção da
biomassa microbiana e de sua atuação permite induzir alterações na dinâmica do
processo de transformação dos resíduos e aumentar a eficiência e redução no
tempo da compostagem (SILVA, 2010).
Para a degradação desses compostos é necessária a ação de
microrganismos que desempenham um papel essencial como fontes de novas
biomoléculas devido à diversidade química e estrutural de seus produtos, além de
serem manipulados geneticamente e suas enzimas apresentarem alta estabilidade
em processos de hidrólise enzimática (ANBU et al., 2013). O processo de
compostagem é regido por variedade de enzimas hidrolíticas que controlam a
velocidade em que os vários substratos são degradados (SHI et al., 2011). A
bioconversão da celulose do resíduo ruminal pode ser conseguida principalmente
através das ações sinérgicas de conjunto de enzimas hidrolases denominadas
celulases (SADHU e MAITI, 2013). A hidrólise enzimática de material celulósico em
glicose envolve a ação sinérgica de pelo menos três enzimas diferentes:
16
Endoglucanase, exoglucanase e glicosidase (LI et al., 2013). O sinergismo entre
estes três tipos de enzimas é que torna possível a efetiva degradação da celulose.
Para que possa haver uma redução nos custos e uma maior aceitação da
técnica de compostagem, é necessário uma aceleração do processo, que poderia
ser obtido pela adição de fontes de resíduos ricos em nutrientes de modo a reduzir a
chamada fase de atraso inicial da compostagem e também na fase termofílica, para
aumentar a taxa de degradação da matéria orgânica complexa, que normalmente
ocorre nessa fase (ZHANG et al., 2014).
Com base nessa problemática, foi proposto esse trabalho cujo objetivo foi
conhecer a comunidade microbiana das diferentes fases da compostagem, isola-los,
realizar triagem dos fungos celulolíticos, atividade enzimática e testes de
compatibilidade para fins de produção de inoculantes.
REFERÊNCIAS
ANBU, P. Characterization of solvent stable extracellular protease from Bacillus
koreensis (BK-P21A). International journal of biological macromolecules,
Elsevier, v. 56, n.1, p. 162–168, 2013.
BIALOBRZEWSKI, I.; MIKŠ-KRAJNIK, M.; DACH, J.; MARKOWSKI, M.; CZEKAŁA,
W.; GŁUCHOWSKA, K. Model of the sewage sludge-straw composting process
integrating different heat generation capacities of mesophilic and thermophilic
microorganisms. Waste Management, Houston, v.43, n.9, p.72–83, 2015.
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Indicadores ibge: Estatística
da Produção Pecuária. 2015, 80 p. Disponível
em:<http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/indicadores/agropecuaria/producaoagro
pecuaria/abate-leite-couro-ovos_201404_publ_completa.pdf> Acesso em:
29/05/2015.
LI, L.; DIEDERICK, R.; FLORA, J. R. V.; BERGE, N. D. Hydrothermal carbonization
of food waste and associated packaging materials for energy source generation.
Waste management, Houston, v. 33, n.11, p. 2478–2492, 2013.
17
SILVA, R. R. Avaliação agronômica de resíduos gerados em frigoríficos
bovinos. 2010. 90f. Tese (Tese em Agronomia) – Departamento de solos e nutrição
de plantas, Universidade Federal de Viçosa.
SADHU, S.; MAITI, T. K. Cellulase Production by Bacteria: A Review. British
Microbiology Research Journal, Gurgaon, v.3, n.3, p. 235-258, 2013.
SHI, J.; EBRIK, M. A.; YANG, B.; GARLOCK, R. J.; BALAN, V.; DALE, B. E.;
PALLAPOLU, V. R.; LEE, Y. Y.; KIM, Y.; MOSIER, N. S.; LADISCH, M. R.;
HOLTZAPPLE, M. T.; FALLS, M.; RAMIREZ, R. S.; DONOHOE, B. S.; VINZANT, T.
B.; ELANDER, R. T.; HAMES, B.; THOMAS, S.; WARNER, R. E.; WYMAN, C. E.
Application of cellulase and hemicellulase to pure xylan, pure cellulose, and
switchgrass solids from leading pretreatments. Bioresource Technology, New York,
v.102, p.80–88, 2011.
USDA. United States Department of Agriculture. Foreign Agricultural Service.
Foreign Agricultural Service [home page]. Disponível em: <http://www.fas.usda.gov/
psdonline/psdQuery.aspx psdonline>. Acesso em: 16 nov. 2015.
ZHANG, X.; ZHONG, Y.; YANG, S.; ZHANG, W.; XU, M.; MA, A.; ZHUANG, G.;
CHEN, G.; LIU, W. Diversity and dynamics of the microbial community on
decomposing wheat straw during mushroom compost production. Bioresource
Technology, New York, v.170, 183–195, 2014.
18
CAPITULO 1
FUNGOS COM POTENCIAL CELULOLÍTICO, METODOLOGIAS PARA
ISOLAMENTO, TRIAGEM E DESENVOLVIMENTO DE INÓCULO: REVISÃO
RESUMO
O isolamento de fungos com suas enzimas correspondentes têm recebido atenção
especial, pois, são os principais responsáveis pela degradação de substâncias de
difícil decomposição durante o processo de compostagem. Objetivou-se realizar
levantamento dos fungos com potencial celulolítico, metodologias para isolamento,
triagem e desenvolvimento de inóculo. Os fungos que decompõem resíduos ricos de
celulose são os principais agentes decompositores de resíduo ruminal, possuem
diversidade de enzimas com capacidade de degradação de compostos orgânicos
complexos, tais como: celulose, hemicelulose, ácidos aromáticos e algumas
proteínas. A seleção de microrganismos com maior potencial decompositor
possibilita aumentar a eficiência e reduzir o tempo do processo de compostagem e o
desenvolvimento de inóculos específicos para a transformação desse tipo de
resíduo.
Palavras chave: atividade enzimática; celulases; cultivo misto.
FUNGI LIFTING WITH POTENTIAL CELLULOLYTIC, METHODOLOGIES FOR ISOLATION, SCREENING AND INOCULUM DEVELOPMENT: REVIEW
ABSTRACT
Isolation and characterization of fungi with their corresponding enzymes have
received special attention because they are the main responsible for the degradation
of substances difficult to decompose during the composting process. Thus in the
present study aimed to carry out a survey of fungi with cellulolytic potential, methods
for isolation, screening and development of inoculum. In general, the fungi which
break down cellulose-rich waste are the main decomposers of ruminal residue
agents since they are enzymes with a diversity of degradability of complex organic
compounds such as cellulose, hemicellulose, aromatic acids and some protein. Thus,
the selection of microorganisms with greater potential decomposer enables
increasing efficiency and reducing the time of the composting process and the
development of specific inocula for processing this type of waste.
Key words: enzymatic activity; cellulases; mixed cropping.
19
1. INTRODUÇÃO
Os resíduos orgânicos são considerados um dos principais habitats para
população de microrganismos e dentre estes, encontram-se os fungos. São
encontrados em comunidades que variam de 104 a 106 organismos por grama,
participando ativamente dos processos de biodegradação, contribuindo para
ciclagem de nutrientes e consequentemente, para a manutenção dos ecossistemas
(SELLE, 2007).
Os setores agroindustriais produzem grande quantidade de resíduos, que, se
não aproveitados, representam perdas de biomassa e nutrientes de alto valor, além
de elevar os preços dos produtos finais, uma vez que o tratamento, transporte e a
disposição final dos resíduos influencia diretamente o custo do processo.
Atualmente, conceitos de recuperação, aproveitamento de subprodutos e
bioconversão de resíduos são cada vez mais difundidos e necessários para garantir
a viabilidade econômica e biocompatibilidade das cadeias agroindustriais, assim
como reduzir o impacto ambiental que o acúmulo destes resíduos provoca (WANG
et al., 2012).
A grande disponibilidade de resíduo, como resíduo ruminal bovino, estimula a
busca por microrganismos mais eficientes na transformação. A transformação de
resíduos de celulose municipais ou agropecuários pode ser realizada através dos
fungos celulolíticos, que são os organismos mais importantes durante a fase
termofílica da compostagem aeróbica (ROY et al., 2013). A bioconversão dos
polímeros lignocelulósicos pode ser realizada pela compostagem (BIALOBRZEWSKI
et al., 2015), através de microrganismos e suas enzimas correspondentes (KUHAD,
2011; KHOKHAR, 2013). O processo envolve a ação sinérgica de um complexo
celulolítico de fungos, formado por endoglucanases, exoglucanases e
β‑D‑glicosidases (VRIES e VISSER, 2001).
Os principais fungos celulolíticos incluem: os gêneros Trichoderma e
Aspergillus (CHUNDAWAT et al., 2011), como Trichoderma reesei, Trichoderma
koningii, Trichoderma lignorum, Aspergillus níger e outros como Sporotrichum
pulverulentum, Penicillium funiculosum, Penicillium iriensis, , Schizophyllumm sp,
Chaetomium sp e Humicola sp (DA SILVA et al., 1994). A reutilização de resíduos
pela ação de fungos converte em diferentes produtos de alto valor agregado como
os biocombustíveis, produtos químicos, produção de enzimas, inoculantes,
biofertilizantes, entre outros (ANWAR et al., 2014).
20
O interesse nos fungos se deve a sua capacidade de decompor diferentes
substratos, o que pode gerar produtos ou processos, como o isolamento,
purificação, caracterização e clonagem de enzimas capazes de degradar compostos
constituídos por celulose, hemicelulose e lignina, além da biodegradação de
resíduos (AMORE et al., 2013). Diante disso o objetivo foi realizar revisão
bibliográfica das espécies de fungos com potencial celulolíticos, o isolamento e
triagem de fungos com esse potencial e a determinação do potencial enzimático.
2. FUNGOS CELULOLÍTICOS
Os fungos que decompõem substâncias celulósicas ocorrem no solo e
coloniza os vegetais, as raízes e seus resíduos, com importante função de
reciclagem de nutrientes. A atividade fúngica depende do conteúdo de matéria
orgânica no solo, a qual determina sobremaneira a ocorrência e a distribuição
desses organismos (RUEGGER e TAUK-TORNISIELO, 2004). Eles são os principais
agentes decompositores do material vegetal, visto que possuem um arsenal
enzimático com capacidade de degradação de compostos orgânicos complexos,
celulose, hemicelulose, ácidos aromáticos e algumas proteínas (Figura 1).
Figura 1. Estrutura da parede celular vegetal (fonte: www.ceres.net , 2011)
Os fungos apresentam uma série de características que os tornam
interessantes para aplicação em sistemas de transformação de resíduos. Eles são
capazes de crescer sob as condições de estresse ambiental que limitam o
crescimento bacteriano. E ainda, o modo de crescimento dos fungos, induzido
quimiostaticamente em direção à fonte de carbono orgânico, através do
21
alongamento e ramificação das hifas, permite a colonização de grandes áreas. São
considerados os microrganismos mais adaptados para transformação de resíduos,
pois suas hifas podem crescer na superfície das partículas e penetrar nos espaços
intra-partículas (HOLKER e LENZ, 2005). Após a germinação de esporos, a hifa do
fungo se desenvolve em um emaranhado micelial, este por sua vez, projeta-se
formando hifas aéreas que penetra o resíduo (Figura 2).
Figura 2. Representação esquemática de alongamento e ramificação das hifas em
resíduos (Legenda no texto) (HÖLKER e LENZ, 2005).
Os espaços vazios entre as hifas aéreas são frequentemente preenchidos
por ar (g), enquanto que os espaços vazios entre o emaranhado micelial ou
partículas são preenchidos por água (l). A atividade metabólica ocorre
principalmente próxima à superfície do substrato e entre os poros, contudo regiões
expostas do micélio (hifas aéreas), também mostram metabolismo e servem como
transportadores de substâncias para as hifas penetrativas. Enzimas hidrolíticas
(azul) são produzidas pelo micélio, difundem para a matriz sólida e catalisam a
degradação de macromoléculas em unidades menores (verde). O O2 é consumido e
CO2, H2O, calor e metabólitos bioquímicos são produzidos durante o cultivo.
Portanto, gradientes se desenvolvem dentro de biofilmes que, por exemplo, forçam o
O2 difundir para a fase gasosa em regiões profundas do biofilme (lilás) e o CO2
difunde para regiões gasosas (vermelha). O desenvolvimento de calor (Q) faz com
que ocorra rapidamente um aumento na temperatura (T), que é um sério problema
durante a FES. O calor é removido do substrato via condução e evaporação da água
(azul escuro). O sistema de equilíbrio da H2O também inclui a H2O que passa
22
lentamente pelo micélio. Outro importante fator é o pH local, que é alterado devido a
liberação de ácidos carbônicos e troca de amônia (cinza) (HÖLKER e LENZ, 2005).
Além da secreção de enzimas, que são críticas à decomposição da celulose,
o crescimento fúngico é realizado pela formação de micélio e têm capacidade de
romper a superfície cutinizada da planta, penetrando no mesófilo (LEE et al., 2014).
Os fungos filamentosos têm sido usados há algum tempo como fonte de produção
de muitos metabólicos e enzimas. Muitos deles secretam naturalmente proteínas e
tem sido explorados comercialmente como “fábricas” de enzimas.
Os fungos lignocelulolíticos são classificados como de degradação Branca e
de degradação Marrom. Os fungos de degradação branca decompõem todos os
polímeros de madeira e inclui a lignina. Nesta degradação a madeira fica com
aspecto branco e fibroso. Eles degradam a lignina graças à habilidade
lignocelulolítica conferida por enzimas extracelulares contendo a lignina peroxidase,
manganês peroxidase e lacase, definidas como fenoloxidases. Estas enzimas estão
envolvidas na oxidação da lignina presente nas madeiras (LEE et al., 2014). Dentre
os fungos de degradação branca temos: Phanerochaete chrysosporium, Ganoderma
lucidum, Irpex lacteus, Pleurotus sapidus, Phanerochaete carnosa e outros.
Quanto aos fungos de degradação marrom, que degradam preferencialmente
a celulose (Figura 3) e provoca um rápido decréscimo no grau de polimerização
(MONRROY et al., 2011). A hidrólise enzimática de material celulósico em glicose
envolve a ação sinérgica de pelo menos três enzimas diferentes: Endoglucanase,
exoglucanase e glicosidase (LI et al., 2013). As endoglucanases clivam
randomicamente os sítios internos amorfos da cadeia polissacarídica da celulose,
originando oligossacarídeos de vários comprimentos; as exoglucanases atuam nos
terminais redutores ou não-redutores das cadeias de celulose, liberando glicose ou
celobiose; e as glicosidase hidrolisam celobiose e oligossacarídeos solúveis em
glicose (NURKANTO, 2009). O sinergismo entre estes três tipos de enzimas é que
torna possível a efetiva degradação da celulose (VRIES e VISSER, 2001).
Figura 3. Representação da estrutura linear da celulose, formada pelas unidades de
celobiose. Fonte: MARTINS, 2005.
23
Como resultado do ataque inicial pelo fungo de degradação marrom
provocado pela despolimerização da celulase a rigidez da madeira decai
rapidamente (MONRROY et al., 2010). Dentre os fungos de degradação marrom
mais citados na produção de celulase estão Aspergillus niger e Trichoderma reesei.
A maioria das celulases comerciais são produzida por fungos, principalmente
os pertencentes aos gêneros Trichoderma e Aspergillus.
2.1. Trichoderma reesei
O gênero Trichoderma possui espécies capazes de produzir enzimas e/ou
atacar e inibir outros fungos e atrai grande atenção em diversas áreas de pesquisa.
Dentre elas, temos o controle biológico de doenças de plantas, produção de
enzimas, assim como estudos genéticos e manipulação em fungos filamentosos
(SAMUELS, 1996). O gênero de fungos filamentosos geralmente são encontrados
em solos e em madeiras em decomposição (SAMUELS, 1996). Muitas espécies
deste gênero são micoparasitas. Trichoderma predomina na microbiota do solo de
diferentes ecossistemas, como os campos, pastos, florestas e até desertos,
adaptado a sobreviver em várias zonas climáticas. Na Figura 4 tem-se micrografia
eletrônica das hifas miceliais do fungo Trichoderma reesei.
Figura 4. Micrografia eletrônica do Trichoderma reesei.
Fonte:http://www.20minutes.fr/sciences/231265-champignon-sauver-4x4
Trichoderma reesei é um dos principais produtores de celulases, e o
microrganismo cujo sistema de celulases tem sido mais estudado. Ele produz pelo
24
menos seis endoglucanases e duas celobiohidrolases ativas em diferentes fontes de
celulose, cristalinas ou amorfas (KARLSSON et al., 2002).
Dos sistemas celulásicos melhor estudados, as celobiohidrolases,
particularmente as CBH I, têm sido consideradas como enzimas essenciais à
sacarificação eficiente da celulose. Evidências experimentais indicam que a remoção
do gene que codifica para a produção CBH I reduz em 70% a atividade do complexo
sobre a celulose cristalina. Além disso, as celobiohidrolases apresentam grande
interação sinergística com outras celulases, principalmente aquelas de atividade
reconhecidamente endoglucanásica (BELDMAN et al., 1988).
2.2. Aspergillus níger
O gênero Aspergillus são altamente aeróbicos e compreende várias centenas
de espécies encontradas em todo o mundo (GUPTA et al., 2012). Em relação à
influência da temperatura e atividade de água, eles são capazes de crescer na faixa
de temperatura, de 6 a 47 ᵒC, com temperatura ótima entre 35-37 ᵒC (SCHUSTER et
al., 2002).
Aspergillus niger é um fungo muito usado na produção de ácido cítrico, e
também na produção de enzimas. A habilidade destes fungos na produção de
enzimas é relacionada à capacidade de utilizar variedades de substratos graças ao
seu sistema enzimático bem desenvolvido (SHAHLAEI et al., 2013). Eles secretam
grandes quantidades de enzimas celulolíticas e junto com o Trichoderma reesei têm
sido extensivamente estudado para a produção industrial destas enzimas (SALIU e
SANI, 2012). Na Figura 5 pode-se observar micrografia eletrônica do Aspergillus
niger.
Figura 5. Micrografia eletrônica do Aspergillus níger. Fonte:
https://www.inspq.qc.ca/en/moulds/fact-sheets/aspergillus-niger
25
2.3. Penicillium echinulatum
Penicillium echinulatum (Figura 6) está entre os microrganismos com grande
potencial para a produção de celulases (DILLON et al., 2011). As linhagens
mutantes utilizadas em estudos para a produção de celulases são provenientes da
linhagem selvagem denominada 2HH.
A importância do complexo enzimático de Penicillium echinulatum deve-se
também ao fato deste apresentar uma proporção equilibrada de atividades de FPA e
β-glicosidase, fato relevante para a hidrólise da celulose. Adicionalmente, FPA e β-
glicosidases de P. echinulatum são importantes para hidrólise de celulose, pois as
celulases produzidas apresentam estabilidade térmica entre 50 ºC e 55 ºC,
respectivamente (MARTINS et al., 2007).
Schneider et al. (2014) estudaram o efeito de seis diferentes fontes de
carbono sobre a morfogênese e produção enzimática da linhagem S1M29 de P.
echinulatum. Entre as seis fontes de carbono estudadas, celulose e bagaço de cana-
de-açúcar foram as mais adequadas para FPA, endoglicanases, xilanases e β-
glucosidases. No que se refere à morfologia de crescimento de Penicillium
echinulatum, observou-se maiores atividades enzimáticas quando o micélio crescia
numa forma dispersa, correlação possivelmente explicada devido a uma maior
interação entre o substrato e as hifas.
Figura 6. Micrografia eletrônica do Penicillium echinulatum. Fonte: Camassola,
2008.
26
2.3. Phanerochaete sp.
O gênero Phanerochaete pertence aos basidiomicetos. Os fungos
filamentosos, especialmente Basidiomycetes, são os mais utilizados para a
produção das enzimas celulolíticas (PANDEY et al., 2000). Por volta de cem
espécies de Phanerochaete têm sido descritas (WU et al., 2010).
O Phanerochaete chrysosporium tem sido o fungo de degradação branca
mais estudado. Secreta um conjunto de peroxidases e oxidases que agem não
especificamente, via geração de radicais livres a partir da lignina, que se quebra
através de reações espontâneas (JOINT GENOME INSTITUTE, 2014). A maior
parte dos estudos tem interesse na habilidade deste fungo de degradar lignina.
Esforços extensivos e sucessivos têm sido feitos para aumentar o rendimento
de diferentes cepas deste microrganismo (SZAB, 1996). Na figura 7 pode-se
observar micrografia do micélio do Phanerochaete chrysosporium.
Figura 7. Micrografia eletrônica do micélio do Phanerochaete chrysosporium. Fonte:
http://commtechlab.msu.edu/sites/dlc-me/zoo/microbes/p_chryso.html
2.4. Ganoderma sp.
É um fungo que está presente em habitats naturais em todo o mundo. Mais de
250 espécies já foram relatadas. Com relação à produção de enzimas
lignocelulolíticas, Manavalan et al. (2012), verificaram as proteínas produzidas pelo
fungo Ganoderma lucidum, com 24% que corresponde a celulases e 5% a
hemicelulases, além de 24 % de enzimas degradadoras de lignina, indica esse fungo
como produtor de enzimas lignocelulolíticas. Além disso, eles verificaram que o
Ganoderma lucidum produz o conjunto completo de celulases. Na Figura 8 pode-se
observar micrografia do micélio de Ganoderma lucidum.
27
Figura 8. Micrografia eletrônica do micélio do Ganoderma lucidum. Fonte:
http://bioweb.uwlax.edu/bio203/2011/mestelle_zach/reproduction.htm
O microorganismo a ser considerado ideal para processo de produção
enzimática de acordo com Bon et al. (2008), deve apresentar as seguintes
características:
- Ser seguro sob o ponto de vista biológico, ou seja, não ser patogênico
- Apresentar elevada capacidade de síntese e excreção da enzima;
- Suportar condições ambientais adversas, relacionadas com a pressão osmótica e a
temperatura;
- Ser tolerante a presença de substâncias tóxicas, que podem ser geradas no
processo de tratamento da matéria-prima ou pelo próprio metabolismo celular.
Outros fungos celulolíticos incluem as espécies Aspergillus terreus,
Neurospora crassa, Arthrographis cellulolyticum, Fusarium solani, Mucor
circinelloides, Penicillium funiculosum e Sporotrichium pruinosum (RABINOVICH et
al., 2002; SAHA, 2004).
3. ISOLAMENTO E TRIAGEM DE FUNGOS COM POTENCIAL CELULOLÍTICO
3.1. Isolamento de microrganismos celulolíticos
O isolamento dos microrganismos é realizado pelas diluições seriadas
conforme proposto por Clark (1965). Inicialmente, 10 g do composto orgânico foi
adicionado em 90 mL de solução salina peptonada estéril, composta por 0,85% (p/v)
de cloreto de sódio e 0,1% (p/v) de peptona bacteriológica (SILVA e JUNQUEIRA,
1995). A amostra é homogeneizada e mantida sob agitação em mesa agitadora
orbital a 127 rpm, por 15 min. Posteriormente, sucessivas diluições seriadas são
28
realizadas e 100 μL de amostra são transferidas em placas de Petri contendo meio
de cultura e espalhadas com auxílio de alça de Drigalsky.
Os meios utilizados para o crescimento são: Yeast extract peptone glucose
(YEPG), composto por (g L-1): extrato de levedura, 10; peptona bacteriológica, 20;
glicose, 20; ágar bacteriológico, 35,5, acrescido de antibiótico cloranfenicol 0,1%
para crescimento de leveduras; Ágar nutriente (AN) (g L-1): extrato de levedura, 3;
peptona bacteriológica, 5; cloreto de sódio, 3; ágar bacteriológico, 13, acrescido de
antibiótico nistatina (1 mL para 250 mL de meio de cultura) para crescimento de
bactérias; Ágar batata dextrose (BDA) (g L-1) preparado de acordo com fabricante
acrescido de antibiótico cloranfenicol 0,1% para crescimento de fungos. As placas
inoculadas são incubadas a 28±2 °C por até 5 dias.
As bactérias são purificadas pela técnica de esgotamento para obtenção de
colônias isoladas. Essa técnica consiste em fazer estrias, com auxílio de alça de
platina, em meio sólido, onde, por esgotamento, se obtêm colônias isoladas no final
das estrias. Quanto à purificação dos fungos, após surgirem as colônias, as mesmas
são separadas com base no aspecto do micélio, cor dos esporos e em outras
características do anverso e reverso das colônias. Estas colônias são reinoculadas,
através de estrias, em meio de seleção até a obtenção de culturas puras. Após o
período de incubação, a contagem total dos morfotipos encontrados é realizada e
caracterizadas de acordo com sua morfologia, incluindo tamanho, forma, cor, borda,
aparência, brilho e elevação de acordo com a metodologia de Yarrow (1998). As
colônias puras dos fungos são preservadas seguindo o método de Castellani (1967).
Todos os tubos/placas são guardados em geladeira, a temperatura de
aproximadamente 4°C.
3.2. Triagem de microrganismos celulolíticos
Os fungos isolados são avaliados quanto às suas atividades celulolíticas em
placas contendo ágar e meio mínimo sais de Vogel (VOGEL,1956), contendo (g L-1):
Na3C6H5O7.5H2O, 150; KH2PO4, 250; NH4NO3, 100; MgSO4.7H2O, 10; CaCl2.2H2O,
5, solução de biotina (0,1 mg Ml-1) 5; clorofórmio 0,2 mL, solução de elementos
traços (g L-1), 5 mL [C6H8O7.H2O, 50; ZnSO4.7H2O, 50; Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O,10;
CuSO4.5H2O, 2,5; MnSO4.H2O, 0,05; H3BO3, 0,05; Na2MoO4.2H2O, 0,05], diluído 50
vezes em água destilada, suplementado com 0,2% de extrato de levedura,
suplementado com 1% (m/v) da fonte de carbono, com o carboximetilcelulose
29
(CMC), e 1,5% (m/v) de ágar. Os isolados são previamente ativados em meio BDA e
inoculados no centro da placa de Petri, incubados à temperatura de 30°C. A
revelação para detecção de atividade enzimática depende do fungo e pode ser do
terceiro ao sexto após o repique.
3.3. Avaliação da atividade celulolítica
A revelação para a determinação de atividade celulolítica é realizada pela
adição da solução de vermelho congo 0,25% (m/v) em tampão Tris-HCl 0,1 M pH
8,0, conforme o método proposto por Hankin e Anagnostakis (1975). A lavagem da
superfície do meio é conduzida com uma solução de NaCl 1M no mesmo tampão e
observado halo transparente em contraste com meio opaco.
3.4. Cálculo do índice enzimático (IE)
Os cultivos em que são possíveis observar a formação de halo ao redor da
colônia tem sua atividade avaliada através do índice enzimático (IE), ou seja, o
diâmetro do halo dividido pelo diâmetro da colônia (HANKIN e ANAGNOSTAKIS,
1977).
3.5. Determinação do potencial enzimático
O cultivo industrial de microrganismos com a finalidade de obter enzimas,
resultantes do seu metabolismo, é atividade biotecnológica em ampla expansão. As
duas principais estratégias para determinação do potencial de enzimas são os
processos de fermentação submersa e fermentação em estado sólido (CASTRO e
PEREIRA JUNIOR, 2010).
A fermentação submersa é a técnica majoritariamente utilizada em processos
industriais devido à facilidade de crescimento dos microrganismos em condições
controladas de pH e temperatura, além de tornar fácil a recuperação das enzimas
extracelulares. Este processo utiliza meio fermentativo, onde as fontes de nutrientes
utilizadas são solúveis e o desenvolvimento do microorganismo se dá em presença
de água livre. O conteúdo de água nesse processo é superior a 95% (ORLANDELLI
et al., 2012). É um sistema capaz de gerar variedade de metabólitos em que os
fungos filamentosos são de grande importância (GIBBS et al., 2000). Em relação ao
cultivo em estado sólido, o cultivo submerso tem como vantagem a possibilidade de
ter melhor racionalização e padronização do processo, o que é fundamental para a
30
indústria (HOLKER e LENZ, 2005) além de permitir um sistema de cultura
homogêneo (AGUILAR et al., 2004).
Com relação a fermentação em estado sólido (FES), o meio de cultura é
composto de substratos sólidos, atuando como fonte de carbono, sem água livre, o
que faz com que essa condição de crescimento tente se aproximar do habitat
natural. É um sistema de cultivo alternativo para a produção de produtos de valor
agregado a partir de microrganismos, especialmente enzimas (PARANTHAMAN et
al., 2008). Produtos ou subprodutos oriundos da agroindústria, na forma de resíduos
não processados, são empregados na FES como substratos para servirem de matriz
sólida e fornecerem carbono para o crescimento do microorganismo, além de
apresentarem custo baixo (ORLANDELLI et al., 2012). A FES é adequada para
fungos filamentosos, pois estes podem se desenvolver em ambientes que
apresentam baixos níveis de umidade relativa. Além disso, os fungos filamentosos
apresentam hifas aéreas propícias para a colonização de substratos sólidos
(SUBRAMANIYAM e VIMALA, 2012).
Comparado com fermentação submersa, o uso de FES apresenta vantagens,
como menor necessidade de energia, menor volume do reator e alta produtividade,
baixo investimento de capital, baixo desperdício de água, maior concentração de
metabólitos obtidos e menor custo de processamento (PARANTHAMAN et al.,
2008). Contudo, FES também apresenta algumas limitações, como a dificuldade de
dissipação de calor gerado pelo metabolismo microbiano, transferência de oxigênio
limitada depende da granulometria do substrato, dificuldade no controle de
temperatura e além dessas variáveis, há uma maior dificuldade de coleta de
amostras representativas durante o processo, devido à não homogeneidade da
massa em fermentação (SANTOS et al., 2006).
3.6. Avaliação da atividade enzimática em fermentação submersa
Os cultivos submersos são preparados em frascos Erlenmeyer de 125 mL,
contendo 30 mL de meio líquido de Vogel (VOGEL, 1956), suplementado com 1% da
fonte de carbono (exemplo: farelo de trigo) e esterilizados a 121ºC por 15 minutos
para a produção das enzimas FPase, endoglicanase, exoglicanase e xilanase . Os
cultivos são inoculados com 1 mL de uma suspensão de 107 esporos mL-1. Os
cultivos são mantidos por 5 dias a 100 rpm, 30°C. Os caldos fermentados são
filtrados em banho de gelo e congelados para avaliação da atividade enzimática.
31
3.7. Avaliação da atividade enzimática por fermentação estado sólido
Os cultivos em substratos sólidos podem ser realizados em sacos plásticos de
polipropileno ou Erlenmeyer contendo a matéria prima acrescidos de água destilada
e então autoclavados a 121oC durante 20 min. A inoculação do substrato é realizada
com 1 mL de suspensão de esporos padronizada a 106 esporos mL-1, devidamente
homogeneizados. Em cultivos mistos, a inoculação é realizada com 1 mL de
suspensão de esporos padronizada a 106 esporos mL-1 para cada fungo utilizado.
Os cultivos são mantidos à 30°C durante 5 dias.
A extração das enzimas pode ser realizada adicionando-se 100 mL de água
destilada gelada ao meio fermentado ao qual, posteriormente, é submetido a
agitação orbital à 8000 rpm, por 20 min. O meio é então filtrado a vácuo, em banho
de gelo e o extrato acondicionado em tubos de ensaio no congelador,
posteriormente utilizado para avaliação da atividade enzimática.
3.8. Atividade de celulases totais (FPase)
A atividade de celulases totais (FPase) é determinada de acordo com as
recomendações da IUPAC empregando papel de filtro (Whatmann N° 1) medindo
1,0 x 6,0 cm, equivalente a 50 mg, como substrato (GHOSE, 1987). O meio
reacional consiste de mistura de tampão citrato de sódio 0,05 M pH 4,8 e uma tira de
papel filtro. A reação é iniciada com a adição do extrato enzimático, mantendo-se
por 60 min, à 50°C. A reação é interrompida pela adição de 3 mL de DNS e
mantidas a 100oC por 5 minutos. Após o resfriamento das amostras são adicionados
20 mL de água destilada. As leituras são realizadas em espectrofotômetro a 540 ƞm.
A liberação de açúcares redutores é determinada de acordo com Miller (1959),
utilizando-se glicose como padrão, a partir do método do ácido dinitrossalicilico
(DNS). Uma unidade de atividade enzima é definida como a quantidade de enzima
necessária para liberar 1 µmol glicose por minuto por mL.
3.9. Atividade de endoglicanase, exoglicanase e xilanase
As atividades de endoglicanase, exoglicanase e xilanase são determinadas
utilizando 1% de solução, carboximetilcelulose (CMC), Avicel e xilana,
respectivamente em tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,5. O meio reacional
consiste de 400 µL do substrato e 400 µL do extrato enzimático, mantidos a 60oC.
32
Após intervalos de tempos 0 (controle), 5 e 10 min, alíquotas de 200 μL são retiradas
do meio reacional e a reação interrompida pela adição de 200 μL de DNS e fervidas
por 5 minutos. As amostras são resfriadas e adiciona-se 2 mL de água destilada. As
leituras são realizadas em espectrofotômetro a 540 ƞm. A liberação de açúcares
redutores é determinada de acordo com Miller (1959), utilizando-se glicose ou xilose
como padrão (coeficiente de extinção molarε: glicose 80,54 M-1 cm-1 ou xilose 74,27
M-1 cm-1), a partir do método do ácido dinitrossalicilico (DNS). Uma unidade de
enzima é definida com a quantidade de enzima necessária para liberar l μmol de
glicose ou xilose por minuto por mililitro.
3.10. Microrganismos celulolíticos como fonte de inóculo
O processo de compostagem pode ocorrer naturalmente com o envolvimento
de microrganismos presentes nos resíduos orgânicos. Contudo, quantidade
insuficiente ou baixa biodegradabilidade da comunidade microbiana nativa pode
levar à baixa eficiência da compostagem e qualidade indesejável do composto (XI et
al., 2007). Para que se consiga redução no tempo de transformação dos resíduos,
aponta-se a inoculação como uma técnica eficiente, pois introduz população de
microrganismos para iniciar e acelerado processo de decomposição do resíduo
orgânico (KIEHL, 2002). O inóculo seria, portanto, uma forma de aumentar em
número e diversidade a comunidade microbiana das leiras de compostagem, além
de poder direcionar para a degradação de um resíduo específico e/ou assegurar
degradação mais completa dos componentes da compostagem (GHAFFARI et al.,
2011).
A inoculação consiste na adição de microrganismos provenientes de cultura
pura, ou inoculação em massa que consiste de grande quantidade de organismos,
geralmente relacionados ao material ao qual o inóculo será aplicado (XI et al., 2012).
A compostagem pode ser acelerada pela adição de inóculo tanto na fase mesofílica
quanto na fase termofílica, entretanto, vários estudos tem indicado que a inoculação
de populações microbianas exógenas e naturais ao longo de todo o processo é mais
eficiente do que o inóculo em apenas uma das fases (WEI et al., 2007; XI et al.,
2012).
33
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A busca no desenvolvimento e descoberta de novos microorganismos deve ser
aumentada nos próximos anos. Conforme foi observado, há grande interesse na
obtenção de microorganismos celulolíticos devido a sua ampla aplicação em
processos agrobiotecnológicos, abrangendo diversas áreas, como produção de
inoculantes, entre outros. A fermentação em estado sólido vem ganhando atenção
pelos pesquisadores devido às vantagens econômicas que oferece e a utilização de
substratos simples, como os resíduos agroindustriais de natureza lignocelulósica,
abundante e de baixo valor comercial.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGUILAR, C. N.; CONTRERAS-ESQUIVEL, J. C.; RODRIGUEZ, R.; PRADO, L. A.;
LOERA, O. Differences in fungal enzyme productivity in submerged and solid state
cultures. Food Science and Biotechnology, Seoul, v. 13, n.1, p. 109 -113, 2004.
AMORE, A; PEPE, O; VENTORINO, V; BIROLO, L; GIANGRANDE, C; FARACO, V.
Industrial waste based compost as a source of novel cellulolytic strains and
enzymes. FEMS Microbiology Letters, Amsterdam, v.339, n.2, p. 93-101, 2013.
ANWAR, Z.; GULFRAZ, M.; IRSHAD, M. Agro-industrial lignocellulosic biomass a
key to unlock the future bio-energy: A brief review. Journal of Radiation Research
and Applied Science, Elsevier, v. 7, p. 163-173, 2014.
BELDMAN, G.; VORAGEM, A. J. G.; ROMBOUTS, F. M.; Pilnik, W. Synergism in
cellulose hydrolysis by Endoglucanases and Exoglucanasespurified from
Trichoderma viride. Biotechnology and Bioengineering, Dublin, v. 31, n.2, p. 173-
178, 1988.
BIALOBRZEWSKI, I.; MIKŠ-KRAJNIK, M.; DACH, J.; MARKOWSKI, M.; CZEKAŁA,
W.; GŁUCHOWSKA, K. Model of the sewage sludge-straw composting process
integrating different heat generation capacities of mesophilic and thermophilic
microorganisms. Waste Management, Elsevier, v.43, n.3, p.72–83, 2015.
BON, E. P. S.; COSTA, R. B.; SILVA, M. V. A.; LEITÃO, V. S. F.; FREITAS, S. P.;
FERRARA, M. A. Enzimas em biotecnologia: produção, aplicações e mercado. IN:
34
Mercado e perspectivas de uso de enzimas industriais e especiais no Brasil.
Rio de Janeiro: Interciência, 2008.
CASTELLANI, A. Maintenace and cultivation of the common pathogenic fungi of man
in sterile distilled water. Futher researches. Journal of Tropical Medicineand
Hygiene, Deerfield, v.70, p.181-184, 1967.
CASTRO, A. M.; PEREIRA JUNIOR, N. Produção, propriedades e aplicação de
celulases na hidrólise de resíduos agroindustriais. Química Nova, São Paulo, v. 33,
n. 1, p. 181-188, 2010.
CLARK, F. E. Agar-plate method for total microbial count. In: BLACK, C. A.; EVANS,
D. D.; WHITE, J. L.; ENSMINGER, L. E.; CLARK, F. E.; DINAUER, R. C. (Eds.).
Methods of soil analysis: chemical and microbiological properties. New York:
Madson, p. 1460-1466, 1965.
CHUNDAWAT, S. P.; LIPTON, M.S.; PURVINE, S. O.; UPPUGUNDLA, N.; GAO, D.;
BALAN, V.; DALE, B. E. Proteomics-based compositional analysis of complex
cellulase-hemi-cellulase mixture. Journal of Proteome Research, Washington, v.
10, n.10, p. 4365 -4372, 2011.
DA SILVA, R.; YIN, D. K.; PARK, Y. K. Application of thermostable xylanases from
Humicola sp. for pulp improvement. Journal of fermentation and bioengineering,
Asaka, v. 77, n. 1, p. 109-111, 1994.
DILLON, A. J.; BETTIO, M.; POZZAN, F. G.; ANDRIGHETTI, T.; CAMASSOLA, M.
A. New Penicillium echinulatum strain with faster cellulase secretion obtained using
hydrogen peroxide mutagenesis and screening with 2-deoxyglucose. Journal of
Applied Microbiology, Maputo, v.111, n.1, p.48-53, 2011.
GHAFFARI, S., SEPAHI, A. A., RAZAVI, M. R., MALEKZADEH, F., HAYDARIAN, H.
Effectiveness of inoculation with isolated Anoxybacillus sp MGA110 on municipal
solid waste composting process. African Journal of Microbiology Research,
Mubarak, v. 5, n.30, p. 5373–5378, 2011.
GHOSE T. K. Measurement of cellulase activities. Pure e Applied
Chemistry,Durham, v.59, n.2, p.257-268, 1987.
35
GIBBS, P. A.; SEVIOUR, R. J.; SCHMID, F. Growth of filamentous fungi in
submerged culture: problems and possible solutions. Critical Reviews in
Biotechnology, Boca Raton, v.20, n.1, p.17-48, 2000.
GUPTA, M.; MANISHA, K.; GROVER, R. Effect of Various Media Types on the Rate
of Growth of Aspergillus niger. Indian Journal of Fundamental and Applied Life
Sciences, Jaipur, v. 2, n. 2, p. 141–144, 2012.
HANKIN, L. ANAGNOSTAKIS, S. G. The use of solid media for detection of enzyme
production by fungi. Mycology, Lawrence, v. 67, p. 597-607, 1975.
HANKIN, L.; ANAGNOSTAKIS, S. L. Solid media containing carboxymethylcellulose
to detect cx cellulase activity of micro-organisms. Journal of General Microbiology,
London, v. 98, n. 1, p. 109–115, 1977.
HOLKER, U.; LENZ, J. Solid-state fermentation – are there any biotechnological
advantages? Current Opinion in Microbiology, Elsevier, v.8, n.3, p.301–306, 2005.
KARLSSON, J.; SIIKA-AHO, M.; TENKANEN, M.; TJERNELD, F. Enzymatic
properties of the low molecular mass endoglucanases Cel12A (EG III) and Cel45A
(EG V) of Trichoderma reesei. Journal of Biotechnology, Amsterdam, v. 99, n.1, p.
63 - 78, 2002.
KIEHL, E. J. Manual de compostagem maturação e qualidade do composto. São
Paulo: Agronômica Ceres, 2002. 171p.
KUHAD, R. C.; GUPTA, R.; SINGH, A. Microbial cellulases and their industrial
applications. Enzyme Research, London, v. 111, n. 12, p. 1-10, 2011.
KHOKHAR, I; HAIDER, M. S.; MUSHTAQ, S; MUKHTAR, I. Isolation and Screening
of Highly Cellulolytic Filamentous Fungi. Journal of Applied Sciences and
Environmental Management, Choba, v. 16, n.3, p.223-226, 2013.
LEE, H.; JANG, Y.; CHOI, Y. S.; KIM, M. J.; LEE, J.; LEE, H.; HONG, J. H.; LEE, Y.
M.; KIM, G. H.; KIM, J. J. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the
degradation of PAHs. Journal of microbiological methods, Elsevier, v. 97, n.1, p.
56–62, 2014.
36
LI, L.; DIEDERICK, R.; FLORA, J. R. V.; BERGE, N. D. Hydrothermal carbonization
of food waste and associated packaging materials for energy source generation.
Waste management, Houston, v. 33, n.11, p. 2478–2492, 2013.
MANAVALAN, T.; MANAVALAN, A.; THANGAVELU, K. P.; HEESE, K. Secretome
analysis of Ganoderma lucidum cultivated in sugarcane bagasse. Journal of
proteomics, Elsevier, v. 77, n.5, p. 298–309, 2012.
MARTINS, L. F.; KOLLING, D.; CAMASSOLA, M.; DILLON, A. J. P.; RAMOS, L. P.
Comparison of Penicillium echinulatum and Trichoderma reesei cellulases in relation
to their activity against various cellulosic substrates. Bioressorce Technology, new
York, v.99, n.5, p. 1417-1424, 2007.
MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing
sugar. Analytical Chemistry, Washington, v. 31, n.3, p. 426-428, 1959.
MONRROY, M.; IBAÑEZ, J.; MELIN, V.; BAEZA, J.; MENDONÇA, R. T.;
CONTRERAS, D.; FREER, J. Bioorganosolv pretreatments of P. radiata by a brown
rot fungus (Gloephyllum trabeum) and ethanolysis. Enzyme and Microbial
Technology, New York, v. 47, n. 1, p. 11–16, 2010.
MONRROY, M.; ORTEGA, I.; RAMÍREZ, M.; BAEZA, J.; FREER, J. Structural
change in wood by brown rot fungi and effect on enzymatic hydrolysis. Enzyme and
microbial technology, New York, v. 49, n. 5, p. 472–477, 2011.
NURKANTO, A. Cellulolitic Activities of Actinomycetes Isolated from Soil
Rhizosphere of Waigeo, Raja Ampat, West Papua. Journal of Tropical Soils,
Bandar Lampung, v.14, n.3, p. 239-244, 2009.
ORLANDELLI, R. C.; SPECIAN, V.; FELBER, A. C.; PAMPHILE, J. A. Enzimas de
interesse industrial; produção por fungos e aplicações. Revista Saúde e Biologia,
Campo Mourão, v.7, n.3, p.97-109, 2012.
PANDEY, A.; SOCCOL, C. R.; MITCHELL, D. Biotechnological potential of agro-
industrial residues. I: sugarcane bagasse. Bioresource Technology, Elsevier, v.74,
n.1, p.69-80, 2000
37
PARANTHAMAN, R.; VIDYALAKSHMI, R.; MURUGESH, S.; SINGARAVADIVEL. K.
Optimization of fermentation conditions for production of tannase enzyme by
Aspergillus oryzae using sugarcane baggasse and rice straw. Global Journal of
Biotechnology e Biochemistry, Dubai, v. 3 n. 2 p. 105-110, 2008.
RABINOVICH, M. L.; MELNICK, M. S.; BOLOBOVA, A. V. The structure and
mechanisms of action of cellulolytics enzymes. Biochemistry, Moscow, v. 65, n. 8,
p. 850 - 871, 2002.
ROY, B. C.; KHAN, M. R. I.; RAHMAN, M. M.; SALLEH, M. A. M.; AHSAN, A. AMIN,
M. R. Development of a Convenient Method of Rumen Content Composting. Jounal
of Animal and Veterinary Advances, New York, v. 12, n.18, p. 1439-1444, 2013.
RUEGGER, M. J. S.; TAUK-TORNISIELO, S. M. Atividade da celulase de fungos
isolados do solo da Estação Ecológica de Atividade da celulase de fungos isolados
do solo da Estação Ecológica de Jureia-Itatins. Revista Brasileira de Botânica, São
Paulo, v. 2, n.2, p. 205–211, 2004.
SAHA, B. C. Production, purification and propertis of endoglucanase from newly
isolated strains of Mucor circinelloides. Process Biochemistry, Oxford, v. 39, n.12,
p. 1871 - 1876, 2004.
SALIU, B. K.; SANI, A. Bioethanol Potentials of Corn Cob Hydrolysed using
Cellulases of Aspergillus niger and Penicillium decumbens. EXCLI Journal,
Dortmund, v. 11, p. 468 - 479, 2012.
SAMUELS, G. J. Trichoderma: a review of biology and systematics of the genus.
Mycological Research, Cambridge, v. 100, n. 8, p. 923–935, 1996.
SANTOS, D. T.; SARROUH, B. F.; SANTOS, J. C.; PÉREZ, V.H.; SILVA, S. S.
Potencialidades e aplicações da fermentação semi-sólida em biotecnologia. Janus,
Lorena, v.3, n.4, p. 165-183, 2008.
SELLE, G.L. Ciclagem de nutrientes em ecossistemas florestais. Bioscience
Journal, Uberlândia, v. 23, n. 4, p. 29-39, 2007.
38
SCHUSTER, E.; DUNN-COLEMAN, N.; FRISVAD, J. C.; M, V. DIJCK. P. W. On the
safety of Aspergillus niger - A review. Applied microbiology and biotechnology
Berlin, v. 59, n. 4-5, p. 426–35, 2002.
SHAHLAEI, M.; POURHOSSEIN, A.; DRUG, N.; CLUB, Y. R.; BRANCH, K. Biomass
of Aspergillus Niger : Uses and Applications. Journal of Reports in Pharmaceutical
Sciences, Kermanshah, v. 2, n. 1, p. 66–72, 2013.
SCHNEIDER, W. D. H.; REIS, L.; CAMASSOLA, M.; DILLON, A. J. P.
Morphogenesis and production of enzymes by Penicillium echinulatum in Response
to different carbon sources. BioMed Research International, Arizona, v.2014, p.1-
10, 2014.
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A. J. Métodos de análise microbiológica de
alimentos: manual técnico n° 14. Campinas: Instituto de Tecnologia de Alimentos,
p.17-19, 1995.
SUBRAMANIYAM, R.; VIMALA, R. Solid state and submerged fermentation for the
production of bioactive substances: A comparative study. I.J.S.N., v.3, n.3, p. 480-
486, 2012.
SZAB, I. J. control of catabolite repression by fed-batch cultivation. Journal of
Biotechnology, Elsevier, v.48, p. 221–230, 1996.
VOGEL, H. J. A. convenient growth medium for Neurospora crassa (medium N).
Microbiology Genetics Bulletin, Columbus, v.13, n.1, p. 42–43, 1956.
WEI, Z., XI, B., ZHAO, Y., WANG, W., LIU, H., JIANG, Y. Effect of inoculating
microbes in municipal solid waste composting on characteristics of humic acid.
Chemosphere, Elsevier, v.68, n.2, p. 368–374, 2007.
WANG, H., GURAU, G., ROGERS, R.D. Ionic liquid processing of cellulose.
Chemical Society Reviews, Elsevier, v.41, n.4, p.1519–1537, 2012.
WU, S. H.; NILSSON, H. R.; CHEN, C. T.; YU, S. Y.; HALLENBERG, N. The white-
rotting genus Phanerochaete is polyphyletic and distributed throughout the phleboid
39
clade of the Polyporales (Basidiomycota). Fungal Diversity, Chiang Mai, v. 42, n. 1,
p. 107–118, 2010.
VRIES, R. P.; VISSER, J. Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cell
wall polysaccharides. Microbiology and Molecular Biology Reviews, Washington,
v. 65,n.4, p. 497-522, 2001.
XI, B. D., HUANG, G. H., ZHANG, G. J., WEI, Z. M., QIN, X. S., LIU, H. L. A
temperature guided threestage inoculation method for municipal solid wastes
composting. Envi ronmental Engineering Science, v. 24, n.6, p.745–754, 2007.
XI, B. D.; HE, X. S.; WEI, Z. M.; JIANG, Y. H.; LI, M. X.; LI, D.; LI, Y.; DANG, Q. L.
Effect of inoculation methods on the composting efficiency of municipal solid wastes.
Chemosphere, Los Angeles, v.88, n.6, p. 744–750, 2012.
YARROW, D. Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts.
The yeasts, a taxonomic study, Amsterdan, v. 4, n.1, p. 77-100, 1998.
40
CAPÍTULO 2
EFEITO ATIVADOR DA FARINHA DE CARNE E OSSO NA SUCESSÃO
MICROBIANA E DECOMPOSIÇÃO DE RESÍDUO RUMINAL BOVINO
RESUMO
A compostagem de resíduo orgânico ruminal bovino é dependente da atividade microbiana, e essa por sua vez é controlada pela labilidade do resíduo disponível. Assim, a adição de outros resíduos com elevados teores de nutrientes e baixos teores de componentes recalcitrantes como ligninas e compostos fenólicos podem funcionar como efeito ativador na sucessão microbiana e na decomposição e humificação do resíduo. O objetivo foi avaliar efeito ativador da farinha de carne e osso na sucessão microbiana e decomposição de resíduo ruminal bovino. Os tratamentos foram arranjados em esquema fatorial 4 x 6, sendo quatro épocas sucessionais de amostragens ao longo do processo de compostagem (7, 21, 39 e 62 dias) e seis doses de farinha de carne e osso (0; 14,2; 30,4; 42,6; 56,8 e 71 kg/ m3 de resíduo ruminal bovino). Foram avaliados os indicadores temperatura, condutividade elétrica, pH, proteína, número e diversidade de colônias de fungos e bactérias. O efeito ativador pelo uso de doses crescentes de farinha tende a ser negativo para a quantidade de bactérias e fungos no início do processo de decomposição e a partir dos 39 dias o efeito passa a ser significativamente positivo em função do aumento das doses da farinha. A alteração nos indicadores temperatura, umidade, açúcares redutores totais, condutividade elétrica, pH e proteína indicaram aumento na degradação do resíduo ruminal bovino em função do efeito ativador com o uso de doses crescentes da farinha. Palavras chave: compostagem, transformação de resíduos, fungos, bactérias.
EFFECT ATIVADORE OF FLESH AND BONE MEAL IN SUCCESSION MICROBIAL AND BREAKDOWN OF WASTE RUMINAL VEAL
ABSTRACT
The composting organic waste bovine rumen is dependent on microbial activity, and this in turn is controlled by the lability of the available waste. Thus, the addition of other waste with a high content of nutrients and low levels of recalcitrant components as lignans and phenolic compounds can act as ativador effect on the microbial succession and decomposition residue and humification. The ativador objective was to evaluate the effect of meat and bone meal in microbial succession and decomposition of bovine rumen waste. The treatments were arranged in a factorial 4 x 6, four successional sampling dates during the composting process (7, 21, 39 and 62 days) and six meat meal and bone doses (0, 14.2, 30 , 4, 42.6, 56.8 and 71 kg / m3 of bovine rumen waste). They evaluated the indicators temperature, electrical conductivity, pH, protein, number and diversity of fungi and bacteria colonies. The activating effect by the use of escalating doses of flour tends to be negative for the amount of bacteria and fungi in the early decomposition process, and from 39 days the effect becomes significantly positive in terms of increased doses of flour. The
41
indicators change in temperature, moisture, reducing sugar, electrical conductivity, pH and protein showed an increase in the bovine rumen degradation due to the waste press effect using increasing doses of flour. Key words: composting, processing waste, fungi, bacteria.
1. INTRODUÇÃO
O resíduo ruminal bovino é composto por forrageiras parcialmente digeridas no
momento do abate dos animais. A produção mundial segundo USDA (2013) é na
ordem de 5,975 bilhões de toneladas. Em 2014, o Brasil abateu aproximadamente
34 milhões de bovinos (IBGE, 2015), e resultou em produção de aproximadamente
847 milhões de toneladas de resíduo ruminal. Esse resíduo é gerado em
matadouros e frigoríficos bovinos e requer atenção especial no que se refere ao seu
gerenciamento e destinação devido ao volume, composição e difícil degradação
(SILVA, 2010). A destinação no Brasil e no mundo tem sido de forma inadequada
em pátios de deposição ao redor dos frigoríficos ou dispostos em propriedades
vizinhas, alterando as características do solo, tornando-se potenciais poluidores dos
recursos hídricos e outros problemas ambientais (SHERESTHA et al., 2011).
A dificuldade encontrada na transformação do resíduo ruminal bovino por meio
da compostagem ocorre em função dos elevados teores de lignina, celulose e
compostos fenólicos ainda presentes, além de baixa composição de estruturas
bioquímicas de maior labilidade para os microrganismos. Essa inversão da
disponibilidade de componentes de fácil ataque por microrganismos torna esse
resíduo potencialmente mais recalcitrante para o processo de compostagem (SILVA,
2010).
Fatores como aeração, umidade, pH, temperatura e composição nutricional
influenciam na sucessão de microrganismos e, por conseguinte, a qualidade do
produto da transformação dos resíduos (WANG et al., 2015). As propriedades
nutricionais da matéria prima são os principais responsáveis pela identidade das
comunidades microbianas, uma vez que afetam seletivamente sua composição e,
consequentemente, as capacidades metabólicas (SONG et al., 2014).
Dentre os microrganismos que atuam na transformação de resíduos
orgânicos as bactérias e os fungos são os mais abundantes (MACCREADY et al.,
2013; NEHER et al., 2013). As bactérias têm recebido maior atenção por dominarem
os processos de transformação em função de sua maior tolerância térmica (BONITO
42
et al., 2010). No entanto, os fungos também desempenham papel importante, não só
por causa das enzimas extracelulares que produzem (DE GANNES et al., 2013),
como também pela capacidade de algumas espécies crescerem em condições
ambientais difíceis (LANGARICA-FUENTES et al., 2014). A utilização de resíduos
ricos e de fácil disponibilidade dos nutrientes ocasiona ativação da comunidade
microbiana e na capacidade de decompor resíduos mais recalcitrantes (FRANKE-
WHITE et al., 2014).
A atividade microbiana pode ser estimulada pelo uso de fontes de carbono
com maior labilidade para ativar as etapas iniciais de um processo de compostagem.
Dentre as fontes encontra-se a farinha de carne e osso, com alto teor de proteína
bruta entre 35 e 60% e importante fonte de nitrogênio, cálcio e fósforo (SIMÃO et al.,
2008). Segundo Lesson e Summers (1997), para cada tonelada de carne preparada
para o consumo humano, cerca de 300 kg são descartados como produtos não
comestíveis, e desses, aproximadamente 200 kg se transformam em farinha de
carne. A farinha de carne e osso é um subproduto de frigoríficos e abatedouros e
tem tido sua produção incrementada nos últimos anos, devido ao aumento da
produção pecuária.
Frente à complexidade de um processo que envolve a transformação de
resíduos orgânicos, tanto físico-química como nutricionais, bem como as interações
entre elas, faz cada processo único em termos de populações microbianas e sua
distribuição de acordo com a cronologia de compostagem (LÓPEZ GONZALEZ et
al., 2014). Uma compreensão da dinâmica da comunidade microbiana frente a
alteração na disponibilidade de nutrientes como efeito ativador dos microrganismos,
torna-se importante e útil como parte de uma tentativa em melhorar a eficiência da
compostagem (BROWN et al., 2008). Diante disso, o objetivo foi avaliar efeito
ativador da farinha de carne e osso na sucessão microbiana e decomposição de
resíduo ruminal bovino.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Caracterização do experimento
O trabalho foi conduzido na Universidade Federal do Tocantins (UFT), Campus
Universitário de Gurupi, coordenadas de 11°44’44,16” de latitude sul e 49°03’04,17”
de longitude oeste, a 280 m de altitude no sul do estado do Tocantins. O
43
experimento foi realizado em duas fases, a primeira realizada em galpão de
compostagem localizado no setor de olericultura, de propriedade do grupo de
pesquisa em resíduos orgânicos e a segunda no Laboratório de Microbiologia
(MICRO BIO) e Laboratório de Biotecnologia/Análise de Alimentos e Purificação dos
Bioprodutos (LABAP), ambos nas dependências da Universidade Federal do
Tocantins, campus universitário de Gurupi.
O processo de compostagem foi realizado sob proteção de galpão com
cobertura de aço zincado com dimensões de 7 x 20 m de largura e comprimento,
respectivamente. A compostagem foi produzida a partir do resíduo ruminal bovino
(RRB) enriquecido com diferentes doses de farinha de carne e osso (FCO).
O experimento foi instalado em delineamento de blocos casualizados. Os
tratamentos foram arranjados em esquema fatorial (4 x 6), sendo quatro épocas
sucessionais de amostragens ao longo do processo de compostagem (7, 21, 39 e 62
dias) e seis doses de farinha de carne e osso (FCO) (0; 14,2; 30,4; 42,6; 56,8 e 71
kg/m³ de resíduo ruminal bovino (RRB), resultando nos seguintes tratamentos: 1 m³
de RRB + 0 kg de FCO; 1 m³ de RRB + 14,2 kg de FCO; 1 m³ de RRB + 30,4 kg de
FCO; 1 m³ de RRB + 42,6 kg de FCO; 1 m³ de RRB + 56,8 kg de FCO; 1 m³ de RRB
+ 71 kg de FCO (Figura 1A)
Figura 1. Pilhas de compostagem com conteúdo ruminal bovino enriquecido com
farinha de carne e osso em diferentes concentrações (1A) e pontos de amostragem (1B) ao longo do processo de compostagem. Gurupi-TO, 2016.
2.2 Características físico-química da biomassa
1A
1B
44
A composição do resíduo ruminal bovino e da farinha de carne e osso
utilizados na confecção do processo de compostagem foram analisados físico,
químicos e bromatologicamente. O conteúdo ruminal bovino possui em composição:
883,8 g kg-1 - Matéria Seca; 816,6 g kg-1 - Matéria Orgânica; 183,4 g kg-1 - Cinzas;
138,6 g kg-1 - Proteína Bruta; 270 g kg-1 - Extrato Etéreo; 783,6 g kg-1 - Fibra em
Detergente Neutro; 418,6 g kg-1 - Fibra em Detergente Ácido e 365 g kg-1 de
Hemicelulose. Composição nutricional da farinha de carne e osso (g kg-1): N - 70,0;
P - 140,0; K - 6,90; Na - 49,10; Mg - 2,90; Ca - 128,40; Zn - 0,80; Cu - 0,20; Fe -
3,20; Al - 1,50.
Os indicadores avaliados foram separados em seções. O primeiro foi quanto a
dinâmica físico-química no processo de compostagem do resíduo ruminal que
compreende a temperatura, umidade, açúcares redutores totais, condutividade
elétrica, pH e proteína. O outro foi dinâmica microbiana do processo de
compostagem do conteúdo ruminal, com avaliação do número de colônias de
bactérias e fungos e diversidade de colônias de bactérias e fungos.
2.3 Dinâmica físico-química no processo de compostagem do resíduo
ruminal
No momento da homogeneização da farinha de carne e osso ao resíduo
ruminal e da confecção das pilhas de compostagem foi adicionado água até atingir
50% de umidade. O tamanho inicial das pilhas foi respectivamente 242, 125 e 72 cm
de comprimento, largura e altura. Durante o período de compostagem foram
realizadas leituras diárias das temperaturas e semanalmente realizados
revolvimentos e umedecimento das pilhas. Imediatamente, antes dos revolvimentos
foram realizadas as amostragens para determinação da umidade (Figura 1B).
As amostras (500 g) foram coletadas durante as fases da compostagem nos
dias 7, 21, 39 e 63. Consistiu em realizar corte transversal (5 cm) na região mediana
da pilha e também coletas na região frontal, lateral e topo. As amostras dos
diferentes pontos foram homogeneizadas, juntamente com a fatia de 5 cm e então
encaminhadas ao laboratório para serem armazenadas em ambiente refrigerado (4
°C) até serem analisadas. Uma parte da amostra foi processada no laboratório de
microbiologia para proceder ao isolamento dos microrganismos. A outra parte da
amostra foi seca em temperatura ambiente para o procedimento das análises de pH,
açúcares, condutividade elétrica e proteína.
45
A determinação do pH foi obtido por potenciometria com pHmetro, com
eletrodo Ag/AgCl. Os açucares foram extraídos com solução de álcool etílico 70% e
determinados, por leitura em espectrofotômetro a 620 nm, utilizou-se reagente de
Antrona como proposto por Dische (1962).
Determinou-se a condutividade elétrica através de extratos de saturação na
proporção de uma parte de solo para cinco partes de água (1:5) (SIMARD et al.,
1988). Quanto à proteína, determinou-se primeiro o teor de nitrogênio total pelo
método Kjeldahl (BREMNER e MULVANEY, 1982). Com os valores de N-total foram
determinados os teores de proteína bruta segundo Silva (1998). Todas as amostras
foram avaliadas em triplicata.
2.4 Dinâmica microbiana do processo de compostagem do conteúdo
ruminal
O isolamento dos microrganismos foi realizado com diluições seriadas
conforme proposto por Clark (1965). Inicialmente, dez gramas do composto orgânico
foi adicionado em 90 mL de solução salina peptonada estéril, composta por 0,85%
(p/v) de cloreto de sódio e 0,1% (p/v) de peptona bacteriológica (Silva e Junqueira,
1995). A amostra foi homogeneizada e mantida sob agitação em mesa agitadora
orbital a 127 rpm, por 15 min. Posteriormente, sucessivas diluições seriadas foram
realizadas e 100 μL de amostra foram transferidas em placas de Petri contendo meio
de cultura e espalhadas com auxílio de alça de Drigalsky.
Os meios utilizados para o crescimento foram: Levedura de glicose extrato de
peptona (YEPG), composto por (g.L-1): extrato de levedura, 10; peptona
bacteriológica, 20; glicose, 20; ágar bacteriológico, 35,5, acrescido de antibiótico
cloranfenicol 0,1% para crescimento de leveduras; Ágar nutriente (AN) (em g.L-1):
extrato de levedura, 3; peptona bacteriológica, 5; cloreto de sódio, 3; ágar
bacteriológico, 13, acrescido de antibiótico nistatina (1 mL para 250 mL de meio)
para crescimento de bactérias; Ágar batata dextrose (BDA) (g.L-1) preparado de
acordo com fabricante acrescido de antibiótico cloranfenicol 0,1% para crescimento
de fungos. As placas inoculadas foram incubadas a 28±2°C por até 5 dias.
As bactérias foram purificadas pela técnica de esgotamento para obtenção de
colônias isoladas. Essa técnica consiste em fazer estrias, com auxílio de alça de
platina, em meio sólido, onde, por esgotamento, se obtêm colônias isoladas no final
das estrias.
46
A contagem total dos morfotipos encontrados foi realizada e caracterizadas de
acordo com sua morfologia, incluindo tamanho, forma, cor, borda, aparência, brilho e
elevação de acordo com a metodologia de Yarrow (1998). Quanto à purificação dos
fungos, após surgirem as colônias, as mesmas foram separadas com base no
aspecto do micélio, cor dos esporos e em outras características do anverso e
reverso das colônias. Estas colônias foram reinoculadas, através de estrias, em meio
de seleção até a obtenção de culturas puras.
As colônias puras dos fungos foram preservadas seguindo o método de
Castellani (1967). As bactérias foram transferidas para placas contendo meio AN
(RHODES, 1957). Todos os tubos/placas foram guardados em geladeira, a
temperatura de aproximadamente 4°C.
2.5 Estatística
Os resultados obtidos foram submetidos ao teste F a 5% de significância e a
media do tratamento comparado pelo teste de média Tukey a 5% de probabilidade.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Dinâmica físico-química no processo de compostagem do resíduo
ruminal
As mudanças de temperatura verificadas nas diferentes pilhas foram
monitoradas diariamente durante todo o período da compostagem e semanalmente,
baseado na temperatura, foram realizados revolvimentos das pilhas. Também de
acordo com a variação da temperatura foram realizadas quatro amostragens do
resíduo em transformação aos 7, 21, 39 e 63 dias do início do processo. O
monitoramento em todos os tratamentos foi observado através de três fases:
aquecimento, termofílica e fases de arrefecimento e variou de 26 a 71,2ºC em
função do efeito ativador pelo uso de doses crescentes da farinha. A temperatura
das pilhas aumentou rapidamente e no segundo dia do processo já atingiu a fase
termofílica em todos os tratamentos e o máximo das temperaturas foram obtidos
entre o terceiro e sétimo dia. As temperaturas máximas foram 59, 64,6, 67,5, 70,1,
71,2 e 69,9ºC, respectivamente, para os tratamentos 0; 14,2; 30,4; 42,6; 56,8 e 71
kg de FCO. O período com altas temperaturas no interior das pilhas foram diferentes
e duraram 13, 24, 32, 36, 39 e 43 dias, respectivamente, para os tratamentos com
farinha, da menor à maior dose (Figura 2).
47
Figura 2. Dinâmica da temperatura (ºC) durante o período de compostagem em
função dos diferentes tratamentos. A demonstração das etapas I, II, III, IV equivale às coletas realizadas durante o precesso de compostagem (Etapa I-7 dias, II - 21 dias, III – 39 dias, IV – 62 dias). As setas representam os revolvimentos realizados semanalmente. Gurupi-TO, 2016.
Caracterizada por temperaturas acima de 45ºC e predominando a faixa de 45 a
65ºC, na fase termofílica, ocorre plena ação de microrganismos termófilos com
intensa decomposição do material e geração de calor e vapor d’água. Nesta fase, a
dinâmica de gases é fortemente influenciada e o calor gerado impulsiona aeração
por convecção (KIEHL, 2002). A decomposição máxima ocorre a temperaturas entre
65 e 70ºC que poderia destruir os organismos patogênicos e indesejáveis sementes
de ervas daninhas. As temperaturas da massa do resíduo em compostagem controla
a taxa de degradação orgânica e proporcionam indicação de condições ideais que
suportam a biomassa microbiana (DISSE-PULLICINO et al., 2007). Outro fator
importante na compostagem de resíduos orgânicos é a umidade nas pilhas. A
48
umidade foi mantida numa faixa em torno de 40 a 65% (Figura 3). Em níveis acima
de 65%, a água pode deslocar muito do ar presente nos espaços porosos da matriz
da pilha e reduzir a continuidade entre os poros, limitando a difusão do ar e,
consequentemente, propiciando condições desfavoráveis para atividade microbiana
aeróbica (CARLESSO et al., 2011). Por outro lado, a redução do teor de umidade,
menor que 40%, pode ser atribuída ao maior grau de temperatura e de perda por
evaporação para o ar circundante. Quando correlacionamos a variação da umidade
com a variação da temperatura, verifica-se que a temperatura variou em função da
umidade da pilha.
Figura 3. Dinâmica da umidade durante o processo de compostagem. Gurupi-TO, 2016.
Os teores de açúcares redutores totais (ART) foram influenciados ao longo do
processo de compostagem (7, 21, 39 e 62 dias), variando de 0,55 a 3,68%.
Observa-se que houve redução nos teores de ART ao longo do processo e que os
maiores teores foram observados aos sete dias, com tratamento 0 kg de FCO e os
menores aos 62 dias, com 14,2 kg de FCO (Figura 4). Entre as coletas houve
diferença e redução nos teores de açúcares de 60,8 e 64,4% nas coletas 7 e 21
dias, respectivamente, para os tratamentos 0 e 14,2 kg de FCO. Aos 39 dias ocorreu
redução nas concentrações de ART para os tratamentos 14,2; 30,4; 42,6; 56,8 e 71
kg de FCO em comparação com o tratamento 0 kg de FCO que se manteve superior
nesse atributo. Aos 62 dias não ocorreu diferença entre os tratamentos e todos
apresentaram redução nos teores de ART. Essa redução nas etapas finais na
decomposição do resíduo pode estar ligada principalmente com a redução da
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
7 14 21 28 35 42 49 56 63
Um
ida
de
(%
)
Período de compostagem (dias)
1 m³ de RRB + 0 kg de FCO 1 m³ de RRB + 14,2 kg de FCO
1 m³ de RRB + 30,4 kg de FCO 1 m³ de RRB + 42,6 kg de FCO
1 m³ de RRB + 56,8 kg de FCO 1 m³ de RRB + 71 kg de FCO
49
biomassa ou composto, induzindo fortemente os fungos a consumir os açúcares
como fontes de carbono e obtenção de energia para seu próprio crescimento
(POMPEU, 2010).
Figura 4. Teores de açúcares redutores totais durante período de compostagem.
Médias seguidas da mesma letra maiúscula entre as épocas de coleta não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05) e médias seguidas da mesma letra minúscula dentro dos tratamentos não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05). Gurupi-TO, 2016.
A maior disponibilidade de ART no período inicial de compostagem ocorre em
função da maior disponibilidade de resíduo orgânico, maior intensidade de quebra
das moléculas orgânicas por enzimas secretadas por fungos. Estes fungos excretam
enzimas durante seu desenvolvimento degradando compostos para obtenção de
carbono, nitrogênio, enxofre e outros nutrientes, incluindo a glicose, resultante da
degradação da celulose por enzimas celulolíticas (DONINI et al., 2005).
O período de compostagem influenciou a condutividade elétrica (CE) com os
maiores valores no final do processo (p <0,05). Aos 7 e 21 dias teve baixos teores
de CE com probabilidade crescente de acordo com aumento da farinha. Já aos 39 e
62 dias a CE nos tratamentos foi decrescente de acordo com a adição da farinha. O
aumento da CE para o seu valor mais elevado aos 62 dias pode ser devido à
mineralização da matéria orgânica, ocasionado pela decomposição do resíduo em
função do aumento das doses de farinha e aumento da concentração de sais
solúveis (LI et al., 2012). A CE em todos os tratamentos aumentou, atingiu no final
Aa
Ba
AB
a
BA
Aa
Ba
Ba
Ba
Aa
AB
a
AB
a
Ba
AB
a
Aa
AB
a
Ba
Aa
AB
a
AB
a
Ba
Aa
Aa
Aa
Aa
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
7 21 39 62
Acu
ca
res re
du
tore
s to
tais
(%
)
Período de compostagem (dias)1 m³ de RRB + 0 kg de FCO 1 m³ de RRB + 14,2 kg de FCO 1 m³ de RRB + 30,4 kg de FCO
1 m³ de RRB + 42,6 kg de FCO 1 m³ de RRB + 56,8 kg de FCO 1 m³ de RRB + 71 kg de FCO
50
do processo, valores de 2,33, 3,16, 2,73, 2,05, 2,20 e 1,95 mS cm-1 em 0; 14,2; 30,4;
42,6; 56,8 e 71 kg de FCO, respectivamente (Figura 5).
Figura 5. Condutividade elétrica durante período de compostagem. Médias seguidas da mesma letra maiúscula entre as épocas de coleta não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05) e médias seguidas da mesma letra minúscula dentro dos tratamentos não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05). Gurupi-TO, 2016.
A CE é importante para verificar o grau de qualidade da transformação do
resíduo, que serve como indicativo dos níveis de fitotoxicidade pela quantidade de
sais presente no composto. Elevados teores de condutividade elétrica e a alta
concentração de ácidos orgânicos podem inibir a germinação de sementes
(MASSUKADO e SCHALCH, 2010).
As mudanças de pH foram observadas entre as épocas e nos tratamentos (p
<0,05). Na primeira etapa (7 dias) variou de 6,1 a 6,7, na segunda (21 dias) de 5,8 a
6,5, na terceira (39 dias) de 5,5 a 6,5 e na quarta etapa (62 dias) de 5 a 6,6 (Figura
6). A variação foi em função das doses da farinha, com exceção da primeira época.
Ba
AB
a AB
a
Aa
Ba
Ba
AB
a
Aa
Ba B
a
AB
a
Aa
Aa
Aa
Aa A
a
Aa
Aa A
a
Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
7 21 39 62
Co
nd
utivid
ade e
létr
ica
(m
S/c
m)
Período de compostagem (dias)
1 m³ de RRB + 0 kg de FCO 1 m³ de RRB + 14,2 kg de FCO 1 m³ de RRB + 30,4 kg de FCO
1 m³ de RRB + 42,6 kg de FCO 1 m³ de RRB + 56,8 kg de FCO 1 m³ de RRB + 71 kg de FCO
51
Figura 6. pH durante período de compostagem. Médias seguidas da mesma letra maiúscula entre as épocas de coleta não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05) e médias seguidas da mesma letra minúscula dentro dos tratamentos não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05). Gurupi-TO, 2016.
Valores mais altos de pH, a medida que aumenta o efeito ativador com a
adição de farinha foram observados aos 39 e 62 dias do processo de compostagem.
O pH elevado pode ser em função dos microrganismos que começam a degradar as
proteínas da farinha, resultou na liberação de amônia e gradual aumento do valor de
pH (HANAJIMA et al., 2010). Diminuição do pH, conforme observado na dose 0 e
14,2 kg de FCO aos 39 e 62 dias, pode ser devido à liberação de ácidos orgânicos e
inorgânicos durante a degradação da matéria orgânica (LI et al., 2012). A faixa de
pH considerada ótima para o desenvolvimento dos microrganismos responsáveis
pela compostagem situa-se entre 5,5 e 8,5, uma vez que a maioria das enzimas
encontram-se ativas nesta faixa de pH (VALENTE et al., 2009).
Quanto aos teores de proteína, houve crescimento ao longo do processo de
compostagem (p <0,05). Na primeira etapa (7dias) variou de 11,24 a 14,91, na
segunda (21 dias) de 13,30 a 16,76, na terceira (39 dias) de 15,59 a 18,06 e na
quarta etapa (62 dias) de 15,94 a 18,89 (Figura 7).
Aa
Bb
Cc
Dd
Aab
Aa
Bc
Cd
Bb A
a
Bb
Cc
Ab
Aab
Ab
Ab
Ab Aa Aa
Aa
Bb
Bab
AB
a Aa
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
7 21 39 62
pH
(á
gu
a)
Período de compostagem (dias)1 m³ de RRB + 0 kg de FCO 1 m³ de RRB + 14,2 kg de FCO 1 m³ de RRB + 30,4 kg de FCO
1 m³ de RRB + 42,6 kg de FCO 1 m³ de RRB + 56,8 kg de FCO 1 m³ de RRB + 71 kg de FCO
52
Figura 7. Teores de proteína durante período de compostagem. Médias seguidas da
mesma letra maiúscula entre as épocas de coleta não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05) e médias seguidas da mesma letra minúscula dentro dos tratamentos não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05). Gurupi-TO, 2016.
Esse comportamento pode ser devido a liberação de nitrogênio (7%) presente
na farinha ao longo do processo, promovendo o efeito ativador na transformação do
resíduo ruminal, conforme pode ser observado os baixos valores de proteína nos
tratamentos aos sete dias, principalmente o tratamento 0 e 14,2 kg de FCO. No
entanto, aos 21, 39 e 62 dias de compostagem estes mesmos tratamentos
obtiveram incremento significativo nos valores de proteína tendo seus valores
máximos aos 62 dias chegando próximos aos valores dos tratamentos 30,4; 42,6;
56,8 e 71 kg de FCO no mesmo período. Pode-se observar também que aos 21 dias
de compostagem houve pequena redução na porcentagem de proteína para os
tratamentos 42,6; 56,8 e 71 kg de FCO ficando abaixo dos valores encontrados para
os tratamentos 0; 14,2 e 30,4 kg de FCO no mesmo período.
O nitrogênio beneficia os tratamentos à medida que aumenta as dosagens de
farinha de carne e osso e funciona como ativador dos microorganismos. Essa
informação pode ser corroborada com o período de temperatura elevada nas pilhas
de compostagem.
3.2. Dinâmica microbiana do processo de compostagem do conteúdo
ruminal
3.2.1. Número de colônias
Aa
Aa
Aa
Aa
Ba
Aa A
a
Aa
Aa
Aa A
a Aa
Ba
Ba
AB
a Aa
Aa
Aa
Aa
Aa
Ba
Ba
AB
a Aa
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
20,00
7 21 39 62
Pro
tein
a (%
)
Período compostagem (dias)
1 m³ de RRB + 0 kg de FCO 1 m³ de RRB + 14,2 kg de FCO 1 m³ de RRB + 30,4 kg de FCO
1 m³ de RRB + 42,6 kg de FCO 1 m³ de RRB + 56,8 kg de FCO 1 m³ de RRB + 71 kg de FCO
53
Durante o processo de compostagem foram isoladas e purificadas 263
bactérias e 116 fungos. Nenhuma levedura foi detectada. A quantidade de colônias
de bactérias (log UFC ml-1) foi influencia pelos diferentes compostos e pelas épocas
de amostragem do resíduo em compostagem para isolamento dos microrganismos
(p≤0,05). Na etapa inicial (7 dias) a quantidade de UFC teve variação de 6,09 a 6,69
log UFC ml-1, na segunda (21 dias) de 5,40 a 6,97 log UFC ml-1, na terceira (39 dias)
de 6,22 a 7,24 log UFC ml-1 e na quarta etapa (62 dias) de 6,14 a 7,55 log UFC ml-1
(Figura 8).
Figura 8. Número de colônias de bactérias (log UFC ml-1) em função de diferentes compostos e épocas de coleta do material em compostagem para isolamento de microrganismos. Médias seguidas da mesma letra maiúscula entre as épocas de coleta não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05) e médias seguidas da mesma letra minúscula dentro dos tratamentos não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05). Gurupi-TO, 2016.
Durante o processo de compostagem, a quantidade de colônias de bactérias
foi superior na 4ª etapa (62 dias), com destaque para os tratamentos 42,6; 56,8 e 71
kg de FCO. Comportamento inverso foi observado na dose zero, ou seja, à medida
que o processo de compostagem evoluiu houve diminuição da quantidade de
bactérias. Já as condições que menos favorecem foram encontradas nos
tratamentos 30,4; 42,6 e 71 kg de FCO na 2ª etapa (21 dias) do processo de
compostagem. Pode-se observar que na 1ª e 2ª etapa (7 e 21 dias) as maiores
quantidades de colônias de bactérias foram encontradas no tratamento 56,8 kg de
Ba
Bb E
c
FdEc
Cd
Ba
Eb
Cb
Fd
Dc Da
Db
Ed
Fc
Aa
Ad
Ac A
b Ca
Fc
Dd
Cb
Ba
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
7 21 39 62
Ba
cté
ria
s lo
g U
FC
/ml
Periodo de compostagem(dias)
1 m³ de RRB + 0 kg de FCO 1 m³ de RRB + 14,2 kg de FCO 1 m³ de RRB + 30,4 kg de FCO
1 m³ de RRB + 42,6 kg de FCO 1 m³ de RRB + 56,8 kg de FCO 1 m³ de RRB + 71 kg de FCO
54
FCO. Aos 39 dias de avaliação (3ª etapa) os maiores valores também foram
observados no tratamento 56,8 kg de FCO.
O número de colônias de fungos (log UFC ml-1) foram influenciados pelos
tratamentos e épocas de amostragem do resíduo durante o processo de
compostagem (p≤0,05). Na etapa inicial (7dias) a quantidade de UFC teve variação
de 1 a 1,8 log UFC ml-1, na segunda (21 dias) de 1,3 a 1,8 log UFC ml-1, na terceira
(39 dias) de 1,6 a 1,9 log UFC ml-1 e na quarta etapa (62 dias) de 1,5 a 1,7 log UFC
ml-1 (Figura 9).
Figura 9. Número de colônias de fungos (log UFC ml-1) em função de diferentes
compostos e épocas de coleta do material em compostagem para isolamento de microrganismos. Médias seguidas da mesma letra maiúscula entre as épocas de coleta não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05) e médias seguidas da mesma letra minúscula dentro dos tratamentos não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05). Gurupi-TO, 2016.
Há uma probabilidade (p≤0,05) crescente na quantidade de colônias de fungos
da primeira à quarta coleta, destacando as coletas realizadas aos 39 e 62 dias,
respectivamente, assim como os tratamentos 14,2 e 30,4 kg de FCO da segunda
coleta. Pode-se observar que as colônias de fungos tiveram aumento nas etapas 3ª
e 4ª (39 e 62 dias) com destaque para os tratamentos 56,8 kg de FCO na 3ª etapa e
o tratamento 71 kg de FCO para a 4ª etapa. Ou seja, os períodos finais de
compostagem compreenderam os maiores valores de colônias de fungos. Já as
menores concentrações de colônias de fungos foram obtidas na 1ª etapa (7 dias) do
processo de compostagem em todos os tratamentos. Nessa etapa, em todos os
Da
Ce
Bc A
c
Dc
Aa
Bb
Cf
Da
Ab
Cd
Bb
Da
Cf
Bf
Ae
Dc
Cd
Aa
Bd
Db
Cc
Be
Aa
0
1
2
3
4
5
7 21 39 62
Fu
ng
os lo
g U
FC
/ ml
Período de compostagem (dias)
1 m³ de RRB + 0 kg de FCO 1 m³ de RRB + 14,2 kg de FCO 1 m³ de RRB + 30,4 kg de FCO
1 m³ de RRB + 42,6 kg de FCO 1 m³ de RRB + 56,8 kg de FCO 1 m³ de RRB + 71 kg de FCO
55
tratamentos a temperatura estava acima de 60 ºC (Figura 3). A diminuição da
quantidade de fungos aos sete dias foi presumivelmente o resultado da elevada
temperatura e condições desfavoráveis estabelecida durante a fase termofílica. Aos
21 dias do processo de compostagem, os tratamentos 14,2 e 30,4 kg de FCO
obtiveram as quantidades de colônias de fungos de todas as épocas e tratamentos.
Esses altos valores estão relacionados a grande quantidade de UFC de um único
fungo. No geral, as maiores quantidades de fungos foram encontradas nos
tratamentos 14,2 e 42,6 kg de FCO na 2ª etapa (21 dias) e o tratamento 56,8 kg de
FCO da 3ª etapa (39 dias) do processo de compostagem. Já os menores valores
foram encontrados nos tratamentos 14,2 e 56,8 kg de FCO na 1ª etapa (7 dias).
3.2.2. Diversidade de colônias
A diversidade de colônias de bactérias apresentou significância (p≤0,05) em
função dos tratamentos (compostos) e das épocas de coletas dos materiais (7, 21,
39 e 62 dias) (Figura 10). A compreensão dessa dinâmica da comunidade
microbiana é importante para melhorar a eficiência do processo de compostagem
(BROWN et al., 2008)
Figura 10. Diversidade de colônias de bactérias em função de diferentes compostos e épocas de coleta do material em compostagem para isolamento de microrganismos. Médias seguidas da mesma letra maiúscula entre as épocas de coleta não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05) e médias seguidas da mesma letra minúscula dentro dos tratamentos não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05). Gurupi-TO, 2016.
Bb
Bc
Ba
Cc
Cc A
b
Ca
Ac
Dc
Ed
Aa
Ab
Aa
Cb
Ea
Dc
Aa
Cc
Ea
Cb
Ed
Dc
Da
Cb
0
5
10
15
20
25
7 21 39 62
Div
ers
ida
de
de
co
loô
nia
s d
e
ba
cté
ria
s
Periodo de compostagem (dias)
1 m³ de RRB + 0 kg de FCO 1 m³ de RRB + 14,2 kg de FCO 1 m³ de RRB + 30,4 kg de FCO
1 m³ de RRB + 42,6 kg de FCO 1 m³ de RRB + 56,8 kg de FCO 1 m³ de RRB + 71 kg de FCO
56
Com o avanço no tempo do processo de compostagem ocorreu a redução na
temperatura e favoreceu a ocorrência dos organismos mesófilos, que atuaram por
menor tempo sobre o processo de compostagem. A maior diversidade de colônias
de bactérias isoladas foi durante a 3ª etapa (39 dias) de compostagem. Nessa etapa
as maiores diversidades de colônias de bactérias foram verificadas nos tratamentos
30,4 kg de FCO (19 colônias), 0 kg de FCO (18 colônias), 14,2 kg de FCO (15
colônias) e 71 kg de FCO (14 colônias), já o 42,6 kg de FCO e 56,8 kg de FCO
foram semelhantes com 13 colônias, com pouco influencia do efeito ativador de
doses crescentes da farinha.
Nas demais épocas, níveis mais baixos foram observados com os tratamentos
42,6; 56,8 e 0 kg de FCO aos 7 dias, 14,2 kg de FCO aos 21 dias, 42,6 e 56,8 kg de
FCO aos 39 dias e 30,4 kg de FCO aos 62 dias. A maior diversidade de colônias de
bactéria foi observada no tratamento 30,4 kg de FCO, seguido pelo 0 kg de FCO e
14,2 kg de FCO da terceira coleta e pode está relacionado com a temperatura
durante a coleta desse material, as quais variaram de 30 a 37 ºC temperatura esta
que favorece o desenvolvimento de organismos mesófilos (25ºC<T<45ºC). Esse fato
fica mais evidenciado quando observa-se que à medida que a temperatura aumenta,
ocorre redução nas colônias de bactérias, o que pode ser mais evidência de que
nessa fase ocorre predominância de bactérias mesófilas.
A temperatura segundo Hassen et al. (2001) é um dos principais indicadores da
compostagem e determina a velocidade a que muitos dos processos biológicos tem
lugar e desempenha papel seletivo na evolução e sucessão nas comunidades
microbiológicas.
Menor quantidade de colônias de bactérias foi observada nos tratamentos 71 e
30,4 kg de FCO (7 dias), 71 e 30,4 kg de FCO (21 dias) e 42,6 kg de FCO (62 dias).
Na pilha de compostagem do tratamento 71 e 30,4 kg de FCO aos 7 e 21 dias a
temperatura chegou próximo a 70ºC, o que pode ter inibido a diversidade de
bactérias termófilas.
No início da decomposição dos resíduos orgânicos, na fase mesófila,
predominam bactérias, que são responsáveis pela quebra inicial da matéria
orgânica, promovendo a liberação de calor na massa em compostagem. Nesta fase,
ocorre a atuação de fungos que utilizam a matéria orgânica sintetizada pelas
bactérias e outros microrganismos como fonte de energia (VALENTE et al., 2009),
57
no entanto em menor quantidade. Isso justifica o fato de ter-se isolado maior
quantidade de colônias de bactérias em relação aos fungos (Figura 7). Se comparar
a diversidade de colônias de bactérias com as colônias de fungos em função dos
diferentes compostos e das diferentes épocas de coleta verifica-se grande diferença,
com as bactérias bem superior em quantidade ao longo do processo de
compostagem.
A diversidade de colônias de fungos apresentou significância ao teste F
(p≤0,05), diferindo (p≤0,05) em função dos tratamentos e das épocas de
amostragem (7, 21, 39 e 62 dias). Na primeira etapa (7dias) a diversidade de fungos
variou de 2 a 6 colônias, na segunda (21 dias) de 2 a 6 colônias, na terceira (39
dias) de 4 a 8 colônias e na quarta etapa (62 dias) de 3 a 5 colônias (Figura 11). A
diversidade dos fungos é bem menor que as de bactérias e seguiu a mesma
tendência, com os maiores valores ocorridos na terceira etapa (39 dias), nos
tratamentos 0 kg de FCO (8 colônias), 14,2 kg de FCO (6 colônias) e 71 kg de FCO
(6 colônias), possivelmente por ter sido observado as menores temperaturas durante
a fase de degradação do material, antes de atingir a estabilização do composto.
Figura 11. Diversidade de colônias de fungos em função de diferentes compostos
(tratamentos) e épocas de coleta do material em compostagem para isolamento de microrganismos. Médias seguidas da mesma letra maiúscula entre as épocas de coleta não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05) e médias seguidas da mesma letra minúscula dentro dos tratamentos não diferem entre si ao teste tukey (p≤0,05). Gurupi-TO, 2016.
Dc
Ba
Aa
Cb
Dc
Bb
Ab
Cb
Aa
Cd
Bd
Dc
Bb
Ce
Ac
Bb
Bc
Ab
Ac
Aa
Dc
Bc
Ab
Cb
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
7 21 39 62
Div
ers
ida
de
de
co
lôn
ias d
e fu
ng
os
Periodo de compostagem (dias)
1 m³ de RRB + 0 kg de FCO 1 m³ de RRB + 14,2 kg de FCO 1 m³ de RRB + 30,4 kg de FCO
1 m³ de RRB + 42,6 kg de FCO 1 m³ de RRB + 56,8 kg de FCO 1 m³ de RRB + 71 kg de FCO
58
Já a menor diversidade de colônias de fungos foram verificadas nos
tratamentos 0; 14,2; 56,8 e 71 kg de FCO, ambos na 1ª etapa (7 dias) da
compostagem, e nos tratamentos 42,6 e 71 kg de FCO na etapa 2 (21 dias). O
limite para a atividade fúngica parece ser 60ºC (DAY e SHAW, 2005). Essa
informação explica também o motivo da etapa 1 (7 dias) ter apresentado no geral as
menores quantidades de colônias de fungos, pois nessa fase foram observadas
temperaturas acima de 60ºC. A diminuição da diversidade de fungos aos sete dias
foi presumivelmente o resultado da elevada temperatura e condições desfavoráveis
estabelecida durante a fase termofílica.
Diante disso, efeito ativador pelo uso de doses crescentes da FCO tende a ser
negativo para a quantidade e diversidade de bactérias e fungos no início do
processo de decomposição do resíduo ruminal bovino e a partir dos 39 dias o efeito
passa a ser significativamente positivo em função do aumento das doses de FCO. A
alteração nos indicadores temperatura, umidade, açúcares redutores totais,
condutividade elétrica, pH e proteína indicaram aumento na degradação do resíduo
ruminal bovino em função do efeito ativador com o uso de doses crescentes da
FCO.
4. CONCLUSÕES
O efeito ativador com o uso de doses crescentes da farinha proporcionou
alteração nos indicadores temperatura, açúcares redutores totais, condutividade
elétrica, pH e proteínas totais indicando aumento na degradação do resíduo ruminal
bovino. A partir dos 39 dias o efeito ativador passa a ser significativamente positivo
em função do aumento das doses de farinha.
5. REFERÊNCIAS
BONITO, G.; ISIKHUEMHEN, O. S.; VILGALYS, R. Identification of fungi
associatedwith municipal compost using DNA-based techniques. Bioresource
Technology, New York, v.101, n.3, p.1021–1027, 2010.
BREMNER, J. M.; MULVANEY, C. S. Nitrogen total. In: Page, A.L. (ed.) Methods of
soil analysis. Part 2. Madison: American Society of Agronomy, v.2, p.595-624,1982.
59
BROWN, S.; KRUGER, C.; SUBLER, S. Greenhouse gas balance for composting
operations. Journal of Environmental Quality, Madison, v.37, n.4, p.1396–1410,
2008.
CARLESSO, W. M.; RIBEIRO, R.; HOEHNE, L. Tratamento de resíduos a partir de
compostagem e Vermicompostagem.Revista Destaques Acadêmicos, Lajeado, v.
3, n.4, p. 105-110, 2011.
CASTELLANI, A. Maintenace and cultivation of the common pathogenic fungi of man
in sterile distilled water. Futher researches. Journal of Tropical Medicine and
Hygiene,Deerfield, v.70, n.13, p.181-184, 1967.
CLARK F. E. Agar-plate method for total microbial count. In: Black CA, Evans DD,
White JL, Ensminger LE, Clark FE; Dinauer RC (Eds.). Methods of soil analysis:
chemical and microbiological properties. New York, 1965, p. 1460-1466.
DAY, M.; SHAW, K. Processos Biológicos, químicos, físicos del compostaje.
In:STOLLELLA, P. e KAHN, B. (eds.), Utización de compost en sistemas de
cultivo hortícola.Ediciones Mundi-Prensa. 2005, p. 17-50.
DE GANNES, V. D.; EUDOXIE, G.; HICKEY, W. J. Prokaryotic successions
anddiversity in composts as revealed by 454-pyrosequencing. Bioresource
Technology, New York, v.133, p.573–580, 2013.
DISCHE, E. Color reactions of carbohydrates. In: WHISTLER, R.L.; WOLFRAM, M.L.
(eds.). Methods in carbohydrates chemistry. Academic Press, New York, 1962,
v.1, p. 477-512.
DONINI, L. P.; BERNARDI, E.; MINOTTO, E.; NASCIMENTO, J. S. Desenvolvimento
in vitro de Pleurotus spp. sob a influência de diferentes substratos e dextrose.
Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v.72, n.3, p.331-338, 2005.
60
FRANKE-WHITTLE, I. H.; CONFALONIERI, A.; INSAM, H.; SCHLEGELMILCH, M.;
KÖRNER, I. Changes in the microbial communities during co-composting of
digestates. Waste Management, Houston, v.34, n.3, p.632–641, 2014.
HANAJIMA, D.; KURODA, K.; MORISHITA, K.; FUJITA, J.; MAEDA, K.; MORIOKA,
R. Key odor components responsible for the impact on olfactory sense during swine
feces composting. Bioresource Technology, New York, v.101, n.7, p.2306 - 2310,
2010.
HASSEN, A.; BELGUITH, K.; JEDIDI, N.; CHERIF, A. Microbial characterization
during composting of municipal solid waste. Bioresource Technology, New York,
v.80, n.1, p.217-25, 2001.
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Indicadores IBGE: Estatística
da Produção Pecuária. 2015, 80 p. Disponível
em:<http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/indicadores/agropecuaria/producaoagro
pecuaria/abate-leite-couro-ovos_201404_publ_completa.pdf> Acesso em:
29/05/2015.
KIEHL, E. J. Manual de Compostagem “Maturação e qualidade do Composto”.
Piracicaba. 2002. 171p.
LANGARICA-FUENTES, A.; ZAFAR, U.; HEYWORTH, A.; BROWN, T.; FOX, G.;
ROBSON, G. D. Fungal succession in an in-vessel composting system characterized
using 454pyrosequencing. FEMS Microbiology Ecology, Amsterdam, v.88, n.2,
p.296–308, 2014.
LESSON, S.; SUMMERS, D. J. Commercial poultry nutrition. 2 ed. Guelph,
Ontario. Canada: University Books; 1997. 350p.
LI, R. H.; WANG, J. J.; ZHANG, Z. Q.; SHEN, F., Z;ANG, G. J.; QIN, R.; LI, X. L.;
XIAO, R. Nutrient transformations during composting of pig manure with bentonite.
Bioresource Technology, New York, v.121, n.3, 362–368, 2012.
61
LÓPEZ GONZÁLEZ, J. A.; VARGAS GARCÍA, M. C.; LÓPEZ, M. J.; SUÁREZ
ESTRELLA, F.; JURADO, M.; MORENO, J. Enzymatic characterization of microbial
isolates from lignocellulose waste composting: chronological evolution. Journal
Environmental Management, New York, v.145, n.4, p.137–146, 2014.
MACCREADY, J. S.; ELBERT, N. J.; QUINN, A. B.; POTTER, B. A. An assessment
ofbacterial populations in a static windrow compost pile. Compost Science And
Utilization, Elsevier, v.21, n.2, p.110–120, 2013.
MASSUCADO, L. M.; SCHALCK, V. Avaliação da qualidade do composto
proveniente da compostagem da fração orgânica dos resíduos domiciliares. Revista
DAE, São Paulo, n. 180, 2010;
NEHER, D. A.; WEICHT, T. R.; BATES, S. T.; LEFF, J. W.; FIERER, N. Changes in
bacterial and fungal communities across compost recipes, preparation methods, and
composting times. PLoS One, San Francisco, v.8, n.11, p.79512. 2013.
POMPEU, G. B., Comportamento enzimático de quatro fungos lignoceluloticos
crescidos em bagaço e palha de cana-de-açucar e exposto a duas
concentrações de nitrogênio, visando a obtenção de etanol. 2010. Tese de
Doutorado, Universidade de São Paulo. Piracicaba, 2010.
RHODES, M. E. The preservation of Pseudomonas under mineral oil. Journal of
Applied Microbiology, Oxford, v. 20, n. 1, p.108–118, 1957.
DISSE-PULLICINO, D.; ERRIQUENS, F. G.; GIGLIOTTI, G. Changes in the chemical
characteristics of water-extractable organic matter during composting and their
influence on compost stability and maturity. Bioresource Technology, New York,
v.98, n.9, p.1822–1831, 2007.
SHRESTHA, K.; SHRESTHA, P.; WALSH, K. B.; HARROWER, K. M.; MIDMORE, D.
J. Microbial enhancement of compost extracts based on cattle rumen content
compost – Characterisation of a system. Bioresource Technology, New York, v.
102. n.17, p. 8027–8034. 2011.
62
SILVA, D. J. Análise de alimentos (Métodos químicos e biológicos). Viçosa,
Universidade Federal de Viçosa, 1998. 166p.
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A. J. Métodos de análise microbiológica de
alimentos: manual técnico n° 14. Campinas: Instituto de Tecnologia de Alimentos,
p.17-19, 1995.
SILVA, R. R. Avaliação agronômica de resíduos gerados em frigoríficos
bovinos. 2010. 90f. Tese (Tese em Agronomia) – Departamento de solos e nutrição
de plantas, Universidade Federal de Viçosa.
SIMÃO, B. R.; AZEVEDO, C. M. S. B.; MIRANDA, L. C.; OLIVEIRA, H. V.; FREITAS,
A. V. L. Farinha de carne e ossos como substituto da Farinha de peixe em dietas de
camarão. Caatinga, Mossoró, v.21, n.1, p.22-28, 2008.
SIMARD, R. R.; EVANS, L. J.; BARES, T. E. Effects of additions of CaCO3 and P on
the soil solution composition of a Podzolic soil. Canadian Journal of Soil Science,
Boca Raton: Lewis Publish, v. 68, n.1, p. 41-52. 1988.
SONG, C.; LI, M.; JIA, X.; WEI, Z.; ZHAO, Y.; XI, B.; ZHU, C.; LIU, D. Comparison of
bacterial community structure and dynamics during the thermophilic composting of
different types of solid wastes: anaerobic digestion residue, pig manure and chicken
manure. Microbial Biotechnology, Boston, v.7, n.5, p.424–433, 2014.
USDA. United States Department of Agriculture. Foreign Agricultural Service.
Foreign Agricultural Service [home page]. Disponível em: <http://www.fas.usda.gov/
psdonline/psdQuery.aspx psdonline>. Acesso em: 16 nov. 2015.
VALENTE, B. S.; XAVIER, E. G.; MORSELLI, T. B. G. A.; JAHNKE, D. S.; BRUM
JR., B. S.; CABRERA, B. R.; MORAES, P. O.; LOPES,D. C. N.Fatores que afetam o
desenvolvimentoda compostagem de resíduos orgânicos. Archivos Zootecnia,
Córdoba, v.58, n.1, p. 59-85, 2009.
63
WANG, X. W.; ZHANG, L. Y.; XI, B. D.; SUN, W. J.; XIA, X. F.; ZHU, C. W.; HE, X.
S.; LI, M. X.; YANG, T. X.; WANG, P. F.; ZHANG, Z. L. Biogas production
improvement and C/N control by natural clinoptilolite addition into anaerobic co-
digestion of Phragmites australis, feces and kitchen waste. Bioresource
Technology, New York, v.180, p.192–199, 2015.
YARROW, D. Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts.
The yeasts, a taxonomic study, Amsterdan, v. 4, n.1, p. 77-100, 1998.
64
CAPITULO 3
COMPATIBILIDADE DE CULTURA MISTA COM FUNGOS CELULOLÍTICOS PARA DEGRADAÇÃO DE RESÍDUO RUMINAL EM PILHAS DE COMPOSTAGEM RESUMO A prospecção de linhagens de fungos a partir de fontes diversificadas e de baixo custo, como os resíduos agroindustriais, pode levar a melhor produção enzimática e também possíveis fontes de inóculo. Diante disso, objetivou-se avaliar a compatibilidade de cultura mista de fungos celulolíticos para bioconversão de resíduos ruminal em pilhas de compostagem. O experimento foi implantado em arranjo fatorial 6 x 4, com o primeiro fator equivalente a seis tratamentos de conteúdo ruminal bovino enriquecido e o segundo a quatro épocas de amostragem durante o processo de compostagem (7, 21, 39 e 62 dias). A triagem dos fungos celulolíticos aos 7, 21, 39 e 62 dias foi realizada em meio de Vogel, suplementado com 1% da fonte de carbono carboximetilcelulose. Os isolados que obtiveram os maiores índices enzimáticos foram testados em cultivos submersos, suplementado com 1% da fonte de carbono para a produção das enzimas FPase, endoglicanase, exoglicanase e xilanase. Os fungos com as maiores produções enzimáticas foram testados quanto ao desenvolvimento e compatibilidade em cultura mista por fermentação em estado sólido, contendo 10 g do conteúdo ruminal + 2,84 g de farinha de carne e osso. Inicialmente, foram isolados 116 fungos, na qual, 41% apresentaram halo indicador da degradação da carboximetilcelulose. Os fungos que apresentam potencial para produção das enzimas FPase (1T5501-0,203 U.ml), endoglucanase (1T5501-42,563 U.mL) e xilanase (2T5501-20,122 U.mL) e quando em compatibilidade por fermentação estado sólido, ocorreram interações mutualísticas em duas combinações para produção de celulases e uma combinação para xilanase. Assim, o conteúdo ruminal bovino enriquecido mostra-se como potencial fonte de inóculo para futuros processos de compostagem. Palavras chave: resíduo frigorífico, processos fermentativos, celulases, inóculo.
COMPATIBILITY ASSESSMENT CULTURE MIXED FUNGI CELLULOLYTIC RUMINAL FOR WASTE COMPOSTING BIOCONVERSION IN CELLS
ABSTRACT
The prospect of fungal strains from diverse sources and low cost, such as agricultural residues, can lead to improved enzyme production as well as possible sources of inoculum. The research objective was to evaluate the mixed culture compatibility cellulolytic fungi for bioconversion rumen waste in compost piles. The experiment was carried out in factorial arrangement 6 x 4, the first factor equivalent to six treatments of bovine rumen contents enriched and the second to four sampling periods during the composting process (7, 21, 39 and 62 days). The screening of cellulolytic fungi at 7, 21, 39 and 62 days was performed on Vogel's medium supplemented with 1% carboxymethylcellulose carbon source. Isolates that had the highest enzyme levels were tested in submerged cultures supplemented with 1% carbon source for the production of FPase enzymes, endoglucanase, exoglucanase
65
and xylanase. Fungi with the highest enzyme production were tested for development and compatibility in mixed culture by solid state fermentation, containing 10 g of rumen contents + 2.84 g of meat and bone meal. Initially, they were isolated mold 116, in which 41% had carboxymethylcellulose halo indicator of degradation. The fungi have potential for the production of enzymes FPase (1T5501-0,203 U.ml), endoglucanase (1T5501-42,563 U.ml) and xylanase (2T5501-20,122 U.ml) and when in compatibility by fermentation solid, there mutualistic interactions two combinations for the production of cellulase to xylanase and a combination. Thus, the bovine rumen contents enriched shows up as a potential source of inoculum for further composting processes. Key words: residue fridge, fermentation processes, cellulases, inoculum. 1. INTRODUÇÃO
A produção de biomassa e sua conversão bioquímica em produtos de maior
valor agregado é tema central de várias áreas de estudo para a mitigação de
problemas ambientais gerados em função da deposição inadequada de resíduos
provenientes da agropecuária. Nas últimas décadas, com a consolidação massiva
de operações de alimentação de animais confinados surgiu a necessidade de novos
sistemas de gestão de resíduos que sejam viáveis e ambientalmente corretos
(CANTRELL et al., 2008). No Brasil, o rebanho bovino abatido no ano de 2014 foi de
aproximadamente 34 milhões de cabeças, enquanto que o Estado do Tocantins
contribuiu com a produção de mais 1,15 milhões de cabeças de gado (IBGE, 2015).
Cada animal, no abate, pode produzir até 25 kg de conteúdo ruminal o que resulta
em produção de aproximadamente 847 mil toneladas de biomassa no País, ou 29
mil toneladas destes resíduos no Estado (VASCONCELOS et al., 2013).
Visto como desperdício nas operações de abate (SHERESTHA et al., 2011), o
conteúdo ruminal pode passar por vários tratamentos biológicos para promover a
bioconversão dos polímeros de lignocelulose em produtos de maior valor agregado
como biocombustíveis, biofertilizantes, biogás, e compostos oriundos da
compostagem (ROY et al., 2013; JIN et al., 2014). Os resíduos do conteúdo ruminal
podem melhorar as propriedades físicas do solo pela matéria orgânica, melhorar a
estrutura do solo, suprimir os patógenos do solo e aumentar o crescimento vegetal.
No entanto, este composto in natura ou imaturo pode causar fitotoxicidade às
plantas e afetar adversamente o ambiente quando aplicado ao solo (FREITAS et al.,
66
2013), tornando-se necessário submeter estes resíduos a processos de maturação e
transformação de sua matéria orgânica.
A bioconversão dos polímeros lignocelulósicos pode ser realizada através do
processo de compostagem, que é processo microbiológico aeróbio desenvolvido por
microrganismos, o que leva a decomposição e estabilização da matéria orgânica
durante três fases: mesofílica, termofílica e maturação (BIAŁOBRZEWSKI et al.,
2015). Uma variedade de enzimas hidrolíticas rege o processo de compostagem e
controlam a velocidade em que os vários substratos são degradados (SHI et al.,
2011). Desse modo, a bioconversão da celulose do conteúdo ruminal, pode ser
conseguida principalmente através das ações sinérgicas de conjunto de enzimas
hidrolases denominadas celulases (SADHU e MAITI, 2013). A hidrólise enzimática
de material celulósico em glicose envolve a ação sinérgica de pelo menos três
enzimas diferentes: Endoglucanase, exoglucanase e glicosidase (LI et al., 2013). As
endoglucanases clivam randomicamente os sítios internos amorfos da cadeia
polissacarídica da celulose, originando oligossacarídeos de vários comprimentos; as
exoglucanases - atuam nos terminais redutores ou não-redutores das cadeias de
celulose, liberando glicose ou celobiose; e as glicosidase hidrolisam celobiose e
oligossacarídeos solúveis em glicose (NURKANTO, 2009; CASTRO e PEREIRA,
2010). O sinergismo entre estes três tipos de enzimas é que torna possível a efetiva
degradação da celulose (VRIES e VISSER, 2001).
A capacidade de produzir enzimas que degradam a celulose em temperaturas
mais elevadas e possuírem maior estabilidade térmica tem sido alvo de pesquisas.
Além de serem novas opções para a produção de celulases termotolerantes, os
fungos termofílicos, sintetizam celulases resistentes à pHs de alcalinidade e acidez
elevadas. Também conseguem desenvolver-se em variedade de substratos com
menores riscos de contaminação por outros microrganismos (BHAT e BHAT, 1997).
Celulases termoestáveis possuem diversas aplicações industriais, tais como
indústrias de alimentos e açúcar, onde processos de altas temperaturas, como
pasteurização, são utilizados. Outras aplicações incluem indústrias de
biocombustíveis, papel, tratamento de resíduos domésticos e agroindustriais (JANG
e CHEN, 2003).
O interesse comercial nos fungos filamentosos se deve a sua capacidade de
decompor diferentes substratos, o que pode gerar produtos ou processos, como o
isolamento de enzimas e a biodegradação de resíduos. Assim, a seleção de
67
microrganismos celulolíticos durante o processo de compostagem é de suma
importância, tendo em vista a procura de novos microrganismos produtores de
enzimas e a melhoria de suas aplicações agronômicas e biotecnológicas (AMORE et
al., 2013, YEOMAN et al., 2010).
Diante disso, objetivou-se avaliar a produção enzimática e desenvolvimento de
cultura mista a partir de fungos filamentosos celulolíticos provenientes da
compostagem de conteúdo ruminal bovino.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Seleção de Microrganismos Produtores de Enzimas Extracelulares
O trabalho foi conduzido na Universidade Federal do Tocantins (UFT), Campus
Universitário de Gurupi, coordenadas de 11°44’44,16” de latitude sul e 49°03’04,17”
de longitude oeste, a 280 m de altitude no sul do estado do Tocantins.
O experimento foi implantado em arranjo fatorial 6 x 4, com o primeiro fator
equivalente a seis tratamentos de conteúdo ruminal bovino (CRB). Os seis
tratamentos foram constituídos por 1 m³ de conteúdo ruminal bovino (CRB) e seis
doses de farinha de carne e osso (FCO), sendo 0; 14,2; 30,4; 42,6; 56,8 e 71 kg de
FCO e o segundo fator são quatro épocas de amostragem durante a compostagem
(7, 21, 39 e 62 dias). O processo de compostagem foi avaliado durante 73 dias.
As amostras (500 g) foram coletadas durante as fases da compostagem nos
dias 7, 21, 39 e 63. Para coleta das amostras foi realizado corte transversal (5cm) de
cima a baixo no centro da pilha e também coletas na região frontal, lateral e topo
(Figura 1).
Figura 1. Pontos de amostragens em pilhas de compostagem de conteúdo ruminal
bovino. Gurupi – TO, 2016.
68
As amostras dos diferentes pontos, juntamente com a amostra do corte
transversal foram homogeneizadas e encaminhadas ao laboratório para serem
armazenadas em ambiente refrigerado (4°C) até serem analisadas.
2.2. Isolamento dos microrganismos
O isolamento dos microrganismos foi realizado com diluições seriadas
conforme proposto por Clark (1965). Inicialmente, 10 g do composto orgânico foi
adicionado em 90 mL de solução salina peptonada estéril, composta por 0,85% (p/v)
de cloreto de sódio e 0,1% (p/v) de peptona bacteriológica (Silva e Junqueira, 1995).
A amostra foi homogeneizada e mantida sob agitação em mesa agitadora orbital a
127 rpm, por 15 min. Posteriormente, sucessivas diluições seriadas foram realizadas
e 100 μL de amostra foram transferidas à placas de Petri contendo meio de cultura e
espalhadas com auxílio de alça de Drigalsky.
O meio utilizado para o crescimento foi o ágar batata dextrose (BDA) (em g L-1)
preparado de acordo com o fabricante acrescido de antibiótico cloranfenicol 0,1%
para crescimento de fungos. As placas inoculadas foram incubadas a 28±2°C e
avaliadas diariamente por até 5 dias. As colônias foram separadas com base no
aspecto do micélio, cor dos esporos e características do anverso e reverso das
colônias. As colônias foram transferidas para as placas contendo meio de cultura
ágar batata dextrose (BDA), por 5 dias, 28±2°C. Estas colônias foram reinoculadas
em meio de seleção até a obtenção de culturas puras. As colônias puras dos fungos
foram preservadas seguindo o método de Castellani (1967) e mantidas a 4°C.
2.3. 1ª Triagem: microrganismos celulolíticos
Os fungos isolados foram avaliados quanto às suas atividades celulolíticas em
placas contendo meio mínimo Agar sais de Vogel (VOGEL, 1956) e em (g L-1)
(Na3C6H5O7.5H2O, 150; KH2PO4, 250; MgSO4.7H2O, 10; CaCl2.2H2O, 5) solução de
biotina (0,1 mg Ml-1) 5; clorofórmio 0,2 mL, solução de elementos traços (g L-1), 5 mL
[C6H8O7.H2O, 50; ZnSO4.7H2O, 50; Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O,10; CuSO4.5H2O, 2,5;
MnSO4.H2O, 0,05; H3BO3, 0,05; Na2MoO4.2H2O, 0,05], diluído 50 vezes em água
destilada, suplementado com 0,2% de extrato de levedura, e 1% (m/v) da fonte de
carbono, sendo carboximetilcelulose (CMC). Os isolados foram previamente ativados
em meio BDA e inoculados no centro da placa de Petri, incubados à temperatura de
30°C. Os isolados foram identificados de acordo com a época de coleta, tratamento
69
e um código que se inicia com número 500, como exemplo 1T3506. A revelação
para detecção de atividade enzimática foi realizada no terceiro dia após o repique e
em triplicata.
A revelação para a determinação de atividade celulolítica foi realizada pela
adição da solução de vermelho congo 0,25% (m/v) em tampão Tris-HCl 0,1 M pH
8,0, conforme o método proposto por Hankin e Anagnostakis (1975). A lavagem da
superfície do meio foi conduzida com solução de NaCl 1M no mesmo tampão e
observado um halo transparente em contraste com meio opaco. Os cultivos em que
foi possível observar a formação de um halo ao redor da colônia tiveram sua
atividade avaliada através do índice enzimático (IE), ou seja, o diâmetro do halo
dividido pelo diâmetro da colônia (HANKIN e ANAGNOSTAKIS, 1977).
2.4. Seleção de fungos filamentosos celulolíticos
2.4.1. 2ª Triagem: cultivo submerso
Os cultivos submersos foram preparados em frascos Erlenmeyer de 125 mL,
contendo 30 mL de meio líquido de Vogel (VOGEL, 1956), suplementado com 1% da
fonte de carbono (farelo de trigo) e esterilizados a 121ºC por 15 minutos. Os cultivos
foram inoculados com 1 mL de uma suspensão de 107 esporos mL-1. Os cultivos
foram mantidos por 5 dias a 100 rpm, 30°C. Os caldos fermentados foram filtrados
em banho de gelo e congelados para avaliação da atividade enzimática. Todos os
cultivos e ensaios foram realizados em triplicata.
2.5. Análise enzimática
2.5.1. Atividade de celulases totais (FPase)
A atividade de celulases totais (FPase) foi determinada de acordo com as
recomendações da IUPAC com uso de papel de filtro (Whatmann n°.1) medindo 1,0
x 6,0 cm, equivalente a 50 mg, como substrato (GHOSE, 1987). O meio reacional
consistiu de mistura de tampão de citrato de sódio 0,05 M pH 4,8 e tira de papel
filtro. A reação foi iniciada com a adição de 0,5 ml do extrato enzimático, mantendo-
se por 60 min, à 50°C. A reação foi interrompida pela adição de 3 mL de DNS e
mantidas a 100oC por 5 minutos. Após o resfriamento das amostras foram
adicionados 20 mL de água destilada. As leituras foram realizadas em
70
espectrofotômetro a 540 ƞm. A liberação de açúcares redutores foi determinada de
acordo com Miller (1959), utilizando-se glicose como padrão (coeficiente de extinção
molar: 59,70 M-1 cm-1). Uma unidade de atividade enzima foi definida como a
quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de glicose por minuto por
mililitro.
2.5.2. Atividade de endoglucanase, exoglucanase e xilanase
As atividades de endoglucanase, exoglucanase e xilanase foram
determinadas utilizando 1% de carboximetilcelulose (CMC), Avicel ou xilana,
respectivamente, em tampão acetato de sódio 0,05M, pH 5,5. O meio reacional
consistiu de 400 µL do substrato e 400 µL do extrato enzimático, mantidos a 60 oC.
Após intervalos de tempos 0 (controle), 5 e 10 min, alíquotas de 200 μL foram
retiradas do meio reacional e a reação foi interrompida pela adição de 200 μL de
DNS e fervidas por 5 minutos a 100ºC. As amostras foram resfriadas e adicionou-se
2 mL de água destilada. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro a 540
ƞm. A liberação de açúcares redutores foi determinada de acordo com Miller (1959),
utilizando-se glicose ou xilose como padrão (coeficiente de extinção molar: glicose
80,54 M-1 cm-1 ou xilose 74,27 M-1 cm-1). Uma unidade de enzima foi definida como a
quantidade de enzima necessária para liberar 1 μmol de glicose ou xilose por min
por mL.
2.5.3. Desenvolvimento de cultura mista
2.5.3.1.Teste de compatibilidade in vitro
As interações foram realizadas por oposição direta entre culturas duplas de
micélio, conforme descrito por Skidmore e Dickinson (1976); Stahl e Christensen,
(1992) e Molla et al., (2001). Os cinco modos de interações entre fungos
filamentosos são mostrados na Tabela 1.
Tabela 1. Modelos de interação entre fungos filamentosos.
Interação Definição
1 Entrelaçamento mútuo Crescimento em que ambos os fungos crescem sem sinal macroscópico de interconexões.
71
2 Entrelaçamento mútuo parcial
Crescimento onde o fungo cresce acima ou abaixo do outro sem qualquer zona de inibição.
3 Invasão/substituição Um micélio cresce sobre o outro e começa consumi-lo, podendo substituí-lo.
4 Inibição (ponto de contato) Os fungos aproximam-se um do outro até com uma linha de demarcação de 1 a 2 mm, entre as duas colónias claramente visíveis.
5 Inibição (a distância) Inibição a uma distância > 2 mm.
2.5.4. Desenho experimental para os testes de compatibilidade
A avaliação das interações entre os fungos foram realizadas em meio de
cultura BDA. Dois discos (7 mm) de diferentes fungos foram cultivados a 4 cm de
distância na mesma placa de Petri para avaliar as diferentes interações fúngicas
(Figura 02). Os controles foram realizados em cultura pura inoculados no canto da
placa. Os cultivos foram mantidos a 30°C e observados diariamente até ser possível
identificar o tipo de interação. Os testes foram realizados em duplicata.
Figura 2. Diagrama esquemático das interações entre duas linhagens diferentes de
fungos filamentosos crescidos em ágar batata dextrose (Modificado de Stahl e Cristensen, 1992).
1- Entrelaçamento mútuo
2- Entrelaçamentos mútuos parciais
3a- Invasão/substituição (fase inicial) 3b- Invasão/substituição (fase final)
4- Inibição (ponto de contato) 5- Inibição (a distância)
72
2.5.5. Teste de compatibilidade entre fungos filamentosos em cultivos
em estado sólido
Os cultivos em substrato sólido foram realizados em sacos plásticos de
polipropileno contendo 10 g do conteúdo ruminal + 2,84 g de FCO acrescidos 12,84
mL de água destilada e então esterilizados em autoclave a 121oC durante 20 min. A
inoculação do substrato foi realizada com 1 mL de suspensão de esporos
padronizada a 106 esporos mL-1, devidamente homogeneizados. Nos cultivos mistos,
a inoculação foi realizada com 1 mL de suspensão de esporos padronizada a 106
esporos mL-1 para cada fungo. Os cultivos foram mantidos à 30°C durante 6 dias.
A extração das enzimas foi realizada adicionando-se 100 mL de água destilada
gelada ao meio fermentado ao qual, posteriormente, foi submetido a centrifugação
orbital à 8000 rpm, por 20 min. O meio foi então filtrado a vácuo, em banho de gelo e
o extrato foi acondicionado em tubos de ensaio no congelador e posteriormente
utilizado para avaliação da atividade enzimática. Todos os cultivos e ensaios foram
realizados em triplicata.
2.6. Estatística
As análises das amostras foram realizadas em triplicata e a média dos valores
são apresentados com desvio-padrão. Os resultados obtidos para produção das
enzimas foram submetidos ao teste F a 5% de significância e comparados pelo teste
de média Scott Knott a 5% de probabilidade e realizado análises de variância.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Etapa 1: Seleção de microrganismos produtores de enzimas
extracelulares
O processo de compostagem do conteúdo ruminal suplementado com farinha
de carne e osso foi avaliado ao longo de 73 dias e vários fungos filamentosos com
potencial celulolíticos foram isolados através de diluições seriadas e as placas
inoculadas foram incubadas a 28±2°C por até 5 dias. Inicialmente, 116 linhagens de
fungos filamentosos foram isoladas. O isolamento procedeu em diferentes períodos
de compostagem, ocorrendo aos 7, 21, 39 e 62 dias. As linhagens obtidas deste
processo foram avaliadas quanto à produção de enzimas celulolíticas em meio
73
sintético, com utilização de carboximetilcelulose como única fonte de carbono
(Tabela 2).
Tabela 2. Atividade celulase de fungos filamentosos isolados da compostagem de resíduos de frigorifico, cultivados em meios sintéticos com carboximetilcelulose por 5 dias a 30°C. Øc = diâmetro da colônia (mm); Øh = diâmetro do halo (mm); Ie = índice enzimático; (-) = não produziu halo. Gurupi-TO, 2016.
74
De todos os isolados analisados, observou-se que 41% dos fungos
filamentosos apresentaram halo de degradação, e os maiores índices enzimáticos
(acima de 1,20) foram observados nos isolados: 2T3502, 1T3506, 3T5506, 1T5501,
2T4504, 1T2506, 1T3503, 4T3505, 1T1502, 2T2500, 2T5501, 1TO501, 1T1500,
3T3503, 1T3500 e 4T1501. Os isolados foram identificados de acordo com a época
de amostragem, tratamento e código que se inicia com número 500, como exemplo
o 1T3506.
Dos fungos (1T0500 a 1T5501) isolados aos sete dias do processo de
compostagem, 78,12% apresentaram halo de degradação nas placas contendo
carboximetilcelulose (CMC), enquanto que nas etapas seguintes, aos 21, 39 e 62
dias foram 30,43, 17,64 e 34,78%, respectivamente. Dos isolados com maiores
índices enzimáticos (IE ≥1,2) 50% foram selecionados na fase termofílica da
compostagem (7 dias de compostagem), com os demais isolados obtidos após 21,
39 e 63 dias (25, 12,5 e 12,5%, respectivamente). Diante disso, pode-se até sugerir
que a melhor época de amostragem para obtenção fungos celuloliticos em
compostagem de conteúdo ruminal suplementado com farinha de carne e osso é a
fase termofílica.
Os maiores índices enzimáticos de celulase foram observados com os isolados
1T3506 e 2T3502 com diâmetro de halos 2,0 e 2,33, respectivamente. O índice
enzimático pode ser utilizado como medida simples e rápida para selecionar
linhagens com potencial produção de enzimas dentro de uma mesma espécie.
Ruegger e Tauk-Tornisielo (2004) observaram que 45% dos isolados de fungos
isolados do solo apresentaram formação do halo de degradação de celulose, entre
elas, algumas colônias com pouco crescimento apresentaram os maiores índices
enzimáticos, como Penicillum herquei e Trichoderma hamatum, Penicillum micznskii,
Penicillum verrucosum e Penicillum glabrum. Resultados semelhantes foram
observados no presente estudo com o fungo 3T5506 que apresentou colônia de
menor diâmetro e alto valor do índice enzimático.
3.2. Etapa 2: Seleção de fungos celulolíticos em cultivo submerso
As enzimas FPase, endoglucanase, exoglucanase e xilanase foram
produzidas pelas linhagens de fungos previamente selecionadas com índice
enzimáticos maiores que 1,2 (Tabela 2). Dentre os fungos com potencial para a
produção de FPase, observou-se que o isolado 1T5501- 0,203 U mL-1 obtido na
75
fase termofílica da compostagem, seguido pelos isolados 1T3503 (0,114 U mL-1),
2T4504 (0,100 U mL-1) e 3T5506 (0,088 U mL-1) (Tabela 3). Valores mais baixos
foram observados em 2T5501, 1T3500, 1T3506, 3T3503, 4T3505, 2T2500, 1T2506,
1T1502, 2T3502, 1T1500, 4T1501 e 1T0501.
A maior produção de endoglucanase, foi observada com os isolado 1T5501
(42,563 U mL-1), seguido por 3T5506 (27,29 U mL-1) e 1T2506 (22,207 U mL-1).
Níveis mais baixos de produção foram observados com as linhagens 1T3506,
1TI502, 1T3503 e 1T3500.
Tabela 3. Produção de FPase, endoglicanase, exoglicanase e xilanase por fungos filamentosos provenientes de conteúdo ruminal bovino em fonte de carbono farelo de trigo. Gurupi-TO, 2016.
Fungo I.E. FPase Endoglicanase Exoglicanase Xilanase
U mL-1 U mL-1
U mL-1 U mL-1
1T0501 1,20 0,016±0,001 b 9,715 ± 1,694 d 0,091± 0,017 b 5,415± 0,081 e
1TI500 1,20 0,030±0,005 b 2,775 ± 0,707 e 0,041± 0,017 d 1,140± 0,211 f
1TI502 1,25 0,052±0,014 b 12,028± 1,039 d 0,094± 0,021 b 12,996±0,234 c
1T2506 1,41 0,055±0,013 b 22,206± 3,926 c 0,005± 0,000 f 1,368± 0,314 f
1T3503 1,40 0,113±0,027 b 11,566± 2,849 d 0,029± 0,004 e 4,104± 0,658 e
1T3506 1,98 0,063±0,017 b 18,968± 2,859 c 0,065± 0,015 c 17,101± 1,888 b
1T3500 1,20 0,063±0,011 b 11,566± 2,414 d 0,029± 0,001 e 16,189±1,492 b
1T5501 1,48 0,202±0,043 a 42,563± 2,617 a 0,183± 0,014 a 0,456±0,141 f
2T2500 1,60 0,058±0,019 b 6,476± 0,8231 e ND 8,208± 1,273 d
2T3502 2,33 0,038±0,007 b 4,626± 0,77e 0,023± 0,002 e 1,596± 0,385 f
2T4504 1,45 0,099±0,021 b 8,790± 0,654 d 0,035±0,002 d 2,052± 0,967 f
2T5501 1,20 0,077±0,007 b 11,566± 1,772 d ND 23,257± 1,29 a
3T3503 1,20 0,058±0,003 b 2,313± 0,443 e ND ND
3T5506 1,79 0,088±0,015 b 27,295± 1,857 b ND 4,332± 0,322 e
4T1501 1,32 0,024±0,002 b 4,626± 0,992 e 0,023± 0,001 e 0,684± 0,0312 f
4T3505 1,38 0,058±0,003 b 4,626± 0,337 e 0,053±0,003 d 6,156± 1,257 e
Condições de cultivo: 120 h de incubação, á 30º C. ND (Não produziu). A identificação dos fungos
com início 1, 2, 3 ou 4, representa as épocas de coletas aos 7, 21, 39 e 62 respectivamente.
A produção de exoglicanase também foi alta para a linhagem 1T5501 (0,183 U
mL-1). Níveis inferiores foram observados com as linhagens 1T1502 (0,094 U mL-1),
1T0501 (0,091 U mL-1) e 1T3506 (0,065 U mL-1). Vinte e cinco por cento das
linhagens não apresentaram atividade enzimática na condição de cultivo analisada.
76
Isolar fungos em temperaturas altas, faixa de 45 a 65ºC é fator importante quando o
objetivo se trata de selecionar fungos termofílicos verdadeiros (ANG et al., 2013).
Apenas os organismos que produzem adequados níveis de endoglucanase,
exoglucanase, seriam eficientes degradantes da lignocelulose (KUMAR et al., 2008).
Esse fato pode ser observado no fungo 1T5501, que foi superior na produção das
enzimas FPase (0,202 U mL-1), endoglucanase (42,56 U mL-1) e exoglucanase
(0,183 U mL-1), que possui a capacidade de desestabilizar a estrutura da lignina, que
por sua vez degradam os componentes do conteúdo ruminal a partir dos quais
obtêm energia para seu crescimento e reprodução (CHAGAS e DURRANT, 2001;
TUOMELA et al., 2000).
A maior produção de xilanase foi observada com o isolado 2T5501. Os isolados
1T3500, 1T3506 e 1TI502 apresentaram níveis intermediários de produção. Em
conjunto com as celulases possuem ampla variedade de aplicações biotecnológicas
nas indústrias de alimentos, ração animal, têxteis, papel e celulose e outros setores
(BHAT, 2000) e os resultados são promissores, principalmente quando relacionados
à questão da termofilia.
3.3. Desenvolvimento de cultura mista para produção de enzimas
O processo de compostagem pode ocorrer naturalmente com o envolvimento
de microrganismos presentes no conteúdo ruminal. Contudo, quantidade insuficiente
ou baixa biodegradabilidade da comunidade microbiana indígena pode levar à baixa
eficiência da compostagem e qualidade do composto indesejável (XI et al., 2007). O
inóculo que é uma cultura ou mistura de várias culturas puras, seria a forma de
aumentar em número e diversidade a comunidade microbiana das leiras de
compostagem, além de poder direcionar para a degradação de um resíduo
específico e/ou assegurar degradação mais completa dos componentes do material
em compostagem.
Entre os 16 isolados para produção de enzima celulolítica, quatro linhagens
1T5501, 1T3503, 2T4504 e 3T5506 demonstraram potencial para FPase e quatro
(2T5501, 1T3500, 1T3506 e 1T1502) para xilanse. Foram utilizados para os testes
de confronto direto em placas, os isolados de FPase e xilanase entre si para verificar
o tipo de interação entre eles. As interações apresentaram bastante diversidade com
relação aos fungos utilizados, que variou as formas de crescimento e movimento do
micélio. Tanto as combinações entre os fungos produtores de FPase quanto para os
77
de xilanase apresentaram interações compatíveis e incompatíveis. Das combinações
realizadas para FPase somente 1T5501/1T3503, 1T3503/1T3506 obtiveram
interações compatíveis ou entrelaçamento mútuo e a interação 1T5501/2T4504 teve
compatibilidade parcial com entrelaçamento mútuo parcial. A interação entre os
fungos 1T5501/3T5506 e 1T3503/2T4504 resultou em incompatibilidade com
inibição em ponto de contato e inibição à distância respectivamente. Apenas uma
das interações, 2T4504/3T5506 ocasionaram incompatibilidade do tipo
invasão/substituição na fase inicial (Tabela 4).
Tabela 4. Tipos de interação entre quatro fungos obtidos pra FPase e entre quatro
fungos obtidos pra xilanase em meio BDA. Gurupi-TO, 2016.
Condições de cultivo: os cultivos foram mantidos a 30
oC. Legenda: BDA (ágar dextrose batata). Os
números de 1 a 6 representam as combinações dos isolados para a enzima FPase e Xilanase.
Entre as combinações realizadas para interação entre os fungos selecionados
para xilanase, 67% das interações apresentaram compatibilidade. As interações
entre os fungos 1T1502/1T3506 e 1T3500/2T5501 tiveram compatibilidade com
entrelaçamento mútuo e os fungos 1T1502/2T5501 e 1T3506/2T5501 do tipo
entrelaçamento mútuo parcial. As combinações incompatíveis ocorreram entre os
fungos 1T3500/1T3506 e 1T1502/1T3500, com interações do tipo inibição à
distância e invasão/substituição na fase inicial, respectivamente.
Três combinações 1T5501/1T3500, 2T4504/1T1502 e 2T4504/1T3506
apresentaram compatibilidade total com interação do tipo entrelaçamento mútuo
(Tabela 05). As combinações 1T3503/1T1502, 1T3503/1T3500, 2T4504/1T3500,
Espécies em
interação
FPase
Meio de cultivo Espécies em
interação
Xilanse
Meio de cultivo
BDA BDA
1 1T5501
1T3503 Entrelaçamento mútuo
1T1502
1T3500
Invasão/substituição
(fase inicial)
2 1T5501
2T4504
Entrelaçamento mútuo
parcial
1T1502
1T3506
Entrelaçamento
mútuo
3 1T5501
3T5506
Inibição (ponto de
contato)
1T1502
2T5501
Entrelaçamento
mútuo parcial
4 1T3503
2T4504 Inibição (a distancia)
1T3500
1T3506 Inibição (a distancia)
5 1T3503
3T5506 Entrelaçamento mútuo
1T3500
2T5501
Entrelaçamento
mútuo
6 2T4504
3T5506
Invasão/substituição
( fase inicial)
1T3506
2T5501
Entrelaçamento
mútuo parcial
78
3T5506/1T1502, 3T5506/1T3500 e 3T5506/1T3506 apresentaram compatibilidade
parcial, com interação do tipo entrelaçamento mútuo parcial. Interações
incompatíveis do tipo invasão/substituição na fase inicial e fase final e inibição à
distância foram observadas em 43,75% das combinações. Na combinação
1T5501/1T3506 ocorreu interação inibitória do tipo invasão/substituição na fase
inicial e nas combinações 1T5501/1T1502, 1T3501/2T5501 e 1T3503/1T5501 tipo
invasão/substituição na fase final. As combinações em que os fungos tiveram
inibição a uma distância > 2 mm ocorreu nas interações 1T3503/1T3506 e
1T5506/1T5501. De acordo com Molla et al. (2001), este tipo de interação ocorre
devido a produção de metabólitos inibitórios em torno de seu território que restringe
o crescimento do outro fungo filamentoso.
Tabela 5. Tipos de interação entre fungos FPase x xilanase em meio BDA. Gurupi-TO, 2016.
Condições de cultivo: os cultivos foram mantidos a 30
oC. Legenda: BDA (ágar dextrose batata). Os
números de 1 a 8 representam as combinações dos isolados obtidos pela interação da enzima FPase e Xilanase.
A realização de confrontos entre espécies de fungos em meios sólidos,
segundo Bertrand et al. (2014) permite avaliar e distinguir a morfologia das espécies
envolvidas nas interações e, portanto, a área de confronto entre os fungos em
oposição, uma vez que há susceptibilidade de ocorrer a indução de metabólitos,
resultou em interação ou sinergismo. No entanto, as culturas de meio sólido são
Espécies em
interação
FPase x xilanase
Meio de cultivo Espécies em
interação
FPase x xilanase
Meio de cultivo
BDA BDA
1 1T5501
1T1502
Invasão/substituição
(fase final)
2T4504
1T1502
Entrelaçamento
mútuo
2 1T5501
1T3500 Entrelaçamento mútuo
2T4504
1T3500
Entrelaçamento
mútuo parcial
3 1T5501
1T3506
Invasão/substituição
(fase inicial)
2T4504
1T3506
Entrelaçamento
mútuo
4 1T3501
2T5501
Invasão/substituição
(fase final)
2T4504
2T5501
Inibição
( à distancia)
5 1T3503
1T1502
Entrelaçamento mútuo
parcial
3T5506
1T1502
Entrelaçamento
mútuo parcial
6 1T3503
1T3500
Entrelaçamento mútuo
parcial
3T5506
1T3500
Entrelaçamento
mútuo parcial
7 1T3503
1T3506 Inibição (à distância)
3T5506
1T3506
Entrelaçamento
mútuo parcial
8 1T3503
2T5501
Invasão/substituição
(fase final)
3T5506
2T5501
Inibição
(à distância)
79
normalmente realizadas na escala placa de Petri, e apenas quantidades limitadas de
metabólitos podem ser extraídos a partir de tais condições de cultura (BERTRAND et
al., 2013).
O diâmetro das colônias que apresentaram interações mutualísticas com
entrelaçamento mútuo total 1T5501/1T3503, 1T3503/3T5506, 1T1502/1T3506,
1T3500/2T5501, 1T5501/1T3500, 2T4504/1T1502, 2T4504/1T3506, cultivados a 4
cm de distância um do outro, foram avaliados aos 2º e 6º dia de crescimento em
meio BDA. A maioria quando em co-cultura apresentaram maior diâmetro de colônia,
tanto aos dois dias quanto aos seis dias, com exceção de alguns os quais tiveram
crescimento inibido reduzindo o diâmetro do halo quando em co-cultura (Tabela 6).
Tabela 6. Diâmetro máximo das colônias de fungos que apresentaram interações
mutualísticas no 2º e 6º dia. Gurupi-TO, 2016.
Legenda: Ágar, batata, dextrose (BDA);Todos os valores estão em mm. A identificação dos fungos
com início 1, 2, 3 ou 4, representa as épocas de coletas aos 7, 21, 39 e 62 respectivamente
Das sete combinações mutualísticas, observou-se no segundo dia que 85,7%
apresentaram maior diâmetro das colônias quando em co-cultura. Somente a
combinação 1T5501/1T3503 resultou em menor diâmetro do IT5501 (2,49mm) em
relação ao controle (3,31mm). O comportamento dos fungos nas interações aos seis
dias de crescimento em diâmetro foi diferente em relação ao 2º dia. Observa-se no
6º dia, que 42,85% das combinações (1T5501/1T3503, 1T3503/3T5506,
1T1502/1T3506) resultaram em maior diâmetro da colônia em co-cultura. Já nas
Diâmetro Maximo Diâmetro Maximo Diâmetro Maximo Diâmetro Maximo
Controle Co - Cultura Controle Co - Cultura
1T5501 3,31±0,630 2,485 ±0,3889 26,17±2,580 40,38±0,537
1T3503 2,35±0,155 3,41±0,240 27,41±0,636 36,745±1,774
1T3503 2,35±0,155 12,04±2,871 27,41±0,636 35,17± 4,423
3T5506 3,89±0,155 15,615±5,112 18,57±0,572 23,88±5,487
1T1502 6,34±0,296 31,07±0,672 34,55±1,350 48,13±3,627
1T3506 3,27±0,372 4,045±0,025 16,61±2,237 15,99±0,007
1T3500 4,09±0,622 22,105±0,074 49,63±7,481 38,105±0,385
2T5501 19,13±1,414 40,685±0,484 62,99±2,262 53,07±0,035
1T5501 3,31±0,630 3,55±0,636 26,17±2,580 16,045± 1,129
1T3500 4,09±0,622 22,25±0,361 49,63±7,481 46,075±0,106
2T4504 2,67±0,402 3,57±0,686 9,21±1,810 6,325±0,459
1T1502 6,34±0,296 21,19±2,850 34,55±1,350 41,17±0,240
2T4504 2,67±0,402 2,68±0,933 9,21±1,810 8,65±2,6721T3506 3,27±0,372 7,12±0,141 16,61±2,237 22,67±0,947
Combinações
Dia 2 Dia 6
80
combinações 1T3500/2T5501 e 1T5501/1T3500 foi o inverso, resultando em menor
diâmetro (1T3500 - controle 49,63 mm, co-cultura 38,11 mm / 2T5501 - controle
62,99 mm, co-cultura 53,07 mm e 1T5501 - controle 26,17 mm, co-cultura 16,05 mm
/ 1T3500 - controle 49,63 mm, co-cultura 46,08 mm). Nas combinações
2T4504/1T1502, 2T4504/1T3506 os fungos não seguiram padrão de crescimento
como os demais. No caso do 2T4504/1T1502 ocorreu menor diâmetro na co-cultura
para 2T4504 (6,33 mm) enquanto que para 1T1502 o diâmetro foi maior (41,17 mm)
em comparação com o fungo controle. Comportamento parecido ocorreu em
2T4504/1T3506.
3.4. Cultivo de fungos filamentosos em conteúdo ruminal bovino
Os cultivos em estado sólido foram realizados utilizando conteúdo ruminal
bovino suplementado com farinha de carne e osso, durante o período de 144 horas
de cultivo. A maior produção de celulase total (FPase) foi observada com 1T3506
(1,48 U g-1) seguidos por 1T3503 (1,32 U g-1) 1T3500 (1,01 U g-1), 1T1502 (0,98 U g-
1) e 2T4504 (0,91 U g-1). Com relação à xilanase, as maiores atividades enzimáticas
ocorreram nos fungos 1T3506 (27,25 U g-1) e 1T3503 (16,94 U g-1), 1T3500 (13,17 U
g-1) e 3T5506 (10,76 U g-1) (Tabela 7). As xilanases possuem importante papel na
hidrólise do conteúdo ruminal por hidrolisar xilana, polissacarídeo formado por
unidades monoméricas de xilose, que é um dos principais constituintes da
hemicelulose (HECK et al., 2002). A presença das duas enzimas nos mesmos
fungos é interessante e vantajosa, pois, além de simular o hábitat natural de
microrganismos fúngicos selvagens (HÖLKER et al., 2004), apresenta maior
produtividade dos extratos enzimáticos, menor susceptibilidade à inibição e maior
estabilidade das enzimas a variações de temperatura e pH (SINGHANIA et al.,
2010).
No cultivo misto, três combinações apresentaram potencial para produção de
celulases por fermentação em estado sólido 3T5506/1T1502 (1,1 U g-1),
2T4504/1T3506 (1,08 U g-1) e 3T5506/1T3500 (1,0 U g-1). Para a produção de
xilanase, a interação entre os fungos 2T4504/1T3506 apresentou atividade
enzimática de 14,07 U g-1. As demais interações das enzimas celulases e xilanase
em cultivo misto apresentaram redução na produção da enzima em comparação
com a cultura pura das mesmas.
81
Tabela 7. Produção de FPase e xilanase por fungos filamentosos em substrato de
conteúdo ruminal bovino enriquecido. Gurupi-TO, 2016.
Condições de cultivo: 120 h de incubação, á 30º C. A identificação dos fungos com início 1, 2 ou 3, representa as épocas de coletas aos 7, 21, 39 respectivamente.
Uma das formas de acelerar o processo de compostagem é a utilização
consorciada de inóculos com potencial enzimático isolados da própria pilha de
compostagem. Este tipo de comportamento pode ser observado em habitats naturais
(BERTRAND et al., 2014). Um consórcio multifuncional de microrganismos com
potencial enzimático foi utilizado como inoculante em compostagem de resíduos
lignocelulósicos. Para isso os microrganismos foram isolados a partir de pilhas de
compostagem com a mesma composição e operado de forma idêntica. O consórcio
consistiu de quatro bactérias (Bacillus altitudinis, Bacillus licheniformis, Bacillus
smithii, Alternaria tenuissima), e dois fungos (Gibellulopsis nigrescens, Streptomyces
albus) e foram inoculados nas pilhas de compostagem aos 8, 15 e 24 dias após o
início do processo. As análises microbiológicas demonstraram que a inoculação
provocou estimulação proeminente do processo de compostagem, e as pilhas que
foram inoculadas ocasionaram a degradação de hemicelulose, celulose e lignina que
foram 28, 21 e 25%, respectivamente superior a não inoculada (JURADO et al.,
2015).
FPAse Xilanase
1T1502 0,98 ± 0,134 c 2,755 ± 0,091 e
1T3503 1,32 ± 0,196 a 16,945 ± 1,902 b
1T3506 1,48 ±0,192 a 44,64 ± 3,804 a
1T3500 1,01 ± 0,09 b 13,175 ± 1,138 c
1T5501 0,55 ± 0,145 c 4,03 ± 0,381 e
2T4504 0,91 ± 0,078 c 3,76 ± 0,001 e
2T5501 0,69 ± 0,106 c 2,42 ±0,381 e
3T5506 0,63 ± 0,155 c 10,76 ±0,001 c
1T5501/1T3500 0,7 ± 0,086 c 5,38±0,743 e
1T3503/1T1502 0,76 ± 0,148 c 4,59 ± 1,046 e
1T3503/1T3500 0,62 ± 0,118 c 3,9 ± 0,763 e
2T4504/1T1502 0,69 ± 0,092 c 3,55 ± 0,134 e
2T4504/1T3500 0,98 ± 0,075 c 6,715 ± 0,700 d
2T4504/1T3506 1,08 ± 0,066 b 14,07 ± 1,329 c
3T5506/1T1502 1,1 ± 0,066 b 6,12 ± 0,424 d
3T5506/1T3500 1,0 ± 0,092 b 7,355 ± 1,322 d
3T5506/1T3506 0,83 ± 0,132 c 6,615 ±0,134 d
FungoAtividades enzimáticas (U g
-1 )
82
4. CONCLUSÕES
Os fungos filamentosos isolados a partir do conteúdo ruminal em processo de
compostagem apresentam potencial celulolítico, com 50% dos maiores índices
enzimáticos (IE ≥1,2) e 78,12% dos halos de degradação selecionados aos sete dias
(fase termofílica), que pode tornar-se a época mais recomendada para obtenção de
fungos celuloliticos em compostagem de conteúdo ruminal. Os isolados 1T5501(0,
203 U.ml), 1T5501(42, 563 U.ml) e 2T5501(20, 122 U.ml) apresentam potencial para
produção das enzimas FPase, endoglucanase e xilanase respectivamente e três
combinações apresentam interações compatíveis para produção de celulases e
xilanase.
4. REFERÊNCIAS
AMORE, A.; PEPE, O.; VENTORINO, V.;BIROLO, L.; GIANGRANDE, C.; FARACO,
V. Industrial waste based compost as a source of novel cellulolytic strains and
enzymes. FEMS microbiology letters, Amsterdam, v.339, n.2, p.93-101, 2013.
ANG, S. K.; SHAZA, E. M.; ADIBAH, Y.; SURAINI, A. A; MADIHAH, M. S. Production
of cellulases and xylanase by Aspergillus fumigatus SK1 using untreated oil palm
trunk through solid state fermentation. Process Biochemistry, Elsevier, v.48, n.9, p.
1293 - 1302, 2013.
BERTRAND, F.; MULLER, S. ROH, K. H.; LAURENT, C.; DUPRE, L.; VALITUTTI, S.
An initial and rapid step of lytic granule secretion precedes microtubule organizing
center polarization at the cytotoxic T lymphocyte/target cell synapse. Proceedings of
the National Academy of Sciences, Washington, v.110, n.15, p.6073-6078, 2013.
BERTRAND, S.; BOHNI, N.; SCHNEE, S.; SCHUMPP, O.; GINDRO, K.;
WOLFENDER, J. L. Metabolite induction via microorganism co-culture: A potential
way to enhance chemical diversity for drug discovery. Biotechnology Advances,
New York, v.32, n.6, p. 1180 – 1204, 2014.
BHAT, M. K.; BHAT, S. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial
applications. Biotechnology Advances, New York, v.15, n.3, p.583 - 620,1997.
83
BHAT, M. K. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Biotechnology
Advances, New York, v. 18, n.5, p. 355 - 383, 2000.
BIALOBRZEWSKI, I.; MIKŠ-KRAJNIK, M.; DACH, J.; MARKOWSKI, M.; CZEKAŁA,
W.; GŁUCHOWSKA, K. Model of the sewage sludge-straw composting process
integrating different heat generation capacities of mesophilic and thermophilic
microorganisms. Waste Management, Houston, v.43, n.9, p.72–83, 2015.
CANTRELL, K. B.; DUCEYT, R. O. K. S.; HUNT, P. G. Livestock waste-to-bioenergy
generation opportunities. Bioresource Technology, New York, v. 99, n.17, p. 7941-
7953, 2008.
CASTELLANI, A. Maintenace and cultivation of the common pathogenic fungi of man
in sterile distilled water. Futher researches. Journal of Tropical Medicine and
Hygiene, Deerfield, v. 70, p.181-184, 1967.
CASTRO, A. M.; PEREIRA JUNIOR, N. Produção, propriedade e aplicação de
celulose na hidrolise de resíduos agroindustriais. Química Nova, São Paulo, v. 33,
n.1, p.181-188, 2010.
CLARK, F. E. Agar-plate method for total microbial count. In: BLACK, C. A.; EVANS,
D. D.; WHITE, J. L.; ENSMINGER, L. E.; CLARK, F. E.; DINAUER, R. C. (Eds.).
Methods of soil analysis: chemical and microbiological properties. New York:
Madson, p. 1460-1466, 1965.
CHAGAS, E. P.; DURRANT, L. R. Decolorization of azo dyes by Phanerochaete
chrysosoporium and Pleurotus sajorcaju. Enzyme and Microbial Technology, New
York, v. 29, n.8, p. 473 - 477, 2001.
FREITAS, G. A.; SILVA, R. R.; BARROS, H. B.; MELO, A. V.; ABRAHÃO, W. A. P.
Produção de mudas de alface em função de diferentes combinações de substratos.
Revista Ciência Agronômica, Fortaleza, v.44, n.1, p.159 -166, 2013.
84
GHOSE, T. K. Measurement of cellulase activities. Pure and Applied Chemistry,
Durham, v. 59, n. 2, p. 257- 268, 1987.
HANKIN, L.; ANAGNOSTAKIS, S. L. Solid media containing carboxymethylcellulose
to detect cx cellulase activity of micro-organisms. Journal of general microbiology,
Londres, v. 98, n.1, p. 109-115, 1977.
HANKIN, L.; ANAGNOSTAKIS, S. G. The use of solid media for detection of enzyme
production by fungi. Mycology, Elsevier, v. 67, n.3, p. 597 - 607, 1975.
HECK, J. X.; HERTZ, P. F.; AYUB, M. A. Z. Cellulase and xylanase production by
isolated Amazon Bacillus strains using soybean industrial residue based solid-state
cultivation. Brazilian Journal of Microbiology, Elsevier, v.33, n.3, p.213-218, 2002.
HÖLKER, U.; HÖFER, M.; LENZ, J. Biotechnological advantages of laboratory-scale
solid-state fermentation with fungi. Applied Microbiology and Biotechnology,
Berlin, v.64, n.2, p.175 - 186, 2004.
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Indicadoresibge: Estatística
da Produção Pecuária. 2015, 80 p. Disponível
em:<http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/indicadores/agropecuaria/producaoagro
pecuaria/abate-leite-couro-ovos_201404_publ_completa.pdf> Acesso em:
29/05/2015.
JANG, H. D.; CHEN, K. S. Production and characterization of thermostable cellulases
from Streptomyces transformant T3-1. World Journal of Microbiology
Biotechnology, New York, v. 19, n.2, p. 263 - 268, 2003.
JURADO, M. M.; SUÁREZ-ESTRELLA, F.; LÓPEZ, M. J.; VARGAS-GARCÍA, M. C.;
LÓPEZ-GONZÁLEZ, J. A.; MORENO, J. Enhanced turnover of organic matter
fractions by microbial stimulation during lignocellulosic waste composting.
Bioresource Technology, New York, v.186, p.15-24, 2015.
85
KUMAR, R.; SINGH, S.; SINGH, O. V. Bioconversion of lignocellulosic biomass:
biochemical and molecular perspectives. Journal of Industrial Microbiology and
Biotechnology, Berlin, v. 35, n.5, p. 377–391, 2008.
LI, L.; DIEDERICK, R.; FLORA, J.R.V.; BERGE, N. D. Hydrothermal carbonization of
food waste and associated packaging materials for energy source generation. Waste
management, Houston, v. 33, n.11, p. 2478–2492, 2013.
MILLER, G. L. Use of DinitrosaIicyIic Acid Reagent for Determination of Reducing
Sugar. Analytical Chemistry, Washington, v. 31, n. 3, p.426-428,1959.
MOLLA, A. H.; FAKHRU’L-RAZI, A.; ABD-AZIZ, S.; HANAFI, M. M.; ALAM, M. Z. In
vitro compatibility evaluation of fungal mixed culture for bioconversion of domestic
wastewater sludge. World Journal of Microbiology and Biotechnology, New York,
v.17, n.9, p. 849 - 856, 2001.
NURKANTO, A. Cellulolitic Activities of Actinomycetes Isolated from Soil
Rhizosphere of Waigeo, Raja Ampat, West Papua. Journal of Tropical Soils,
Bandar Lampung, v.14, n.3, p. 239-244, 2009.
ROY, B. C.; KHAN, M. R. I.; RAHMAN, M. M.; SALLEH, M. A. M.; AHSAN, A.; AMIN,
M. R. Development of a Convenient Method of Rumen Content Composting. Journal
of Animal and Veterinary Advances, New York, v. 12, n.18, p. 1439-1444, 2013.
RUEGGER, M. J. S.; TAUK-TORNISIELO, S. M. Atividade da celulase de fungos
isolados do solo da Estação Ecológica de Atividade da celulase de fungos isolados
do solo da Estação Ecológica de Jureia-Itatins. Revista Brasileira Botânica,
Pampulha, v. 27, n.2, p. 205–211, 2004.
SADHU, S.; MAITI, T. K. Cellulase Production by Bacteria: A Review. British
Microbiology Research Journal, Gurgaon, v.3, n.3, p. 235-258, 2013.
SHRESTHA, K.; SHRESTHA, P.; WALSH, K. B.; HARROWER, K. M.; MIDMORE, D.
J. Microbial enhancement of compost extracts based on cattle rumen content
86
compost – Characterisation of a system. Bioresource Technology, New York, v.
102, p. 8027–8034, 2011.
SHI, J.; EBRIK, M. A.; YANG, B.; GARLOCK, R. J.; BALAN, V.; DALE, B. E.;
PALLAPOLU, V. R.; LEE, Y. Y.; KIM, Y.; MOSIER, N. S.; LADISCH, M. R.;
HOLTZAPPLE, M. T.; FALLS, M.; RAMIREZ, R. S.; DONOHOE, B. S.; VINZANT, T.
B.; ELANDER, R. T.; HAMES, B.; THOMAS, S.; WARNER, R. E.; WYMAN, C. E.
Application of cellulase and hemicellulase to pure xylan, pure cellulose, and
switchgrass solids from leading pretreatments. Bioresource Technology, New York,
v.102, n.24, p.80–88, 2011.
SKIDMORE, A. M.; DICKINSON, C. M. Colony interactions and hyphal interference
betweenSepatoria nodorumand phylloplane fungi. Transactions of the British
Mycological Society, London, v.66, n.1, p. 57-64, 1976.
STAHL, P. D.; CHRISTENSEN, M. In vitro interactions among members of a soil
microfungal community. Soil Biology and Biochemistry, Elsevier, v. 24, n.4, p. 309-
316, 1992.
TUOMELA, M.; VIKMAN, M.; HATAKKA, A.; ITAVAARA, M. Biodegradationof lignin
in a compost environment: a review. Bioresource Technology, New York, v. 72,
n.2, p. 169–183, 2000.
SINGHANIA, R. R.; SUKUMARAN, R. K.; PATEL, A. K.; LARROCHE, C.; PANDEY,
A. Advancement and comparative profiles in the production technologies using solid-
state and submerged fermentation for microbial cellulases. Enzyme and Microbial
Technology, New York, v.46, n.7, p.541-549, 2010.
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A. J. Métodos de análise microbiológica de
alimentos: manual técnico n° 14. Campinas: Instituto de Tecnologia de Alimentos,
1995, p.17-19.
VASCONCELOS, W. A.; ANDRADE, A. P.; SANTOS, E. M.; EDVAN, R. L.; SILVA,
D. S.; SILVA, T. C. Características morfogenéticas e produção do capim buffel
87
adubado com conteudo ruminalsólida. Revista Brasileira Saúde Produção Animal,
Salvador, v.14, n.1, p.01-09, 2013.
VOGEL, H. J. A. Convenient growth medium for Neurospora crassa (medium N).
Microbiology Genetics Bulletin, Ohio, v. 13, p. 42–43, 1956.
VRIES, R. P.; VISSER, J. Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cell
wall polysaccharides. Microbiology and Molecular Biology Reviews, Washington,
v. 65,n.4, p. 497-522, 2001.
XI, B. D.; HUANG, G. H.; ZHANG, G. J.; WEI, Z. M.; QIN, X. S.; LIU, H. L. A
temperature guided threestage inoculation method for municipal solid wastes
composting. Environmental Engineering Science, v. 24, n.6, p.745–754, 2007.
YEOMAN, C. J.; HAN, Y.; Dodd, D.; SCHROEDER, C. M.; MACKIE, R. I.; CANN, I.
K. Thermostable Enzymes as Biocatalysts in the Biofuel Industry. Advances in
Applied Microbiology, Elsevier, 2010, cap. 1, v. 70, p. 1-55.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados alcançados neste trabalho apontam que a farinha de carne e
osso possui potencial ativador nos parâmetros físicos químicos e microbiológicos da
compostagem de resíduo ruminal bovino. As doses crescentes da farinha
proporcionou alteração na dinâmica da temperatura, açúcares redutores totais,
condutividade elétrica, pH e proteínas. A partir dos 39 dias o efeito ativador passa a
ser significativamente positivo em função do aumento das doses.
O teste de compatibilidade in vitro mostrou uma alternativa viável para o
desenvolvimento de cultura mista para a produção de enzimas hidrolíticas, visando o
aproveitamento da biomassa do resíduo ruminal bovino em sistemas de cultivos em
estado sólido para a produção de celulases, xilanases e pode tornar-se possível
inoculante para futuros processos de compostagem.
Sete combinações apresentaram interação do tipo entrelaçamento mútuo e
dessas, quando testadas em rumem, três combinações para celulases e uma para
xilanase aumentaram a produção enzimática.
88
Este estudo poderá contribuir para o desenvolvimento de processo de
produção de enzimas em cultura mista e para a reciclagem de resíduos
agroindustriais na produção de inoculantes em sistema de compostagem utilizando
resíduo ruminal bovino em todo estado do Tocantins.