apresentação do powerpoint - iq uspallchemy.iq.usp.br/agregando/wpa/palestra17b.pdf · s. massa...

Marco A. Z. ArrudaAPLICAÇÃOAPLICAÇÃOExtração Extração de de proteínas proteínas -- Ponto NuvemPonto Nuvem

SurfactantesSurfactantes nãonão--iônicos iônicos

SurfactantesSurfactantes iônicosiônicos

SurfactantesSurfactantes anfóterosanfóteros((zwiteriônicoszwiteriônicos)

PréPré--concentraçãoconcentração

SemiSemi--purificaçãopurificação

PurificaçãoPurificação

)

Temperaturas evitam Temperaturas evitam desnaturaçãodesnaturação

APLICAÇÃOAPLICAÇÃOExtração Extração de de proteínas proteínas -- Ponto NuvemPonto Nuvem

5 grandes frações:5 grandes frações:Albumina (59%)Albumina (59%)αα1 1 (5%)(5%)αα22 (8%)(8%)ββ (12%)(12%)γγ (16%)(16%)

Proteínas do plasma sangüíneoProteínas do plasma sangüíneo

76 proteínas76 proteínasMonitorar Monitorar doençasdoenças

Interesse Interesse protéicoprotéico

Marco A. Z. Arruda


Otimizar um sistema utilizando Otimizar um sistema utilizando TritonTriton XX--114 114 na extração e/ou semipurificação de proteínas na extração e/ou semipurificação de proteínas de plasma sangüíneode plasma sangüíneo

Caracterizar as proteínas das fases pobre e Caracterizar as proteínas das fases pobre e rica no rica no surfactante

CH2C

CH3 CH3

CH3CH3

CH3 C O (CH2CH2O)7_ 8H

surfactante

Marco A. Z. Arruda

FASE RICAFASE RICA

FASE POBREFASE POBRE

Marco A. Z. Arruda

Extração Extração de de proteínas proteínas -- Ponto NuvemPonto NuvemAPLICAÇÃOAPLICAÇÃO

Homogeneização Homogeneização ((vórtexvórtex)) Tempo de contato entre a Tempo de contato entre a

proteína e o proteína e o surfactantesurfactanteNaClNaCl(s)(s) + 8 + 8 mLmL surf.+surf.+

200 µL tampão 200 µL tampão KK22HPOHPO44/ / NaOHNaOH + +

amostraamostra

Variáveis:Variáveis:

* Concentração do * Concentração do surfactante surfactante (2 a 15% m/v)(2 a 15% m/v)

* Volume de amostra* Volume de amostra(100 a 2000 µL) (100 a 2000 µL)

* Concentração de * Concentração de NaClNaCl(6 a 12% m/v)(6 a 12% m/v)

* pH de extração* pH de extração(6,4 a 7,4)(6,4 a 7,4)

* Tempo de contato* Tempo de contato(0 a 20 minutos)

Centrifugação Centrifugação 3000 3000 rpmrpm (10 min)(10 min)

(0 a 20 minutos)Proteínas totais: Proteínas totais:

Método de Método de BradfordBradford


Marco A. Z. Arruda

PMPMkDakDa

116116

66,266,2

45,045,0

35,035,0

25,025,0

FRFR FPFP

Condição Condição ótima ótima

TXTX--114 5% (m/v)114 5% (m/v)

100 µL de 100 µL de amostraamostra

10% (m/v) de 10% (m/v) de NaClNaCl

pH 7,2pH 7,2

0 min0 min

tt trabalho 25ºCtrabalho 25ºC% extração: 65,0 % extração: 65,0 -- 84,6%84,6%

RSDsRSDs < 15%< 15%

Metodologia simples, rápida e versátil na Metodologia simples, rápida e versátil na extração/semiextração/semi--purificação de proteínas purificação de proteínas

Sistema Sistema micelarmicelar contribui na manipulação e no contribui na manipulação e no tratamento de biomoléculas tratamento de biomoléculas

Marco A. Z. Arruda

Extração Extração de de proteínasproteínasPonto Nuvem

APLICAÇÃOAPLICAÇÃO

Ponto Nuvem

Etapas básicas na extraçãoEtapas básicas na extração//separaçãoseparaçãode de proteínas

Marco A. Z. Arruda

AmostraAmostra

Ruptura celularRuptura celular

CentrifugaçãoCentrifugação

Análise/Análise/DetDet..

SolubilizaçãoSolubilização

proteínas

FracionamentoFracionamento

Marco A. Z. ArrudaAnálise/DeterminaçãoAnálise/DeterminaçãoProteínas totaisProteínas totais

BiuretoBiureto Mistura de cobre e hidrMistura de cobre e hidróóxido de sxido de sóódiodiocom um com um complexante complexante para estabilizapara estabilizaçãçãoo

LowryLowry Mistura de Mistura de molibdatomolibdato, , tungstato tungstato e e áácido fosfcido fosfóórico que sofre redurico que sofre reduçãção quando reage como quando reage com

proteproteíínas na presennas na presençça de Cu (II)a de Cu (II)

BradfordBradford Determina proteDetermina proteíínas totais utilizando nas totais utilizando o corante o corante ““Coomassie Brilliant BlueCoomassie Brilliant Blue”” BGBG--250250

Análise/DeterminaçãoAnálise/Determinação

Proteínas totais Proteínas totais -- BradfordBradfordInteração ocorre com macromoléculas de proteínas contendo aminoácidos com cadeias laterais básicas

ou aromáticas

NC2H5

CH3

SO3-Na+

C

NH

OC2H5

NC2H5

-O3S

Coomassie Brilliant Blue G-250Marco A. Z. Arruda


Proteínas totais Proteínas totais -- BradfordBradford

ausência de proteínasausência de proteínas

Marco A. Z. Arruda

595 595 nmnm

presença de proteínaspresença de proteínas

Marco A. Z. Arruda

Espectrometria de massasEspectrometria de massasAnálise/DeterminaçãoAnálise/Determinação

•• Determinação da estrutura primária;Determinação da estrutura primária;

•• alta sensibilidade;alta sensibilidade;

•• rapidezrapidez

••MALDIMALDI--TofTof--MSMS (do ingl(do inglêês, s, MatrixMatrix--AssistedAssisted Laser Laser DesorptionDesorption//IonizationIonization

Time of Time of Flight Mass Spectrometry Flight Mass Spectrometry

Matrizes para MALDII- Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (CCA)II- Ácido sinpínico

CH CH COOHH3CO

HOOCH3

CH CCOOH

HO

CN

I II

Marco A. Z. Arruda


Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArruda

Analisador de massas baseado em tempo de vôo

Feixe de Laser

pulsado

++

+

++

+++

++

+++

+

++ +

+

Marco A. Z. Arruda

Aceleração de partículas carregadas

Campo elétrico

(5-20 kV)

Laser

Detector


Alto vácuo: 10-5 – 10-8 mbar

Processador de sinal

Marco A. Z. Arruda


Laser

Detector


Marco A. Z. Arruda


Laser

Detector


Marco A. Z. ArrudaSpectrum

Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArrudaAnálise/DeterminaçãoAnálise/Determinação

APLICAÇÕESAPLICAÇÕES

ParkPark, Z, Z--Y & Russel, D. H.Y & Russel, D. H.

Anal. Anal. ChemChem.. 73(2001)255873(2001)2558

•• IdentificaIdentificaçãção de proteo de proteíínas em uma mistura nas em uma mistura ((concconc. de 1. de 1-- 5 5 µµmol/L) usando MALDI.mol/L) usando MALDI.

•• DesnaturaDesnaturaçãção to téérmica e qurmica e quíímica (mica (hidrocloretohidrocloretode de guanidinaguanidina, DTT e , DTT e iodoacetaminaiodoacetamina). As ). As amostras foram digeridas.amostras foram digeridas.


Marco A. Z. Marco A. Z. ArrudaArrudaAPLICAÇÕESAPLICAÇÕES

A bu n

d ân c

i a d e

ìons

Massa (m/z)

39 39 fragfrag..6 6 protprot..

A bu n

d ân c

i a d e

ìons

Massa (m/z)

A bu n

d ân c

i a d e

ìons

26 26 fragfrag..6 6 protprot..

Massa (m/z)

76 76 fragfrag..

11 11 protprot..

Espectros de massas de mistura de proteínas. A) nãoEspectros de massas de mistura de proteínas. A) não--desnaturada, B) desnaturação química e C) desnaturada, B) desnaturação química e C) desnaturação térmica.desnaturação térmica.

CaCa, , FeFe, Mg, K, Cu, , Mg, K, Cu, ZnZn......

••Agentes sinalizadoresAgentes sinalizadores••NutrientesNutrientes••ContaminantesContaminantes••Ligados a proteínasLigados a proteínas••Incorporados em suasIncorporados em suasestruturasestruturas

MetalômicaMetalômicaEstrutura terciária da Estrutura terciária da CalmodulinaCalmodulinade um terminal N com de um terminal N com CaCa ligado àligado àsua estruturasua estrutura8,523 8,523 kDakDaIshida Ishida etet alal., ., BiochemBiochem., 2000 ., 2000 fonte: www.fonte: www.rcsbrcsb..orgorg//pdbpdb/cgi /cgi

Marco A. Z. Arruda

METALÔMICAMETALÔMICA

Lactoferrina Lactoferrina alteraalteraçãção de conformao de conformaçãção o seletividade seletividade

Marco A. Z. Arruda

APLICAÇÕESAPLICAÇÕES

Marco A. Z. Arruda

Calo de Calo de CitrusCitrus(25x)(25x)

Amostra Amostra Material Material embriogembriogêêniconicoExtração proteínas:Extração proteínas:300 mg amostra +300 mg amostra +TrisTris--HClHClSDSSDSββ--mercaptoetanolmercaptoetanolGlicerolGlicerolAzul de Azul de bromofenolbromofenol

Mistura:Mistura:moagem (4°C),moagem (4°C),agitação (20 min) eagitação (20 min) eultracentrifugaçãoultracentrifugação(5 min (5 min –– caca. 8500 g)

VerbiVerbi, F. M. , F. M. etet alal., ., JBBMJBBM, aceito , aceito

. 8500 g)

Separação eletroforética – SDS PAGE

Marco A. Z. Arruda

i=10mA i=10mA E=40VE=40V

i=30mAi=30mAE=120VE=120Vcaca.. 10 h10 h1010--1515ooCC

GelGelseparadorseparador3,0% (m/v)3,0% (m/v)

pH 6,8pH 6,8

Gel deGel decorridacorrida

12,5% (m/v)12,5% (m/v)pH 8,8pH 8,8

Resultado da separação eletroforética

Obtained Obtained gelgel

11 22 33 44PMPM

((kDakDa))116116

66.266.2

45.045.0

35.035.0

25.025.0

18.418.4

14.414.4

Branco, 86, 81, 75, 62, Branco, 86, 81, 75, 62,

55, 53, 36, 32, 27, 26,555, 53, 36, 32, 27, 26,5

19, 15, 14 19, 15, 14 kDakDa

Marco A. Z. Arruda

Decomposição das proteínas e do gel

0033

790062

400031

Potência(W)

Tempo(min)

EtapaPrograma

HNOHNO33/H/H22OO22: 4:1 : 4:1 mLmLquase à secura (60quase à secura (60--7070ooC)C)volumes ajustados para 5mLvolumes ajustados para 5mLcom HNOcom HNO33 0,2% (v/v)

Teores de C Teores de C resres.:.:0,52 0,52 –– 1,50%1,50%

Marco A. Z. Arruda0,2% (v/v)

---2,36±0,7121,8±5,4744,0±6,02235±35,514---4,42±0,94---24,7±7,18---15---------6,02±2,3042,4±7,1619---------19,7±0,74126±19,624

23,5±6,721,30±0,14------210±42,626,517,7±5,364,78±1,08---------275,70±1,445,05±1,56---2,47±0,45283±33,332

---2,75±0,58---------3617,1±4,940,91±0,23---6,85±0,98---5329,1±5,93------6,31±0,97---553,39±0,82------------6229,7±4,587,50±1,52------61,7±7,6475

------105±12,7------81

14,1±4,4415,9±2,32---96,8±16,6---86

ZnCuFeKCa

MetaisPM (kDa)

SRSR--TRXRF (LNLS) TRXRF (LNLS) -- n=3, (n=3, (µµg gg g--11))

GEPAM GEPAM –– BioanalíticaBioanalítica

Joselito NardyJoselito Nardy Ribeiro (PD)Ribeiro (PD)

Jerusa Simoni Garcia (Dr) Jerusa Simoni Garcia (Dr)

Cristiana Cristiana Schmidt de Magalhães (Dr) Schmidt de Magalhães (Dr)

Aline Aline Soriano Soriano Lopes (Lopes (MScMSc))

Alessandra Alessandra Sussulini Sussulini ((MScMSc))

Marcelo A. Marcelo A. OseasOseas da Silva (IC)da Silva (IC)


OBRIGADO!!OBRIGADO!!

Marco A. Z. Arruda

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