apostila_patologiaflorestal_caldeira1999

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE ENGENHARIA FLORESTAL

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA FLORESTAL

PATOLOGIA FLORESTAL

ROTEIRO DE AULAS PRTICAS (2a. Edio)

SIDNEY FERNANDO CALDEIRA

Eng. Florestal - CREA 2.919-MT - M. Sc. Fitopatologia

CUIAB - 1999

PATOLOGIA FLORESTAL i

APRESENTAO Esta segunda verso publicada com o objetivo de orientar os acadmicos nas atividades prticas da disciplina de Patologia Florestal do curso de Engenharia Florestal. A busca do conhecimento no deve ser limitada e esta publicao apenas introduz um comportamento laboratorial para subsdio nas anlises das doenas em espcies florestais. Outra finalidade estimular e orientar o aluno no processo de consulta e pesquisa, apresentando diversos ttulos publicados que podem complementar seu ensino e aprendizagem. Como bem mencionou Francisco Alves Ferreira, nosso amigo "Xyko", em seu livro sobre Patologia Florestal: "este trabalho foi publicado para no ser rescrito".

PATOLOGIA FLORESTAL ii

AGRADECIMENTOS

Aos poucos que, de alguma forma, colaboraram.

A

todos que, de qualquer forma, incentivaram.

grande maioria que, pelo menos, no atrapalhou.

DEDICAO

minha mulher e filhos, pela pacincia.

A voc, leitor, pela ateno.

PATOLOGIA FLORESTAL iii

NDICE

AULA PGINA

1. Introduo atividade laboratorial ................................... 1

2. Preparaes microscpicas ................................................... 6

3. Medies microscpicas ......................................................... 11

4. Isolamento de fitopatgenos ............................................... 16

5. Inoculao de fitopatgenos ................................................ 29

6. Fungos inferiores Mastigomycotina e Zygomycotina .. 38

7. Fungos superiores Ascomycotina ..................................... 46

8. Fungos superiores Ascomycotina ..................................... 57

9. Fungos superiores Basidiomycotina ................................ 58

10. Fungos imperfeitos Deuteromycotina ............................ 65

11. Outros agentes biticos de fitomolstias .......................... 74

12. Prescrio tcnica ................................................................... 81

13. Defensivos agrcolas para a rea florestal ........................ 89

Bibliografia ............................................................................... 93

PATOLOGIA FLORESTAL iv

LISTA DE FIGURAS

FIGURA PGINA

1. Maneira correta para depositar a lamnula sobre a lmina .............. 8

2. Disposio das etiquetas e informaes para identificao ............... 8

3. Conidiforo e micrmetro ocular, MO ................................................... 13

4. Clamidsporo e micrmetro ocular (acima); micrmetro ocular e lmina micromtrica (abaixo) ..................................................................

14

5. Seqncia da tcnica de induo da esporulao ................................. 18

6. Seqncia da tcnica de induo do crescimento micelial ................. 18

7. Seqncia da tcnica de induo de diluio ......................................... 20

8. Seqncia da tcnica de armadilha .......................................................... 20

9. Esquema da tcnica de fluxo bacteriano ................................................ 22

10. Esquema da tcnica de diluio ................................................................ 23

11. Esquema de montagem da tcnica do funil de Buckmann ................. 24

12. Seqncia da tcnica de peneiramento mido ...................................... 25

13. Seqncia da tcnica de centrifugao em suspenso de sacarose .. 26

14. Seqncia da tcnica de aplicao direta de miclio em folha e em colo de mudas ...............................................................................................

31

15. Seqncia da atomizao com suspenso de esporos ou miclio em folhas .......................................................................................................

32

16. Seqncia da tcnica de injeo em tecido lenhoso ............................. 32

17. Seqncia da tcnica de infestao do solo com inculo ................... 34

18. Seqncia da tcnica de imerso de razes em suspenso aquosa de inculo ......................................................................................................

34

19. Diagrama do sistema de cinco Reinos proposto por Whittaker em 1969, segundo AINSWORTH & BISBY (1983) ......................................

39

20. Chave simplificada dos fungos inferiores de importncia para a Patologia Florestal .......................................................................................

42

PATOLOGIA FLORESTAL v

FIGURA PGINA

21. Ciclo de vida tpico de fungos de gnero Pythium, segundo GALLI (1994) ............................................................................................................

43

22. Ascomas tpicos e estruturas de reproduo sexual e assexual da subdiviso Ascomycotina, segundo AGRIOS (1979) ............................

47

23. Ciclo do mal das folhas de Hevea sp., causado por Microcyclus ulei, segundo GASPAROTTO & FERREIRA (1989) ................................

51

24. Ciclo de Calonectria crotalariae (Cylindrocladium crotalariae), agente causal de manchas de folhas em Eucalyptus sp., segundo FERREIRA (1989) .........................................................................................

53

25. Ciclo de Apiosphaeria guaranitica, agente causal da crosta marrom do ip, segundo FERREIRA (1989) ..........................................

54

26. Ciclo da mancha aureolada da seringueira, causada por Thanatephorus cucumeris, segundo GASPAROTTO & FERREIRA (1989) ............................................................................................................

60

27. Ciclo da ferrugem do ip-amarelo, causada por Prospodium bicolor, segundo FERREIRA (1989) .........................................................

62

28. Esquema e caractersticas das classes e ordens da subdiviso Deuteromycotina .........................................................................................

66

29. Ciclo de Oidium sp. em Eucalyptus sp. e diversas essncias florestais, segundo FERREIRA (1989) .....................................................

69

30. Ciclo de Cercospora sp., agente de manchas foliares em diversas espcies florestais, segundo FERREIRA (1989) .....................................

70

31. Ciclo de Fusarium sp., agente causal de tombamento de mudas, segundo FERREIRA (1989) ........................................................................

71

32. Os seis principais gneros de fitobactrias e sintomas tpicos, Segundo GALLI et al. (1994), adaptado de Kiraly et al. (1970) .......

75

33. Anatomia tpica de nematide macho e fmea, fitoparasitos, segundo AGRIOS (1971) ............................................................................

78

PATOLOGIA FLORESTAL vi

LISTA DE TABELAS

TABELA PGINA

1. Diluio e meios de cultura indicados para isolar fitopatgenos do solo ..................................................................................................................

19

2. Classificao do reino dos fungos segundo AINSWORTH & BISBY (1983) ............................................................................................................

39

3. Classificao simplificada de classes, ordens, famlias e alguns exemplos dos fungos inferiores ................................................................

41

4. Associao de gneros de Ascomycotina com Deuteromycotina ...... 47

5. Classificao simplificada de ordens, famlias e alguns exemplos de fungos da subdiviso Ascomycotina ........................................................

48

6. Classes da subdiviso Basidiomycotina segundo diferentes autores. 59

7. Resumo do ciclo de vida de um fungo causador de ferrugem .......... 61

8. Principais caractersticas dos gneros de bactrias fitopatognicas. 77

9. Nematides fitoparasitos de algumas espcies florestais e respectivo modo de ao ............................................................................

77

10. Classificao de pulverizao de acordo com o volume de calda utilizado .........................................................................................................

82

11. Algumas substncias qumicas utilizadas como fungicidas e classificados quanto sua gerao e grupo qumico ...........................

83

12. Princpio ativo e nome comercial de alguns nematicidas e alguns antibiticos utilizados como bactericidas e fungicidas .......................

84

13. Denominao, cor da faixa e equipamento obrigatrio de acordo com a classe toxicolgica dos defensivos agrcolas ..............................

84

14. Dose e agrotxicos para controle qumico de doenas do Cacau (Theobromae cacao) ..................................................................................

89

15. Dose e agrotxicos para controle qumico de doenas do Eucalipto (Eucalyptus spp.) .........................................................................................

89

16. Dose e agrotxicos para controle qumico de doenas do Ip (Tabebuia spp.) ...........................................................................................

90

PATOLOGIA FLORESTAL vii

TABELA PGINA

17. Dose e agrotxicos para controle qumico de doenas do Pinheiro (Pinus spp.) ...................................................................................................

90

18. Dose e agrotxicos para controle qumico de doenas de plantas ornamentais ..................................................................................................

90

19. Dose e agrotxicos para controle qumico de doenas da Seringueira (Hevea spp.) ...........................................................................

91

20. Dose e agrotxicos para controle qumico de doenas de outras espcies florestais ........................................................................................

92

INTRODUO ATIVIDADE LABORATORIAL

PATOLOGIA FLORESTAL 1

INTRODUO ATIVIDADE LABORATORIAL 1. OBJETIVOS Conhecer e saber as normas do Laboratrio de Patologia Florestal e as tcnicas de coleta de amostras de material vegetal doente para anlises patolgicas. 2. CONSIDERAES Nas aulas prticas de Patologia Florestal uma srie de normas deve ser seguida para atingir os objetivos propostos e o domnio tcnico dessas atividades. 2.1. Normas de laboratrio obrigatrio o uso de guarda-p em todas as aulas prticas e expressamente proibido fumar nas dependncias do laboratrio. Todo aluno deve ter para seu uso pessoal: esmalte incolor; estilete de ponta grossa e de ponta fina; etiquetas gomadas; lminas de barbear; lpis preto n. 2 e borracha. Somente utilize material e equipamentos que fizerem parte da atividade prtica em execuo. A assepsia fundamental para atingir os objetivos propostos; o aluno deve lavar suas mos com sabo e limpar a bancada com lcool 70% e algodo, antes de iniciar seu trabalho, alm de limpar o seu local de trabalho, aps o trmino da atividade. No deixe de resolver as questes propostas, consultar a literatura adicional e tirar suas dvidas, pois as atividades prticas faro parte das avaliaes gerais e avaliaes prticas e somente sero aceitos relatrios dos alunos que participarem da execuo da atividade prtica. 2.2. Noes de Microscpio O microscpio um equipamento de preciso e sensvel; deve ser utilizado com cuidado e mantido sempre limpo e coberto aps o uso. Antes da utilizao faa um ajuste das lentes oculares de acordo com a sua acuidade visual e distncia interpupilar. Somente utilize para observao em microscpio o material devidamente montado em lmina. Qualquer outro tipo de material deve ser observado em microscpio



estereoscpio, a lupa, que adequado para material volumoso. Antes da observao abaixe a mesa do microscpio e aps depositar a lmina, sempre com a objetiva de menor aumento, suba a mesa vagarosamente acionando o parafuso macromtrico e observando vista nua. Olhe pela lente ocular e acerte o foco com o parafuso macromtrico e complete o ajuste com o parafuso micromtrico. Faa as observaes em outras objetivas e selecione a que proporcionar a melhor visualizao para desenhar as estruturas observadas. Evite a utilizao de mxima luminosidade, para no prejudicar sua viso e diminuir a vida til da lmpada do aparelho. Somente utilize a objetiva de imerso, a de 100 vezes, para observao de esfregao bacteriano, adicionando uma gota de leo de imerso, leo-de-cedro, sobre o local a ser observado e aps o exame efetue a limpeza da objetiva com algodo embebido em xilol, secando posteriormente com algodo limpo e seco. Ao trmino limpe a mesa do microscpio, desligue o aparelho, retire o plugue da tomada e cubra o equipamento, eliminando as lminas em recipiente adequado, separando a lmina da lamnula. Quando for solicitado entregue a lmina montada, devidamente etiquetada, junto com o respectivo relatrio dirigido, j preenchido. 2.3. Noes de Sintomatologia Diagnose a determinao de uma enfermidade e seu agente etiolgico atravs do exame de sintomas e sinais apresentados pela planta doente, associado s tcnicas de isolamento de planta doente e inoculao do patgeno em planta sadia, repetio dos mesmos sintomas e sinais e o reisolamento do mesmo patgeno da planta inoculada. De modo simplificado, sintoma a exteriorizao da doena, como resultado das alteraes fisiolgicas e morfolgicas no hospedeiro; sinal a presena de estruturas ou produtos da ao do patgeno junto ao tecido afetado. Os sintomas observados em plantas doentes so assim agrupados: (a) necrticos, caracterizados por morte do tecido infectado, observados como: amarelecimento, mancha, murcha, seca, cancro, tombamento, gomose, morte dos ponteiros, podrido e resinose, entre outros; (b) hiperplsticos ou hipertrofias, caracterizados por incremento no nmero ou tamanho das clulas, observados como: galha, tumor, sarna e vassoura-de-bruxa, entre outros e (c) hipoplsticos ou hipotrofias, quando apresentam reduo no desenvolvimento ou atrofia, como: albinismo, clorose, mosaico, estiolamento, enfezamento e roseta, entre outros. Os microorganismos que podem estar envolvidos nestes sintomas so os fungos, bactrias, nematides e vrus, denominados agentes de doenas patognicas. possvel observar alguns desses sintomas cuja causa so agentes no patognicos, denominados de desordens fisiolgicas, causadas por: adversidade climtica, deficincia nutricional, poluentes e toxidez mineral, entre outros. Alguns desses sintomas podem ser causados por insetos, o que implicar em procedimentos que no so objeto desta disciplina. Quanto localizao os sintomas podem surgir nas folhas, flores, frutos, ramos, galhos, troncos e razes. Quando ocorrem no local da infeco so genericamente denominados de sintomas primrios e quando ocorrem em parte do vegetal diferente do



local da infeco, so denominados de sintomas secundrios ou reflexos. importante observar que existem sintomas caractersticos em certas doenas:

como murcha, seca e podrido mas, de modo geral, ocorrem vrios sintomas ou sinais no processo doena. Esse conjunto de sintomas e sinais, que caracteriza determinada doena, denominado de quadro sintomatolgico. 2.4. Recomendaes para coleta de material doente Para diagnosticar uma enfermidade necessrio que o material doente chegue em condio de anlise no laboratrio e as amostras representem os sintomas e sinais que esto ocorrendo no campo e envio imediato ao laboratrio. A forma adequada de coleta para cada parte do vegetal a seguinte: (a) material foliar: se for possvel chegar ao laboratrio em 48 horas, poder ser enviado fresco em sacos de papel ou caixas de papelo com pequenos furos ou entre folhas de papel de jornal. Quando exceder a 48 horas, o material dever ser prensado e secado sombra. No enviar em sacos plsticos. (b) ramos, galhos, troncos ou suas partes: destacar a parte afetada, de forma representativa, com faca ou ferramenta afiada e, quando necessrio, proceder a lavagem em gua corrente e deixar secar ao sol, acondicionando em sacos de papel ou caixa de papelo e completar o espao vazio com papel amassado, para evitar movimento do material. No enviar em sacos plsticos.

(c) razes: proceder a coleta, lavagem, secagem e acondicionamento de forma semelhante ao item anterior. Efetuar coletas adicionais de 8 a 10 subamostras de solo rizosfrico, prximo das razes doentes, em diversos locais e a diferentes profundidades; misturar e retirar uma amostra composta com cerca de 500g e umedecer levemente, se necessrio, acondicionando em saco plstico bem vedado. (d) frutos e rgos suculentos: coletar e acondicionar amostras representativas em vidro contendo lcool a 40% ou soluo 1:1:1 de lcool a 90%, gua e benzeno. Junto com as amostras coletadas dever ser respondido um questionrio complementar que acompanhar as amostras ao laboratrio, com os recipientes devidamente identificados com data e local de coleta, coletor, espcie e variedade coletada. Na coleta importante tentar caracterizar o quadro sintomatolgico existente; nem sempre possvel amostrar totalmente este quadro em certas pocas e situaes. O treinamento visual do tcnico muito importante para uma correta diagnose, principalmente para comparao com a literatura, herbrio e outras fontes de consulta. 3. PROCEDIMENTOS Efetuar uma coleta de material florestal doente, respondendo adequadamente ao questionrio. Efetuar a descrio dos sintomas e sinais observados. Observar que este mesmo material poder ser utilizado futuramente para execuo das tcnicas de isolamento de fitopatgenos.



4. RESULTADOS Entregar o material coletado, com a devida identificao acompanhado do questionrio informativo. 5. QUESTES COMPLEMENTARES 1. O que assepsia e qual sua importncia na atividade laboratorial para anlise das doenas florestais? 2. Quais as partes que compem um microscpio ptico? 3. Que tipos de ajustes podem ser efetuados em um microscpio ptico para otimizar a visualizao do material a ser observado? 4. O que um esfregao e como preparado? 5. Qual a funo do leo-de-imerso e quando este deve ser utilizado na rotina de laboratrio? 6. Quais so os principais erros cometidos na coleta de material para diagnstico de doenas florestais? 7. Qual a diferena entre sintoma e sinal? 8. O que quadro sintomatolgico? 9. Quais informaes devem ser enviadas nas embalagens de material coletado para exame fitopatolgico?



RELATRIO DE AULA PRTICA N. 01 Data: Sub-turma: Aluno(a):

QUESTIONRIO INFORMATIVO - ANLISE DE FITOMOLSTIA

Interessado: Endereo: Cidade/UF: Telefone:

Espcie: idade: rea plantada: Variedade: espaamento: rea afetada: Estgio: [ ]fruto; [ ]semente; [ ]estaca; [ ]muda; [ ]rvore jovem; [ ]rvore adulta Parte(s) afetada(s): poca observada: vegetao adjacente:

[ ] = Se o fato ocorreu, marque com um x e procure detalhar da melhor forma.

Sintomas observados: [ ]em planta isolada; [ ]foco(s) isolado(s); [ ]em reboleira(s); [ ]generalizado [ ]ocorrncia anterior: [ ]em outras espcies? Quais:

[ ]Temperatura alta [ ]frente fria [ ]falta de chuva [ ]inundao - dias [ ]excesso de sombra [ ]insolao forte tipo de solo: profundidade: ons txicos no solo: pH do solo: poluentes atmosfricos:

[ ]Calagem [ ]fertilizantes ou adubos [ ]irrigao [ ]poda(s) [ ]desrama(s) [ ]desbaste(s) [ ]capina/roada, equipamento: [ ]outras, especificar: defensivos agrcolas (produto e dosagem):

[ ]Remessa anterior ao laboratrio: observaes: data da coleta: / / coletor:

PREPARAES MICROSCPICAS


PREPARAES MICROSCPICAS 1. OBJETIVOS Recordar as tcnicas rotineiras de preparaes microscpicas para as anlises laboratoriais e saber as funes dos lquidos de montagem. 2. CONSIDERAES O diagnstico de uma enfermidade, na maioria das vezes, no pode ser feito pela simples observao dos sintomas; podem ser necessrios exames microscpicos de cortes histolgicos, de estruturas reprodutivas do patgeno ou raspagem da superfcie de leses, alm da execuo dos postulados de Koch.

Somente possvel estabelecer a causa de uma fitomolstia a um microorganismo atravs dos postulados descritos por Robert Koch em 1881, que so: (a) associao constante do patgeno e hospedeiro: presena do microorganismo em todas as plantas da mesma espcie, observadas com os sintomas; (b) isolamento do patgeno das leses observadas no hospedeiro doente; (c) inoculao do patgeno isolado em planta sadia, da mesma espcie e reproduo dos mesmos sintomas observados inicialmente no hospedeiro doente, e (d) reisolamento do patgeno do hospedeiro sadio inoculado. 2.1. Lquidos de montagem

Alm das tcnicas de isolamento e inoculao, para execuo do postulados de Koch necessria a identificao do microorganismo, o que efetuado mediante estudo de suas estruturas em preparaes microscpicas. Os lquidos de montagem utilizados nas preparaes microscpicas tm as funes de colorao, que objetiva um melhor contraste das estruturas com o meio circundante; de fixao, cuja finalidade conservar o material evitando a deteriorao das estruturas e, finalmente, da manuteno da umidade, para que o material no seque e mantenha a forma original das estruturas.

Dentre os lquidos de montagem mais utilizados para observaes rpidas, podem ser citados: a gua destilada e a glicerina a 20%; para preparaes permanentes os mais comuns so: lactofenol, azul de Amann e fuccina cida, cujas formulaes so apresentadas a seguir.



O lactofenol preparado pela mistura de 10 ml de cido lctico com 10 ml de glicerina PA e mais 10 g de fenol cristalizado em 10 ml de gua destilada. J a fuccina cida ou lactofuccina preparada pela mistura de 0,1 g de fuccina cida em 100 ml de cido lctico PA. Para preparar o azul de Amann basta adicionar o corante azul de algodo, "cotton blue", na proporo de 0,05 a 0,1%, a partir de uma soluo estoque a 0,5% em gua destilada, a um determinado volume de lactofenol, preparado segundo as indicaes j apresentadas. 2.2. Preparaes microscpicas As tcnicas mais comuns para preparaes microscpicas, so:

(a) fragmentao ou esmigalhamento de estruturas: indicada para corpos frutferos como apotcio, peritcio, picndios, entre outros, atravs da presso do material acondicionado entre a lmina e a lamnula; (b) exame de culturas superficiais: aps o acondicionamento do material em lmina e lamnula, retirado de meio de cultura com auxlio de estilete; (c) raspagem da superfcie de leses: indicado para montagem de condios, conidiforos, picndios, entre outros, desde que se apresentem superficialmente no tecido do hospedeiro; (d) corte histolgico: efetuado com micrtomo ou mo livre, indicado para observao de estruturas subepidermais no tecido do hospedeiro, como acrvulos, picndios, estromas e outros; (e) fita adesiva: utilizada para observaes de esporos ou frutificaes superficiais existentes no tecido do hospedeiro. Em alguns casos possvel a observao direta do material afetado e identificao do microorganismo, quando este apresenta-se sobre o tecido afetado com as estruturas de frutificao. Isto comum nas anlises fitossanitrias de sementes e algumas doenas de folhas e troncos, cuja frutificao pode ser estimulada pelo acondicionamento do material em cmara mida. importante observar que a montagem de boas lminas depende de treinamento e da tentativa repetitiva e cuidadosa, j que as estruturas so bastante pequenas e sensveis. Normalmente para obter-se uma boa lmina devemos efetuar, pelo menos, trs montagens e selecionar a melhor estrutura. 3. PRODECIMENTOS Observar os rgos com leses ou as placas com fungos que forem apresentados em aula sob o microscpio estereoscpio at a completa visualizao das estruturas do patgeno. Retirar com auxlio de um estilete flambado a estrutura do microorganismo e acondicionar em uma gotcula de lquido de montagem sobre uma lmina e cobrir cuidadosamente com a lamnula, conforme o esquema apresentado na figura 1.



FIGURA 1 - Maneira correta para depositar a lamnula sobre a lmina.

FIGURA 2 - Disposio das etiquetas e informaes para identificao.



Se a estrutura for volumosa e interessar a observao de seu interior, efetuar o esmigalhamento com o cabo do estilete, atravs de presso ou batidas suaves sobre a lamnula. Aps a observao da estrutura proceder a lutagem com o esmalte incolor e somente aps a secagem do esmalte desenhar a estrutura e colar a etiqueta anotando as informaes especificadas na figura 2. Para as preparaes em que o material estiver em placa de Petri, com meio de cultura, o procedimento ser idntico, mas ao colocar o material no lquido de montagem utilize dois estiletes para separar e posicionar o material na lmina. Cuidar para no exagerar na quantidade de lquido de montagem e quando isto ocorrer, antes da lutagem, remover o excesso com leno de papel ou papel borro. Nunca utilizar o leo de imerso neste tipo de trabalho. 4. RESULTADOS O aluno dever executar a montagem de lminas com os materiais entregues em sala de aula, efetuar a lutagem, etiquetar, desenhar e identificar as estruturas observadas em relatrio prprio que ser entregue juntamente com as lminas montadas. 5. QUESTES COMPLEMENTARES 1. Qual a finalidade dos lquidos de montagem? 2. Qual o objetivo de se efetuar as preparaes microscpicas nas anlises laboratoriais? 3. Qual a funo do esmalte nas preparaes microscpicas e que outros produtos so utilizados para tal finalidade? 4. Quais os erros mais comuns cometidos na montagem de lminas? 5. Citar dois lquidos de montagem e respectiva formulao, diferentes dos que foram apresentados neste roteiro. 6. Porque devemos dar a localizao das estruturas montadas em lminas? 7. Quais so as tcnicas mais utilizadas nas preparaes microscpicas?




Material 1:

Subdiviso:

Classe:

Ordem:

Famlia:

Gnero:

Espcie:

Estruturas observadas: Lmina n.: Abs. X ord.: Ampliao:

Material 2:

Subdiviso:

Classe:

Ordem:

Famlia:

Gnero:

Espcie:


MEDIES MICROSCPICAS


MEDIES MICROSCPICAS 1. OBJETIVOS Aprender a calcular os coeficientes micromtricos e medir algumas estruturas de microorganismos em microscpio binocular. 2. CONSIDERAES Dentre as vrias caractersticas utilizadas para a classificao de microorganismos, a dimenso de suas estruturas vegetativas e reprodutivas parmetro de fundamental importncia na identificao de gneros e espcies. Para medio dessas estruturas necessrio utilizar determinado aparato junto ao microscpio e a operao divide-se em duas fases: primeiro determinar os coeficientes micromtricos, CM, e depois medir as estruturas. Na primeira fase utilizada a lmina micromtrica, LM, junto com o micrmetro ocular, MO, e na segunda fase utilizado o mesmo MO e a lmina montada com o material a ser mensurado. A LM caracteriza-se por ser reticulada de 10 em 10, ou com uma medida conhecida, num total de 100 retculos. J o MO reticulado de forma eqidistante, sem uma medida definida, podendo ter um total de 50 ou de 100 retculos. O MO utilizado como um referencial para registrar os CM resultantes dos efeitos da ampliao sofrida pela medida real da LM que, nas diferentes objetivas, geram diferentes CMs. importante salientar que cada lente objetiva ter um CM e seu valor ser inversamente proporcional ampliao oferecida pelas lentes objetivas. Como alguns microscpios apresentam diferentes lentes oculares, 10X, 15X e at 20X, e estas lentes influenciam na ampliao final obtida, ao se trocar de lente ocular ou lente objetiva, ocorrer alterao no valor do CM. O clculo do CM dado pela equao:

CM = 10 x (LM) / MO

MEDIES MICROSCPICAS


onde:

LM = nmero de retculos considerados da LM MO = nmero de retculos do MO que coincidiu com o nmero de retculos da LM

O valor do CM dado em micros, no importando qual o nmero de retculos considerados; ele sempre ter o mesmo valor para um determinado conjunto de lentes objetiva e ocular. Finalmente, considerando que o valor dos CMs sempre inversamente proporcional ampliao oferecida pelo conjunto ptico do microscpio, possvel estimar com uma regra de trs simples o valor de todos os CMs, a partir de um nico calculado. Nesta estimativa podero ocorrer pequenas diferenas em funo das lentes ou da passagem da luz pelo sistema ptico do microscpio mas, de modo geral, aparelhos de mesma marca e mesmo modelo apresentam CMs cujos valores so bastante prximos para os respectivos conjuntos de lentes ocular e objetiva. 3. PROCEDIMENTOS Inicialmente o aluno dever regular o microscpio sua viso; acondicionar a LM na mesa do microscpio, prendendo-a pela platina e o MO dever ser instalado junto lente ocular direita do microscpio. Observando com a objetiva de menor aumento efetuar a superposio dos retculos iniciais da LM e do MO e localizar a superposio de qualquer outro retculo da LM com outro do MO, efetuando a contagem do nmero de retculos contido entre estes dois, tanto na LM como no MO. Os valores encontrados devero ser substitudos na equao apresentada anteriormente para determinao do CM, especificando sempre para qual conjunto de lentes objetiva e ocular foi efetuada esta determinao. A operao dever ser repetida para outros conjuntos de lentes objetiva e ocular, Uma opo para este passo pode ser a estimativa dos CMs dos outros conjuntos de lentes, com base nas ampliaes oferecidas pelo microscpio. Em seguida a LM dever ser retirada da mesa do microscpio e em seu lugar depositada a lmina montada com a estrutura a ser medida, selecionando a lente objetiva que oferecer a melhor visualizao da estrutura. O passo final efetuar a contagem do nmero de retculos do MO que ocupam a estrutura a ser medida, sendo este valor denominado de leitura, L, e para determinao do tamanho da estrutura utilizar a seguinte equao :

T (obj.) = (CM) x (L)

MEDIES MICROSCPICAS


onde: T (obj.) = dimenso da estrutura, em micros CM = valor do coeficiente micromtrico, em micros L = leitura correspondente ao nmero de retculos ocupados pela estrutura medida

4. RESULTADOS Apresentar o relatrio com os clculos ou estimativas de todos os CMs para o microscpio que for utilizado, bem como o desenho das estruturas observadas, em relatrio prprio, e as dimenses encontradas. 5. QUESTES COMPLEMENTARES 1. Se um microscpio apresenta quatro objetivas: 4, 6, 60 e 100 e um conjunto de trs oculares: 5X, 10X e 20X, quantos CMs dever ter a mais que outro que apresenta somente trs objetivas: 6, 10 e 60 e duas oculares: 10X e 20X? 2. Um microscpio apresenta o CM = 10, objetiva 10 com a ocular 10X. Qual ser o tamanho do conidiforo, filide e condio, esquematizados na figura 3, abaixo, se sua observao visual foi efetuada na objetiva 60 com a ocular 15X?

FIGURA 3 - Conidiforo e micrmetro ocular, MO.

MEDIES MICROSCPICAS


3. Um microscpio apresenta os seguintes CMs: 16,1 para a lente objetiva 10 com a lente ocular 10X e 7,98 para a lente objetiva 10 com a lente ocular 20X. Qual o tamanho provvel de um objeto, se as Ls efetuadas foram, respectivamente: 20,2 e 39,5? 4. Sabe-se que um objeto mede 100 micros. Quais devem ter sido as Ls efetuadas se o microscpio apresenta os seguintes CMs : 29,5, objetiva 4 com a ocular 15X, e 2,2, objetiva 60 com a ocular 15X ? Se substituirmos a ocular 15X pela ocular 10X, quais seriam os valores dos CMs e as respectivas leituras? 5. Um microscpio apresenta as objetivas 4, 10, 60 e 100 e as oculares 10X, 15X e 20X. Ao acondicionarmos a LM e o MO o observador constatou o campo visual esquematizado na figura 4a; utilizando a objetiva 4 com a ocular 15X. Posteriormente utilizando a objetiva 100 com a ocular 10X observou uma hifa com um clamidsporo, esquematizados na figura 4b. Com estas informaes pergunta-se : a) quais so os CMs possveis de serem calculados e/ou estimados para este microscpio ? b) qual ser o dimetro do clamidsporo e a espessura da parede da hifa?

FIGURA 4 Clamidsporo e micrmetro ocular (acima); micrmetro ocular e lmina micromtrica (abaixo).

MEDIES MICROSCPICAS


RELATRIO DE AULA PRTICA N. 03 Data: Sub-turma:

Aluno(a):

1. CLCULO DOS COEFICIENTES MICROMTRICOS (CMs) QUADRO DE LEITURAS QUADRO DOS CMs

Lentes N. de retculos Lentes Lentes Oculares Objetivas L M M O Objetivas 10 X 15 X 20 X

OCULAR UTILIZADA:

2. DESENHO

Material :

Estruturas observadas:

Lmina n.: Abs. X ord.: Ampliao:

3. CLCULO DA DIMENSO DAS ESTRUTURAS QUADRO DE RESULTADOS

Estrutura C M Leitura Tamanho

1. 2.

ISOLAMENTO DE FITOPATGENOS


ISOLAMENTO DE FITOPATGENOS 1. OBJETIVOS Conhecer e saber as principais tcnicas de isolamento de fungos e bactrias fitopatognicas e as tcnicas de extrao de nematides fitfagos, dos diferentes rgos e tecidos afetados do hospedeiro e tambm do solo. 2. CONSIDERAES A presena do patgenos nos tecidos do hospedeiro ocasiona uma srie de leses que, em alguns casos, so to peculiares a ponto de possibilitar a diagnose da doena. Em outros casos h necessidade de se isolar o microorganismo, principalmente para testar se existe patogenicidade, atravs dos postulados de Koch, para determinar variedades resistentes, ensaio com defensivos e outros testes. Isolar um fitopatgeno consiste em transferi-lo do tecido vegetal atacado para crescer isoladamente em meio de cultura. Observe-se que os parasitas obrigatrios agentes de doenas conhecidas como ferrugens, por exemplo: Puccinia sp., Uromyces sp. e outros; como carves, por exemplo: Ustilago sp. e outros; como mldios, por exemplo: Plasmopora sp., Peronospora sp. e outros e como mldios pulverulentos ou oidioses, por exemplo: Erysiphe sp., Oidium sp. e outros, no crescem em meio de cultura artificial. O isolamento afetado pelos seguintes fatores: condio do material vegetal doente, tipo de desinfetante superficial, meio de cultura utilizado, temperatura de incubao e pela tcnica de isolamento utilizada. 2.1. Isolamento de fungos fitopatognicos 2.1.1. Induo da esporulao A tcnica de induo da esporulao indicada para isolamento de fungos que causam manchas foliares, como Cercospora sp., Colletotrichum sp., Helminthosporium sp., Phoma sp., Septoria sp., entre outros. Contudo comum o aparecimento de Alternaria sp., Aspergillus sp., Cladosporium sp., Penicillium sp. e Trichoderma sp. que, na maioria das vezes, so apenas contaminantes saprofticos, mas que costumam prejudicar essa tcnica de isolamento.



Esta tcnica consiste em tomar pedaos quadrados de 1 a 2 cm da folha lesionada na rea de transio do tecido doente para o tecido sadio, cortados com lmina flambada e imerso em lcool a 70% por 1a 2 minutos; em seguida em hipoclorito de sdio a 2% por 30 a 60 segundos e por mais trs passagens sucessivas em gua estril para retirar o excesso do hipoclorito de sdio. Em seguida retirar o excesso de gua entre folhas de papel de filtro esterilizadas e deposio em placas de Petri com meio de cultura gar-gua, sempre com auxlio de pina flambada. As placa de Petri sero incubadas em ambiente ou estufa com observao diria. Aps o aparecimento da esporulao utilizar estilete flambado para repicar o fungo para placa de Petri com meio de cultura BDA e montar a lmina para identificao das estruturas. O material poder tambm ser repicado para tubo de ensaio quando se desejar armazenar o fungo. A figura 5 apresenta um esquema deste procedimento tcnico. Observa-se que a funo do lcool, como solvente orgnico, consiste em eliminar substncias cerosas da folha vegetal que possam impedir o contato do desinfetante superficial, o hipoclorito de sdio, com o tecido foliar, sendo que a menor ou maior durao desta operao depender da espessura e estado do material. 2.1.2. Induo do crescimento micelial Os organismos que atacam tecidos carnosos como galhos, madeira, razes e frutos, aqueles de difcil esporulao e os que causam tombamento de plntulas so geralmente isolados a partir de pedaos internos do tecido afetado para crescer em meio de cultura gar-gua ou meio de BDA acidificado. Esta tcnica presume que nos tecidos internos somente estar presente o fungo patognico com ausncia de saprfitas que usualmente esto sobre a superfcie dos tecidos afetados. indicada para isolar Cryphonectria cubensis, Sclerotium sp. e Armillaria mellea, entre outros. A tcnica consiste em lavagem externa da rea afetada com gua corrente e, se necessrio, com ajuda de escova de cerdas duras, retirar excesso de terra e secagem com papel de filtro. A desinfestao externa pode ser efetuada com lavagem com ou passagem de algodo embebido em lcool a 70% ou hipoclorito de sdio a 2% seguido de flambagem externa. Com auxlio de bisturi retirado um pedao do tecido interno e acondicionado em placa de Petri com o meio de cultura selecionado.

A incubao, observaes dirias, repicagem para placa e tubo de ensaio alm da montagem de lmina so semelhantes tcnica anterior e com os mesmos objetivos. A figura 6 apresenta um esquema deste procedimento tcnico. 2.1.3. Diluio Esta tcnica indicada para isolar microorganismos que produzem grande nmero de unidades reprodutivas, principalmente patgenos do solo, com Fusarium sp., bactrias, actinomycetes e fermentos. Esta tcnica pode ser afetada pela forma de coleta e armazenamento do solo, pelas caractersticas do material utilizado e pelo meio de cultura utilizado. A tabela 1 apresenta um resumo das diluies mais adequadas e respectivos meios de cultura seletivos indicados para alguns fitopatgenos.



FIGURA 5 Seqncia da tcnica de induo da esporulao

FIGURA 6 Seqncia da tcnica de induo do crescimento micelial



A tcnica consiste em tomar uma amostra de solo representativa, secar naturalmente, moer em almofariz e aps peneirar, retirar 10 g que sero diludas em gua esterilizada, at atingir a diluio desejada. Em seguida alquotas de 1 ml sero depositadas em placas de Petri com o meio de cultura selecionado, conforme apresenta o esquema da figura 7. TABELA 1 - Diluio e meios de cultura indicados para isolar fitopatgenos do solo.

MICROORGANISMO DILUIO MEIO DE CULTURA SELETIVO Actinomycetes 1/105 gar-gua, casena-glicerol

Bactrias 1/105 a 1/107 gar-nutriente, extrato de solo Fungos 1/104 BDA-tergitol, V-8 Martin, DAES

Uma alternativa mais simples e que diminui a quantidade de vidraria, consiste em tomar cerca de 0,005 a 0,15 g de solo devidamente preparado e misturar com 1 ml de gua em placa de Petri esterilizados, adicionando em seguida de 10 a 15 ml do meio de cultura selecionado temperatura de 40 a 45C e com movimentos rotatrios misturar a gua com o solo com o meio de cultura. Em qualquer desses dois procedimento, a incubao, observaes dirias, repicagem para placa e tubo de ensaio e montagem de lmina so semelhantes s tcnicas anteriores e com os mesmos objetivos. necessrio corrigir o pH do meio de cultura para 4,00 a 4,50 se o objetivo for o isolamento de fungos e em torno de 7,00 se for para isolar bactrias. 2.1.4. Em hospedeiros Esta tcnica indicada principalmente para patgenos obrigatrios, sendo tambm utilizada para infeces brandas e organismos de crescimento muito lento. Consiste em crescer o hospedeiro em ambiente controlado e isento de outros microorganismos e posteriormente transferir esporos da planta doente para esta planta sadia que incubada no mesmo local, com observaes dirias e montagem de lmina para identificar as estruturas do fitopatgeno. 2.1.5. Armadilha indicada para fungos do solo que apresentam bom crescimento sobre certas iscas como cenoura, tomate, sementes de alfafa do Nordeste, folhas de abacaxi, ma, entre outros. Consiste na utilizao de um substrato preferencial, isca ou armadilha nutritiva, para atra-los, antes de outros, da microfauna do solo. Observa-se que o tempo de contato entre o solo e o substrato no deve ser curto ou excessivo e o solo deve ser coletado de amostras compostas sempre na rizosfera ou prximo ao colo da planta afetada. De modo geral o enterro de hospedeiros suscetveis sadios em solo infestado tambm considerado uma armadilha. A garantia do sucesso da tcnica est na utilizao de um substrato adequado e na alta populao desse patgeno no solo onde est a planta doente.



FIGURA 7 Seqncia da tcnica de induo de diluio.

FIGURA 8 Seqncia da tcnica de armadilha.



A utilizao de cenoura como armadilha d bons resultados com Agrobacterium tumefaciens e Thielaviopsis basicola; a tcnica com celofane tm sido utilizada para Rhizoctonia sp.; a deposio de solo em buracos feitos em frutos de ma ou o enterro de folhas de abacaxi, sem ferimentos, em solo infectado por Phytophthora spp. atra este fitopatgeno; quando as folhas de abacaxi so feridas com estilete flambado e enterradas atraem Pythium spp..

Para executar esta tcnica, cortar com escalpelo flambado discos de cenoura desinfestada superficialmente e depositar em placa de Petri com papel de filtro e gua esterilizados. Sobre o disco colocar cerca de 1g de solo e incubar por 24 a 48 horas; em seguida retirar o solo com jatos de gua esterilizada e incubar novamente os discos de cenoura em cmara mida, com observaes dirias, repicagem e montagem de lmina, igual ao exposto anteriormente. Em alguns casos possvel transferir para placas de Petri com meio de cultura, pedaos da armadilha. A assepsia ser fundamental para obter-se bons resultados. A figura 8 apresenta um esquema deste procedimento. 2.1.6. Direto Esta tcnica indicada especialmente para microorganismos que podem ser encontrados em colnias puras e tambm para alguns de crescimento lento. Neste caso a transferncia da estrutura do microorganismo direta do tecido vegetal afetado para placa de Petri com meio de cultura e tambm para a montagem de lminas, com auxlio de um estilete flambado. 2.2. Isolamento de bactrias fitopatognicas As bactrias fitopatognicas, seres unicelulares, encontram-se aos milhares no tecido enfermo e as tcnicas para seu isolamento procuram diminuir essa quantidade atravs de diluies para tentar obter-se colnias puras e separadas, oriundas de uma nica clula. importante dar oportunidade para que as bactrias fitopatognicas possam formar colnias individualizadas, pois estas crescem mais lentamente que as bactrias saprfitas. De modo geral as bactrias desenvolvem-se bem em meio de reao neutra com pH entre 6,50 e 7,50 enquanto para os fungos o pH ideal est entre 4,50 a 5,50. O meio de cultura mais utilizado para bactrias o gar-nutritivo preparado com 3 g de extrato de carne, 10 g de peptona, 18 g de gar e volume de gua destilada para completar 1000 ml. Se nesta formulao for retirado o gar e adicionado 10 g de dextrose, este meio de cultura conhecido como caldo-nutritivo. Existe uma rotina prtica para diferenciar uma leso de folha ou do sistema vascular causada por bactria. No caso das folhas basta cortar um pequeno pedao de cerca de 3 mm de lado, na rea de transio entre o tecido sadio e o tecido afetado e colocar com gua estril entre lmina e lamnula e observar ao microscpio. Se existirem bactrias as mesmas formaro um fluxo bacteriano de cor cinza claro, saindo das nervuras, facilmente observvel.



No caso de doena vascular basta cortar pedaos de ramos ou caules, plano na base e em bisel na parte superior, de tamanho varivel e depositar imediatamente em p sobre uma placa de Petri com gua esterilizada, cobrindo o conjunto com cuba de vidro. O surgimento de pequenas bolhas na extremidade superior dos vasos, de colorao cinza claro, ser indicativo de fluxo bacteriano, conforme esquema da figura 9.

FIGURA 9 Esquema da tcnica de fluxo bacteriano 2.2.1. Plaqueamento em gar Esta tcnica semelhante quelas descritas de induo da esporulao e induo do crescimento micelial para isolamento de fungos fitopatognicos, utilizadas de acordo com o tipo de tecido afetado pelas bactrias. 2.2.2. Diluio a mesma tcnica apresentada para isolamento de fungos fitopatognicos, sendo que para bactrias existe outra alternativa prtica na rotina de laboratrio, que consiste em obter uma suspenso bacteriana e posteriormente diluir, por meio de estrias, no meio de cultura gar-nutritivo em placa de Petri. Inicialmente feita a desinfestao superficial do tecido lesionado com hipoclorito de sdio a 2% e retirada do excesso por lavagem com gua estril. Em um placa de Petri esterilizada depositar 3 a 4 gotas de gua estril e transferir para cada gota um pedao do tecido que foi desinfestado. Com basto de vidro ou bisturi



flambado triturar os tecidos para difuso das bactrias e deixar em repouso por 10 a 20 minutos. Com ala de platina flambada retirar uma gota da suspenso bacteriana e depositar no canto de um placa de Petri contendo gar-nutritivo e sem arranhar o meio de cultura traar estrias deslizando a ala de platina em ziguezague ou perpendicularmente. Outra variao a deposio de 3 a 5 pedaos de tecido lesionado em 5 ml de gua esterilizada em tubo de ensaio e deixar repousar de 10 a 30 minutos, transferir uma gota e fazer as estrias nas condies descritas anteriormente, conforme figura 10.

FIGURA 10 Esquema da tcnica de diluio. 2.2.3. Armadilha Esta tcnica tambm igual quela descrita para isolamento de fungos. 2.3. Extrao de nematides de solo e razes Os nematides, animais naturais do solo, podem ser extrados do solo ou de razes em funo de sua mobilidade. 2.3.1. Funil de Buckmann Esta tcnica indicada basicamente para extrao de nematides migradores, tanto do solo como das razes. O procedimento consiste em colocar uma quantidade



representativa de solo e raiz da planta atacada sobre um papel de filtro, montado sobre uma tela plstica na parte superior de um funil, contendo um tubo de ensaio com gua destilada na sua parte inferior, conforme ilustra a figura 11.

FIGURA 11 Esquema de montagem da tcnica do funil de Buckmann.

O solo deve ser levemente umedecido e aps 24 a 48 horas os nematides devero estar depositados no fundo do tubo de ensaio. O excesso de gua eliminado e o restante com os nematides colocado em vidro de relgio para coleta, tambm chamada de pescaria, dos nematides com estilete e montagem de lmina. 2.3.2. Peneiramento mido indicada tanto para nematides migradores como para nematides sedentrios, desde que no segundo caso as razes sejam previamente trituradas em liquidificador por 2 a 3 minutos com gua destilada para liberao dos nematides. A tcnica consiste em tomar uma amostra de solo e raiz da planta atacada, com cerca de 200 g, que deve ser misturada em aproximadamente 1000 ml de gua destilada e aps agitao deixar decantar por alguns minutos. Em seguida a mistura deve passar por uma peneira com 2 mm de malha, recolhendo o lquido peneirado e descartado o material retido nesta peneira.

O lquido peneirado deve ser passado em outra peneira de 0,25 mm, sendo o material retido na peneira coletado em vidro de relgio com auxlio de uma piseta com gua destilada. O lquido peneirado agora descartado. O vidro de relgio levado sob microscpio estereoscpio e os nematides so pescados, conforme figura 12.



FIGURA 12 Seqncia da tcnica de peneiramento mido. Quando o material apresentar grande quantidade de matria orgnica esta tcnica tambm pode ser associada tcnica de centrifugao em sacarose que consiste em resuspender o material retido na segunda peneira em um tubo de centrfuga com uma soluo de sacarose, preparada pela diluio de 454 g de sacarose e volume completado com gua para 1000 ml, at 1 cm da borda do tubo. O tubo ento submetido centrifugao a 2.000-3.000 rpm por 3 minutos. A suspenso ento novamente passada pela peneira de 0,25 mm, deixando-se o material orgnico no fundo do tubo centrfugo e efetuada a lavagem do material retido na peneira, com auxlio de uma piseta com gua destilada, para remoo da soluo de sacarose. O material retido ento coletado em vidro de relgio e o procedimento o mesmo da tcnica apresentada anteriormente. Uma seqncia da tcnica est esquematizada na figura 13. 2.3.3. Extrao direta Esta tcnica adequada para extrao de nematides sedentrios. Consiste em lavar as razes em gua corrente, secar com papel de filtro e depositar sob microscpio estereoscpio em um vidro de relgio. Com auxlio de dois estilete finos efetuado ento o dessecamento das galhas ou das leses nas razes at encontrar os nematides que so transferidos para outro vidro de relgio com gua destilada, seguido de montagem de lmina.



FIGURA 13 Seqncia da tcnica de centrifugao em suspenso de sacarose. 3. PROCEDIMENTO

Executar isolamento de fitopatgeno de material doente de sua livre escolha, colhido no campo, ou o apresentado em laboratrio, selecionando a tcnica que julgar adequada para operacionalizar. 4. RESULTADOS Entregar um tubo de ensaio com o fitopatgeno isolado, bem como a montagem de lmina/lamnula, identificao e desenho em relatrio dirigido. 5. QUESTES

1. Qual a importncia do isolamento de fitopatgenos? 2. Como a condio do material doente pode afetar o isolamento? 3. Qual o objetivo de se utilizar lcool a 70% e hipoclorito de sdio a 2% e a gua

esterilizada na tcnica de induo da esporulao? 4. Qual a garantia de sucesso quando utilizada a tcnica de induo do

crescimento micelial para isolamento de patgenos de tecidos carnosos?



5. Quais so as vantagens e desvantagens da tcnica de diluio para isolamento de patgenos do solo?

6. Qual a vantagem e a desvantagem da tcnica de armadilha sobre a tcnica de diluio para isolamento de patgenos do solo?

7. Em que se baseia a tcnica de armadilha ou isca? 8. Qual o princpio bsico de todas as tcnicas de isolamento de bactrias? 9. Quais so as principais caractersticas dos nematides fitfagos? 10. Qual o princpio envolvido na tcnica de peneiramento mido e na tcnica de

centrifugao em sacarose para extrao de nematides?

11. Qual o princpio da tcnica do funil de Buckmann para extrao de nematides do solo?

12. Quais as vantagens da tcnica de peneiramento mido sobre a tcnica do funil de Buckmann?




Material 1:

Subdiviso:

Classe:

Ordem:

Famlia:

Gnero:

Espcie:


Material 2:

Subdiviso:

Classe:

Ordem:

Famlia:

Gnero:

Espcie:


INOCULAO DE FITOPATGENOS


INOCULAO DE FITOPATGENOS 1. OBJETIVOS Conhecer e saber as tcnicas utilizadas para inoculao de fitopatgenos nos tecidos e rgos de hospedeiros florestais. 2. CONSIDERAES Inculo qualquer tipo de propgulo do patgeno que possa causar infeco nos tecidos da planta hospedeira. Os tipos mais comuns de propgulos dos fungos so hifas ou pedaos de hifas, esporos sexuais como osporo, zigsporo, ascsporo e basidisporo, alm de esporos assexuados como condio, esporangisporo, esclerdio e outros. J as bactrias propagam por suas clulas e algumas podem apresentar endsporos, enquanto os vrus so propagados por suas prprias estruturas virais e, finalmente, os nematides atravs dos ovos, larvas e indivduos adultos. Inoculao a transferncia do Inculo de sua fonte at os tecidos suscetveis do hospedeiro, onde dever estabelecer o processo infeccioso pela colonizao das clulas e tecidos, aps a penetrao. O tempo decorrido desde a inoculao at o aparecimento dos sintomas da doena no hospedeiro denominado de perodo de incubao ou perodo latente, enquanto o tempo que demora desde a inoculao at a reproduo do patgeno denominado de perodo de gerao. O potencial de inculo refere-se quantidade de propgulos que compe o inculo ou seja, quanto maior for o nmero de propgulos maior ser o potencial deste inculo. O aumento deste potencial resultar em mais leses e doena sobre o hospedeiro, at determinado limite, aps o que qualquer outro aumento pouco afetar na variao da quantidade de doena. O objetivo bsico da inoculao testar a patogenicidade do microorganismo atravs do estabelecimento dos postulados de Koch, mas tambm pode servir para determinar variedades resistentes, determinar rgos suscetveis ou no do hospedeiro, estudar formas de penetrao, estudar influncia de fatores externos no estabelecimento da infeco, entre outros. Alguns fatores podem afetar o sucesso da inoculao, como: a patogenicidade do microorganismo; a suscetibilidade do hospedeiro; as condies ambientais e o potencial de inculo.



Dentre estes fatores necessrio destacar que as condies ambientais favorveis no devem ser somente durante o processo de inoculao, mas devem durar ainda algum tempo aps a efetiva penetrao do patgeno no interior dos tecidos. Por esta razo esta tcnica sempre efetuada em ambiente controlado como casa-de-vegetao e cmaras de neblina ou cmaras midas, onde existe a possibilidade de manter alta umidade relativa e temperaturas adequada infeco, que pode demorar de 12 a 72 horas para doenas de folhas ou frutos e at semanas para doenas de galhos ou troncos.

Na prtica de inoculao possvel efetuar variaes que facilitem a penetrao do patgeno, normalmente atravs de ferimentos com estilete flambado ou escarificantes superficiais para eliminar a barreira que representam as clulas epidermais. 2.1. Inoculao de fungos Os fungos apresentam distintas formas de penetrao como aqueles que penetram diretamente pelo rompimento da epiderme, os que penetram por ferimentos ou aberturas naturais e aqueles que penetram por rgos especiais como o Fusarium sp. que pode penetrar pelo local de emisso de novas radicelas. O conhecimento prvio do tipo de penetrao facilita a execuo destas tcnicas. 2.1.1. Aplicao direta de miclio A aplicao direta do miclio fngico no campo de infeco, com disco de miclio, indicada principalmente para fungos de difcil esporulao, principalmente aqueles que atacam a parte foliar, podendo ser ainda utilizada para ramos, galhos e tronco, como o caso de Cryphonectria cubensis em Eucalyptus spp.. Consiste em retirar cilindros de meio de cultura com miclio fngico utilizando-se um fura-rolhas flambado e depositar esses cilindros sobre o local de inoculao na planta hospedeira que pode receber ou no ferimentos. Se a inoculao for em folhas estas devero ser cobertas com um saco plstico transparente contendo em seu interior um pedao de algodo embebido em gua esterilizada por 24 a 48 horas, aps o que o saco deve ser retirado. Deve ser evitada exposio direta ao sol para no queimar as folhas inoculadas.

Quando a inoculao efetuada em mudas embaladas, pode ser necessria uma armao de arame para sustentar o saco plstico. J a inoculao de tecidos lenhosos pode ser feita por aberturas na casca, com o mesmo fura-rolhas, com ferimento por estilete ou ferramenta cortante flambado ou ento sem qualquer tipo de ferimento, sendo o local igualmente coberto com plstico e um pedao de algodo embebido em gua esterilizada para garantir alta umidade. A figura 14 apresenta um esquema deste procedimento tcnico. 2.1.2. Atomizao com suspenso aquosa de esporos ou miclio A suspenso de esporos ou de miclio triturado indicada para inoculao de folhas, inflorescncias e frutos, tanto com parasitas obrigatrio como facultativos. Para os parasitas obrigatrios a coleta de esporos efetuada pela raspagem com pincel ou



escalpelo do local doente ou ainda a deposio dos tecidos com esporos diretamente sobre a gua esterilizada em um bquer. A concentrao dos esporos dever ser de 103 at 106 esporos por mililitro, o que feito com auxlio de hematocitmetro ou cmara de Neubauer. A inoculao feita por atomizao com pulverizador De Vilbs.

FIGURA 14 Seqncia da tcnica de aplicao direta de miclio em folha e em colo de mudas. Os parasitas facultativos devem ser previamente cultivados em placas de Petri com meio de cultura adequado e aps crescimento micelial o contedo da placa de Petri deve ser triturado com gua esterilizada em liquidificador. Quando o fungo apresentar esporulao, um pouco de gua esterilizada deve ser adicionada placa de Petri seguido de agitao para liberao dos esporos e a suspenso coletada em bquer para avaliao e correo da concentrao. A inoculao semelhante ao descrito anteriormente e a figura 15 apresenta um esquema deste procedimento tcnico. 2.1.3. Injeo com suspenso aquosa de esporos ou miclio A injeo com suspenso aquosa de esporos ou miclio no caule de plantas pode ser empregada para patgenos que causam murchas vasculares, como Ceratocystis ulmi e C. fimbriata, com auxlio de uma seringa. Previamente deve ser efetuada uma abertura longitudinal no caule, com 1 a 2 cm de comprimento, levemente inclinada, onde deve ser injetada a suspenso. O preparo da suspenso e a correo da concentrao so semelhantes ao descrito na tcnica anterior, conforme mostra a figura 16.



FIGURA 15 Seqncia da atomizao com suspenso de esporos ou miclio em folhas.

FIGURA 16 Seqncia da tcnica de injeo em tecido lenhoso.



2.1.4. Aplicao de esporos a seco A inoculao com aplicao de esporos a seco indicada principalmente para doenas como oidioses e ferrugens, causadas por parasitas obrigatrios, cuja fonte de inculo so as prprias plantas hospedeiras infectadas. A inoculao pode ser efetuada pela simples agitao de folhas doentes sobre as folhas sadias ou ento retirar os esporos da folha infectada com auxlio de um pincel seco que ser passado em seguida sobre a folha sadia a ser infectada. As folhas a serem inoculadas podero ser previamente nebulizadas com gua esterilizada, utilizando-se um pulverizador De Vilbs n. 15 e, em seguida, permanecero em cmara mida pelo perodo que for necessrio, at o aparecimento dos sintomas. 2.1.5. Infestao do solo com inculo Esta tcnica indicada para inoculao de fungos que atuam no sistema radicular ou no colo das plantas, alm das infeces sistmicas cujos patgenos penetram pelo sistema radicular, como Cylindrocladium spp., Botrytis sp., Fusarium spp., Armillaria mellea, entre outros. Consiste em produzir previamente mudas sadias em vasilhames contendo solo expurgado e a seguir infest-lo por irrigao com um volume conhecido de uma suspenso de inculo tambm de concentrao conhecida. Esta tcnica pode ser efetuada com ou sem ferimento do sistema radicular, o que pode ser feito por sucessivos furos perpendiculares no solo, prximo ao colo das plantas, com estilete flambado.

Uma variao desta tcnica a infestao do solo com o inculo seguido de semeadura ou transplante do hospedeiro, tambm com ou sem ferimento do sistema radicular. A figura 17 apresenta um esquema deste procedimento tcnico. 2.1.6. Imerso de razes em suspenso aquosa de inculo

Esta tcnica tambm indicada para fungos que atacam as razes e consiste na retirada das plantas que estavam crescendo em vasilhame com solo previamente expurgado, imerso das razes por 1 a 5 minutos em um bquer com suspenso de inculo e replantio. Outra opo a imerso de plntulas durante o processo de repicagem. A figura 18 apresenta um esquema deste procedimento tcnico.

De modo geral tanto o transplante como a repicagem so processos que causam algum tipo de ferimento no sistema radicular, mas este processo pode ser intensificado por ferimentos, com estilete flambado. 2.2. Inoculao de bactrias As bactrias caracterizam-se por no apresentar penetrao direta, s penetrando por ferimentos ou por aberturas naturais. Este fato implicar na necessidade de ferimentos ou de propiciar condies adequadas para o contato do inculo com as aberturas naturais no local de infeco do hospedeiro.



FIGURA 17 Seqncia da tcnica de infestao do solo com inculo.

FIGURA 18 Seqncia da tcnica de imerso de razes em suspenso aquosa de inculo.



As tcnicas utilizadas para inoculao de bactrias so: picada com estilete previamente mergulhado em suspenso bacteriana; injeo de suspenso de inculo; atomizao de suspenso aquosa de inculo, com ou sem ferimento e, finalmente, imerso das razes na suspenso de inculo. Exceto a primeira tcnica, especfica para bactrias, as outras so executadas de modo semelhante quele descrito para os fungos, observando-se que os meios de cultura para bactrias so diferentes, sendo mais fcil obter a suspenso bacteriana pelo cultivo da bactria em meios lquidos, como o caldo nutritivo. Quanto picada com estilete previamente mergulhado em suspenso bacteriana necessrio tambm criar um ambiente favorvel infeco, o que pode ser feito com uma cmara mida, tambm descrito anteriormente. 2.3. Inoculao de nematides Os nematides so inoculados atravs de seus ovos, larvas ou adultos. Aps extrao do solo e raiz; um volume, com concentrao conhecida dessas estruturas, inoculado em solo previamente expurgado, em vasilhames onde esto crescendo as plantas hospedeiras, sem necessidade de qualquer ferimento, considerando que este microorganismo apresenta o estilete com o qual ir atingir as razes do hospedeiro.

A execuo desta tcnica semelhante quela descrita para infestao do solo, utilizada tanto para fungos como bactrias. 3. PROCEDIMENTO

Executar a inoculao com o material apresentado em sala de aula ou isolado na prtica anterior, selecionando a tcnica mais adequada e respectivo local de infeco. 4. RESULTADOS Entregar um relatrio com observaes dirias anotando somente nos dias em que for observada presena ou variao de sintomas. 5. QUESTES 1. Qual a importncia de executar a inoculao de fitopatgenos? 2. Conceituar inculo, inoculao e potencial de inculo. 3. Descrever uma tcnica de inoculao para fungo fitopatognico. 4. Como possvel avaliar o potencial de inculo de fitopatgenos? 5. Quais so os cuidados que devem ser tomados na preparao do inculo e nas tcnicas de inoculao? 6. Quais fatores podem afetar a tcnica de suspenso aquosa de inculo?



7. Qual o objetivo de se utilizar cmara mida aps a inoculao? 8. Que tipo de caracterstica fundamental distinguir quando utilizada a mesma tcnica de inoculao para fungos e bactrias fitopatognicos? 9. Quando possvel afirmar que uma tcnica de inoculao foi satisfatoriamente executada? 10. Qual a importncia de se conhecer os perodos de incubao e inoculao de determinada doena e como estes valores podem ser determinados? 11. Que resultado pode evidenciar que a tcnica de inoculao foi mal executada? Justifique sua resposta.




RELATRIO DE INOCULAO Hospedeiro: Patgeno: Tcnica de inoculao: Data da inoculao: Tipo de inculo: Potencial: Localizao da(s) planta(s) inoculada(s): Parte vegetal inoculada: N. de plantas inoculadas: Outros procedimentos:

Data Sintoma(s) observado(s) / / / / / / / / / / Perodo de incubao: Perodo de gerao: Observaes:

FUNGOS INFERIORES - MASTIGOMYCOTINA E ZYGOMYCOTINA


FUNGOS INFERIORES - MASTIGOMYCOTINA E ZYGOMYCOTINA 1. OBJETIVOS Conhecer e saber as espcies de fungos inferiores de importncia patolgica para essncias florestais, bem como montar lminas, conhecer e identificar suas estruturas. 2. CONSIDERAES Os fungos constituem um reino de seres vivos, segundo Whittaker (1969), conforme o diagrama apresentado na figura 19. Tipicamente so seres heterotrficos com clula eucaritica e multinucleada; apresentam estrutura vegetativa filamentosa, denominada hifa, com presena ou no de septos e parede com quitina; um conjunto de hifas denominado miclio. A reproduo pode ser sexuada ou assexuada que pode ocorrer em corpos de frutificao denominados esporocarpos. A classificao que ser adotada a de AINSWORTH & BISBY (1983) que agrupa os fungos em duas divises: Myxomycota e Eumycota. A diviso Myxomycota contm sete classes: Acrasiomycetes, Ceratiomyxomycetes, Dictyosteliomycetes, Labyrinthulomycetes, Myxomycetes, Plasmodiophoromycetes e Protosteliomycetes, onde esto agrupados os fungos amebides e plasmdios. A segunda diviso apresenta cinco subdivises, denominadas: Ascomycotina, Basidiomycotina, Deuteromycotina, Mastigomycotina e Zygomycotina, sendo que os fungos inferiores esto agrupados nas subdivises Mastigomycotina e Zygomycotina. A tabela 2 resume esta classificao. Mastigomycotina apresenta trs classes: Chytridiomycetes, Hyphochytriomycetes e Oomycetes, enquanto Zygomycotina contm duas classes: Trichomycetes e Zygomycetes, sendo que para este estudo interessam somente as classes Oomycetes e Zygomycetes. Os fungos inferiores caracterizam-se por apresentar miclio cenoctico sem septo, multinucleado, geralmente intercelular e com haustrios, sem grampo de conexo e sem esclerdios. Os esporos assexuais so endgenos produzidos em esporngios, denominados esporangisporos, e a reproduo sexual pode ocorrer por isogamia ou heterogamia. Isogametas originam o zigsporo, tpico da classe zygomycetes; heterogametas, o masculino, anterdio, e o feminino, oognio, originam o osporo, da classe oomycetes. Tambm possvel observar a presena de esporos mveis, denominados de zosporos, e as estruturas de resistncia so os clamidsporos e especificamente em Zygomycotina podem ser encontrados os azigsporos.



FIGURA 19 Diagrama do sistema de cinco Reinos proposto por Whittaker em 1969, segundo AINSWORTH & BISBY (1983). TABELA 2 - Classificao do reino dos fungos segundo AINSWORTH & BISBY (1983).

DIVISO SUBDIVISO CLASSE Myxomycota No tem 1.1. Protosteliomycetes (falsos fungos) 1.2. Ceratiomyxomycetes 1.3. Dictyosteliomycetes 1.4. Acrasiomycetes 1.5. Myxomycetes 1.6. Plasmodiophoromycetes 1.7. Labyrinthulomycetes Eumycota 1. Mastigomycotina 1.1. Chytridiomycetes (fungos verdadeiros) 1.2. Hyphochytriomycetes 1.3. Oomycetes 2. Zygomycotina 2.1. Zygomycetes 2.2. Trichomycetes 3. Ascomycotina No reconhecidas 4. Basidiomycotina 4.1. Hymenomycetes 4.2. Gasteromycytes 4.3. Urediniomycetes 4.4. Ustilaginomycetes 5. Deuteromycotina 5.1. Coelomycetes 5.2. Hyphomycetes



Apesar da complexidade dos fungos inferiores, so poucas as espcies de interesse para a Patologia Florestal. As principais enfermidades causadas pelos fungos inferiores so o tombamento, tambm denominado "damping-off", queimas, podrides radiculares, podrides de sementes e aquelas conhecidas como mldios. A tabela 3 apresenta uma classificao simplificada das classes, ordens, famlias e alguns exemplos dos fungos inferiores de interesse patolgico, alm de uma chave simplificada apresentada na figura 20. 2.1. Ordem Peronosporales Nesta ordem est a famlia Pythiaceae como a mais importante por apresentar os gneros Pythium e Phytophthora, que se caracterizam como parasitas facultativos, com miclio intercelular com haustrios, presena de esporngios ovides a esfricos, que nascem isoladamente na extremidade do esporangiforo, como resultado da reproduo assexual; a reproduo sexual ocorre pela presena de heterogametas que originam o osporo. As espcies de Pythium caracterizam-se pela produo de vescula no esporngio, para onde passa a maior parte do contedo protoplasmtico onde so formados os zosporos, tpicos por apresentarem flagelos que permitem sua mobilidade em pelcula de gua. Aps sua liberao os zosporos nadam, deslocam-se, por alguns minutos no filme de gua no solo ou na superfcie do hospedeiro, incistam e posteriormente germinam atravs do tubo germinativo, produzem apressrio e penetram diretamente pela cutcula. Se isto ocorrer fora do hospedeiro o esporo no atingir o hospedeiro e poder morrer. A sobrevivncia destes fungos se d no solo em restos culturais ou em matria orgnica em decomposio, na forma de hifas ou osporos. Estes fungos so importantes por causarem tombamento de plntulas na sementeira, em vrias essncias florestais, principalmente quando ocorre condio de alta umidade, associada a alta densidade de sementes ou plntulas; so exemplos: Pythium ultimum em Eucalyptus spp. e Pythium spp. em espcies de Pinus. A figura 21, a seguir, ilustra um ciclo de vida tpico de fungos do gnero Pythium. As espcies do gnero Phytophthora so responsveis por inmeras doenas de grande importncia, como a requeima da seringueira e a podrido parda do cacau causada por P. palmivora; o cancro do painel da seringueira, Phytophthora spp.; tombamento de Eucalyptus spp., P. palmivora e P. cinnamomi e, na Austrlia, o "jarrah-die-back" de E. marginata, causado por P. cinnamomi. 2.2. Ordem Glomales (Endogonales) A famlia Endogonaceae tambm importante, no por apresentar fungos de importncia patolgica, mas sim por apresentar fungos que formam endomicorriza vesicular-arbuscular, MVA, com as razes de plantas superiores e, praticamente, com a maioria das espcies, excetuando-se umas poucas famlias, como Pinaceae e Abietaceae, que formam ectomicorriza. Alguns autores preferem a denominao apenas de MV, pois nem todos os fungos desta associao apresentam arbsculos.



TABELA 3 - Classificao simplificada de classes, ordens, famlias e alguns exemplos dos fungos inferiores. CLASSE ORDEM (*) FAMLIA EXEMPLO

Chytridiomycetes 1. Chytridiales (9) 1.1. Synchytriaceae Synchytrium endobioticum 2. Harpochytriales (1) 3. Blastocladiales (4) 4. Monoblepharidales (2) Hyphochytriomycetes 5. Hyphochytriales (3) Oomycetes 6. Peronosporales (4) 6.1. Pythiaceae Phytophthora sp. e Pythium sp. 6.2. Peronosporaceae Peronospora spp. e Plasmopara spp. (mldio pulverulento) 6.3. Albuginaceae Albugo spp. (ferrugem branca) 7. Lagenidiales (3) 8. Leptomitales (2) 9. Saprolegniales (5) Zygomycetes 1. Glomales (1) 1.1. Endogonaceae Acaulospora spp., Entrophospora spp., Gigaspora spp.,

Glomus spp., Endogone spp., Modicella spp., Sclerocystis spp. e Scutellispora spp.

2. Mucorales (9) 2.1. Mucoraceae Choanephora spp. Mucor spp. e Rhizopus spp. 3. Entomophthorales (3) parasitas de insetos e nematides 4. Dimargaritales (1) 5. Kickxellales (1) 6. Zoopagales (4) parasitas de fungos e nematides Trichomycetes 7. Harpellales (2) 8. Asellariales (1) 10. Amoebidiales (1) 11. Eccrinales (3) (*) O nmero entre parnteses indica a quantidade de famlias apresentada em cada Ordem.



FIGURA 20 - Chave simplificada dos fungos inferiores de importncia para a Patologia Florestal.



A MVA uma associao simbitica obrigatria, com benefcios para ambos simbiontes. O fungo beneficiado pelo habitat disponvel e ambos so beneficiados nutricionalmente, o vegetal principalmente pelo aumento da disponibilidade de fsforo, sendo que o vegetal pode ter uma proteo maior contra patgenos do sistema radicular, alm de resistir melhor passagem do fogo e seca, quando comparado com planta da mesma espcie, em condies semelhantes, mas no micorrizada. Estes fungos caracterizam-se por apresentar infeco intracelular, com a presena de vesculas e, em alguns casos, arbsculos, caractersticas estruturais que determinam sua denominao, sendo os arbsculos relacionados com as trocas nutricionais com o citoplasma celular e as vesculas estruturas de armazenamento de energia, principalmente na forma de lpides. A reproduo sexual por isogametas origina o zigsporo e a reproduo assexual ocorre formando clamidsporo ou azigsporo, sendo que o azigsporo um tipo especial de reproduo assexual por gemulao da hifa prxima vescula, com migrao do contedo nutricional para este esporo, sendo comum observar a presena de vesculas vazias remanescentes, aps a produo do azigsporo. Os gneros desta famlia que formam MVA so: Glomus, Acaulospora, Entrophospora, Gigaspora [Endogone], Sclerocystis, e Scutellispora , alm dos gneros: Endogone e Modicella. Entre as espcies arbreas que formam MVA, podem ser citadas so: Araucaria cunninghamii, Cedrela odorata, Delonix regia, Eucalyptus spp., Hevea spp., Jacaranda mimosaefolia, Michelia champaca, Chorisia speciosa, Tectona grandis e Theobroma cacao, entre outras.

FIGURA 21 - Ciclo de vida tpico de fungos de gnero Pythium, segundo GALLI (1994).



2.3. Ordem Mucorales Os gneros Rhizopus, Mucor e Choanephora pertencem famlia Mucoraceae, com importncia patolgica, sendo que Rhizopus sp., apesar de ser um fungo saprfita, um importante apodrecedor de sementes de essncias florestais armazenadas de maneira inadequada, geralmente em alta umidade e alta temperatura, alm de causar podrido mole em frutos e tubrculos ricos em carbohidratos. Alm disso, Rhizopus sp. um importante contaminante de laboratrio, juntamente com o fungo Monilia sp., da subdiviso Deuteromycotina, e tambm contamina sementes em testes de germinao, juntamente com os fungos Nigrospora sp., Aspergillus sp. e Penicillium sp., tambm da subdiviso Deuteromycotina. 3. PROCEDIMENTO Examinar as culturas e os materiais apresentados, no microscpio estereoscpio e montar lminas para conhecer o esporangiforo, esporngio, esporangisporo, vesculas, zosporos e outras estruturas dos fungos inferiores. 4. RESULTADOS Desenhar e identificar as estruturas observadas, em relatrio prprio, entregando juntamente com as lminas montadas. 5. QUESTES COMPLEMENTARES 1. Quais as principais doenas causadas pelos fungos inferiores em espcies florestais? 2. Porque normalmente as sementes so armazenadas em condies de baixo teor de umidade e baixa temperatura? 3. Como caracterizada morfologicamente a endomicorriza do tipo vesicular-arbuscular, MVA, ou simplesmente MV e qual a sua importncia para espcies florestais? 4. Quais as caractersticas reprodutivas dos fungos denominados inferiores? 5. Citar, pelo menos, duas doenas diferentes das relacionadas neste relatrio, em espcies florestais, causadas por fungos inferiores. 6. Porque importante o controle de condies ambientais no processo de produo de mudas com semeadura seguida de repicagem? 7. Quais so as estruturas responsveis pela sobrevivncia dos fungos inferiores durante a estao seca? 8. Quais as caractersticas que diferenciam as ordens e famlias dos fungos inferiores, de importncia patolgica?




Material 1:

Subdiviso:

Classe:

Ordem:

Famlia:

Gnero:

Espcie:


Material 2:

Subdiviso:

Classe:

Ordem:

Famlia:

Gnero:

Espcie:


FUNGOS SUPERIORES - ASCOMYCOTINA


FUNGOS SUPERIORES - ASCOMYCOTINA 1. OBJETIVOS Conhecer e saber as espcies de fungos desta subdiviso de importncia patolgica para essncias florestais, alm de montar lminas, conhecer e identificar suas estruturas. 2. CONSIDERAES Esta subdiviso o maior grupo dos fungos contendo cerca de 28.650 espcies, em 2.770 gneros. Estes fungos apresentam miclio septado, esporos assexuais exgenos na fase conidial e esporos sexuais endgenos em asco. Alm de fungos com miclio desenvolvido tambm existem alguns unicelulares, como as leveduras. As estruturas de resistncia so os clamidsporos e ascsporos. Na fase sexual podem produzir diferentes corpos de frutificao, denominados genericamente de ascomas, onde esto arranjados os ascos, apresentando os seguintes tipos: cleistotecial, peritecial, apotecial e estromaticial. Os gametas envolvidos na reproduo sexual, basicamente por contato gametangial, so o anterdio e ascognio, que do origem aos ascsporos, geralmente em nmero de 8, dentro de cada asco, mas que podem ter de 1 at mais de 1000 ascsporos. A presena ou no de oprculo, operculado e inoperculado, e tipo de tnica, unitunicado ou bitunicado, nos ascos, arranjo dos ascos, tipo de ascoma e presena ou no de camada himenial, himnio, so as caractersticas mais importantes para classificao desses fungos. A figura 22 apresenta os ascomas e outros tipos de estruturas apresentados por fungos desta subdiviso. Nesta subdiviso encontram-se grande nmero de saprfitas, formadores de liquens, fermentadores, produtores de antibiticos, comestveis, simbiontes que formam ectomicorriza, alm de importantes patgenos para essncias florestais. A maioria dos fungos imperfeitos da subdiviso Deuteromycotina apresenta sua fase sexual nesta subdiviso, conforme exemplos apresentados na tabela 4, a seguir. Anteriormente, estes fungos eram agrupados em uma nica classe denominada Ascomycetes e respectivas ordens, famlias e assim por diante; posteriormente, com base no arranjo dos ascos nos ascomas, estes fungos foram agrupados em seis classes: Hemiascomycetes, Plectomycetes, Pyrenomycetes, Discomycetes, Laboulbeniomycetes e Loculoascomycetes.



FIGURA 22 - Ascomas tpicos e estruturas de reproduo sexual e assexual da subdiviso Ascomycotina, segundo AGRIOS (1979). Atualmente existem inmeras classificaes, sendo complexa a adoo de um sistema, conforme AINSWORTH & BISBY (1983) que citaram doze diferentes classificaes de 1931 a 1983, sugerindo a adoo de 37 ordens sem agrup-las em classes, conforme a tabela 5 que apresenta uma classificao simplificada dessas, ordens, famlias e alguns exemplos de interesse patolgico. TABELA 4 - Associao de gneros de Ascomycotina com Deuteromycotina.

FASE PERFEITA (SEXUAL) FASE IMPERFEITA (ASSEXUAL) Cryphonectria sp. Phomopsis sp. Ceratocystis sp. Graphium sp. Microcyclus sp. Fusicladium sp. Cucurbitaria sp. Diplodia sp. e Phoma sp. Elsinoe sp. Sphaceloma sp. Glomerella sp. Colletotrichum sp. Calonectria sp., Giberella sp., Nectria sp. Fusarium sp., Cylindrocladium sp. Mycosphaerella sp. Cercospora sp., Cladosporium sp.,

Septoria sp. Eurotium sp. e Sartoria sp. Aspergillus sp. Eupenicillium sp. e Talaromyces sp. Penicillium sp.



TABELA 5 - Classificao simplificada de ordens, famlias e alguns exemplos de fungos da subdiviso Ascomycotina. ORDEM (*) FAMLIA EXEMPLO

1. Coryneliales (1) 1.1. Coryneliaceae Corynelia sp. 2. Diaporthales (5) 2.1. Gnomoniaceae Endothia sp. (Cytospora sp.) 2.2. Valsaceae Cryphonectria sp. e Diaporthe sp. (Phomopsis sp.) e Valsa sp. 3. Dothideales (52) 3.1. Aulographaceae Aulographina sp. 3.2. Botryosphaeriaceae Botryosphaeria sp. (Botryodiplodia sp., Dothiorella sp. e Lasiodiplodia sp.) 3.3. Capnodiaceae Capnodium sp.(Polychaeton sp.) - Fumagina 3.4. Cucurbitariaceae Cucurbitaria sp. (Diplodia sp. e Phoma sp.) 3.5. Elsinoeaceae Elsinoe sp. (Sphaceloma sp.) 3.6. Dothideaceae Microcyclus sp. e Mycosphaerella sp. (Cercospora sp.. e Septoria sp.) 3.7. Masarinaceae Massarina sp. (Coniothyrium sp.) 3.8. Melanommataceae Melanomma sp. (Aposphaeria sp.) 3.9. Meliolaceae Meliola sp. 3.10. Pleosporaceae Pleospora sp. (Alternaria sp. e Phoma sp.) 3.11. Pyrenophoraceae Cochliobolus sp. e Pyrenophora sp. (Drechslera sp. e Helminthosporium sp.) 4. Elaphomycetales (1) 4.1. Elaphomycetaceae Elaphomyces sp. ectomicorriza 5. Endomycetales (4) 5.1. Saccharomycetaceae Saccharomyces sp. levedo 6. Erysiphales (1) 6.1. Erysiphaceae Erysiphe sp. (Oidium sp. mldio pulverulento) e Uncinula sp. 7. Eurotiales (3) 7.1. Trichocomaceae Eupenicillium sp., Eurotium sp. e Talaromyces sp. (Aspergillus sp.) 8. Helotiales (11) 8.1. Sclerotiniaceae Sclerotinia sp. (Sclerotium sp.) 9. Hypocreales (2) 9.1. Hypocreaceae Giberella sp. (Cylindrocladium sp.) e Nectria sp. (Fusarium sp.) 10. Ophiostomatales (1) 10.1. Ophiostomataceae Ceratocystis sp. (Cephalosporium sp. e Graphium sp.) 11. Pezizales (13) 11.1. Pezizaceae saprfitas em madeira e ectomicorriza 12. Polystigmatalaes (1) 12.1. Phyllachoraceae Apiosphaeria sp., Catacauma sp. e Glomerella sp. (Colletotrichum sp. e

Gloeosporium sp.) e Phyllachora sp. 13. Rhytismatales (4) 13.1. Hypodermataceae Davisomycella sp. e Laphodermium sp.



TABELA 5 - Classificao simplificada de ordens, famlias e alguns exemplos de fungos da subdiviso Ascomycotina (continuao). 14. Sordariales 14.1. Chaetomiaceae Chaetomium sp. 14.2. Sordariaceae Sordaria sp. 15. Sphaeriales (4) 15.1. Xylariaceae Rosellinia sp. e Xylaria sp. 16. Taphrinales (2) 16.1. Taphrinaceae Taphrina sp. 17. Arthoniales 18. Ascosphaerales 19. Caliciales 20. Clavicepitales 21. Cyttariales 22. Ciatrypales 23. Graphidales 24. Gyalectales 25. Gymnoascales 26. Laboulbeniales 27. Lecanidiales decompositores de madeira 28. Lecanorales 29. Microascales 30. Opegraphales 31. Ostropales saprfitas de madeira e caule de herbceas 32. Peltigerales 33. Pertusariales 34. Pyrenulales saprfitas em madeira 35. Spathulosporales 36. Teloschistales 37. Verrucariales (*) O nmero entre parnteses indica a quantidade de famlias apresentada em cada Ordem.



Aqui sero apresentadas algumas caractersticas e somente exemplos das ordens com fungos de importncia patognica e aqueles que podem formar ectomicorriza: 2.1. Ordem Coryneliales Apresenta apenas uma famlia Coryneliaceae, ex.: Corynelia sp., parasita de folhas de rvores da famlia Podocarpaceae e conferas. No constatado no Brasil. 2.2. Ordem Diaporthales (Valsales) Os fungos apresentam ascoma peritecial com rostro, imerso em estroma e asco unitunicado. Contm cinco famlias, destacando-se duas: Gnomoniaceae (Obryzaceae), ex.: Endothia sp., agente de cancros em espcies arbreas e a famlia Valsaceae (Diaporthaceae), ex.: Cryphonectria cubensis [Diaporthe cubensis], agente do cancro do Eucalyptus sp. e Valsa sp., agente de cancro em diversas espcies arbreas. 2.3. Ordem Dothideales (Asterianales, Capnodiales, Chaetothyriales, Dothiorales,

Hysteriales, Melanommatales, Meliolales, Myriangiales, Perisporiales, Pleosporales e Pseudosphaeriales)

Nesta ordem so classificados fungos que caracterizam-se por apresentar asco

bitunicado em lculos dentro de tecido estromtico. a ordem que apresenta maior nmero de famlias, cinqenta e duas, destacando-se diversas delas com fungos agente de doenas florestais:

Na famlia Aulographaceae, ex.: agente de mancha de folha de Eucalyptus sp., Aulographina eucalipti, cuja fase anamrfica Thyrinula eucalyptina, enquanto na famlia Botryosphaeriaceae, ex.: Botryosphaeria sp. presente em cancros arbreos com estrias que pode ser de causa fisiolgica. que agrupa as formas perfeitas da fase anamrfica Botryodiplodia sp., Lasiodiplodia sp., Dothiorella sp. e Fusicoccum sp..

Na famlia Capnodiaceae, ex.: Capnodium sp. responsvel pela fumagina dos citros e diversas espcies de plantas; na famlia Cucurbitariaceae, ex.: Cucurbitaria sp., que na fase imperfeita apresenta-se como Diplodia sp. e Phoma sp. enquanto na famlia Elsinoeaceae, ex.: Elsinoe heveae (Sphaceloma heveae) agente da antracnose maculada da seringueira e Elsinoe sp. agente da verrugose dos citros.

Em Dothideaceae (Mycosphaerellaceae), ex.: Microcyclus ulei [Dothidella ulei] o agente do mal das folhas da seringueira, cuja fase imperfeita em Deuteromycotina conhecida como Fusicladium macroscoporum [Aposphaeria ulei]; A figura 23 apresenta o ciclo de vida do agente do mal das folhas de Hevea sp.

A espcie Mycosphaerella pini [Scirrhia pini] fase perfeita de Dothistroma septospora [D. pini], o agente da queima das acculas de Pinus sp. importante destacar que o gnero Mycosphaerella pode tambm ser a fase perfeita dos gneros Cercospora, Ramularia, Ascochyta, Phoma e Septoria, entre outras espcies. Em Massarinaceae, ex.: Massarina sp., cuja fase anamrfica Coniothyrium sp.; Na famlia Melanommataceae, ex.: Melanomma sp., cuja fase anamrfica Aposphaeria sp.; Em Meliolaceae, ex.: Meliola sp.; Em Pleosporaceae, ex.: Pleospora sp. cuja fase anamrfica



pode ser Alternaria sp.; e finalmente Pyrenophoraceae, ex.: Pyrenophora sp., e Cochliobolus sp. fases perfeitas de Helminthosporium sp., Drechslera sp., e Curvularia sp..

FIGURA 23 - Ciclo do mal das folhas de Hevea sp., causado por Microcyclus ulei, segundo GASPAROTTO & FERREIRA (1989). 2.4. Ordem Elaphomycetales Apresenta uma nica famlia Elaphomycetaceae, ex.: Elaphomyces sp., destaca-se por apresentar espcies que podem formar ectomicorriza com espcies arbreas. 2.5. Ordem Endomycetales (Ascoideales, Cephaloascalaes, Dipodascales,

Spermophthorales);

Esta ordem no tem importncia patolgica para espcies florestais, contudo, a famlia Saccharomycetaceae contm os fungos denominados leveduras como o Saccharomyces cerevisiae. 2.6. Ordem Erysiphales Esta ordem apresenta apenas a famlia Erysiphaceae, ex.: Erysiphe sp., agente de doena conhecida como mldio pulverulento, cuja forma imperfeita o gnero Oidium sp., razo pela qual a doena tambm conhecida como oidiose. Esta doena comum em



viveiros de Eucalyptus sp., em mudas passadas, mas j foram constatados alguns surtos em plantios adultos. Em Mato Grosso sua ocorrncia comum em uruc

apostila_patologiaflorestal_caldeira1999

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