UNIVERSIDADE DE SO PAULO INSTITUTO DE QUMICA

BIOQUMICA QBQ 0215 FARMCIA NOTURNO

ProfessoresNadja C. de S. P. Lardner (nadja@iq.usp.br) coordenadora Fabio L Forti (flforti@iq.usp.br) Ricardo J. Giordano (giordano@iq.usp.br) Mrio Jos Politi (mjpoliti@usp.br)

Reginaldo Almeida da Trindade

Monitor

2009

Apresentao QBQ 0215 Curso de Bioqumica para estudantes do curso noturno da Faculdade de Cincias Farmacuticas. Perodo: Segundo semestre de 2009. Horrio: 19:00 s 23:00 s quartas- e quintas-feiras; 8:00 s 12:00 aos sbados Local: Salas 9 e 10 do B6 Trreo IQUSP Neste curso as atividades estaro distribudas em: I-aulas expositivas conforme os temas constantes no cronograma; II-estudos dirigidos em sala de aula, com superviso dos professores e monitores (PE); e III- resoluo de exerccios para consolidao dos temas apresentados, em Grupos de Discusso (GD) que sero realizados aos sbados. As quartas e quintas-feiras sero apresentadas aulas expositivas, seguidas de perodos de estudo e exerccios para fixao das matrias. Destes exerccios um ser selecionado no dia para entrega individual pelos alunos. Este exerccio constar para avaliao de participao. Desta maneira, o esquema geral para as quartas- e quintasfeiras ser: 19:00 s 20:30 aula expositiva 20:30 s 20:45 intervalo 20:45 s 22:00 perodo de estudos e exerccios 22:00 s 23:00 discusso e Exerccio do Dia Aos sbados sero apresentadas aulas expositivas de integrao, seguidas de GDs. Os grupos de discusso consistem de exerccios monitorados para o aprofundamento do conhecimento pelos estudantes. Os temas da semana sero, ento, avaliados atravs de Prova tipo GD para ser realizada por grupos de 5-6 alunos; a mdia aritmtica de todas as Provas GD (GD) compor a nota final, como descrito abaixo. O cronograma para os sbados ser: 8:00 s 9:45 Aula de Integrao 9:45 s 10:00 intervalo 10:00 s 12:00 Prova GD Alm das atividades descritas acima, teremos a preparao e apresentao de um seminrio por grupo, como distribudo no programa. Os temas de seminrio sero apresentados e distribudos no incio do curso, com um perodo de cerca de dois meses para a preparao das apresentaes. As apresentaes sero aos sbados, comforme o cronograma, e devem ser de 25-30 min; sugerimos que os grupos abordem seus temas 2

como propostas de projetos de pesquisa. Os semirios sero avaliados e comporo a nota final, como descrito abaixo.

Avaliao

O critrio de avaliao ser feito de acordo com a Frmula, MF = [P1 + P2 + P3 + P4 + (GD + S)/2]/5 Onde: MF = mdia final P1-4 = provas 1 a 4 GD = mdia de provas GD S = nota de seminrio A mdia mnima para aprovao Cinco. Para os alunos que perderem alguma prova teremos uma Prova Substitutiva ao final do curso. Nesta Prova constar toda a matria do semestre.Bibliografia

Portugus: Bioqumica Bsica - A. Marzzoco & B.B. Torres - Ed. Guanabara Koogan 2a ed. - 1999. Princpios de Bioqumica - A.L. Lehninger, D.L. Nelson & M.M. Cox - Ed. Sarvier - 1995. Bioqumica - J. M. Berg, J.L. Tymoczko & L. Stryer - W.H.Freeman and Company 5th ed. 2002. Fundamentos de Bioqumica D. Voet, J. G. Voet & C. W. Pratt Artmed Editora- 2000. Ingls: Lehninger Principles of Biochemistry - D.L. Nelson & M.M. Cox - Worth Publishers - 3rd ed. -2000. Biochemistry - J. M. Berg, J.L. Tymoczko & L. Stryer - W.H.Freeman and Co. - 5th ed. 2002. Biochemistry - D. Voet & J.G. Voet - John Wiley & Sons - 2004. Biochemistry - C. K. Mathews & K.E. van Holde - The Benjamin/Cummings Publishing Co. - 1996. 3

Principles of Biochemistry - H.R. Horton, L.A. Moran, R.S. Ochs, J.D. Rawn & K.G Scrimgeour Prentice Hall - 1993. Principles of Biochemistry - G.L. Zubay, W.W. Parson & D.E. Vance - WCB Publishers 1995.

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PROFESSORES:Prof. Dr. Nadja Cristhina de Souza P. Lardner (coordenador) Bloco 10 Sup., Sala 1065 Fone: 3091-3810 r 242 Prof. Dr. Fabio Luis Forti Bloco 9 Inf., Sala 908 Fone: 3091-3810 r 216 Prof. Dr. Ricardo Giordano Bloco 10 Inf., Sala 1011 Fone: 3091-3810 r 233 Prof. Dr. Mrio Jos Politi Bloco 12 Sup., Sala 1258 Fone: 3091-3877

MONITORES: Reginaldo Almeida da Trindade e-mail:registrindade@gmail.com

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Cronograma

2O SEMESTRE FARMCIA 2008 QBQ 215

Agosto 19/08 P 20/08 P 22/08 P 26/08 P 27/08 P 29/08 P Setembro 02/09 P 03/09 P 05/09 R 09/09 P 10/09 P 12/09 P 16/09 P 17/09 P 19/09 P 23/09 P 24/09 P 26/09 P 30/09 P Outubro 01/10 P 03/10 P 07/10 P 08/10 P 10/10 P 14/10 15/10 17/10 21/10 F 22/10 F 24/10 F 28/10 29/10 F 31/10 F Novembro 04/11 F 05/11 F 07/11 F 11/11 R 12/11 R 14/11 P

dias quarta quinta sbado quarta quinta sbado quarta quinta sbado quarta quinta sbado quarta quinta sbado quarta quinta sbado quarta quinta sbado quarta quinta sbado quarta quinta sbado quarta quinta sabado quarta quinta sabado quarta quinta sbado quarta quinta sabado

Mdulos Apresentao / gua, tampes, pH do sangue Aminocidos: Funes e Propriedades Aula integrao & GD 1 Estrutura e funo de Protenas I Estrutura e funo de Protenas II Aula integrao & GD 2 Enzimas - conceitos gerais Cintica enzimtica Aula integrao & GD 3 cidos Nuclicos e Estruturas Acares e Polissacardeos Aula integrao & GD 4 Prova 1 Lipdeos e membranas Aula integrao & GD 5 Colesterol, partculas carreadoras e sais biliares Bioenergtica e ATP Aula integrao & GD 6 Gliclise Ciclo de Krebs Aula integrao & GD 7 Fosforilao Oxidativa Prova 2 GD 8 e Seminrios (2) Semana da Farmcia (no haver aula) Semana da Farmcia (no haver aula) Semana da Farmcia (no haver aula) Ciclo das Pentoses Neoglicognese GD 9 e Seminrios (2) Dia do funcionrio pblico (no haver aula) Metabolismo de Glicognio GD 10 e Seminrios (2) cidos Graxos - Degradao cidos Graxos - Sntese GD 11 e Seminrios (2) Metabolismo de Amino cidos Prova 3 GD 12 e Seminrios (2) 6

18/11 R 19/11 R 21/11 R 25/11 R 26/11 N 28/11 R Dezembro 02/12 N 03/12 N 05/12 N 09/12 N 10/12 N 12/12 N 16/12 N 17/12 N P = Politi F = Fabio R= Ricardo N = Nadja

quarta quinta sbado quarta quinta sbado quarta quinta sbado quarta quinta sbado quarta quinta

Ciclo da Uria Metabolismo de Purinas e Pirimidinas GD 13 e Seminrios (2) Fotossntese Integrao do Metabolismo GD 14 e Seminrios (2) Fluxos de materiais em Humanos,Transporte em Membranas Diabetes e Hormnios GD 15 e Seminrios (2) Metabolismo Muscular Transduo de Sinais Prova 4 Aula de integrao e GD 16 Prova substitutiva

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Temas para os Seminrios: 1. As reaes qumicas e a origem da vida 2. Importncia da estrutura das protenas para as propriedades fsicas de materiais biolgicos 3. Enzimas como alvos farmacuticos 4. Alcoolismo 5. Obsidade e desnutrio 6. Sndrome Metablica e diabetes 7. Osteoporose e Hipercalcemia 8. O metabolismo e a pirmide alimentar 9. Doenas do metabolismo de purina/pirimidinas 10. Ictercias 11. Hiperlipidemia e Doenas Cardiovasculares 12. O nitrognio e a vida 13. Fotossntese e o impacto biolgico do ciclo de carbono 14. Cancer e estratgias anti-neoplasicas 15. Membranas como alvos farmacuticos 16. Doenas mitocondriais

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H2O e Sistemas TAMPO

1. A molcula de gua, H2O, apresenta um ngulo de 104,5 graus entre as duas ligaes O-H, dando-lhe um carter altamente polar. Alm disso, o tomo de O possui 2 pares de eltrons livres, permitindo a formao de ligaes (ou pontes) de H entre molculas vizinhas. Esta estrutura d gua propriedades fsicas e qumicas de enorme importncia biolgica. 2. A gua se ioniza atravs de uma reao cido-base: H2O + H2O H3O++ OHA reao cido-base se caracteriza pela troca de prtons entre pares conjugados de cidos e bases. A gua pode se comportar como cido e como base: AH + H2O B + H2O Por exemplo: K = [H3O+] [A-] [AH] [H2O] K mede a afinidade relativa das bases, de cada par cido-base conjugados (AH/ A- e H3O+/ H2O), por prtons. Fala-se comumente em constante de dissociao de um cido (Ka), significando: Ka = K [H2O] = [H+] [A-], onde [H2O] essencialmente constante (55 M). [AH] 3. [H ] a concentrao hidrogeninica e os valores de [H+] para a maioria das solues so muito baixos e difceis de serem comparados. Um valor mais prtico conhecido como pH: pH = - log [H+]. como pode-se obter por analogia e 1/[H+] = 1/K x [A-]/[AH] pH = - logK + log [A-]/[AH] - log K = pK pH = pK + log [A-]/[AH]+

H3O+ + ABH + OH-

Estas so reaes de equilbrio, s quais correspondem constantes de equilbrio definidas.

Conclui-se que pK numericamente igual a pH da soluo na qual as concentraes molares do cido e sua base conjugada so iguais (ie log [A-]/[AH] = 0). A igualdade pH = pK + log [A-]/[AH] conhecida como Equao de HendersonHasselbach. 4. cidos so classificados de acordo com sua fora relativa, ou seja, de acordo com sua capacidade de transferir um prton para a gua. cidos com constantes de dissociao menores do que aquela de H3O+ (que, por definio, igual a 1 em solues aquosas (v se consegue confirmar porqu!)) so s parcialmente ionizados em solues aquosas e so conhecidos como cidos fracos (K < 1). J os cidos fortes tm constantes de dissociao maiores que a de H3O+, sendo quase completamente ionizados em solues aquosas (K>1). 5. Tampes so sistemas aquosos que tendem a resistir a variaes no seu pH quando pequenas quantidades de cido (H+) ou base (OH-) so adicionadas. Um sistema tampo

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consiste de um cido fraco (o doador de prtons) e sua base conjugada (o aceptor de prtons). comum encontarr os seguintes smbolos para representar um cido (AH ou BH+) e sua base conjugada (A ou B:) 6. A adio de cido forte (H+) ou base forte (OH-) a uma soluo aquosa de um cido fraco, por exemplo, cido actico (pKa = 4,76), causa pequenas variaes de pH, se a soluo estiver a um pH prximo do pK do cido. Este comportamento define um tampo cido-base. 7. O pH do sangue mantido atravs de um sistema de reaes envolvendo a Hemoglobina e o CO2, ie o on HCO3-. Exerccios 1 1) Defina cidos e bases no conceito de Brnsted, mostrando exemplos. 2) a) Qual o pH das solues 0,1 M dos cidos fortes HCl e HNO3? b) Usar a equao HendersonHasselbach para calcular o grau de dissociao dos cidos fracos i) H2S (Ka=1x10-7) e ii) cido actico (Ka=2x10-5) em solues 0,1 M. Qual o respectivo pH dessas solues? 3) Esquematize a curva de titulao de 1 L de uma soluo de 0,1 M H3PO4 com uma soluo de 10 M NaOH, colocando pH (eixo y) em funo de volume de base adicional (eixo x). Indicar os pontos na titulao (volumes de NaOH) em que o pH equivale cada um dos pKas do cido. 4) Indique como se pode preparar 1 L de um tampo a pH=7,0, capaz de manter o pH estvel com adio de 10 mL de HCl 0,1M, dispondo-se das solues: a) 1M H3PO4 b) 1M cido actico c) 1M NaOH 5) Desenhe a estrutura do gelo, mostrando pontes de hidrognio entre molculas de gua. O que acontece quando o gelo derrete? Porque a gua lquida 4oC mais densa do que o gelo 0oC? 6)Discuta as propriedades de gua em comparao a outros solventes e a molculas isoeletrnicas. 7) Desenhe a estrutura do NaCl no estado slido e tambm no estado aquoso, neste ltimo, destaque suas interaes com gua.-

8) Discuta como o sistema tampo do sangue mantm o pH estvel em condies de acidose e de alcalose.

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AMINOCIDOS1. Aminocidos, bases purnicas e pirimidnicas, nucleosdeos e nucleotdeos, hexoses (como glicose), so componentes monomricos dos principais polmeros biolgicos, ou seja, protenas, cidos nuclicos (DNA e RNA) e polissacardeos (glicognio, amido e celulose). Aminocidos, bases, nucleosdeos e nucleotdeos so em geral muito solveis em gua e possuem grupos funcionais que participam em reaes cido-base. Glicose tambm altamente solvel em gua, mas no participa em reaes cido-base. i. H 20 aminocidos que compem protenas (Tabela 1), todos mostrando a frmula geral: R+

H3N

C H

COO-

on dipolar ou zwitterion encontrado em gua pH 7

2. Aminocidos podem ser agrupados em classes com base nas propriedades dos seus grupos radicais (R), em particular sua polaridade ou tendncia de interagir com gua em pH biolgico ( 7,0). 3. Todos os aminocidos livres comportam como cidos poliprticos. Quando um aminocido cristalino dissolvido em gua, ele pode agir como um cido ou como uma base. O grupo carboxlico mostra um pK em torno de 2,0, enquanto o grupo amino tem um pK entre 9,0 e 10,0. Portanto, no pH fisiolgico (pH 7,0), a maioria das molculas de todos os aminocidos est na forma de ons dipolares (zwitterions). Chama-se pI de um aminocido o pH da soluo na qual suas molculas possuem carga lquida nula. Na cadeia lateral (-R) os aminocidos apresentam grupos funcionais, entre os quais existem grupos cido-base. 4. O carbono dos aminocidos, excetuando-se a glicina, assimtrico, fazendo com que estas substncias tenham atividade ptica e, portanto, apresentem pares de ismeros pticos.

Exerccios 2 1) Quais dos aminocidos tm dois carbonos quirais e qual deles no possui isomeria ptica? 2) Mostre porque a seguinte forma no-inica de um aminocido no pode ser encontrada em soluo aquosa. R H2N C H COOH

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3) O etanol no tem carter cido em gua, enquanto fenol e cido actico se dissociam em soluo aquosa, sendo o cido actico (pK=4,8) mais forte que o fenol (pK=10). Como se pode explicar o comportamento destes trs compostos em gua a partir de suas estruturas moleculares? 4) Esquematize a curva de titulao da glicina com NaOH a partir de pH=1 e do cido asprtico com HCl a partir de pH=11. Coloque o pH na ordenada e, na abscissa, a quantidade de equivalentes de cido ou base forte. 5) a) Quais os pontos isoeltricos de: glicina (pKs=2,5 e 9,5), cido asprtico (pKs=2,5; 4,0 e 9,5), lisina (pKs=2,5; 9,5 e 10) e histidina (pKs=2,5; 6,0 e 9,5)? b) Calcular as cargas lquidas (aproximadas) do cido asprtico, lisina ou histidina nos seguintes pHs: pH 1, pH 8, pH 11. 6) Tentar classificar os aminocidos em termos da natureza qumica dos seus grupos radicais: a) ionizveis ou no ionizveis, b) cidos ou bsicos, c) polares ou no polares, d) hidroflicos ou hidrofbicos, e) alifticos ou aromticos, f) lineares ou ramificados e g) pequenos e grandes. 7) Na Tabela 1 indicar: a) O cdigo de letra nica para cada aminocido e b) os pKR dos aminocidos com grupos radicais ionizveis.

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Tabela 1: Estrutura dos 20 aminocidos encontrados em protenas

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ESTRUTURA PRIMRIA DE PROTENAS1. A descrio da estrutura das protenas dividida em quatro nveis de organizao: estrutura primria, secundria, terciria e quartenria. 2. A estrutura primria se refere seqncia de aminocidos que compem a protena. Tratase, portanto, da estrutura de ligaes covalentes. A principal ligao covalente entre aminocios a ligao peptdica. Os aminocidos podem formar polmeros atravs da ligao do grupo carboxila de um aminocido com o grupo amino de outro. Esta ligao carbono-nitrognio chamada ligao peptdica, obtida por excluso de uma molcula de gua. Quimicamente, a formao da ligao peptdica pode ser representada pela seguinte equao:

Esta reao, como esta escrita, jamais ocorre nos seres vivos. A unio dos aminocidos por ligao peptdica no feita por reao direta entre eles, mas atravs de um complexo aparato de sntese protica, que inclui ribossomos, cidos ribonuclicos, vrias protenas e enzimas num processo chamado traduo. A equao mostra apenas o resultado liquido do processo. 3. As propriedades da ligao peptdica impem restries ao dobramento do polmero formado. A ligao peptdica, apesar de ser representada por um nico trao de ligao, tem caractersticas intermediarias entre uma ligao simples e uma dupla ligao, devido s interaes entre duas formas de ressonncia.

4. A conseqncia desse carter parcial de dupla ligao que no h possibilidade de rotao em torno da ligao peptdica. Assim sendo, os quatro tomos dos grupamentos que participam da ligao peptdica ficam dispostos em um plano rgido, constituindo o que se costuma chamar de grupo peptdico ou unidade peptdica (vide retngulos) Notar tambm que os dois carbonos alpha (C) vizinhos de cada ligao peptdica tambm se encontram o plano.

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Marzzocco & Torres, Bioqumica Bsica.

O polmero formado pode, portanto, ser visualizado como uma cadeia constituda por unidades planares (unidades peptdicas), unidas entre si com uma articulao flexvel: o carbono . Esta cadeia chama-se cadeia polipeptdica. As protenas podem ser formadas por uma ou mais cadeias polipeptdicas. 4. Todavia, existem pontos de dobramento entre as unidades peptdicas rgidas, graas a possibilidade de rotao em torno das ligaes com o carbono alfa (N-C e C-C), que so ligaes efetivamente simples (vide figura acima). Estas ligaes so chamadas phi () e psi () respectivamente. 5. A cadeia polipeptdica pode ser dividida entre a cadeia principal e as cadeias laterais (grupos R) ligados aos carbonos alfa.

Exerccios 3 1) Defina estrutura primria, secundria, terciria e quaternria de uma protena, dando exemplos. 2) Esquematize a estrutura de uma ligao peptdica. 3) a) Desenhar o tripeptdeo Ala-Asp-His. b) Calcular o seu pI. c) Calcular sua carga lquida em pH 1, pH 6 e pH 12.

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4) Com os dados abaixo, defina a seqncia do peptdeo analisado: a) hidrlise cida total resultou em: Arg, Tyr, Leu, Ala, Glu Lys, Ser e Pro; b) dansilao e hidrlise produziram: dansil-Leu; c) dois ciclos consecutivos de degradao de Edman liberaram, respectivamente Leu e Tyr; d) tripsina liberou 2 peptdeos cujas composies, aps hidrlise cida total, foram, respectivamente (Tyr, Leu, Arg) e (Ser, Glu, Pro, Ala Lys); e) carboxipeptidase A no liberou nada, mas carboxipeptidase C liberou Ser; f) endopeptidase V8 liberou o tripeptdeo Lys-Pro-Ser e um pentapeptdeo que, tratado com carboxipeptidase C, liberou Glu.

5) Mostre a reao de xido-reduo da cistena que importante na estrutura de peptdeos.

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ESTRUTURA SECUNDRIA E TERCIRIA DE PROTENAS

1. A estrutura secundria definida pela conformao local do esqueleto de ligaes peptdicas que compe o eixo da protena. Esta conformao local pode ser explicitamente expressa atravs dos ngulos phi () e psi (). Em geral, certas combinaes de ngulos phi () e psi () so permitidas enquanto outras no so permitidas devido a impedimentos estricos entre tomos de grupos vizinhos. Este princpio pode ser resumido num diagrama de Ramachandran (Figura 1).

Figura 1: Diagramas de Ramachandran. Esquerda: Estruturas secundrias correpondentes s combinaes estericamente permitidas para angulos phi e psi. Direta: ngulos observados para todas as ligaes em 12 protenas com estruturas de alta resoluo determinadas por cristalografia.

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Figura 2: -hlice.

Figura 3: Folha pregueada.

2. H duas estruturas secundrias principais: -hlice (Figura 2) e folha pregueada (Figura 3), que so estruturas organizacionais regulares e repetitivas. Estas duas estruturas podem ser caracterizadas por combinaes de angulos phi e psi (Figura 1) adotadas pela cadeia principal. Alm de -hlice e folha , as protenas globulares mostram tambm alas de formas definidas, mas irregulares e no repetitivas. 5. A estrutura terciria descreve o arranjo tridimensional da cadeia principal da protena, incluindo a disposio espacial das cadeias laterais dos aminocidos. H muitas possibilidades de arranjos tridimensionais para a estrutura terciria das protenas. a. As propriedades bioqumicas e biolgicas de uma protena so determinadas pelo arranjo tridimensional de sua cadeia, isto , pela sua estrutura terciria. Logo, nas condies fisiolgicas a protena adquire uma estrutura terciria bem definida e necessria sua funo, que conhecida como estrutura nativa. O desarranjo da estrutura terciria leva perda de funo da protena, processo que genericamente chamado de desnaturao. b. Em protenas pequenas da estrutura primria define a estrutura terciria nativa da protena. Nestes casos os processos de desnaturao e renaturao da estrutura da protena so reversveis. A estrutura nativa a conformao da protena de menor nvel de energia livre (G) e alcanada espontaneamente (processo exergnico). O exemplo clssico desse comportamento dado pela protena Rnase A, uma enzima que no seu estado nativo catalisa a hidrlise de RNA. Para protenas grandes o processo de desnaturao irreversvel e o fenmeno de alcance da conformao nativa complexo e ainda mal entendido.

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c. A estrutura tridimensional das protenas mantida por ligaes fracas como pontes de H, ligaes inicas e interaes hidrofbicas. A exceo a ponte de dissulfeto (-S-S-) que, apesar de covalente, importante na manuteno da conformao nativa de protenas. d. Protenas possuem muitos grupos ionizveis atravs de reao cido-base, cujos pKs variam enormemente. O pI de uma protena definido como pH da soluo na qual a carga lquida da molcula de protena nula. 4. Existem muitas maneiras diferentes para apresentar estruturas tridimensionais de protenas.

Estrutura de mioglobina de baleia, uma protena globular tpica

Topografia de superfcie

Fita (azul = H)

modelo space-filling19

6. A Hb e a Mb so protenas com funes parecidas. Ambas apresentam afinidade pelo O2 molecular. A HB o carreador do O2 pelo sistema arterial e capilares enquanto a Mb seqestra o O2 em nvel do tecido muscular. Servindo como depsito para a contrao do msculo em aerobiose. A curva de interao Hb/O2 tem carter sigmoidal (alostrica) emquanto a da Mb hiperblica. Esta diferena permite um controle fino da troca de O2 entre artrias e msculo. Em paralelo a curva de afinidade O2/Hb entre a me e o feto apresenta maior afinidade pela Hb fetal permitindo a troca eficiente de O2 para o feto. 7. Efeito Bohr. Exerccios 4 1) Distinga estrutura secundria e terciria de uma protena. D exemplos. 2) Descreva -hlice e folha pregueada. Aponte as diferenas essenciais entre estas formas de estrutura secundria encontradas em peptdeos. 3) Discuta os dois diagramas de Ramachandran apresentados na Figura 1 e relacione-os com as estruturas apresentadas nas Figuras 2 e 3. 4) Descreva a experincia clssica de Anfinsen com a enzima ribonuclease A, indicando sua concluso principal. Qual o papel das pontes de dissulfeto na manuteno da estrutura nativa (terciria) da ribonuclease? Conceitue estrutura nativa e desnaturao de protenas, mostrando o que isso tem a ver com a atividade enzimtica da ribonuclase A. Que funo termodinmica promove espontaneamente a transio da ribonuclease de desnaturada para nativa? 5) Duas protenas, apesar de terem diferenas quanto a alguns de seus aminocidos, so capazes de desempenhar a mesma funo. Explique como isto possvel. 6) Pesquisar informaes sobre a estrutura de hemoglobina. Descrever a sua estrutura terciria e quartenria. Descrever as mudanas na estrutura quartenria que acontecem devido ligao de oxignio. 7) O que efeito hidrofbico e qual o seu papel na manuteno da estrutura terciria das protenas? Qual o fator preponderante no efeito hidrofbico: o entlpico ou o entrpico? Explique qualitativamente sua resposta. 8) Discuta porque uria e cloreto de guanidina desorganizam a -hlice.

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CINTICA ENZIMTICA

1. 2.

Enzimas so catalisadores biolgicos cuja natureza qumica proteica. A natureza proteica das enzimas lhes proporciona alto grau de especificidade. A grande maioria das reaes biolgicas no ocorre, ou ocorrem a velocidades baixssimas nas condies fisiolgicas de pH e temperatura. Logo, as reaes biolgicas, em geral, necessitam de catlise para ocorrer, isto , necessitam de enzimas. Para cada reao h uma enzima especfica.

3.

Na reao genrica A B a direo espontnea da reao dada pela variao de energia livre, .G0, conforme esquematizado no grfico da Figura 5.

Energia Livre (G)

* G10# G0#-1 *

Estado de transio da reao no catalisada

Estado de transio da reao catalisada

Estado Inicial (S) (Reagentes)

G0#1cat G0

G0#-1cat

Coordenada de ReaoFigura 6. Variao de energia livre (G) na reao genrica A B. G0 uma constante que se relaciona com a constante de equilbrio da reao pela expresso G0=2.3 RTlogK. Por outro lado, as velocidades das reaes AB e BA ou, respectivamente, as constantes de velocidade k1 e k-1 no dependem do G0 da reao, mas dos, respectivos, G10 e G-10, que por sua vez s dependem da energia livre (G) do estado de transio (energias de ativao). A enzima (catalisador) no muda o G0 da reao, pois catalisadores no interferem com os estados inicial e final das reaes, mas mudam o caminho da reao e, por conseqncia diminuem a energia do Estado de Transio.

Estado Final (P) (Produtos)

4.

Uria uma substncia muito estvel em gua, mas que pode ser rapidamente decompostas por hidrlise se a reao for catalisada pela enzima urease:

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H2N C=O + H2O H2N

UREASE

CO2 + 2 NH3

Trata-se de reao de primeira ordem, onde v=k1[uria], apesar da equao estequiomtrica indicar a existncia de 2 reagentes. Esta reao pode ser acompanhada em tubo de ensaio no laboratrio. As Tabelas 3 e 4 mostram resultados obtidos na prtica.

Tabela 3. Cintica da enzima urease.Tubo no 1 2 3 4 5 6 Tempo (minuto) 0 2 4 6 8 10 NH3(moles) 0 0.084 0.168 0.252 0.336 0.420

Concentrao da uria: 5 mM; Concentrao da urease: 0,1 g/mL; Volume de reao: 1 mL; Temperatura: 30oC.

Os dados da Tabela 3 mostram que a velocidade da reao constante ao longo do tempo estudado. J os dados da Tabela 4 mostram variaes relativamente complexas da velocidade de reao em funo da concentrao da uria para um perodo de 10 minutos de reao. Os dados da Tabela 4 permitem medir experimentalmente duas constantes importantes das reaes enzimticas Vmax (velocidade mxima) e Km (constante de Michaelis) atravs da equao v = Vmax[S] / (Km + [S]).

Tabela 4. Cintica da enzima urease. Tubo n 1 2 3 Uria (mM) 2,5 5,0 10 Urease (g) 0,1 0,1 0,1 NH3 (moles) 0,21 0,42 0,59

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4 5 6 7 8 9

15 25 50 100 200 200

0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 -

0,67 0,73 0,78 0,79 0,78 0,00

Os significados de Vmax e Km so definidos no modelo de cintica enzimtica proposto por Michaelis e Menten no incio do sculo passado onde ES um complexo enzima substrato formado antes de converso do substrato em produtos.

E + S

k1 k-1

ES

kcat

E + P

A derivao da equao Michaelis Menten: v = Vmax[S] / (Km + [S]) = kcat[Et][S] / (Km + [S]) apresentada na prxima pgina.

23

Velocidade naquela [S]

Velocidade mxima

Concentrao do substrato

Kdiss aparente do Complexo enzima-substrato

Frao de Etot na forma de ES = [S]/(Kdiss + [S])

24

5.

Substncias que reduzem a atividade de uma enzima so chamadas inibidores. Em termos gerais, inibidores podem atuar em vrias maneiras. Aqui vamos focalizar em inibidores que ligam reversivelmente com a enzima com constantes de dissociao KI. Estes tipos de inibidores podem atuar em duas maneiras diferentes: a) Eles podem competir com o substrato para o mesmo stio de ligao na superfcie da enzima livre. Neste caso so chamados inibidores competitivos ou b) Eles podem ligar em outro stio na enzima livre (E) e/ou no complexo enzima-substrato (ES). Estes inibidores so chamados inibidores mistos/nocompetitivos se podem ligar a E e ES e so chamados acompetitivos se ligam somente ao complexo ES.

6. 7.

A presena de um inibidor competitivo se manifesta em uma mudana no valor do Km: Km obs = Km(1+[I]/KI) = Km Km e no valor do Vmax: Km obs = Km(1+[I]/KI)/(1+[I]/KI) = Km Vmax obs = Vmax / onde (1+[I]/KI) A presena de um inibidor misto/no-competitivo se manifesta em uma mudana nos valores do

8.

A presena de um inibidor acompetitivo se manifesta em uma mudana nos valores do Km e no valor do Vmax: Km obs = Km / (1+[I]/KI) = Km Vmax obs = Vmax /

Exerccios 5 1) As velocidades de uma reao enzimtica foram determinadas para diversas concentraes de substrato, conforme a tabela abaixo: [S] (M) 5 10 20 50 100 200 V (mol/L.min) 22 39 65 102 120 135

Os grficos de, respectivamente, V em funo de [S] e 1/V em funo de 1/[S] podem servir para determinar Km e Vmax? Como?

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2) Numa reao enzimtica, o valor de Vmax, mas no o de Km diretamente proporcional concentrao da enzima? Justifique. 3) A velocidade inicial de uma reao enzimtica em funo da concentrao do substrato S, na ausncia e na presena dos inibidores A e B segue os dados da tabela abaixo:

[S] (M) 1,25 1,67 2,5 5,0 10,0

VELOCIDADE (MOL/L X MIN) SEM I1,72 2,04 2,63 3,33 4,17 Com Inibidor A 0,98 1,17 1,47 1,96 2,38 Com Inibidor B 1,01 1,26 1,72 2,56 3,49

a) Qual a classe dos inibidores A e B? b) Determine Vmax e Km na ausncia e presena dos inibidores. 4) Utilizando-se dos valores de Km e Vmax determinados nas questes 1 e 3, esquematize num mesmo grfico, para as duas reaes, V em funo da concentrao de substrato, expressa em mltiplos de Km. No eixo dos Y ajuste arbitrariamente as escalas para cada reao fazendo coincidir os pontos de V = Vmax. Como so as curvas para duas reaes? Justifique o resultado.

5) O que so enzimas alostricas? Defina utilizando-se de grficos esquemticos de V em funo de [S], compare uma enzima michaeliana (da questo 4) com uma enzima alostrica positiva e com uma enzima alostrica negativa.

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MECANISMOS DE CATLISE ENZIMTICA

1. Catlise cido/base catlise por transferncia de protons. A catlise cida um processo no qual a transferncia parcial de prtons de um cido para o estado de transio diminui a energia livre do estado de transio de uma reao. A reao pode ser tambm estimulada por uma catlise bsica se a taxa de reao aumentar com a abstrao de um prton por uma base. Algumas reaes podem ser sujeitas simultaneamente a ambos os processos, caracterizando uma catlise cido-base. Em reaes catalisadas por enzimas os cidos e bases catalisadores so grupos especficos ionizveis da enzima localizados no seu stio ativo/stio cataltico. A mutarrotao da glicose (Figura 6) e a catlise da ribonuclease pancretica bovina A (RNase A) (Figura 7) so exemplos de catlise cido-base.

Figura 6. Mutarrotao da glicose.

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Figura 7. Catlise da ribonuclease pancretica bovina A (RNase A).

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2. Catlise covalente envolve a acelerao da taxa de reao atravs da formao transiente de uma ligao covalente substrato-catalisador. A descarboxilao do acetoacetato um exemplo deste processo:

No primeiro estgio desta reao, a amina faz um ataque nucleoflico ao grupo carbonila do acetoacetato formando uma base de Schiff (ligao imina).

OH

-

O tomo de nitrognio protonado do intermedirio covalente atua como um receptor de eltrons reduzindo assim o carter de alta energia do enolato. A catalise covalente possui estgios nucleoflicos e eletroflicos. A catlise covalente pode ser dividida conceitualmente em trs estgios: 1) A reao nucleoflica entre o catalisador e o substrato formando uma ligao covalente. 2) A perda de eltrons do centro da reao pelo catalisador agora eletroflico. 3) A eliminao do catalisador que uma reao essencial para retornar ao estgio 1.

Exerccios 6 1) Examine a reao de hidrlise de RNA catalisada pela RNase A para verificar que se trata de um mecanismo de catlise cido-base. 2) Faa o grfico da velocidade de uma reao enzimtica em funo do pH para uma enzima estvel entre pHs 3 e 12, considerando que o substrato no possui grupos ionizveis e a

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atividade enzimtica exige no centro ativo uma carboxila (pKa = 5) desprotonada e um grupo amino (pKa = 9) protonado. 3) Definir catlise eletrosttica. Procure um exemplo de uma enzima que utiliza esta estratgia. 4) Descrever o mecanismo empregado pelas serina proteases (tripsina, quimiotripsina, elastase, etc) para hidrolisar ligaes peptdicas. Descrever todas as etapas da reao. Quais tipos de catlise so empregados em cada uma das etapas?

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CIDOS NUCLEICOSTendo em vista que no curso do prximo semestre, dedicado Biologia Molecular, neste modulo daremos nfase nicamente aos aspectos estruturais de RNA e DNAs. Conforme j bem estabelecido estes polmeros (polieletrlitos) so constitudos por um corrimo que consiste de riboses e deoxiriboses grupo fosfato, e pendente `a estes encontram-se as bases pricas e pirimidnicas. Nos RNAs estas bases so C, T, A e U j nos DNAs as bases so C, T, A e G. 1) A estrutura do DNA de dupla fita e do RNA fita simples. 2) Nucleosdeos so denominados os monmeros compostos de purinas ou pirimidinas aos acares ribose e deoxiribose (deoxinucleosdeo). 3) Nucleotdeos (deoxinucleotdeos) so ster de fosfato de nucleosdeos (deoxinucleosdeos). 4) A fita de DNA em -hlice apresenta as denominadas cavernas (grooves) maior e menor. Stios estes de ligao de molculas. 5) as bases constituem espcies de degraus, sendo as interaes entre T-A estabilizada por 2 pontes de H e C-G por trs pontes. 6) O teor de CG e AT determina a temperatura de fuso das cadeias ie a temperatura de separao das cadeias. Esta temperatura acorre abruptamente. 7) O DNA encontra-se altamente enovelado no ncleo da clula. 8) O fenmeno de hipercromismo ajuda detectar a temperatura de melting das cadeias e permite fazer a hibridizao de cadeias. 9) Molculas de DNA so extremamente longas e frgeis. A simples sonicao leva fragmentao em vrias sub-partculas.

Exerccios 7 1) Esboce as estruturas do DNA e do RNA. 2) Por que o DNA chamado cido DESOXIribonucleico e o RNA chamado somente ribonucleico? 3) Como deve ser a viscosidade de solues de DNA enovelado e aps a fuso?

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4) Qual deve ser o efeito de sais na questo 3? 5) Considerando seja um DNA linear ou circular como possvel enovelar o DNA em tal dimenses?

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ACARES E POLISSACARDEOS: ESTRUTURA E FUNO

1. Os carboidratos so compostos que apresentam a frmula emprica (CH2O)n (n> ou = 3), sendo funcionalmente poliidroxialdedos ou poliidroxicetonas. Os carboidratos mais simples so os monossacardeos, que se apresentam na formas de aldoses ou cetoses, conforme o grupo funcional carbonlico que possuem, isto , respectivamente, aldedo ou cetona. H duas trioses: o gliceraldedo, uma aldotriose, e a diidroxiacetona, uma cetotriose (Figura 8). O gliceraldedo apresenta um carbono (C2) assimtrico, dando origem a dois ismeros opticos, as formas D e L (Figura 9). J a diidroxiacetona no possui C assimtrico e, por isso, no mostra esse tipo de isomeria. Os outros monossacardeos podem ser derivados pelo crescimento da cadeia destas duas trioses. A Figura 10 mostra a famlia D derivada do Dgliceraldeido, cujas frmulas estruturais planares obedecem as regras de Fisher.

Figura 8. Gliceraldedo e diidroxiacetona.

Figura 9: Carbono quiral ou carbono assimtrico.

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Figura 10. Famlia D derivada do D-gliceraldedo.

Figura 11. Ciclizao da D-glicose.

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O aumento da cadeia do monossacardeo leva ao aparecimento de novos Cs assimtricos e, portanto mais ismeros estruturais, tambm chamados estereoismeros. O nmero de ismeros dado pela expresso 2n onde n o nmero de carbonos assimtricos. Por exemplo, em aldoexoses h 4 Cs assimtricos, logo o nmero de ismeros 24 =16, sendo 8 da forma D e 8 da forma L. Mas, as estruturas lineares como representadas na Figura 10 tanto para pentoses como para hexoses so poucos estveis em soluo, formando estruturas cclicas segundo a reao mostrada na Figura 11. Esta uma reao bem conhecida da qumica orgnica, pela qual um lcool (OH) faz uma adio nucleoflica a carbonila de um aldedo, formando um composto de condensao conhecido como semiacetal. No caso do exemplo da Figura 11 a hexose a D-glicose e, como a figura mostra, a ciclizao leva ao aparecimento de outra isomeria estrutural devido s duas posies possveis do OH do C1 em relao ao plano do anel, gerando os ismeros e . importante enfatizar que o OH do C1 no quimicamente equivalente aos demais OHs que so alcolicos, sendo por isso chamado de OH glicosdico. A existncia do OH glicosdico permite que todos os monossardeos sejam oxidados em condies brandas pelo reagente de Fehling, uma reao de oxido-reao na qual os OHs alcolicos no participam.

Figura 12. Nomenclatura para estereoismeros.

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2. Conforme exemplificado na Figura 12 h uma nomenclatura especificamente designada para distinguir pares de estereoismeros. Enantimeros possuem estruturas isomricas que so uma imagem especular da outra, por exemplo, cada membro da famlia D de hexoses mostrada na Figura 10 tem um, e, somente um, enantimero na famlia L. So epmeros pares de estereoismeros que diferem apenas pela configurao de um C assimtrico. So anmeros os dois ismeros resultantes da posio do OH glicosdico do C1 na estrutura cclica da hexose. E, finalmente, so denominados diastereoismeros pares de ismeros que no caem em nenhuma das categorias anteriores. 3. Ligao glicosdica: os monossacardeos podem se apresentar na forma de oligo ou polissacardeos, onde os monmeros so ligados atravs de ligaes glicosdicas. Oligossacardeos so formados por um pequeno nmero de monossacardeos, resultantes da condensao de um OH glicosdico com um OH alcolico, como exemplificado abaixo pela dimerizao de duas molculas de -glicose por ligao 1-4, originando o dissacardeo maltose:

Caso a ligao glicosdica envolva a condensao dos dois OHs glicosdicos como o caso da trealose, uma 1-1-diglicose, o dissacardeo no pode ser oxidado pelo reagente de Fehling (dissacardeo no redutor). J a maltose, que possue um OH glicosdico livre um dissacardeo redutor, sendo oxidado pelo reagente de Fehling. 4. Polissacardeos so polmeros constitudos de centenas ou milhares de resduos de monossacardeos, geralmente glicose, formando cadeias lineares, como a celulose (1-4poliglicose), ou cadeias ramificadas, como o glicognio e o amido. O glicognio altamente ramificado, as suas cadeias lineares so formadas por ligaes 14-glicosdicas e suas ramificaes decorrem de ligaes 1-6-glicosdicas (Figura 13). O glicognio apresenta uma nica extremidade redutora livre (C1 no resduo final na ltima molcula de glicose da cadeia) e inmeras extremidades no redutoras. A partir das extremidades no redutoras h acrscimo ou retirada de resduos do polmero. Portanto, as molculas de glicognio no tm tamanhos definidos.

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Figura 13. Glicognio Poli (1-4) (1-6) glicose. 5. Ciclodextrinas so compostos derivados da unio de molculas de glicose por ligao 1-4, gerando sistemas cclicos denominados em funo do nmero de unidades de glicose de , e CDs macrociclos estes que tem, 6, 7 e 8 unidades glicosdecas. Estes compostos so produzidos por enzimas extra-celulares. Estes ciclos tem a cavidade interna relativamente hidrofbicas e permitem a incluso de vrios compostos, na ordem estes so benzeno, naftaleno e antraceno. Estes compostos tem grande aplicao em Farmcia e na indstria de alimentos.

Exerccios 8 1) Desenhe o conjunto dos ismeros de D-aldoses de 6 C, atravs das frmulas de projeo de Fisher. Quantos epmeros possue uma hexoaldose. Identifique todos os epmeros de D-glicose. Existem pares enantiomricos na famlia D de monossacardeos. Explique. 2) Descreva o fenmeno da mutarrotao de D-glicose, incluindo as reaes qumicas pertinentes com as respectivas frmulas estruturais dos reagentes. O que este fenmeno tem a ver com os conceitos de C anomrico e anmeros. 3) Compare os dissacardeos maltose e sacarose, identificando a ligao glicosdica em cada caso. Por que maltose redutora e sacarose no . 4) Analise a estrutura do glicognio. Procure destacar as vantagens e desvantagens da funo deste polmero como composto de reserva energtica.

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5) Verifique as principais caractersticas dos polissacardeos estruturais, comparando celulose, quitina e glicosaminoglicanos (estes tambm chamados mucopolissacardeos). 6) A poro de natureza sacardica de algumas glicoprotenas pode servir como stio de reconhecimento celular. Para desempenhar esta funo, os oligossacardeos ou glicoprotenas devem ter a capacidade de formar um grande nmero de diferentes estruturas. Qual dos dois pode produzir uma maior variedade de estruturas: oligopeptdeos compostos de cinco resduos de diferentes aminocidos ou oligossacardeos compostos de cinco resduos de diferentes monossacardeos? Explique. 7) Frutose, o principal acar do mel, comumente usada como adoante de alimento. Este acar na forma -D-piranose provavelmente a substncia mais doce conhecida. A forma -Dfuranose muito menos doce. a) Quais so as estruturas da -D-frutopiranose e -D-frutofuranose? b) A doura do mel diminui ao deix-lo em repouso e ao mesmo tempo aumentando a temperatura. Explique. 8) Interconverso das formas de D-galactose. Uma soluo recm-preparada da forma de Dgalactose (1g/ml em um tubo polarimtrico de 1 dm) mostra uma rotao ptica de + 150,7o. Quando deixada em repouso por um longo perodo de tempo a rotao decresce gradualmente at atingir um valor de equilbrio igual a + 80,2o. Em contraste, uma soluo recm-preparada (1g/ml) da forma mostra rotao tica de apenas +52,8o . Quando esta soluo deixada em repouso por vrias horas a rotao aumenta at o valor de equilbrio igual a +80,2o , valor idntico quele observado para a -D-galactose. a) Escreva as frmulas de projeo de Haworth das formas e da D-galactose. Qual caracterstica distingue as duas formas? b) Por que a rotao de uma soluo recm-preparada da forma decresce gradualmente com o tempo? Explique por que solues das formas e (de concentraes iguais) atingem o mesmo valor de rotao ptica no equilbrio? c) Calcule a composio percentual das duas formas de galactose no equilbrio. 9) Esquematize as , e CDs indicando o tamanho da cavidade e a forma de cone truncado. Como voc acha que o processo de formao de complexos de incluso? Qual a cintica dos mesmos?

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CIDOS GRAXOS, LPIDEOS & MEMBRANAS 1. Lpides ou lipdeos so substncias biolgicas solveis em solventes orgnicos, como clorofrmio e metanol e, praticamente, insolveis em gua. Os lpides compreendem: a) cidos graxos, em geral na forma de triacilglicerois; b) glicerofosfolpides; c) esfingolpides; d) colesterol e derivados. 2. cidos graxos so cidos carboxlicos com longas cadeias hidrocarbonadas, encontrados na forma de tri-esteres de glicerol. A maioria possui um nmero par de C, predominando os de 16 C (cido palmtico) e os de 18 C (cido olico). Grande parte apresenta dupla ligao (insaturado) e muitos so poli-insaturados. 3. As propriedades fsicas dos cidos graxos dependem do grau de insaturao da cadeia hidrocarbonada. As molculas dos cidos graxos saturados so muito flexveis, facilitando a atrao e coeso entre si. Duplas ligaes entre C impe rigidez cadeia, tornando-a menos flexvel e limitando a coesividade entre as molculas do cido graxo. Em conseqncia disso, a temperatura de fuso (transio de fase slido/lquido) diminui com o grau de insaturao dos cidos graxos. 4. Os triacilglicerdeos desempenham um papel de reserva de energia metablica. Algumas de suas propriedades fsico-quimicas so ideais para essa funo: a) elevado grau de reduo de seus C, maximizando a quantidade de energia livre liberada na oxidao e b) alta hidrofobicidade, permitindo estocagem livre de gua (estoques anidros). No por acaso que os triglicerdeos compem cerca de 90% da reserva de energia metablica e tambm da dieta lipdica dos humanos. 5. A reserva de triacilglicerdeos do tecido adiposo mobilizada atravs da hidrlise a glicerol e cidos graxos livres, catalisada por lpase especfica. Os cidos graxos livres so carregados pela corrente sangunea na forma de complexos com albumina, que representa 50% da protena do plasma. 6. Molculas anfiflicas, como lipdeos com uma nica cauda hidrofbica, cidos graxos livres e detergentes, quando em soluo aquosa e acima de um limiar de concentrao (concentrao micelar crtica ou cmc) formam agregados globulares chamados micelas. 7. Por outro lado, lipdeos com duas caudas hidrofbicas, como glicerofosfolipdeos e esfingolipdeos, tendem a formar bicamadas lipdicas, que so a base estrutural das membranas biolgicas.

Micela

Bicamada39

8. As membranas biolgicas so compostas por protenas associadas a uma matriz de bicamada lipdica. As protenas que compe as membranas pertencem a duas categorias: a) integrais ou

Modelo de mosaico fludo para membranas biolgicasintrnsecas e b) perifricas ou extrnsecas. Este arranjo estrutural foi originalmente proposto em 1972 por Singer e Nicholson como o modelo de mosaico fludo para as membranas biolgicas, que foi plenamente confirmado por resultados experimentais estruturais e funcionais.

9.

As membranas so barreiras hidrofbicas que oferecem grande resistncia passagem de solutos hidroflicos, cuja permeao exige protenas transportadoras especficas, conforme

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esquematizado na figura abaixo. Desta maneira a membrana, atravs de transportadores especficos, regula o transporte de metabolitos entre compartimentos celulares.

10. Um exemplo clssico de transporte a tomada de glicose pela hemcia mediada por um transportador especfico, cuja velocidade depende da concentrao externa de glicose e obedece a uma curva hiperblica de saturao j bem conhecida da cintica enzimtica, sendo Kt anlogo a Km: Esta forma de transporte conhecida como transporte passivamente mediado ou difuso facilitada. Trata-se de um processo exergnico, pelo qual o soluto, no caso a glicose, atravessa espontaneamente a membrana indo do compartimento de maior para o de menor concentrao. 11. Existem 5 transportadores conhecidos que mediam a difuso facilitada de glicose em humanos: GLUT1 a 5, cujos Kts so diferentes para atender as necessidades funcionais dos tecidos nos quais so expressos. GLUT1 o transportador em hemcias, j GLUT2 expresso no fgado e clulas beta do pncreas, enquanto GLUT4 aparece no msculo esqueltico, tecido adiposo etc. 12. Mas, no epitlio do intestino a glicose obtida da dieta transportada para dentro da clula contra a gradiente de concentrao, portanto atravs de um processo endergnico que exige consumo de energia metablica para ocorrer e referido como transporte ativo. Neste caso o transportador chamado simport, pelo qual a glicose transportada junto com Na+ e termodinamicamente possvel porque existe um gradiente eletroqumico de Na+ de fora para dentro da clula. H mltiplas formas de transporte ativo, das quais este exemplo da glicose apenas uma delas. Grande parte da energia metablica consumida pelas clulas se deve

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manuteno da enorme diversidade de transportadores que promovem a transferncia de metabolitos e ons contra gradientes de concentrao.

Exerccios 9 1) O que concentrao micelar crtica. Como varia tamanho e forma de micelas formadas por anfiflicos de uma nica cauda hidrocarbonada? Explique. 2) Uma hiptese central na pesquisa de membranas que os lipdeos da membrana devem ser fludos (em oposio a "congelados") a fim de que a membrana possa desempenhar suas funes. O apoio para esta hiptese fornecido pela observao de que a composio de cido graxo das membranas pode ser alterada pelas condies nas quais a bactria cresce. Por exemplo, se a bactria est crescendo em temperatura menor que a normal, as quantidades observadas de cidos graxos insaturados (relativas ao contedo de cido graxo saturado) esto acima do normal. Contrariamente, se a bactria est crescendo em temperatura acima da normal, as quantidades observadas de cidos graxos insaturados nos lipdeos da membrana (relativas aos cidos graxos saturados) esto abaixo do normal. a) Sugira razes para o fato de que o contedo lipdico na membrana bacteriana deve ser fluido para que a membrana intacta opere apropriadamente. b) Explique como a alterao observada nos nveis dos cidos graxos insaturados relativa aos nveis dos cidos graxos saturados, em diferentes temperaturas de crescimento, apia a hiptese da fluidez da membrana. 3) Fornea uma explicao termodinmica para o fato de que molculas de fosfolipdeo difundem rapidamente no plano da bicamada, mas muito lentamente mudam de uma face oposta. 4) Descreva os mecanismos pelos quais detergentes extraem protenas integrais de membrana, mantendo-as em soluo. 5) Explique porque soda funciona bem para desentupir pias entupidas com gordura animal. 6) Para saber se uma bactria tomava leucina e etileno glicol por transporte mediado ou no mediado, foram feitas medidas de velocidade inicial de tomada em funo da concentrao de ambas substncias, resultando na tabela fornecida abaixo. O que voc conclui do exame dessa tabela? Explique e calcule Kt e Vmax se encontrar evidncias de transporte mediado.

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ComponenteLeucina

Concentrao [M]1 x 10 2 x 10 5 x 10 1 x 10 3 x 10 1 x 10 5 x 10 1 x 10-6 -6 -6 -5 -5 -4 -4 -3 -3 -3

Velocidade Inicial (unidades arbitrrias)110 220 480 830 1700 2600 3100 3200 1 5 10 50 100 500 1000

Etileno glicol

1 x 10 5 x 10 0,01 0,05 0,1 0,5 1,0

7) Clulas epiteliais de intestino de camundongo isoladas em cultura transportam L-leucina e Dleucina mostrando Kt (mM) e Vmax, respectivamente iguais a: 0,24 e 420 para L-leucina e 4,7 e 310 para D-leucina, ambos em presena de Na+ no meio de cultura. Mas na ausncia de Na+ , Lleucina mostra 0,24 e 23 enquanto D-leucina mostra 4,7 e 5 para Kt (mM) e Vmax, respectivamente. Classifique esse transportador de leucina quanto ao tipo e mecanismos de ao. Que efeitos voc esperaria se nesse meio de cultura fosse colocada valinomicina (ionforo de Na+)? E se fosse dissolvida ouabana (inibidor da ATPase Na+/K+) no meio de cultura? Explique. 8) O pH e a absoro de drogas. A droga aspirina, intensamente receitada, um cido fraco com um pKa de 3,5. A aspirina absorvida para o sangue atravs das clulas de revestimento do estmago e do intestino delgado. Para uma substncia ser absorvida ela deve atravessar facilmente a membrana celular. A passagem atravs da membrana celular determinada pela polaridade da molcula: molculas inicas (carregadas) e molculas altamente polares passam lentamente, enquanto aquelas neutras e hidrofbicas passam rapidamente. Como o pH do suco gstrico cerca de 1 e o pH no intestino delgado, cerca de 6, pergunta-se: a) Escreva por frmulas estruturais a ionizao reversvel da aspirina. b) Onde a aspirina mais absorvida para a corrente sangunea, no estmago ou no intestino delgado? Justifique claramente a sua escolha.

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COLESTEROL E LIPOPROTENAS

1. O colesterol do organismo humano pode ser obtido atravs da dieta ou por sntese endgena. Os principais rgos responsveis pela produo de colesterol so o fgado e o intestino, que produzem em torno de 25 % do colesterol endgeno. 2. A sntese de colesterol ocorre no citoplasma das clulas, sendo a acetil-CoA a precursora de todos os tomos de carbono presentes na molcula e o agente redutor, NADPH. A via composta por vrias reaes em que a acetil-CoA forma unidades de cinco carbonos, com estrutura similar do isopreno, que se polimerizam em um intermedirio linear que, aps, ciclizao, origina o colesterol. 3. A sntese inicia-se com a condensao de duas molculas de acetil-CoA, produzindo acetoacetil-CoA; esta condensa-se com outra molcula de acetil-CoA, produzindo 3-hidrxi3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA). As enzimas que catalisam estas reaes so, respectivamente, tiolase e hidroximetilglutaril-CoA sintase. A HMG-CoA a seguir reduzida a mevalonato, custa de 2 NADPH, numa reao catalisada pela HMG-CoA redutase, uma enzima ligada ao retculo endoplasmtico. Esta a reao limitante da sntese do colesterol, sendo controlada por vrios fatores. 4. O mevalonato sofre duas fosforilaes, que consomem 3 ATP, e uma descarboxilao, originando a unidade isoprenide, o isopentenil-pirofosfato 5. Um total de 6 molculas de isopentenil-pirofosfato so consumidas para formar esqualeno, o ltimo intermedirio linear da via. A sntese de esqualeno processa-se atravs de reaes de isomerizao, condensao, reduo por NADPH e eliminao de pirofosfato. 6. A etapa final consiste na ciclizao do esqualeno, incluindo consumo de O2 e NADPH, remoo de grupos metila e migrao de ligaes duplas, que levam, finalmente, produo de colesterol. 7. O colesterol, alm de ser um importante componente das membranas biolgicas, precursor dos cidos biliares, hormnios esterides e vitamina D. 8. As lipoprotenas so responsveis pelo transporte de lipdeos no nosso organismo. Consistem de uma poro protica mais externa e uma poro no-protica (nesse caso, lipdica) mais interna. O cerne lipdico composto por lipdeos mais apolares (triglicerdeos e steres de colesterol) e/ou mais polares (fosfolipdeos e colesterol livre). So classificadas de acordo com sua densidade (quanto maior o cerne lipdico, menor a densidade). Em ordem crescente de densidade, temos: Quilomcrons: realizam o transporte preferencial de triglicerdeos (85 %) do intestino para o fgado e tecidos extra-hepticos (tecidos adiposo, cardaco e musculoesqueltico). VLDL (Lipoprotena de densidade muito baixa): transporta triglicerdeos (50 %) endgenos do fgado para tecidos extra-hepticos.

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IDL (Lipoprotena de densidade intermediria): responsvel pelo transporte de colesterol e steres de colesterol para tecidos extra-hepticos, sendo metade captada pelo fgado e a outra, convertida em LDL. LDL (Lipoprotena de densidade baixa): realiza o transporte de colesterol (8 %) e steres de colesterol (37 %) para tecidos perifricos e est envolvida na regulao da sntese de colesterol. HDL (Lipoprotena de densidade alta): faz o transporte reverso do colesterol, isto , dos tecidos extra-hepticos para o fgado, e para tecidos que o utilizam como precursor biossinttico.

9. Conforme mencionado, a regulao da sntese do colesterol incide principalmente sobre a reao catalisada pela HMG-CoA redutase, atravs de alteraes na atividade e concentrao da enzima. Sua atividade controlada por fosforilao/desfosforilao: a forma desfosforilada ativa e a fosforilada, inativa. Isto quer dizer que a adrenalina e o glucagon inibem a enzima, enquanto a insulina a estimula. A concentrao da HMG-CoA redutase regulada por variao da expresso gnica e da velocidade de degradao da enzima. O colesterol e o mevalonato inibem a sntese e a traduo do RNAm da HMG-CoA redutase e aumentam a velocidade de degradao da enzima. 10. A sntese de receptores de LDL tambm inibida por nveis elevados de colesterol intracelular. As LDL penetram nas clulas por endocitose adsortiva, que se inicia pela ligao da lipoprotena ao seu receptor presente na membrana plasmtica. Sendo assim, uma diminuio do nmero de receptores de LDL propicia uma reduo no aporte de colesterol para as clulas. A conseqncia da menor incorporao celular de LDL-colesterol o aumento da sua concentrao no plasma.

Exerccios 10

1. Qual a principal forma de excreo do colesterol? Que importante papel fisiolgico tem aexcreo do colesterol? Explique quimicamente.

2. Quais so os principais grupos de hormnios esterides? Onde so sintetizados e quais soseus papis fisiolgicos? Esquematize a sntese de tais hormnios a partir do colesterol. 3. Quais so as conseqncias de uma doena hereditria caracterizada pela ausncia de receptores de LDL? Explique. 4. Por que comum referir-se ao LDL-colesterol e HDL-colesterol como colesterol mau e bom, respectivamente? 5. Por que uma dieta com restrio em colesterol, no suficiente para reduzir seus nveis plasmticos?

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6. Uma das terapias medicamentosas utilizadas para a normalizao do colesterol plasmtico o uso de resinas, como a colestiramina. Explique o processo fisiolgico sobre o qual tal interveno atua e de que forma essas resinas funcionam. 7. As estatinas (sinvastatina, lovastatina, pravastatina, atorvastatina, etc.) so medicamentos utilizados para reduzir os nveis plasmticos de colesterol. Baseados na estrutura qumica de tais compostos, explique seu mecanismo de ao.

8. Por que indivduos diabticos possuem maior predisposio para nveis elevados de colesterol? Justifique bioquimicamente. 9. Que so Sais Biliares e quais as funes dos mesmos? Quais os pigmentos que conferem a colorao s fezes?

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BIOENERGTICA, TERMODINMICA e ATP

1. A variao de energia livre padro diretamente relacionada constante de equilbrio: Go = -2.3RT log Keq 2. A composio de um sistema de reao (uma mistura de reagentes e produtos) tende a uma variao contnua at que o equilbrio alcanado. No equilbrio, as taxas de reao para um lado e para outro so exatamente iguais. As concentraes de reagentes e produtos no equilbrio definem a constante de equilbrio. Na reao: A + B Keq = [C][D] / [A][B] 3. Quando um sistema no est em equilbrio, ele tende ao equilbrio, e a magnitude desta tendncia pode ser medida como a variao de energia livre da reao, G. A energia livre de Gibbs (G), uma propriedade termodinmica, definida pela equao: G = H TS, onde H, T e S so respectivamente entalpia, temperatura absoluta e entropia, todas tambm propriedades termodinmicas. 4. Numa transio de estado a temperatura (T) e presso constantes (condies comuns s reaes bioqumicas) a variao de G (G) : G = H - TS. Se se trata de uma reao bioqumica, H o calor de reao. Quando H positivo a reao endotrmica, se H for negativo a reao exotrmica. Nestas condies, a espontaneidade da reao definida pelo valor de G: se G negativo, a reao espontnea, sendo denominada exergnica. Se, ao contrrio, G for positivo, a reao no ocorre espontaneamente e denominada endergnica. Portanto, a reao ocorre no sentido em que a energia livre total diminui. 4. No equilbrio, G = 0. Logo, possvel demonstrar a validade das seguintes igualdades: G = G + 2,3 RT logB/A B/A = K G = - 2,3 RT logK 5. Em condies padro, 25C (298K), com concentraes de reagentes e produtos iguais a 1M, pH = 0, a variao de energia livre considerada padro, ou G. Entretanto, a maioria das reaes bioqumicas ocorrem em pH 7,0, para as quais utiliza-se G. 6. A Figura 4 mostra esquematicamente como varia G com o desenvolvimento da reao, indicado no eixo das abcissas como coordenada de reao C + D , a constante de equilbrio dada por:

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Energia Livre (G)

Estado de Transio (T) G*

Estado Inicial (S)

G'

Estado Final (P)

Coordenada de ReaoFigura 4. Variao de energia livre (G) no decorrer de uma reao genrica. Para que a reao ocorra, necessariamente tem-se Gfinal < Ginicial, isto , G negativo. Um ponto importante a ser destacado que o valor de G permite prever se a reao pode ocorrer, mas no a velocidade com que a reao atinge o equilbrio. A velocidade de reao depende da energia livre do Estado de Transio que maior que do que o dos reagentes no Estado Inicial, isto , G* positivo. Quanto maior o valor de G*, menor ser a velocidade de reao. 8. Na reao genrica A B a velocidade (v) proporcional a [A], isto , v1=k1[A]. A velocidade da reao inversa ser, consequentemente, v-1=k-1[B]. k1 e k-1 so constantes de velocidade e reaes como AB e BA so ditas de primeira ordem, porque as suas respectivas velocidades dependem de concentrao molar de um nico reagente elevado potncia 1. As constantes de velocidade k1 e k-1 so diferentes da constante de equilbrio da reao, K=[B]/[A]. No estado de equilbrio, por definio, v1=v-1 e, portanto, formalmente, K=k1/k-1. As reaes representadas pelas equaes seguintes: 2AB e A+BC so de segunda ordem, cujas velocidades so, respectivamente, v=kA[A]2 e v=kAB[A][B]. Notar que a ordem da reao no coincide necessariamente com a estequiometria da equao qumica. 9. As quinases formam uma classe muito importante e abundante de enzimas, que se caracterizam por catalisar a transferncia de um grupo fosfato de alta energia para uma outra substncia receptora. 10. So chamados compostos de alta energia substncias orgnicas com o grupo fosfato em ligaes anidrido ou fosfoenol, cuja hidrlise libera fostato inorgnico (Pi) com um G0 negativo e em valor absoluto superior a 8kcal/mol. Outros compostos fosforilados com o fosfato em ligaes ester ou tioester tambm mostram um G0 de hidrlise negativo, mas de valor absoluto

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da ordem de 3kcal/mol. Estas classes de compostos esto ilustradas na Tabela 2. O principal composto fosforilado da clula o ATP; cuja frmula estrutural est na Figura 5. O ATP possui fosfato em ligaes anidrido e ester, aos quais correspondem G0 de hidrlise de, respectivamente, -8kcal/mol e -3,5kcal/mol. Todas estas reaes so, portanto, muito voltadas para os produtos de hidrlise, sendo praticamente irreversveis. No entanto, nenhuma destas reaes ocorre na clula a velocidade significante se no houver catlise por uma enzima especfica, da classe das fosfatases.

NH2 N HC N OOOO H OH H C C N C N C H Ad e n i n a

- O- P - O- P - O- P - O- C H 2 O O O H H HO

Ri b o s e

A MP ADP AT P

ATP = Adenosina 5-trifosfato Na clula: FIGURA 2Figura 5. Frmula estrutural do ATP.

[ATP] + [ADP] + [AM = Constante P]

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Tabela 2. Compostos fosforilados.R C O P + H2O R C O + Pi cido

Go' = - 13.000 cal/mol

CH2 Fosfoenol R C O P + H2O

CH3 cetona R C OH O cido cido + Pi

Go' = - 8.000 cal/mol

O Anidrido fosfrico

R O

P

+

H2O

R OH lcool

+

Pi cido

Go' = - 3.000 cal/mol

ster fosfrico

R C S O Tioster

CoA

+

H2O

R C OH + HS-CoA O cido tiolcool

Go' = - 3.000 cal/mol

ATP Adenosina trifosfato ADP Adenosina difosfato AMP Adenosina monofosfato

+

H2O

ADP cido

+

Pi cido

Go' = - 8.000 cal/mol

+

H2O

AMP cido

+

Pi cido Pi cido

Go' = - 8.000 cal/mol

+

H2O

A OH + lcool (Adenosina)

Go' = - 3.500 cal/mol

Pi = fosfato inorgnico = HPO 2- (pH=7,4) 4 P = PO32-

Na clula: [ATP] + [ADP] + [AMP] = constante

11. No metabolismo muito importante a transferncia de fosfatos de um composto fosforilado de alta energia para outro. Uma das reaes chave deste tipo : fosfoenolpiruvato + ADP ATP + piruvato G0=-5kcal/mol Como esta reao no ocorre sem catlise, seu controle pela clula feito atravs de uma enzima quinase especfica.

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12. Alm das quinases que catalisam a transferncia de grupo fosfato do ATP para metablitos, existem as quinases que tem transferem grupos fosfato entre protenas. Essas enzimas so genericamente referidas como quinases de protena ou, simplesmente, protena-quinases. H alguns milhares de protena-quinases diferentes em um organismo, que catalisam a transferncia de fosfato de ATP para o grupo OH da cadeia lateral de resduos especficos de serina e treonina formando um ster de fosfato. As reaes deste tipo so genericamente chamadas de fosforilaes e so modificaes covalentes que causam mudana de conformao das protenas, alterando sua atividade biolgica. Por exemplo, um grande nmero de enzimas so fosforiladas para sofrer uma transio do estado inativo ao ativo ou vice-versa. Mais raramente as protenas so fosforiladas no grupo enlico de resduos de tirosina.

Exerccios 11 1) Defina reaes exotrmicas e endotrmicas. Qual a relao entre estes conceitos e a funo termodinmica entalpia? 2) Defina reaes exergnicas e endergnicas. Qual a relao destes conceitos com G0. 3) G0 caracterstico de cada reao (desde que a temperatura seja constante) e no varia com as concentraes de reagentes e produtos no equilbrio. G, por outro lado, no caracterstico da reao, podendo assumir qualquer valor em funo das concentraes iniciais de reagentes e produtos (quociente Q na expresso de G). Mostre por que estas afirmaes so verdadeiras discutindo a expresso que relaciona G0 e G. 4) Na reao genrica A B Keq=103. Qual o valor de G0? No ponto de equilbrio as concentraes molares de A e B podem variar? Como varia G com as concentraes molares iniciais de A e B? 5) Ainda para a reao A B (questo 4) proponha uma condio na qual a reao inversa seja espontnea. Mostre que a sua proposta possvel calculando o respectivo G. Esta questo possui mltiplas respostas ou apenas uma resposta nica? 6) Para a reao A B (questo 4), se a constante de velocidade de primeira ordem, k1 for igual a 10, qual deve ser o valor da constante k-1 para a reao inversa? Para um mesmo K, constante de equilbrio, pode haver mltiplos valores de k1 e k-1 ? Qual a interpretao termodinmica para a sua resposta?

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7) Considerando a equao G0 = -2,3 RT log K, sendo: R = 1,98 x 10-3 kcal/mol K; T = 298K e 2,3 RT = 1,36 kcal/mol. Calcule os valores de G0 quando K varia de 105 a 10-5. Faa uma tabela. 8) Porque a hidrlise de ATP necessita catlise enzimtica, sendo este um composto rico em energia? Utilize-se do grfico esquemtico de variao de G (energia livre) em funo de coordenada de reao para responder a esta questo, definindo estado de transio e energia de ativao.

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METABOLISMO GERAL ESTRATEGIAS

1. Os sistemas vivos para se manterem na condio de baixa entropia (alta organizao) e ainda fora do equilbrio termodinmico necessitam retirar energia e poder redutor do meio ambiente. Lembre-se que as molculas sintetizadas pelo organismo via de regra esto no estado reduzido, como acares e lipdios. Lembre-se tambm que os organismos autotrficos procedem sntese de Glicose a partir de CO2, H2O e energia na forma de Luz (h). Este processo inclui a reduo do C (CO2) (Nox=4) para CH2O (hidrato de Carbono) (Nox= 0). 2. Do ponto de vista metablico dois processos ocorrem. Queima de compostos para obteno de energia e poder redutor = Catabolismo. Uso das energias (ATP) e poder redutor para Snteses de macromolculas, movimentos, transportes contra gradientes etc. Processos estes uphill. 3. A manuteno dos processos metablicos e do fluxo de materiais controlada por meticuloso sistema enzimtico que permite o controle metablico seja em direo ao catabolismo, seja em direo ao anabolismo. Este fino controle exercido em funo da condio metablica, no qual vias so bloqueadas e outras so ativadas. 4. Reaes uphill podem ser tranformadas em downhill pelo acoplamento de reao favorvel, em geral pela hidrlise de ATP, seja para ADP e Pi seja para AMP e PPi (pirofosfato). Este PPi pode ser ainda hidrolizado duas de Pi e isto auxilia em deslocar o equilbrio no sentido de produtos. 5. Como os produtos de reaes pouco favorveis so retirados para outras vias, isto pode levar a reao complexo. 6. O ATP considerado a moeda corrente de Energia Livre. O ATP esta sempre sendo formado e consumido. O ATP no depsito de energia. Depsitos de energia so Lipdios, Glicognio, Creatina-Pi (msculo). 7. O creatina-Pi reserva de ~Pi no msculo. 8. NADH e FADH2 so os principais carreadores de eltrons nas oxidaes biolgicas. O NADPH a maior fonte de eltrons para as redues biossintticas. Note que o grupo Pi a nica diferena entre o NAD e o NADP, o quem permite o reconhecimento por enzimas. 9. A Coenzima-A o carreador de grupos acila. 10. Abaixo se encontram figuras do catabolismo e anabolismo

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Catabolismo

Anabolismo 54

Estratgia Metablica 1) Alvos: Produzir ATP, gerar poder Redutor, obter blocos para Snteses. 2) Funes do ATP : Fonte de Energia para Msculo Transporte Ativo Amplificao de Sinais (checar AMPc) Biossntese 3) Hidrlise de ATP muda equilbrio acoplado por um fator de 108!! 4)Sntese de ATP glicose 2 ATP (vantagem a rapidez) Ac. Graxos 30/32 ATPs (cido palmtico) 5)Via das Pentoses NADPH (biossnteses) 6)Blocos DHP glicerol TAGs PEP aas aromticos Acetil-CoA unidades de 2C Succinil-CoA porfirinas Pentose Ribose 5 Pi 7)Degradao Sntese, porm em geral exergnicos graas ao ATP. 8)Atividade Enzimtica Chave para Sucesso 9) Controle do Metabolismo em geral no Passo Irreversvel Transforma processos de msegundos para Segundos 10)Modificao Covalente 11)Nvel de Enzimas (controle da transcrio). Sntese vs. Degradao Hormnios 12)Compartimentalizao de Processos. Ex. mitocndria, fluxo de metablitos.

Exerccios 12

1) Qual o valor do G0 para hidrlise do ATP? E do PPi? 2) Escreva a forma do ATP e esquematize quais grupos podem ser denominados ~Pi? 3) Por que o ATP rico em energia livre? Qual as formas do ATP no pH fisiolgico? Por que o ATP em geral esta acompanhado do on Mg2+? 4) Qual o fator que a hidrlise de ATP desloca equilbrios? 5) Mostre as estruturas do NAD, do FAD e do NADP oxidados e reduzidos. Saliente quais grupos das molculas so oxidados e reduzidos. 6) Como a estrutura da Co-Enzima A? 7) Quais as vitaminas presentes no NAD, FAD e CoA. 55

8) O que significa Carga Energtica e Potencial de fosforilao? 9) Discuta os 12 tens apresentado no tema acima Estratgia Metablica.

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GLICLISE

1. A gliclise a principal via catablica da glicose compreendendo as 10 reaes enzimaticamentecatalisadas que so mostradas na figura abaixo e cuja estequiometria total pode ser observada na equao qumica seguinte: Glicose + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H2O + 2 H+ A gliclise, como todas as vias catablicas, exergnica e a equao acima corresponde a Go = -43,4 kJ/mol. Mas o dado da variao de energia livre mais interessante em termos de G, cujo valor exato depende de cada clula especfica, por exemplo, em msculo cardaco estima-se que seja igual a 74,0 kJ/mol.

2. A finalidade da gliclise obteno de energia, como a equao estequiomtrica indica, cadamolcula de glicose degradada a duas de piruvato e parte da energia livre liberada nesta degradao retida nos produtos na forma de 2 NADH e 2 ATP.

3. A reao que permite a obteno de NADH a nica de oxido-reduo da gliclise, pela qualgliceraldedo-3-P oxidado a glicerato-1,3-bisP, atravs da ao oxidante de NAD+ catalisada pela enzima gliceraldedo desidrogenase. A manuteno da capacidade oxidante da gliclise exige que NADH seja re-oxidada a NAD+ , uma alternativa para isso apresentada na figura, atravs da reao pela qual NADH reduz piruvato a lactato, recuperando NAD+. Esta alternativa ocorre no msculo esqueltico com baixos nveis de O2.

4. J ATP produzido em duas reaes distintas pelas quais um radical fosforil transferido de,respectivamente, glicerato-1,3-P e P-enolpiruvato para ADP, em transferncias catalisadas por glicerato-1,3-P-quinase e P-enolpiruvato-quinase. Esta maneira de fosforilao de ADP conhecida como fosforilao a nvel do substrato, para distingui-la da fosforilao oxidativa da mitocndria que ser vista mais adiante.

5. Na gliclise, h 3 reaes de fosforilao irreversveis catalisadas, respectivamente, pelahexoquinase, fosfofrutoquinase e piruvato-quinase, que funcionam como marca-passos da via, cuja regulao se d por um elaborado sistema de controle alostrico das enzimas.

6. Diversas outras hexoses, como frutose, galactose e manose, tambm so metabolisadas pela viaglicoltica.

7. A gliclise em condies anaerbicas tem energtica e funes variadas, conforme o organismo.Cabe fazer dois destaques importantes.

8. Em vertebrados, encontram-se msculos esquelticos muito pobres em mitocndria, que soespecializados para produzir ATP a partir de gliclise anaerbica, cuja energtica obedece a seguinte reao geral: Glicose 2Lactato + 2H+ ; Go = -196kJ/mol. Mas, parte dessa energia livre liberada que seria dissipada (61kJ/mol) retida na forma de 2ATP produzidos por mol de glicose degradada. Deve-se ainda enfatizar que o lactato no descartado, pois vai ser

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aproveitado no fgado, aonde reoxidado a piruvato, alternativa metablica importante a ser examinada mais frente.

9. Leveduras mostram um exemplo de gliclise anaerbica na forma da fermentao alcolica,segundo a reao geral: Glicose 2Etanol + CO 2; Go = -235kJ/mol. Aqui tambm parte da energia livre, +61kJ/mol, mantida com a produo de 2ATP. A parte final da fermentao alcolica compreende duas reaes: a primeira envolve a descarboxilao de piruvato e liberao de acetaldedo, catalisada pela enzima piruvato-carboxilase, que no existe em animais. Na segunda reao a desidrogenase alcolica catalisa a reduo do acetaldedo por NADH.

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HOCH2 O OH HO OH ATP ADP P -OCH2 O OH HO OH OH ATP ADP OH

GLICLISE

Glicose

Glicose 6-fosfato

P -O-CH2 O CH2OH HO OH HO ATP ADP P -O-CH2 O CH2O- P

Frutose 6-fosfato

ATP ADP

HO OH HO

Frutose 1,6 bisfosfato

H2C-O- P C=O H2C-OH

HC=O HC-OH H2C-O- P Pi NAD+ NADH O=C-O- P HC-OH H2C-O- P ADP ATP O=C-OHC-OH H2C-O- P ADP ATP Pi NAD+ NADH

Diidroxiacetona fosfato

Gliceraldedo 3-fosfato

1,3 Bisfosfoglicerato

3-Fosfoglicerato

COOHC-O- P H2C-OH

2-Fosfoglicerato

H2O COOC-O- P CH2 ADP ATP COOHC-OH CH3 NAD+ NADH COOC=O CH3 ADP ATP

Fosfoenolpiruvato

LactatoNAD+ NADH

Piruvato

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Exerccios 13 1) Classifique as reaes da gliclise, destacando as que so de xido-reduo. 2) Equacione a reao de oxidao de gliceraldedo-3-fosfato, destacando o oxidante e o redutor. 3) Na reao do item 2) parte da energia utilizada para produzir ATP. Mostre como isso possvel, equacionando as etapas relevantes da reao. Defina fosforilao ao nvel do substrato. 4) Equacione a reao lquida da transformao de glicose em piruvato. Como regenerada a capacidade oxidante do sistema NAD+/NADH necessria atividade glicoltica nos glbulos vermelhos humanos (que no tm mitocndria) e na cultura de levedo sem O2 (fermentao). 5) Examine uma tabela com as 10 reaes da via glicoltica que contenha, respectivamente, o G0 e o G das reaes. Quais so as reaes irreversveis da gliclise? 6) Porque os valores de G0 e de G da mesma reao podem ser diferentes? Para decidir se a via glicoltica numa determinada clula reversvel ou irreversvel, que valor mais relevante, G0 ou G? 7) Uma pessoa incapaz de executar exerccios fsicos intensos e prolongados teve suas enzimas analisadas. Todas as enzimas da via glicoltica estavam em concentrao normal, com excesso da fosfoglicerato mutase muscular. a) Como ser afetada a produo de energia metablica em uma clula que apresenta baixos nveis desta enzima? b) Como ser afetada a produo de Lactato na ausncia desta enzima? [Referncia: Di Mauro, S.; Miranda, A.F.; Kahn, S.e Gitlin, K. - Human muscle phosphoglycerate mutase deficiency Science 1981, vol. 212, 1277-1279. 8) Calcular a porcentagem de energia armazenada pela clula ao degradar glicose pela via glicoltica. Sabe-se que:o

Glicose 2 lactato

G ' = - 47.000 cal/mol

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CICLO DE KREBS

1. Em condies aerbicas, o destino do piruvato produzido na gliclise sofrer umadescarboxilao oxidativa catalisada pela piruvato desidrogenase, que um complexo multienzimtico existente no interior da mitocndria de eucariotos. Portanto, o piruvato precisa entrar na mitocndria para ser degradado por essa via. A reao geral a seguinte: Piruvato + CoA + NAD+ Acetil-CoA + NADH + CO2

2. O acetilCoA resultante da metabolizao do piruvato totalmente oxidado no ciclo do cidoctrico, tambm chamado ciclo de Krebs, conforme a seguinte reao geral: Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O 2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP + CoA + 2 H+ O ciclo de Krebs, esquematizado na figura, compreende 8 reaes, envolvendo 8 enzimas e 8 cidos carboxlicos, di e tri-cidos, todos dispersos na matriz da mitocondria. Portanto, comeando no piruvato e passando pelo acetilCoA, ocorre oxidao completa desses metabolitos liberando 3CO2 sem participao de O2 molecular. Os agentes oxidantes em todas as reaes so NAD+ ou FAD e as formas reduzidas destas co-enzimas (NADH + FADH2 ), resultantes do processo, s so reoxidadas na cadeia respiratria, uma via especializada que se localiza na membrana mitocondrial interna e ser considerada mais adiante. 3. O ciclo de Krebs, conforme sua reao geral indica, essencialmente catablico, pois promove a oxidao do radical acetil a 2CO2 e retm parte da energia livre desta reao na forma de coenzimas reduzidos que, posteriormente, serviro produo de ATP atravs da fosforilao oxidativa. Para cumprir esta funo basta que os 8 intermedirios do ciclo ocorram em concentraes catalticas. Mas, o ciclo possui outra funo, alm da catablica, diversos de seus intermedirios alimentam as vias de sntese de aminocidos, lipdeos e glicose, isto , o ciclo tem tambm funo anablica e, portanto, deve ser classificado como anfiblico. Para que o ciclo desempenhe concomitantemente ambas as funes, catablica e anablica, as concentraes dos intermedirios so mantidas e controladas atravs de um complexo sistema de reaes auxiliares, conhecidas como reaes anaplerticas. Um exemplo de reao anaplertica a carboxilao de piruvato para obter oxalacetato, catalisada pela enzima piruvato carboxilase. 4. A transformao de piruvato em acetil-CoA, uma reao para a qual convergem diversas vias catablicas e anablicas, alm da gliclise. Por esse motivo a piruvato desidrogenase est sujeita a um controle altamente elaborado, compreendendo dois nveis de regulao: a) controle alostrico atravs da inibio pelo produto, exercido por NADH e acetil-CoA; b) modificao covalente reversvel da subunidade E1 da enzima, por fosforilao/desfosforilao. 5. As enzimas citrato sintase, isocitrato desidrogenase e -cetoglutarato desidrogenase so as reguladoras do fluxo metablico atravs do ciclo de Krebs e esto sujeitas a controle alostrico, envolvendo NADH como inibidor e Ca+ e ADP como ativadores.

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Piruvato

CoASH + NAD+ CO2 + NADH

Acetil-CoAH 2O

OxaloacetatoNADH + H+ NAD+ L-Malato H2 O

CoASH

CitratoH2O

cis-AconitatoH 2O

FumaratoFADH2 FAD

Ciclo de Krebs

IsocitratoNAD+ NADH + H+

SuccinatoGTP GDP + Pi CO2 CoASH

OxalosuccinatoCO2

Succinil-CoANADH + H+

a-CetoglutaratoNAD+

Exerccios 14 1) Escrever a reao de formao de acetil-CoA a partir de piruvato e indicar: a) as 5 coenzimas necessrias b) as vitaminas envolvidas c) a sua localizao celular 2) Como a equao qumica, estequiometricamente equilibrada, que representa a oxidao de acetil-CoA no ciclo de Krebs? Como se pode medir o rendimento do ciclo de Krebs em termos de coenzimas reduzidos (poder redutor) e ATP (ligaes de fosfato de alta energia). 3) Identifique os tipos de reaes que ocorrem no ciclo de Krebs, mostrando as respectivas equaes qumicas.

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4) Equacione a descarboxilao oxidativa de -cetoglutarato a succinato, respeitando a estequiometria da reao. Mostre as etapas que compem esta reao com as respectivas enzimas e coenzimas. 5) Quais so as enzimas do ciclo de Krebs sujeitas a regulao? Explique como cada uma delas regulada. 6) Explique porque piruvato estequiometricamente convertido a CO2 na respirao de fatias de msculo mantidas em soluo fisiolgica, enquanto oxalacetato e citrato tem efeito cataltico neste mesmo processo. Mostre porque a respirao pode ser sustentada pelo consumo estequiomtrico de citrato, mas no de acetato, quando o ciclo de Krebs inibido por malonato. 7) Dispondo das enzimas necessrias, a adio de que compostos far aumentar a concentrao de oxaloacetato em um sistema in vitro que contm mitocndrias: acetil-CoA, piruvato, glutamato, citrato ou cidos graxos? 8) Uma suspenso de mitocndrias, suplementada com acetil-CoA marcada com C14, produz CO2 marcado apenas quando suprida de oxignio. Em condies anaerbias, a adio de azul de metileno restaura a produo de CO2 marcado, observando-se tambm a descolorao do corante (azul de metileno reduzido incolor). Explique estes dados.

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CADEIA RESPIRATRIA E FOSFORILAO OXIDATIVA

1. Fosforilao oxidativa o processo bioqumico pelo qual a oxidao de NADH e FADH2

,

produzidos na gliclise e ciclo de Krebs, ocorre acoplada produo de ATP, a partir de ADP + Pi. Este processo se d na cadeia respiratria ou cadeia de transporte de eltrons, que compreende um conjunto ordenado de enzimas e transportadores de eltrons inseridos na membrana interna da mitocndria.

2. A cadeia respiratria contem 4 complexos, I,II, III e IV, ordenados por ordem crescente depotencial redox, indo do potencial padro de NAD+/NADH (E0= -0,315V) ao do O2/H2O (E0= +0,815V). Os eltrons so transferidos do complexo I ou II para o complexo III pela coenzima Q (ou ubiquinona), e do complexo III para o complexo IV pelo citocromo C para chegar ao O2. NADH e FADH2,

cedem eltrons, respectivamente, aos complexo I e II. A transferncia

exergnica de eltrons do nvel redox de NADH para o de O2 ( E0= 1,130V) envolve uma diferena de energia livre liberada ( G0= -218kJ/mol) que em parte retida pelo transporte de H+ do lado interno para o externo da membrana, criando o gradiente eletroqumico de prtons que permitir empurrar o processo endergnico de fosforilao de ADP por Pi para gerar ATP, atravs da bomba de prtons que constitui a ATP sintase (tambm conhecida com F1F0ATPase).Espao Intermembranar

2 H+

4 H+ Cit C

2 H+

Complexo I

Q

Complexo III

Complexo IV

Matrix Mitocondrial

NAD+ NADH + H+ 1/2 O2 + 2H+ H2O

Complexo II FADH2

3. A ATP sintase distinta e fisicamente separada da cadeia de transporte de eltrons. Atransferncia de 2e de NADH at O2 envolve um G0= -218kJ/mol, que gera um incremento no gradiente de prtons suficiente para mover a ATP sintase, permitindo a produo de 3 moles de ATP ( G0= +30,5kJ/mol). Nestas condies, a ATP sintase trabalha com uma eficincia termodinmica igual a 42%. , no entanto, necessrio destacar que quando os 2e saem do nvel

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redox de FADH2

,

formam-se apenas 2ATP. Naturalmente, para uma melhor medida da real

eficincia termodinmica da fosforilao oxidativa seria preciso estimar o G da transferncia de eltrons em vez do G0.

4. A grande quantidade de energia livre que seria dissipada na oxidao completa da glicose a CO2e H2O [C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O; G0= -2823 kJ/mol] aproveitada para produo de ATP, graas quase exclusivamente ao processo de fosforilao oxidativa, rendendo 38ATP por mol de glicose (incluindo neste total 2ATP da gliclise e 2 do ciclo de Krebs).

5. Vrios mecanismos da cadeia de transporte de eltrons e de seu acoplamento sntese de ATPforam elucidados atravs da utilizao de inibidores e desacopladores, entre os quais esto: rotenona, amital, antimicina A, cianeto e DNP. Rotenona e amital inibem a reduo dos complexo I e III por NADH. Antimicina A inibe o transporte de eltrons no complexo II. Cianeto inibe o transporte no complexo IV. DNP desacoplador, pois promove o vazamento de H+ ,levando dissipao do gradiente de prtons e contnuo transporte de eltrons, desacoplado da sntese de ATP.

6. A sntese de ATP a partir de ADP e Pi na mitocndria, que catalisada pela ATP sintase, dirigida pelo processo de transporte de eltrons. Mas como a ATP sintase fisicamente separada das protenas do transporte de eltrons, a energia livre liberada no transporte de eltrons deve ser conservada em uma forma que possa ser utilizada pela ATP sintase. A energia livre do transporte de eltrons conservada pelo bombeamento de H+ da matriz mitocondrial para o espao intermembranar, criando um gradiente de H+. A volta dos prtons ao interior da mitocndria termodinamicamente favorvel. A membrana interna da mitocndria impermevel a prtons em toda sua extenso, exceto na ATP sintase; e ento por este canal que os prtons atravessam a membrana, de volta matriz mitocondrial. A variao de energia livre associada ao transporte de um prton atravs da membrana interna da mitocndria pode ser determinada atravs de medidas da diferena de pH e do potencial de membrana estabelecidos em mitocndrias consumindo oxignio.

Exerccios 15 1) Definir potencial de xido-reduo (E), potencial de xido-reduo padro (Eo) e potencial de xido-reduo padro bioqumico (Eo). 2) Entre os transportadores universais de eltrons da cadeia respiratria esto NAD+ e os nucleotdeos de flavina (FAD e FMN), quais so as diferenas entre estes transportadores de eltrons quanto a potencial redox e forma de interao com as enzimas com as quais atuam?

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3) Classifique os seguintes inibidores quanto a seus mecanismos de ao na cadeia respiratria: a) rotenona; b) antimicina A; c) oligomicina e d) DNP (2,4-dinitrofenol). 4) Descreva o mecanismo de ao do DNP (2,4-dinitrofenol), mostrando porque o mecanismo de ao deste inibidor uma demonstrao experimental importante da hiptese quimiosmtica da fosforilao oxidativa. 5) Porque F1 e Fo so ambos necessrios para a sntese de ATP? 6) Em mitocndrias isoladas, o transporte de eltrons no ocorre na ausncia de ADP e Pi, mesmo que haja abundncia de succinato para fornecer eltrons. Como se explica que mitocndrias nessas condies passam a transportar eltrons e consumir oxignio se forem tratadas com DNP? 7) A relao entre energia livre padro de uma reao e o potencial redox : i. ii. iii. iv. v. vi. Go = -nFE0onde n o nmero de eltrons transferidos F a constante de Faraday (F = 23.60 cal V-1) Eo' o, diferena de potencial padro da dupla redox. Lactato + NAD+Piruvato + NADH + H+ Eo' (NAD+/NADH) = -0,32 V Eo' (Piruvato/Lactato) = -0,19 V

8) A uma soluo 1 M de NAD+, NADH, Piruvato e Lactato, adicionou-se lactato desidrogenase. A) Em que sentido a reao ocorrer? B) medida que a reao ocorre, como variam esses potenciais redox?

9) Na hiptese do acoplamento quimiosmtico, a energia que comea na forma de potencial qumico de reduo/oxidao, convertida na forma de potencial prton-motriz e finalmente convertida na forma de potencial qumico de ATP. Qual a diferena entre o potencial qumico (G) e o potencial eltrico ( ) de um soluto distribudo dos dois lados de uma membrana? Defina fora prton-motriz

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CICLO DAS PENTOSES 1. Muitas funes celulares que envolvem reaes endergnicas so efetuadas graas hidrliseexergnica de ATP. Outras reaes endergnicas, como a sntese de cidos graxos e colesterol e a fotossntese, requerem NADPH, que tem um grande poder redutor.

2. O grupo fosforila no carbono 2 de uma das unidades de ribose do NADPH o diferencia de NADH.NADH oxidado pela cadeia respiratria para gerar ATP, enquanto que NADPH serve como um doador de eltrons em reaes biossintticas redutoras.

3. Na via das pentoses, NADPH gerado quando a glicose-6-fosfato oxidada a ribose-5-fosfato,que um acar de 5 carbonos, componente de vrios compostos importantes, como ATP, CoA, NAD+, FAD, RNA e DNA.

4. A via das pentoses tambm catalisa a interconverso de acares de 3, 4, 5, 6 e 7 carbonos, emuma srie de reaes no oxidativas que ocorrem no citosol.

5. As reaes da via das pentoses so as seguintes: glicose-6-fosfato desidrogenado e convertido a ribulose-5-fosfato, em trs reaes, produzindo 2 NADPH + H+. ribulose-5-fosfato isomerizada a ribose-5-fosfato. Nestas reaes, 2 NADPH + H+ e uma ribose-5-fosfato so gerados para cada glicose-6-fosfato oxidada. ribose-5-fosfato convertida a gliceraldedo-3-fosfato e frutose-6-fosfato pela transcetolase e transaldolase. A transcetolase catalisa a transferncia de unidades de C2 de uma cetose para uma aldose. A transaldolase transfere unidades de C3 de uma aldose para uma cetose. As reaes de transcetolase e transaldolase criam uma ligao reversvel entre a via das pentoses e a via glicoltica. O resultado dessas reaes a formao de 2 hexoses e 1 triose a partir de 3 pentoses: C5 + C5 C7 + C3 C5 + C4 C3 + C7 C4 + C6 C3 + C6 Transcetolase Transaldolase Transcetolase

6. O excesso de ribose-5-fosfato formado pela vias das pentoses pode ser completamenteconvertido em intermedirios da via glicoltica.

7. A primeira reao da via das pentoses, a desidrogenao da glicose-6-fosfato, praticamenteirreversvel. E essa a reao em que a via das pentoses controlada. O fator regulatrio mais importante o nvel de NADP+, o receptor de eltrons na oxidao da glicose-6-fosfato a 6fosfogluconolactona. Alm disso, NADPH compete com NADP+ pela ligao enzima. A parte no oxidativa da via das pentoses controlada principalmente pela disponibilidade de substratos.

8. A via percorrida pela glicose-6-fosfato depende da necessidade celular de NADPH + H+, ribose-5fosfato e ATP:

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Quando muito mais ribose-5-fosfato requerida que NADPH + H+, a maior parte de glicose-6-fosfato convertida a frutose-6-fostato e gliceraldedo-3-fosfato pela via glicoltica, a transaldolase e a transcetolase convertem esses em ribose-3-fosfato. Quando a necessidade de NADPH + H+ e ribose-5-fosfato esto balanceadas, a reao predominante a formao de 2 NADPH e uma ribose-5-fosfato de glicose-6-fosfato pela fase oxidativa da via das pentoses. Quando muito mais NADPH + H+ requerido que ribose-5-fosfato, a glicose-6-fosfato completamente oxidada a CO2, ou convertida a piruvato.

Exerccios 16 1) Mostre a parte oxidativa do ciclo das pentoses com as equaes das reaes envolvidas, indicando os agentes oxidantes e a origem do carbono presente no CO2 liberado. 2) Compare NADH e NADPH, indicando suas funes no metabolismo de carboidratos. Explique porque a via da pentose-fosfato muito mais ativa no tecido adiposo que no msculo. 3) Quando h necessidade de NADPH, o ciclo das pentoses pode funcionar dando um resultado lquido que equivale oxidao total de glicose a CO2. Explique este processo atravs das respectivas reaes estequiometricamente equilibradas. 4) Ribose 5-fosfato pode ser obtida para a sntese de nucleotdeos atravs da via das pentoses, com ou sem oxidao da glicose. Mostre como isso possvel com as respectivas equaes qumicas. 5) Explique como a via da pentosefosfato controlada, tendo em vista que grande parte das reaes dessa via reversvel. 6) Compare as reaes catalisadas por transaldolases e transcetolases, indicando reagentes, produtos e a natureza das reaes.

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GLICONEOGNESE 1. O fgado humano precisa manter nveis mnimos da glicose circulante, porque crebro e hemcias dependem quase exclusivamente de glicose para produo de energia. No entanto, a reserva de glicognio heptico no suficiente para essa finalidade. Por isso, o fgado sintetiza glicose de novo a partir de lactato, piruvato, glicerol, intermedirios do ciclo de Krebs e aminocidos, atravs de uma via anablica chamada de gliconeognese. No jejum, mesmo o jejum de poucas horas, a gliconeognese a principal fonte da glicose liberada pelo fgado na circulao. 2. A gliclise, como j foi visto, um a via catablica com a finalidade de produzir energia na forma de 2 NADH + 2 ATP a partir da degradao de glicose a piruvato de acordo com a equao qumica seguinte: Glicose + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H2O + 2 H+ A gliconeognese tem a finalidade de sintetizar glicose a partir de piruvato