UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”

Departamento de Ciências Biológicas

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS

BIOQUÍMICA

PROF. DR. DANIEL SHERER DE MOURAPROFA. DRA. HELAINE CARRERPROF. DR.LUIZ ANTONIO GALLOPROF. DR. LUIZ CARLOS BASSOPROF. DR. MURILO MELO

Piracicaba - SP

2012

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SUMARIO

ASSUNTO pg

Normas para redação do relatório de aulas práticas

de Bioquímica 03

Colorimetria e Espectrofotometria 04

Determinação de Açucares Redutores 10

Cromatografia em Papel de Filtro 21

Determinação de Proteínas (reação do biureto) 27

Determinação da Constante de Michaelis (Km) e da

Velocidade máxima (Vm) de uma Enzima. 30

Reação de Hill (Fotólise da água) 34

Redutase de Nitrato em Plantas 37

Listas de Exercícios 40

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NORMAS PARA REDAÇÃO DO RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA LCB 208(OPCIONAL)

A forma para se redigir o relatório deve ser respeitada, uma vez que a avaliação do mesmo é feita de acordo com esta orientação. Assim todo relatório devera conter os seguintes itens:

CAPA Devera ter: Nome da ESALQ. Depto de Ciências Biológicas Relatório de aulas práticas de BioquímicaTítulo da aula (numero da aula)Nome e número dos alunosData (d/m/a)

OBJETIVOS

INTRODUÇÃO

Comentário da aula, incluindo comparativamente os fundamentos químicos da metodologia empregada

REVISÃO DE LITERATURA

Aspectos teóricos e informativos do assunto da aula pratica encontrados na literatura

MATERIAL E MÉTODOS (PROCEDIMENTOS)

Descrever os procedimentos executados em aula, inclusive as modificações propostas pelo professor

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Colocar em tabelas os resultados obtidos, gráficos, etc. As reta padrão somente serão aceitas se forem feitas em papel milimetrado. Comentar os resultados comparando-os com os da literatura

CONCLUSÃO

Comentar quais as conclusões da aula pratica. Ser claro e objetivo nas conclusões. Algumas poucas linhas são suficientes. Esclarecer se os objetivos propostos foram atingidos ou não.

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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Aula Pratica Nº 1 : COLORIMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA

1. OBJETIVOS

Dosagens de espécies químicas mediante a absorção de luz.

2. FUNDAMENTOS

A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas mediante a absorção de energia radiante (luz).

A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatória, caracterizada pelos diversos comprimentos de onda (, expressos em m ou nm) e que apresenta a propriedade de interagir com a matéria, sendo que parte de sua energia é absorvida por elétrons da eletrosfera dos átomos constituintes das moléculas.

Uma solução quando iluminada por luz branca, apresenta uma cor que é resultante da absorção relativa dos vários comprimentos de onda que a compõem. Esta absorção, em cada comprimento de onda, depende da natureza da substância, de usa concentração e da espessura da mesma que é atravessada pela luz.

Figura 1: Espectro de radiação eletromagnética, com destaque para a região do visível.

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Tabela 1 – Comprimento de onda aproximado das cores  

Cor Comprimento de onda (nm)

Cor Comprimento de onda (nm)

Ultravioleta

<400 Amarelo 570-590

Violeta 400-450 Alaranjado 590-620 Azul 450-500 Vermelho 620-760 Verde 500-570 Infravermelho >760

Figura 2: O espectro de radiação eletromagnético e sua comparação com objetos

A Lei de Lambert-Beer: A lei diz que a absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade ótica e concentração, e de uma relação logarítmica entre transmitância e concentração.

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Io I

b

c= concentração da espécie química absorvente

b= espessura atravessada pelo feixe luminoso Io= intensidade de luz incidente I= intensidade de luz emergente (transmitida) I < Io Io

Ab = D.O. = K.b.c = log (absorbância ou densidade ótica) I

A = - log T = - log I / Io = log Io / I

A Transmitância ou Transmissão (T%), corresponde a: I Io I T = 100

100 T Io

I T Io 100como, = , temos que : =

Io 100 I T

Io 100

portanto, log = log

I T

logo, Ab = log 100 - log T

Fotocolorímetro:

Figura 3 : Esquema de um fotocolorimetro (espectrofotômetro)

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Ab = 2 – log T

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Equipamentos e Vidrarias - Espectrofotômetro com cubetas - Pipetas de 5 mL graduadas - Estante com tubos de ensaio

3.2. Reagentes

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- Alaranjado de Metila: Concentração: ______ - Azul de Bromofenol : Concentração: ______

3.3. Procedimento:

A. Coleta de dados para a construção do espectro de absorção do Alaranjado de Metila ou do Azul de Bromofenol (um composto para cada grupo).

Usando água destilada como referência, efetuar as leituras de Absorbância (ou D.O.) do Alaranjado de Metila ( nos seguintes comprimentos de onda: 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 550, 600, 650 e 700 nm) e o Azul de Bromofenol (nos seguintes comprimentos de onda: 400, 440, 490, 520, 540, 565, 580, 590, 620, 660 e 700 nm)

Figura 4 – Exemplo de espectro de absorção de uma amostra

Preencher os dados da tabela 1 abaixo, de acordo com o corante escolhido pelo grupo:CORANTE: ALARANJADO DE METILA

(nM) LeituraT(%)

Absorbância

400 42044460480500520550600650700

CORANTE: AZUL DE BROMOFENOL (nM) Leitura

T (%)Absorbância

400440490520

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540565580590620660700

Utilizando os dados da tabela acima preparar um gráfico ( x = comprimento de onda nm )e (y = leitura em absorbância), encontrando qual o comprimento de onde refere-se ao pico de absorção do corante usado em aula.

Abs

Qual o comprimento de onda correspondente ao pico de absorção do seu corante? ____________nm

B. Demonstração da Lei de Lambert-Beer:

Preparar 6 tubos de ensaio (enumerados de 0 a 5) conforme o quadro que se segue (Tabela 2); o tubo no 6 estará contendo solução do corante com concentração desconhecida, a qual deverá ser determinada através da Lei de Lambert-Beer.Tabela 2: TUBO(No)

ÁGUA(mL)

CORANTE*(mL)

CONCENTRAÇÃO OBTIDA (g/mL)

TRANSMITÂNCIA(T%)**

ABSORBÂNCIA(Abs ou D.O.)

0 5 01 4 12 3 23 2 34 1 45 0 56 5 mL Encontrar no

gráfico* Alaranjado de Metila ou Azul de Bromofenol** Leituras efetuadas no comprimento de onda que corresponde ao pico de absorção do composto ( max).

4. RESULTADOS A SEREM APRESENTADOS NO RELATÓRIO:

4.1. Tabela de leitura do corante completando os valores de absorbância através de tabela ou cálculo.

4.2. Construir um gráfico da Absorbância (Abs) em função do comprimento de onda () e determinar o pico de absorção (max) do composto estudado.

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4.3. Completar a tabela 2 calculando as concentrações do corante nos diversos tubos

4.4. Construir um segundo gráfico apresentando as variações de Densidade Ótica (D.O.) ou Absorbância (Abs) em função da concentração da espécie química absorvente e um terceiro gráfico apresentando as variações de Transmitância em função da concentração.

4.5. Apresentar o valor da concentração do corante no tubo 6 mediante interpolação da leitura de Transmitancia (T x concentração) e Absorbância (Abs x concentração)no gráfico.

Abs

5. ANÁLISES DOS RESULTADOS E CONCLUSÕES

Discutir os resultados e listar as conclusões obtidas durante os experimentos realizados em classe.

6. BIBLIOGRAFIA

Listar as referências bibliográficas utilizadas para preparar o relatório.

Fundamentos de Bioquímica Experimental - Jose Raul Cisternas, Jose Varga e Osmar Monte. Ed. Atheneu 1999, 276 pg.Métodos de Laboratório em Bioquímica – Adelar Bracht e Emy Luiza Ishii-Iwamoto. Ed. Manole, 2003 439 pg.

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Transmitância

Concentração Concentração

Aula Pratica Nº 2 : DETERMINAÇÃO DE AÇUCARES REDUTORES (MÉTODO DE SOMOGY & NELSON)

1. OBJETIVO

Quantificar o teor de lactose em amostra de leite pelo método de Somogy-Nelson.

2. INTRODUÇÃO

O Leite: O leite é uma combinação de diversos elementos sólidos em água. Os elementos sólidos representam aproximadamente 12 a 13% do leite e a água, aproximadamente 87%. Os principais elementos sólidos do leite são lipídios (gordura), carboidratos, proteínas, sais minerais e vitaminas. Esses elementos, suas distribuições e interações são determinantes para a estrutura, propriedades funcionais e aptidão do leite para processamento. As micelas de caseína e os glóbulos de gordura são responsáveis pela maior parte das características físicas (estrutura e cor) encontradas nos produtos lácteos.

Os termos sólidos totais (ST) ou extrato seco total (EST) englobam todos os componentes do leite exceto a água. Por sólidos não gordurosos (SNG) ou extrato seco desengordurado (ESD) compreendem-se todos os elementos do leite, menos a água e a gordura.

Os componentes do leite permanecem em equilíbrio, de modo que a relação entre eles é muito estável. O conhecimento dessa estabilidade é a base para os testes que são realizados com o objetivo de apontar a ocorrência de problemas que alteram a composição do leite. Uma redução substancial da concentração de lactose ou dos sólidos totais poderia levantar suspeitas de adição fraudulenta de água, após a ordenha. Nesse caso, ocorrem alterações das propriedades físicas do leite, facilmente detectáveis em laboratório.

A composição do leite pode variar de acordo com o estágio de lactação: no colostro, o conteúdo de proteína é maior e o de lactose encontra-se reduzido. Outros fatores que podem interferir na composição do leite são: raça das vacas, alimentação (plano de nutrição e forma física da ração), temperatura ambiente, manejo e intervalo entre as ordenhas, produção de leite e infecção da glândula mamária.

O leite é o alimento mais completo de que se pode dispor, devendo ser tomado pelas crianças, jovens e adultos.Para que se tenha boa saúde e crescimento normal é indispensável tomar leite todos os dias, nas seguintes quantidades:- Crianças ...................................................... 3 a 4 copos por dia- Adultos ........................................................ 2 a 3 copos por dia- Senhoras em gestação ou amamentação........ 4 a 6 copos por dia

O leite faz bem à saúde porque:- Ajuda o crescimento;- Contribui para a formação dos ossos, músculos e dentes fortes;- Regula o sistema nervoso;- Aumenta a resistência às doenças infecciosas;- Desperta o apetite;- Facilita a digestão;- Ajuda a pessoa a se conservar alegre e disposta para o trabalho.

O leite, embora traga todos esses benefícios, poderá também causar muito mal se não tiver o necessário cuidado com ele durante a ordenha, no transporte e na sua conservação posterior: na usina de beneficiamento, nas fábricas, no comércio e na distribuição.

Definição do leite

Há diversas definições do leite, cada uma delas feita por um ou mais

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estudiosos do assunto e considerando o leite sob determinado ponto de vista.Para o nosso caso vamos considerar apenas uma definição, isto é, sob o ponto de vista higiênico:“Leite é o produto íntegro da ordenha total e sem interrupção, de uma fêmea leiteira sadia, bem alimentada, descansada, devendo ser ordenhado e acondicionado em condições higiênicas e sem conter colostro”.

Colostro

O colostro é o leite produzido nos primeiros dias após o parto. Tem composição diferente do leite normal e não deve ser usado na alimentação humana, e nem no fabrico de produtos de laticínios, principalmente de queijos. No entanto, não pode deixar de ser dado aos bezerros recém-nascidos, pois sua composição especial protege a saúde do animal e é um bom laxativo.

Caractesrísticas organolépticas

Entende-se por características organolépticas do leite o que se pode perceber pela visão, olfato e paladar. Com estes três sentidos pode-se observar o aspecto, a cor, o cheiro e o sabor do leite.

O leite bom tem:Aspecto: líquido, homogêneo (bem misturado), limpo (não contém substâncias estranhas). Geralmente forma uma camada de gordura na superfície quando deixado em repouso.Cor: cor branca, meio amarelada.Odor: suave, levemente ácido, e lembra mais ou menos o animal que o produziu.Sabor: levemente adocicado e agradável.

COMPOSIÇÃO DO LEITE DE DIFERENTES ESPÉCIES

Espécies   Densidade  Água    Proteínas  Gordura      Lactose     Extrato seco  Sais Minerais  Mulher       1.031        88,12     1,90          4,50              5,30        11,88             0,18Égua          1.031        88,80     2,70          2,50              5,50        11,20             0,50Cabra        1.032        87,54     3,70          4,20              4,00       2,46               0,56Ovelha      1.038        80,41     6,52          6,86              5,23        19,59              0,98Jumenta    1.033        90,45      1,70         1,55              5,80        9,55                0,50Búfala       1.034        82,05      4,00          7,98              5,18        17,95        0,79Vaca          1.030         87,25       3,50         3,80              4,80       12,75              0,65

O leite, em condições normais, tem em média os seguintes componentes:- Água........................................................... 87,25%- Extrato seco (ou sólidos).............................. 12,75%

O extrato seco é constituído dos seguintes elementos:- Gordura.......................................................... 3,80%- Proteínas........................................................ 3,50%- Lactose (açúcar).............................................. 4,80%- Sais Minerais................................................... 0,65%

A composição do leite pode variar de acordo com os seguintes fatores:a) Raça

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b) Período de lactaçãoc) Alimentaçãod) Saúdee) Período de ciof) Idadeg) Características individuaish) Climai) Espaço entre as ordenhasj) Estação do ano

Descrição dos componentes 

Água: é o componente que existe no leite em maior quantidade, onde se encontram dissolvidos, suspensos ou emulsionados os demais componentes. A água comum é igual a água do leite em todos os sentidos. Isto é, praticamente provado quando se dissolve leite em pó na água e se obtém o leite líquido com algumas modificações pequenas nos sólidos.

GORDURA : é o componente que dá ao leite cor amarelada. A gordura é um dos componentes mais ricos do leite. A matéria gorda do leite forma uma emulsão relativamente estável, constituída por glóbulos de pequenos diâmetros, bem distribuídos, que 1 milímetro cúbico de leite contém 1 a 5 milhões de glóbulos. Os glóbulos são cobertos por uma membrana protetora. A batedura do creme resultante do desnate do leite, rompe a membrana protetora e permite a união dos glóbulos para formar a manteiga . Cada glóbulo é envolvido por uma camada formada por um componente da gordura denominado fosfolipídio. Essa camada forma uma membrana que impede a união de todos os glóbulos. Desse modo, a gordura do leite é mantida na forma de suspensão.

A maior parte da gordura do leite é constituída de triglicerídios, que são formados por ácidos graxos ligados ao glicerol. A gordura do leite está presente em forma de pequenos glóbulos em suspensão na água. A fração de gordura do leite serve de veículo para as vitaminas lipossolúveis (A, D, E, K), colesterol e outras substâncias solúveis em gordura, como os carotenóides (provitamina A), que dão ao leite sua cor amarelo creme.

A concentração de gordura no leite varia geralmente entre 3,5 e 5,3%, em razão de diferenças entre raças, estágio da lactação e de acordo com a alimentação dos animais.

A gordura pode ser retirada do leite por processo natural, retirando-se a nata que sobe à superfície quando o leite fica em repouso, isto porque é mais leve que os outros componentes do leite, ou pelo processo do desnate, através de máquina denominada desnatadeira. É o que se chama de desnate do leite. A gordura se separa em forma de creme.

Emprego industrial da gordura:a) Fabricação de manteiga;b) Fabricação de creme de mesa;c) Fabricação de queijo;d) Fabricação de creme chantity;e) Fabricação de sorvetes, etc...

PROTEÍNAS

As proteínas representam entre 3% e 4% dos sólidos encontrados no leite. A porcentagem de proteína varia, dentre outros fatores, com a raça e é proporcional à quantidade de gordura presente no leite. Isso significa que quanto maior a percentagem de gordura no leite, maior será a de proteína.

Existem vários tipos de proteína no leite. A principal delas é a caseína, que apresenta alta qualidade nutricional e é muito importante na fabricação dos queijos. A caseína é produzida pelas células secretoras da glândula mamária e

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encontra-se organizada na forma de micelas, que são agrupamentos de várias moléculas de caseína junto com cálcio, fósforo e outros sais. Cerca de 95% da caseína total do leite está nessa forma. As micelas de caseína junto com os glóbulos de gordura são responsáveis por grande parte das propriedades relativas à consistência e à cor dos produtos lácteos.

A caseína não é facilmente alterada pelo calor, permanecendo bastante estável quando o leite é pasteurizado. Entretanto, quando ocorrem mudanças na acidez do leite, há rompimento da estrutura das micelas, o que faz a caseína precipitar e formar coágulos. A gordura e a caseína têm importância fundamental para a manufatura de vários derivados lácteos, sendo que representam a maior concentração de elementos sólidos dos queijos. As proteínas dão ao leite a cor esbranquiçada opaca. É fácil de se conhecer as proteínas do leite, pois são elas as principais formadoras de massa branca quando o leite coagula, e é manipulado para fabricar queijos.As proteínas do leite são formadas de:- Caseína (maior parte);- Albumina e globulina.

A caseína é formada por uma solução coloidal constituindo-se na maior parte de matéria azotada do leite. É um dos componentes mais úteis do leite. Obtém-se a caseína propriamente dita: pela precipitação natural do leite, fermentação lática e pela coagulação com auxílio de coalhos (enzima) e ácidos-fermento lático, etc...

A importância industrial da caseína está na: fabricação de queijos, caseína propriamente dita e leite em pó associado a outros componentes do leite.

A albumina, denominada também de lacto-albumina, é solúvel na água, não se coagula pelo coalho, mas pelo calor e pelos ácidos. Quando se fabrica queijos, a albumina sai junto com o soro. Este soro é aproveitado para fazer ainda outro queijo, a Ricota, obtido pelo aquecimento do soro e adição de ácido lático, fermento lático ou ainda soro ácido a 90ºD.

As proteínas existentes no leite apresentam-se nas seguintes percentagens médias: 3,0%, lacto-albumina 0,5%. Estas percentagens são muito mais fixas que as referentes a gordura.

CARBOIDRATOS

O principal carboidrato do leite é a lactose. É produzida pelas células epiteliais da glândula mamária e é a principal fonte de energia dos recém nascidos. Além da lactose, podem ser encontrados no leite outros carboidratos, como a glicose e a galactose, mas em pequenas quantidades.

A lactose compreende aproximadamente 52% dos sólidos totais do leite desnatado e 70% dos sólidos encontrados no soro do leite. Controla o volume de leite produzido, atraindo a água do sangue para equilibrar a pressão osmótica na glândula mamária. A quantidade de água do leite e, conseqüentemente, o volume de leite produzido pela vaca, depende da quantidade de lactose secretada na glândula mamária. A concentração de lactose no leite é de aproximadamente 5% (4,7 a 5,2%). É um dos elementos mais estáveis do leite, isto é, menos sujeito a variações.

A lactose é o açúcar do leite, sendo praticamente o único que nele existe e se apresenta no leite de todos os mamíferos. Portanto, é a responsável pelo gosto adocicado do leite.Industrialmente, porém, a fermentação da lactose, por ação microbiana, ocupa lugar de maior destaque. Um número elevado de microrganismos transforma a lactose em ácido lático. Uma molécula de lactose transforma-se em 4 moléculas de ácido lático. No leite a acidificação natural é um fato de observação corrente. Em muitos casos a fermentação da lactose com a acidificação do leite é um fenômeno devidamente controlado e dirigido, é aproveitado na indústria de laticínios para obtenção de diversos produtos

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derivados do leite: iogurte, leite acidófilo, queijos, requeijões, ácido lático, caseínas e etc...

Emprego industrial da lactose:a) preparo de leite maternizados;b) preparo de produtos farmacêuticos;c) em laboratórios de microbiologia – meios de cultura;d) na fabricação de queijos (como componente natural do leite).

SAIS MINERAIS E VITAMINAS

O leite é uma fonte excelente da maioria dos sais minerais necessários para o desenvolvimento dos indivíduos jovens. O cálcio e o fósforo do leite apresentam alta disponibilidade, em parte porque se encontram associados à caseína. Por isso, o leite é a melhor fonte de cálcio para o crescimento do esqueleto dos indivíduos jovens e para a manutenção da integridade dos ossos dos adultos. O conteúdo de ferro é baixo.

O leite é uma importante fonte de vitaminas, algumas se associam com a gordura (A, D, E e K), enquanto outras se associam com a parte aquosa. Dentre as últimas, estão as do complexo B e a vitamina C. Mais de dez vitaminas diferentes do complexo B são encontradas no leite. Entretanto, com exceção da vitamina B2 (riboflavina), as outras são encontradas em quantidades pequenas. As vitaminas do complexo B são produzidas no estômago composto (rúmen) dos animais.

O leite é uma fonte importante de vitamina C (ácido ascórbico), mas esta é rapidamente oxidada na presença de cobre em um produto biologicamente inativo.

Sais minerais: no leite existem principalmente fosfatos, citratos, carbonato de sódio, cálcio, potássio e magnésio. A ação fisiológica dos diferentes sais do leite é importante, principalmente do fosfato de cálcio, na formação de ossos e dentes. Daí a necessidade de se alimentar as crianças com maior quantidade de leite.

Vitaminas: o leite constitui uma larga fonte para fornecimento de vitaminas necessárias ao organismo. São encontradas no leite as seguintes vitaminas:

a) Vitamina AA vitamina A é relativamente abundante no leite, estritamente associada à gordura, mas o seu teor é muito variável, tendo como função básica a alimentação verde fornecida ao gado (pastagem);

b) Complexo BVitamina B1 existe no leite em proporções variáveis, cerca de 750 miligramas por litro, os quais 75% das necessidades humanas desta vitamina.

Vitamina B2, riboflavina, desempenha papel importante nas fermentações, na produção dos aromas característicos na manteiga pela formação de diacetil, está presente no leite numa proporção em torno de 1 mg por litro, quantidade que cobre boa parte das necessidades humanas.

Vitamina B4 desempenha ação co-fermento na fermentação lática.

Vitaminas B6 e B12 são outros componentes do complexo B presentes regularmente no leite, em quantidades que exercem um papel fisiológico importante.

c) Vitamina CO leite constitui a fonte mais rica de vitamina C de origem animal, encontra-se

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nele na proporção de 10 a 20 mg por litro. As necessidades humanas são de 50 a 70 mg por dia.

d) Vitamina DO leite, de modo geral, não é muito rico nesta vitamina, pois contém apenas 1 a 2 miligramas por litro. Considera-se que as necessidades alimentares são de umas 10 miligramas. A irradiação do leite pelos raios ultravioleta aumenta extraordinariamente o seu teor de vitamina D, até 1.000 a 2.000 vezes.

e) Vitamina ESe encontra associada à gordura do leite, mas em quantidade insuficiente para atender as necessidades humanas de 1 mg diariamente

f) Vitamina KTem sido encontrada em quantidades variáveis, mas é comum estar presente no leite. Assim, pode-se afirmar que o leite normal conta com todos os elementos vitamínicos necessários a uma boa nutrição.

Uma dieta exclusivamente láctea pode assegurar perfeito desenvolvimento aos mamíferos por períodos relativamente longos.

Tipos de Leite:

Leites caseinosos - leite em que a quantidade de caseína é muito superior às quantidades de albumina e globulina (vaca, cabra e ovelha);Leites albuminosos – leite em que a proporção entre a albumina e globulina é quase igual à caseína (mulher, asna e égua);

Classificação do Leite - Categorias de leite animal comercializadoLeite tipo AOrdenha de leite mecânica

Leite in natura, é retirado pela ordenha mecânica e vai direto para um tanque, onde é aquecido até 70-75 graus Celsius e depois resfriado. Esse processo denomina-se pasteurização, em seguida vai para a máquina embaladora.

Quanto a composição, a diferença entre o A e o B é bem pequena. Os dois são praticamente integrais. O tipo A tem mais gordura e menos proteína que o tipo B.

O leite tipo A dura mais que o tipo B por ter uma quantidade menor de bactérias.

Leite tipo B

As vacas permanecem em estábulos, o que ajuda na manutenção das condições de higiene. Assim como no leite tipo A, a ordenha deve ser mecânica. O local de armazenamento é mais sofisticado do que o tipo C. Permite uma refrigeração a temperaturas mais baixas, entre 3,5 a 4ª graus centigrados. A mecanização contribui para a excelência na extração do leite tipo B.

Em verdade a diferença, está na quantidade de gordura e proteínas constantes no leite tipo B.

Leite tipo C

A ordenha pode ser manual ou mecânica e as vacas ficam soltas no pasto. O leite é armazenado em abrigos rústicos, mas refrigerados, antes de seguir para a usina onde será embalado. Apresenta um teor de gordura de aproximadamente 3%. As usinas utilizam o restante para produzir manteiga, queijo e derivados.

Variedades de leite

De vaca, ou bovino é largamente utilizado na alimentação humana, e rico em vitamina A e cálcio.

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De búfala, muito apreciado e mais gorduroso que o leite bovino.

De cabra, muito comum no Nordeste brasileiro, sendo o tipo de leite mais consumido no mundo.

De camela, muito apreciado entre os beduínos, povo nômade do norte de África.

De égua, consumida na Ásia Central, utilizada na fabricação da bebida Kumis.

Tabela 2. Composição média (%) do leite de diferentes raças de bovinos leiteiros. 

Raça Gordura Proteína Lactose Cinzas Sólidos*

Ayrshire 3,90 3,40 4,81 0,68 8,89

Pardo Suiço 3,30 3,00 5,08 0,72 8,80

Guernsey 3,60 3,20 4,96 0,74 8,90

Holandês 3,40 3,20 4,87 0,68 8,75

Jersey 4,40 3,60 5,00 0,70 9,30

* Sólidos desengordurados

             Fonte : HARRIS & BACHMAN, 1988.

Leite humano

Designa-se por leite materno o leite produzido pelas mulher e que é utilizado para alimentar os bebes. O leite materno é a primeira e principal fonte de nutrição dos recém-nascidos até que se tornem aptos a comer e digerir os alimentos sólidos.

Tem características variadas dependendo da idade gestacional do recém-nascido e cronológica do recém- nascido e da duração da amamentação em si.

É produzido pela mãe de um recém-nascido prematuro ou não, possui grande quantidade de imunoglobulinas (=anticorpos).

Nos primeiros dias de idade o leite tem características bem diferentes, contendo pouca gordura e mais imunoglobulinas, é o chamado colostro.

Entre os humanos, é bastante comum que a mãe tenha pouco leite logo após o parto, principalmente se for seu primeiro filho. A "descida" do leite pode demorar até uns quatro dias e é conhecida como apojadura.

FUNDAMENTO DO MÉTODO

Química do leite

Açucares redutores: Os açúcares redutores possuem grupos aldeídos e cetonas livres na cadeia e são chamados redutores por atuarem como agentes redutores, isto é,que sofrem oxidação (doam elétrons). Açúcares não redutores (como a sacarose) possuem esses grupamentos interligados e tornam-se redutores a partir do momento em que sofrem hidrólise(quebra).

Lactose (Galactose β-1,4 glucose) é um tipo de glicídio. É o açúcar presente no leite e seus derivados. Os açúcares são formados por unidades chamadas sacarídeos. A lactose é formada por duas dessas unidades, a glicose e a galactose, sendo, portanto, um dissacarídeo.

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O leite humano contém de 6-8% de lactose e o de vaca, de 4-6%. Esta é hidrolisada pela ação da lactase, uma beta-galactosidase sendo considerada portanto como um beta-galactosídeo. É fracamente doce. A levedura não a fermenta, mas pode ser adaptada para fazê-lo. Lactobacilos a transformam-na em ácido lático. A Lactose é o hidrato de carbono mais importante no leite da maioria de espécie. É biossintetizado na glândula mamaria. As concentrações no leite variam fortemente com a espécie. A Lactose é o primeiro e único hidrato de carbono que o filhote de mamífero (seres humanos inclusive) consome em quantidades significativas. O leite de Bovídeos contem 45 a 50 gramas de lactose por o litro. Industrialmente, a lactose é produzida do leite de Bovídeos somente, ou a partir dos derivados do leite tais como o soro do queijo ou do filtrado da ultrafiltração. A Lactose é conhecida também como o açúcar de leite.

Na maior parte dos mamíferos, a enzima responsável pela sua hidrólise (a lactase) só é sintetizada durante o período de aleitamento. Na ausência de lactase, a lactose não pode ser digerida, tornando-se por isso uma fonte de alimento abundante para a flora intestinal (que então começa a crescer descontroladamente), e originando por isso náuseas e vómitos, assim como diarréia (por afetar a osmolaridade do intestino delgado). No entanto, desde a domesticação do gado, algumas populações humanas desenvolveram a capacidade de continuarem a sintetizar a lactase durante toda a vida. Origem: Wikipédia, a enciclopédia livre.

O nome químico oficial da lactose, como encontrado freqüentemente em manuais tais como o Pharmacopoeia, é: 4-O-β-D-galactopyranosyl, D-glucopyranose α/β-isomeros. No leite, a lactose se encontra em duas formas isoméricas denominadas de α- e β-lactose.As estruturas moleculares da α- e da β-lactose diferem na orientação de um hidrogênio e em um grupo hidroxila no átomo de carbono 1 (na molécula da glicose). Ambos os isômeros mudam entre si continuamente. Este fenômeno é chamado mutarrotação. A velocidade da mutarrotação é determinada por fatores tais como a temperatura, a concentração, e o pH da solução. As

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soluções de Lactose procuram o estado do equilíbrio entre as formas α e β. Na temperatura ambiente, o equilíbrio resulta em uma relação de 40% α-lactose e 60% de β-lactose aproximadamente. O fato de que dois isomeros da lactose existem e que diferem na estrutura molecular tem efeitos profundos em várias propriedades da lactose, tais como suas propriedades no estado sólido,na morfologia dos cristais e na solubilidade. A Lactose é um dos excipientes mais extensamente usados na indústria farmacêutica. Há muitas razões para esta popularidade, por que a lactose é inerte, relativamente barata, não tóxica e a lactose tem uma longa história de ser aplicada em milhares de formulações bem sucedidas mundialmente. Estas formulações bem sucedidas incluem inalantes, tabletes, cápsulas e saquinhos secos do pó (Sachets).

A lactose, dissacarídio redutor, reduz o íon cúprico do reativo de SOMOGYI a óxido cuproso, em meio alcalino e a quente. Em seguida, o óxido cuproso reage com o anion arseno-molibdato do reativo de NELSON produzindo um composto de coloração azul (óxidos de molibdênio, Mo2O3, com max = 540 nm).

Dentro de certos limites, a intensidade da coloração azul é diretamente proporcional à quantidade de lactose na amostra.

Antes da reação quantitativa, a amostra de leite deve ser desproteinizada e clarificada, mediante precipitação de interferentes com Ba(OH)2 e ZnSO4.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Equipamentos e vidrarias - Espectrofotômetro - Centrífuga de mesa - Banho-maria (ebulição) - Balão volumétrico de 100 mL - Estante com 8 tubos de ensaio e 2 tubos de centrífuga - Pipetas

3.2. Reagentes - Hidróxido de bário 0,3N - Sulfato de zinco 5% - Reativo de Somogyi: dissolver 28 gramas de fosfato monoácido de sódio e 40 gramas de tartarato duplo de sódio e potássio em 700 ml de água. Adicionar 100 ml de NaOH 1N. Gotejar, sob agitação constante, 80 ml de CuSO4.5H2O a 10%. Adicionar 180 gramas de sulfato de sódio anidro e

completar a 1 litro. Deixar em repouso por 2 dias e filtrar. Guardar em frasco

escuro a cerca de 37oC. Filtrar antes do uso. - Reativo de Nelson: dissolver 25 gramas de molibdato de amônio em 450 ml de água destilada. Cuidadosamente, adicionar 26 ml de ácido sulfúrico concentrado. Adicionar 3 gramas de arseniato dibásico de sódio dissolvido em 25 ml de água. Manter em repouso em frasco escuro durante 2 dias antes de uso. - Padrão de lactose: dissolver 0,100 gramas de lactose pura em um litro de água. Esta solução conterá 100 g/ml.

33. Reta Padrão

a) Tomar 6 tubos de ensaio e numerá-los de 0 a 5. Adicionar 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1.0 mL da solução padrão de lactose contendo (100 microgramas/mL = 100 g/mL) e completar o volume a 1.0 mL com água destilada.

b) Acrescentar em cada tubo 1.0 mL do REATIVO DE SOMOGYI e agitar. Deixar em banho-maria fervente por 10 minutos. Esfriar em água corrente.

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c) Adicionar 1.0 ml do REATIVO DE NELSON e agitar. Completar o volume a 10 mL, adicionando 7 ml de água destilada.

d) Fazer leitura em espectrofotômetro em 540 nm. Preencher a tabela abaixo:

TUBO(No)

ÁGUA(ml)

Lactose(mL)

Conc. Obtida (g/mL )

Reat. Somogy (mL)

BanhoMaria(min)

Reat.Nelson (mL)

Compl. Vol. (10 mL)

Transmit.(T%)

Absorb.

∆ Absorb.

0 1.0 0 1.0 10 1.0 7 mL 01 0.8 0.2 1.0 10 1.0 7 mL2 0.6 0.4 1.0 10 1.0 7 mL3 0.4 0.6 1.0 10 1.0 7 mL4 0.2 0.8 1.0 10 1.0 7 mL5 0 1.0 1.0 10 1.0 7 mL

3.4. Preparo das amostras de leite

Cada grupo receberá 2 amostras de leite: uma armazenada em geladeira e outra mantida à temperatura ambiente.

a) Transferir 1 mL (com pipeta volumétrica) da amostra de leite para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada. Agitar bem.

b) Transferir 1 mL (com pipeta volumétrica) da solução diluída de leite para tubo de centrífuga. Efetuar a remoção dos interferentes pela adição de 1,0 mL de ZnS04 a 5% (agitar) e acrescentar 1,0 mL de hidróxido de bário 0,3N. Agitar. Completar a 10 mL adicionado 7 mL de água destilada. Agitar. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos (3.000 rpm).

3.5. Determinação do teor de lactose no leite Determinar os teores de lactose nas duas amostras de leite, preparando as amostras como segue na tabela abaixo:

TUBO Volume(mL)

Reat. Somogy (mL)

Banho Maria ( min.)

Reat.Nelson (mL)

Completar Vol.(10 mL)

Transmit.(T%)

Absorb.

ΔAbsorb.

Concentra

ção.(g/ 100 mL =

%)Leite Ambiente

1.0 1.0 10 1.0 7 mL

LeiteGeladeira

1.0 1.0 10 1.0 7 mL

4. RESULTADOS

4.1. Construir um gráfico com as concentrações de lactose na abscissa (g de lactose por tubo) e as leituras de Absorbância dos padrões (tendo subtraído o valor da leitura da prova em branco, ou seja do tubo no 0), na ordenada.

4.2. Determinar os teores de lactose nas duas amostras de leite utilizando os dados de Δ Absorbância, fazendo-se a interpolação na reta padrão obtida no item acima. Colocar no gráfico os resultados de concentração de lactose encontrados.

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4.3. Expressar os resultados em g/100 mL de leite (%), observar que a amostra de leite analisada foi diluída 1:100.

4.4 Fazer os cálculos escritos no espaço abaixo:

5. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

a. Discutir os resultados obtidos de acordo com a concentração de lactose encontrada nas amostras de leite mantidas em temperatura ambiente e refrigerada. Os resultados obtidos foram os esperados?

b. Qual ou quais as razões para que os resultados da concentração de lactose no leite mantido na temperatura ambiente e refrigerada não serem iguais? Como a temperatura afeta a qualidade do leite?

6. BIBLIOGRAFIA USADA

Listar as bibliografias utilizadas para preparar o relatório (opcional).

Fundamentos de Bioquímica Experimental - Jose Raul Cisternas, Jose Varga e Osmar Monte. Ed. Atheneu 1999, 276 pg.Métodos de Laboratório em Bioquímica – Adelar Bracht e Emy Luiza Ishii-Iwamoto. Ed. Manole, 2003 439 pg.Ivo M. Demiate; G. Wosiacki; Cristina Czelusniak e Alessandro Nogueira. Determinação de açucares redutores e totais em alimentos: comparação entre método colorimetrico e titulometrico. Soil Science 8(1) p. 65-78, 2002.Roberto N. Silva; Valdirene, N.Monteiro; Joana D.X. Alcanfor; Elaine M. Assis; Eduardo R. Asquieri Comparação de métodos para determinação de açucares redutores e totais em mel. Cienc. Tec. Alim. 23(3) p. 337-341, 2003.Elisa M. Isejima; Jose A.B. Costa; Daniel I.S. Junior Método de determinação de açucares redutores aplicável no sistema de pagamento de cana de açúcar. Pesq. Agropec. Brasil. V. 37 (5) p.729-734, 2002.

Questionário:

1 – Qual foi a finalidade deste trabalho pratico?

2 – Cite algumas aplicações da metodologia empregada neste trabalho pratico.

3 – Indique através de cálculos como foram preparadas as soluções:

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Aula Pratica Nº 3 : CROMATOGRAFIA EM PAPEL DE FILTRO

Introdução:

Cromatografia.

A cromatografia é um processo de separação de análise qualitativa, através do qual permite separar constituintes de uma mistura devido à sua distribuição por duas fases uma estacionária (fixa) e outra móvel. O método que utiliza diversas técnicas que tem como objetivo principal a separação de substâncias de uma mistura, com fins analíticos ou preparativos, muito utilizado em laboratórios industriais, de pesquisa e de ensino. Todas as técnicas cromatográficas utilizam uma fase estacionária e uma fase móvel. A fase estacionária é formada de um material escolhido para reter de forma diferenciada os componentes da amostra que se deseja separar. A fase móvel é o material que se desloca pela fase estacionária, arrastando os componentes da amostra. Após transitar pela fase estacionária, por um percurso de distância adequadamente escolhida, os componentes da amostra se separam e são assinalados pelo sistema detector na seqüência: do primeiro componente menos retido, ao último componente mais retido pela fase estacionária. A escolha do processo a usar depende do tipo de equilíbrio estabelecido entre as fases estacionária e móvel e a mistura que se quer separar. Sendo o mais importante o equilíbrio entre a fase estacionária e a mistura. Esta separação resulta das diferenças de velocidade dos componentes arrastados pela fase móvel devido às diferentes interações com a fase estacionária. Os principais métodos cromatográficos são: cromatografia em papel (CP), cromatografia de camada delgada (CCD), cromatografia gasosa (CG) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).

CROMATOGRAFIA EM PAPEL:

A cromatografia em papel (CP) é uma das técnicas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realização, porém é a que apresenta as maiores restrições para sua utilização em termos analíticos. Neste tipo de cromatografia, uma amostra líquida flui por uma tira de papel adsorvente disposto verticalmente.O papel é composto por moléculas de celulose que possuem uma forte afinidade pela água presente na mistura de solvente, mas muito pouca afinidade pela fase orgânica, atuando como suporte inerte contendo a fase estacionária aquosa (polar). A medida que o solvente contendo o soluto flui através do papel, uma partição deste composto ocorre entre a fase móvel orgânica (pouco polar) e a fase estacionária aquosa. Desta forma, parte do soluto deixa o papel e entra na fase móvel. Quando a fase móvel alcança uma seção do papel que não contém soluto, o fenômeno de partição ocorre novamente, só que agora o soluto é transferido da fase móvel para a fase estacionária. Com o fluxo contínuo de solvente, o efeito desta partição entre a fases móvel e estacionária possibilita a transferência do soluto do seu ponto de aplicação no papel, para um outro ponto localizado a alguma distância do local de aplicação no sentido do fluxo de solvente.

CAMADA DELGADA

Na cromatografia em camada delgada (TLC), a fase estacionária é uma camada fina formada por um sólido granulado (sílica, alumina, poliamida, etc.) depositado sobre uma placa de vidro, alumínio ou outro suporte inerte. Pequenas gotas de solução das amostras a serem analisadas são aplicadas em um ponto próximo ao extremo inferior da placa. Deixa-se a placa secar e, então se coloca a mesma em um recipiente contendo a fase móvel (solvente ou mistura de solventes). A polaridade do solvente deverá ser de acordo com a substância que se deseja separar.

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Como somente a base da placa fica submersa, o solvente começa a molhar a fase estacionária e sob por capilaridade. Deixa-se secar a placa após o deslocamento da fase móvel sobre ela. A revelação da placa é feita com a aplicação de um reativo que de cor às substâncias de interesse.

CROMATOGRAFIA GASOSA

A cromatografia gasosa (CG) é uma técnica com poder de resolução excelente, possibilitando a análise de várias substâncias em uma mesma amostra. Dependendo do tipo de substância a ser analisada e do detector empregado, consegue-se detectar cerca de 10-12 g do composto por mL de solução. Essa sensibilidade permite que pequenas quantidades de amostra possam ser analisadas. A fase estacionária da cromatografia gasosa é um material, líquido ou sólido, que propicia a separação da mistura através de processos físicos e químicos. A fase estacionária líquida é um líquido pouco volátil que recobre um suporte sólido, separando as substancias presentes na amostra através das diferenças de solubilidadee volatilidade. Como fase móvel é utilizado um gás, denominado gás de arraste, que transporta a amostra através da coluna de separação até o detector, onde os compostos separados são detectados.Os gases mais utilizados são o hélio (He), hidrogênio (H), nitrogênio (N) e argônio (Ar). Como o He é de difícil obtenção e alto custo é pouco utilizado no Brasil. A pureza do gás de arraste interfere no resultado, acusando impurezas na ordem de partes por milhão (ppm) ou partes por bilhão (ppb).As colunas cromatográficas utilizadas podem ser de níquel, aço inox ou de vidro. De acordo com o aparelho, as colunas variam de formato, mas na maioria das vezes elas são espirais. O comprimento e o diâmetro da coluna a ser usada irá depender do material a ser analisado.As colunas recheadas analíticas possuem diâmetro interno (d.i.) de cerca de 1,0 a 4,0 mm e comprimento de 1,0 a 3,0 m, enquanto que as colunas recheadas preparativas apresentam d.i. de 5,0 a 100,0 mm, possibilitando a injeção de maior volume de amostra. Já, as colunas capilares têm d.i. variando de 0,15 a 0,75 mm e comprimento de 10,0 a 100,0 m, sendo as mais utilizadas as de sílica fundida, pois esta é altamente inerte e flexível.Os detectores são dispositivos que transformam as variações na composição do gás de arraste em sinais elétricos. Existe diferentes tipos de detectores: 1) detector de condutividade térmica (DCT), usado para compostos orgânicos, inorgânicos, derivadosde petróleo etc. Os DCT possuem dois ou quatro filamentos de platina (Pt), tungstênio (W), níquel (Ni) ou Pt - W, os quais são aquecidos por corrente elétrica. Conforme o gás passa pelos filamentos há transferência de calor e, o tempo da passagem do gás, juntamente com a condutividade térmica são registrados, efetuando-se assim, a análise. Esta análise é feita comparando-se o gás de arraste puro (que passa por um conjunto de filamentos) com o gás de arraste com a amostra (que passa por outro conjunto de filamentos). 2) detector de ionização de chama (DIC), utilizados apenas para compostos orgânicos com baixa sensibilidade para formaldeído e ácido fórmico, consiste de um campo elétrico (200 - 300 v) e uma chama onde a amostra é queimada. A combustão resulta em radicais livres que são ionizados pelo campo elétrico, aumentando a corrente nos eletrodos. 3) detector de captura de elétrons (DCE), usado principalmente na detecção de pesticidas e drogas. Neste detectorhá uma fonte de radiação beta em corrente constante. O gás de arraste passa com uma amostra onde há substituição de um elétron por um íon negativo, o que diminui a corrente elétrica. O gás de arraste com a amostra é comparado com o gás de arraste puro (corrente de fundo), que quanto maior seu valor maior é a sensibilidade do detector. A diminuição do valor da corrente de fundo é sinal de impureza, vazamento da fonte, sujeira ou coluna mal condicionada. O gás de arraste usado é o N2 livre de H2 e O2, isto é, gás N2 ultrapuro. 5) detector fotométrico de chama (DFC) apresenta alta estabilidade para compostos sulfurados e fosforados. Há uma combustão no campo elétrico com emissão de luz de diversos comprimentos de ondas. Filtros

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eliminam as radiações desnecessárias, selecionando as de interesse, em especial as que tenham enxofre (S) e fósforo (P). O gás de arraste é o N2 e dachama é o H2 com ar ultrapuro e seco.A pureza dos reagentes deve ser na ordem de partes por trilhão (ppt).

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ou HPLC) se desenvolveu muito nos últimos anos, recebendo o nome de cromatografia líquida por que a sua fase móvel é um solvente.Os componentes de um cromatógrafo líquido são: bomba, coluna cromatográfica, detector e o registrador. É um método utilizado para separação de espécies iônicas ou macromoléculas e compostos termolábeis.A fase móvel da CLAE deve ser um solvente que respeite algumas características impostas por esse método analítico. A principal característica é que a fase móvel dissolva a amostra sem qualquer interação química entre ambas. Esta fase deve ter alto grau de pureza ou ser de fácil purificação, para que se possam fazer análises de alta sensibilidade, pois as impurezas podem interferir na detecção do analito por ultravioleta (UV). A fase móvel deve ser compatível com o detector empregado e, também possuir polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra. Embora existam vários solventes, três deles são mais utilizados: água, metanol e acetonitrila.Como fase estacionária utilizam-se sólidos ou semirígidos, cujas partículas porosas esféricas ou irregulares apresentam diferentes diâmetros e suportam pressão até 350 bar.A coluna cromatográfica é feita de um material inerte que resiste a todas as pressões em que ela vai ser usada. A capacidade da coluna é determinada pelo comprimento, diâmetro e pelo material de recheio. As colunas geralmente utilizadas são: octadecil (C18, RP18, ODS), octil (C8, RP8), CN (cianopropil) e NH2 (amina). Quanto aos detectores, não existe um que apresente todas as propriedades para que ele seja ideal para CLAE. Não são versáteis, ou universais, mas existem detectores que apresentam ampla faixa de aplicações. A sensibilidade de um detector é determinada a partir da relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gera este sinal. A linearidade é a faixa linear do sistema, onde o sinal do detector é diretamente proporcional à concentração do soluto.Os detectores mais usadas na CLAE são os fotométricos, baseados na absorbância no ultra violeta e no visível. Os detectores de fluorescência, utilizados como método de detecção específica, são sensíveis para substâncias que fluorescem. Este tipo de detector pode detectar quantidades de ordem picograma. Também são utilizados detectores por índice de refração, os quais acompanham continuamente a diferença no índice de refração entre a fase móvel pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra. A resposta deste detector é moderada, geralmente de ordem micrograma.

Técnicas cromatográficas:

A- Cromatografia de adsorção

Nesta a fase estacionária é sólida e a fase móvel pode ser líquida ou gasosa. Esta baseia-se nas diferentes afinidades adsorventes da superfície da fase estacionária pelas moléculas da substância a separar.

B- Cromatografia de partição

Nesta fase a fase estacionária é líquida. Este processo é baseado na diferente solubilidade dos componentes da mistura nas duas fases líquidas.

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Cromatografia em camada fina (plana) (TLC): a retenção das substâncias deve-se à adsorção sofrida na superfície da fase estacionária, colocada sobre um dos lados de uma placa de vidro ou metal.

Cromatografia em coluna: utiliza-se uma coluna de vidro aberta na parte superior e munida de uma torneira na extremidade inferior, por onde sai o líquido (eluído). Dentro da coluna encontra-se a fase estacionária constituída por um enchimento sólido no caso da cromatografia de adsorção, ou por uma fase líquida no caso da cromatografia de partição. A fase móvel é líquida em ambos os casos.

Cromatografia em papel (plana): a retenção das substâncias é devida à partição das duas fases líquidas, uma móvel e outra estacionária, sendo esta constituída pelo líquido absorvido no papel. Encontra-se bastante divulgada devido à sua facilidade experimental e ao seu baixo custo.

Este é o tipo que será utilizado na aula prática. Usualmente, trabalha-se com papel Whatmann, com a devida especificação (número 4 por exemplo).

Para efeito de facilidade vamos enumerar alguns termos de uso corrente:

a) Cromatografia - consta de papel devidamente tratado, ou seja, cortando de acordo com as dimensões da câmara onde será colocado, no qual fizemos “manchas” de soluções padrões ou de soluções problemas.

b) Câmaras cromatográficas - são os recipientes, hermeticamente fechados, onde os cromatogramas são desenvolvidos;

c) Linha básica - é a linha traçada, geralmente a três centímetros do bordo inferior do papel, sobre o qual distribuímos as “manchas” de solutos.

Alguns cuidados que devem ser tomados:

a) antes de ser iniciar o processo cromatográfico, a câmara, contendo a mistura de solvente, já deve estar saturada de seus vapores,

b) o solvente não deve correr até o bordo superior do papel (cuidado com o número de horas de processamento) e nem tampouco uma pequena distância. De preferência até uns 2 a 3 cm do bordo superior.

Os tipos de câmara cromatográfica variam de tamanho e forma, desde as mais bem trabalhadas, até a um simples tubo de ensaio ou proveta.

As modalidades de cromatografia em papel são as mais variadas possíveis. Temos cromatografia ascendente e descendente, mono e bidimensional, vertical e horizontal. Mais orientações a respeito serão fornecidas pelo professor durante a aula.

Cálculo de Rf ( Fator de Retenção)

Imaginemos o seguinte diagrama

limite até onde o solvente

atingiu

sentido em que b’o cromatograma c’ xfoi desenvolvido d’ a’

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c’

a b c d linha básica

Chama-se de Rf a relação existente entre a distância percorrida pelo soluto (até o centro da mancha), pela distância total percorrida pelo solvente.

Assim: Rfa = a’/x Rfb = b’/x Rfc = c’/x Rfd= d’/x

Os valores de Rf fornecem uma orientação quanto à distribuição dos solventes ao longo do papel.

Teoria sobre Rf (equação de Martin e Synge)

Chama-se de Rf a relação:

Al

Al + a As

onde: a = coeficiente de partiçãoAs = área ocupada pelo soluto na fase estacionáriaAl = área ocupada pelo soluto na fase móvel

Solventes usados em cromatografia:

De acordo com as substâncias a serem cromatografadas, utilizamos solvente os mais diversos

Fenol - Água (80: 20)Usado para cromatografia de aminoácidos. Pode-se inclusive adicionar 40 mg de 8-hidroxiquinolina de 1 ml de NH4OH concentrado por 100 ml de solvente.

Butanol: H2O (4: 1: 1)Também empregado na cromatografia de aminoácidos, açúcares etc.

Benzol: butanol: Piridina: H2O (5: 3: 3: 1)

Existem basicamente três modos de revelação

a) Pelo uso da luz ultra-violeta: empregado quando os compostos possuem núcleo que revelam o comprim,ento de onda ao nível do U.V;

b) Uso de reagentes: comumente utiliza-se para açúcares e imersão na seguinte solução: 1 ml de anilina + 1g de difenilamina + 100 ml de acetona + 10 ml de H2PO4 a 85%.

Para aminoácidos pulveriza-se o papel com solução de ninhidrina a 0,3% em álcool (usado nesta aula)

Para ácidos orgânicos pulveriza-se o papel com a seguinte solução: 1g de xilose + 3 ml de água + 1 ml de anilina + 100 ml de álcool metílico;

c) Detectores especiais

PARTE PRÁTICA

1) Preparação do papel de filtro

Examinar a câmara cromatográfica e planejar as dimensões do papel. Tome muito cuidado para não tocar o mesmo com os dedos, visto que há contaminação com aminoácidos da mão. Cada grupo montará um cromatograma.

2) Padrões de aminoácidos: arginina, ácido glutâmico. leucina e prolina

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Preparar padrões de aminoácidos 0,01 M e guardá-los no congelador.

Cada grupo receberá três padrões diferentes com a finalidade de comparar estas três manchas com as produzidas pela amostra problema (esta será fornecida pelo professor).

Montagem do cromatograma

Traçar numa linha básica a 3 cm da base do papel e deixar 2 cm de bordadura

Distribuir as soluções a serem analisadas no papel dentro nos pontos marcados

Em seguida fazer manchas de área aproximada de 0,5 cm2 utilizando um volume de 40-50 microlitros usando micropipetas.

Secar as manchas conforme instruções dadas pelo professor

Adaptar o cromatograma à câmara tomando sempre o cuidado de não tocá-lo com os dedos.

Front

Mistura aa1 aa2 aa3 aa 4

3 cm

Deixar o cromatograma correndo até que o solvente atinja uns 2 ou 3 cm abaixo do bordo superior do papel

Em seguida retire-o e deixe secar. Após a secagem pulverizar ninidrina a 0,3% em solução alcoólica. Levar o cromatograma à estufa à temperatura de 60 - 65oC até aparecimento de manchas coloridas

Determinação do Rf:

Marcar o limite até onde o solvente atingiu (front).

Medir a distância da linha básica até o “front”(x) , marcar o centro das manchas A, B, C e D. Verificar as distâncias d A, d B, d C, e d D, que vão desde a linha básica até o centro de A, B, C e D.

Calcular os Rfs dA dB

Rfa = Rfb = x x

RESULTADOS E DISCUSSÃO

1. Escrever quais os aminoácidos estudados em classe e a coloração deles na reação com ninidrina

2. Apresentar Rf dos aminoácidos utilizados no experimento

3. Qual aminoácido apresentou maior Rf e porque?

4. Qual aminoácido apresentou menor Rf e porque?

5. Os aminoácidos apresentaram coloração diferente? Porque?

6. Quais aminoácidos estão presente na mistura?

7. Quais as aplicações da metodologia da cromatografia?

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BIBLIOGRAFIA

NOÇÕES BÁSICAS DE CROMATOGRAFIA Terezinha Bonanho PeresCentro de Pesquisa e Desenvolvimento de Proteção Ambiental-Instituto Biológico , São Paulo, v.64, n.2, p.227-229, jul./dez., 2002COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Introdução a métodos cromatográficos. 6. Ed. Campinas: Editora UNICAMP,1995.CIOLA, R. Introdução à cromatografia em fase gasosa. São Paulo:Edgard Blücher, 1973.CIOLA R. Fundamentos da cromatografia a líquido de alto desempenho HPLC. 1ª. Ed. São Paulo: Edgard Blücher,1998.

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Aula Pratica Nº 4 : DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNAS NO LEITE (PELA REAÇÃO DO BIURETO)

1. FUNDAMENTO DA METODOLOGIA

As proteínas podem ser dosadas em diversos materiais biológicos por várias metodologias. A reação do “Biureto”, que é utilizada para a caracterização de proteínas, pode ser empregada para a quantificação das mesmas mediante a colorimetria.

O fundamento da metodologia se baseia no fato de que as proteínas formam um complexo com o íon cúprico (Cu++) em meio alcalino, e tal complexo apresenta um pico de absorção a 540 nm. A reação é positiva para peptídios constituídos de no mínimo de três aminoácidos. Tal complexação também ocorre com o biureto (H2N-CO-NH-CO-NH2), daí o nome da reação.(Figura 1)

Figura 1: Complexo de cor violeta (púrpura)

2. MATERIAL E MÉTODOS:

Equipamentos e Vidrarias:

ESPECTROFOTÔMETRO (540 nm) Estante com 7 tubos de ensaio1 pipeta graduada de 5 mL2 pipetas graduadas de 10 mL

Reagentes:

Reagente do Biureto

Pesar 1.5 g de CuSO4.5H2O e 6g de tartarato duplo de sódio e potássio, dissolvê-los em água destilada completando o volume a aproximadamente 500 ml. Juntar, sob agitação, 300 mL de NaOH 10% e completar a 1 litro.

Padrão de Caseína (5 mg/mL) -

dissolver 2,5g de caseína em 500 mL de NaOH 0,1 N

3. PROCEDIMENTO ANALÍTICO

1. Transferir 1 ml de leite (pipeta volumétrica) para tubo de ensaio e completar o volume com 9 ml de água destilada (esta solução corresponde ao leite diluído 1:10). Agitar bem.

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2. Em 7 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 6, pipetar os componentes conforme o quadro abaixo.

3. Após a adição do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em repouso por 30 minutos. A coloração púrpura formada á indicativo da presença de proteínas.

4. Fazer leitura de Transmitância a 540 nm em espectrotofômetro e converter em Absorbância com auxílio de tabela (Ab = 2 - log T).

5. Com os dados obtidos dos tubos 0 a 5, fazer um gráfico em papel milimetrado contendo no eixo Y os valores de Absorbância ou Leitura e no eixo X as concentrações de caseína expressas em mg/tubo.

6. Interpolar o valor de leitura da amostra de leite diluído e calcular a concentração de caseína no leite expressando o valor em mg/100 mL de leite.

TUBO(NO)

ÁGUADESTIL.

CASEÍNA(6 mg/mL)

CASEÍNA(mg/tubo)

REATIVOBIURETO

Transmitância(%)

ABSORB.540 nm

ABSORB.540 nm

0 4.0 0.0 5 01 3.5 0.5 52 3.0 1.0 53 2.5 1.5 54 2.0 2.0 55 1.5 2.5 56 1 mL leite diluído

(1:10)x 5

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO:

1. Completar tabela2. Gráfico com os valores de absorbância (y) e concentração (x)3. Determinar o valor da concentração de caseína no leite através do gráfico

e dar o resultado em mg/100mL de leite4. Discutir o valor encontrado em relação ao valor nutricional do leite.5. O quê ocorre com a caseína do leite quando o valor de pH fica abaixo de

6.5?

ABSORB. (540 nm)

6. BIBLIOGRAFIA

AOAC. Association of Official Analytical Chemists. Official methods of analysis of AOAC International. 16th ed. Gaitheersburg, 1997. Cap. 39, p. 6-7.

BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein dye binding. Analytical Biochem., v. 72, p. 248-254, 1976.

30

Concentração (mg/tubo)

LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bactiophage t4. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970.

RAGHUNATH, M.R.; SANKAR, T.V.; AMMU, K.; DEVADASAN, K. Biochemical and nutritional changes in fish proteins during drying. J. Sci. Food Agric., v. 67, n. 2, p. 197-204, 1995.

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADALivros textos1- VOET & VOET - Biochemistry - John Wiley and Sons, New York. 1995.2- VOET, VOET & PRATT – Fundamentos de Bioquímica – Artmed Editora, São Paulo. 2000.3- CAMPBELL - Biochemistry - Harcourt Brace College Publishers, New York. 1994.4- CAMPBELL – Bioquímica – Artmed Editora, 3a ed., São Paulo. 1999.5- LEHNINGER, NELSON & COX - Principles of Biochemistry - 2a ed. Worth Publishers, New York. 1993. 6- LEHNINGER – Princípios de Bioquímica - Editora Sarvier, São Paulo. 1985.7- RAWN - Biochemistry - Neil Patterson Publishers - Burlington, North Carolina8- ANDERSON & BEARDALL - Molecular Activities of Plant Cells- Black Well Scientific publications, Oxford.9- WHITE, HANDLER & SMITH - Bioquímica: Aspectos Gerais - Editora Guanabarana Koogan, Rio de Janeiro.10- SMITH, HILL, LEHMAN, LEFKOWITZ, HANDLER & WHITE - Bioquímica Mamíferos - Guanabara - Koogan, Rio de Janeiro.11- STRYER - Bioquímica - 4a ed. Editora Reverté, Madrid. 1995.12- CONN & STUMPF - Introdução à Bioquímica - Editora Edgard Blucher - São Paulo.13- CORREIA - Bioquímica Animal - Editora Fundação Calouste Gulbenkian.14- VIEIRA, GUAZZINELLI & MARES-GUIA - Bioquímica Celular - Ed. Ateneu, São Paulo.

31

Aula Pratica Nº 5 : DETERMINAÇÕES DA CONSTANTE DE MICHAELIS (Km)

E DA VELOCIDADE MÁXIMA (Vm) PARA A INVERTASE DE LEVEDURA

1. OBJETIVOS

Determinar os parâmetros Km e Vm da enzima invertase utilizando a sacarose como substrato, mediante o estudo cinético da reação.

2. FUNDAMENTOSAs reações químicas conduzidas pelos organismos vivos são, na sua grande maioria, catalisadas enzimaticamente, tornando a velocidade das mesmas compatíveis com as exigências metabólicas. A enzima escolhida para este estudo é justamente a invertase da levedura que catalisa a hidrólise da sacarose para produzir glicose e frutose:

C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6

sacarose água glicose frutose

Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (µg) de açúcar redutor formado, por um cálculo estequiométrico simples, pode-se determinar a quantidade correspondente (µg) sacarose hidrolisada. Podemos determinar a afinidade de determinada enzima pelo substrato da reação que catalisa utilizando um valor KM, que é a concentração de substrato necessária para se atingir metade da velocidade máxima da reação catalisada pela enzima em questão. Um modelo da reação onde a enzima interage com o substrato está fornecido abaixo:

E + S ES E + P onde E é a enzima, S é o substrato, ES é o complexo enzima-substrato e P é o produto da reação. Observe que a enzima é devolvida ao meio na mesma proporção em que foi utilizada na reação à esquerda. Michaelis e Menten, com essas considerações, desenvolveram a expressão de velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e desta forma puderam descrever o comportamento de diversas enzimas.

V = Vmáx * [S] KM + [S]

onde [S] é a concentração do substrato e Vmáx é a velocidade máxima da reação, em mol (de produto formado) por unidade de tempo.

Assim a levedura (Saccharomyces cerevisiae), por intermédio da "invertase" hidrolisa a sacarose resultando numa mistura equimolecular de glicose e frutose, açúcares esses que são absorvidos pela célula. A membrana plasmática é impermeável à sacarose, e a levedura acaba excretando a invertase (sendo, pois, uma exoenzima) para a hidrólise ocorrer fora da célula de levedura.

32

Figura 2: Saccharomyces cerevisiae

Figura 3. Imagem de levedura (Saccharomyces cerevisiae) da University of Kent Biosciences. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/2004/bossie/mfyg.html

Figura 4: Hidrólise da sacarose catalisada pela invertase. Tanto a glicose quanto a frutose são açúcares redutores.

No presente experimento a invertase será obtida de levedura de panificação (fermento Fleischmann) e adicionada à sacarose (açúcar não redutor), cuja hidrólise resulta na formação de açúcares redutores (glicose e frutose) que serão estimados pela reação de Somogyi-Nelson.

Para tal se colocará a enzima frente à diferentes concentrações de substrato (sacarose), resultando em diferentes velocidades de reação enzimática, permitindo, mediante um tratamento matemático adequado, determinar graficamente os valores de Km e Vm para a reação enzimática da levedura. 3. MATERIAL

33

3.1. Equipamentos e Vidrarias - Espectrofotômetro - Estante com 8 tubos de ensaio (por grupo) - 2 pipetas graduadas de 2 mL (por grupo) - 1 pipeta graduada de 1 mL (por grupo) - 1 pipeta volumétrica de 1 mL (por grupo) - Centrífuga e banho-Maria para dosagem de açúcares redutores

3.2. Reagente - 4 g de fermento prensado tipo Fleischmann - Reagente de Somogyi - Reagente de Nelson - Padrão de açúcar redutor (100 ug de glicose por 2,5 mL)

- Substrato (sacarose 12,5 mM = 4,27 g/L)

4. PROCEDIMENTO

4.1. Extração da enzima

Transferir 4 g de fermento de panificação para tubo de centrífuga,

adicionar 20 mL de água destilada e deixar em estufa a 37oC por 30 minutos agitando casualmente. Centrifugar a 1.000 x g por 15 minutos recolhendo o sobrenadante que contém a enzima invertase. Fazer uma diluição de 1:100 ou 1:200 (a critério do professor).

4.2. Ensaio enzimático

Em 8 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 7, pipetar os volumes (em mL) das soluções conforme indica o quadro que se segue:

TUBO(NO)

SACAROSE12,5 mM

ÁGUA INVERTASEDILUÍDA

0 0,0 2,0 0,51 0,4 1,6 0,52 0,8 1,2 0,53 1,2 0,8 0,54 1,6 0,4 0,55 2,0 0,0 0,56 2,0 0,5 0,07 2,5 mL de

padrãocontendo 100 ug de glicose

Incubar os tubos (exceto o tubo no 7) a 37oC, por 15 minutos, para que a invertase catalise a hidrólise da sacarose, resultando na formação de glicose e frutose (açúcares redutores), os quais podem ser determinados pela reação de Somogyi-Nelson.

4.3. Reação para dosagem de açúcares redutores.

Tão logo termine o período de incubação acrescentar 1 mL do reativo de Somogy (a reação enzimática é paralisada pela desnaturação da invertase, quer pela ação do Cu++ ou pela alcalinidade do reagente).

Ferver os tubos em banho-maria por 10 minutos, resfriá-los e juntar 1 mL do reativo de Nelson.

Agitar, completar o volume a 10 mL (adicionando 5,5 mL de água destilada), agitar novamente a fazer leitura a 530 nm.

34

5. ANÁLISES DOS RESULTADOS E DISCUSSÃO

Coletar os dados, organizando-os conforme o quadro que se segue.

Tabela 1: Determinação de (S) e (V) e 1/(S) e 1/(V) para a invertase

TUBO(NO)

T%530 nm

D.O.530 nm

D.O.530 nm

[S]* V** 1 [S]

1 V

0 0 mM1 2 mM2 4 mM3 6 mM4 8 mM5 10 mM6 - - - -7 - - - -* [S] = concentração de substrato (sacarose) no meio de reação enzimática expressa em milimolaridade mM.** V = velocidade de reação enzimática expressa em g (micrograma) de glicose (açúcar redutor) formado por hora.

PARA O RELATÓRIO:

1. Preencher a Tabela 1

2. Transformar as leituras de densidade ótica em quantidades de açúcar redutor

3. Calcular as velocidades de reação (V) para cada tubo. Com os dados construir os gráficos V em função de [S] e 1/V em função de 1/[S].

4. Determinar analiticamente os valores de Km e Vmáx e discutir os seus significados bioquímicos.

5. Explique o que ocorre nos tubos 0 e 6 comparando os resultados obtidos no experimento.

BIBLIOGRAFIA

ADELAR BRACHT E EMY LUIZA ISHII-IWAMOTO

Métodos de Laboratório em Bioquímica, Ed. Manole 1ª Ed. 2003

AVRON, M., "Mechanism of photoinduced electron transport in isolated

chloroplasts", in D.R. Sanadi (ed.), Current Topics of Bioenergetics,

12, Academic Press, New York, 1967, p.1.

HAGEMAN, R.H. & D. FLESHER. Nitrate reductase activity in corn seedling as effected by light and nitrate content of nutrient media. Plant Physiology, 35: 700-708 (1960).

HEWITT, E.J. Physiological and Biochemical factors which control the assimilation of inorganic nitrogen supplies by plants. In

35

"Nitrogen Nutrition of the Plant", E.A. Kirkby (ed.), Un. Leeds, 1970. p.78-103.

JACOBS, M.B. The Chemical Analysis of Foods and Food Products. Van Nostrand, New York, 1958, 970 p.

LITWACK, G. Experimental Biochemistry - A Laboratory Manual. John Wiley & Sons, Inc., New York, 1960, 313p.

MARTELLI, H.L. & PANEK, A.D. Bioquímica Experimental. Ao Livro Técnico, Rio de Janeiro, 1968, 112p.

VILLELA, G.G.; BACILA, M. e TASTALDI, H. Técnicas e Experimentos de Bioquímica. Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1972, 522 p.

WHARTON, D.C. & Mc CARTY, R.E. Experiments and Methods in Biochemistry. McMillan Publishing Co, Inc., New York, 1972, 350p.

36

Aula Pratica Nº 6 : REAÇÃO DE HILL (FOTÓLISE DA ÁGUA)

1. OBJETIVOS

Avaliar a habilidade metabólica do cloroplasto de promover a fotólise da água, o primeiro passo na sequência de reações da fotossíntese.

2. FUNDAMENTOS

O processo fotossintético, que ocorre no interior do cloroplasto, compreende 2 etapas:

a) Fase luminosa: dependente de luz, ocorrendo a fotólise da água

acoplada com as produções de NADPH+H+ (fotorredução) e de ATP (fotofosforilação), conforme a equação abaixo.

luz

NADP+ + ADP + Pi + H20 NADPH + H+ + ATP +½02

cloroplastos

b) Fase escura: não depende de luz e corresponde à redução do CO2

ao nível de carboidrato às expensas do NADPH+H+ e ATP.

escuro

NADPH + H+ + ATP + CO2 NADP+ + ADP + Pi + C(H20)

cloroplastos

Hill, em 1937, tentando desvendar o processo fotossintético

empregando cloroplastos isolados de espinafre, pretendia a redução do C02

ao nível de carboidrato. Por dificuldades técnicas, limitadas pela época, não

conseguiu o seu intento, mas chegou a demonstrar a habilidade de

cloroplastos isolados de reduzir outros compostos em um processo acoplado

à fotólise da água com evolução de 02:

luz

2Fe+3 + H20 2Fe+2 + 2H+ + ½02

cloroplastos Assim a produção fotoquímica de oxigênio exige a presença de um

aceptor de H+ e/ou elétrons, que necessariamente não precida ser o CO2.

No presente experimento será utilizado como aceptor de elétrons (reagente de Hill) um indicador de óxido-redução, o 2,6-diclorofenolindofenol, que na forma oxidada é azul (com max ao redor de 540 nm) e na forma reduzida é incolor, o que permite o acompanhamento da reação fotoquímica mediada por cloroplastos isolados de espinafre.

37

3. MATERIAL

3.1. Equipamentos e Vidrarias

- Tubos de ensaio (4 por grupo) - Centrífuga de mesa com tubos (10 ml) - Banho de gêlo - Almofariz com pistilo (1 para cada grupo) - Lâmpada de 100 W (2) - Folha de alumínio

- Banho maria (100oC)

3.2. Reagentes - Sacarose 0,35M - Tampão fosfato 0,05 M (pH = 6,5) contendo sacarose 0,35 M - 2,6-diclorofenol indofenol (16 mg/100 ml) - Ácido ascórbico (cristais)

4. PROCEDIMENTO

4.1. Extração dos Cloroplastos

a) Picar 5 g de folhas de espinafre e homogeneizar em almofariz usando areia lavada como abrasivo e 10 ml de sacarose 0,35 M (adicionados aos poucos) como extrator.

b) Filtrar o homogeneizado em gase, ou algodão.c) Centrifugar por 2 minutos a 200 x g, (1300 rpm) desprezar o

precipitado e centrifugar novamente o sobrenadante por 7 minutos a 1000 xg. (3000 rpm)

d) Ressuspender os cloroplastos lavados em 10 ml de tampão fosfato 0,05 M (pH= 6,5) contendo sacarose 0,35 M. Manter em banho de gelo até o momento do uso.

4.2. EnsaioPreparar 4 tubos de colorímetro conforme o quadro que se segue:

TUBOSSUSPENSÃ

O

CLOROPLA

STO

(mL)

TAMPÃO

FOSFATO

(mL)

2,6-DCF

(mL)

OBSERVAÇÕES

1 1,5

(+

ác.ascórbico

)

3 0,5 ajustar o “zero”do

aparelho

2 1,5 3 0,5 ler imediatamente

3 1,5 3 0,5 ler imediatamente e

cobrir com folha de

Alumínio

4 1,5

(ferver 3’)

3 0,5

Os tubos 2, 3 e 4 são expostos à luz de lâmpada (100 W) durante 1

minuto (o tubo nº 3 protegido da luz) e faz-se a leitura de absorbância (D.0)

repetindo a operação 4 vezes.

38

5. ANÁLISES DOS RESULTADOS

Anotar as leituras obtidas e fazer um gráfico

Discutir os resultados:

a) Qual a função do ácido ascórbico?

b) Qual a função do 2,6 DCF?

c) Descreva o observado nos tubos 2, 3 e 4 durante as leituras.

d) Quais tubos ocorre fotossíntese? Porque?

e) Quais tubos não ocorre a fotossíntese? Porque?

BIBLIOGRAFIA:

ADELAR BRACHT E EMY LUIZA ISHII-IWAMOTO

Métodos de Laboratório em Bioquímica, Ed. Manole 1ª Ed. 2003

AVRON, M., "Mechanism of photoinduced electron transport in isolated

chloroplasts", in D.R. Sanadi (ed.), Current Topics of Bioenergetics,

12, Academic Press, New York, 1967, p.1.

HAGEMAN, R.H. & D. FLESHER. Nitrate reductase activity in corn seedling as effected by light and nitrate content of nutrient media. Plant Physiology, 35: 700-708 (1960).

HEWITT, E.J. Physiological and Biochemical factors wich control the assimilation of inorganic nitrogen supplies by plants. In

"Nitrogen Nutrition of the Plant", E.A. Kirkby (ed.), Un. Leeds, 1970. p.78-103.

JACOBS, M.B. The Chemical Analysis of Foods and Food Products. Van Nostrand, New York, 1958, 970 p.

LITWACK, G. Experimental Biochemistry - A Laboratory Manual. John Wiley & Sons, Inc., New York, 1960, 313p.

MARTELLI, H.L. & PANEK, A.D. Bioquímica Experimental. Ao Livro Técnico, Rio de Janeiro, 1968, 112p.

VILLELA, G.G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Técnicas e Experimentos de Bioquímica. Koogan, Rio de Janeiro, 1973, 552p.

WHARTON, D.C. & Mc CARTY, R.E. Experiments and Methods in Biochemistry. McMillan Publishing Co, Inc., New York, 1972, 350p.

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Aula Pratica Nº 7 : ANALISE DA REDUTASE DE NITRATO EM PLANTAS

1. OBJETIVOS

Verificar a habilidade de tecidos vegetais de reduzir o nitrato, o primeiro passo na utilização metabólica dessa forma nitrogenada, avaliando-se ainda o efeito da luminosidade.

2. FUNDAMENTOS

O nitrato (NO3-) é a forma nitrogenada mais abundante no solo e as

plantas desenvolveram mecanismos bioquímicos para a sua utilização. Para

tal o NO3- é reduzido a NO2- pela enzima "redutase de nitrato"e a seguir o

NO2- é transformado em amônia (NH3) pela "redutase de nitrito. A amônia é

posteriormente assimilada resultando nos compostos orgânicos nitrogenados.

A redutase de NO3 é estimulada pela luz e há indícios de que a

atividade da mesma esteja relacionada com a capacidade de certas plantas

em acumular mais proteínas, o que tem sugerido o melhoramento genético

monitorado pela medida da atividade enzimática. Também tem sido utilizada

na avaliação da nutrição nitrogenada em diversas culturas.

NO3- + NADH + H+ NO 2 - + NAD+ + H2O

(nitrato) (redutase) (nitrito)

A atividade da enzima pode ser estimada pela quantidade de N02-

formada que é colorimétricamente dosada mediante reação com sulfanilamida e -naftilenodiamino, gerando um complexo colorido (diazo composto) com max em 540 nm.

3. MATERIAL

3.1. Equipamentos e Vidrarias

- Espectrofotômetro

- Banho-Maria (37oC) - Perfurador (0,5 cm de diâmetro) - Pinças - Estante com tubos de ensaio (8 tubos por grupo) - 5 pipetas graduadas de 5 ml (por grupo)

3.2. Reagentes - Sulfanilamida 1% em HCl 12 N - -naftilenodiamino 0,05% - Padrão de NaNO2 10 M

- Substrato tamponado (KNO3 200 mM em tampão fosfato 50 mM pH=

7.4)

40

4. PROCEDIMENTO

a) Pesar 100 mg de discos foliares (0,5 cm de diâmetro), de folhas iluminadas e de folhas mantidas ao abrigo da luz, transferindo para tubos de ensaio.

b) Incubar com 5 mL de substrato tamponado a 37oC por 1 hora, mantendo os tubos ao abrigo da luz (envoltos em folhas de alumínio).

c) Paralizar a reação enzimática pela adição de sulfanilamida 1% em HCl 2N e a seguir adicionar 1 ml de -neftilenodiamino 0,05%.

d) Agitar, aguardar 5 minutos para a reação cromogênica, remover os

discos por filtração e efetuar a leitura em fotocolorímetro com filtro no 54.e) Paralelamente fazer reta padrão fazendo-se reação conforme a tabela

que se segue:

TUBO NO

H2ODEST.

NaNO2

10 MSULFANILAMIDA

NAFTILENO DIAMINO

LEITURA t% 540 nm

Abs540nm

Δ Abs540 nm

0 5 mL 1 mL 1 mL 1 ml1 4 mL 1 mL 1 mL 1 ml2 3 mL 2 mL 1 mL 1 ml3 2 mL 3 mL 1 mL 1 ml4 1 mL 4 mL 1 mL 1 ml5 0 mL 5 mL 1 mL 1 mL6 5 mL folha

Escuro0 1 mL 1 mL

7 5 mL folha Claro

0 1 mL 1 mL

5. RESULTADOS e DISCUSSÃO

Com os dados obtidos estabelecer a reta padrão (leituras na ordenada

contra concentrações de N02- na abscissa) e mediante interpolação na reta

calcular as atividades de Redutase de Nitrato, expressando os valores em

moles de nitrato reduzido por hora por g de tecido foliar fresco (moles. g-1 .

h -1).

Discutir os resultados:

1. Porque a diferença encontrada entre os resultados das folhas mantidas no claro em relação as folhas mantidas no escuro?

2. Qual a importância da luz no processo de redução do Nitrato?

REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

ADELAR BRACHT E EMY LUIZA ISHII-IWAMOTO

Métodos de Laboratório em Bioquímica, Ed. Manole 1ª Ed. 2003

AVRON, M., "Mechanism of photoinduced electron transport in isolated

chloroplasts", in D.R. Sanadi (ed.), Current Topics of Bioenergetics,

12, Academic Press, New York, 1967, p.1.

HAGEMAN, R.H. & D. FLESHER. Nitrate reductase activity in corn seedling as effected by light and nitrate content of nutrient media. Plant Physiology,

41

35: 700-708 (1960).

HEWITT, E.J. Physiological and Biochemical factors wich control the assimilation of inorganic nitrogen supplies by plants. In

"Nitrogen Nutrition of the Plant", E.A. Kirkby (ed.), Un. Leeds, 1970. p.78-103.

JACOBS, M.B. The Chemical Analysis of Foods and Food Products. Van Nostrand, New York, 1958, 970 p.

LITWACK, G. Experimental Biochemistry - A Laboratory Manual. John Wiley & Sons, Inc., New York, 1960, 313p.

MARTELLI, H.L. & PANEK, A.D. Bioquímica Experimental. Ao Livro Técnico, Rio de Janeiro, 1968, 112p.

VILLELA, G.G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Técnicas e Experimentos de Bioquímica. Koogan, Rio de Janeiro, 1973, 552p.

WHARTON, D.C. & Mc CARTY, R.E. Experiments and Methods in Biochemistry. McMillan Publishing Co, Inc., New York, 1972, 350p.

42

QUESTIONÁRIO 1

ASSUNTO: CARBODRATOS E LIPIDEOS

1.Defina ligação hemicetal demonstrando um exemplo através de uma cetose e uma aldose (ciclo hexose).

2.Escreva a fórmula cíclica (projeção) dos principais monossacarideos (hexoses). Considere as posições D,L, e

3.A molécula de D-- glicose difere em que de uma molécula de D- -glucose?

4.Explique resumidamente: (1) Como se faz a numeração da cadeia de um monossacarídeo; (2) Diferencie posição D,L,(+) e (—), 5.Escreva as fórmulas de: sacarose, maltose, lactose e celobiose.

6.O que são ligações glicosídicas dos tipos a ( 1,4) e a ( 1,4)?

7.Diferencie os polissacarideos amido, glicogênio e celulose quanto às ligações glicosídicas.

Esquematize as três macromoléculas e fale de suas funções.8.Como se dividem os polissacarideos? Dê exemplos.

9.O que são dextranas, frutanas e hemicelulose?

10.O que são N-glicosideos, o-metílicos, açúcares-alcoóis e amino-açúcares

111. Citar as funções dos lipídeos nos seres vivos.

12.Qual a importância do índice de saponificação e índice de iodo (em relação ao peso molecular e grau de insaturação) nos ácidos graxos , gorduras e óleos.

13.Escreva a relação entre ponto de fusão e solubilidade quanto ao peso molecular, estrutura e grau de insaturação de lipídeos.

14.O que ocorre na rancificação oxidativa? Qual o papel dos antioxidantes? Cite exemplos.

15.Citar as características necessárias para que uma molécula funcione como sabão ou detergente.

16.Quais os componentes estruturais de uma cera e o tipo de ligação entre elas?

17.Que são ácidos graxos saturados, insaturados e poliinsaturados?. Dê exemplos.

18.Quais as funções dos triglicerídeos? Que tipo de ligação existe?

19.Qual a função dos fosfolipideos? Escreva um exemplo, dando sua importância.

20.Testosterona e Progesterona pertencem a que classe de lipideos? Porque?

43

QUESTIONARIO 2

1.Escreva as classificações dos aminoácidos de acordo com a cadeia lateral.

2. Cite dois exemplos de cada classe

3 Escrever a reação entre dois aminoacido, identificando a ligação peptidica.

4. Explicar o que significa ponto isoelétrico de um aminoácido.

5 . Citar a carga de um aminoácido abaixo e acima de seu ponto isoeletrico.

6. Representar a ligação peptidica..

7 O que vem a ser a estrutura primaria, secundaria, terciária e quaternária de

uma proteína?

8. Citar os tipos de ligação responsáveis pelas estruturas secundaria e

terciária da proteína

9. O que vem a ser desnaturação de uma proteína, e que agentes causam

esta desnaturação?

10. Definir proteína simples e conjugada. De exemplos.

11.O que vem a ser velocidade de uma reação enzimática?

12. Qual a explicação de Michaelis Mentem para o modo de ação de uma

enzima?

13. Qual o conceito de”sitio ativo’?

14.Escreva graficamente a comparação entre as energias de ligação de uma

reação catalisada e uma reação não catalisada.

15.Que vem a ser inibidor competitivo e não competitivo?

16.O que é uma enzima alosterica?

17. Qual o efeito da temperatura em uma reação enzimática?

18.Qual o efeito do pH em uma reação enzimática?

19.Q que é cofator enzimático?

20.O que são coenzimas ? de exemplo

QUESTIONARIO 3

1) Escreva graficamente a comparação entre as energias de ativação de uma reação catalisada e de uma reação não catalisada. 2) Qual o conceito de “sitio ativo”?

3) Qual o significado da constante de Michaelis e Menten?4) O que é glicólise?

5) Localização celular da glicólise.6) Qual a relação entre insulina e glicólise?

7)A frutose pode ser utilizada na glicõlise?8) A aldolase apresenta K-equilibrio 9 x 104. Porém na célula a reação se desloca no sentido da degradação da frutose. Por quê?9)Qual o efeito da adrenalina sobre a glicólise?10) Explicar o balanço de ATP no processo da glicólise.

11) Qual a relação entre abate de animais e descanso?

12)0 que significa formação de ATP a nível de substrato?

44

13)0 que é gluconeogênese?14) Qual a importância da gluconeogenese?

15) Como pode ser utilizada a fermentação alcoólica para a produção de glicerol?16) Mecanismo de formação do glicerol.17) Quais as diferenças entre glicólise e fermentação alcoólica?18) Destacar a importância da nicotinamida (vit. do complexo B) na glicólise.19) Qual a importância do ciclo das pentoses?20) Localização celular do ciclo das pentoses.

21) No que consiste o ciclo das pentoses?

22) Comparar glicólise com ciclo das pentoses.23)Destacar a importância de elementos minerais no ciclo das pentoses.

24)Como você pode determinar, na prática, se um tecido está realizando glicólise ou ciclo das pentoses?

25) Porque há necessidade do ciclo de Krebs para a oxidação do acetil-CoA?

26) Quais os produtos do ciclo de Krebs?

27) Quais são as enzimas regulatórias do ciclo de Krebs?

28) Qual o significado do ciclo de Krebs?

29) Quais os inibidores do ciclo?

30) Que significa cadeia respiratória?

31) Qual a produção de ATP através da oxidação total de uma molécula de glicose?

32) Quais os venenos respiratórios?

33) Que composto é o último aceptor de eletrons na cadeia respiratória?

34) Qual a diferença entre ATP e GTP ?’

QUESTIONARIO 4 (GLICÓLISE, CICLO DE KREBS E CADEIA RESPIRATORIA)

1. O que vem a ser glicólise?2. Em que região da célula se processa a glicólise e qual a sua finalidade?3. O que vem a ser “balanço de coenzimas” e por que ele é nulo em anaerobiose?4. Quais os substratos e os produtos do metabolismo anaeróbico dos carboidratos?5. Qual o rendimento energético obtido por uma célula muscular ao degradar anaerobicamente a glicose? Por que este rendimento é superior quando se utiliza glicogênio como substrato? Dados:

ATP ADP + Pi; (AG=-8.000 cal/mol)C6H1206 2C3H603 (AG=-47 .000cal/mol)

6. O que vem a ser “malte” e qual a sua função na produção de etanol a

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partir de cereais?7. Qual a vantagem do abate de animais descansados à luz do metabolismo anaeróbico nas células musculares?8. Em que se fundamenta a conservação de alimentos (coalhadas, iogurtes, ensilagem, picles, etc.) ao se propiciar a fermentação lática?9. Quais as funções do Ciclo de Krebs? Onde ele se processa?1O.Quais as funções da Cadeira Respiratória? Onde ela se processa epor que a mesma está acoplada ao Ciclo de Krebs?11 Qual a diferença entre “veneno respiratório” e “desacoplador da fosforilaçâo oxidativa”?12.Qual a diferença entre “fosforilação oxidativa” e “fosforilação ao nível de substrato”? Qual a mais significativa em condições de aerobiose, por que?13. Qual o rendimento energético obtido por uma célula ao oxidar completamente a molécula de glicose? Quantos ATPs são produzidos pela fosforilação oxidativa e quantos pela fosforilação ao nível de substrato? Dados:

C6H1206 C02 + H2O ; ( G°=-686.000 cal/moI)

14.Quantos ATPs são produzidos pela combustão biológica completa do acetil-CoA, piruvato, lactato e etanol?15.Qual a vantagem da membrana interna da mitocôndria se apresentar enrugada?16.Como se explica a ação tóxica do flúor acetato (principio tóxico de algumas plantas) sobre o Ciclo de Krebs?17.Como se explica a ação tóxica do cianeto na Cadeia Respiratória?

QUESTIONÁRIO 5: VIA PENTOSE FOSFATO, METABOLISMO DOSTRIGLICERIDIOS, METABOLISMO DEGRADAT1VO DAS PROTEINAS EAMINOÁCIDOS E EXCREÇÃO DO NITROGÊNIO.

1. Cite duas diferenças e duas semelhanças entre glicólise e via pentose fosfato.

2. Quais as finalidades da via pentose fosfato e em que região da célula ela opera?

3. Comparando-se as glândulas mamárias e o músculo esquelético em quais desses tecidos predomina a via pentose fosfato? Justifique. idem para os tecidos vegetais jovens e maduros.

4. Qual a importância energética quantitativa e qualitativa dos triglicerídios de nossa dieta?

5. O que resulta da beta-oxidação dos ácidos graxos? Onde ela se processa e quais os destinos dos seus produtos?

6. Quantos ATPs seriam obtidos por uma célula ao oxidar completamente o triglicerídio abaixo estruturado?

CH2- O - CO - (CH2)13- CH3

CH-O-CO-(CH2)14-CH3

CH2- O-CO - (CH2) 14- CH3

7. Como a célula efetua a dessaturação dos ácidos graxos? Como ela está relacionada com a aclimatação de certas plantas em ambientes mais frio?

46

8. Por que as proteínas devem estar presentes em nossa dieta? Podem elas, e como, atender a demanda energética de nosso organismo?

9. O que vem a ser aminoácido essencial? Cite 3 deles para o homem.10. 0 que vem a ser balanço nítrogenado? Por que ele é nulo em animais

adultos e negativo quando de uma dieta deficiente em aminoácidos essenciais?

11. O que vem a ser reação de transaminação? Cite uma delas e comente a sua importância. Idem para reação de descarboxilação de aminoácido.

12. Quais as formas nitrogenadas de excreção utilizadas pelos organismos animais? Que propriedades de solubilidade e toxidez apresentam?

13. Por que a uréia é a forma nitrogenada de excreção mais adequada para os mamíferos? Idem quanto ao ácido úrico para as aves.

14. Por que animais com habilidade metabólica para excreção de uréia ou ácido úrico voltam a excretar nitrogênio amoniacal quando em ambiente com grande disponibilidade de água?

QUESTIONÁRIO 6 : INTEGRAÇÃO DO METABOLISMO, REGULAÇÃO METABÓLICA, FOTOSSINTESE E CICLO DO NITROGÊNIO

1.Quais são as etapas (fases) pelas quais passam polissacarídios,

triglicerídios e proteínas para atender à demanda de energia (ATP) por

parte da célula?

2.Com que eficiência é aprisionada a energia das ligações ésteres,

glicosídicas e peptídicas na fase de hidrólise dos alimentos?

3.Quais são os 3 compostos chaves do metabolismo degradativo dos

carboidratos, lipídios e proteínas? Quais os seus destinos?

4.Esquematize a formação de triglicerídio a partir de carboidrato.

5. Esquematize a formação dos ácidos glutâmico, aspártico e alanina a partir

de uréia e açúcar de melaço no rumen bovino. Porque a uréia tem que ser

fornecida juntamente com uma forma facilmente metabolizável de açúcar?

6.O que vem a ser “aminoacido glicogênico”? Cite 3 deles. Qual a importância

deste fato para o metabolismo animal?

7. O que vem a ser “corpos cetônicos” e como são formados em nosso

organismo? Em que condições fisiológicas tais compostos se mostram com

conteúdos mais elevados na urina e no sangue?

8.Podem os triglicerídios ser convertidos em açúcar no organismo animal? Por

que?

9.O que vem a ser “Ciclo do Glioxilato”? Em que organismos ocorre e

qual a sua função bioquímica? Porque tal ciclo é particularmente ativo

durante a germinação de sementes oleaginosas?

10.0 que vem a ser “Efeito Pasteur” e como ele é explicado bioquímicamente?

11.Por que uma adubação nitrogenada excessiva por acarretar o

“acamamento” em certas culturas?

12.Como o excesso de amônia pode comprometer o metabolismo das células

nervosas (cérebro) levando ao coma cerebral? Como a intoxicação com etanol

leva ao mesmo quadro clínico?

47

13.Porque o diabético bebe mais água que o indivíduo saudável?

14.Quais os eventos que dependem e quais os que não dependem da luz

quanto à formação de glicose por uma planta fotossintetizadora?

15.Por que as luzes de comprimentos de onde de 450 e 650 nm são mais

eficientes para a realização de fotossíntese pelas plantas superiores?

16.Quais as funções dos carotenóides no processo fotossintético conduzido

pelas plantas?

17.Como se explicam a essencialidade do Cl, Mn e Mg para o processo

fotossintético?

1 8.Como são estruturados os sistemas de pigmentos para a captação da

energia radiante para a condução da fotossíntese?

19.Qual a função da água no processo fotossíntético?

20. 0 que fica demonstrado quando se observa a redução do 2,6-

diclorofenolindofenol por cloroplastos iluminados (reação de Hill)?

21. 0 que vem a ser “foto-redução do NADP + e “fotofosforilação do ADP”?

22. Qual o primeiro composto formado pela assimilação do CO2 mediante a

via C-3 de fixação? Idem para a via C-4. Quais as enzimas ‘envolvidas nesta

etapa e suas afinidades para com o CO2?

23.Que adaptações ocorreram nas crassuláceas que lhes permitem a Me

sobrevivência em ambientes quentes e áridos?

24.0 que vem a ser “fotorrespiração”? Qual o seu substrato e porque é pouco

intensa nas plantas C-4? Qual a importância da luz e do 02 neste processo?

25.Cite 4 diferenças entre plantas C-3 e C-4 (exceto foto-respiração).

26.Por que as plantas C-4 são menos exigentes em nitrogênio quando

comparadas com as C-3?

27.Porque as plantas C-4 fazem fotossíntese com boa eficiência mesmo em

temperaturas mais elevadas?

28. Porque a fotossíntese nas plantas C-4 não atinge a saturação mesmo com

grande intensidade luminosa?

29.0 que vem a ser “ponto de compensação” e por que é menor para as

plantas C-4?

30.Porque o nitrato é a forma nitrogenada mais abundante no solo? Existiria

alguma vantagem para as plantas?

31 .Como os herbicidas que bloqueiam o transporte de elétrons no processo

fotossintético matam a planta?

32.0 que vem a ser “redução do nitrato”? Quais as participações do ferro e

molibdênio neste processo?

33.0 que vem a ser “fixação do nitrogênio”? Quais as modalidades de fixação

do N ?

34. 0 que vem a ser “assimilação da amônia” e quais a vias metabólcas

envolvidas?

48

35. 0que vem a ser “nitrificação” e qual a importância agronômica para essa

transformação?

36.0 que vem a ser “desnitrificação”? Que organismo está envolvido e com

que objetivo tal processo é conduzido?

37.Como que os herbicidas ‘que bloqueiam o transporte de elétrons na

fase luminosa da fotossíntese (2,4-DNP e DCMU) matam a planta?

49

Tabela de Conversão

T% em A x 1.000

00 01 02 03 04 05 06 07 08 09

0 3.00026992.5232.3982.3012.222 2.1552.097 2.046

1 2.0001.9591.9211.886 1.8541.8241.7961.770 1.745

1.721

2 1.6991.6781.6581.638 1.6201.6021.5851.569 1.553

1.538

3 1.5231.5091.4951.481 1.4691.4581.4441.4321.420 1.409

4 1.3981.3871.3771.387 1.3571.3471.3371.328 1.319

1.310

5 1.3011.2921.2841.276 1.2681.2601.2521.244 1.237

1.229

6 1.2221.2151.2081.201 1.1941.1871.1801.174 1.167

1.161

7 1.1551.1491.1431.137 1.1311.1251.1191.114 1.108

1.102

8 1.0971.0921.0861.0811.076 1.0711.0661.0601.056 1.051

9 1.0481.0411.0361.0321.0271.022 1.0181.0131.009 1.004

10 1.0000.9960.9910.987 0.9830.9790.9750.971 0.967

0.963

11 959 955 951 947 943 939 938 932 928 924

12 921 917 914 910 907 903 900 896 893 889

13 886 883 879 876 873 870 866 863 860 857

14 854 851 848 845 842 839 836 833 830 827

15 824 821 818 815 812 810 807 804 801 799

16 796 793 790 788 785 783 780 777 775 772

17 770 767 764 762 759 757 764 752 750 747

18 745 745 742 738 735 733 730 728 726 724

19 721 719 717 714 712 710 708 706 703 701

20 699 697 695 693 690 688 686 684 682 680

21 678 676 674 672 670 688 666 664 662 660

22 658 656 654 652 650 648 646 644 642 640

23 638 636 635 633 631 629 627 625 623 622

24 620 618 616 614 613 611 609 607 606 604

25 602 600 599 597 595 503 592 590 588 587

26 585 583 582 580 578 577 575 573 572 570

27 569 567 565 564 562 561 559 558 556 554

28 553 551 550 548 547 545 544 542 541 539

29 538 536 535 533 532 530 529 527 528 524

30 523 521 520 519 517 516 514 513 511 510

50

31 509 507 506 504 503 502 500 499 498 495

32 495 493 492 491 489 488 487 485 484 483

33 481 480 479 478 476 475 474 472 471 470

34 469 467 468 465 463 462 461 460 458 457

35 456 455 453 452 451 450 449 447 446 445

36 444 442 441 440 439 438 437 435 334 433

37 432 431 429 428 427 426 425 424 423 421

38 420 419 418 417 416 415 413 412 411 410

39 409 408 407 406 405 403 402 401 400 399

40 398 397 396 395 394 393 391 390 389 388

41 387 386 385 384 383 382 381 380 379 378

42 377 376 375 374 373 372 371 370 369 368

43 367 366 365 364 363 362 361 360 359 358

44 357 356 355 354 353 352 351 350 349 348

45 347 346 345 344 343 342 341 340 339 338

46 337 336 335 334 333 333 332 331 330 329

47 328 327 328 326 325 324 323 322 321 320

48 319 318 317 316 315 314 313 312 312 311

49 310 309 308 307 306 305 305 304 303 302

50 301 300 299 298 298 297 296 295 294 293

51 292 292 291 290 289 288 287 287 286 285

52 284 283 282 281 281 280 279 278 277 277

53 278 275 274 273 272 272 271 270 289 268

54 268 267 266 265 264 264 263 262 261 260

55 250 259 258 257 257 256 255 254 253 253

56 252 251 250 249 249 248 247 246 246 245

57 244 243 243 242 241 240 240 239 238 237

58 237 236 235 234 234 233 232 231 231 230

59 229 228 228 227 226 225 225 224 223 223

60 222 221 220 220 219 218 218 217 216 215

61 215 214 213 213 212 211 210 210 209 208

62 208 207 206 206 205 204 203 203 202 202

63 201 200 199 199 198 197 197 196 195 194

64 194 193 192 192 191 190 190 189 188 188

65 187 186 186 185 184 184 183 182 182 181

66 180 180 179 178 178 177 177 176 175 175

67 174 173 173 172 171 171 170 169 169 168

68 167 167 166 166 165 164 164 163 162 162

69 161 161 160 159 159 158 157 157 156 156

70 155 154 154 153 152 152 151 151 150 149

71 149 148 148 147 146 146 145 144 144 143

72 143 142 141 141 140 140 139 138 138 137

51

73 137 136 135 135 134 134 133 133 132 132

74 131 130 130 129 128 128 127 127 126 126

75 125 124 124 123 123 122 121 121 120 120

76 119 119 118 117 117 116 116 115 115 114

77 114 113 112 112 111 111 110 110 109 109

78 108 107 107 106 106 105 105 104 103 103

79 102 102 101 101 100 100 099 099 098 097

80 097 096 096 095 095 094 094 093 093 092

81 092 091 090 090 089 089 088 088 087 087

82 086 086 085 085 084 084 083 083 082 081

83 081 080 080 079 079 078 078 077 077 076

84 076 075 075 074 074 073 073 072 072 071

85 071 070 070 069 069 068 068 067 067 066

86 066 065 064 064 063 063 062 062 061 061

87 060 060 059 059 058 058 057 057 057 056

88 056 055 055 054 054 053 053 052 052 051

89 051 050 050 049 049 048 048 047 047 046

90 046 045 045 044 044 043 043 042 042 041

91 041 040 040 040 039 039 038 038 037 037

92 036 036 035 035 034 034 033 033 032 032

93 032 031 031 030 030 029 029 028 028 027

94 027 026 026 025 025 025 024 024 023 023

95 022 022 021 021 020 020 020 019 019 018

96 018 017 017 016’ 016 015 015 015 014 014

97 013 013 012 012 011 011 011 010 010 009

98 009 008 007 007 007 007 006 006 005 005

99 004 004 003 003 003 002 002 001 001 000

52